WO2008029843A1 - Electrode catalyst and enzyme electrode - Google Patents

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WO2008029843A1
WO2008029843A1 PCT/JP2007/067304 JP2007067304W WO2008029843A1 WO 2008029843 A1 WO2008029843 A1 WO 2008029843A1 JP 2007067304 W JP2007067304 W JP 2007067304W WO 2008029843 A1 WO2008029843 A1 WO 2008029843A1
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enzyme
electrode
carbon
cueo
nitrogen
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Tsutomu Kajino
Norihiko Setoyama
Keiko Uemura
Hisao Kato
Kenji Kano
Seiya Tsujimura
Takeshi Sakurai
Kunishige Kataoka
Original Assignee
Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
Kyoto University
National University Corporation Kanazawa University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02E60/50—Fuel cells

Definitions

  • the present invention relates to an electrode catalyst and an enzyme electrode, and more particularly to an enzyme electrode used as an electrode of various electrochemical devices such as a biosensor and a fuel cell, and an electrode catalyst used for the enzyme electrode.
  • An enzyme is a biocatalyst that promotes a chemical reaction (metabolism) in a living body, and has a protein as a basic structure. Enzymes may consist only of proteins. Many of them require components (cofactors) other than proteins in order to develop catalytic activity or enhance catalytic activity.
  • enzymes that catalyze redox in the body are called “oxidoreductases”.
  • an enzyme that oxidizes a substrate using oxygen as an electron acceptor is particularly referred to as an “oxidase”
  • an enzyme that reduces a substrate is particularly referred to as a “reductase”.
  • an electrode is called an “enzyme electrode” and is used as an electrode for various biosensors, fuel cells and the like.
  • an enzyme In order to use an enzyme as an electrode catalyst, it is necessary to immobilize the enzyme on the surface of an appropriate carrier.
  • the enzyme since the enzyme is generally water-soluble, there is a problem that the enzyme tends to flow out during use.
  • the enzyme has a site (active center) where the substrate specifically binds and is catalyzed. Since the active center is often buried deep in a protein having a complex three-dimensional structure, it is difficult to exchange electrons directly with the electrode. In such a case, a low-molecular substance that normally penetrates to the active site of the enzyme, exchanges electrons with the enzyme, and carries electrons to the electrode is used in combination. Such low molecular weight substances are called “mediators”. However, since the electron transfer rate between the enzyme and mediator depends on the molecular motion of each, it may be a factor that limits the current density of the enzyme electrode, which is not always sufficient.
  • Patent Document 1 discloses a nitrogen-containing carbon comprising a porous body made of a nitrogen-containing carbon-based material having a skeleton formed of carbon atoms and nitrogen atoms, and a redox enzyme supported on the porous body.
  • a composite material is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses an enzyme electrode having a conductive member, an enzyme, and first and second mediators, wherein the first mediator and the second mediator are supported by a carrier.
  • glucose oxidase glucose oxidase, galactose oxidase, bilirubin oxidase, pyruvate oxidase, D or L amino acid oxidase, amin oxidase, cholesterol oxidase, asconolelevate oxidase, cytochrome oxidase, alcohol dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, cholesterol dehydrogenase, cholesterol 3-aldehyde Acid dehydrogenase, 3-hydroxysteroid dehydrogenase, diaphorase, catalase, peroxidase, glutathione reductase
  • NADH cytochrome b5 reductase NADH cytochrome b5 reductase, NADPH adrenoxin reductase, cytochrome b5 reductase, adrenodoxin reductase, and nitrate reductase.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-343775
  • Patent Document 2 JP 2006-058289 A
  • an oxidoreductase has a site (electron transfer gate) for exchanging electrons with an active center in addition to an active center that binds to a substrate. Since electron transfer to an enzyme in a living body is usually mediated by a mediator, the electron transfer gate of the enzyme is often buried in a protein pocket. When the enzyme in this state is immobilized on the electrode surface, the distance between the electron transfer gate and the electrode surface inevitably increases. Since the common logarithm of the electron transfer speed becomes slower in proportion to the distance, a conventionally known enzyme cannot obtain a high electron transfer efficiency. In order to solve this problem, it is also possible to use a mediator as disclosed in Patent Document 2. However, there is a limit to improving the electron transfer efficiency only by using the mediator together. In addition, there has been no example of an enzyme suitable for an enzyme electrode capable of obtaining a sufficient current density.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a novel electrode catalyst comprising an oxidase having high electron transfer efficiency and an enzyme electrode using the same.
  • the electrode catalyst according to the present invention comprises CueO.
  • the enzyme electrode according to the present invention includes a carbon porous body and an electrode catalyst made of CueO supported on the surface of the carbon porous body.
  • CueO which is a kind of multi-copper oxidase
  • a high current density can be obtained compared to conventional oxidoreductases.
  • the electrode catalyst of the present invention is excellent in electron transfer efficiency, and a high current density can be obtained as compared with conventional oxidoreductases. That is, the enzyme electrode in which the electrode catalyst of the present invention is immobilized has a high current value even when the electrode catalyst is immobilized in a limited area where the current value obtained per amount of immobilized electrode catalyst is large. Can be obtained. Specifically, it is possible to obtain a current density equivalent to that of an electrode using a platinum catalyst. However, since the enzyme electrode to which the electrode catalyst of the present invention is immobilized can obtain a high current value even when a small amount of the electrode catalyst is immobilized, the cost can be reduced.
  • the electrocatalyst of the present invention has a high electron transfer efficiency, that is, the electron transfer speed between the electrode and the electrocatalyst is very high, thereby improving the speed of the electrode reaction in the enzyme electrode Therefore, a high current value can be obtained without using a mediator.
  • the electrode catalyst of the present invention since the electrode catalyst of the present invention has a high electron transfer efficiency and the electron transfer speed between the electrode catalysts is very high, the catalyst current obtained in the enzyme electrode on which the electrode catalyst of the present invention is immobilized is It is limited by the oxygen supply rate to the electrode rather than the enzyme activity of the catalyst. That is, the enzyme electrode on which the electrode catalyst of the present invention is immobilized exhibits stable electrode activity and can provide stable output. Therefore, by using the enzyme electrode on which the electrode catalyst of the present invention is immobilized, the output of the fuel cell can be improved and the sensitivity of the oxygen detection type sensor can be increased.
  • FIG. 1 Molecular structure of CueO derived from Escherichia coli, a kind of multi-copper oxidase.
  • FIG. 2 is a cyclic voltamgram of an enzyme solution containing various multi-copper oxidases.
  • FIG. 3 Sizes of enzyme electrodes containing various multi-copper oxidases supported on various carbon supports.
  • the electrode catalyst according to the present invention comprises CueO.
  • An oxidoreductase is an enzyme that catalyzes a redox reaction, and has an active center and an electron transfer gate in the three-dimensional structure of a protein.
  • Active center refers to a site where a substrate specifically binds and is catalyzed.
  • Electrode transfer gate refers to a site for exchanging electrons with an active center.
  • An oxidoreductase is roughly classified into an oxidase that oxidizes a substrate and a reductase that reduces a substrate.
  • Which one is used as an electrode catalyst enzyme depends on the polarity of the electrode. That is, when an enzyme is used as a material on the positive electrode side, an oxidase that can accept electrons by reaction (in other words, can catalyze a reaction that produces water using protons and oxygen as substrates). Use. On the other hand, when an enzyme is used as the negative electrode material, a reductase that releases electrons by reaction is used.
  • the oxidoreductase is a macromolecule having an inherent three-dimensional structure, and the active center and the electron transfer gate are usually buried in the back of the opening (indentation or crack) of the three-dimensional structure. It is in a state.
  • the active center and the electron transfer gate may be in the same opening or in different openings.
  • the oxidoreductase having a first opening containing an electron transfer gate and a second opening containing an active center causes the movement of the substrate to move when the enzyme catalyzes the substrate. There is no interference with. Therefore, the efficiency of electron transfer between the enzyme and the electrode is improved as compared with an enzyme containing an active center and an electron transfer goat in the same opening.
  • an oxidoreductase in which the first opening including the electron transfer gate is opposite to the second opening including the active center can be obtained by bringing the first opening close to the electrode surface. Electron transmission between them can be performed very smoothly. This further improves the efficiency of electron transfer between the enzyme / electrode.
  • the first opening is opposite the second opening
  • the normal direction of the surface with the first opening and the normal direction of the surface with the second opening are The angle formed is greater than 90 °. The closer the angle between the two normals is to 180 °, the better, the better.
  • multi-copper oxidase catalyzes a reaction of generating water by producing 4-electron reduction of molecular oxygen using electrons extracted from the substrate.
  • Multi-copper oxidase has mononuclear blue copper (type ICu) as the electron transfer gate and trinuclear copper cluster (type IICu, type IIICu) as the active center.
  • the two openings are on the front and back surfaces of the three-dimensional structure formed by the protein, respectively. Therefore, a multi-copper oxidase or a modified enzyme obtained by modifying this by gene manipulation is particularly suitable as a catalyst for the positive electrode of an enzyme electrode used in various electrochemical devices such as biosensors and fuel cells.
  • multi-copper oxidase examples include laccase, bilirubinoxidase, ascorbate oxidase, cell mouth plasmin, CueO, and endospore coat protein CotA of Bacillus bacteria.
