WO2008029601A1

WO2008029601A1 - Agent thérapeutique cancéreux comprenant un ligand pour la molécule (fm4) du récepteur 2 de neuromédine u en tant qu'ingrédient actif

Info

Publication number: WO2008029601A1
Application number: PCT/JP2007/065904
Authority: WO
Inventors: Naoki Kimura
Original assignee: Forerunner Pharma Research Co., Ltd.
Priority date: 2006-08-16
Filing date: 2007-08-15
Publication date: 2008-03-13
Also published as: EP2052739A4; CA2656227A1; EP2052739A1; JPWO2008029601A1; US20100298234A1

Description

明細書

ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドを有効成分として含む癌治療剤

技術分野

[0001] 本発明は癌の診断および治療方法、ならびに細胞増殖抑制剤および抗癌剤に関する。

背景技術

[0002] ニューロメジン U (neuromedin U；以下本明細書中においては「NmU」と指称される。）は、 1985年に豚の脊髄より平滑筋収縮活性を指標に単離された 23アミノ酸よりなる生理活性ペプチドである（非特許文献 1)。強力な子宮収縮作用を有することから、 Ut erus (子宮）の Uをとつてニューロメジン Uと命名された。し力もながら、構造的に他の生理活性ペプチドとは相同性がなぐその生理作用は、発見から 15年間もの間ほとんど解明されていなかった。

[0003] 2000年になり、 NmUが、ォーファン GPCRであった FM3と FM4の内因性のリガンドであることが複数のグループによって相次いで発表された。これを機に、 NmUの生理作用が次第に明らカ、にされるようになった（非特許文献 2〜7)。

[0004] NmUは脳内、および消化管に発現する。特に脳内においては、視床下部弓状核や室傍核など限局した部位に NmU産生ニューロンが存在して!/、る。 NmUのラット脳室内投与実験により、喑期と絶食後の摂餌量の減少（非特許文献 3)、および、 NmU-KO マウスにおける過食、運動量低下、代謝活動低下、不規則な摂餌行動に伴う肥満、高脂血症、脂肪肝が観察されている（非特許文献 8)。一方、抗 NmU IgG抗体の脳室内投与によって接餌量の優位な増加が観察されて!/、る（非特許文献 2)。これらの知見から、 NmUは摂食抑制とエネルギー消費の亢進をもたらす内因性生理活性ぺプチドとして機能して!/、ると考えられて!/、る。

[0005] NmUの受容体として、まず NmUIR (FM3/GRP66)がクローニングされ、つ!/、で NmU2 R (FM4)が二番目の受容体としてクローニングされた。 FM3と FM4の間のアミノ酸配列の相同性は約 50%であるが、生体内における両者の発現パターンは大きく異なる。 F M3は、ヒト生体内においては小腸、胃、勝臓、心臓など末梢組織で広範な発現が観察されているが、脳での発現は観察されていない。対照的に FM4は、脳内の限局した部位でのみ発現が観察されており、末梢組織では精巣以外の組織では検出されていない（非特許文献 9)。

[0006] NmUは、 FM3および FM4を強制発現させた CHO、 HEK_293、および COS-7細胞に対して、ナノモル単位の濃度で細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を引き起こす。このことから、 NmUは受容体を介して細胞内にシグナルを伝達しており、その結果として細胞に何らかの生理活性を誘導していると考えられる。

[0007] FM3に関しては、ヒト急性骨髄性白血病細胞株 (AML)細胞株である K562細胞で、内在性に NmUと FM3が発現して!/、ることが報告されて!/、る。また K562を用いた実験により、 NmUの FM3を介したオートクラインシグナル力 562細胞に細胞増殖を誘導することが明らかにされて!/、る (非特許文献 10)。

[0008] 一方、 FM4に関しては、癌細胞などヒト由来細胞株での発現の報告がないため、 F M4を介した NmUシグナルによって引き起こされる生理活性に関しては解析されていない。同様に、 CHO細胞などを用いた FM4強制発現株によるシグナル解析もなされていない。このように、 FM4を介した NmUの細胞に対する生理活性は全く明らかにされていない。

[0009] なお、本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。

非特許文 l¾ l： N. Minamino, . Kangawa and H. Matsuo. Neuromedin U_8 and U-25 ： Novel uterus stimulating and hypertensive peptides identified in porcine spinal cor d. Biochem. Biophys. Res. Commun. 130 ( 1985) 1078—1085·

非特許文献 2 : M. ojima, R. Harunoa, M. Nakazato, Y. Date, N. Murakami, R. Han ada, H. Matsuo and . Kangawa. Purification and Identification of Neuromedin U as an Endogenous Ligand for an Orphan Receptor GPR66 (FM3) Biochem. Biophys. R es. Commun. 276，（2000) 435-438.

非特許文献 3 : Howard AD, Wang RP, Pong SS, Mellin TN, Strack A, Guan XM, Zen g ΖΔ, Williams DL, Feighner SD， Nunes CN, et al. Identification of receptors for neu romedin U and its role in feeding. Nature 406 (2000) 70-74. 非特許文献 4： Szekeres PG， Muir AI, Spinage LD， Miller JE， Butler SI, Smith A， Ren nie GI， Murdock PR, Fitzgerald LR， Wu HL， et al. Neuromedin U is a potent agonist at the orphan G protein-coupled receptor FM3. J Biol Chem 275 (2000) 20247-20 250.

^特許文献 5 : R. Fujii, M. Hosoya, S. Fukusumi, Y. Kawamata, Y. Habata, S. Hinum a, H. Onda, O. Nishimura and M. Fujino. Identification of neuromedin U as the cogn ate ligand of the orphan G protein-coupled receptor FM_3. J. Biol. Chem. 275 (200 0) 21068-21074.

非特許文献 6 : Hosoya M， Moriya T， Kawamata Y， Ohkubo S， Fujii R， Matsui H， Shi ntani Y， Fukusumi S， Habata Y， Hinuma S， et al. Identification and functional charac terization of a novel subtype of neuromedin U receptor. J Biol Chem 275 (2000) 29 528-29532.

非特許文献 7 : Raddatz R， Wilson AE， Artymyshyn R， Bonini JA， Borowsky B， Botej u LW， Zhou SQ， Kouranova EV， Nagorny R， Guevarra MS, et al. Identification and characterization of two neuromedin U receptors differentially expressed in peripheral tissues and the central nervous system. J Biol Chem 275 (2000) 32452-32459. 非特許文献 8 : Hanada R， Teranishi H， Pearson JT, Kurokawa M， Hosoda H， Fukushi ma N， Fukue Y， Serino R， Fujihara H， Ueta Y， Ikawa M， Okabe M， Murakami N， Shi rai M， Yoshimatsu H， Kangawa K， Kojima M. Neuromedin U has a novel anorexigeni c effect independent of the leptin signaling pathway. Nat Med. 10 (2004) 10b /_73. 非特許文献 9 : Paul J. Brighton, Philip G. Szekeres and Gary B. Willars. Neuromedin

U and Its Receptors: Structure, Function, and Physiological Roles. Pharmacol Rev 56 (2004) 231-248

非特許文献 10 : Shetzline SE， Rallapalli R， Dowd KJ， Zou S， Nakata Y， Swider CR， K alota A， Choi JK, Gewirtz AM. Neuromedin U: A Myb- regulated autocrine growth fa ctor for human myeloid leukemias. Blood. 104 (2004) 1833-40.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0010] 本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドとその用途を提供することを課題とする。より詳細には、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドを用いた癌を治療する新規方法、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドを含む新規な細胞増殖抑制剤および抗癌剤を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明者はニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子が勝臓癌などの癌細胞で高発現していることを見出した。さらに本発明者は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドによる勝臓癌などの癌細胞に対する増殖抑制効果を測定したところ、当該リガンドが癌細胞増殖抑制効果を有すること、及び、当該効果が FM4分子を介したシグナルにより生じることを見出した。また本発明者は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドによる勝臓癌などの癌細胞に対するコロニー形成抑制効果を評価したところ、当該リガンドがコロニー形成抑制効果を有すること、及び、当該効果が FM4分子を介して引き起こされていることを見出した。さらに本発明者は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドによる勝臓癌などの癌細胞に対する細胞運動抑制効果を評価したところ、当該リガンドが細胞の運動抑制効果を有すること、及び、当該効果が FM4分子を介して引き起こされていることを見出した。以上の知見により、本発明者は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドが勝臓癌をはじめとしたニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子が発現亢進する癌の治療 '転移の予防に有効であることを見出して、本発明を完成させた。

[0012] 即ち、本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明はより具体的には、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドを有効成分として含有する細胞増殖抑制剤を提供する。更に本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドを有効成分として含有するコロニー形成抑制剤を提供する。本発明はまた、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドを有効成分として含有する細胞運動抑制剤を提供する。本発明はまた、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドを有効成分として含有する癌治療剤を提供する。更に本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドを有効成分として含有する癌転移抑制剤を提供する。

[0013] 本発明における上記薬剤において、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドは、好ましくは天然又は人工のリガンドであり、更に好ましくは天然のリガンドである。また、特に好ましい天然リガンドとしてはヒト由来のリガンドが挙げられ、更に好ましいリガンドとしてはニューロメジン U及びニューロメジン Uと実質的に同一のァゴ二スト活性を有するペプチドが挙げられる。このようなペプチドの一例として、 GenBan k番号 P48645 (配列番号： 14)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド及び当該アミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一のペプチドを挙げることができる。また、当該抗癌剤の対象とする特に好適な癌種として勝臓癌を挙げることができる。

[0014] 別の態様においては、本発明は、癌診断マーカーとしてのニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子の使用を提供する。

[0015] 別の態様においては、本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子を発現する細胞とニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドとを接触させることによりニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子を発現する細胞の細胞増殖を抑制する方法を提供する。更に別の態様においては、本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM 4)分子を発現する細胞とニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドとを接触させることによりニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子を発現する細胞のコロニ一形成を抑制する方法を提供する。また別の態様においては、本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子を発現する細胞とニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドとを接触させることによりニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子を発現する細胞運動を抑制する方法を提供する。

[0016] 上記本発明の方法において、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドは、好ましくは天然又は人工のリガンドである。また、ニューロメジン U受容体 2 (FM 4)分子を発現する細胞は、好ましくは癌細胞であり、更に好ましくは勝臓癌細胞であ

[0017] 更に別の態様としては、本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を指標とした、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。すなわち本発明は、以下〔1〕〜〔28〕を提供するものである。

〔1〕配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌治療剤、

〔2〕リガンドが配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする〔1〕に記載の癌治療剤、

〔3〕癌が勝臓癌である〔1〕又は〔2〕に記載の癌治療剤、

〔4〕配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌転移抑制剤、〔5〕リガンドが配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする〔4〕に記載の癌転移抑制剤、〔6〕癌が勝臓癌である〔4〕又は〔5〕に記載の癌転移抑制剤、

〔7〕配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む細胞増殖抑制剤、

〔8〕リガンドが配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする〔7〕に記載の細胞増殖抑制剤、

〔9〕細胞が勝臓癌細胞である〔7〕又は〔8〕に記載の細胞増殖抑制剤、

〔10〕以下の（a)から（c)の工程を含む、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスタリーニング方法：

(a)配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、

(b)工程 (a)の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、

(c)被検物質を接触させてレ、な!/、場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程、

〔11〕以下の（a)から（c)の工程を含む、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスタリーニング方法：

(c)ニューロメジン Uを接触させた場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程、

〔12〕細胞が組換え細胞であることを特徴とする〔10〕又は〔11〕に記載の方法、〔13〕組換え細胞が CHO又は PANC1由来の細胞であることを特徴とする〔12〕に記載の方法、

