WO2007141460A2 - Procédé de greffage de polymères bioactifs sur des matériaux prothétiques - Google Patents

Procédé de greffage de polymères bioactifs sur des matériaux prothétiques Download PDF

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Véronique MIGONNEY
Gérard Helary
Flavie Noirclere
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Universite Paris 13
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Definitions

  • the present invention relates to methods for grafting bioactive polymers onto a prosthetic material, materials obtainable by this method and applications thereof. More specifically, the invention relates to a process for directly grafting polymers to the surface of prosthetic materials.
  • a prosthesis in a bone site generates a cascade of tissue / implant reactions called "host response" which, if it is controlled, ultimately leads to "osseointegration of the implant” .
  • Osseointegration is the perfect integration of the implant into the bone thanks to an intimate bone / prosthesis contact and an absence of fibrous tissue at the interface. This integration is necessary to rehabilitate a deficient function through definitive bone implants (joint prostheses, dental implants). This process can however be affected by several parameters. On the one hand the physicochemical properties of the material such as surface topography, roughness, chemical composition and surface energy, on the other hand the surgical technique and the presence of germs. In addition, the presence of "fibro-inflammatory" tissue around the implant, which has neither the biological activities nor the mechanical characteristics of the bone tissue, increases the susceptibility to aseptic loosening (disconnection of the implant) and infection of the implantation site.
  • Biomaterials are materials intended to replace all or part of the functions that can no longer be provided by tissues, organs or parts of organs deficient.
  • implantable biomaterials must mainly meet two criteria. They must first have specific mechanical properties, necessary to correctly ensure the mechanical functions of tissues or defective organs. They must also not trigger a hostile response from the host that is to say, be “accepted” and integrated by the host in a controlled manner, in other words be "biointegrable”.
  • staphylococcal infections following the implantation of a pe- perant (orthopedic prosthesis) or even temporary (catheter) biomaterial often have dramatic consequences for patients such as septicemia, endocarditis or osteomyelitis and their healing is extremely difficult if not impossible. as long as the implant stays in place.
  • These unwanted biological responses to the implant can lead to further surgery or even removal of the implanted biomaterial. It is therefore necessary to optimize the biomaterial / cell interactions in the case of joint implants but also in the case of dental implants and at the same time to prevent the infection of these materials by controlling the biomaterial / bacterial interactions.
  • a method of grafting polymers by silanization has been described. This process makes it possible to functionalize hydroxylated or NH 2 -rich surfaces prior to the grafting of a polymer.
  • silanization was mainly used to create metal-polymer interfaces.
  • the graft polymers may be bioactive polymers, ie polymers that are capable of orienting eukaryotic and / or prokaryotic cellular responses in the sense that such graft polymers promote the post-integration of a prosthetic implant and prevent the development of 'an infection.
  • silanization protocol used on these substrates by most authors involves etching the surface of the sample to promote the presence of the hydroxyl groups, and then immersing the sample in a solution containing the silane molecule.
  • the advantages of these reactions are their simplicity and stability, ascribed to their covalent bond and their network structure.
  • the effectiveness of the silanization depends on the concentration of hydroxyl groups on the surface of the material, and this technique does not immobilize all the polymers, but only those which have a functional group compatible with that located at the end of the chain. silane derivative.
  • the present inventors have developed a novel process for grafting bioactive polymers onto a prosthetic material.
  • a first aspect of the invention therefore relates to a method for grafting bioactive polymers onto a prosthetic material.
  • the invention relates to prosthetic materials that can be obtained by such a method.
  • the invention relates to prosthetic implants made from prosthetic materials that can be obtained by the method of the invention.
  • no intermediate molecule such as a silane derivative, is used between the surface of the material and the polymer to be grafted onto it. .
  • the subject of the invention is a process for grafting bioactive polymers onto a prosthetic material comprising the following steps:
  • the prosthetic material on which active species have been generated is placed in the presence of at least one monomer carrying a function allowing a radical polymerization, its radical polymerization allowing the formation of a bioactive polymer, in the absence of oxygen.
  • the process according to the invention is a direct process, as opposed to the indirect method described above, in that the polymers are formed directly on the prosthetic material from the monomers composing them. Indeed, in the present process, free radicals are formed directly on the prosthetic material which then serves as an initiator of the polymerization reaction.
  • the inventors have been able to show that such a direct grafting process has several advantages over the indirect grafting method.
  • the process according to the invention is in particular more economical, faster and more effective than the indirect method, in particular in terms of the amount of polymer fixed on the prosthetic material.
  • the process of the present invention makes it possible to obtain a grafting density 2 to 15 times greater than that obtained with the indirect silanization grafting method of the prior art.
  • a prosthetic material is a material that can be used in the manufacture of a medical implant such as a prosthesis, in particular a hip prosthesis or a dental prosthesis.
  • the materials modified by the process of the present invention more specifically correspond to any material on the surface of which free radicals can be formed by chemical oxidation, in particular by acidic chemical oxidation or by ozonation, and then heating.
  • metal supports including titanium and its alloys, in particular based on nickel, vanadium, aluminum and / or molybdenum, aluminum, tantalum, iridium, zirconium, gold and steel, ceramic or glass.
  • the prosthetic material is a non-polymeric prosthetic material.
  • the prosthetic material is titanium or one of its alloys.
  • Titanium is commonly used as a prosthetic material because it is biocompatible. Indeed, titanium is a material of choice for orthopedic or dental implants because of its mechanical properties quite close to those of the bone, its good tolerance due to its osseointegration capacities and / or the absence of phenomenon of allergy or rejection vis-a-vis titanium.
  • the prosthetic material can be polished by abrasion before formation of free radicals to overcome the problems of roughness of the surface of the material.
  • the prosthetic materials are polished with abrasive paper and preferably with different abrasive papers of decreasing particle size. More specifically, mechanical polishing of prosthetic materials can be achieved by means of an automatic arm mounted on a rotary polisher, with abrasive paper of decreasing grain size.
  • abrasive papers of grade 800, 1000 and then 1200 can be successively used.
  • the prosthetic material may also be washed, preferably successively with polishing, in particular in an acetone solution, and then preferably dried. It can be used directly after the polishing, washing and / or drying, or can be stored in the absence of oxygen, preferably under an inert atmosphere, such as under argon or helium.
  • the active species that give off free radicals are generated on the surface of the prosthetic material by oxidation, in particular by chemical oxidation.
  • a chemical oxidation may notably be mentioned by the use of an acid / H 2 O 2 mixture, in particular H 2 SO 4 / H 2 O 2 , or an oxidation by ozonation.
  • the chemical oxidation by the use of an acid / H 2 O 2 mixture is particularly preferred in the case of the oxidation of metal prosthetic materials, in particular the use of an H 2 SOVH 2 O 2 mixture.
  • Other acids may also be used to form peroxides on the surface of the prosthetic material, in particular hydrofluoric acid or hydrochloric acid, always in admixture with H 2 O 2 .
  • acid mixture / H 2 ⁇ 2 is meant the simultaneous or sequential mixing of the solutions, namely the acid solution and the H 2 O 2 solution .
  • the two solutions are brought into contact simultaneously with the prosthetic material to be oxidized, or the acid solution is brought into contact at first, then the H 2 O 2 solution is contacted in a second step with the prosthetic material.
  • the oxidation time may vary to a large extent and the person skilled in the art may adapt it depending on the prosthetic material to be treated, the chemical oxidation mode used to form radical donor species. free on the surface of this material and the desired graft density.
  • Those skilled in the art may in particular determine the best procedure by measuring the degree of grafting obtained after grafting polymers on the oxidized prosthetic material to be tested, in particular by assaying the graft density toluidine blue (see Example 1.5).
  • the oxidation time is preferably from 1 to 10 minutes, more preferably from 3 to 6 minutes and most preferably from oxidation time is 5 minutes.
  • this oxidation time applies to the oxidation of titanium or one of its alloys with a H 2 SO 4 / H 2 O 2 solution .
  • the prosthetic material may be, for example, immersed in the acid solution for at least 10 seconds, preferably for at least 20 seconds, preferably for at least 30 seconds, more preferably for more than 50 seconds, more preferably for more than 1 minute, more preferably for more than 2 minutes, more preferably for more than 3 minutes preferably for more than 4 minutes.
  • This time of bringing titanium, or one of its alloys, with H 2 SO 4 can be much higher and can, for example, reach 30 minutes or more.
  • the time for bringing the prosthetic material into contact with the acid solution is less than or equal to 5 minutes, a time beyond which a decrease in the degree of grafting is observed. This procedure is in particular applied in the case of the oxidation of titanium or one of its alloys, in the presence of a solution of H 2 SO 4
  • the time of bringing the prosthetic material into contact with the H 2 O 2 solution may vary.
  • the prosthetic material preferably titanium or one of its alloys
  • the prosthetic material is brought into contact with H 2 O 2 for at least 10 seconds, preferably at least 20 seconds, preferably at least 30 seconds, preferably at least 20 seconds.
  • an action of H 2 SO 4 on the titanium, or one of its alloys is preferred for 1 minute and then an H 2 O 2 action on the titanium for 2 minutes.
  • the contacting of the prosthetic material with the acid solution and / or the H 2 O 2 solution can be carried out by any means known per se.
  • the solutions may be poured into a container containing the prosthetic material, or the prosthetic material may be immersed in a container containing the solution (s).
  • the inventors believe that the treatment with an acidic solution makes it possible to eliminate the native oxide layer that forms spontaneously on the prosthetic materials in the presence of air, by attacking it chemically.
  • Hydrogen peroxide makes it possible to create hydroperoxides on the surface of the prosthetic material, in particular titanium hydroperoxides (TiOOH) in the case of the use of titanium as a prosthetic material.
  • TiOOH titanium hydroperoxides
  • These hydroperoxides free radical donors when they are heated, can then serve as initiators for the radical polymerization of the monomers on the prosthetic material, in particular on titanium.
  • the proportion of acid with respect to H 2 O 2 can vary to a large extent and the skilled person is able to define, on the basis of the present description, the most effective ratio to result in a degree of grafting. wish.
  • a 50/50 (v / v) HiSO 4 ZH 2 O 2 solution is used to oxidize the prosthetic material.
  • the temperature used is generally room temperature (20-30 ° C.), or even a lower temperature (for example, between 0 and 20 ° C.), the oxidation reaction being able to be exothermic.