  • CueO particularly copper metabolism-related oxidase CueO of E. coli (CueO derived from E. coli)
  • CueO has a higher current density than conventional oxidoreductases when used as an electrode catalyst for enzyme electrodes. Is obtained.
  • rCueOj is a kind of multi-copper oxidase collected from various strains! “ColiO derived from E. coli” refers to CueO collected from E. coli. Sequence number 1 of a sequence table Shows the amino acid sequence of natural mature CueO (swissprot accession: Q8X947).
  • CueO may be natural CueO collected directly from the strain, or a part of the amino acid sequence of natural CueO was altered or deleted by genetic manipulation to the extent that catalytic activity and electron transfer ability are not lost. It may be a modified CueO.
  • the enzyme electrode according to the present invention includes a carbon porous body and an electrode catalyst made of CueO supported on the surface of the carbon porous body.
  • CueO is particularly preferred from E. coli. Among these, CueO and CueO derived from E. coli are as described above, and the description is omitted.
  • a carbon porous body is used as the carrier for supporting the enzyme.
  • the carbon porous body can physically carry the enzyme in the pores when the pore diameter is suitable so that the electron transfer between the enzyme and the electrode can be performed smoothly. This is particularly suitable as a carrier.
  • the carbon porous body has one or more of the following conditions [1 ⁇ ] to [4 ⁇ ] Those are preferred.
  • the carbon porous body preferably has an average pore diameter of 2 to 50 nm.
  • the average pore diameter is more preferably 2 to 20 nm.
  • the average pore diameter is often smaller than the enzyme size, and the adsorptivity is reduced.
  • the average pore size force exceeds S50 nm, the specific surface area is lowered and the adsorptivity is lowered.
  • the average pore diameter of the carbon porous body is preferably equal to or larger than the molecular diameter of the enzyme. The average pore diameter is more preferably about!
  • the average pore diameter of the carbon porous body is in the above range, the enzyme is easily fixed in the pores.
  • the outer wall of the pore suppresses the structural change of the enzyme due to heat, so that the inactivation of the enzyme due to heat can be suppressed, and the thermal stability is improved.
  • the average pore size is a pore size distribution obtained from a nitrogen adsorption isotherm described later. It means the pore diameter value of the distribution peak top.
  • the carbon porous body preferably has a pore volume distribution region of 2 to;!, And a pore volume in the range of ⁇ 25% of the average pore diameter of 60% or more based on the total pore volume in the range of OOnm. If the uniformity of the pore diameter is worse than this, the number of pores other than the optimum pore diameter for supporting the enzyme increases, and the stability and activity of the enzyme may be insufficient.
  • the carbon porous body preferably has a specific surface area of 100 m 2 / g or more.
  • the specific surface area is more preferably 500 to 1000 m 2 / g.
  • the specific surface area of the carbon porous body is less than 100 m 2 / g, the contact area with the enzyme decreases and the pores taking in the enzyme decrease, and the adsorptivity of the enzyme decreases.
  • the pore volume of the carbon porous body is not particularly limited because it varies depending on the specific surface area and the average pore diameter, but is preferably from 0.;! To 50 ml / g.
  • the pore volume is more preferably 0.2 to 2.5 ml / g.
  • the total volume of pores having a pore diameter larger than the molecular diameter of the enzyme is preferably more than the total volume of the supported enzyme! /.
  • the specific surface area and pore volume of the carbon porous body can be determined by the general volumetric measurement described below.
  • the carbon porous body is put in a container and cooled to a liquid nitrogen temperature (1198 ° C.), nitrogen gas is introduced into the container, and the adsorption amount is obtained by a volumetric method. Next, the pressure of the introduced nitrogen gas is gradually increased, and the nitrogen gas adsorption amount against each equilibrium pressure is plotted to obtain a nitrogen adsorption / desorption isotherm. Using this nitrogen adsorption / desorption isotherm, the specific surface area and pore volume can be calculated by the SPE (Subtracting Pore Effect) method (K. Kaneko, C. Ishii, M. Ruike, H. uwabara, Carbon 30, 1075, 1986). The SPE method is a method that calculates the specific surface area, etc.
  • SPE Subtracting Pore Effect
  • the pore size value and the pore size value at the distribution peak top can be obtained from the obtained nitrogen adsorption / desorption isotherm by BJH analysis (Barret EP, Joyner LG, Halenda PH, Journal of American and hemical society 3, 37 ⁇ , 1951).
  • the carbon porous body that satisfies the above-described conditions has the following strength s .
  • a first specific example of the carbon porous body is mesoporous carbon particles.
  • “Mesoporous carbon particles” are porous carbon materials with regularly arranged meso-sized (2 ⁇ ;! Onm) pores, and 2 ⁇ ; for the total pore volume (S) in the pore size distribution region of OOnm. , 2
  • Carbon gel refers to a porous carbon material in which meso-sized pores are irregularly arranged and satisfies the following conditions (i) and (mouth).
  • the pore size value (d) at the distribution peak top is in the range of 2 nm or more and less than 10 nm, 60% or more of the total pore volume in the pore diameter region of d ⁇ 2 nm with respect to the pore size value (d). Is included,
  • the pore size value (D) at the top of the distribution peak is in the range of 10 nm to 50 nm
  • the region contains more than 60% of the total pore volume.
  • Condition (ii) represents the presence or absence of a regular arrangement of mesopores.
  • the pore is a so-called mesoporous force (MPC) in which the pores are regularly arranged with a period of 0.9-17.7 nm.
  • the condition (mouth) represents the uniformity of the pore diameter.
  • mouth represents the uniformity of the pore diameter.
  • the carbon gel preferably further has the following condition (c).
  • the carbon gel preferably has a pore size value at the distribution peak top of 2 to 20 nm! /.
  • the pore diameter value of the carbon gel is less than 2 nm, the pore size is often smaller than the enzyme size, so that the adsorptivity decreases.
  • the pore diameter value exceeds 50 nm, the specific surface area is reduced and the adsorptivity is reduced.
  • the pore size value of the distribution peak top exceeds 20 nm, there is a possibility that inconvenience may occur when the enzyme is loaded.
  • a third specific example of the carbon porous body is a nitrogen-containing carbon gel.
  • “Nitrogen-containing carbon gel” refers to a carbon gel having nitrogen-containing carbon at least near the surface thereof.
  • the “surface” includes an inner surface of a pore that extends only on the outer surface. Near the surface is nitrogen-containing carbon Carbon gel has the advantage that the amount, stability and activity of the enzyme are improved.
  • the atomic ratio (N / C ratio) between N atoms and C atoms in the nitrogen-containing carbon gel is preferably 0.01 or more. If the N / C ratio is less than 0.01, the number of N atoms decreases and the number of adsorption sites that can interact with the enzyme decreases.
  • the N / C ratio is more preferably 0.05 or more.
  • the N / C ratio is preferably 0.4 or less. When the N / C ratio exceeds 0.4, the strength of the carbon skeleton decreases and it becomes difficult to maintain the pore structure.
  • the N / C ratio is more preferably 0.3 or less.
  • N / C ratio in nitrogen-containing carbon can be determined by CHN elemental analysis or XPS.
  • the description thereof is omitted.
  • the enzyme that is an electrocatalyst is supported on the surface of the carrier.
  • the surface of the carrier refers to the outer surface of the carrier and the inner surface of the pores. It is preferable that at least a part of the enzyme is supported on the inner surface of the pore. The larger the amount of enzyme supported in the pore, the better.
  • the amount of the enzyme supported on the carrier is not particularly limited as long as the enzyme activity is shown. In general, the higher the amount of enzyme supported, the higher the activity. In order to obtain a practically sufficient activity, the amount of the enzyme supported is preferably 0.01 parts by mass or more with respect to 100 parts by mass of the carbon porous body. On the other hand, when the amount of the enzyme loaded becomes excessive, the effect is saturated and there is no actual benefit. Therefore, the amount of the enzyme supported is preferably 80 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the carbon porous body.
  • the enzyme electrode according to the present invention may be composed of only the above-described carrier and enzyme, or may be further loaded with a mediator that promotes the transfer of electrons between carbon porous body enzymes. good.
  • the oxygen supply rate becomes the rate-determining step as compared with the electron transfer reaction between the electrode enzyme and the electron transfer efficiency of the enzyme which is an electrode catalyst is very high. For this reason, the enzyme electrode of the present invention does not exclude the use of force mediators that can obtain high current values without using mediators.
  • mediators include metal cyanides such as ABTS and WCN, and Os complexes. These mediators are preferably immobilized on the electrode surface. For this purpose, it is desirable to use it by bonding to a polymer such as poly 1-butimidazole and making it insoluble. Furthermore, the mediator may be directly fixed on the carbon support. These mediators may be used alone or in combination of two or more.
  • the enzyme electrode according to the present invention can be used in a state in which an enzyme (and a mediator if necessary) is supported on the surface of an electron conductive support when the carrier is in a sheet form. S can.
  • the carrier carrying the enzyme can be used by further immobilizing it on the surface of a suitable metal electrode (for example, Pt electrode).
  • mesoporous carbon, carbon gel, and nitrogen-containing carbon gel can be produced by the following method.
  • the method for producing mesoporous carbon particles is not particularly limited, and for example, it can be produced by the following method.