〔14〕細胞刺激活性が細胞内 Ca²⁺濃度増加活性である、〔10〕から〔13〕のいずれかに記載の方法、

〔15〕細胞刺激活性が細胞増殖抑制活性である、〔10〕から〔13〕の!/、ずれかに記載の方法、

〔16〕細胞刺激活性が細胞のコロニー形成抑制活性である、〔10〕から〔13〕のいずれかに記載の方法、

〔17〕細胞刺激活性が細胞の細胞運動抑制活性である、〔10〕から〔13〕の!/、ずれかに記載の方法、

〔18〕〔10〕から〔17〕のいずれかに記載の方法より取得されたリガンド、

〔19〕癌の診断方法であって、

標本の生物試料における配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルを検出する工程を含み、

正常組織と比較して、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルが上昇している場合に、癌と診断される方法、

〔20〕検出が、配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、それと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらの断片をプローブとして用いて行われる、〔19〕に記載の方法、

〔21〕ポリヌクレオチドが配列番号： 13に記載の塩基配列を含むことを特徴とする〔20 〕に記載の方法、

〔22〕癌が勝臓癌である〔19〕から〔21〕のいずれかに記載の方法、

〔23〕配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法

〔24〕配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌の転移を抑制する方法、

〔25〕配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、細胞の増殖を抑制する方法、

〔26〕癌治療剤の製造における、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリぺプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用、

〔27〕癌転移抑制剤の製造における、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用、

〔28〕細胞増殖抑制剤の製造における、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。

図面の簡単な説明

[図 la]図 laは、 GeneChipによる解析結果を示すグラフである。図 laは、ヒト組織における NmUの発現比較を示す。

[図 lb]図 lbは、 GeneChipによる解析結果を示すグラフである。図 lbは、ヒト由来の癌細胞株における NmUの発現比較を示す。

[図 2]図 2は、 NmUとその受容体遺伝子 NmU-Rの RT-PCRによる発現解析の結果を示す写真である。図 2 (A)は、勝臓癌細胞及び正常組織における NmU遺伝子、及び g3pdh (インターナルコントロール)遺伝子の発現比較を示す。図 2 (B)は、勝臓癌細胞及び正常組織における 2種類の NmU_R (FM3, FM4)の発現比較を示す。 [図 3]図 3は、 CHO細胞、 FM4発現 CHO細胞（FM4-CHO)の NmU刺激に対する反応性を細胞内 Ca²⁺濃度変化により解析した結果を示すグラフである。

[図 4]図 4は、 NmUの細胞増殖への影響を示すグラフである。図 4 (A)は、 FM4発現 CHO細胞（FM4-CHO)における NmUの細胞増殖への影響を示す。図 4 (B)は、 2種類の勝臓癌細胞（PANC-1, CAPAN-1)における NmUの細胞増殖への影響を示す。

[図 5]図 5は、 FM4発現 PANC1細胞（FM4-PANC1)における FM4遺伝子の発現を RT-PCRにより解析した結果を示す写真である。

[図 6]図 6は、 NmU刺激による PANC1細胞、 FM4発現 PANC1細胞（FM4-PANC1) の NmUに対する反応性を細胞内 Ca²⁺濃度変化により解析した結果を示すグラフであ

[図 7]図 7は、 FM4発現 PANC1細胞（FM4-PANC1)のコロニー形成に対する NmU の抑制作用の解析結果を示す写真及びグラフである。図 7 (A)は、コロニーを示す写真である。図 7 (B)は、 NmU添加によるコロニー数の変化をグラフ化したものである。

[図 8]図 8は、 FM4発現 CHO細胞（FM4-CHO)の形態の変化を示す写真である。

[図 9]図 9は、 NmUの細胞運動に対する影響を示す写真である。図 9 (A)は、 NmU刺激による CHO細胞の細胞運動に対する影響を示す写真である。図 9 (B)は、 NmU刺激による FM4発現 CHO細胞（FM4-CHO)の細胞運動に対する影響を示す写真である。

〔発明の実施の形態〕

1.ニューロメジン U¾容体 2 (FM4)及びこれをコードする遺伝子

天然のニューロメジン U受容体 2 (FM4)のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれ GenBank番号 NP_064552 (配列番号： 12)及び NM_020167 (配列番号： 11)に開示されている。本発明においてニューロメジン U受容体 2 (FM4) ( 以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）とは、配列番号： 12に記載のァミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを意味する。配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドとしては、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片が挙げられる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)の断片とは、天然のニューロメジン U受容体 2 (F M4)タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質と実質的に同等の機能又は活性を有するポリペプチドを意味する。天然のニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質と実質的に同等の機能又は活性としては、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。

[0020] また、本発明におけるニューロメジン U受容体 2 (FM4)と機能的に同等なポリぺプチドとして、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチドも挙げることが出来る。すなわち、本発明におけるニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)と機能的に同等なポリペプチドのより具体的な態様としては、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号： 11に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。

[0021] あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T， Mizuno, T， Ogasahara, Υ ， and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber metho d for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、 Zoller, MJ, and Smith, M.(198 3) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors .Methods Enzymol. 100， 468-500、 ramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer, B, Pfl ugfelder,M, and

The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide -directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、 Kramer W, and fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dupl ex DNA Methods. Enzymol. 154， 350—367、 unkel,TA(1985) Rapid and efficient site -specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 4 88-492)などを用いて、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)と機能的に同等な変異体を調製すること力 Sできる。また、タンパク質中のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)のアミノ酸配列（配列番号： 12)にお!/ヽて 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。

[0022] アミノ酸残基を改変する場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（ A、 I、し、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水十生アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、月旨肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R、 K、 Η)、及び、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。これらの各グループ内のアミノ酸の置換を保存的置換と称す。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個（好ましくは、；!〜 10個程度、より好ましくは 1〜5個程度）のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al. , Proc.Natl.Acad. Sci.USA (1984)81 : 5662-6 ; Zoller, M. J. and Smith, M. , Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-500; Wang, A. et al. , Science(1984)224: 1431-3; Dalbadie- McFarland, G. et al. , Proc.Natl.Acad . Sci.USA ( 1982)79 :6409- 13) このような変異体は、本発明のタンパク質のアミノ酸配歹 IJと少なくとも 70%、より好ましくは少なくとも 75 %、より好ましくは少なくとも 80%、さらに好ましくは少なくとも 85 %、さらにより好ましくは少なくとも 90%、そして、最も好ましくは少なくとも 95 %のアミノ酸配列の同一性を有する。本明細書において配列の同一性は、配列同一性が最大となるように必要に応じ配列を整列化し、適宜ギャップ導入した後、元となったタンパク質のアミノ酸配列の残基と同一の残基の割合として定義される。アミノ酸配列の同一性は、上述の方法により決定することができる。なお、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、例えば後述の Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST (Proc.Natl.Acad. Sci.USA(1993)90: 5873-7)によって決定することができる

〇

[0023] 一方、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNA (以下、本発明の DNAと略記する場合がある）としては、前述したニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNA及びそれと機能的に同等な DNAが挙げられる。ニューロメジン U受容体 2 (F M4)をコードする DNAの具体的な態様としては、配列番号： 11に記載の DNAが挙げられる。また、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNAと機能的に同等な DNAとしては、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)の断片をコードする塩基配列を含有するものであって、適当な細胞中で発現させた際にニューロメジン U受容体 2 (F M4)と実質的に同質の機能又は活性 (例、リガンド結合活性、シグナル伝達作用など）を有するものが挙げられる。このような DNAのより具体的な態様としては、配列番号： 11に記載の DNAの断片が挙げられる。

[0024] また本発明におけるニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNAと機能的に同等な DNAとして、配列番号： 11に記載の塩基配列を含む DNAと同等の生物学的活性を有するポリヌクレオチドを挙げることも出来る。すなわち、本発明における二ユーロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNAと機能的に同等な DNAのより具体的な態様として、配列番号： 11に記載の塩基配列において 1若しくは複数の塩基が置換、欠失、揷入、および/または付加した塩基配列からなる DNA、または、配列番号： 11に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズする DNAであって、配列番号： 11に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする DNAが挙げられる。

[0025] 本発明の DNAは、上記の要件を備えれば、ゲノム DNA、ゲノム DNAライブラリー、前記した細胞 ·組織由来の cDNA、前記した細胞 ·組織由来の cDNAライブラリー、合成 DNAのいずれでもよい。適当な細胞中で発現する際に使用するベクターは、バタテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。

[0026] 本発明のタンパク質及び DNAは、例えば、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)の発現系を用いた受容体結合アツセィを行う際に有用である。ニューロメジン U受容体 2 ( FM4)の発現系を用いた受容体結合アツセィ系を用いることによって、ヒトゃ哺乳動物に特異的なニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドをスクリーニングすること力 Sできる。当該スクリーニングによって得られたリガンドは、各種疾病の予防'治療斉 IJなどとして使用すること力 Sできる。 [0027] ニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNA及びそれと機能的に同等な D NAは、本発明のタンパク質をコードする DNAの塩基配列の部分塩基配列を含有する合成 DNAプライマー、及び、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)を発現する細胞.組織より mRNAを含む RNA画分を調製したものを铸型として用いて、直接 Reverse Tra nscriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と指称する。 )によって増幅すること力でさる。

[0028] 具体的には、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNA及びそれと機能的に同等な DNAとしては、例えば、配列番号： 11に記載の塩基配列を含む DNAなどが用いられる。また、当該塩基配列の一又はそれ以上の何れかの塩基に付カロ、欠失又は置換がされた DNAであっても、適当な細胞中で発現させた際にニューロメジン U受容体 2 (FM4)と実質的に同質の機能又は活性 (例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するものであれば好適に使用することができる。又、当該合成 DNAプライマーとしては配列番号： 7、 8、 9及び 10のいずれかに記載の塩基配歹 IJを含む DNAを好適に用いることができる力これに限定されるものではない。即ち、適当な細胞中で発現させた際にニューロメジン U受容体 2 (FM4)と実質的に同質の機能又は活性 (例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など)を有するニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNAを増幅することができれば、何れの配列であっても好適に使用できる。特定配列を有する合成 DNAプライマーは、半自動化された機械（例えば、 PE Applied Biosytems社製 Models 392/394など）を用いて固相合成法により作成することができる。

[0029] ニューロメジン U受容体 2 (FM4)を完全にコードする DNAを当該 PCR法によって増幅する際には、铸型としてニューロメジン U受容体 2 (FM4)を発現する細胞から取得した複数種の mRNAを含む RNAライブラリーを好適に使用することができる。ニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)を発現する細胞としては特に限定されな!/、が黒質、延髄、橋網様体、脊髄、視床、海馬、視床下部、大脳皮質、精巣の組織から由来する細胞の他、本発明に係る癌細胞株、好ましくは勝臓癌細胞株である Capan-1、 Capan -2、 CFPAC1、 HPAF II、 AsPC、 MPANC96,又は su.86.86等を好適に用いることができる。 RNAの単離は、公知の方法、例えば、グァニジン超遠心法 (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18， 5294—5299，（1979》、 AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N ·， Anal. Biochem. 162， 156-159， (1987》等により全 RNAを調製することができる。このように調製した全 RNAから mRNA Purification Kit (Pharmacia社）等を使用して mR NAを精製すること力 Sできる。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia社）を用いることにより、上記記載のニューロメジン U受容体 2 (FM4)を発現する細胞から mRNAを直接調製することもできる。

[0030] 上記に記載した RNAライブラリーの他には当該 RNAライブラリーから作成された c DNAライブラリーも好適に用いることができる。得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAライブラリーを合成する。 cDNAライブラリーの合成は、 AMV Reverse Tra nscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業社）等を用いて行うことができる。また、 5'- Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)および Polymerase chain reacti on (以下、 PCR法と指称する）を用いた 5'_RACE法 (Frohman, M. A. et al., ProcNatl .Acad.Sci.U.S.A. (1988) 85， 8998-9002， (1988); Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17， 2919-2932, (1989》に従い、 cDNAライブラリーの合成および増幅を行うことができる。そのような cDNAライブラリ一は市販の cDNAライブラリーから入手することもできる。