  • metal salts iron, nickel, chromium, copper are added during the step of generating active species that give free radicals.
  • These metal salts are in particular added to the acid / H 2 O 2 mixture.
  • the concentration of these salts can vary to a large extent. In particular, the concentration ranges from 10 -4 mol / l to 2 mol / l, which promote the formation of a higher concentration of peroxide on the surface of the prosthetic material, in particular titanium or one of its alloys, and increase thus the degree of grafting.
  • iron sulfate is added to the mixture acid / H 2 ⁇ 2 salts based on iron, nickel, chromium or copper, such as ferrous sulfate (FeSO 4), acetate Iron (Fe (C 2 H 3 O 2 X iron bromide (FeBr 3 ), iron iodide (FeI 2 ), iron nitrate Fe (NO 3 ) 3 ), iron thyocyanate (Fe (SCN ) 2 , Fe (SCN) 3 ) Fe 2 (SCN) 6 , ...
  • iron sulfate is added to the acid / H 2 O 2 mixture.
  • a step of obtaining free radicals from the active species generated beforehand on the surface of the material is carried out, in particular by thermal reaction of the active species generated. More specifically, the thermal reaction is carried out at a temperature of between 25 and 160 ° C., preferably between 40 and 100 ° C., more preferably between 50 and 80 ° C., more preferably between 60 and 75 ° C. and most preferably at 70 ° C.
  • the step of producing the free radicals can be carried out before, preferably during or after the step of contacting the monomers with the material on which active species have been generated.
  • the method according to the invention comprises the following steps:
  • active species are generated on a prosthetic material as defined above;
  • free radicals are generated, in particular by heating between 40 ° C. and 100 ° C .; and the prosthetic material on which free radicals have been generated is placed in the presence of at least one monomer carrying a radical polymerization-functional, its radical polymerization allowing the formation of a bioactive polymer, in the absence of 'oxygen.
  • active species are first generated on the material which is then brought into contact with monomers and under conditions allowing the formation of free radicals from the active species, in particular by heating the solution. of monomers.
  • active species are first generated on the material which is then brought into contact with a solution of monomers, the free radicals then being formed, in particular by heating the solution of monomers.
  • the monomers used in the present process are advantageously grafted onto the abovementioned supports by means of a radical polymerization reaction.
  • the latter is initiated by the free radicals generated directly on the support to be grafted.
  • the monomers used in the process according to the invention comprise at least one group which allows the polymerization.
  • the monomers comprise at least one aliphatic unsaturation, preferably a vinyl group, which allows the polymerization.
  • An advantage of the process of the present invention over the indirect method described above is based on the possibility of grafting a wide variety of polymers. Indeed, everything monomer capable of being polymerized via a radical polymerization reaction may be used in the present invention.
  • the structure of the monomers used in the present invention allows the formation of a bioactive polymer on the surface of a prosthetic material.
  • a polymer is bioactive if it is capable of orienting the eukaryotic and / or prokaryotic cellular responses to the site of integration of the prosthetic implant made from a prosthetic material that can be obtained according to the method of the present invention, ie whether it is capable of promoting post-integration of the prosthetic implant and preventing the development of an infection.
  • the monomers used in the context of the present process advantageously comprise a sulphonate and / or carboxylate group.
  • polymers bearing sulphonate and / or carboxylate ionic groups promote the adhesion, colonization and differentiation of osteoblasts.
  • polymers bearing these same groups but even more so when they carry only sulfonate groups, allowed to inhibit the adhesion of bacterial strains, in particular Staphylococcus aureus, a strain that is very predominantly involved. in infections on prosthetic materials.
  • the polymers formed on the prosthetic materials by the process according to the invention are formed from at least one of the following monomers: acrylic acid, methacrylic acid, methyl methacrylate (MMA), N- (sodium phenyl sulfonate) acrylamide (NaAS), N- (sodium sulfonate phenyl) methacrylamide (NaMS), sodium styrene sulfonate (NaSS), ethylene glycol methacrylate phosphate, methacryloyl- di-, isopropylidene, monomers bearing osicidal groups such as, for example, glucose, glucofuranose, sucrose, polyose, fructose, etc.
  • monomers bearing osicidal groups such as, for example, glucose, glucofuranose, sucrose, polyose, fructose, etc.
  • the graft polymers obtained may be homopolymers or copolymers.
  • the graft homopolymers are formed from sodium styrene sulphonate (grafting of polyNaSS) or from methyl methacrylate (grafting of poly (methyl methacrylate), or PMMA). .
  • the polymers that can be grafted by the process according to the invention are copolymers obtained by radical polymerization of monomers comprising at least one monomer of general formula (I) and at least one monomer of general formula (II), formulas (I) and (II) being as follows:
  • R and R ' which may be identical or different, represent a hydrogen atom or a linear or branched C 1 to C 6 alkyl radical, and A represents a corresponding arylsulphonate or acidic radical.
  • the monomers of formula (I) may initially have ester functions, the copolymers thus obtained will then be hydrolysed (partially or totally) to obtain the corresponding acid functions.
  • A is chosen from the radicals of the following formulas:
  • M represents a metal ion, preferably an alkali metal.
  • the alkali metal is preferably selected from sodium and potassium, advantageously sodium.
  • linear or branched C 1 to C 6 alkyl radicals there may be mentioned the methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl or t-butyl, pentyl and hexyl radicals.
  • acrylic acid AA
  • methacrylic acid MA
  • ethacrylic acid EA
  • their corresponding salts in particular alkali metal salts, preferably sodium
  • Methacrylic acid is preferred.
  • NaAS sodium sulfonate phenyl
  • NaMS N- (sodium phenyl sulfonate) methacrylamide
  • NaSS sodium styrene sulfonate
  • Sodium styrene sulfonate is preferred.
  • the graft copolymer on the prosthetic material may be represented more specifically by the following general formula (V):
  • Comma means that the amount, ratio, and sequence of monomeric units present in the copolymers vary. This variation is directly related to the parameters of the polymerization process, such as for example the amount of each monomer used.
  • the molecular weights of the graft polymers according to the process of the present invention may vary to a large extent and are selected or controlled by those skilled in the art depending on their application or subsequent use. To give an order of magnitude, the weight average molecular weight can range from 1,000 to 100,000 daltons.
  • the amounts of the monomers of formulas (I) and (II) can vary to a large extent and depend in particular on the properties desired for the copolymers.
  • the molar ratio of (I) to (II) varies from 90/10 to 10/90, advantageously from 80/20 to 20/80.
  • copolymers according to the invention have in particular the following molar fractions of (I) on (II): 90/10, 80/20, 70/30, 60/40, 50/50, 40/60, 30/70, 20/80 and 10/90 (these fractions actually correspond to the fractions of the monomers introduced, the fractions of the monomers incorporated in the copolymers obtained by NMR analysis varying by at most ⁇ 2 with respect to those mentioned above).
  • the graft copolymers according to the process of the present invention may be obtained by radical polymerization of monomers comprising, in addition to the monomers of formulas (I) and (II), other monomers having at least one aliphatic unsaturation.
  • the Other monomers having at least one aliphatic unsaturation may be of any kind, including monomers giving a water-soluble character or not to graft polymers.
  • the additional monomers are water-soluble in nature, such as monomers having a sugar or phosphate type radical.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a linear or branched C 1 -C 6 alkyl radical, as defined above, and n 'represents a real number between 10 and 1000.
  • n represents a real number between 10 and 1000.
  • groups ose of the formula (VII) there may be mentioned glucose, galactose and sucrose.
  • the amount of the monomers of formula (I) and (II) is advantageously greater than or equal to 25%, preferably greater than or equal to 50%, in moles relative to the total number of moles. monomer units present in the polymers.
  • the copolymers are capable of being obtained by radical polymerization of the monomers of formula (I) and (II) only.
  • the grafting time can vary to a large extent. Those skilled in the art are able to choose the time required for the polymerization on the prosthetic material depending on the nature of the latter, the polymer to be grafted and the desired graft density. The skilled person can select the most suitable time by measuring the graft density at
  • the prosthetic material is contacted with the monomer (s) for at least approximately 30 minutes, and preferably between approximately 1 hour and approximately 48 hours. More preferably, the prosthetic material is brought into contact with the monomer (s) for more than 2 hours, preferably more than 3 hours, preferably more than 5 hours, preferably more than 8 hours, and preferably for approximately 15 hours.
  • the invention relates to a method for grafting polyNaSS onto titanium comprising the following steps: active species that give off free radicals are generated on the surface of the titanium; and
  • the titanium on which active species have been generated is brought into contact with NaSS at a temperature of between 40 and 100 ° C., for at least 8 hours, in the absence of oxygen.
  • the invention relates to a method for grafting polyNaSS onto titanium comprising the following steps:
  • the titanium on which active species have been generated is brought into contact with NaSS at a temperature of 70 ° C. for 15 hours, in the absence of oxygen.
  • the radical polymerization reaction must proceed in the absence of oxygen, which is an inhibitor of the reaction.
  • the reaction is carried out in the absence of oxygen, under an inert atmosphere, in particular under argon, helium or nitrogen, advantageously under nitrogen.
  • the material thus grafted is recovered, and optionally rinsed, in particular with water (for example distilled water), in particular in order to remove the polymers formed but not grafted.
  • Another subject of the invention relates to prosthetic materials grafted with bioactive polymers that can be obtained according to the method described above.
  • the invention also relates to the use of a prosthetic material according to the invention for the manufacture of a prosthetic implant, in particular for the manufacture of a joint prosthesis or a dental prosthesis.
  • a further object of the invention relates to prosthetic implants made from prosthetic materials obtainable by the method described above.
  • Figure 1 Diagram showing the direct NaSS grafting procedure according to the invention.
  • FIG. 2 graph representing the IR spectrum of the chemically oxidized and then grafted titanium surface of polyNaSS.
  • Figure 3A deconvolution of carbon elements CIs (left) and oxygen Ois (right) of chemically oxidized titanium.
  • Figure 3B deconvolution of carbon elements CIs (left) and Ois oxygen (right) of grafted titanium of polyNaSS.
  • Figure 3C deconvolution of titanium elements Ti2p (left) and sulfur S2p (right) of chemically oxidized titanium.
  • Figure 3D deconvolution of titanium elements Ti2p (left) and sulfur S2p (right) of grafted titanium of polyNaSS.