  • organic molecules such as sucrose and furfuryl alcohol are adsorbed and impregnated into porous particles (silical type) such as silica and titania with regularly arranged mesopores, and then carbonized in an inert atmosphere. To do. Thereafter, the soot mold is dissolved and removed with hydrofluoric acid or NaOH / EtOH to obtain mesoporous carbon particles.
  • silica mesoporous material MCM-48 can be used as the saddle type.
  • the method for producing the carbon gel is not particularly limited, and for example, it can be produced by the following method with the force S.
  • an organic gel was synthesized according to the method described in the literature (RWPekala, CTAlviso, FMKong, and SSHulsey, J. Non-cryst. Solids, vol. 145, ⁇ ⁇ 90 (1992)). To do. That is, a phenol resin such as resorcinol is reacted with an aldehyde such as formaldehyde in the presence of an alkali catalyst or an acid catalyst, followed by aging to obtain an organic gel composed of a phenol resin. Next, after drying the obtained organic gel, the carbon gel can be obtained by baking and carbonizing in an inert atmosphere.
  • the method for producing the nitrogen-containing carbon gel is not particularly limited, and for example, it can be produced by the following method.
  • N atoms into the carbon gel can be carried out according to the method described in the literature (P.Chambrion et al., Energy & Fuels vol.11, p.681-685 (1997)), for example. It is. In other words, a carbon gel is placed in a quartz reaction tube and heated to about 950 ° C under a helium stream. Thereafter, NO diluted with helium (concentration of about 100 ppm) is introduced into the reaction tube and reacted at a reaction temperature of about 600 to 900 ° C.
  • the reaction time required for this reaction is not particularly limited, but if the reaction time is extended, the amount of nitrogen incorporated into the carbon skeleton increases.
  • a nitrogen-containing organic compound is introduced into the pores of the carbon gel, and the nitrogen-containing organic compound is thermally decomposed to deposit nitrogen-containing carbon on the surface of the carbon gel. That is, first, a carbon gel is placed in a reaction tube and heated to a predetermined temperature while introducing an inert gas such as nitrogen or argon into the reaction tube. Next, while maintaining the heating state, a nitrogen-containing organic compound in a gaseous state is introduced into the reaction tube, so that the nitrogen-containing organic compound is introduced into the pores of the vigorous Bongel and the CVD reaction is performed for a predetermined time. Do.
  • nitrogen-containing carbon having a skeleton formed of C atoms and N atoms can be deposited in the pores of the carbon gel.
  • the deposition process by the thermal CVD method is usually performed in an inert atmosphere such as nitrogen or argon because C combustion occurs when the reaction atmosphere is an oxidizing atmosphere.
  • the nitrogen-containing organic compound used here is not particularly limited as long as it is an organic compound containing an N atom.
  • examples thereof include nitrogen-containing heterocyclic compounds, amines, imines, and nitriles.
  • examples of the nitrogen-containing heterocyclic compound include a nitrogen-containing heterocyclic monocyclic compound and a nitrogen-containing condensed heterocyclic compound.
  • Nitrogen-containing monocyclic compounds include pyrrole and its derivatives which are 5-membered ring compounds, diazoles and derivatives thereof such as pyrazol and imidazole, pyridine and its derivatives which are 6-membered ring compounds, pyridazine and pyrimidine and the like. Diazines such as pyrazine and its Derivatives, triazines, and triazine derivatives such as melamine cyanuric acid.
  • nitrogen-containing condensed heterocyclic compound examples include quinoline, phenanthrin, and purine.
  • Examples of amines include primary to tertiary amines, diamines, triamines, polyamines, and amino compounds.
  • primary to tertiary amines include aliphatic amines such as methylamine, ethylamine, dimethylamine and trimethylamine, and aromatic amines such as aniline and derivatives thereof.
  • amino compound examples include amino alcohols such as ethanolamine.
  • imines examples include pyrrolidine and ethylimine.
  • nitriles examples include aliphatic nitriles such as acetonitrile and aromatic nitriles such as benzonitrile.
  • nitrogen-containing organic compounds include polyamides such as nylon, amino sugars such as galactosamine, nitrogen-containing polymer compounds such as polyacrylonitrile sugar, amino acids and polyimides.
  • the nitrogen-containing organic compound is introduced into the reaction tube as a gas state by vapor evaporation using a bubbler, a mass flow pump, or the like. can do.
  • a nitrogen-containing organic compound in a gaseous state using nitrogen, argon or the like as a carrier gas.
  • it is preferable to prevent back flow by installing a bubbler containing liquid paraffin or the like on the reaction tube outlet side so that the gas once circulated in the reaction tube does not flow back from the reaction tube outlet side.
  • a heating evaporator (sublimation) can be installed on the reaction tube inlet side, and the nitrogen-containing organic compound can be introduced into the reaction tube as a gas state by heating. .
  • the temperature of the evaporator must be adjusted to a temperature at which the nitrogen-containing organic compound is not thermally decomposed.
  • the nitrogen-containing organic compound has polymerizability, it is preloaded in the pores of the carbon gel. After that, it is possible to take a method of thermally decomposing in an inert atmosphere in a reaction tube.
  • the nitrogen-containing organic compound when the nitrogen-containing organic compound is not vaporized by heating, the nitrogen-containing organic compound is previously introduced into the pores of the carbon gel by a solution adsorption method, an evaporation to dryness method, etc. By pyrolysis under an atmosphere, nitrogen-containing carbon can be precipitated in the pores of the carbon gel.
  • the reaction temperature in the precipitation step by the thermal CVD method is not particularly limited as long as the nitrogen-containing organic compound is thermally decomposed and carbonized, but is preferably 300 to 1000 ° C.
  • the reaction temperature is more preferably 500 to 700 ° C.
  • the reaction temperature is less than 300 ° C, the nitrogen-containing organic compound is less likely to be thermally decomposed, so that the deposition rate of nitrogen-containing carbon is slowed, and the reaction time and energy consumption tend to increase.
  • the reaction temperature exceeds 1000 ° C, it is difficult for carbon to remain in the carbon skeleton, so the N / C ratio decreases.
  • deposition process when precipitation amount of a nitrogen-containing carbon to deposit in the pores of the carbon gel is not particularly limited, where the specific surface area per carbon gel lg and Ym 2, (0. 000 l XY) It is preferable that it is g or more.
  • the amount of nitrogen-containing carbon deposited is less than (0.0001 XY) g, the amount of deposited is small, and there is a possibility that the adsorptive improvement by N atoms cannot be obtained.
  • the amount of precipitation correlates with the CVD reaction time, and the amount of precipitation can be controlled by adjusting the CVD reaction time.
  • the amount of precipitation varies depending on the CVD reaction temperature, the type of carbon gel, the type of nitrogen-containing organic compound, the flow rate when introducing the nitrogen-containing organic compound, etc. Accordingly, the amount of precipitation can be adjusted.
  • an enzyme is supported on the surface of the carbon porous body.
  • the enzyme loading method is not particularly limited, and various methods such as a sublimation method and an impregnation method can be used, but an impregnation method is preferred.
  • Enzyme loading by the impregnation method is performed as follows. That is, first the enzyme precipitates Dissolve in water or buffer to a low concentration (preferably 0.;! To 1000 mg / ml). Then, the powdery carrier is suspended at a temperature (preferably 0 to 50 ° C.) without freezing the solution and the enzyme is not denatured, or the sheet-like carrier is immersed to support the enzyme. Touch the body. The contact time is preferably at least 5 minutes or more, more preferably 30 minutes or more. As a result, the enzyme is immobilized on the surface or pores of the carrier.
  • the concentration at which the carrier is suspended in the solution is not particularly limited, but is preferably about 0.;! To 1000 mg / m 1. Further, after the supporting step, there may be a step of further separating the carrier from the solution by performing centrifugation or the like. Alternatively, the liquid component may be removed by drying or the like.
  • the method for supporting the mediator on the carrier can be performed using the same method as the method for supporting the enzyme on the carrier. Further, the enzyme and the electron transfer medium may be simultaneously supported on the carrier.
  • Fig. 1 shows the molecular structure of CueO derived from E. coli, a type of multi-copper oxidase (Sue A. Roberts et al., PNAS, vol. 99 (2002), 2766-2771).
  • CueO is composed of mononuclear blue copper (type IC u) that functions as an electron transfer gate and trinuclear copper cluster (type IICu, type II) that acts as an electron transfer gate in the three-dimensional structure of the protein.
  • niCu mononuclear blue copper and trinuclear copper clusters are in different openings (Kunishige Kataoka, Biochemistry, Vol. 77 (2005), pp. 148-153). The two openings are respectively on the front and back surfaces of the three-dimensional structure formed of the protein.
  • natural CueO is covered with a helical molecule called helix 5 on the top of mononuclear blue copper.
  • a high current density can be obtained by using a porous carbon body having a predetermined pore diameter, pore distribution, and specific surface area.
  • nitrogen-containing carbon gel when used as the carbon porous body, high electron transfer efficiency can be maintained over a long period of time. This is presumably because the introduction of nitrogen into the carbon gel introduces a polar group into the pore inner wall and creates a new bond such as a hydrogen bond with the hydrophilic group on the protein surface.