[0031] また好適なベクターに組み込んで作成した cDNAライブラリーの中から、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする cDNAを含有する cDNAのクローンをハイブリダィゼーシヨンによって選別することができる。当該ハイブリダィゼーシヨンの際には、例えば配列番号： 5又は 6に記載のオリゴヌクレオチドの他、配列番号： 11に記載されるポリヌクレオチド配列、またはこれと相補的な塩基配列中の連続する少なくとも 15塩基、好ましくは少なくとも 30塩基、より好ましくは少なくとも 50塩基の配列を有し、多くとも 2000塩基、好ましくは多くとも 1000塩基、より好ましくは多くとも 500塩基の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することが出来る。若しくは配列番号： 11に記載されるポリヌクレオチド配列、またはこれと相補的な塩基配列が好適に用いられる。これら DNAの合成方法は上記記載の方法が好適に使用できる。当該 cDNAライブラリ一の作成方法、当該プローブの標識方法、ハイブリダィゼーシヨンの反応条件、その他当該ハイブリダィゼーシヨンの際に用いる方法は、モレキュラー 'クローニング（Mol ecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載された方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。

[0032] ハイブリダィゼーシヨンの用語は、 DNAまたはこれに対応する RNA力 S、溶液中でまたは固体支持体上で、別の DNAまたは RNA分子と水素結合相互作用により結合することを意味する。このような相互作用の強さは、ハイブリダィゼーシヨン条件のストリンジエンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性によって、種々のストリンジエンシーのハイブリダィゼーシヨン条件を用いることができる。ストリンジエンシーは、塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節すること力 Sできる。そのようなストリンジエンシーの調節方法は当該技術分野においてよく知られており、上記モレキユラ一 ·クローユングに記載されている。

[0033] ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件とは、 50%ホルムアミドの存在下で、 7 OOmMの NaCl中 42°C、またはこれと同等の条件をいう。ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件の一例は、 50%ホルムアミド、 5XSSC、 50mM NaH PO

2 4、 pH6.

8、 0. 5%SDS、 0. lmg/mL超音波処理サケ精子 DNA、および 5Xデンハルト溶液中で 42°Cにて終夜のハイブリダィゼーシヨン； 2XSSC、 0. 1 %SDSで 45°Cでの洗浄；および 0. 2XSSC、0. 1 %SDSで 45°Cでの洗浄である。

[0034] 2. の Iff ¾ ぴ Ifffflffl.成,

本発明によれば、上記記載に基づき取得されたニューロメジン U受容体 2 (FM4) 分子をコードする DNAを用いて、勝臓癌を始めとする癌細胞を診断することが可能となる。即ち本発明は、被検患者からバイオプシー等により採取された組織片、血液、細胞その他の被検試料を使用して、係る被検試料中の癌細胞の存在を診断する方法を提供する。また本発明は、癌細胞の存在を検出するための組成物、すなわち、癌の診断用組成物を提供する。具体的には、本発明の診断用組成物は、配列番号： 11に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（ニューロメジン U受容体 2 (FM4 )をコードする DNA)を増幅することができる 1組のプライマーを含んでいてもよい。さらに本発明は、配列番号： 11に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（ニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNA)を増幅することができるプライマーを提供する。このようなプライマーとしては、配列番号： 15に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このようなプライマーを用いて、上記記載の方法により被検試料から抽出された RNA若しくは当該 RNAより調製された cDNAをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)を行うことにより、目的とする配列を増幅することが出来る。そして、被検試料中のニューロメジン U受容体 2 (FM4)の転写産物の存在または量的変化を検出することができる。このような PCR手法は当該技術分野においてよく知られており、列えば、 "PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications "， Academic Press, Michael， et al.， eds. 1990に記載されている。

[0035] 被検試料中のニューロメジン U受容体 2 (FM4)の転写産物の存在量またはその変化量をより定量的に測定する方法としては、例えば定量的 RT— PCRなどが挙げられる。定量的 RT— PCR法は、 PCRの反応に使用する機器であるサーマルサイクラ一と分光蛍光光度計を一体化した機器を用いて PCRでの増幅産物の生成の過程をリアルタイムで検出し、解析する方法である。内部標準（internal standard)を用いた定量的 PCRを行うには、同じ増幅効率のものについて指数関数的な増幅が起こっているところで増幅産物の量を比較することが必要である力定量的 RT— PCR法では増幅産物の生成の過程を連続して見ることができるため、より正確な定量が可能である。このような定量的 PCRのキット、測定機器からなるシステムは市販されており（例えば Bio-Rad社の" i Cycler iQ Real-Time PCR System"等）、当該システムやキットに付属のマニュアルに従って使用することができる。内部標準としては g3pdh (グリセノレアルデヒド脱水素酵素）や ACT (ァクチン）をコードする DNAを好適に使用できる。

[0036] プライマーとして好適に用いるためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号： 11に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の、連続する少なくとも 12 塩基以上、好ましくは 12— 50塩基、より好ましくは 12— 20塩基の配列を有する。より好ましくは、配列番号： 5又は 6に記載のオリゴヌクレオチドを挙げることができる。

[0037] また、細胞内に発現している DNAおよび/または RNAを可視的に検出する手法である生体内ハイブリダィゼーシヨン（in situ hybridization)法も好適に使用することができる。組織切片や細胞標本などに、標識したプローブを反応させることによって、組織中の限局された領域で発現しているニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子の発現を当該組織切片や細胞標本上で可視化することが可能となる。

[0038] 生体内ハイブリダィゼーシヨン法に使用するプローブとして好適に用いるためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号： 11に記載の塩基配歹ほたはこれと相補的な塩基配列中の、連続する少なくとも 15塩基、好ましくは少なくとも 30塩基、より好ましくは少なくとも 50塩基の配列を有し、かつ、多くとも 1000塩基、好ましくは多くとも 5 00塩基、より好ましくは多くとも 300塩基の配列を有する。当該プローブは、放射性リンで標識する手法である hot法によって標識することができる。

[0039] また、予めニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子をコードする DNAを PCR法で増幅させ、その後に生体内ハイブリダィゼーシヨン法で検出する、 in situ PCR法も好適に使用することができる。 in situ PCR法で使用するニューロメジン U受容体 2 (F M4)分子配列に特異的なプライマーとしては、上記記載のオリゴヌクレオチド、即ち配列番号： 11に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の、連続する少なくとも 12塩基以上、好ましくは 12— 50塩基、より好ましくは 12— 20塩基の配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。具体的には、配列番号： 5又は 6に記載のォリゴヌクレオチドを挙げること力 Sできる。 i_n situ PCR法の手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、 "Cell and Molecular Biology, In-Situ PCR Technique s"， Wiley, Omar Bagasra & John Hansen, eds. 1997に記載されている。本発明の診断方法の対象となる癌は特に限定されず、肺癌、大腸癌、勝臓癌、胃癌などの如何なる癌でもよい。好ましい癌の例としては、勝臓癌を挙げること力 Sできる。

[0040] 3.ニューロメジン U¾容体 2 (FM4)を発現する組換え細胞

本発明は更に、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)を発現する組換え細胞を提供する。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNAは、その 5'末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、また 3 '末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TG Aまたは TAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成 DNAアダプターを用いて付加することもできる。ニューロメジン U受容体 2 ( FM4)の発現ベクターは、例えば、（ィ）ニューロメジン U受容体 2 (FM4)をコードする DNAを含む DNAから目的とする DNA断片を切り出し、（口）当該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができ [0041] ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、 pBR322、 pBR325、 pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、 pUBHO, pC194、 pE194Ts等）、酵母由来プラスミド (例えば PSH19等）、 λファージなどのバタテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρΑ1-11、 pXTl、 pRc/CMV, pRC/RSV, pcDNAI/Neo, pcDNA3.1、 pRC/CMV2、 pRc/RSV (Invitrogen社）などが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 HIV-LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、 CM Vプロモーター、 SR aプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロモーター、 λ PLプロモ一ター、 lppプロモーターなど力宿主がバチルス属菌である場合は、 SP01プロモーター、 SP02プロモーターなど、宿主が酵母である場合は、 PH05プロモーター、 PGK プロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロモーターなどが好ましい。

[0042] 発現ベクターには、以上の他に、所望によりェンノヽンサ一、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 SV40複製オリジン（以下、 SV40oriと指称する場合がある。）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、 dhfrと指称する場合がある。）遺伝子 (メソトレキセート (MTX)耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、 Amprと指称する場合がある。 ) 、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、 Neorと指称する場合がある。 G418耐性）等が挙げられる。特に、 CHO(dhfr-)細胞を用いて dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質の N端末側に付加する。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoAシグナル酉己列、 OmpAシグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、 α —アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列など力宿主が酵母である場合は、 MF aシグナル配歹 IJ、 SUC2シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配歹 IJ、 a—インターフエロンシグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築されたニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質をコードする DNAを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。

[0043] 宿主としては、例えば、ェシエリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、植物細胞などが用いられる。ェシエリヒア属菌の具体例としては、ェシエリヒア.コリ（Escherichia coli) 12 · DH 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60， 160， 1996)、HB 1 0l j.Mol.Biol.41， 459， 1969)、 C600 (Genetics, 39， 4401， 1954)などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス'サチルス（Bacillus subtilis)、 MI114 (Gene， 24， 255, 1983)などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス 'セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae) AH22、 AH22R -、シゾサッカロマイセス*ボンべ（Schizo saccharomyces pombe) NCYC 1913, NCYC2036、ピキア'パストリス（Pichia pastoris) などが用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが AcNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell ; Sf細胞）、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Mamestra brassic ae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウィルスが BmN PVの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N ; BmN細胞）などが用いられる。当該 Sf細胞としては、例えば、 Sf9細胞（ATCC CRL1711)、 Sf 21細胞（以上、 Vaughn, J丄.ら、イン.ヴイボ（In Vivo) , 13, 213-217,(1977))などが用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞 COS_7、 Vero、チャイニーズノヽムスター細胞 CHO (J.Exp.Med. 108， 945，（1995)。以下、 CHO細胞と指称する。）、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズノヽムスター細胞 CHO (Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 77， 4216-4220，（1980)。以下、 CHO (dihf r-)細胞と指称する。）、マウス L細胞、マウス AtT-20、マウスミエローマ細胞、ラット GH 3、ヒト FL細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle, et al.， Nature, 291， 338-3 40，（1981))などの両生類細胞が用いられる。植物細胞としては、例えば、ニコチアナ -タバカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞をカルス培養すればよい。

[0044] プラスミドベクターの導入は、ウィルスベクターによる感染の他、原核細胞の内、例えばェシエリヒア属菌の場合は塩化カルシウム法やエレクト口ポレーシヨン法、例えば、バチルス属菌の場合はコンビテント細胞を用いた接触法やエレクト口ポレーシヨン法、真核細胞の内、サッカロマイセス 'セレビシェ等の場合は PEG法やエレクト口ポレーシヨン法、動物細胞の場合はリン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクト口ポレーション法、リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能である。

[0045] 4.ニューロメジン U¾容体 2 (FM4)に対するリガンド

本発明はまた、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドに関する。本発明においてリガンドとは、受容体に対して特異的に結合し、当該受容体を発現する細胞に情報を伝達する能力を有する物質を指称する。狭義の意では体内に本来備わつており細胞において発現する受容体に結合することによって、当該受容体を通じて細胞に情報を伝達する物質である内在性リガンドを示す。し力、し本発明のリガンドは、前記の当該受容体を発現する細胞の宿主において内在する天然型の内在性リガンドに限定されるものではない。本発明のリガンドには、本発明の受容体に対してァゴニスティックに作用するリガンドゃ天然又は人工の化合物またはそれらの塩が含まれる。本発明における塩としては、例えば無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、シユウ酸、安息香酸、メタンスルフォン酸、ベンゼンスルフォン酸）との塩などが挙げられるがこれらに限定されない。天然に存在するが当該宿主以外の宿主により生産される物質であっても、当該受容体に結合又は接触したときに当該受容体を発現する細胞に情報を伝達する能力を有する物質であれば、また、人工の化合物であっても、当該受容体に結合及び接触したときに当該受容体を発現する細胞に情報を伝達する能力を有する物質であれば、本発明にお!/、てリガンドとして使用すること力 Sできる。