  • Figure 3E Comparison of the deconvolutions of the sulfur element S2p of chemically oxidized titanium (left) and titanium grafted polyNaSS (right).
  • Figure 4 sectional views of the neoformed bone surface around implants.
  • S100 / OC 100% sulfonate and 0% carboxylate; C100 / S0 100% carboxylate and 0% sulphonate.
  • the first step was the development of the grafting of ionic groups.
  • the functionalization was made on titanium discs (99.7% purity) previously polished to overcome the problems of roughness.
  • the grafting of the arysulphonate groups on the titanium surface was done directly by the creation of free radicals by chemical oxidation, which are then used as initiators of the polymerization of a monomer bearing the arylsulphonate functions.
  • the monomer molecule is sodium styrene sulfonate (NaSS).
  • NaSS sodium styrene sulfonate
  • Titanium (Alfa Aesar company) is in the form of extruded bars 12.7 mm in diameter, having undergone a 30-minute expansion annealing at 700 ° C. Its purity (Table 1) is 99.7% of nominal composition (grade 1, or T40). Table 1 Chemical composition of pure titanium used
  • the mechanical polishing of the discs is carried out by means of an automatic arm, mounted on a rotary polisher, with abrasive paper of decreasing granulometry (struers).
  • a first polishing with a grade 800 paper (22 ⁇ m grains) removes about 1/10 th of a mm thickness, which has the effect of removing the thickness of metal damaged by pitting due to EDM cutting mode. (electric arc).
  • the polishing is then refined by the use of paper of smaller and smaller sizes (paper 1000, then 1200).
  • the protocol used is the following: 8 min. at P800, 4 min at P1000, 4 min at P 1200 (14 ⁇ m grains). A roughness surface equivalent to that commonly used in the literature for cell behavior studies is obtained.
  • the samples are washed with a solution of pure acetone under ultrasound for 10 minutes at room temperature. They are then dried and used immediately, or kept under argon (glove box).
  • the monomer used to provide the appropriate ionic groups on the titanium surface is sodium styrene sulfonate (NaSS, A-vinylbenzenesulfonic acid sodium salt, Aldrich), a vinyl monomer whose chemical formula is shown below. H 2
  • Sodium styrene sulfonate is purified by recrystallization. This procedure consists of dissolving a mass m of monomer in a water / ethanol mixture in a proportion of 10/90 at a temperature of 60-70 ° C. The solution is then filtered under heat, under water jet vacuum. The solution thus filtered is placed at 4 ° C. for 24 hours. The crystals formed are recovered by filtration under vacuum and then dried at 60-70 ° C. under vacuum.
  • the "Toluidine Blue Assay” is a colorimetric technique using the chromophore molecule is Toluidine Blue which absorbs in the visible at 633 nm.
  • This molecule has the particularity to complex, via its group N + (CHS) 2 , with the anionic groups (-COO " ).
  • the dosage of toluidine blue This property has been transposed to NaSS, which can complex with the N + (CHS) 2 group via its sulfonate group (-SO 3 " ).
  • the grafted titanium samples are brought into contact with a solution of Toluidine Blue at 5 ⁇ 10 -4 M (adjusted to pH 10) at a temperature of 30 ° C. for 6 hours This step corresponds to the complexation of Toluidine blue with The monomer units of the grafted polyNaSS are then rinsed thoroughly with a solution of sodium hydroxide 1. 10 -4 M 5 to remove uncomplexed Toluidine Blue. Rinses are stopped when the solution is colorless.
  • the complexed Toluidine Blue is then decomplexed with a solution of 50% acetic acid (Acros organics) which is left in contact with the titanium samples for 24 hours.
  • the solution obtained is determined spectrophotometrically using a Safas Xenius-type spectrophotometer controlled by its software.
  • the molar extinction coefficient ⁇ of toluidine blue is equal to 51230 L-mol ⁇ xm- 1 .
  • the surface of a pellet measures 1 cm 2 , so this mass of grafted monomer can be expressed in amount of material grafted in g / cm 2 for a pellet surface.
  • the measured optical density gives a quantity of grafted molecules of approximately 10 ⁇ g / cm 2 .
  • the assayed samples were then washed several times with water and their complexation with toluidine blue was assayed up to four times.
  • the graft density measured then fell to 3 ⁇ g / cm 2 , and stabilized at this value.
  • the phenomenon described above can explain this observation: indeed, the complexation with Toluidine Blue may have caused a distortion of the polymer chains and the multiple washes performed have allowed to evacuate the entangled chains and not actually grafted.
  • the graft density obtained with the process according to the invention is an extremely important density because the values obtained in the literature with the indirect silanization process are rather of the order of 0.1 to 0.2 ⁇ g / cm 2 .
  • the FTIR spectrophotometer used to make the measurements is a Nicolet device, Avatar 370-FT-IR. Samples are analyzed in ATR mode. For the measurements, the wavelengths are scanned between 4000 and 650 cm “1 , at a pitch of 4 cm “ 1 , with a resolution of 1 cm "1.
  • the titanium samples, oxidized or not, grafted or not, are applied with a force calibrated against the crystal, to ensure maximum contact between the sample and the diamond, 120 acquisitions are accumulated per point, to limit the background noise to the maximum.The background is taken on the atmosphere.
  • Table 2 summarizes the main absorption bands characteristic of polyNaSS and their attributions to the different chemical groups. Table 2: Characteristic IR absorption bands of polyNaSS
  • the antisymmetric valence vibration of the SO 2 group corresponds to the peak at 1410 cm -1 , and a shoulder of the preceding peak is noted around 1220 cm -1 , which corresponds to the symmetric valence vibration of the SO 2 group.
  • the samples were analyzed with an Escalab VG 22Oi-XL spectrometer. X-rays are produced by a monochromatic AlKa source of 1486.6 eV.
  • Samples are introduced four by four into the analysis chamber, which is pumped under ultra-high vacuum (10 -9 to 10 -10 mbar).
  • the emission angle used is 45 °, for a depth of analysis of the surface of 10 nm at full depth (the detector being placed in the normal of the sample).
  • the diameter of the dots on the sample is 150 to 200 ⁇ m
  • each sample begins with the acquisition of a global spectrum scanning the entire domain of binding energies, in order to identify the main chemical elements present on the surface of the sample, which will be analyzed each then more finely. .
  • the given energy resolution is ⁇ 0.1 eV.
  • the main elements are carbon, oxygen, and titanium; for the grafted samples, sulfur and sodium (NaSS) are also detailed. Deconvolutions are realized with the software Elipse, provided by VG; the reference is taken from the principal peak of the carbon contribution Q 8 , which is fixed at a binding energy of 284.8 eV.
  • the overall surface composition of the chemical oxide is almost the same as that of the native oxide of the control, with the exception of the atomic percentage of titanium which is lower: thus, the percentages of carbon and oxygen are respectively 33% and 46% for the native oxide and 34% and 47% for the chemical oxide.
  • the atomic percentage of titanium drops from 15% to 7% after chemical oxidation.
  • the amount of titanium detected decreases in "relative proportion" because of the significant presence of sulfur contamination. This sulfur detected in large quantities (8 atomic%) on the oxidized samples, is probably a residue of the oxidation bath which contains sulfuric acid which persists despite all the rinses carried out.
  • the deconvolution of the Ti2p spectrum (left) of the grafted oxide (FIG. 3D) has the same appearance as with the non-grafted oxide (FIG. 3C), with a single Ti (IV) component that is even less intense because the titanium present in the TiO 2 oxide has moved away from the analyzed zone, masked by the polymer layer.
  • the peak position at 168.1 eV sulfur indicates that the sulfur is present as SO3 sulfonate ions ".
  • the peak S2py 2 is positioned with a ⁇ energy of 1.18 eV, or about 169.3 eV.
  • FIG. 3E shows for comparison the S2p3 / 2 spectra of sulfur, obtained respectively on the chemical oxide alone (on the left) and the grafted chemical oxide (on the right).
  • the shift of the S2p 3/2 peak position from 168.9 eV to 168.1 eV between the oxidized and grafted states is easily observed.
  • the sodium peak of Nais comes out at an energy of 1072 eV.
  • a decrease in the value of the contact angle with water is observed from control titanium to titanium grafted with poly NaSS due to the hydrophilic nature of the poly NaSS.
  • Titanium control 44.3 ( ⁇ 2.3) 27.7 ( ⁇ 1.1) 16.5 ( ⁇ 1.2)
  • the overall value of the surface energy increases more and more from polished to titanium titanium grafted with polyNaSS.
  • it goes from 44.3 mN / m for unmodified titanium to 59.2 mN / m for oxidized titanium, and to 64.9 mN / m for grafted titanium.
  • This increase is mainly due to the increase in the polar component of the energy whose contribution is multiplied by 2 between the unmodified and oxidized states; this same contribution increases practically by a factor of 3 between the unmodified and grafted states, while that of the dispersive component decreases at the same time by a factor of 1.6.
  • the grafting of the polyNaSS slightly increases the surface energy compared with the chemically oxidized titanium.
  • the surface energy increases from 59.2 to 64.9 mN / m, the NaSS being a polar molecule thanks to its ionic sulfonate group, and carrier of three oxygen atoms.
  • the cells chosen to study the cellular activity in contact with the modified titanium surfaces belong to a line derived from human osteoblasts MG-63. Adhesion measurements, alkaline phosphatase activity, and amounts of precipitated calcium phosphate were made.
  • Adhesion measurements of the MG63 cells were performed after 30 minutes of incubation under a constant force of 140 dynes / cm 2 . It is found that the percentage of detached cells decreases oxidized titanium (14%) to titanium grafted poly NaSS (8%). The grafted surfaces of polyNaSS improve adhesion although their hydrophilic character is at a level fairly close to that of only oxidized surfaces.
  • the first step was to measure the alkaline phosphatase activity of the cells for the primordial role of this enzyme in the formation of bone and its inducing effect on the mineral deposit as it regulates the phosphate transport.
  • the presence of poly NaSS grafted on the titanium surface significantly increases the alkaline phosphatase activity of the order of 25% relative to the oxidized titanium surface.
  • the second stage of differentiation is characterized by bone formation and mineral deposition: calcification.
  • the calcium phosphate assay was therefore performed to determine the stage of differentiation achieved by the MG-63 osteoblasts. It has been found that the amounts of calcium extracted from the cells are increased significantly (about 30%) when the supports were grafted with polyNaSS relative to the oxidized surfaces.
