JPWO2008029601A1 - ニューロメジンu受容体2(fm4)分子に対するリガンドを有効成分として含む癌治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
N. Minamino, K. Kangawa and H. Matsuo. Neuromedin U-8 and U-25: Novel uterus stimulating and hypertensive peptides identified in porcine spinal cord. Biochem. Biophys. Res. Commun. 130 (1985) 1078-1085. M. Kojima, R. Harunoa, M. Nakazato, Y. Date, N. Murakami, R. Hanada, H. Matsuo and K. Kangawa. Purification and Identification of Neuromedin U as an Endogenous Ligand for an Orphan Receptor GPR66 (FM3) Biochem. Biophys. Res. Commun. 276, (2000) 435-438. Howard AD, Wang RP, Pong SS, Mellin TN, Strack A, Guan XM, Zeng ZZ, Williams DL, Feighner SD, Nunes CN, et al. Identification of receptors for neuromedin U and its role in feeding. Nature 406 (2000) 70-74. Szekeres PG, Muir AI, Spinage LD, Miller JE, Butler SI, Smith A, Rennie GI, Murdock PR, Fitzgerald LR, Wu HL, et al. Neuromedin U is a potent agonist at the orphan G protein-coupled receptor FM3. J Biol Chem 275 (2000) 20247-20250. R. Fujii, M. Hosoya, S. Fukusumi, Y. Kawamata, Y. Habata, S. Hinuma, H. Onda, O. Nishimura and M. Fujino. Identification of neuromedin U as the cognate ligand of the orphan G protein-coupled receptor FM-3. J. Biol. Chem. 275 (2000) 21068-21074. Hosoya M, Moriya T, Kawamata Y, Ohkubo S, Fujii R, Matsui H, Shintani Y, Fukusumi S, Habata Y, Hinuma S, et al. Identification and functional characterization of a novel subtype of neuromedin U receptor. J Biol Chem 275 (2000) 29528-29532. Raddatz R, Wilson AE, Artymyshyn R, Bonini JA, Borowsky B, Boteju LW, Zhou SQ, Kouranova EV, Nagorny R, Guevarra MS, et al. Identification and characterization of two neuromedin U receptors differentially expressed in peripheral tissues and the central nervous system. J Biol Chem 275 (2000) 32452-32459. Hanada R, Teranishi H, Pearson JT, Kurokawa M, Hosoda H, Fukushima N, Fukue Y, Serino R, Fujihara H, Ueta Y, Ikawa M, Okabe M, Murakami N, Shirai M, Yoshimatsu H, Kangawa K, Kojima M. Neuromedin U has a novel anorexigenic effect independent of the leptin signaling pathway. Nat Med. 10 (2004) 1067-73. Paul J. Brighton, Philip G. Szekeres and Gary B. Willars. Neuromedin U and Its Receptors: Structure, Function, and Physiological Roles. Pharmacol Rev 56 (2004) 231-248 Shetzline SE, Rallapalli R, Dowd KJ, Zou S, Nakata Y, Swider CR, Kalota A, Choi JK, Gewirtz AM. Neuromedin U: A Myb-regulated autocrine growth factor for human myeloid leukemias. Blood. 104 (2004) 1833-40.
〔1〕配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌治療剤、
〔2〕リガンドが配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする〔1〕に記載の癌治療剤、
〔3〕癌が膵臓癌である〔1〕又は〔2〕に記載の癌治療剤、
〔4〕配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌転移抑制剤、
〔5〕リガンドが配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする〔4〕に記載の癌転移抑制剤、
〔6〕癌が膵臓癌である〔4〕又は〔5〕に記載の癌転移抑制剤、
〔7〕配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む細胞増殖抑制剤、
〔8〕リガンドが配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする〔7〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔9〕細胞が膵臓癌細胞である〔7〕又は〔8〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔10〕以下の(a)から(c)の工程を含む、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法:
(a)配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
(b)工程(a)の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、
(c)被検物質を接触させていない場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程、
〔11〕以下の(a)から(c)の工程を含む、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法:
(a)配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
(b)工程(a)の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、
(c)ニューロメジンUを接触させた場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程、
〔12〕細胞が組換え細胞であることを特徴とする〔10〕又は〔11〕に記載の方法、
〔13〕組換え細胞がCHO又はPANC1由来の細胞であることを特徴とする〔12〕に記載の方法、