[0046] ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドの例としては、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と同一、または、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同一のタンパク質と結合する能力を有するペプチド若しくは低分子化合物、並びにそれらの塩が挙げられる。当該ペプチドの例として具体的には、ニューロメジン U及びニューロメジン Uと実質的に同一のァゴニスト活性を有するペプチドを挙げること力 Sできる。更に具体的にはニューロメジン Uは、 SwissProt番号 P48645 (酉己歹 IJ番号： 14)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド及び SwissPr ot番号 P48645 (配列番号： 14)に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドを挙げることができる。

[0047] 配列番号： 14に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、；!〜 10個程度、より好ましくは 1〜5個程度）のァミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有するペプチドが用いられる。上述のように、あるアミノ酸配列に対する 1または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および/または他のァミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U SA (1984) 81， 5662-5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10， 6487-6500、 Wang, A. et al.， Science 224， 1431-1433、 Dalbadie- McFarland, G. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79， 6409-6413)。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドペプチドとしては、好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動物由来のペプチド、さらに好ましくはヒト由来のペプチドが挙げられる。

[0048] 配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同一のポリぺプチドとしては、例えば、配列番号： 14に記載のアミノ酸配列と少なくとも約 70%以上、少なくとも約 75%以上、好ましくは約 80%以上、好ましくは約 85%以上、より好ましくは約 90%以上、更に好ましくは約 95%以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号： 14に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号： 14に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号： 14に記載のアミノ酸配歹 IJを含むポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドが挙げられる。

[0049] アミノ酸配列の同一性は、比較すべき 2つの配列において、同一である残基の数を残基の総数で除し、 100を乗ずることにより表される。標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム、例えば、 Gapped B LASTまたは PSI_BLAST(Altschul， et. Al. Nucleic Acids Res. 25， 3389-3402， 1997)、 BLAST (Altschul et. al.， J.Mol.Biol. 215， 403-410， 1990)、及び、スミスウォーターマン（Smith- Waterman) (Smith, et.al., J.Mol.Biol., 147， 195-197， 1981)が利用可能である。

[0050] 本発明の配列番号： 14に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号： 14に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号： 14 に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリぺプチドが挙げられる。実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナノレ情報伝達作用等が挙げられるが、これらに限定されない。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用等の活性が同等（例、約 0. 5〜2倍）であることが好ましいが、これらの活性以外の活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は、異なって!/、てもよ V、。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができ、例えば、後述の決定方法やスクリーニング方法に従って行うことが出来る。

本発明の配列番号： 14に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号： 16に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号： 16 に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリぺプチドが、生体内での発現した後に切断等の修飾を受けた結果生成されるポリペプチドなどが挙げられる。

[0051] 本明細書におけるポリペプチドおよびタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従い、左端が N末端（ァミノ末端）、右端が C末端 (カルボキシル末端）である。配列番号： 14 に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをはじめとするニューロメジン U受容体 2 (F M4)に対するリガンドペプチドは、 C末端がカルボキシル基（一 COOH)、カルボキシレート (一 COO ）、アミド（一 CONH2)またはエステノレ（ - COOR)の可れであつてもよい。ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピノレ、イソプロピルもしくは n ブチルなどの C 1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロへキシルなどの C3-8シクロアルキル基、例えば、フエニル、 a ナフチルなどの C6-12ァリール基、例えば、ベンジル、フエネチルなどのフエ二ルー C 1-2アルキル基もしくは a ナフチルメチルなどの α ナフチルー C 1-2アルキル基などの C7-14ァラルキル基のほカ経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。

[0052] 本発明に係るニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドペプチド力 S、 C末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有して!/、る場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも、本発明のリガンドペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明に係るニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドペプチドには、上記したペプチドにおいて、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、ァセチル基などの C2-6アルカノィル基などの C 1-6ァシル基など）で保護されて!/、るもの、 N端側が生体内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば、 OH、— SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グァニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミノレ基、ァセチル基などの C2-6アルカノィル基などの C 1-6ァシル基など）で保護されて V、るもの、あるいは糖鎖が結合した!/、わゆる糖ペプチド '·糖タンパク質などの複合ぺプチドなども含まれる。

[0053] ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドペプチドの具体例としては、例えば、配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むヒト由来のポリペプチドなどがあげられるが、当該アミノ酸配列と物質として同一でないポリペプチドであっても、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドとしての機能又は活性 (例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するものであれば、本発明において好適に使用すること力 Sできる。当該リガンドは化学合成法によっても作成することもでき、天然物力、ら抽出することもでき、又は組換えタンパク質としても調製することもできる。

[0054] 組換えタンパク質として調製する場合は、上記 1.〜3.に記載の方法を用いて調製すること力 Sできる。その際に使用されるポリヌクレオチドの具体例としては、配列番号： 14に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号： 13に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドの一例としては、配列番号： 15に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号： 15に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、未成熟型のポリぺプチドとして配列番号： 16に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。配列番号： 16に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、組換え細胞内において産生された後、分泌、プロセッシングを受ける。その結果、配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドが産生される。

[0055] 配列番号： 15に記載されるポリヌクレオチドは上記 1.に記載の方法にて作成すること力 Sできる。 RT— PCR法又は PCR法にて作成する場合には、当該合成 DNAプライマーとして、配列番号： 17、 18、 19及び 20のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを好適に用いることができる力 S、これに限定されるものではない。即ち、適当な細胞中で発現させた際に配列番号： 14又は 16と実質的に同質の機能又は活性 (例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など)を有するニューロメジン U 受容体 2 (FM4)をコードする DNAを増幅することができる限り、どのような配列を有するポリヌクレオチドであっても、好適に使用できる。特定配列を有する合成 DNAプライマーは、半自動化された機械（例えば、 PE Applied Biosytems社製 Models 392/3 94など。）を用いて、固相合成法により作成することができる。

[0056] ニューロメジン U受容体 2 (FM4)を完全にコードする DNAを当該 PCR法によって増幅する際には、铸型として配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞から取得した複数種の mRNAを含む RNAライブラリーを好適に使用すること力 Sできる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)を発現する細胞としては特に限定されないが、例えば黒質、延髄、橋網様体、脊髄、視床、海馬、視床下部、大脳皮質、精巣の組織から由来する細胞の他、本発明に係る癌細胞株、好ましくは勝臓癌細胞株である Capan-1、 Capan_2、 CFPAC1、 HPAF II、 AsPC、 MPANC96,又は su. 86.86等を好適に用いることができる。

[0057] 5.ニューロメジン U¾容体 2 (FM4)に対するリガンドのスクリーニング

本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に被検物質を接触させ、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)が関与する細胞内のシグナル伝達活性を測定することを特徴とする、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。また本発明は、本発明のリガンドのスクリーニング方法によって得られたリガンドを提供する。本発明のスクリーニング方法は細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤、癌転移抑制剤などのスクリーニングに有用である。

[0058] 本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、以下の（a)から（c)の工程を含む、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対するリガンドのスクリーニング方法が挙げられる。

(a)配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに被検物質を接触させる工程、

(b)配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドと被検物質の結合を検出する工程、及び

(c)配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドと結合する被検物質を選択する工程。

[0059] 第一の態様では、まず、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに被検物質を接触させる。本発明の方法における「被検物質」としては、特に制限はなぐ例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。また上記被検物質は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等が挙げられるがこれらに限定されない。

[0060] 本発明において「接触」は、以下のようにして行う。例えば、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドが精製された状態であれば、精製標品に被検物質を添加することにより行うことができる。また、細胞膜に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検物質を添加することにより行うことができる。被検物質がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードする DNAを含むベクタ一を、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドが発現している細胞へ導入する、または該ベクターを配列番号 : 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリぺプチドが発現している細胞の培養液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ハイブリッド法を利用することも可能である。

[0061] 第一の態様では、次いで、上記配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリぺプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドと被検物質の結合を検出する。タンパク質間の結合を検出または測定する手段は、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うこと力 Sできる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵素ツーハイブリット法や、 BIACOREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法においては、ついで、上記生合成酵素と結合した被検物質を選択する。選択された被検物質の中には、癌を治療するための薬剤等の候補物質が含まれる。また、選択された被検物質を、以下のスクリーニングの被検物質として用いてもよい。

[0062] また本発明は、以下の（a)から（c)の工程を含む、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。

(b)工程 (a)の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、及び

(c)被検物質を接触させてレ、な!/、場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。

本発明のスクリーニング方法は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に被検物質を接触させた場合における、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)の当該被検物質に対する応答反応、例えば、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質の生理学的若しくは生化学的変化を検出すること、又は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)を発現する細胞に対して被検物質を接触させた場合に当該細胞に対する刺激活性等を測定することにより好適に実施される。

[0063] 本発明のスクリーニング方法は、具体的には、被検物質を細胞膜上に発現したニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に接触させ、ニューロメジン U受容体 2 (FM4 )タンパク質を介した細胞刺激活性を測定する工程を含む、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を有する化合物またはその塩のスクリーユング方法である。細胞膜上に発現したニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質は、例えば、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質をコードする DNAを含有する形質転換体を培養することによって取得することが出来る。また細胞刺激活性としては、例えば、ァラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内 Ca²⁺遊離、細胞内 cA MP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、 c fosの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性、細胞増殖抑制活性、コロニー形成アツセィ、細胞運動抑制活性などが挙げられるがこれらに限定されない。

また本発明のスクリーニング方法は、具体的には、被検物質をニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質をコ一ドする DNAを含有する形質転換細胞の抽出物に接触させ、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定する工程を含む、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法である。細胞刺激活性としては、例えば上記の活性が挙げられる。

[0064] ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性の測定には、例えばニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を発現した細胞又は該細胞の抽出物を用いることが出来る。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を発現した細胞としては、前述の組換え型ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞株などが望ましレ、。形質転換体であるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞は、安定発現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。また、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を発現した細胞の抽出物には、該タンパク質を含む膜画分が含まれる。被検物質としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、これらの化合物の塩、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられるがこれらに制限されない。

ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性の測定方法に使用されるアツセィ系として、例えば下記（1)〜（9)のアツセィ系が挙げられる。

(1)受容体発現細胞が受容体ァゴニストによって刺激されると、細胞内の Gタンパクが活性化されて、 GTPが結合する。この現象は、受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、 GTPは加水分解されて GDPへと変化する。この際に反応液中に GTP γ Sを添カロしておくと、 GTP γ Sは GTPと同様に Gタンパクに結合するものの、加水分解はされずに Gタンパクを含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識した GTP _y Sを用いて細胞膜に残存した放射活性を測定することによって、受容体ァゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。この反応を利用して、本発明の被検物質及びリガンドの、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。この方法は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含む細胞を用いるものではなぐニューロメジン U受容体 2 ( FM4)タンパク質を含む膜画分を用いるアツセィ法ではあり、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含む膜画分への GTP γ S結合促進活性を指標にして細胞刺激活性を測定するものである。本測定法において、ニューロメジン U受容体 2 (FM4) タンパク質を含む膜画分への GTP γ S結合促進活性を示す物質は、ァゴニストである。（1)に係るアツセィ系において、被検物質を添加しニューロメジン U受容体 2 (FM 4)タンパク質を含む細胞膜画分への GTP γ S結合促進活性に変化が生じることを観察することによって、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。