  • Escherichia coli-derived CueO (Example 1)
  • Urushi-derived laccase (Comparative Example 1)
  • Myrotheci umu sp. 8 11 8 of enzyme solution was prepared.
  • Figure 2 shows the cyclic voltamgram.
  • Figure 2 shows that laccase (Comparative Example 1) and BO
  • the oxidation current density of OV in the stationary state of D (Comparative Example 2) is 500 ⁇ A / cm 2 or less, whereas the oxidation current density of 0 V in the stationary state of CueO derived from E. coli is about 2 000 11 A / It can be seen that it is cm 2 .
  • Resorcinol 5.5 g (Wako Pure Chemical Industries) and 26.5 mg of sodium carbonate (Wako Pure Chemical Industries) were dissolved in 16.9 g of distilled water, and then 8. lg of 37% formaldehyde solution (Wako Pure Chemical Industries) was added and mixed. The mixed solution became light yellow and transparent.
  • the organic gel was immersed in acetone (Wako Pure Chemical) as an exchange solvent.
  • acetone Waako Pure Chemical
  • the water in the organic gel diffuses into the acetone, and the water in the gel can be replaced with acetone.
  • the immersion solvent was changed to n-pentane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the solvent exchange immersion was repeated until the acetone power in the organic gel was completely replaced with pentane.
  • the organic gel substituted with n-pentane was air-dried to obtain a dried organic gel.
  • the obtained dried organic gel was heated at 1000 ° C. in a nitrogen stream (flow rate 300 ml / min) to carbonize the organic gel.
  • the heating time was 6 hours.
  • the electrical characteristics of the electrode were evaluated by the cyclic voltammgram method (electric potential: sweeping current between 200 and 500 mV, sweeping speed 20 mV / sec). Platinum was used for the counter electrode, and a silver / silver chloride electrode was used for the reference electrode.
  • the electrolyte a 50 mM potassium phosphate buffer ( ⁇ 7.0) saturated with oxygen was used. Furthermore, the electrical characteristics were evaluated with both the electrolyte solution and the enzyme electrode stationary.
  • Figure 3 shows the cyclic voltagram. From Fig. 3, it can be seen that the amount of current increases for both laccase and CueO in carbon gel compared to ketjen black. In particular, in the CueO / CG combination, the current density at 200 mV increased about 7 times compared to laccase / KB.
  • the electrode catalyst according to the present invention can be used as an electrode catalyst for various electrochemical devices such as biosensors and fuel cells, and solar cells.
  • the enzyme electrode according to the present invention can be used as an electrode for various electrochemical devices such as biosensors and fuel cells, and solar cells.

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Description

明 細 書
電極触媒及び酵素電極
技術分野
[0001] 本発明は、電極触媒及び酵素電極に関し、さらに詳しくは、バイオセンサー、燃料 電池などの各種電気化学デバイスの電極として用いられる酵素電極、及び酵素電極 に用いられる電極触媒に関する。
背景技術
[0002] 酵素は、生体内の化学反応（代謝)を進行させる生体触媒であり、タンパク質を基 本構造とする。酵素は、タンパク質のみからなるものもある力 その多くは、触媒活性 を発現させ又は触媒活性を高めるために、タンパク質以外の成分 (補因子）を必要と する。
酵素は、
(1)常温、常圧付近の穏和な条件で触媒作用を示し、
(2)特定の基質 (酵素によって作用を受ける物質）にのみ作用する「基質特異性」と、 特定の化学反応に対して触媒作用を示し、副反応を起こさない「反応特異性」とを併 せ持つ、
という特徴がある。
酵素の中でも、生体内の酸化還元を触媒する酵素を「酸化還元酵素 (ォキシドレド クタ一ゼ）」という。また、酸素を電子受容体として基質を酸化させる酵素を特に「酸化 酵素（ォキシダーゼ）」とレ、レ、、基質を還元させる酵素を特に「還元酵素（レダクターゼ
)」という。電極表面にある種の酸化還元酵素を固定すると、酵素の触媒作用によつ て電極上で特定の酸化還元反応のみが選択的に進行し、酸化還元反応による物質 の変化を電極により電気信号に変換することができる。このような電極は「酵素電極」 と呼ばれており、各種のバイオセンサー、燃料電池などの電極に利用されている。
[0003] 酵素を電極触媒として用いるためには、これを適当な担体表面に固定する必要が ある。し力、しながら、酵素は、一般に水溶性であるので、使用中に酵素が流出しやす いという問題がある。 また、酵素は、基質が特異的に結合し、触媒作用を受ける部位 (活性中心)を持つ ている。活性中心は、複雑な立体構造を有するタンパク質の奥深いところに埋もれて いることが多いので、電極との間で直接、電子の授受を行うのが難しい。このような場 合には、通常、酵素の活性部位まで侵入し、酵素と電子の受け渡しを行い、電極ま で電子を運ぶ低分子物質が併用される。このような低分子物質は、「メディエータ」と 呼ばれている。し力もながら、酵素/メディエータ間の電子移動速度は、それぞれの 分子運動に依存するため、必ずしも十分ではなぐ酵素電極の電流密度を制限する 要因となる可能性があった。
[0004] そこでこの問題を解決するために、従来から種々の提案がなされている。
例えば、特許文献 1には、炭素原子及び窒素原子により骨格が形成されている含 窒素炭素系材料からなる多孔体と、多孔体に担持されてレ、る酸化還元酵素とを備え た含窒素炭素系複合材料が開示されている。
同文献には、
(1) 含窒素炭素系材料は細孔表面に極性点が点在するため、これに酸化還元酵 素を担持させると、タンパク質表面の親水基との間で水素結合等の新たな結合が生 じ、タンパク質と担体との結合が強められる点、及び、
(2) 担体に担持させる酸化還元酵素として、ラッカーゼ、ジァホラーゼ、リポキシアミ ドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースォキシダーゼ（他の糖 を基質とするォキシダーゼを含む）、グルコースデヒドロゲナーゼ（他の糖を基質にす るデヒドロゲナーゼを含む）が挙げられる点、
が記載されている。
[0005] また、特許文献 2には、導電性部材と、酵素と、第 1及び第 2のメディエータとを有す る酵素電極であって、第 1のメディエータと第 2のメディエータとが担体によって、導電 性部材に固定化され、かつ第 1のメディエータと第 2のメディエータとは、互いに酸化 還元電位が異なる酵素電極が開示されて!/、る。