〔14〕細胞刺激活性が細胞内Ca2+濃度増加活性である、〔10〕から〔13〕のいずれかに記載の方法、
〔15〕細胞刺激活性が細胞増殖抑制活性である、〔10〕から〔13〕のいずれかに記載の方法、
〔16〕細胞刺激活性が細胞のコロニー形成抑制活性である、〔10〕から〔13〕のいずれかに記載の方法、
〔17〕細胞刺激活性が細胞の細胞運動抑制活性である、〔10〕から〔13〕のいずれかに記載の方法、
〔18〕〔10〕から〔17〕のいずれかに記載の方法より取得されたリガンド、
〔19〕癌の診断方法であって、
標本の生物試料における配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルを検出する工程を含み、
正常組織と比較して、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルが上昇している場合に、癌と診断される方法、
〔20〕検出が、配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、それと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらの断片をプローブとして用いて行われる、〔19〕に記載の方法、
〔21〕ポリヌクレオチドが配列番号:13に記載の塩基配列を含むことを特徴とする〔20〕に記載の方法、
〔22〕癌が膵臓癌である〔19〕から〔21〕のいずれかに記載の方法、
〔23〕配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法、
〔24〕配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌の転移を抑制する方法、
〔25〕配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、細胞の増殖を抑制する方法、
〔26〕癌治療剤の製造における、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用、
〔27〕癌転移抑制剤の製造における、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用、
〔28〕細胞増殖抑制剤の製造における、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。
1.ニューロメジンU受容体2(FM4)及びこれをコードする遺伝子
天然のニューロメジンU受容体2(FM4)のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれGenBank番号NP_064552(配列番号:12)及びNM_020167(配列番号:11)に開示されている。本発明においてニューロメジンU受容体2(FM4)(以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある)とは、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを意味する。配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドとしては、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片が挙げられる。ニューロメジンU受容体2(FM4)の断片とは、天然のニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質と実質的に同等の機能又は活性を有するポリペプチドを意味する。天然のニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質と実質的に同等の機能又は活性としては、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。
本発明によれば、上記記載に基づき取得されたニューロメジンU受容体2(FM4)分子をコードするDNAを用いて、膵臓癌を始めとする癌細胞を診断することが可能となる。即ち本発明は、被検患者からバイオプシー等により採取された組織片、血液、細胞その他の被検試料を使用して、係る被検試料中の癌細胞の存在を診断する方法を提供する。また本発明は、癌細胞の存在を検出するための組成物、すなわち、癌の診断用組成物を提供する。具体的には、本発明の診断用組成物は、配列番号:11に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(ニューロメジンU受容体2(FM4)をコードするDNA)を増幅することができる1組のプライマーを含んでいてもよい。さらに本発明は、配列番号:11に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(ニューロメジンU受容体2(FM4)をコードするDNA)を増幅することができるプライマーを提供する。このようなプライマーとしては、配列番号:15に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このようなプライマーを用いて、上記記載の方法により被検試料から抽出されたRNA若しくは当該RNAより調製されたcDNAをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことにより、目的とする配列を増幅することが出来る。そして、被検試料中のニューロメジンU受容体2(FM4)の転写産物の存在または量的変化を検出することができる。このようなPCR手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、"PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications", Academic Press, Michael , et al., eds. 1990に記載されている。
本発明は更に、ニューロメジンU受容体2(FM4)を発現する組換え細胞を提供する。ニューロメジンU受容体2(FM4)をコードするDNAは、その5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。ニューロメジンU受容体2(FM4)の発現ベクターは、例えば、(イ)ニューロメジンU受容体2(FM4)をコードするDNAを含むDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ロ)当該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
本発明はまた、ニューロメジンU受容体2(FM4)に対するリガンドに関する。本発明においてリガンドとは、受容体に対して特異的に結合し、当該受容体を発現する細胞に情報を伝達する能力を有する物質を指称する。狭義の意では体内に本来備わっており細胞において発現する受容体に結合することによって、当該受容体を通じて細胞に情報を伝達する物質である内在性リガンドを示す。しかし本発明のリガンドは、前記の当該受容体を発現する細胞の宿主において内在する天然型の内在性リガンドに限定されるものではない。本発明のリガンドには、本発明の受容体に対してアゴニスティックに作用するリガンドや天然又は人工の化合物またはそれらの塩が含まれる。本発明における塩としては、例えば無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルフォン酸、ベンゼンスルフォン酸)との塩などが挙げられるがこれらに限定されない。天然に存在するが当該宿主以外の宿主により生産される物質であっても、当該受容体に結合又は接触したときに当該受容体を発現する細胞に情報を伝達する能力を有する物質であれば、また、人工の化合物であっても、当該受容体に結合及び接触したときに当該受容体を発現する細胞に情報を伝達する能力を有する物質であれば、本発明においてリガンドとして使用することができる。
本発明の配列番号:14に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号:16に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号:16に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドが、生体内での発現した後に切断等の修飾を受けた結果生成されるポリペプチドなどが挙げられる。