当該活性測定法の一例について、より具体的に以下に述べる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（50 mM Tris, 5 mM M gCl， 150 mM NaCl, 1 μ M GDP, 0.1% BSA pH 7.4)で希釈する。希釈率は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質の発現量により異なる。これを Falcon2053に 0.2 mlずつ分注し、本発明のリガンドあるいは被検物質を加え、さらに終濃度 200 pMとなるように [³⁵ S]GTP _y Sを加える。 25°Cで 1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgCl， 150 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% CHAPS pH 7.41, 5ml)を加えて、ガラス繊維ろ紙 GF/Fでろ過する。 65°C、 30分保温して乾燥後、液体シンチレーシヨンカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した [³⁵ S]GTP _y Sの放射活性を測定する。本発明のリガンドを加えた対照の放射活性を 100%、本発明のリガンドを加えな力、つた対照の放射活性を 0 %とし、被検物質を加えた場合に測定される放射活性の値に基づいて被検物質による GTP γ S結合促進活性に対する被検物質の影響を算出する。

(2)ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質の発現細胞は、本発明のリガンドにより刺激されると、細胞内 cAMP量が減少する。この反応を利用して、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質の発現細胞における、本発明のリガンドによるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を発現させた種々の動物細胞の cAMP 産生量は、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と ¹²⁵1標識 cAMP (ともに市販品）を使用することによって、 RIAで測定することが出来る。あるいは、抗 cAMP抗体と標識 cAMPとを組み合わせた他の EIA系で測定することもできる。また、抗 cAMP抗体をプロテイン Aあるいは抗 cAMP抗体産生に用いた動物の IgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと¹²⁵1 標識 cAMPとを使用する SPA法による定量も可能である（アマシャムフアルマシアバィォテク製のキットを使用する）。 cAMP産生抑制のアツセィにおいて、フオルスコリンまたは calcitoninなど細胞内 cAMP量を増加させるようなリガンドなどによって細胞内 cAMP量を上昇させた後に、本発明のリガンド又は被検物質を添加することによって、本発明のリガンド又は被検物質の単独投与による細胞内 cAMP量の産生量に対する抑制の変化を測定することが出来る。この測定を通して、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出すること力できる。

測定方法を、より具体的に以下に記載する。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現 CHO細胞（DG44細胞；後述の実施例 2— 2)を 24穴プレートに 5xl0⁴cell /wellで播種し、 48時間培養する。細胞を 0.2mM 3—イソブチル—メチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー (ρΗ7·4)で洗浄する（以下、 0· 2mM 3—イソブチル一メチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスノッファー (pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後 0.5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 2 H Mフオルスコリンを含む 0.25mlの反応用バッファーに 1 nMの本発明のリガンドあるいは被検物質を添加したものを細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させる。 100 1の 20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で 1時間置くことにより、細胞内 cAMPを抽出する。抽出液中の cAMP量は、 cAMP E IAキット（アマシャムフアルマシアバイオテク）を用いて測定する。フオルスコリン刺激によって産生された cAMP量を 100%とし、 1 nMの本発明のリガンドの添加によって抑制された cAMP量を 0%として、被検物質 Sによる cAMP産生抑制活性を算出する。 cAMP産生促進活性を測定するには、フオルスコリンを添加せずに本発明のタンノク質発現 CHO細胞に被検物質を添加して産生された cAMPを上記の方法で定量する。

(3) CRE (cAMP response element)を含む DNAを、ピツカジーン'べィシックべクタ一またはピツカジーン'ェンハンサーベクター（東洋インキ製造 (株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに揷入し、これを CRE—レポーター遺伝子ベクターとする。 CRE—レポーター遺伝子ベクターをトランスフエクシヨンした細胞において、 cAMP上昇を伴う刺激は、 CREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 CRE—レポーター遺伝子ベクター導入細胞内の cAMP量の変動を検出することができる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞に CRE—レポーター遺伝子ベクターをトランスフエクシヨンした細胞を利用して、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性の測定を行なうことができる。

具体的な測定法を以下に記す。 CRE—レポーター遺伝子を導入したニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞を 24穴プレートに 5xl0³ cell/wellで播種し、 48時間培養する。細胞を 0.2mM 3—イソブチルーメチルキサンチンと 0.05% BSAと 2 OmM HEPESを含むハンクスバッファー (ρΗ7·4)で洗浄する（以下、 0.2mM 3—イソブチル一メチルキサンチンと 0.05%BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー (ρΗ7· 4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後 0.5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 InMの本発明のペプチドあるいは 1 nMの本発明のペプチドおよび試験化合物と 2 H Mフオルスコリンを含む 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え、 37°C で 24分間反応させる。細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 (東洋インキ製造 (株) )で溶かし、溶解液に発光基質 (東洋インキ製造 (株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーシヨンカウンターまたはトップカウンタ一により測定することが出来るが、これらに限定されない。本発明のリガンド又は被検物質と二ュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性は、ルシフェラーゼによる発光量の抑制を指標に測定することができる。即ち、フオルスコリン刺激によって上昇した発光量に対する本発明のリガンド又は被検物質による抑制効果を指標として、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。レポーター遺伝子として、ルシフエラーゼ以外に、例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフエニコーノレ'ァセチルトランスフェラーゼ、又は /3—ガラクトシダーゼ等を用いることができるが、これらに限定されない。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は、以下のように市販の測定キットを用いて、容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製 Lumi-Phos 530によって測定することが出来る力 S、これらに限定されない。クロラムフエニコーノレ'ァセチノレトランスフェラーゼ（chloramphenicol acet yltransferase)活性は、例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransfe rase Assay Kitによって測定することが出来る力 S、これらに限定されない。また βーガラタトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEによって測定することができる力これらに限定されない。

(4)ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞は、本発明のリガンドによる刺激の結果、ァラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。あらかじめ、放射活性を有するァラキドン酸を細胞に取り込ませておくことによって、ニューロメジン U受容体 2 (F M4)タンパク質を介した細胞刺激活性を、細胞外に放出された放射活性を指標に測定すること力 Sできる。即ち、本発明のリガンド又は被検物質を添加することによって、ァラキドン酸代謝物放出活性に対する影響を調べることにより、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。

ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性の測定法について、以下に具体的に述べる。本発明のタンパク質発現 CHO細胞を 24穴プレートに 5 X 10⁴ cell/wellで播種し、 24時間培養後、 [³ H]ァラキドン酸を 0.25 Ci/wellとなるよう添加する。 [³ H]ァラキドン酸添加 16時間後、細胞を 0.05% BSAと 20mM HEPES を含むハンクスバッファー (ρΗ7·4)で洗浄し、各 wellに 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー (ρΗ7·4)に溶解した終濃度 10 ηΜの本発明のペプチドあるいは 1 0 ηΜの本発明のリガンド又は被検物質を含むバッファー 500 1を添加する。以降、 0 .05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー (ρΗ7·4)を反応用バッファーと呼ぶ。 37°Cで 60分間インキュベートした後に、反応液 400 1をシンチレ一ターに加え、反応液中に遊離した [³ H]ァラキドン酸代謝物の量をシンチレーシヨンカウンターにより測定する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーによる培地中の [³ H]ァラキドン酸代謝物の量を 0%とし、 10 nMの本発明のリガンドを添加したときの培地中の [³ H] ァラキドン酸代謝物の量を 100%として、被検物質を添加したときの培地中の [³ H]ァラキドン酸代謝物の量を測定することにより、被検物質によるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。

(5)ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞は、本発明のリガンドにより刺激されることによって、細胞内の Ca²⁺イオン濃度が上昇する。これを利用することによって、本発明のリガンド又は被検物質のニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性に対する影響を調べることができる。

具体的には、後述の実施例 2— 3に準じた方法で調べることができる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞を、 2 X 10⁴ cells/wellになるように 96 well pla te (蛍光測定用黒色プレート）に撒き一晩培養する。培地を除去した後、 50 a 1/well で Fluo 4 AM sol' n [2% FCS, 3〃 M Fluo 4 AM (Molecular PROBES社）を含む assay buffer (2 mM HEPES, 1.5 mM probenecid in HBSS)]を添加する。遮光して 37°C、 30 分インキュベートした後、細胞を assay bufferで 3回洗浄する。そして、 2.5 μ Μ濃度で Ν mU (フナコシ社）を含有する assay bufferを添加し、 490 nm励起光での細胞内 Ca²⁺依存蛍光トレースを、蛍光測定解析プレートリーダー（Fusion; PerkinElmer社）でモニタ一する。本発明のリガンド又は被検物質の添加による蛍光強度の上昇を観察することによって、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。別の態様では、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞に、細胞内 Ca²⁺イオンの上昇によって発光するタンパク質の遺伝子（例、 aequ orinなど）を共発現させておき、細胞内 Ca²⁺イオン濃度の上昇によって、当該タンパク質の遺伝子（例、 aequorinなど）が Ca²⁺結合型となり発光することを利用する。本発明のリガンド又は被検物質の添加の有無によって変化する発光強度の相違を測定することにより、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。

(6)細胞内 Ca²⁺イオンの上昇によって発光するタンパク質の遺伝子（例、 aequorinなど）の他、細胞内 Ca²⁺イオンの上昇に応答する転写エレメント（例： TRE (TPA respon se element) )の下流にレポーター遺伝子を揷入した DNAを共発現する方法も、好適に使用することカできる。即ち、 TRE (TPA response element)を含む DNAを、ピツカジーン.べィシックベクターまたはピツカジーン.ェンハンサーベクター（東洋インキ製造（株） )のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに揷入し、これを T

RE—レポーター遺伝子ベクターとする。 TRE—レポーター遺伝子ベクターをトランスフエクシヨンした細胞において、細胞内 Ca²⁺イオン濃度上昇を伴う刺激は、 TREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 TRE—レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウムイオン量の変動を検出することができる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞に TRE—レポーター遺伝子ベクターをトランスフエタトした細胞に、本発明のリガンド又は被検物質を投与し、発光量の増加を観察することにより、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性の測定を行なうことができる。具体的な測定方法を以下に記す。 TRE レポーター遺伝子を導入したニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞を、 24穴プレートに 5 x 10³cell/wellで播種し、 48時間培養する。細胞を 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー (ρΗ7·4)で洗浄した後、 10 ηΜの本発明のリガンドあるいは被検物質を添加し、 37°C で 60分間反応させる。細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 (東洋インキ製造 (株) )で溶かし、溶解液に発光基質 (東洋インキ製造 (株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーシヨンカウンターまたはトップカウンタ一により測定することが出来るが、これらに限定されない。本発明のリガンドの投与により、細胞内 Ca²⁺イオン濃度が上昇し、発光量が増加することを利用する。発明のリガンドの非添加反応バッファーを用いたときの発光量を 0%とし、 10 nMの本発明のリガンドを添カロしたときの発光量を 100%として、被検物質を添加したときの発光量を測定することにより、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンノク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフエニコーノレ'ァセチノレトランスフェラーゼあるいは /3—ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポ一ター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は、以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製 L umi-Phos 530によって測定することが出来る力これに限定されない。クロラムフエ二コーノレ ·ァセチノレトランスフェラーゼ chloramphenicol acetyltransferase)活十生は、例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kitによって測定することが出来るが、これに限定されない。 β ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEによって測定すること力 Sできる力これに限定されない。

(7)本発明によれば、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞の増殖抑制効果を指標に、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞の増殖抑制の評価としては、通常の細胞増殖活性測定法を好適に用いることができる。即ち、（a)血球計算板上で細胞数の計測を行う方法、 (b) DNA複製の前駆体であるチミジンを放射標識したものである [ ]-チミジンを培養細胞に添加する。一定時間経過後、培地中の遊離 [³H]_チミジンを洗浄除去した後に、細胞内に取り込まれた放射量を、液体シンチレーシヨンカウンターを用いて測定する方法、（c)細胞のミトコンドリア内のコハク酸脱水素酵素により、テトラゾリゥム塩化合物が特定の波長の発色を呈する化合物に変換される現象を利用する方法（当該発色の強度を分光光度計によって測定する方法）、などを好適に使用することができる。（a)の変法として使用される色素排除法は、細胞数計測の際にトリパンブルーなどの生細胞によって細胞外へ排出される性質を有する化合物を添加することによって、単なる細胞数のみを測定するのではなぐ生細胞又は死細胞の別を検出することが可能となる方法である。（c) のテトラゾリゥム塩の具体例としては、本願実施例 2— 4で使用される WST— 8 (特許番号第 2757348号）の他、 WST— l (Biochem.， 179， 1-7 (1989))、 MTT (J. Immunol. Methods 65， 55-63， (1983))、 MTS (Cancer Commun. 3， 207-212， (1991))、 XTT ( Cancer Res. 48， 4827-4833，（1988))などの化合物が好適に使用できる。