同文献には、
(1) このような構成を採用することによって、導電性部材の実効表面積当たりの酵 素担持密度を高くすることが可能となる点、 (2) 酵素との間で高速の電子移動を行うことが可能な第 1のメディエータに加えて、 第 1のメディエータと導電性部材間の電荷輸送を行う第 2のメディエータをさらに使用 することによって、酵素と高速の電子移動を行うことが可能になる点、及び
(3) 酵素として、グルコースォキシダーゼ、ガラクトースォキシダーゼ、ビリルビンォ キシダーゼ、ピルビン酸ォキシダーゼ、 D または L アミノ酸ォキシダーゼ、ァミン ォキシダーゼ、コレステロ一ノレォキシダーゼ、ァスコノレビン酸ォキシダーゼ、チトクロ ムォキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレス テロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ 、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナー ゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ， 17Bヒドロキシステロィ ドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール 17Bデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナー ゼ、グリセリルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ、 3—ヒドロキシステロイドデヒドロ ゲナーゼ、ジァホラーゼ、カタラーゼ、ペルォキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ
、 NADH チトクロム b5レダクターゼ、 NADPH アドレノキシンレダクターゼ、チトク ロム b5レダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸レダクターゼが挙げられる点 が記載されている。
[0006] 特許文献 1：特開 2005— 343775号公報
特許文献 2：特開 2006— 058289号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 酸化還元酵素は、一般に、基質と結合する活性中心の他に、活性中心との間で電 子の授受を行うための部位（電子伝達ゲート）を持っている。生体内における酵素へ の電子伝達は、通常、メディエータに仲介されてなされているので、酵素の電子伝達 ゲートは、タンパク質のポケット内部に埋もれていることが多い。このような状態の酵素 を電極表面に固定すると、電子伝達ゲートと電極表面の距離はどうしても大きくなる。 電子移動速度の常用対数は、距離に比例して遅くなるため、従来知られている酵素 では、高い電子伝達効率は得られない。 この問題を解決するために、特許文献 2に開示されているように、メディエータを併 用することも考えられる。し力もながら、メディエータを併用する方法のみでは、電子 伝達効率の向上に限界がある。また、十分量の電流密度が得られる酵素電極に適し た酵素が報告された例は、従来にはない。
[0008] 本発明が解決しょうとする課題は、電子伝達効率が高い酸化酵素からなる新規な 電極触媒、及びこれを用いた酵素電極を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 上記課題を解決するために本発明に係る電極触媒は、 CueOからなる。
また、本発明に係る酵素電極は、カーボン多孔体と、前記カーボン多孔体の表面 に担持された CueOからなる電極触媒とを備えている。
発明の効果
[0010] マルチ銅酸化酵素の一種である CueOを酵素電極用の触媒として用いると、従来 の酸化還元酵素に比べて高!/、電流密度が得られる。
これは、以下の理由によると考えられる。
(1) CueOは、酸化反応を触媒する活性中心と、電子伝達ゲートが酵素分子中で 分離しているために、電極固体表面に酵素を固定化しても触媒反応と電子伝達が同 時に成し遂げられる。
(2) CueOは、電子伝達ゲートがより分子表面に存在しているので、固体表面に固 定化された状態において電極との距離が小さくなり、電子移動の効率が向上する。 以上のような理由により、本発明の電極触媒は、電子伝達効率に優れ、従来の酸 化還元酵素に比べて高い電流密度が得られる。すなわち、本発明の電極触媒を固 定化した酵素電極は、電極触媒の固定化量あたりで得られる電流値が大きぐ限ら れた面積に電極触媒を固定化する場合であっても高い電流値を得ることができる。 具体的には、白金触媒を用いた電極と同等の電流密度を得ることも可能である。しか も、本発明の電極触媒を固定化した酵素電極は、少量の電極触媒の固定化であつ ても、高い電流値が得られることから、コスト削減が可能である。
さらに、本発明の電極触媒は電子伝達効率が高い、つまり、電極 電極触媒間の 電子移動速度が非常に速いため、酵素電極における電極反応の速度を向上させる ためにメディエータを用いなくても、高い電流値を得ることができる。
また、本発明の電極触媒は電子伝達効率が高ぐ電極 電極触媒間の電子移動 速度が非常に速いことから、本発明の電極触媒を固定化した酵素電極において得ら れる触媒電流は、該電極触媒の酵素活性よりも、電極への酸素供給速度により制限 される。すなわち、本発明の電極触媒を固定化した酵素電極は、安定した電極活性 を示し、安定した出力を得ることができる。従って、本発明の電極触媒を固定化した 酵素電極を用いることによって、燃料電池の出力向上、酸素検出型センサの高感度 化が可能である。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]マルチ銅酸化酵素の一種である大腸菌由来 CueOの分子構造である。
[図 2]各種マルチ銅酸化酵素を含む酵素溶液のサイクリックボルタムグラムである。
[図 3]各種カーボン担体に担持された各種マルチ銅酸化酵素を含む酵素電極のサイ
Figure imgf000007_0001
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、本発明の一実施の形態について詳細に説明する。
本発明に係る電極触媒は、 CueOからなる。
酸化還元酵素は、酸化還元反応を触媒する酵素であり、タンパク質の立体構造の 中に活性中心と、電子伝達ゲートとを持つ。「活性中心」とは、基質が特異的に結合 し、触媒作用を受ける部位をいう。「電子伝達ゲート」とは、活性中心との間で電子の 授受を行うための部位をいう。
酸化還元酵素は、基質を酸化させる酸化酵素と、基質を還元させる還元酵素に大 別される。いずれを電極触媒用酵素として使用するかは、電極の極性により異なる。 すなわち、酵素を正極側の材料として用いる場合には、反応により電子を受け取るこ とができる（換言すれば、プロトンと酸素を基質として水を生成する反応を触媒するこ とができる）酸化酵素を用いる。一方、酵素を負極側の材料として用いる場合には、 反応により電子を放出する還元酵素を用いる。
[0013] また、酸化還元酵素は、固有の三次元構造を有する巨大分子であり、活性中心や 電子伝達ゲートは、通常、三次元構造の開口部（くぼみ、割れ目）の奥に埋もれた状 態になっている。この場合、活性中心及び電子伝達ゲートは、同一の開口部にあるも のでも良ぐあるいは、異なる開口部にあるものでも良い。
これらの中でも、電子伝達ゲートを含む第 1の開口部と、活性中心を含む第 2の開 口部を備えた酸化還元酵素は、酵素が基質を触媒する際に、基質の移動が電子の 移動と干渉することがない。そのため、同一の開口部に活性中心及び電子伝達グー トを含む酵素に比べて、酵素/電極間の電子伝達効率が向上する。
特に、電子伝達ゲートを含む第 1の開口部が活性中心を含む第 2の開口部の対面 にある酸化還元酵素は、第 1の開口部を電極表面に近接させることにより電極/電 子伝達ゲート間の電子伝達を極めて円滑に行うことができる。そのため、酵素/電極 間の電子伝達効率がさらに向上する。
ここで、「第 1の開口部が第 2の開口部の対面にある」とは、第 1の開口部がある面の 法線方向と第 2の開口部がある面の法線方向とのなす角が 90° より大きいことをいう 。 2つの法線のなす角は、大きい方が好ましぐ 180° に近いほど良い。
[0014] 酸化還元酵素の中でも、マルチ銅酸化酵素は、基質から取り出した電子を用いて 分子状酸素を 4電子還元し、水を生成する反応を触媒する。マルチ銅酸化酵素は、 電子伝達ゲートとなる単核ブルー銅 (タイプ ICu)と、活性中心となる三核銅クラスタ 一（タイプ IICu、タイプ IIICu)があり、単核ブルー銅と三核銅クラスタ一は、それぞれ、 異なる開口部の内部にある。しかも、 2つの開口部は、それぞれ、タンパク質で形作ら れる立体構造の表面及び裏面にある。そのため、マルチ銅酸化酵素又はこれを遺伝 子操作により改変した改変型酵素は、バイオセンサー、燃料電池等の各種電気化学 デバイスに用いられる酵素電極の正極用の触媒として特に好適である。
マルチ銅酸化酵素としては、具体的には、ラッカーゼ、ビリルビンォキシダーゼ、ァ スコルビン酸ォキシダーゼ、セル口プラスミン、 CueO、バシラス属細菌の内生胞子コ 一トタンパク質 CotAなどがある。これらの中でも、 CueO (特に、大腸菌の銅代謝関 連ォキシダーゼ CueO (大腸菌由来 CueO) )は、これを酵素電極用の電極触媒とし て用いたときに、従来の酸化還元酵素に比べて高い電流密度が得られる。
[0015] rCueOjとは、種々の菌株から採取されるマルチ銅酸化酵素の一種を!/、う。また、「 大腸菌由来 CueO」とは、大腸菌から採取される CueOをいう。配列表の配列番号 1 に、天然型成熟 CueOのアミノ酸配列 (swissprot accession： Q8X947)を示す。