本発明は、ニューロメジンU受容体2(FM4)に被検物質を接触させ、ニューロメジンU受容体2(FM4)が関与する細胞内のシグナル伝達活性を測定することを特徴とする、ニューロメジンU受容体2(FM4)に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。また本発明は、本発明のリガンドのスクリーニング方法によって得られたリガンドを提供する。本発明のスクリーニング方法は細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤、癌転移抑制剤などのスクリーニングに有用である。
(a)配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに被検物質を接触させる工程、
(b)配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドと被検物質の結合を検出する工程、及び
(c)配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドと結合する被検物質を選択する工程。
(a)配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
(b)工程(a)の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、及び
(c)被検物質を接触させていない場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。
本発明のスクリーニング方法は、ニューロメジンU受容体2(FM4)に被検物質を接触させた場合における、ニューロメジンU受容体2(FM4)の当該被検物質に対する応答反応、例えば、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質の生理学的若しくは生化学的変化を検出すること、又は、ニューロメジンU受容体2(FM4)を発現する細胞に対して被検物質を接触させた場合に当該細胞に対する刺激活性等を測定することにより好適に実施される。
また本発明のスクリーニング方法は、具体的には、被検物質をニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質をコードするDNAを含有する形質転換細胞の抽出物に接触させ、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定する工程を含む、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法である。細胞刺激活性としては、例えば上記の活性が挙げられる。
(1)受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると、細胞内のGタンパクが活性化されて、GTPが結合する。この現象は、受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、GTPは加水分解されてGDPへと変化する。この際に反応液中にGTPγSを添加しておくと、GTPγSはGTPと同様にGタンパクに結合するものの、加水分解はされずにGタンパクを含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したGTPγSを用いて細胞膜に残存した放射活性を測定することによって、受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。この反応を利用して、本発明の被検物質及びリガンドの、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。この方法は、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を含む細胞を用いるものではなく、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を含む膜画分を用いるアッセイ法ではあり、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を含む膜画分へのGTPγS結合促進活性を指標にして細胞刺激活性を測定するものである。本測定法において、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を含む膜画分へのGTPγS結合促進活性を示す物質は、アゴニストである。(1)に係るアッセイ系において、被検物質を添加しニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を含む細胞膜画分へのGTPγS結合促進活性に変化が生じることを観察することによって、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。
当該活性測定法の一例について、より具体的に以下に述べる。ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液(50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1μM GDP, 0.1% BSA pH 7.4)で希釈する。希釈率は、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質の発現量により異なる。これをFalcon2053に0.2mlずつ分注し、本発明のリガンドあるいは被検物質を加え、さらに終濃度200 pMとなるように[35 S]GTPγSを加える。25℃で1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液(50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% CHAPS pH 7.41, 5ml)を加えて、ガラス繊維ろ紙GF/Fでろ過する。65℃、30分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した[35 S]GTPγSの放射活性を測定する。本発明のリガンドを加えた対照の放射活性を100%、本発明のリガンドを加えなかった対照の放射活性を0%とし、被検物質を加えた場合に測定される放射活性の値に基づいて被検物質によるGTPγS結合促進活性に対する被検物質の影響を算出する。
測定方法を、より具体的に以下に記載する。ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現CHO細胞(DG44細胞;後述の実施例2−2)を24穴プレートに5x104cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM 3−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する(以下、0.2mM 3−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ)。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて30分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーに1 nMの本発明のリガンドあるいは被検物質を添加したものを細胞に加え、37℃で24分間反応させる。100μlの20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で1時間置くことにより、細胞内cAMPを抽出する。抽出液中のcAMP量は、cAMP EIAキット(アマシャムファルマシアバイオテク)を用いて測定する。フォルスコリン刺激によって産生されたcAMP量を100%とし、1 nMの本発明のリガンドの添加によって抑制されたcAMP量を0%として、被検物質SによるcAMP産生抑制活性を算出する。cAMP産生促進活性を測定するには、フォルスコリンを添加せずに本発明のタンパク質発現CHO細胞に被検物質を添加して産生されたcAMPを上記の方法で定量する。