  • the bone is evenly distributed along the bone surface with relatively large contact areas. Fibrous tissue and cartilaginous nodules are not observed, unlike unmodified titanium implants.
  • the contacts between the bone and the implant are present but the surfaces are smaller and fewer. There are areas of fibrous tissue in contact with the implanted surface that contain giant cells.
  • the presence of sulfonate group increases the amount of bone tissue in contact with the implant. Conversely, the presence of carboxylate groups promotes the formation of fibrous tissue.
  • a more quantitative evaluation of bone / implant contact was performed by histomorphometry. The mean bone / implant contact percentage for unmodified titanium was 32% and 38% for sulfonate-modified titanium. The percentage of contact decreases sharply for the implant coated with carboxylate group (12%). The percentage contact cartilage / implant ranges from 1.3% for titanium SO 3 "to 8% titanium carboxylated. The important point is that the percentage contact bone + cartilage to sulfonate titanium is greater than that measured for the unmodified titanium .

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Abstract

La présente invention concerne des procédés pour greffer des polymères bioactifs sur un matériau prothétique, les matériaux susceptibles d'être obtenus par ce procédé et des applications de ces derniers. Plus spécifiquement, l'invention concerne un procédé de greffage direct de polymères à la surface de matériaux prothétiques.

Description

PROCEDE DE GREFFAGE DE POLYMERES BIOACTIFS SUR DES MATERIAUX PROTHETIQUES
La présente invention concerne des procédés pour greffer des polymères bioactifs sur un matériau prothétique, les matériaux susceptibles d'être obtenus par ce procédé et des applications de ces derniers. Plus spécifiquement, l'invention concerne un procédé de greffage direct de polymères à la surface de matériaux prothétiques.
L'implantation d'une prothèse dans un site osseux engendre une cascade de réactions tissus/implants intitulée « réponse de l'hôte » qui, si elle est contrôlée, permet d'aboutir in fine à « l'ostéointégration de l'implant ». L'ostéointégration est l'intégration parfaite de l'implant dans l'os grâce à un contact intime tissu osseux/prothèse et à une absence de tissus fibreux à l'interface. Cette intégration est nécessaire pour réhabiliter une fonction déficiente par l'intermédiaire d'implants osseux définitifs (prothèses articulaires, implants dentaires). Ce processus peut cependant être affecté par plusieurs paramètres. D'une part les propriétés physicochimiques du matériau telles que la topographie de surface, la rugosité, la composition chimique et l'énergie de surface, d'autre part la technique chirurgicale et la présence de germes. De plus, la présence de tissu « fibro-inflammatoire » autour de l'implant, qui n'a ni les activités biologiques, ni les caractéristiques mécaniques du tissu osseux augmente la susceptibilité à un descellement aseptique (désolidarisation de l'implant) et à l'infection du site de l'implantation.
Actuellement, pour assurer l'ancrage de prothèses totales de hanche dans l'os, deux approches sont couramment utilisées : soit l'implant métallique (éventuellement revêtu d'hydroxyapatite) est ancré mécaniquement en force dans l'os, soit il est fixé à l'aide d'un ciment à base de poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA). Durant ces trente dernières années, les revêtements « hydroxyapatite » ont été très utilisés pour améliorer l'ostéointégration des implants, car ils permettent un bon ancrage osseux tout en offrant de bonnes performances mécaniques dans un temps relativement court.
Les biomatériaux sont des matériaux destinés à remplacer tout ou partie des fonctions ne pouvant plus être assurées par des tissus, un organe ou une partie d'organe déficients. Pour cela, les biomatériaux implantables doivent principalement répondre à deux critères. Ils doivent d'abord posséder des propriétés mécaniques spécifiques, nécessaires pour assurer correctement les fonctions mécaniques des tissus ou des organes défectueux. Ils doivent aussi ne pas déclencher de réponse hostile de l'hôte c'est-à-dire être « acceptés » et intégrés par l'hôte d'une manière contrôlée, en d'autres termes être « biointégrables ».
Cependant, aucun matériau de synthèse actuellement implanté ne peut réellement être considéré comme « bioiαtégrable ». En effet, le matériau implanté est considéré comme un « corps étranger » par le système vivant et cela déclenche une série d'événements regroupés sous le terme de réponse inflammatoire, qui si elle n'est pas contrôlée peut alors conduire in fine au rejet de l'implant. Par ailleurs, ce matériau considéré comme « corps étranger » apparaît comme un support privilégié pour l'adhésion et la colonisation de microorganismes tels que les bactéries. L'adhésion de bactéries potentiellement infectantes sur les implants biomédicaux étant l'étape initiatrice de l'infection, représente donc un sérieux problème. D'autre part cette adhésion bactérienne est dans de nombreux cas suivie de la formation d'un « biofîlm » qui joue un rôle de protection des bactéries contre toute thérapie et notamment contre les antibiotiques. Par exemple, les infections à staphylocoques suite à Pimplantation d'un biomatériau peπnanent (prothèse orthopédique) ou même temporaire (cathéter) ont souvent des conséquences dramatiques pour les patients comme des septicémies, des endocardites ou des ostéomyélites et leur guérison est extrêmement difficile voire impossible tant que l'implant reste en place. Ainsi, nous observons trop souvent des phénomènes de rejet lors de l'implantation d'un biomatériau dans un organisme vivant ainsi que des phénomènes d'infection des matériaux implantés. Ces réponses biologiques indésirables vis-à-vis de l'implant peuvent conduire à une nouvelle intervention chirurgicale voire même au retrait du biomatériau implanté. II convient donc d'optimiser les interactions biomatériaux/cellules dans le cas d'implants articulaires mais également dans le cas des implants dentaires et parallèlement de prévenir l'infection de ces matériaux en contrôlant les interactions biomatériaux/bactéries
Des recherches ont été menées afin d'améliorer la biocompatibilité et la biointégration des matériaux utilisés comme implants et par conséquent diminuer les réponses hostiles de l'hôte conduisant au rejet de l'implant. Un axe de recherche concerne la modification des surfaces des matériaux prothétiques, en particulier la modification de la surface du titane et de ses alliages. Une telle modification a pour but de favoriser la biointégration des implants dans les tissus osseux, tout en prévenant les infections.
Un procédé de greffage de polymères par silanisation a été décrit. Ce procédé permet de fonctionnaliser des surfaces hydroxylées ou riches en NH2 préalablement au greffage d'un polymère. Dans le cas du titane, la silanisation a été principalement utilisée pour créer des interfaces métal-polymère. Les polymères greffés peuvent être des polymères bioactifs, c'est à dire des polymères qui sont capables d'orienter les réponses cellulaires eucaryotes et/ou procaryotes en ce sens que de tels polymères greffés favorisent Postéointégration d'un implant prothétique et préviennent le développement d'une infection.
Le protocole de silanisation utilisé sur ces substrats par la plupart des auteurs consiste à attaquer chimiquement la surface de l'échantillon pour favoriser la présence des groupements hydroxyles, puis à immerger l'échantillon dans une solution contenant la molécule de silane. Les avantages de ces réactions sont leur simplicité et leur stabilité, attribuées à leur liaison covalente et à leur structure en réseau. Toutefois, l'efficacité de la silanisation dépend de la concentration en groupements hydroxyles à la surface du matériau, et cette technique ne permet pas d'immobiliser tous les polymères, mais seulement ceux qui possèdent un groupement fonctionnel compatible avec celui situé en bout de chaîne du dérivé silane.
La plupart des auteurs utilisent donc la silanisation comme une étape intermédiaire au greffage ultérieur d'une molécule bioactive ou organique. Dans la suite de cette demande, ce procédé de greffage par silanisation préalable sera désigné comme « procédé de greffage indirect ».
Les présents inventeurs ont mis au point un nouveau procédé de greffage de polymères bioactifs sur un matériau prothétique.
Un premier aspect de l'invention concerne donc un procédé de greffage de polymères bioactifs sur un matériau prothétique.
Selon un deuxième aspect, l'invention concerne les matériaux prothétiques susceptibles d'être obtenus par un tel procédé. Selon un dernier aspect, l'invention concerne les implants prothétiques fabriqués à partir des matériaux prothétiques susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention.
Dans le procédé de greffage de la présente invention, et à la différence du procédé de greffage indirect décrit ci-dessus, aucune molécule intermédiaire, telle qu'un dérivé silane, n'est utilisée entre la surface du matériau et le polymère à greffer dessus.
Ainsi, l'invention a pour objet un procédé de greffage de polymères bioactifs sur un matériau prothétique comprenant les étapes suivantes :
- des espèces actives donneurs de radicaux libres sont générées à la surface du matériau prothétique ; et
- le matériau prothétique sur lequel des espèces actives ont été générées est mis en présence d'au moins un monomère porteur d'une fonction permettant une polymérisation radicalaire, sa polymérisation radicalaire permettant la formation d'un polymère bioactif, en l'absence d'oxygène.
Le procédé selon l'invention est un procédé direct, par opposition au procédé indirect décrit ci-dessus, en ce sens que les polymères sont formés directement sur le matériau prothétique à partir des monomères les composant. En effet, dans le présent procédé, des radicaux libres sont formés directement sur le matériau prothétique qui sert alors d'amorceur de la réaction de polymérisation.
Les inventeurs ont pu montrer qu'un tel procédé direct de greffage a plusieurs avantages par rapport au procédé de greffage indirect. Le procédé selon l'invention est notamment plus économique, plus rapide et plus efficace que la méthode indirecte, en particulier en terme de quantité de polymère fixé sur le matériau prothétique. Ainsi, généralement, le procédé de la présente invention permet d'obtenir une densité de greffage 2 à 15 fois supérieure à celle obtenue avec le procédé de greffage indirect par silanisation de l'art antérieur.
Comme spécifié précédemment, le procédé de greffage de la présente invention est exempt de toute étape intermédiaire de greffage d'une molécule intermédiaire entre le matériau prothétique et le polymère greffé. Au sens de la présente invention, un matériau prothétique est un matériau utilisable dans la fabrication d'un implant médical tel qu'une prothèse, en particulier une prothèse de la hanche ou une prothèse dentaire.