CueOは、菌株から直接採取された天然型 CueOでも良ぐあるいは、触媒活性及 び電子伝達能を消失させない範囲において、遺伝子操作により天然型 CueOのアミ ノ酸配列の一部を変更、削除等した改変型 CueOであっても良い。
[0016] 次に、本発明に係る酵素電極につ!/、て説明する。
本発明に係る酵素電極は、カーボン多孔体と、カーボン多孔体の表面に担持され た CueOからなる電極触媒とを備えている。 CueOは、特に大腸菌由来 CueOが好ま しい。これらの内、 CueO及び大腸菌由来 CueOについては、上述した通りであるの で、説明を省略する。
[0017] 酵素を担持する担体には、カーボン多孔体を用いる。カーボン多孔体は、酵素/ 電極間の電子伝達を円滑に行うことができるだけでなぐ細孔径が適切である場合に は酵素を細孔内に物理的に担持でき、し力、も酵素の失活を抑制できるので、担体とし て特に好適である。
[0018] 担持成分である酵素の安定性及び活性を十分に向上させるためには、カーボン多 孔体は、以下の [1 · ]〜[4· ]のいずれか 1以上の条件を備えているものが好ましい。
[1. 平均細孔径]
カーボン多孔体は、平均細孔径が 2〜50nmであるものが好ましい。平均細孔径は 、さらに好ましくは、 2〜20nmである。平均細孔径が 2nm未満では、細孔の大きさが 酵素の大きさよりも小さくなることが多くなり、吸着性が低下する。一方、平均細孔径 力 S50nmを超えると、比表面積の低下を招き、吸着性が低下する。また、平均細孔径 が 20nmを超えると、一部の酵素を担持する際に不都合が生じやすくなるおそれがあ また、カーボン多孔体の平均細孔径は、酵素の分子径以上が好ましい。平均細孔 径は、さらに好ましくは、酵素の分子径の;!〜 1. 25倍程度である。カーボン多孔体の 平均細孔径が前述の範囲にあると、酵素が細孔内に固定されやすくなる。酵素が細 孔内に固定されると、熱による酵素の構造変化を細孔外壁が抑制するので、熱によ る酵素の失活を抑制することができ、熱的安定性が向上する。
なお、平均細孔径とは、後述する窒素吸着等温線から求められる細孔径分布にお いて、分布ピークトップの細孔径値をいう。
[0019] [2. 細孔径分布]
カーボン多孔体は、細孔径分布領域が 2〜； !OOnmの範囲における全細孔容積を 基準として、平均細孔径の ± 25%の範囲における細孔容量が 60%以上であるもの が好ましい。細孔径の均一性がこれより悪いと、酵素の担持に最適な細孔径以外の 細孔が多くなり、酵素の安定性及び活性が不十分となるおそれがある。
[0020] [3. 比表面積]
カーボン多孔体は、比表面積が 100m2/g以上であるものが好ましい。比表面積は 、さらに好ましくは、 500〜； 1000m2/gである。カーボン多孔体の比表面積が 100m2 /g未満の場合には、酵素との接触面積の低下及び酵素を取り込む細孔の減少が 生じ、酵素の吸着性が低下する。
[0021] [4. 細孔容量]
カーボン多孔体の細孔容量は、比表面積及び平均細孔径によっても変動するため 特に限定されないが、 0.；!〜 50ml/gが好ましい。細孔容量は、さらに好ましくは、 0 . 2〜2. 5ml/gである。
また、カーボン多孔体の細孔の内、酵素の分子径以上の細孔径を有する細孔の全 容量は、担持された酵素の全体積以上が好まし!/、。
[0022] なお、カーボン多孔体の比表面積及び細孔容量は、以下に述べる一般的な容量 法測定により求めることができる。
すなわち、カーボン多孔体を容器に入れて液体窒素温度（一 198°C)に冷却し、容 器内に窒素ガスを導入して容量法によりその吸着量を求める。次いで、導入する窒 素ガスの圧力を除々に増加させ、各平衡圧に対する窒素ガスの吸着量をプロットして 窒素吸脱着等温線を得る。この窒素吸脱着等温線を用いて、 SPE (Subtracting Pore Effect)法により比表面積及び細孔容量を算出することができる（K.Kaneko, C.Ishii, M.Ruike, H. uwabara, Carbon 30， 1075， 1986)。 SPE法とは、 a s—プロット法、 t— プロット法等によってミクロ細孔解析を行い、ミクロ細孔の強いポテンシャル場の効果 を取り除いて比表面積等を算出する方法であり、ミクロ細孔性多孔体の比表面積等 の算出にぉレ、て BET法よりも精度の高!/、方法である。 また、細孔径分布及び分布ピークトップの細孔径値は、得られた窒素吸脱着等温 線から BJH解析により求めることができる（Barret E.P., Joyner L.G., Halenda P.H., J ournal of Americanし hemical society 3， 37ό, 1951)。
[0023] 上述のような条件を満たすカーボン多孔体としては、具体的には、以下のようなもの 力 sある。
[1. メソポーラスカーボン粒子]
カーボン多孔体の第 1の具体例は、メソポーラスカーボン粒子である。「メソポーラス カーボン粒子」とは、メソサイズ（2〜； !Onm)の細孔が規則配列した多孔質カーボン 材料であって、 2〜； !OOnmの細孔径分布領域における全細孔容積（S )に対する、 2
0
〜； !Onmの細孔径分布領域における全細孔容積（S)の割合（=S X 100/S )力 0
0
%以上であるものをいう。なお、このような細孔径分布は、 XRD法及び窒素吸着法に より測定すること力でさる。
[0024] [2. カーボンゲノレ]
カーボン多孔体の第 2の具体例は、カーボンゲルである。「カーボンゲル」とは、メソ サイズの細孔が不規則配列した多孔質カーボン材料であって、以下の（ィ)及び（口） の条件を満たすものをレ、う。
(ィ） スキャン領域 2 Θ =0· 5〜10° (CuKa線）において X線回折ピークが認めら れなレ、。
(口） 吸脱着等温線から計算された細孔径分布にお!/、て、
分布ピークトップの細孔径値（d)が 2nm以上 10nm未満の範囲に存在する場合に は、前記細孔径値（d)に対して d±2nmの細孔径領域に全細孔容量の 60%以上が 含まれており、
分布ピークトップの細孔径値（D)が 10nm以上 50nm以下の範囲に存在する場合 には、前記細孔径値（D)に対して（0· 75XD)〜（； 1. 25XD)nmの細孔径領域に 全細孔容量の 60%以上が含まれる。
[0025] 条件 (ィ）は、メソ細孔の規則配列の有無を表す。 X線回折ピークは、そのピーク角 度に相当する d値の周期構造が試料中にあることを意味する。従って、スキャン領域 2 Θ =0. 5〜； 10° (CuKa線）において 1本以上のピークが認められるカーボン多 孔体は、細孔が 0. 9-17. 7nmの周期で規則配列している、いわゆるメソポーラス力 一ボン（MPC)である。
一方、カーボンゲルは、スキャン領域 2 Θ =0. 5〜； 10° (CuK a線）において X線 回折ピークが認められない。これは、カーボンゲル中の細孔が周期的配列構造を有 していないことを示している。カーボンゲルは、細孔が相互に連結した 3次元的ネット ワーク構造を有している。カーボンゲルを担体として用いると、その理由の詳細は不 明であるが、メソポーラスカーボンを用いた場合に比べて、酵素の安定性及び活性が 向上する。
[0026] なお、 X線回折測定 (XRD)において、バックグラウンドノイズ強度に対するピーク強 度の比が 3未満のものは、 X線回折ピークと認めない。すなわち、「スキャン領域 2 Θ =0. 5〜； 10° (CuK a線）において X線回折ピークが認められない」とは、スキャン 領域 2 Θ =0· 5〜10° (CuK a線）において、バックグラウンドノイズ強度に対するピ ーク強度の比が 3以上の X線回折ピークが 1本も観測されないことをいう。
[0027] 条件（口）は、細孔径の均一性を表す。細孔分布が上述の範囲にあると、酵素の担 持に最適な細孔径を持つ細孔の量が多くなるので、酵素の安定性及び活性が向上 する。
[0028] カーボンゲルは、上述の（ィ）及び（口）に加えて、以下の（ハ）の条件をさらに備えて いるものが好ましい。
(ハ） カーボンゲルは、その細孔径分布において、分布ピークトップの細孔径値が 2 〜20nmであるものが好まし!/、。
カーボンゲルの細孔径値が 2nm未満では、細孔の大きさが酵素の大きさよりも小さ くなることが多いので、吸着性が低下する。一方、細孔径値が 50nmを超えると、比表 面積の低下を招き、吸着性が低下する。また、分布ピークトップの細孔径値が 20nm を超えると、酵素を担持する際に不都合が生じるおそれがある。
[0029] [3. 含窒素カーボンゲル]
カーボン多孔体の第 3の具体例は、含窒素カーボンゲルである。「含窒素カーボン ゲル」とは、その少なくとも表面近傍が含窒素炭素からなるカーボンゲルをいう。また 、「表面」とは、外表面だけでなぐ細孔の内表面も含まれる。表面近傍が含窒素炭素 力、らなるカーボンゲルは、酵素の担持量、安定性及び活性が向上するという利点が ある。
[0030] 含窒素カーボンゲル中の N原子と C原子との原子比（N/C比）は、 0. 01以上が好 ましい。 N/C比が 0. 01未満の場合、 N原子が減少し、酵素と相互作用することが 可能な吸着サイトが少なくなる。 N/C比は、さらに好ましくは、 0. 05以上である。 一方、 N/C比は、 0. 4以下が好ましい。 N/C比が 0. 4を超えると、炭素骨格の強 度が低下し、細孔構造を維持するのが困難となる。 N/C比は、さらに好ましくは、 0. 3以下である。
なお、このような含窒素炭素における N/C比は、 CHN元素分析又は XPSによつ て求めること力 Sできる。また、含窒素カーボンゲルに関するその他の点は、カーボン ゲルと同様であるので、説明を省略する。
[0031] 電極触媒である酵素は、担体の表面に担持される。 「担体の表面」とは、担体の外 表面及び細孔の内表面をいう。酵素の少なくとも一部は、細孔の内表面に担持され ているのが好ましい。細孔内に担持される酵素の量は、多いほどよい。