具体的な測定法を以下に記す。CRE−レポーター遺伝子を導入したニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞を24穴プレートに5x103 cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM 3−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する(以下、0.2mM 3−イソブチル−メチルキサンチンと0.05%BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ)。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて30分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、1nMの本発明のペプチドあるいは1 nMの本発明のペプチドおよび試験化合物と2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え、37℃で24分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤(東洋インキ製造(株))で溶かし、溶解液に発光基質(東洋インキ製造(株))を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定することが出来るが、これらに限定されない。本発明のリガンド又は被検物質とニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性は、ルシフェラーゼによる発光量の抑制を指標に測定することができる。即ち、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量に対する本発明のリガンド又は被検物質による抑制効果を指標として、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に、例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、又はβ−ガラクトシダーゼ等を用いることができるが、これらに限定されない。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は、以下のように市販の測定キットを用いて、容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって測定することが出来るが、これらに限定されない。クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(chloramphenicol acetyltransferase)活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kitによって測定することが出来るが、これらに限定されない。またβ−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができるが、これらに限定されない。
ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性の測定法について、以下に具体的に述べる。本発明のタンパク質発現CHO細胞を24穴プレートに5 x 104 cell/wellで播種し、24時間培養後、[3 H]アラキドン酸を0.25μCi/wellとなるよう添加する。[3 H]アラキドン酸添加16時間後、細胞を0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄し、各wellに0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)に溶解した終濃度10 nMの本発明のペプチドあるいは10 nMの本発明のリガンド又は被検物質を含むバッファー500 μlを添加する。以降、0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を反応用バッファーと呼ぶ。37℃で60分間インキュベートした後に、反応液400 μlをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した[3 H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーによる培地中の[3 H]アラキドン酸代謝物の量を0%とし、10 nMの本発明のリガンドを添加したときの培地中の[3 H]アラキドン酸代謝物の量を100%として、被検物質を添加したときの培地中の[3 H]アラキドン酸代謝物の量を測定することにより、被検物質によるニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。
具体的には、後述の実施例2−3に準じた方法で調べることができる。ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞を、2 x 104 cells/wellになるように96 well plate(蛍光測定用黒色プレート)に撒き一晩培養する。培地を除去した後、50 μl/wellでFluo 4 AM sol’n [2% FCS, 3μM Fluo 4 AM (Molecular PROBES社) を含むassay buffer (2 mM HEPES, 1.5 mM probenecid in HBSS)] を添加する。遮光して37℃、30分インキュベートした後、細胞をassay bufferで3回洗浄する。そして、2.5μM濃度でNmU(フナコシ社)を含有するassay bufferを添加し、490 nm励起光での細胞内Ca2+依存蛍光トレースを、蛍光測定解析プレートリーダー(Fusion; PerkinElmer社)でモニターする。本発明のリガンド又は被検物質の添加による蛍光強度の上昇を観察することによって、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。別の態様では、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞に、細胞内Ca2+イオンの上昇によって発光するタンパク質の遺伝子(例、aequorinなど)を共発現させておき、細胞内Ca2+イオン濃度の上昇によって、当該タンパク質の遺伝子(例、aequorinなど)がCa2+結合型となり発光することを利用する。本発明のリガンド又は被検物質の添加の有無によって変化する発光強度の相違を測定することにより、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。
具体的な測定方法を以下に記す。TRE−レポーター遺伝子を導入したニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞を、24穴プレートに5 x 103cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した後、10 nMの本発明のリガンドあるいは被検物質を添加し、37℃で60分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤(東洋インキ製造(株))で溶かし、溶解液に発光基質(東洋インキ製造(株))を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定することが出来るが、これらに限定されない。本発明のリガンドの投与により、細胞内Ca2+ イオン濃度が上昇し、発光量が増加することを利用する。発明のリガンドの非添加反応バッファーを用いたときの発光量を0%とし、10 nMの本発明のリガンドを添加したときの発光量を100%として、被検物質を添加したときの発光量を測定することにより、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は、以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって測定することが出来るが、これに限定されない。クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(chloramphenicol acetyltransferase)活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kitによって測定することが出来るが、これに限定されない。β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができるが、これに限定されない。