具体的には、以下のような方法を用いて、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞の増殖抑制効果を指標に、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。本発明のニューロメジン U受容体 2 ( FM4)タンパク質発現細胞を 96穴プレートに播いて、 48時間後の細胞に、 WST- 8 を主成分として含有する呈色試薬（Cell Count Reagent SF，ナカライテスタ社）を加え、プレートリーダーにて呈色強度を測定する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーを添加したときの発色値を 0%とし、本発明のリガンドを添加したときの発色値を 1 00%として被検物質を添加したときの発色値を測定することにより、被検物質によるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。

(8)更に本発明によれば、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞のコロニー形成抑制効果を指標に、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。細胞の悪性形質転換はジェネティックゃェピジェネティックの変化により誘導され、成長抑制因子のシグナルに関係なく独自で成長する細胞集団を産生し、細胞外の成長因子をほとんど必要とせずに成長する。具体的には、癌細胞などの形質転換細胞は、正常細胞と異なり、接着せずに増殖する（足場非依存性増殖)ことが可能となる。即ち、基質に付着して増殖する正常細胞は、軟寒天中では足場が無いために増殖できないのに対して、癌細胞などの形質転換細胞は足場非依存性増殖（Anchorage independent growth)が可能であることから、軟寒天中でコロニー形成能を有する。即ち、被検ニューロメジン U受容体 2 (FM4) タンパク質発現細胞の軟寒天中におけるコロニー形成活性を指標に、当該細胞の形質転換の程度及び転移能などを評価することができる。更に、当該測定に使用する軟寒天中のニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンド又は被検物質の有無に基づくコロニー形成能を測定することにより、ニューロメジン U受容体 2 (F M4)タンパク質を介した細胞刺激活性として評価することができる。

具体的には、以下のような方法を用いて、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞のコロニー形成能を指標に、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。即ち、 1.5 ml/wellずつ base agar ( 0.5% agar, 1 x MEM, 10% FCS)を添加した 6 well plateに、 PANC 1細胞、あるいは、 F M4-PANC 1細胞を top agar (0.35% agar, 1 x MEM, 10% FCS)中に本発明のリガンド又は被検物質の存在下、又は非存在下で 0.5 X 10⁴ cells/wellになるように 1.5 ml/wel 1で各 wellに添加する。 1ヶ月間培養後、 soft agar中におけるコロニー形成細胞数を顕微鏡下で測定する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーを添加したときのコロニー数を 100 %とし、本発明のリガンドを添加したときのコロニー数を 0 %として、被検物質を添加したときのコロニー数を測定することにより、被検物質によるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。

(9)また、本発明によれば、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞の細胞運動抑制効果を指標に、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。正常細胞の場合、増殖により細胞同士が接触したときに運動阻止（contact inhibition)が起こり、細胞が密に増殖すると互いに平行に並ぶ。これに対して、ジェネティックゃェピジェネティックの変化により誘導される悪性形質転換細胞においては、細胞同士の接触による運動阻止が起こらず (loss of contact inhibition)、お互いに重なり合った不規則な配列を示す増殖像を示す。こうした細胞運動の接触阻止現象を評価することによって、被検細胞の形質転換の程度及び転移能などを評価することができる。即ち、被検ニューロメジン U受容体 2 (F M4)タンパク質発現細胞の細胞運動活性を指標に、当該細胞の形質転換の程度及び転移能などを評価することができる。更に、リガンド又は被検物質の有無に基づく細胞運動活性を検出することにより、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を評価することができる。

具体的には、以下のような wound healing assayなどの方法を用いて、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞の細胞運動活性を指標に、ニューロメジン U 受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。即ち、シヤーレ中でコンフルェントにさせたニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞をピペットチップの先で傷つけ、細胞間に一定の隙間を作る。細胞を PBSで 2回洗浄後、本発明のリガンド又は被検物質の存在下又は非存在下で培養を行う。同様にニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を発現しない細胞を対照として同じ条件下で培養を行う。 24時間後に、細胞間の隙間へと移動した細胞の存在を顕微鏡で観察し、その数を計測する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーを添加したときの細胞数を 0%とし、本発明のリガンドを添加したときの細胞数を 100%として、被検物質を添加したときのコロニー数を測定することにより、被検物質によるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。

6.ニューロメジン容体 2 (FM4)に対するリガンドの拮杭試験スクリーニングまた本発明は、以下の（a)から（c)の工程を含む、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。

(c)ニューロメジン Uを接触させた場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。

本発明に係るスクリーニングの別の好ましレ、態様としては、 (i)ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に本発明のリガンドを接触させた場合と（ii)上記したニューロメジン U受容体 2 (FM4)に本発明のリガンドおよび被検物質を接触させた場合における、例えば当該ニューロメジン U受容体 2 (FM4)に対する本発明のリガンドの結合量などを測定して比較することにより、拮抗試験スクリーニング法としても好適に実施される。係るスクリーニング法により見出された化合物は、上記細胞刺激活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法と同様の方法に基づいて、更に当該刺激活性を評価すること力 Sでさる。

上記の拮抗試験スクリーニング法の一態様としては、以下の工程を含む、本発明のリガンドとニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。

(1)標識した本発明のリガンドを、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に接触させる工程、

(2)標識した本発明のリガンドおよび被検物質を、ニューロメジン U受容体 2 (FM4) タンパク質に接触させる工程、および

(3)上記（1)および（2)のそれぞれにおいて、標識した本発明のリガンドの本発明のタンパク質に対する結合量を測定し、上記（1)および（2)における結合量を比較する工程。

本発明の拮抗試験スクリーニング法の一態様としては、以下の工程を含む、本発明のリガンドとニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。

(1)標識した本発明のリガンドを、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含有する細胞または当該細胞の膜画分に接触させる工程、

(2)標識した本発明のリガンドおよび被検物質を、ニューロメジン U受容体 2 (FM4) タンパク質を含有する細胞または当該細胞の膜画分に接触させる工程、および

(3)上記（1)および（2)のそれぞれにおいて、標識した本発明のリガンドの当該細胞または当該膜画分に対する結合量を測定し、上記（1)および（2)における結合量を比較する工程。

(1)標識した本発明のリガンドを、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質をコードする DNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に接触させる工程、

(2)標識した本発明のリガンドおよび被検物質を、ニューロメジン U受容体 2 (FM4) タンパク質をコードする DNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に接触させる工程、および

(3)上記（1)および（2)のそれぞれにおいて、標識した本発明のリガンドのニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対する結合量を測定し、上記（1)および（2)における結合量を比較する工程。

本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下に記載する。まず、本発明のスクリーニング方法に用いるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質としては、上記のニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含有するものであれば何れのものであってもよい。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、組換え体を用いて大量発現させたニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質などが適して!/ヽる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を製造するには、前述の方法などが用いられる。本発明のスクリーニング方法において、ニューロメジン U受容体 2 (FM4 )タンパク質を含有する細胞あるいは当該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含有する細胞を用いる場合、当該細胞をダルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うことができる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含有する細胞としては、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を発現した宿主細胞が挙げられる。当該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられる。膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことを!/、う。細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダ一やポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500rpm〜3000rpm)で短時間（通常、約 1分〜 10分）遠心し、上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm)で通常 30分〜 2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。当該膜画分中には、発現した本発明のタンパク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含有する細胞や膜画分中の二ユーロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質の量は、 1細胞当たり 10³ 〜10⁸分子であるのが好ましぐ 10⁵ 〜10⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるば力、りでなぐ同一ロットで大量の試料を測定することが可能である。本発明のリガンドとニューロメジン U受容体 2 (FM4)との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の拮抗試験スクリーニングを実施するためには、適当なニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質画分と、標識した本発明のリガンドが用いられる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含む画分としては、天然型のニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含む画分力、、またはそれと同等の活性を有する組換え型のニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含む画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識した本発明のリガンドとしては、例えば〔³ H〕、〔¹²⁵ I〕、〔¹⁴ C〕、〔³⁵ S〕などで標識された本発明のリガンドなどを利用することができる。特に、ボルトンハンター試薬を用いて公知の方法で調製した本発明のリガンドの標識体を利用することもできる。具体的には、本発明のリガンドとニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まずニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより受容体標品を調製する。バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8)のリン酸バッファー、トリス一塩酸バッファーなど、リガンドと受容体との結合を阻害しない任意のバッファーを使用することが出来る。また、非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Tween- 80 (花王一アトラス社）、ジギトニン、デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明のタンパク質や本発明のペプチドの分解を抑える目的で PMSF、ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製）、ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 O.Olml〜 Omlの当該受容体溶 ί夜に、一定量（5000cpm〜500000c pm)の標識した本発明のリガンドを添加し、同時に 10— ⁴〜； 10— Mの被検物質を共存させる。非特異的結合量 (NSB)を知るために大過剰の未標識の本発明のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は 0°Cから 50°C、望ましくは 4°Cから 37°Cで 20分から 24時間、望ましくは 30分から 3時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターまたは γ—カウンターで計測する。拮抗する物質がな V、場合のカウント (Β0)から非特異的結合量 (NSB)を引いたカウント（Β0— NSB)を 1 00%とした時、特異的結合量 (B— NSB)が例えば 50%以下になる被検物質を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。また、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質と本発明のリガンドとの結合を測定する方法として、 BIAcore ( アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いることもできる。この方法では、本発明のリガンドを装置に添付のプロトコールに従ったァミノカップリング法によってセンサーチップに固定し、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含有する細胞、ニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質をコードする DNAを含有する形質転換体から精製したニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質またはニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含む膜画分、または精製したニューロメジン U受容体 2 (FM 4)タンパク質またはニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を含む膜画分および被検物質を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分 2— 20 1の流量で通過させる。センサーチップ上の本発明のリガンドとニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を、共存する被検物質が変化させることを観察することによって、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質と本発明のリガンドとの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。この方法は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質をセンサーチップに固定し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび被検物質を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても、同様に測定することができる。被検物質としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられるがこれらに限定されない。

[0078] 上記拮抗試験スクリーニング法により選択された本発明のリガンドについてそのニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定するには、ニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を発現した細胞が好適に用いられる。ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を発現した細胞としては、前述の組換え型ニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞株などが望まし!/、。形質転換体であるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞は、安定発現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。被検物質としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられるがこれらに限定されない。

[0079] 7.ニューロメジン U 容体 2 (FM4)が閗与する瞌臓 #；を始めする癌の治療および /または方剤

別の観点においては、本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する薬剤を提供する。本発明の薬剤としては、細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤、癌転移抑制剤などが挙げられる。本発明の薬剤は、癌を罹患して!/、る対象、羅患した癌を手術により切除した対象または罹患して!/、る可能性がある対象に投与されることが好ましい。対象としては、例えば哺乳動物（例えばヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ィヌ、サル等）などが挙げられる力これらに限定されるものではない。また、本発明において「抑制」とは、ニューロメジン U 受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドによって、当該受容体の生物学的活性が減少することを意味する。本発明においては、その減少の程度は制限されるものではなぐ生物学的活性の一部でも減少すれば、本発明における「抑制」の意味に含まれる。

[0080] 本発明にお!/、て、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する細胞増殖抑制剤は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含む細胞増殖を抑制する方法、または、細胞増殖抑制剤の製造におけるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。更に本発明において、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有するコロニー形成抑制剤は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含むコロニー形成を抑制する方法、または、コロニー形成抑制剤の製造におけるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。また本発明において、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する細胞運動抑制剤は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含む細胞運動を抑制する方法、または、細胞運動抑制剤の製造におけるニューロメジン U受容体 2 ( FM4)タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。