Les matériaux modifiés par le procédé de la présente invention correspondent plus spécifiquement à tout matériau sur la surface duquel des radicaux libres peuvent être formés par oxydation chimique, notamment par oxydation chimique acide ou par ozonation, puis chauffage. A ce titre, on peut notamment citer les supports en métal, incluant le titane et ses alliages, en particulier à base de nickel, de vanadium, d'aluminium et/ou de molybdène, l'aluminium, le tantale, l'iridium, le zirconium, l'or et l'acier, en céramique ou encore en verre. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, le matériau prothétique est un matériau prothétique non polymère.
Avantageusement, le matériau prothétique est le titane ou un de ses alliages.
Le titane est couramment employé comme matériau prothétique car il est biocompatible. En effet, le titane est un matériau de choix pour les implants orthopédiques ou dentaires en raison de ses propriétés mécaniques assez proches de celles de l'os, sa bonne tolérance due à ses capacités d'ostéointégration et/ou à l'absence de phénomène d'allergie ou de rejet vis-à- vis du titane.
Avantageusement, le matériau prothétique peut être poli par abrasion avant formation des radicaux libres pour s'affranchir des problèmes de rugosité de la surface du matériau. Ainsi, dans un mode particulier de réalisation de l'invention, les matériaux prothétiques sont polis avec du papier abrasif et de préférence avec différents papiers abrasifs de granulométrie décroissante. Plus spécifiquement, le polissage mécanique des matériaux prothétique peut être réalisé à l'aide d'un bras automatique monté sur une polisseuse rotative, avec du papier abrasif de granulométries décroissantes. Ainsi, on peut successivement utiliser des papiers abrasifs de grade 800, 1000 puis 1200. Le matériau prothétique peut être également lavé, de préférence successivement au polissage, notamment dans une solution d'acétone, puis de préférence séché. Il peut être utilisé directement après l'étape de polissage, lavage et/ou séchage, ou peut être conservé en l'absence d'oxygène, de préférence sous atmosphère inerte, telle que sous argon ou hélium.
Avantageusement, les espèces actives donneurs de radicaux libres sont générées à la surface du matériau prothétique par oxydation, en particulier par oxydation chimique. On peut notamment citer une oxydation chimique par l'utilisation d'un mélange acide/H2θ2, en particulier H2SO4/H2O2, ou une oxydation par ozonation. L'oxydation chimique par l'utilisation d'un mélange acide/H2O2 est particulièrement préférée dans le cas de l'oxydation de matériaux prothétiques métalliques, en particulier l'utilisation d'un mélange H2SOVH2O2. On peut également utiliser d'autres acides pour former des peroxydes à la surface du matériau prothétique, notamment l'acide fluorhydrique ou l'acide chlorhydrique, toujours en mélange avec H2O2.
Par « mélange acide/H2θ2 » on entend le mélange simultané ou séquentiel des solutions, à savoir la solution d'acide et la solution de H2O2. Ainsi, soit les deux solutions sont mises en contact simultanément avec le matériau prothétique à oxyder, soit la solution d'acide est mise en contact dans un premier temps, puis la solution de H2O2 est mise en contact dans un deuxième temps avec le matériau prothétique. Dans tous les cas, le temps d'oxydation peut varier dans une large mesure et l'homme du métier pourra l'adapter en fonction du matériau prothétique à traiter, du mode d'oxydation chimique mis en oeuvre pour former des espèces donneurs de radicaux libres à la surface de ce matériau et de la densité de greffage souhaitée. L'homme du métier pourra notamment déterminer le meilleur mode opératoire en mesurant le taux de greffage obtenu après avoir greffé des polymères sur le matériau prothétique oxydé à tester, notamment par dosage de la densité de greffage au Bleu de toluidine (voir exemple 1.5).
Dans le cas d'un mélange d'oxydation acide/H2θ2 simultané, de préférence le temps d'oxydation est de préférence de 1 à 10 minutes, de manière plus préférée de 3 à 6 minutes et de manière la plus préférée le temps d'oxydation est de 5 minutes. De préférence, ce temps d'oxydation s'applique à l'oxydation du titane ou d'un de ses alliages avec une solution H2SO4/H2O2.
Dans le cas de l'utilisation d'un mélange séquentiel, le matériau prothétique peut être, par exemple, plongé dans la solution d'acide pendant au moins 10 secondes, de préférence pendant au moins 20 secondes, de préférence pendant au moins 30 secondes, de manière plus préférée pendant plus de 50 secondes, de manière préférée pendant plus de 1 minute, de manière préférée pendant plus de 2 minutes, de manière préférée pendant plus de 3 minutes, de manière préférée pendant plus de 4 minutes. Ce temps de mise en présence du titane, ou d'un de ses alliages, avec H2SO4 peut être largement supérieur et peut, par exemple, atteindre 30 minutes ou plus. Cependant, dans un mode préféré de réalisation, le temps de mise en présence du matériau prothétique avec la solution d'acide est inférieur ou égal à 5 minutes, temps au delà duquel une diminution du taux de greffage est observée. Cette procédure est en particulier appliquée dans le cas de l'oxydation du titane ou d'un de ses alliages, mis en présence d'une solution de H2SO4
De la même manière, le temps de mise en présence du matériau prothétique avec la solution de H2O2 peut varier. De préférence, le matériau prothétique, de préférence le titane ou un de ses alliages, est mis en présence de H2O2 pendant au moins 10 secondes, de préférence au moins 20 secondes, de préférence au moins 30 secondes, de préférence au moins 40 secondes, de préférence au moins 50 secondes, de préférence au moins 1 minute, de préférence au moins 2 minutes, de préférence pendant 2 à 3 minutes, et de manière la plus préférée pendant deux minutes après ajout de la solution de H2O2. Dans un mode préféré de réalisation, on préfère une action de H2SO4 sur le titane, ou un de ses alliages, pendant 1 minute puis une action de H2O2 sur le titane pendant 2 minutes.
La mise en contact du matériau prothétique avec la solution d'acide et/ou la solution de H2O2 peut être réalisée par tout moyen connu en soi. Ainsi, par exemple, les solutions peuvent être versées dans un récipient contenant le matériau prothétique, ou le matériau prothétique peut être plongé dans un récipient contenant la/les solution(s).
Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que le traitement par une solution acide permet d'éliminer la couche d'oxyde natif qui se forme spontanément sur les matériaux prothétiques en présence d'air, en l'attaquant chimiquement. Le peroxyde d'hydrogène permet de créer des hydroperoxydes à la surface du matériau prothétique, en particulier des hydroperoxydes de titane (TiOOH) dans le cas de l'utilisation du titane comme matériau prothétique. Ces hydroperoxydes, donneurs de radicaux libres lorsqu'ils sont chauffés, peuvent alors servir d'amorceurs à la polymérisation radicalaire des monomères sur le matériau prothétique, en particulier sur du titane. La proportion d'acide par rapport à H2O2 peut varier dans une large mesure et l'homme du métier est à même de définir, sur la base de la présente description, le rapport le plus efficace pour aboutir à un taux de greffage souhaité. De préférence, une solution HiSO4ZH2O2 50/50 (v/v) est utilisée pour oxyder le matériau prothétique. La température utilisée est généralement la température ambiante (20-300C), voire une température plus faible (par exemple, entre 0 et 200C), la réaction d'oxydation pouvant être exothermique.
Avantageusement, on ajoute des sels métalliques (fer, nickel, chrome, cuivre) lors de l'étape de génération des espèces actives donneurs de radicaux libres. Ces sels métalliques sont en particulier ajoutés au mélange acide/H2O2. La concentration de ces sels peut varier dans une large mesure. En particulier, la concentration varie de 10"4 mol/1 à 2 mol/1. Ils favorisent la formation en concentration plus importante de peroxyde à la surface du matériau prothétique, en particulier du titane ou d'un de ses alliages, et augmentent ainsi le degré de greffage. Par exemple, on peut avantageusement ajouter au mélange acide/H2θ2 des sels à base de fer, nickel, chrome ou cuivre, comme par exemple le sulfate de fer (FeSO4), l'acétate de fer (Fe(C2H3O2X le bromure de fer (FeBr3), l'iodure de fer (FeI2), le nitrate de fer Fe(NO3)3), le thyocyanate de fer (Fe(SCN)2 , Fe(SCN)3) Fe2(SCN)6, ... De préférence, du sulfate de fer est ajouté au mélange acide/H2O2.
Avantageusement, une étape d'obtention des radicaux libres à partir des espèces actives générées préalablement à la surface du matériau est réalisée, en particulier par réaction thermique des espèces actives générées. Plus spécifiquement, la réaction thermique est réalisée à une température comprise entre 25 et 16O0C, de préférence entre 40 et 1000C, de manière encore plus préférée entre 50 et 800C, de manière plus préférée entre 60 et 75°C et de manière la plus préférée à 700C.
L'étape de production des radicaux libres peut être réalisée avant, de préférence pendant ou après l'étape de mise en contact des monomères avec le matériau sur lequel des espèces actives ont été générées. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes :
- des espèces actives sont générées sur un matériau prothétique tel que défini ci-dessus;
- des radicaux libres sont générés, en particulier par chauffage entre 400C et 100°C; et - le matériau prothétique sur lequel des radicaux libres ont été générés est mis en présence d'au moins un monomère porteur d'une fonction permettant une polymérisation radicalaire, sa polymérisation radicalaire permettant la formation d'un polymère bioactif, en l'absence d'oxygène.
Selon un autre mode de réalisation, des espèces actives sont d'abord générées sur le matériau qui est ensuite mis en contact avec des monomères et dans des conditions permettant la formation des radicaux libres à partir des espèces actives, en particulier par chauffage de la solution de monomères.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, des espèces actives sont d'abord générées sur le matériau qui est ensuite mis en contact avec une solution de monomères, les radicaux libres étant alors formés, en particulier par chauffage de la solution de monomères.
Les monomères utilisés dans le présent procédé sont avantageusement greffés sur les supports précités par l'intermédiaire d'une réaction de polymérisation radicalaire. Cette dernière est amorcée par les radicaux libres générés directement sur le support à greffer.
Les monomères utilisés dans le procédé selon l'invention comprennent au moins un groupement qui permet la polymérisation. Avantageusement, les monomères comprennent au moins une insaturation aliphatique, de préférence un groupement vinylique, qui permet la polymérisation. Par monomères présentant au moins une insaturation aliphatique, on entend selon l'invention des monomères présentant une ou deux, de préférence une, double ou triple liaison, avantageusement une double liaison -CH=CH-.