具体的には、以下のような方法を用いて、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞の増殖抑制効果を指標に、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。本発明のニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞を96穴プレートに播いて、48時間後の細胞に、WST−8を主成分として含有する呈色試薬(Cell Count Reagent SF, ナカライテスク社)を加え、プレートリーダーにて呈色強度を測定する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーを添加したときの発色値を0%とし、本発明のリガンドを添加したときの発色値を100%として被検物質を添加したときの発色値を測定することにより、被検物質によるニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。
具体的には、以下のような方法を用いて、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞のコロニー形成能を指標に、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。即ち、1.5 ml/well ずつbase agar(0.5% agar, 1 x MEM, 10% FCS)を添加した6 well plateに、PANC1細胞、あるいは、FM4-PANC1細胞をtop agar(0.35% agar, 1 x MEM, 10% FCS)中に本発明のリガンド又は被検物質の存在下、又は非存在下で0.5 x 104 cells/wellになるように1.5 ml/wellで各wellに添加する。1ヶ月間培養後、soft agar中におけるコロニー形成細胞数を顕微鏡下で測定する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーを添加したときのコロニー数を100%とし、本発明のリガンドを添加したときのコロニー数を0%として、被検物質を添加したときのコロニー数を測定することにより、被検物質によるニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。
具体的には、以下のようなwound healing assayなどの方法を用いて、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞の細胞運動活性を指標に、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。即ち、シャーレ中でコンフルエントにさせたニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞をピペットチップの先で傷つけ、細胞間に一定の隙間を作る。細胞をPBSで2回洗浄後、本発明のリガンド又は被検物質の存在下又は非存在下で培養を行う。同様にニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を発現しない細胞を対照として同じ条件下で培養を行う。24時間後に、細胞間の隙間へと移動した細胞の存在を顕微鏡で観察し、その数を計測する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーを添加したときの細胞数を0%とし、本発明のリガンドを添加したときの細胞数を100%として、被検物質を添加したときのコロニー数を測定することにより、被検物質によるニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。
また本発明は、以下の(a)から(c)の工程を含む、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。
(a)配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
(b)工程(a)の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、及び
(c)ニューロメジンUを接触させた場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。
本発明に係るスクリーニングの別の好ましい態様としては、(i)ニューロメジンU受容体2(FM4)に本発明のリガンドを接触させた場合と(ii)上記したニューロメジンU受容体2(FM4)に本発明のリガンドおよび被検物質を接触させた場合における、例えば当該ニューロメジンU受容体2(FM4)に対する本発明のリガンドの結合量などを測定して比較することにより、拮抗試験スクリーニング法としても好適に実施される。係るスクリーニング法により見出された化合物は、上記細胞刺激活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法と同様の方法に基づいて、更に当該刺激活性を評価することができる。
(1)標識した本発明のリガンドを、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に接触させる工程、
(2)標識した本発明のリガンドおよび被検物質を、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に接触させる工程、および
(3)上記(1)および(2)のそれぞれにおいて、標識した本発明のリガンドの本発明のタンパク質に対する結合量を測定し、上記(1)および(2)における結合量を比較する工程。
本発明の拮抗試験スクリーニング法の一態様としては、以下の工程を含む、本発明のリガンドとニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
(1)標識した本発明のリガンドを、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を含有する細胞または当該細胞の膜画分に接触させる工程、
(2)標識した本発明のリガンドおよび被検物質を、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質を含有する細胞または当該細胞の膜画分に接触させる工程、および
(3)上記(1)および(2)のそれぞれにおいて、標識した本発明のリガンドの当該細胞または当該膜画分に対する結合量を測定し、上記(1)および(2)における結合量を比較する工程。
本発明の拮抗試験スクリーニング法の一態様としては、以下の工程を含む、本発明のリガンドとニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
(1)標識した本発明のリガンドを、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に接触させる工程、
(2)標識した本発明のリガンドおよび被検物質を、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に接触させる工程、および
(3)上記(1)および(2)のそれぞれにおいて、標識した本発明のリガンドのニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に対する結合量を測定し、上記(1)および(2)における結合量を比較する工程。