担体に担持される酵素の量は、酵素活性が示されれば特に制限はない。一般に、 酵素の担持量が多くなるほど高い活性が得られる。実用上十分な活性を得るために は、酵素の担持量は、カーボン多孔体 100質量部に対して 0. 01質量部以上が好ま しい。一方、酵素の担持量が過剰になると、効果が飽和し、実益がない。従って、酵 素の担持量は、カーボン多孔体 100質量部に対して 80質量部以下が好ましい。
[0032] 本発明に係る酵素電極は、上述した担体及び酵素のみからなるものでも良ぐある いは、担体にさらに、カーボン多孔体 酵素間の電子の授受を促進するメディエータ が担持されていても良い。本発明の酵素電極においては、電極触媒である酵素の電 子伝達効率が非常に高ぐ電極 酵素間の電子移動反応よりも酸素供給速度が律 速段階となる。そのため、本発明の酵素電極は、メディエータを用いなくても高い電 流値を得ることが可能である力 メディエータの使用を排除するものではなぐ必要に 応じてメディエータを用いてもょレ、。
メディエータとしては、具体的には、 ABTS、 WCNをはじめとする金属シアン化物、 Os錯体等がある。これらのメディエータは、電極表面に固定化されていることが望ま しぐこのためにポリ 1—ビュルイミダゾールのようなポリマに結合し、不溶化して用 いること力 S望ましい。さらにまた、メディエータを直接カーボン担体上に固定化しても 良い。これらのメディエータは、単独で用いても良ぐあるいは 2種以上を組み合わせ て用いても良い。
[0033] なお、本発明に係る酵素電極は、担体がシート状であるときには、電子伝導性の担 体表面に酵素 (及び、必要に応じてメディエータ）を担持させた状態のまま使用する こと力 Sできる。一方、担体が粉末状であるときには、酵素を担持した担体をさらに適当 な金属電極 (例えば、 Pt電極)表面に固定して使用することもできる。
[0034] 次に、担体に用いられるカーボン多孔体の製造方法について説明する。カーボン 多孔体の内、メソポーラスカーボン、カーボンゲル、及び含窒素カーボンゲルは、以 下のような方法により製造することができる。
[1. メソポーラスカーボンの製造方法]
メソポーラスカーボン粒子の製造方法は、特に限定されず、例えば、以下の方法に より製造すること力 Sできる。すなわち、メソ孔が規則配列したシリカ、チタニア等の多孔 質粒子（铸型）に対して、ショ糖、フルフリルアルコール等の有機分子を吸着、含浸さ せた後、不活性雰囲気下で炭素化する。その後、フッ酸や、 NaOH/EtOH等によ り铸型を溶解、除去すると、メソポーラスカーボン粒子が得られる。铸型としては、例 えば、シリカメソ多孔体 MCM— 48を使用することができる。
[0035] [2. カーボンゲルの製造方法]
カーボンゲルの製造方法は特に限定されず、例えば、以下のような方法により製造 すること力 Sでさる。
すなわち、まず、文献（R.W.Pekala, C.T.Alviso, F.M.Kong, and S.S.Hulsey, J.Non- cryst.Solids, vol.145, ρ·90(1992)参照）に記載の方法に準じて有機ゲルを合成する。 すなわち、レゾルシノール等のフエノール樹脂とホルムアルデヒド等のアルデヒド類を アルカリ触媒又は酸触媒の存在下で反応させ、熟成させてフエノール樹脂からなる 有機ゲルを得る。次に、得られた有機ゲルを乾燥させた後、不活性雰囲気下で焼成 して炭素化させることにより、カーボンゲルを得ることができる。
[0036] [3. 含窒素カーボンゲルの製造方法] 含窒素カーボンゲルを製造する方法は特に限定されず、例えば、以下のような方 法により製造することカでさる。
(A) 一酸化窒素を用!/、てカーボンゲルに N原子を導入する方法。
カーボンゲルへの N原子の導入は、例えば、文献（P.Chambrion et al.， Energy & F uels vol.11, p.681-685(1997))に記載の方法に準じて実施することが可能である。す なわち、石英反応管中にカーボンゲルを配置し、ヘリウム気流下で 950°C程度に加 熱する。その後、ヘリウムで希釈された NO (濃度 lOOOppm程度）を反応管へ導入し 、 600〜900°C程度の反応温度で反応させる。この反応に要する反応時間は特に限 定されないが、反応時間を延長すれば炭素骨格中に取り込まれる窒素の量は増加 する。
[0037] (B) 熱 CVD法によりカーボンゲル表面に含窒素炭素を析出させる方法。
この方法は、カーボンゲルの細孔内に含窒素有機化合物を導入し、その含窒素有 機化合物を熱分解させることによってカーボンゲル表面に含窒素炭素を析出させる 方法である。すなわち、まず、反応管にカーボンゲルを設置し、窒素、アルゴン等の 不活性ガスを反応管に導入しながら所定の温度まで加熱する。次に、加熱状態を維 持したまま、気体状態の含窒素有機化合物を反応管内に導入することによって、力 一ボンゲルの細孔内に含窒素有機化合物を導入させながら、所定時間の CVD反応 を行う。これによつて、カーボンゲルの細孔内に C原子及び N原子により骨格が形成 されている含窒素炭素を析出させることができる。熱 CVD法による析出工程は、反応 雰囲気が酸化雰囲気である場合には Cの燃焼が起こるため、通常、窒素、アルゴン 等の不活性雰囲気で行われる。
[0038] ここで用いられる含窒素有機化合物としては、 N原子を含む有機化合物であれば 特に制限はなぐ例えば、含窒素複素環式化合物、アミン類、イミン類、二トリル類等 が挙げられる。含窒素複素環式化合物としては、含窒素複素単環化合物及び含窒 素縮合複素環化合物が挙げられる。
含窒素単環化合物としては、 5員環化合物であるピロール及びその誘導体、ピラゾ ールゃイミダゾール等のジァゾール類及びその誘導体、並びに、 6員環化合物であ るピリジン及びその誘導体、ピリダジンやピリミジンゃピラジン等のジァジン類及びそ の誘導体、トリアジン類及び、メラミンゃシァヌル酸等のトリアジン類誘導体等が挙げ られる。
また、含窒素縮合複素環化合物としては、キノリン、フエナント口リン、プリン等が挙 げられる。
[0039] アミン類としては、第 1級〜第 3級ァミン、ジァミン類、トリアミン類、ポリアミン類、及 びァミノ化合物等が挙げられる。
第 1級〜第 3級ァミンとしては、メチルァミン、ェチルァミン、ジメチルァミン及びトリメ チルァミン等の脂肪族ァミン、並びに、ァニリン等の芳香族ァミン及びその誘導体等 が挙げられる。
ァミノ化合物としては、エタノールァミン等のァミノアルコール等が挙げられる。 イミン類としては、ピロリジン及びェチルイミン等が挙げられる。
二トリル類としては、ァセトニトリル等の脂肪族二トリル及びべンゾニトリル等の芳香 族二トリル等が挙げられる。
その他の含窒素有機化合物としては、ナイロン等のポリアミド類、ガラクトサミン等の アミノ糖、ポリアクリロニトリル糖の含窒素高分子化合物、アミノ酸及びポリイミド類等が 挙げられる。
[0040] 熱 CVD法による析出工程において、含窒素有機化合物が常温で液体状態である 場合には、バブラ、マスフローポンプ等を用い、蒸気蒸発によって含窒素有機化合 物を気体状態として反応管内に導入することができる。また、このときに窒素、ァルゴ ン等をキャリアガスとして用いて気体状態の含窒素有機化合物の導入を行うことが好 ましい。さらに、一度反応管内を流通させた気体が反応管の出口側から逆流しないよ うに、反応管出口側に流動パラフィン等を入れたバブラを設置する等して逆流を防ぐ ことが好ましい。
含窒素有機化合物が常温で固体状態である場合には、加熱蒸発 (昇華)器を反応 管入口側に設置し、加熱によって含窒素有機化合物を気体状態として反応管へ導 入すること力 Sできる。また、このときの蒸発器の温度は、含窒素有機化合物が熱分解 しない温度に調整する必要がある。
[0041] 含窒素有機化合物が重合性を有する場合には、予めカーボンゲルの細孔内で重 合させておき、その後、反応管中、不活性雰囲気下で熱分解する方法をとることもで きる。
さらに、含窒素有機化合物が加熱によって気化しないものである場合には、溶液吸 着法や蒸発乾固法等によって、カーボンゲルの細孔内に予め含窒素有機化合物を 導入し、これを不活性雰囲気下で熱分解することによって、カーボンゲルの細孔内に 含窒素炭素を析出させることができる。
[0042] 熱 CVD法による析出工程における反応温度は、含窒素有機化合物が熱分解及び 炭素化する温度であれば特に限定されないが、 300〜； 1000°Cが好ましい。反応温 度は、さらに好ましくは、 500〜700°Cである。反応温度が 300°C未満の場合には、 含窒素有機化合物の熱分解が起こりにくくなるため、含窒素炭素の析出速度が遅く なってしまい、反応時間及びエネルギー消費が大きくなる傾向がある。一方、反応温 度が 1000°Cを超える場合には、炭素骨格中に炭素が残留し難いため、 N/C比が 低下する。
[0043] 析出工程において、カーボンゲルの細孔内に析出させる含窒素炭素の析出量は、 特に制限されないが、カーボンゲル lg当たりの比表面積を Ym2とした場合、（0. 000 l XY) g以上であることが好ましい。含窒素炭素の析出量が（0. 0001 XY) g未満の 場合には、析出量が少ないため、 N原子による吸着性の向上が得られなくなるおそ れがある。
[0044] 析出量は、 CVD反応時間と相関関係があり、 CVD反応時間を調整することによつ て析出量を制御することができる。さらに、析出量は、 CVD反応温度、カーボンゲル の種類、含窒素有機化合物の種類、及び含窒素有機化合物を導入する際の流量等 によっても変化する力 それぞれの場合で CVD反応時間を適宜調整することによつ て析出量を調整することができる。
[0045] 次に、本発明に係る酵素電極の製造方法につ!/、て説明する。
まず、カーボン多孔体の表面に酵素を担持させる。酵素の担持方法は、特に限定 されるものではなぐ昇華法、含浸法等の種々の方法を用いることができるが、含浸 法が好適である。