Un avantage du procédé de la présente invention par rapport au procédé indirect décrit ci- dessus repose sur la possibilité de greffer une grande variété de polymères. En effet, tout monomère susceptible d'être polymérisé via une réaction de polymérisation radicalaire peut être utilisé dans la présente invention.
La structure des monomères utilisés dans la présente invention peπnet la formation d'un polymère bioactif à la surface d'un matériau prothétique. Au sens de l'invention, un polymère est bioactif s'il est capable d'orienter les réponses cellulaires eucaryotes et/ou procaryotes au site d'intégration de l'implant prothétique fabriqué à partir d'un matériau prothétique susceptible d'être obtenu selon le procédé de la présente invention, c'est à dire s'il est capable de favoriser Postéointégration de l'implant prothétique et de prévenir le développement d'une infection.
Afin d'améliorer les propriétés d'ostéointégration et anti-bactériennes des matériaux cités ci-dessus, les monomères utilisés dans le cadre du présent procédé comprennent avantageusement un groupement sulfonate et/ou carboxylate. En effet, il a récemment été montré que des polymères porteurs de groupements ioniques sulfonate et/ou carboxylate favorisaient l'adhérence, la colonisation et la différenciation des ostéoblastes. De plus, il a également été montré que des polymères porteurs de ces mêmes groupements, mais plus encore lorsqu'ils sont porteurs des seuls groupements sulfonate, permettaient d'inhiber l'adhérence de souches bactériennes, notamment de Staphylococcus aureus, souche très majoritairement impliquée dans les infections sur matériels prothétiques.
On peut également envisager de greffer des groupements osidiques (glucose, saccharose, fructose, polyose,...) ou encore des groupements phosphates de type -0-PO-(OH)2, notamment de formule (A) :
Figure imgf000011_0001
De préférence, les polymères formés sur les matériaux prothétiques par le procédé selon l'invention sont formés à partir d'au moins un des monomères suivants : l'acide acrylique, l'acide méthacrylique, le méthacrylate de méthyle (MMA), l'acrylamide de N-(sulfonate de sodium phényl) (NaAS), le méthacrylamide de N-(sulfonate de sodium phényl) (NaMS), le styrène sulfonate de sodium (NaSS), l'éthylène glycol méthacrylate phosphate, méthacryloyl- di-,isopropylidène, des monomères porteurs de groupements osidiques oses tels que, par exemple, glucose, glucofuranose, saccharose, polyose, fructose, etc.
Les polymères greffés obtenus peuvent être des homopolymères ou des copolymères. Ainsi, dans un mode particulier de réalisation de l'invention, les homopolymères greffés sont formés à partir du styrène sulfonate de sodium (greffage de polyNaSS) ou à partir du méthacrylate de méthyle (greffage de poly (méthacrylate de méthyle), ou PMMA).
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, les polymères susceptibles d'être greffés par le procédé selon l'invention sont des copolymères obtenus par polymérisation radicalaire de monomères comprenant au moins un monomère de formule générale (I) et au moins un monomère de formule générale (II), les formules (I) et (II) étant les suivantes :
R
CH =
COOH (I) ou un sel métallique correspondant
Figure imgf000012_0001
dans lesquelles R et R', identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de Ci à Ce, linéaire ou ramifié, et A représente un radical de type arylsulfonate ou acide correspondant.
Selon une variante du procédé du procédé selon l'invention, les monomères de formule (I) peuvent au départ présenter des fonctions esters, les copolymères ainsi obtenus seront alors hydrolyses (partiellement ou totalement), pour obtenir les fonctions acide correspondantes.
Plus spécifiquement, A est choisi parmi les radicaux de formules suivantes :
Figure imgf000013_0001
dans lesquels M représente un ion métallique, de préférence de métal alcalin. Le métal alcalin est préférentiellement choisi parmi le sodium et le potassium, avantageusement le sodium.
Parmi les radicaux alkyle de Ci à Ce, linéaires ou ramifiés, on peut notamment citer les radicaux méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle ou t-butyle, pentyle, et hexyle.
Parmi les monomères de formule (I), on peut notamment citer l'acide acrylique (AA), l'acide méthacrylique (MA), l'acide éthacrylique (EA), leurs sels correspondants (en particulier sels de métal alcalin, de préférence de sodium) et leurs mélanges. On préfère l'acide méthacrylique.
Parmi les monomères de formule (II), on peut notamment citer l'acrylamide de N-
(sulfonate de sodium phényl) (NaAS), le méthacrylamide de N-(sulfonate de sodium phényl) (NaMS), le styrène sulfonate de sodium (NaSS) et leurs mélanges. On préfère le styrène sulfonate de sodium.
A titre d'illustration, lorsque A du monomère de formule (II) présente la formule (III), le copolymère greffé sur le matériau prothétique peut être représenté plus spécifiquement par la formule générale (V) suivante :
Figure imgf000014_0001
SO3-M+
(V) dans laquelle R, R', et M sont tels que définis ci-dessus, et n représente un nombre, réel compris entre 10 et 1000.
La virgule signifie que la quantité, le rapport et l'enchaînement des unités monomères présentes dans les copolymères varient. Cette variation est directement liée aux paramètres du procédé de polymérisation, tels que par exemple la quantité de chaque monomère mis en oeuvre.
Les poids moléculaires des polymères greffés selon le procédé de la présente l'invention peuvent varier dans une large mesure et sont choisis ou contrôlés par l'homme du métier en fonction de leur application ou usage ultérieur. Pour donner un ordre de grandeur, le poids moléculaire moyen en poids peut varier de 1 000 à 100 000 daltons.
A ce titre, les quantités des monomères de formules (I) et (II) peuvent varier dans une large mesure et dépend notamment des propriétés désirées pour les copolymères. De préférence, le rapport molaire de (I) sur (II) varie de 90/10 à 10/90, avantageusement de 80/20 à 20/80. Les copolymères selon l'invention présentent en particulier les fractions molaires de (I) sur (II) suivantes : 90/10, 80/20, 70/30, 60/40, 50/50, 40/60, 30/70, 20/80 et 10/90 (ces fractions correspondent en réalité aux fractions des monomères introduits, les fractions des monomères incorporés dans les copolymères obtenus par analyse RMN variant au maximum de ± 2 par rapport à celles mentionnées ci-dessus).
Les copolymères greffés selon le procédé de la présente invention peuvent être obtenus par polymérisation radicalaire de monomères comprenant, en plus des monomères de formules (I) et (II), d'autres monomères présentant au moins une insaturation aliphatique. Les autres monomères présentant au moins une insaturation aliphatique peuvent être de toute nature, incluant des monomères donnant un caractère hydrosoluble ou non aux polymères greffés. De préférence, les monomères additionnels sont de nature hydrosoluble, tels que les monomères présentant un radical de type sucre ou phosphate.
On peut citer comme monomères additionnels, les monomères de formules suivantes :
Figure imgf000015_0001
dans lesquelles R1, identique ou différent, représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de Ci à C6, linéaire ou ramifié, tel que défini précédemment, et n' représente un nombre réel compris entre 10 et 1000. Parmi les groupements ose de la formule (VII), on peut notamment citer le glucose, galactose et saccharose.
Afin de préserver les caractéristiques des polymères greffés, l'homme du métier est à même, par des manipulations de routine, de déterminer les monomères additionnels envisageables et dans quelles quantités.
Plus particulièrement et pour donner un ordre de grandeur, la quantité des monomères de formule (I) et (II) est avantageusement supérieure ou égale à 25 %, de préférence supérieure ou égale à 50%, en moles par rapport au nombre total de moles des unités monomères présentes dans les polymères. Selon un aspect particulier de l'invention, les copolymères sont susceptibles d'être obtenus par polymérisation radicalaire des monomères de formule (I) et (II) uniquement. Le temps de greffage peut varier dans une large mesure. L'homme du métier est capable de choisir le temps nécessaire à la polymérisation sur le matériau prothétique en fonction de la nature de ce dernier, du polymère à greffer et de la densité de greffage souhaitée. L'homme du métier peut sélectionner le temps le plus adapté par mesure de la densité de greffage au
Bleu de Toluidine (voir exemple 1.5).
Avantageusement, le matériau prothétique est mis en contact avec le(s) monomère(s) pendant au moins approximativement 30 minutes, et de préférence entre approximativement 1 heure et approximativement 48 heures. De manière plus préférée, le matériau prothétique est mis en contact du(des) monomère(s) pendant plus de 2 heures, de préférence plus de 3 heures, de préférence plus de 5 heures, de préférence plus de 8 heures, et de préférence pendant approximativement 15 heures.
Dans un mode préféré de réalisation, l'invention concerne un procédé pour greffer du polyNaSS sur du titane comprenant les étapes suivantes : des espèces actives donneurs de radicaux libres sont générées à la surface du titane ; et
- le titane sur lequel des espèces actives ont été générées est mis en présence de NaSS à une température comprise entre 40 et 1000C, pendant au moins 8 heures, en l'absence d'oxygène.
Dans un mode particulièrement préféré de réalisation, l'invention concerne un procédé pour greffer du polyNaSS sur du titane comprenant les étapes suivantes :
- des espèces actives donneurs de radicaux libres sont générées à la surface du titane ; et
- le titane sur lequel des espèces actives ont été générées est mis en présence de NaSS à une température de 700C, pendant 15 heures, en l'absence d'oxygène.
La réaction de polymérisation radicalaire doit se dérouler en l'absence d'oxygène, celui-ci étant un inhibiteur de la réaction. De préférence, la réaction est réalisée en l'absence d'oxygène, sous atmosphère inerte, en particulier sous argon, hélium ou azote, avantageusement sous azote. Après polymérisation, le matériau ainsi greffé est récupéré, et éventuellement rincé, notamment avec de l'eau (par exemple de l'eau distillée), notamment afin d'élirniner les polymères formés mais non greffés.
Un autre objet de l'invention concerne des matériaux prothétiques greffés avec des polymères bioactifs susceptibles d'être obtenus selon le procédé décrit ci-dessus.
L'invention concerne également l'utilisation d'un matériau prothétique selon l'invention pour la fabrication d'un implant prothétique, en particulier pour la fabrication d'une prothèse articulaire ou d'une prothèse dentaire.
Un objet supplémentaire de l'invention concerne des implants prothétiques fabriqués à partir des matériaux prothétiques susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit ci-dessus.