別の観点においては、本発明は、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又本発明は、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する薬剤を提供する。本発明の薬剤としては、細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤、癌転移抑制剤などが挙げられる。本発明の薬剤は、癌を罹患している対象、羅患した癌を手術により切除した対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。対象としては、例えば哺乳動物(例えばヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、サル等)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明において「抑制」とは、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に対するリガンドによって、当該受容体の生物学的活性が減少することを意味する。本発明においては、その減少の程度は制限されるものではなく、生物学的活性の一部でも減少すれば、本発明における「抑制」の意味に含まれる。
また本発明は、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞とニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に対するリガンドとを接触させる工程を含む、コロニー形成を抑制する方法を提供する。
また本発明は、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質発現細胞とニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に対するリガンドとを接触させる工程を含む、細胞の転移を抑制する方法を提供する。
ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に対するリガンドは、本発明のニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に対するリガンドとして上述したとおりである。ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質に対するリガンドが結合する細胞は、ニューロメジンU受容体2(FM4)タンパク質が発現している細胞であれば特に限定されないが、好ましくは癌細胞であり、より好ましくは膵臓癌細胞である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
1-1. Gene chip を用いたヒトNmU遺伝子発現解析
肺癌や膵癌といった癌組織で特異的に発現亢進する遺伝子を探索するため、GeneChip U133A(アフィメトリクス社製)を用いて、正常組織、癌組織及び癌細胞株の網羅的遺伝子発現解析を実施した。
はじめに、表1及び表2に示す正常組織、癌組織及び癌細胞株からISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いて常法により全RNAを調製した。そしてそれらの全RNAを各10 μgずつ用い、GeneChip U-133A(アフィメトリクス社製)に供しExpression Analysis Technical Manual(アフィメトリクス社製)に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、癌組織あるいは癌細胞において発現が亢進する遺伝子の探索を行った。
以上より、ヒトNmU遺伝子(プローブID: 206023_at HG-U133A)は正常組織で発現量が非常に低いのに対し、肺癌、大腸癌、膵癌、胃癌及び腎癌と広範な癌種で発現亢進していることが明らかとなった。
GeneChip 解析によりNmUの発現が複数の膵臓癌患者で発現上昇していることを見出した。そこで、実際の膵臓癌における遺伝子発現を詳細に解析することを目的として、NmUおよびその受容体であるFM3およびFM4の膵臓癌での発現について、RT-PCRにより解析を行った。
具体的な手法は以下に記すとおりである。まず12種類の膵臓癌細胞株(BxPC-3, CFPAC-1, PANC-1, HPAC, MIApaca, Capan-1, Capan-2, HPAF II, AsPc, HS766T, Mpanc96, Su.86.86 ; いずれもAmerican Type Culture Collection (ATCC)より購入)を、ATCCの指南書記載の培養条件下で培養した。各細胞をTrizol (Invitrogen) で溶解し、細胞よりtotal RNAを調整した。このRNAより添付のマニュアルに従って cDNA を合成し (SuperScript II ファーストストランドシステム;invitogen)、得られた膵臓癌細胞株由来cDNAと、ヒト各種正常臓器cDNA (human Marathon-Ready cDNA; Clontech) を鋳型にして、EX Taq polymerase(タカラ)によりRT-PCRを行った。各遺伝子の増幅条件と使用したプライマーセットを以下に示す。
NmU (94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒:30サイクル)
NmU-1 : CTCAGGCATCCAACGCACTG(配列番号:1)
NmU-2 : CTGACCTTCTTCCATTCCGTG(配列番号:2)
FM3 (94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒:34サイクル)
NmUR1-1 : GCTATTTCCGCACGCTACTGT(配列番号:3)
NmUR1-2 : GCCCAATGAGCAGGTAGAGC(配列番号:4)
FM4 (94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒:34サイクル)
NmUR2-1 : GGGCTGCTACTTCAAGACGG(配列番号:5)
NmUR2-2 : CCCTTCATCTGCCTCAAGAGA(配列番号:6)
このようにFM4遺伝子が膵臓癌で亢進されているという知見は新規であり、FM4が膵臓癌に対する分子標的治療薬の標的分子として有用であることが強く示唆された。
2-1. FM4発現ベクターの構築
FM4発現ベクターを構築するため、まずFM4遺伝子のクローニングを以下のとおり行った。膵臓癌細胞株(Capan-1)由来cDNAを鋳型にしてPyrobest Taq polymerase(タカラ)以下の条件でRT-PCRを行い、全長FM4遺伝子をクローニングした。
FM4-UP :ATGTCAGGGATGGAAAAACTTC(配列番号:7)
FM4-LOW :TCAGGTTTTGTTAAAGTGGAAGC(配列番号:8)
(94℃ 30秒、59℃ 30秒、72℃ 60秒:32サイクル)
FM4-ECO :AAAGAATTCCACCATGTCAGGGATGGAAAAACTTCAGAA(配列番号:9)
FM4-NOT :TTTGCGGCCGCTCAGGTTTTGTTAAAGTGGAAGCTTT(配列番号:10)
(94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 60秒:、20サイクル)
これをEcoRI、NotIで切断し、同じくEcoRI、NotIで切断した動物細胞用発現ベクター(pMCN)に挿入し、FM4発現ベクター(pMCN-FM4)を構築した。
pvuIで切断することにより直鎖化したFM4発現ベクター(pMCN-FM4)15 μgを、1.5 kV, 25 μFDでCHO細胞にエレクトロポレーション(Gene Pulser ; BioRad)により導入した。細胞を500 μg/ml のG418を含む培地で培養し、G418耐性細胞をピックアップした。これら細胞にNmUを添加し、細胞内Ca2+濃度の上昇を指標にNmUに反応する細胞株を選抜した。
細胞をトリプシンではがし、2 x 104 cells/wellになるように96 well plate(蛍光測定用黒色プレート)に撒き一晩培養後、細胞内カルシウム測定に使用した。細胞内カルシウム濃度測定は以下のとおり行った。
樹立したFM4-CHO細胞株は、NmUで刺激することにより、速やかに細胞内Ca2+濃度が上昇した(図3)。このことから、得られた細胞は、FM4を介してNmUシグナルが細胞内に伝わっていることが確認された。
NmU刺激で細胞内Ca2+濃度が上昇することを指標にスクリーニングしたFM4発現CHO細胞株(FM4-CHO)を用いて、FM4を介したNmU signalingについて解析を行った。