[0081] 本発明において、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する癌治療剤は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含む癌を予防または治療する方法、または、癌治療剤の製造におけるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。更に本発明において、ニューロメジン U受容体 2 (FM 4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する癌転移抑制剤は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含む癌の転移を予防または治療する方法、または、癌転移抑制剤の製造におけるニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。本発明にお!/、て「転移」とは、細胞が本来コロニーを形成して!/、た原発部位から離れて異なる別の部位に移動して別のコロニーを形成することを！/、い、生体内及び生体外で観察される現象を指称する。本発明の癌治療剤または癌転移抑制剤が対象とする癌は特に限定されず、肺癌、大腸癌、勝臓癌、胃癌などの如何なる癌でもよい。好ましレ、癌の例としては、勝臓癌を挙げること力 Sできる。

[0082] 本発明において、「ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する」とは、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを主要な活性成分として含むという意味であり、ニューロメジン U受容体 2 (F M4)タンパク質に対するリガンドの含有率を制限するものではない。

[0083] 本発明の医薬組成物（例えば、細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤及び癌転移抑制剤。以下同様。 )に含有されるリガンドはニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質と結合し細胞刺激活性を有する限り特に制限はなぐ本明細書中に記載されたリガンドが例示できる。

[0084] 本発明のリガンドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、または水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る溶媒との無菌性溶液、もしくは懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のリガンドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、了力モノ油またはチェリーのような香味剤等が用いられる。

[0085] 調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油等のような天然産出植物油等を溶解または懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソノレビトール、 D—マンニトール、塩化ナトリウム等）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート 80TM、 HCO— 50等）等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロ力イン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なァンプルに充填される。

[0086] このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えばヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ィヌ、サル等）に対して投与すること力 Sできる。本発明のリガンドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はある力一般的に成人（60kgとして）においては、一日にっき本発明のリガンド、を約 lmg〜； 1000mg、好ましくは約 5〜500mg、より好ましくは約 10〜200mg 投与する。非経口的に投与する場合は、本発明のリガンドの 1回投与量は例えば齢数、症状などの相違、投与対象、対象疾患等によっても異なる力例えば、本発明のリガンドを注射剤の形で成人（体重 60kgとして）に投与する場合、一日にっき当該ぺプチドを約 1〜； !OOOmg程度、好ましくは約 5〜200mg程度、より好ましくは約 10〜 lOOmg程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、 60kg当たりに換算した量を投与することができる。

[0087] 上記記載の通り、本発明の医薬組成物の投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによつて実施できる力特に好ましくは非経口投与による投与方法である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。

[0088] また本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞とニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドとを接触させる工程を含む、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞の増殖を抑制する方法を提供する。また本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞とニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドとを接触させる工程を含む、コロニ一形成を抑制する方法を提供する。

また本発明は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞とニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドとを接触させる工程を含む、細胞の転移を抑制する方法を提供する。

ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドは、本発明のニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドとして上述したとおりである。ニュ一ロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドが結合する細胞は、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質が発現して!/、る細胞であれば特に限定されないが、好ましくは癌細胞であり、より好ましくは勝臓癌細胞である。

[0089] 本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞の培養液にニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを添加することにより行われる。この場合において、添加されるリガンドの担体としては、溶液又は凍結乾燥等により得られる固体等の担体が適宜使用できる。水溶液として添加される場合にあっては純粋にリガンドのみを含有する水溶液であってもよいし、例えば軽質無水ケィ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ポリビニノレァセターノレジェチノレアミノアセテート、ポリビュルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリダリセライド、ポリオキシェチレン硬化ヒマシ油 60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等などにより例示される界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。添加する濃度は特に限定されないが、培養液中の最終濃度として、好ましくは 1 pg/mlから 1 g/mlの範囲であり、より好ましくは 1 ng/mlから 1 mg/m 1であり、更に好ましくは 1 g/mlから 1 mg/mlが好適に使用されうる。

[0090] また本発明において「接触」は、別の態様では、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や、内在的にニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質を発現する癌細胞を有する動物に投与することによつても行われる。投与方法は経口、非経口投与のいずれかによつて実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の薬剤（細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤および癌転移抑制剤）が全身または局部的に投与され得る。また、被験動物の齢数、症状により適宜投与方法を選択することができる。水溶液として投与される場合にあっては純粋にリガンドのみを含有する水溶液であってもよいし、例えば上記記載の界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重 1 kgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、対象あたり 0.001から 100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。し力もながら、本発明のリガンド投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。

ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドの接触によってニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞に引き起こされた細胞増殖抑制活性を、試験管内において評価又は測定する方法としては、例えば、上記 2 (7)に記載の方法が好適に使用される。また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法としては、例えばニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被検リガンドを含む担体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより、細胞増殖抑制活性と規定することができる。試験管内での評価と同様に、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドを含まな!/、担体を投与し、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンド投与群における腫瘍の大きさ力、対照であるリガンド非投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいか否かによって、細胞増殖抑制活性を判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してその Tリンパ球の機能を欠失したヌード (nu/nu)マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与されたリガンドによる細胞増殖抑制活性の評価 ·測定に当たって被検動物中の Tリンパ球の関与を除くことができる。

[0092] 更に、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドの接触によって、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞に引き起こされたコロニー形成抑制活性を試験管内において評価又は測定する方法としては、例えば、上記 2 (8 )に記載の方法が好適に使用される。また、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質に対するリガンドの接触によってニューロメジン U受容体 2 (FM4)タンパク質発現細胞に引き起こされた細胞運動抑制活性を試験管内において評価又は測定する方法としては、例えば、上記 2 (9)に記載の方法が好適に使用される。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0093] 以下、本発明を実施例によって詳細に説明する力本発明の範囲はこれらの実施例に記載された態様に限定されるものではない。

[0094] 1. NmU-R2 (FM4)の瞵臓癌における発現

1-1. Gene chipを用いたヒト NmU遺伝子発現解析

肺癌ゃ瞵癌といった癌組織で特異的に発現亢進する遺伝子を探索するため、 Gen eChip U133A (ァフィメトリタス社製）を用いて、正常組織、癌組織及び癌細胞株の網羅的遺伝子発現解析を実施した。

はじめに、表 1及び表 2に示す正常組織、癌組織及び癌細胞株から ISOGEN (ニッボンジーン社製）を用いて常法により全 RNAを調製した。そしてそれらの全 RNAを各 1

0 a gずつ用い、 GeneChip U-133A (ァフィメトリタス社製）に供し Expression Analysis

Technical Manual (ァフィメトリタス社製）に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を 100とし、癌組織あるいは癌細胞において発現が亢進する遺伝子の探索を行った。

[表 1] 組織

全脇 Clontech 64020-1 肺臨床検体 1例気管 Clontech 64091 -1 心臓 Ambion7966 腎臓 Ambion 7976 肝臓 clinical sample (Surgery) 薛臓 Ambion 7954

clinical sample (Surgery) 小腸 Ambion 7984 大腸 Ambion 7986 骨髄 Clontech64106-1 末梢血単核球細胞臨床検体 1例

巣 Clontech64027-1

Ambion 7988 卵巣 Ambion 7974 皮膚 Stratagene 735031 肺小細胞癌 1 臨床検体 1例肺小細胞癌 2 臨床検体 1例肺小細胞癌 3 臨床検体 1例肺小細胞癌 4 臨床検体 1例肺小細胞癌 5 臨床検体 1例肺小細胞癌 6 臨床検体 1例肺小細胞癌 7 臨床検体 1例肺小細胞癌 8 臨床検体 1例肺小細胞癌 9 臨床検体 1例肺小細胞癌 1 0 臨床検体 1例肺扁平上皮癌 1 臨床検体 1例肺扁平上皮癌 2 臨床検体 1例肺扁平上皮癌 3 臨床検体 1例肺扁平上皮癌 4 臨床検体 1例肺扁平上皮癌 5 臨床検体 1例

肺腺癌 1 臨床検体 1例肺腺癌 2 臨床検体 1例肺腺癌 3 臨床検体 1例肺腺癌 4 臨床検体 1例肺腺 5 臨床検体 1例降癌 1 臨床検体 1例膝癌 2 臨床検体 1例降癌 3 臨床検体 1例膝癌 4 臨床検体 1例

[表 2]

その結果、ヒト NmU遺伝子（プローブ ID : 206023_at HG-U133A)力 S、調査した正常組織においては顕著な発現が認められず、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、ならびに瞵癌組織で発現亢進していた。また、 NmU遺伝子力 S100以上のスコアを示す癌細胞株は、脳腫瘍 (U251)、食道癌（TE2)、胃癌細胞株 (AGS KATOIII, M N45 2M)、大腸癌細胞株（DLD1 hCT116 LOVO, SW480)、膝癌細胞株（Capanl L Ml、 PK59)、肺癌細胞株（Lul30、 H1395、 H1648、 H2347)及び子宮頸癌（Hela)であつた（図 1 (A)及び (B) )。

以上より、ヒト NmU遺伝子（プローブ ID : 206023_at HG-U133A)は正常組織で発現量が非常に低いのに対し、肺癌、大腸癌、瞵癌、胃癌及び腎癌と広範な癌種で発現亢進していることが明ら力、となった。

1-2. RT-PCRによる NmU,およびその ¾容体遺伝子の発現解析

GeneChip解析により NmUの発現が複数の勝臓癌患者で発現上昇して!/、ることを見出した。そこで、実際の勝臓癌における遺伝子発現を詳細に解析することを目的として、 NmUおよびその受容体である FM3および FM4の瞵臓癌での発現について、 RT -PCRにより解析を行った。

具体的な手法は以下に記すとおりである。まず 12種類の勝臓癌細胞株 (BxPC-3， CFPAC-1, PANC-1, HPAC, MIApaca, Capan- 1， Capan-2, HPAF II, AsPc, HS766 T， Mpanc96, Su.86.86；いずれも American Type Culture Collection (ATCC)より購入）を、 ATCCの指南書記載の培養条件下で培養した。各細胞を Trizol (Invitrogen) で溶解し、細胞より total RNAを調整した。この RNAより添付のマニュアルに従って cD NAを合成し（Superscript IIファーストストランドシステム； invitogen)、得られた瞵臓癌細胞株由来 cDNAと、ヒト各種正常臓器 cDNA (human Marathon-Ready cDNA; CI ontech)を铸型にして、 EX Taq polymerase (タカラ）により RT-PCRを行った。各遺伝子の増幅条件と使用したプライマーセットを以下に示す。

NmU (94°C 30秒、 60°C 30秒、 72°C 30秒： 30サイクル）

NmU-1： CTCAGGCATCCAACGCACTG (酉己歹 IJ番号： 1)

NmU— 2： CTGACCTTCTTCCATTCCGTG (酉己歹 IJ番号： 2)

FM3 (94°C 30秒、 60°C 30秒、 72°C 30秒： 34サイクル）

NmURl-1： GCTATTTCCGCACGCTACTGT (配列番号： 3)

NmURl-2： GCCCAATGAGCAGGTAGAGC (配列番号： 4)

FM4 (94°C 30秒、 60°C 30秒、 72°C 30秒： 34サイクル）

NmUR2-l： GGGCTGCTACTTCAAGACGG (配列番号： 5)

NmUR2-2： CCCTTCATCTGCCTCAAGAGA (酉己歹 IJ番号： 6) [0097] RT-PCR解析の結果、 NmUの発現は 12株中 10株で認められた（図 2 (A) )。受容体の 1つである FM4の発現は、正常抹消組織ではまったく発現が認められない一方で、勝臓癌細胞株においては 12株中 7株という高い頻度で発現が確認された。もう一方の受容体である FM3は、肝臓、勝臓、脾臓、精巣、小腸などの末梢組織で発現が観察されたものの、勝臓癌細胞株での発現はまったく見出されな力た（図 2 (B) )。このように FM4遺伝子が勝臓癌で亢進されているという知見は新規であり、 FM4が勝臓癌に対する分子標的治療薬の標的分子として有用であることが強く示唆された