Les avantages de la présente invention vont maintenant être détaillés dans les exemples suivants, et éventuellement à la lumière des figures annexés.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : diagramme représentant la procédure de greffage de NaSS directe selon l'invention.
Figure 2 : graphe représentant le spectre IR de la surface de titane oxydée chimiquement puis greffée de polyNaSS.
Figure 3A : déconvolution des éléments carbone CIs (à gauche) et oxygène Ois (à droite) du titane oxydé chimiquement.
Figure 3B : déconvolution des éléments carbone CIs (à gauche) et oxygène Ois (à droite) du titane greffé de polyNaSS.
Figure 3C : déconvolution des éléments titane Ti2p (à gauche) et soufre S2p (à droite) du titane oxydé chimiquement. Figure 3D : déconvolution des éléments titane Ti2p (à gauche) et soufre S2p (à droite) du titane greffé de polyNaSS.
Figure 3E : comparaison des déconvolutions de l'élément soufre S2p du titane oxydé chimiquement (à gauche) et du titane greffé de polyNaSS (à droite).
Figure 4 : vues en coupe de la surface osseuse néoformée autour d'implants. S100/OC : 100% sulfonate et 0% carboxylate ; C100/S0 100% carboxylate et 0% sulfonate.
EXEMPLES
Exemple 1 : Greffage de polymère bioactif à la surface de cylindres en titane
La première étape a été la mise au point du greffage des groupements ioniques. Par souci de simplification, nous avons choisi dans un premier temps de greffer uniquement des groupements arysulfonate. La fonctionnalisation a été faite sur des disques de titane (99,7% de pureté) préalablement polis pour s'affranchir des problèmes de rugosité.
Le greffage des groupements arysulfonate à la surface du titane s'est fait par voie directe par création de radicaux libres par oxydation chimique qui sont ensuite utilisés comme amorceurs de la polymérisation d'un monomère porteur des fonctions arylsulfonate.
La molécule de monomère est le styrène sulfonate de sodium (NaSS). L'ensemble de la procédure adoptée est résumé dans le figure 1.
1.1. Caractéristiques du titane
Le titane (société Alfa Aesar) se présente sous la forme de barreaux extradés de 12,7 mm de diamètre, ayant subi un recuit de détente de 30 min à 7000C. Sa pureté (Tableau 1) est de 99,7% de composition nominale (grade 1, ou T40). Tableau 1 Composition chimique du titane pur utilisé
Elément C N O H Fe Ti
% atomique 0,006 0,005 0,14 0,0014 0,08 99,7676
Toutes les études ont été réalisées sur des disques de 2 mm d'épaisseur, obtenus par découpe par électroérosion dans un bain d'eau réalisé par la société Prestasem (Champagne sur Seine, France 77). Ce mode de découpe présente l'avantage d'éviter un écrouissage trop important du matériau et une perte de matière trop grande, par rapport à un usinage au tour par exemple.
1.2. Polissage du titane
Le polissage mécanique des disques est réalisé à l'aide d'un bras automatique, monté sur une polisseuse rotative, avec du papier abrasif de granulométries décroissantes (Struers). Un premier polissage avec un papier de grade 800 (grains de 22 μm) enlève environ 1/10e de mm d'épaisseur, ce qui a pour effet de retirer l'épaisseur de métal abîmée par les piqûres dues au mode de découpe par électroérosion (arc électrique).
Le polissage est ensuite affiné par l'utilisation de papiers de granulométries de plus en plus faibles (papiers 1000, puis 1200). Le protocole utilisé est le suivant : 8 min. à P800, 4 min à P1000, 4 min à P 1200 (grains de 14 μm). On obtient une surface de rugosité équivalente à celle qui est couramment utilisée dans la littérature pour les études de comportement cellulaire.
Après polissage, les échantillons sont lavés avec une solution d'acétone pure sous ultrasons pendant 10 minutes à température ambiante. Ils sont ensuite séchés et utilisés immédiatement, ou conservés sous argon (boîte à gants).
1.3. Purification du monomère NaSS
Le monomère utilisé pour apporter les groupements ioniques adéquats à la surface du titane est le styrène sulfonate de sodium (NaSS, sel sodique d'acide A- vinylbenzenesulfonique, Aldrich), monomère vinylique dont la formule chimique est représentée ci-dessous H2
Figure imgf000020_0001
Molécule de Styrène Sulfonate de Sodium
Le styrène sulfonate de sodium est purifié par recristallisation. Cette procédure consiste à dissoudre une masse m de monomère dans un mélange eau/éthanol en proportion 10/90 à la température de 60-700C. La solution est ensuite filtrée à chaud, sous vide de trompe à eau. La solution ainsi filtrée est placée à 4°C pendant 24h. Les cristaux formés sont récupérés par filtration sous vide, puis séchés à 60-700C sous vide.
1.4. Oxydation et greffage
La fonctionnalisation se fait sous atmosphère contrôlée d'argon (boîte à gants) et peut se résumer comme suit :
1. Nettoyage des surfaces de titane polies ; 2. Formation de radicaux peroxydes à la surface des disques en titane par trempe des échantillons dans un mélange H2SO4 (Acros)/H.2θ2 (Alώich) 50/50 à température ambiante. Les deux réactifs sont versés simultanément dans le bêcher contenant les échantillons, et l'ensemble est agité pendant 2 minutes. La réaction est immédiate, fortement exothermique et s'accompagne d'un dégagement gazeux. La solution d'oxydation initialement incolore vire au jaune, à l'orangé, puis au rouge brique (ce qui est dû à la réaction de l'acide sulfurique sur le titane et la formation d'ions Ti4+).
3. Rinçages multiples des surfaces oxydées à l'eau distillée ;
4. Immersion des échantillons dans une solution aqueuse de monomère NaSS à la concentration de 0,7 M ; 5. Chauffage à 700C de la solution de monomères en contact avec les échantillons de titane pendant 14 h. Le chauffage à 700C permet la rupture de la liaison peroxyde (O- O) en radicaux libres TiO* , qui serviront à amorcer la polymérisation radicalaire des monomères vinyliques ; 6. Rinçage des surfaces métalliques greffées de polyNaSS à l'eau distillée afin d'éliminer l'homopolymère formé en solution, susceptible d'être mêlé avec les chaînes de polymère greffées.
1.5. Caractérisation chimique et physico-chimique
a) Dosage de la densité de greffage au Bleu de Toluidine
Le « dosage au bleu de Toluidine » est une technique colorimétrique utilisant la molécule chromophore est le Bleu de Toluidine qui absorbe dans le visible à 633 nm. Cette molécule a la particularité de se complexer, via son groupement N+(CHS)2, avec les groupements anioniques (-COO"). Une mole de Bleu de Toluidine se complexe avec une mole de groupement carboxylate. Le dosage du bleu de toluidine donne donc la quantité de monomère greffé. Cette propriété a été transposée au NaSS, qui peut se complexer au groupe N+(CHS)2 via son groupement sulfonate (-SO3 ").
Figure imgf000021_0001
Cl-
Les échantillons de titane greffés sont mis au contact d'une solution de Bleu de Toluidine à 5.10"4 M (ajustée à pH 10) à la température de 300C pendant 6 heures. Cette étape correspond à la complexation du Bleu de Toluidine aux unités monomères du polyNaSS greffées. Les échantillons sont ensuite rincés abondamment avec une solution d'hydroxyde de sodium 1. 10"4 M5 pour éliminer le Bleu de Toluidine non complexé. On arrête les rinçages lorsque la solution est incolore.
Le Bleu de Toluidine complexé est ensuite décomplexé au moyen d'une solution d'acide acétique 50% (Acros organics) qui est laissée au contact des échantillons de titane pendant 24h.
La solution obtenue est dosée par spectrophotométrie à l'aide d'un spectrophotomètre de type Safas Xenius piloté par son logiciel. Le coefficient d'extinction molaire ε du bleu de toluidine est égal à 51230 L-mol^xm"1. A partir de la concentration calculée on calcule la quantité de molécules greffées à partir de l'équation suivante :
Figure imgf000022_0001
(en g) avec V = volume de la solution dosée (5.10"3 L) Mmonomère = masse molaire du monomère NaSS
La surface d'une pastille mesure 1 cm2, donc cette masse de monomère greffé peut être exprimée en quantité de matière greffée en g/cm2 pour une face de pastille. La densité optique mesurée donne une quantité de molécules greffées de 10 μg/cm2 environ. Les échantillons dosés ont ensuite été relavés plusieurs fois à l'eau et leur complexation au bleu de toluidine a été dosée jusqu'à quatre fois. La densité de greffage mesurée est alors tombée à 3 μg/cm2, et s'est stabilisée à cette valeur. Le phénomène exposé précédemment peut expliquer cette observation : en effet, la complexation au Bleu de Toluidine a peut-être entraîné une distorsion des chaînes de polymère et les multiples lavages effectués ont permis d'évacuer les chaînes enchevêtrées et non réellement greffées.
La densité de greffage obtenue avec le procédé selon l'invention est une densité extrêmement importante car les valeurs obtenues dans la littérature avec le procédé indirect par silanisation sont plutôt de l'ordre de 0,1 à 0,2 μg/cm2.
b) Spectroscopie InfraRouge à Transformée de Fourier à Réflexion Totale
Atténuée (ATR/FTIR)
Nous avons utilisé la spectroscopie FTIR en mode de réflexion totale atténuée (ATR) pour analyser la surface de nos échantillons en titane. Le spectrophotomètre FTIR utilisé pour réaliser les mesures est un appareil Nicolet, Avatar 370-FT-IR. Les échantillons sont analysés en mode ATR. Pour les mesures, les longueurs d'ondes sont balayées entre 4000 et 650 cm"1, au pas de 4 cm"1, avec une résolution de 1 cm"1. Les échantillons de titane, oxydés ou non, greffés ou non, sont appliqués avec une force calibrée contre le cristal, afin d'assurer un contact maximal entre l'échantillon et le diamant ; 120 acquisitions sont accumulées par point, pour limiter le bruit de fond au maximum. Le background est pris sur l'atmosphère.