[0046] 含浸法による酵素の担持は、以下のように行う。すなわち、まず、酵素を沈殿が生じ ない濃度（好ましくは、 0.；!〜 1000mg/ml)となるように水又は緩衝液に溶解させる 。そして、その溶液が凍結することなぐまた酵素が変性することのない温度（好ましく は、 0〜50°C)で粉末状の担体を懸濁させ、又はシート状の担体を浸漬し、酵素と担 体を接触させる。接触時間は、少なくとも 5分以上が好ましぐさらに好ましくは、 30分 以上である。これにより担体の表面又は細孔内に酵素が固定される。
溶液中に担体を懸濁させる際の濃度は特に制限されないが、 0.；!〜 1000mg/m 1程度とすることが好ましい。また、担持工程の後に、さらに遠心分離等を行って担体 を溶液と分離して取り出す工程を有していても良い。あるいは、乾燥等を行って液体 成分を除去しても良い。
[0047] 担体にメディエータを担持させる方法は、担体に酵素を担持させる方法と同様の方 法を用いること力 Sできる。また、担体に酵素と電子移動媒体とを同時に担持させても 良い。
[0048] 次に、本発明に係る電極触媒及び酵素電極の作用につ!/、て説明する。
図 1に、マルチ銅酸化酵素の一種である大腸菌由来 CueOの分子構造を示す（Sue A.Roberts et al.， PNAS, vol.99(2002)， 2766-2771)。図 1に示すように、 CueOは、タ ンパク質の立体構造の中に、電子伝達ゲートとして機能する単核ブルー銅 (タイプ IC u)と、活性中心となる三核銅クラスター（タイプ IICu、タイプ niCu)があり、単核ブルー 銅と三核銅クラスタ一は、それぞれ、異なる開口部の内部にある（片岡 邦重、生化 学、第 77巻（2005年）、第 148頁〜第 153頁）。また、 2つの開口部は、それぞれ、タ ンパク質で形作られる立体構造の表面及び裏面にある。さらに、天然型 CueOは、単 核ブルー銅の上部がヘリックス 5と呼ばれるらせん状分子で覆われている。
[0049] このような CueOを酵素電極用の電極触媒として用いると、従来の酸化還元酵素に 比べて高!/、電流密度が得られる。
その理由の詳細は不明である力 以下の理由によると考えられる。
(1) CueOは、酸化反応を触媒する活性中心と、電子伝達ゲートが酵素分子中で 分離しているために、電極固体表面に酵素を固定化しても触媒反応と電子伝達が同 時に成し遂げられる。
(2) CueOは、電子伝達ゲートがより分子表面に存在しているので、固体表面に固 定化された状態において電極との距離が小さくなり、電子移動の効率が向上する。
[0050] また、 CueOを担体に固定する場合において、所定の細孔径、細孔分布及び比表 面積を有するカーボン多孔体を用いると、高い電流密度が得られる。
これ ίま、
(1) 酵素の大半をカーボン多孔体の細孔内に固定することができるので、担体/酵 素間の電子の移動が容易になるため、及び、
(2) 細孔壁によってタンパク質の立体構造の変化が抑制されるので、熱による失活 が軽減され、熱的安定性が向上するため、
と考免られる。
また、カーボン多孔体としてカーボンゲルを用いると、高い電子伝達効率が得られ る。これは、酵素の担持に適した細孔を多量に有していること、細孔が相互に連結し た 3次元的ネットワークを形成していること等によると考えられる。
さらに、カーボン多孔体として含窒素カーボンゲルを用いると、長期間に渡って高 い電子伝達効率を維持することができる。これは、カーボンゲルに窒素を導入するこ とによって細孔内壁に極性基が導入され、タンパク質表面の親水基との間に水素結 合等の新たな結合が生じるためと考えられる。
実施例
[0051] (実施例 1、比較例 1、 2)
[1. 試験方法]
大腸菌由来 CueO (実施例 1)、ウルシ由来ラッカーゼ（比較例 1)、又は、 Myrotheci umu sp.由来ビリルビンォキシダーゼ（BOD) (比較例 2)をリン酸緩衝液（0· 05M、 p Η7· 0)に溶解し、 8 11 Μの酵素溶液を調製した。
あらかじめ酸素を飽和させておいた上記酵素溶液を用いて、 HOPG (highly orient ede pyrolytic graphite)電極を作用極としてサイクリックボルタムグラム法（電位： 50 〜650mV、掃引速度： 20mV/sec)により、酵素と電極間の直接電子移動特性を 評価した。対極には白金電極を、参照極には銀/塩化銀電極を用いた。
[0052] [2. 結果]
図 2に、サイクリックボルタムグラムを示す。図 2より、ラッカーゼ（比較例 1)及び BO D (比較例 2)の静止状態における OVの酸化電流密度は、 500 μ A/cm2以下で あるのに対し、大腸菌由来 CueOの静止状態における 0Vの酸化電流密度は、約 2 000 11 A/cm2であることがわかる。
[0053] (実施例 2、 3、比較例 3、 4)
[1. カーボンゲルの作製]
レゾルシノール 5. 5g (和光純薬）及び炭酸ナトリウム 26. 5mg (和光純薬）を蒸留 水 16. 9gに溶解させ、その後 37%ホルムアルデヒド溶液 8. lg (和光純薬）を加えて 攪拌混合した。混合溶液は、薄黄色透明となった。なお、各成分のモル比は、レゾル シノール：炭酸ナトリウム：ホノレムァノレデヒド = 200： 1： 400である。
次に、得られた原液に水を加えて、体積比で 2倍に希釈した。希釈した溶液をバイ アル瓶に入れて密栓し、室温で 24時間、 50°Cで 24時間、さらに 90°Cで 72時間静 置し、水和された有機ゲルを得た。
[0054] 次に、有機ゲル中の水分を除去するために、交換溶媒であるアセトン（和光純薬） 中に有機ゲルを浸漬した。有機ゲルをアセトン中に浸漬すると、有機ゲル中の水分 がアセトン中に拡散し、ゲル中の水分をアセトンに置換することができる。水分の拡散 が飽和したところで、アセトンを新品に交換する操作を数回繰り返し、ゲル中の水分 を完全にアセトンに置換した。次いで、浸漬溶媒を n ペンタン (和光純薬）に変更し 、有機ゲル中のアセトン力 ¾ ペンタンに完全に入れ替わるまで、溶媒交換 浸漬を 繰り返した。さらに、 n ペンタンに溶媒置換された有機ゲルを風乾させ、乾燥有機ゲ ルを得た。
得られた乾燥有機ゲルを窒素気流下（流量 300ml/min)、 1000°Cで加熱し、有 機ゲルを炭化させた。加熱時間は、 6時間とした。
[0055] [2. 酵素電極の作製]
5%PDVF (Polyviniylidine Difluoride)を含有する NMP (N-Methyl-pyrrolidone)溶 液に 6. 7%量のカーボンゲル (実施例 2)あるいはケッチェンブラック（実施例 3)を懸 濁したスラリーを調製し、直径 6mmのグラッシ一カーボン電極（BAS社製、型番： 00 2012)表面に上記スラリーを添力 P、スピンコート（3000rpm)してカーボン担体を電 極表面にコートした。得られたカーボン修飾電極を大腸菌由来 CueO水溶液（12. 5 mg/ml)に 4°Cで 1晚浸漬することにより、酵素をカーボン修飾電極に固定化した。 また、同様の手順に従い、ウルシ由来ラッカーゼをカーボンゲル（比較例 3)あるい はケッチェンブラック（比較例 4)修飾電極に固定した。
[0056] [3. 試験方法]
[2. ]で得られた各種酵素電極を作用電極として、サイクリックボルタムグラム法（電 位： 200〜500mVの間で電流掃引、掃引速度 20mV/sec)により電極の電気特性 を評価した。対極には、白金を用い、参照極には、銀/塩化銀電極を用いた。電解 質には、酸素を飽和させた 50mMリン酸カリウム緩衝液（ρΗ7· 0)を用いた。さらに、 電気特性の評価は、電解液及び酵素電極の双方を静止させた状態で行った。
[0057] [4. 結果]
図 3に、サイクリックボルタムグラムを示す。図 3より、ケッチェンブラックに比べ、カー ボンゲルでは、ラッカーゼ、 CueO共に電流量が増加することがわかる。特に、 CueO /CGの組み合わせでは、 200mVでの電流密度は、ラッカーゼ/ KBに比べて約 7 倍に増加した。
[0058] 以上、本発明の実施の形態について詳細に説明した力 本発明は上記実施の形 態に何ら限定されるものではなぐ本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改変 が可能である。
産業上の利用可能性
[0059] 本発明に係る電極触媒は、バイオセンサー、燃料電池等の各種電気化学デバイス 、太陽電池等の電極触媒として使用することができる。
また、本発明に係る酵素電極は、バイオセンサー、燃料電池等の各種電気化学デ バイス、太陽電池等の電極として使用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] CueOからなる電極触媒。
[2] 前記 CueOは、大腸菌由来 CueOである請求の範囲第 1項に記載の電極触媒。
[3] カーボン多孔体と、
前記カーボン多孔体の表面に担持された CueOからなる電極触媒と
を備えた酵素電極。
[4] 前記 CueOは、大腸菌由来 CueOである請求の範囲第 3項に記載の酵素電極。
[5] 前記カーボン多孔体は、以下の（ィ)及び（口）の条件を満たすカーボンゲルである 請求の範囲第 3項に記載の酵素電極。
(ィ）スキャン領域 2 Θ = 0· 5〜10° (CuK a線）において X線回折ピークが認められ ない。
(口）吸脱着等温線から計算された細孔径分布にお!/、て、
分布ピークトップの細孔径値（d)が 2nm以上 lOnm未満の範囲に存在する場合に は、前記細孔径値（d)に対して d ± 2nmの細孔径領域に全細孔容量の 60%以上が 含まれており、
分布ピークトップの細孔径値（D)が lOnm以上 50nm以下の範囲に存在する場合 には、前記細孔径値（D)に対して（0· 75 X D)〜（； 1. 25 X D) nmの細孔径領域に 全細孔容量の 60%以上が含まれる。
[6] 前記カーボン多孔体—前記 CueO間の電子の授受を促進するメディエータをさら に備えた請求の範囲第 3項から第 5項までのいずれかに記載の酵素電極。
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