〇

[0098] 2. NmU-R2 (FM4)を介する NmUの増殖抑制効果

2-1. FM4発現ベクターの構築

FM4発現ベクターを構築するため、まず FM4遺伝子のクローニングを以下のとおり行った。勝臓癌細胞株（Capan-1)由来 cDNAを铸型にして Pyrobest Taq polymerase ( タカラ）以下の条件で RT-PCRを行い、全長 FM4遺伝子をクローニングした。

FM4-UP： ATGTCAGGGATGGAAAAACTTC (配列番号： 7)

FM4-LOW： TCAGGTTTTGTTAAAGTGGAAGC (配列番号： 8)

(94°C 30秒、 59°C 30秒、 72°C 60秒： 32サイクル）

[0099] 次に、得られた PCR産物を铸型にして、以下の条件で再度 PCRを行い、 5'端、 3'端にそれぞれ EcoRI、 Notl切断配列が付加された全長 FM4 cDNA断片を得た。番号: 9) : 10)

(94°C 30秒、 68°C 30秒、 72°C 60秒：、 20サイクル）

これを EcoRI、 Notlで切断し、同じく EcoRI、 Notlで切断した動物細胞用発現べクタ一 (pMCN)に揷入し、 FM4発現ベクター (pMCN-FM4)を構築した。

[0100] 2-2. FM4発現 CHO細胞株の樹立

pvulで切断することにより直鎖化した FM4発現ベクター（pMCN-FM4) 15 gを、 1.5 kV， 25 FDで CHO細胞にエレクト口ポレーシヨン（Gene Pulser； BioRad)により導入した。細胞を 500 [I g/mlの G418を含む培地で培養し、 G418耐性細胞をピックアツプした。これら細胞に NmUを添加し、細胞内 Ca²⁺濃度の上昇を指標に NmUに反応する細胞株を選抜した。

[0101] 2-3.細胞内カルシウム濃度の測定

細胞をトリプシンではがし、 2 X 10⁴ cells/wellになるように 96 well plate (蛍光測定用黒色プレート）に撒き一晩培養後、細胞内カルシウム測定に使用した。細胞内カルシゥム濃度測定は以下のとおり行った。

[0102] 培地を除!/、た後、 50 a 1/wellで Fluo 4 AM sol ' n [2% FCS, 3 ju M Fluo 4 AM (Molec ular PROBES) in assay buffer (2mM HEPES, 1.5mM probenecid in HBSS) ]を添加した。遮光して 37°C、 30分インキュベートした後、細胞を assay bufferで 3回洗浄した。そして、 ²· 5 a Μの NmU (フナコシ）を含有する assay bufferを添加し、 ⁴90nm励起での細胞内 Ca²⁺依存蛍光トレースを蛍光測定解析プレートリーダー（Fusion; PerkinElmer 社）でモニターした。

樹立した FM4-CHO細胞株は、 NmUで刺激することにより、速やかに細胞内 Ca²⁺濃度が上昇した（図 3)。このこと力、ら、得られた細胞は、 FM4を介して NmUシグナルが細胞内に伝わっていることが確認された。

[0103] 2-4. NmUの増殖抑制効果の解析

NmU刺激で細胞内 Ca²⁺濃度が上昇することを指標にスクリーニングした FM4発現 C HO細胞株（FM4-CHO)を用いて、 FM4を介した NmU signalingについて解析を行つた。

FM4-CHO細胞を、 2 X 10³ cells/wellで 96 well plateに撒種した。翌日、各 wellに Nm Uを各濃度 (0.096〜60 a M)で添加し培養を行い、 48時間後に WST-8 assay (Cell c ounting kit-8 ,同仁化学）により生細胞数の数を解析した。その結果、 NmUは低濃度で、 FM4-CHOに対して増殖を抑制した（図 4A)。

[0104] 次に、 FM4を高発現している勝臓癌細胞株に対しても、 NmUが増殖抑制効果を示すか検証を行った。 RT-PCR解析で FM4遺伝子の発現が高い Capan- 1、および、 FM 4遺伝子の発現が検出されない PANC- 1を選び、これらの細胞を 96 well plateに撒いた。翌日、各 wellに NmUを 0.096〜60 μ Μで添加し、 72時間後に細胞数を測定した。その結果、 PANC-1の増殖に対して NmUは全く作用しなかったのに対し、 FM4遺伝子の発現が高レ、Capan-lにお!/、て NmUの増殖抑制効果が認められた（図 4B)。

[0105] 3. NmU-R2 (FM4)を介する NmUのコロニー形成抑制効果

3-1. FM4発現 CHO細胞株の樹立

勝臓癌細胞株 PANC-1の FM4強制発現細胞株の樹立を以下のとおり行った。 pvul で切断し直鎖化した FM4発現ベクター（pMCN-FM4) 15 μ gを 1.5 kV， 25 μ FDで CH O細胞にエレクト口ポレーシヨン（Gene Pulser； BioRad)により導入した。細胞を 400 μ g/mlの G418を含む培地で培養し、 G418耐性細胞 7クローンをピックアップした。これらの細胞より total RNAを精製し、 cDNAを合成した。得られた cDNAを铸型にして FM 4の発現を RT-PCRにより解析した（図 5)。クローン # 6が FM4遺伝子を最も発現していたので、この株を FM4発現 PANC-UFM4-PANC 1)として以下の実験に用いた。

[0106] 3-2. FM4発現 PANC 1細朐に対する NmUのコロニー形成抑制効果

得られた FM4発現 PANC 1細胞（FM4-PANC 1)力 mUシグナルを細胞内に伝達することを確認するため、 NmU添加により細胞内 Ca²⁺濃度の上昇が認められるかを解析した。その結果、 FM4-PANC 1において NmU ( 1 μ Μ)の添加によって細胞内 Ca²⁺濃度の上昇が確認された（図 6)。このことから樹立した FM4-PANC 1細胞は NmU刺激により FM4を介して細胞内にシグナルが伝達されていることが確認された。

この細胞のコロニー形成能に対する NmUの作用を解析するため soft agar colony fo rmation assay¾r 施した。 Soft agar colony formation assayは下のとおりネ丁つた。

1.5 ml/wellずつ base agar (0.5% agar, 1 x MEM, 10% FCS)を添加した 6 well plate に、 PANC 1細胞、あるいは、 FM4- PANC 1細胞を top agar (0.35% agar, 1 x MEM, 10% FCS)中に NmU ( 1 M)存在下、あるいは非存在下で 0.5 x 10⁴ cells/wellになるように 1.5 ml/wellで各 wellに添加した。 1ヶ月間培養後、 soft agar中におけるコロニー形成細胞数を顕微鏡下で測定した。

[0107] その結果、 FM4を発現してない親株のコロニー形成能に対しては、 NmUはまったく影響を及ぼさなかった力 FM4-PANC 1においては、 NmUによるコロニー形成抑制作用が確認された（図 7)。

以上の結果より、 NmUは FM4を介して軟寒天培養におけるコロニー形成を抑制することが示された。

[0108] 4. NmU-R2 (FM4)を介する NmUの細胞運動抑制効果

4-1. FM4-CHO細胞の細胞形熊変化

FM4を強制発現させた FM4-CHO細胞の細胞形態を顕微鏡で観察した。その結果、親株である CHO細胞に比べて、 FM4-CHO細胞では細胞突起の増加と細胞の肥大とレ、つた特徴に見られる細胞の形態変化が観察された（図 8)。

そして、これらの特徴を有する FM4-CHO細胞を、さらに NmUで刺激することによつて、約 12時間程度で細胞突起の消失など著しい細胞の形態変化が観察された（図 8 )。このこと力、ら、 NmUが細胞の接着と細胞運動を調節するシグナル伝達に関与していることが推測された。

[0109] 4-2. NmUによる細朐運動能の抑制効果

次に wound healing assayにより細胞運動能に対する NmUの作用について解析を行つた。シャーレ中でコンフルェントにさせた親株 CHO、および FM4-CHO細胞をピぺットチップの先で傷つけ細胞間に一定の隙間を作った。細胞を PBSで 2回洗浄後、無血清培養液に NmU (5 M)添加/非添加で培養を行った。 24時間後に、細胞間の隙間へと移動した細胞を顕微鏡で観察 ·写真撮影した。

[0110] その結果、 NmUは親株 CHO細胞の細胞移動にまったく影響を与えなかったのに対し、 FM4-CHO細胞は、 NmU刺激により細胞移動が完全に阻害された（図 9)。このことから、 NmUは FM4を介して細胞運動を抑制する作用を有することが強く示唆された

〇

産業上の利用可能性

[0111] 本発明に係るニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドは、ニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子を発現する勝臓癌などの各種の癌細胞の細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、又は細胞運動抑制剤として使用することができる。更に、本発明に係るニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子に対するリガンドは、勝臓癌などの癌に対する癌治療剤として使用することができる。更に勝臓癌などの癌の術後予防薬として使用すること力 Sできる。

[0112] また、本発明に係るニューロメジン U受容体 2 (FM4)分子は、勝臓癌などの癌の診断マーカーとして使用することができる。即ち、当該ニューロメジン U受容体 2 (FM4) 分子を検出することのできるプローブを化学物質又はラジオアイソトープなどにより標識し使用することにより、生体外又は生体内において勝臓癌の存在を検出することができる。

Claims

請求の範囲

[I] 配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌治療剤。

[2] リガンドが配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする請求項 1に記載の癌治療剤。

[3] 癌が勝臓癌である請求項 1又は 2に記載の癌治療剤。

[4] 配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌転移抑制剤。

[5] リガンドが配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする請求項 4に記載の癌転移抑制剤。

[6] 癌が勝臓癌である請求項 4又は 5に記載の癌転移抑制剤。

[7] 配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む細胞増殖抑制剤。

[8] リガンドが配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする請求項 7に記載の細胞増殖抑制剤。

[9] 細胞が勝臓癌細胞である請求項 7又は 8に記載の細胞増殖抑制剤。

[10] 以下の（a)から（c)の工程を含む、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリぺプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法

[I I] 以下の（a)から（c)の工程を含む、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリぺプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法 (a)配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、

[12] 細胞が組換え細胞であることを特徴とする請求項 10又は 11に記載の方法。

[13] 組換え細胞が CHO又は PANC1由来の細胞であることを特徴とする請求項 12に記載の方法。

[14] 細胞刺激活性が細胞内 Ca²⁺濃度増加活性である、請求項 10から 13のいずれかに記載の方法。

[15] 細胞刺激活性が細胞増殖抑制活性である、請求項 10から 13の!/、ずれかに記載の方法。

[16] 細胞刺激活性が細胞のコロニー形成抑制活性である、請求項 10から 13のいずれかに記載の方法。

[17] 細胞刺激活性が細胞の細胞運動抑制活性である、請求項 10から 13のいずれかに記載の方法。

[18] 請求項 10から 17のいずれかに記載の方法より取得されたリガンド。

[19] 癌の診断方法であって、

正常組織と比較して、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルが上昇している場合に、癌と診断される方法。

[20] 検出が、配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、それと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらの断片をプローブとして用いて行われる、請求項 19に記載の方法。

[21] ポリヌクレオチドが配列番号： 13に記載の塩基配列を含むことを特徴とする請求項 2 0に記載の方法。

[22] 癌が勝臓癌である請求項 19から 21のいずれかに記載の方法。

[23] 配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法。

[24] 配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌の転移を抑制する方法。

[25] 配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、細胞の増殖を抑制する方法。

[26] 癌治療剤の製造における、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。

[27] 癌転移抑制剤の製造における、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリぺプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。

[28] 細胞増殖抑制剤の製造における、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含むポリぺプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。