FM4-CHO細胞を、2 x 103 cells/wellで96 well plateに撒種した。翌日、各wellにNmUを各濃度(0.096〜60 μM)で添加し培養を行い、48時間後にWST-8 assay(Cell counting kit-8,同仁化学)により生細胞数の数を解析した。その結果、NmUは低濃度で、FM4-CHOに対して増殖を抑制した(図4A)。
3-1. FM4発現CHO細胞株の樹立
膵臓癌細胞株PANC-1のFM4強制発現細胞株の樹立を以下のとおり行った。pvuIで切断し直鎖化したFM4発現ベクター(pMCN-FM4)15μgを1.5 kV, 25 μFDでCHO細胞にエレクトロポレーション(Gene Pulser ; BioRad)により導入した。細胞を400 μg/ml のG418を含む培地で培養し、G418耐性細胞7クローンをピックアップした。これらの細胞より total RNAを精製し、cDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型にしてFM4の発現をRT-PCRにより解析した(図5)。クローン#6がFM4遺伝子を最も発現していたので、この株をFM4発現PANC-1(FM4-PANC1)として以下の実験に用いた。
得られたFM4発現PANC1細胞(FM4-PANC1)がNmUシグナルを細胞内に伝達することを確認するため、NmU添加により細胞内Ca2+濃度の上昇が認められるかを解析した。その結果、FM4-PANC1においてNmU(1μΜ)の添加によって細胞内Ca2+濃度の上昇が確認された(図6)。このことから樹立したFM4-PANC1細胞はNmU刺激によりFM4を介して細胞内にシグナルが伝達されていることが確認された。
この細胞のコロニー形成能に対するNmUの作用を解析するためsoft agar colony formation assayを実施した。Soft agar colony formation assayは以下のとおり行った。
1.5 ml/well ずつbase agar(0.5% agar, 1 x MEM, 10% FCS)を添加した6 well plateに、PANC1細胞、あるいは、FM4-PANC1細胞をtop agar(0.35% agar, 1 x MEM, 10% FCS)中にNmU(1μΜ)存在下、あるいは非存在下で0.5 x 104 cells/wellになるように1.5 ml/wellで各wellに添加した。1ヶ月間培養後、soft agar中におけるコロニー形成細胞数を顕微鏡下で測定した。
以上の結果より、NmUはFM4を介して軟寒天培養におけるコロニー形成を抑制することが示された。
4-1. FM4-CHO細胞の細胞形態変化
FM4を強制発現させたFM4-CHO細胞の細胞形態を顕微鏡で観察した。その結果、親株であるCHO細胞に比べて、FM4-CHO細胞では細胞突起の増加と細胞の肥大といった特徴に見られる細胞の形態変化が観察された(図8)。
そして、これらの特徴を有するFM4-CHO細胞を、さらにNmUで刺激することによって、約12時間程度で細胞突起の消失など著しい細胞の形態変化が観察された(図8)。このことから、NmUが細胞の接着と細胞運動を調節するシグナル伝達に関与していることが推測された。
次にwound healing assayにより細胞運動能に対するNmUの作用について解析を行った。シャーレ中でコンフルエントにさせた親株CHO、およびFM4-CHO細胞をピペットチップの先で傷つけ細胞間に一定の隙間を作った。細胞をPBSで2回洗浄後、無血清培養液にNmU(5μM)添加/非添加で培養を行った。24時間後に、細胞間の隙間へと移動した細胞を顕微鏡で観察・写真撮影した。
Claims (28)
- 配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌治療剤。
- リガンドが配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする請求項1に記載の癌治療剤。
- 癌が膵臓癌である請求項1又は2に記載の癌治療剤。
- 配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌転移抑制剤。
- リガンドが配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする請求項4に記載の癌転移抑制剤。
- 癌が膵臓癌である請求項4又は5に記載の癌転移抑制剤。
- 配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む細胞増殖抑制剤。
- リガンドが配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする請求項7に記載の細胞増殖抑制剤。
- 細胞が膵臓癌細胞である請求項7又は8に記載の細胞増殖抑制剤。
- 以下の(a)から(c)の工程を含む、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法:
(a)配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
(b)工程(a)の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、
(c)被検物質を接触させていない場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。 - 以下の(a)から(c)の工程を含む、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法:
(a)配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
(b)工程(a)の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、
(c)ニューロメジンUを接触させた場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。 - 細胞が組換え細胞であることを特徴とする請求項10又は11に記載の方法。
- 組換え細胞がCHO又はPANC1由来の細胞であることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 細胞刺激活性が細胞内Ca2+濃度増加活性である、請求項10から13のいずれかに記載の方法。
- 細胞刺激活性が細胞増殖抑制活性である、請求項10から13のいずれかに記載の方法。
- 細胞刺激活性が細胞のコロニー形成抑制活性である、請求項10から13のいずれかに記載の方法。
- 細胞刺激活性が細胞の細胞運動抑制活性である、請求項10から13のいずれかに記載の方法。
- 請求項10から17のいずれかに記載の方法より取得されたリガンド。
- 癌の診断方法であって、
標本の生物試料における配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルを検出する工程を含み、
正常組織と比較して、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルが上昇している場合に、癌と診断される方法。 - 検出が、配列番号:14に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、それと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらの断片をプローブとして用いて行われる、請求項19に記載の方法。
- ポリヌクレオチドが配列番号:13に記載の塩基配列を含むことを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 癌が膵臓癌である請求項19から21のいずれかに記載の方法。
- 配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法。
- 配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌の転移を抑制する方法。
- 配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、細胞の増殖を抑制する方法。
- 癌治療剤の製造における、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。
- 癌転移抑制剤の製造における、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。
- 細胞増殖抑制剤の製造における、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。
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KR20100058554A (ko) * | 2007-09-11 | 2010-06-03 | 몬도바이오테크 래보래토리즈 아게 | 치료제로서의 망막 콜린성 뉴런을 위한 신경영양성 인자 (nfrcn) 및 융모성 고나도트로핀―베타 (109―145)의 용도 |
DE102012216972B3 (de) * | 2012-09-21 | 2013-09-19 | Hilti Aktiengesellschaft | Verwendung oberflächenfunktionalisierter Kieselsäuren als Additiv für Reaktionsharz-Zusammensetzungen sowie dieses enthaltende Harz- und Härter-Zusammensetzungen |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001044297A1 (en) * | 1999-12-17 | 2001-06-21 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Dna encoding snorf62 and snorf72 receptors |
WO2001081418A1 (en) * | 2000-04-27 | 2001-11-01 | Merck & Co., Inc. | New neuromedin u receptor nmur2 and nucleotides encoding it |
GB2374665A (en) * | 2001-01-11 | 2002-10-23 | Glaxo Group Ltd | G-protein coupled receptor for neuromedin |
JP2005526981A (ja) * | 2002-05-23 | 2005-09-08 | バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト | ニューロメジンu受容体2(nmu2)の診断および治療的使用 |
JP2005532041A (ja) * | 2002-03-07 | 2005-10-27 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー | 後生的に沈黙化された腫瘍抑制遺伝子のゲノムスクリーニング |
WO2006024283A2 (de) * | 2004-08-31 | 2006-03-09 | Technische Universität Dresden | Verbindungen und methoden zur behandlung, diagnose und prognose bei pankreaserkrankungen |
JP2009536516A (ja) * | 2006-04-20 | 2009-10-15 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | 肺癌の治療標的としてのNMU−GHSR1b/NTSR1発癌シグナル伝達経路 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US7138249B2 (en) * | 2000-02-04 | 2006-11-21 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Screening method |
AU2001264559A1 (en) * | 2000-06-05 | 2001-12-17 | Avalon Pharmaceuticals | Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets |
JP2004511252A (ja) * | 2000-10-16 | 2004-04-15 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | ニューロメディンuデルタ |
WO2004067725A2 (en) * | 2003-01-30 | 2004-08-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying modulators of nmur2-mediated activity |
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001044297A1 (en) * | 1999-12-17 | 2001-06-21 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Dna encoding snorf62 and snorf72 receptors |
WO2001081418A1 (en) * | 2000-04-27 | 2001-11-01 | Merck & Co., Inc. | New neuromedin u receptor nmur2 and nucleotides encoding it |
GB2374665A (en) * | 2001-01-11 | 2002-10-23 | Glaxo Group Ltd | G-protein coupled receptor for neuromedin |
JP2005532041A (ja) * | 2002-03-07 | 2005-10-27 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー | 後生的に沈黙化された腫瘍抑制遺伝子のゲノムスクリーニング |
JP2005526981A (ja) * | 2002-05-23 | 2005-09-08 | バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト | ニューロメジンu受容体2(nmu2)の診断および治療的使用 |
WO2006024283A2 (de) * | 2004-08-31 | 2006-03-09 | Technische Universität Dresden | Verbindungen und methoden zur behandlung, diagnose und prognose bei pankreaserkrankungen |
JP2009536516A (ja) * | 2006-04-20 | 2009-10-15 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | 肺癌の治療標的としてのNMU−GHSR1b/NTSR1発癌シグナル伝達経路 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CHIRURGISCHES FORUM FUER EXPERIMENTELLE UND KLINISCHE FORSCHUNG, vol. 34, JPN6007013876, 2005, pages 65 - 66, ISSN: 0002297512 * |
DASGUPTA, S ET AL., ORAL ONCOLOGY, vol. 42, no. 3, JPN6012040813, 2006, pages 306 - 316, ISSN: 0002297515 * |
NATURE, vol. 406, JPN6007013866, 2000, pages 70 - 74, ISSN: 0002297514 * |
PHARMACOLOGICAL REVIEWS, vol. 56, JPN6007013871, 2004, pages 231 - 248, ISSN: 0002297513 * |
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