Le tableau 2 ci-dessous résume les principales bandes d'absorption caractéristiques du polyNaSS et leurs attributions aux différents groupements chimiques. Tableau 2 : Bandes d'absorption IR caractéristiques du polyNaSS
Fréquence (cm"1) Apparence du (ou des) pic(s) Attribution
1640-1600 et 1496-1433 Faible v (C=C) du noyau aromatique
1410 Moyen v (SO2)
1180-1127 Fort SO3-Na+ (sel)
1040 Fort v (O=S=O)
1009 Fort noyau aromatique
Les pics caractéristiques des vibrations du groupement sulfone O=S=O et du noyau aromatique de la molécule de NaSS constituent un doublet situé à 1009-1040 cm"1 ; les pics situés vers 1127 et 1180 cm"1 sont attribuables à l'absorption du sel d'acide sulfonique. La vibration de valence antisymétrique du groupement SO2 correspond au pic à 1410 cm"1, et on note un épaulement du pic précédent vers 1220 cm"1, ce qui correspond à la vibration de valence symétrique du groupement SO2. Quant à la série de pics entre 1640 et 1430 cm"1, elle peut être attribuée aux vibrations de valence des liaisons (>C=C<) du noyau benzénique. Le spectre infrarouge de la surface de titane oxydée chimiquement et greffée de ce même produit est présenté sur la figure 2.
La présence de polyNaSS sur cette surface est surtout confirmée par les deux pics caractéristiques à 1008 et 1040 cm"1. On retrouve aussi l'absorption du sel d'acide sulfonique vers 1127-1180 cm"1. En revanche, les vibrations de valence du groupement SO2 et des doubles liaisons C=C du noyau aromatique sont noyées dans le bruit de fond, compte tenu de la différence d'intensités entre le produit pur de polyNaSS sous forme de poudre et le produit greffé sur la surface.
c) Analyse chimique par spectroscopie des photoélectrons (XPS)
Les échantillons ont été analysés avec un spectromètre Escalab VG 22Oi-XL. Les rayons X sont produits par une source monochromatique AlKa de 1486,6 eV.
Les échantillons sont introduits quatre par quatre dans la chambre d'analyse, qui est pompée sous ultra vide (10"9 à 10"10 mbar). L'angle d'émission utilisé est de 45°, pour une profondeur d'analyse de la surface de 10 nm en pleine profondeur (le détecteur étant placé à la normale de l'échantillon). Le diamètre du pointé sur l'échantillon est de 150 à 200 μm
(puissance de 70 W environ, faisceau incident 10 kV). L'analyse de chaque échantillon commence par l'acquisition d'un spectre global balayant tout le domaine des énergies de liaison, afin d'identifier les principaux éléments chimiques présents à la surface de l'échantillon, et qui seront analysés chacun ensuite plus finement. La résolution en énergie donnée est de ± 0,1 eV.
En ce qui concerne l'analyse des échantillons simplement oxydés, les éléments principaux sont le carbone, l'oxygène, et le titane ; pour les échantillons greffés, le soufre et le sodium (NaSS) sont aussi détaillés. Les déconvolutions sont réalisées avec le logiciel Elipse, fourni par VG ; la référence est prise sur le pic principal de la contribution Q8 du carbone, que l'on fixe à une énergie de liaison de 284,8 eV.
La composition chimique des surfaces de titane oxydé chimiquement et greffées a été reportée dans le tableau 3.
Tableau 3 : composition chimique des surfaces de titane
% atomiques ± SD O Ti " Na Polluais
Témoin Ti poli
33,2 ±4,4 46,4 ± 2,1 14,7 ± 0,4 5,4 ± 2,2
P1200 Oxyde chimique
34,2 ± 2,6 47,0 ± 1,6 7,4 ± 0,8 7,8 ± 1,7 2,7 ± 0,6
H2SO4ZH2O2 Oxyde chimique
53,8 ± 1,3 30,3 ± 1,9 5,0 ± 1,4 5,8 ± 0,9 3,8 ± 0,8 1,2 ± g$ greffé de pNaSS
La composition globale de surface de l'oxyde chimique est quasiment la même que celle de l'oxyde natif du témoin, à l'exception du pourcentage atomique du titane qui est plus faible : ainsi, les pourcentages de carbone et d'oxygène sont respectivement de 33% et 46% pour l'oxyde natif et de 34% et 47% pour l'oxyde chimique. Par contre, le pourcentage atomique de titane chute de 15% à 7% après oxydation chimique. En fait, la quantité de titane détectée diminue en « proportion relative » à cause de la présence importante de contamination au soufre. Ce soufre détecté en grande quantité (8% atomiques) sur les échantillons oxydés, est probablement un résidu du bain d'oxydation qui contient de l'acide sulfurique qui persiste malgré tous les rinçages effectués. L'analyse de l'évolution de composition atomique entre l'état oxydé et l'état greffé de polyNaSS permet de faire les constats suivants :
• Le pourcentage atomique de carbone augmente d'un facteur 1,6, et passe de 34% pour l'oxyde chimique à 54% pour l'oxyde greffé. • Parallèlement, le pourcentage d'oxygène diminue d'un facteur 1,6, et sa contribution passe de 47% à 30%. Par conséquent, le rapport C/O passe de 0,7 pour l'oxyde seul à 1,8 pour l'oxyde greffé de polyNaSS. Cela semble logique, étant donné que les molécules de NaSS ajoutées contiennent peu d'oxygène par rapport au carbone.
• La contribution du titane diminue elle aussi de 7,4% à 5%, car l'oxyde est masqué et le titane plus difficilement détecté sous l'épaisseur de polymère greffé.
• Apparition de sodium (4%), et maintien du pourcentage de soufre à 6%, par rapport à l'oxyde seul (8%).
Ces résultats confirment qu'il y a eu polymérisation du NaSS et que du polyNaSS est bien présent en surface du titane. Par ailleurs, le rapport des pourcentages atomiques Na/S oscille entre 0,6 et 0,7, alors qu'en toute logique il devrait être de 1. Cela peut être expliqué par le fait que le styrène sulfonate de sodium NaSS est un sel qui est dissocié en milieu aqueux, et il est donc possible que le sodium soit complexé à un autre contre ion.
Les déconvolutions des différentes contributions des éléments CIs, Ois, Ti2p et S2p des échantillons oxydés chimiquement et greffés de polyNaSS sont données dans les figures BA¬
L'allure de la déconvolution du spectre CIs du carbone (à gauche) de l'oxyde greffé (figure 3B) ressemble sensiblement à celle de l'oxyde non greffé (figure 3A). Cependant, le pourcentage très important d'espèces hydrocarbonées à 284,6 eV est attribué à la chaîne carbonée et aux cycles du polyNaSS greffé (liaisons CHx et C=C). Cette contribution représente à présent la quasi-totalité (85%) du carbone présent.
Le reste est partagé ente les composantes liées à l'oxygène, dans des intensités beaucoup plus faibles que précédemment (15% du carbone présent conte 35% pour l'oxyde seul).
Sur le spectre Ois de l'oxygène (à droite), la contribution habituellement hydroxyle à 532 eV est décalée vers les basses énergies à 531,5 eV. Elle peut alors être attribuée aux ions SO3" des groupements fonctionnels sur les cycles du polyNaSS; cette composante (50% de l'oxygène présent) regroupe aussi les carbonyles C=O et potentiellement une partie des hydroxyles OH s'ils sont encore présents.
La déconvolution du spectre de Ti2p (à gauche) de l'oxyde greffé (figure 3D) a la même allure qu'avec l'oxyde non greffé (figure 3C), avec une composante Ti(IV) unique et encore moins intense, car le titane présent dans l'oxyde TiO2 s'est éloigné de la zone analysé, masqué par la couche de polymère.
La position du pic du soufre à 168,1 eV (avec la correspondance sur Ois à 531,5 eV) montre que le soufre est présent sous forme d'ions sulfonate SO3". Le pic S2py2 est positionné avec un Δ en énergie de 1,18 eV, soit vers 169,3 eV.
La figure 3E reporte pour comparaison les spectres S2p3/2 du soufre, obtenus respectivement sur l'oxyde chimique seul (à gauche) et l'oxyde chimique greffé (à droite). On observe aisément le décalage de la position du pic S2p3/2 de 168,9 eV à 168,1 eV entre les états oxydé et greffé. Cela atteste que le soufre de l'échantillon greffé de polyNaSS est présent sous forme d'ions sulfonate SO3 ", et non plus sulfate SO4 2", ce qui confirme à nouveau le greffage du polyNaSS.
Le pic du Nais du sodium sort à une énergie de 1072 eV.
d) Energie de surface par mesure de l'angle de contact Une goutte de liquide est posée sur une surface, et après obtention de la position d'équilibre, l'angle entre la tangente de la goutte et la surface est déterminée à l'aide d'un goniomètre.
Les mesures d'angle de contact ont été réalisées par la « méthode de la goutte posée », en mode statique, à l'aide d'un appareil DSA 10 (Kruss). L'énergie de surface a été déduite des mesures de ces angles par la méthode d'Owens-Wendt.
Figure imgf000026_0001
Des gouttes de 0,5 μL de différents solvants sont déposées sur les surfaces : eau distillée, formamide (à 99,5%, Aldrich), éthylène glycol et diiodométhane. Les mesures sont prises une fois l'état d'équilibre atteint après le dépôt de chaque goutte, soit environ 5 secondes. Au moins six zones de la surface sur deux échantillons différents élaborés selon le même protocole sont ainsi photographiées pour vérifier l'homogénéité des surfaces étudiées. L'erreur expérimentale est estimée à ± 2°. Les résultats des mesures sont représentés dans le tableau 4.
Tableau 4 : Angles de contact mesurés sur les surfaces de titane oxydées chimiquement et greffées de polyNaSS par voie directe
Angles de contact Eau Formamide Ethylène Glycol Diiodométhane
Témoin titane 59 ± 5 35 ± 5 38 ± 5 48 ± 5 Oxyde chimique 31 ± 7 18 ±4 20± 6 30± 6 Oxyde chimique + pNaSS 16 ± 5 18 ± 5 17 ± 4 40 ± 5
On constate une diminution de la valeur de l'angle de contact avec l'eau en passant du titane témoin au titane greffé de poly NaSS due au caractère hydrophile du poly NaSS.
A partir des valeurs d'angles de contact, les énergies de surface correspondantes ont été calculées par la méthode d'Owens-Wendt (Tableau 5).
Tableau 5
Energie de surface globale y Composante dispersive γ^ Composante polaire γp Energie de surface
(mN/m) (mN/m) (mN/m)
Témoin titane 44,3 (±2,3) 27,7 (±1,1) 16,5 (±1,2)
Oxyde chimique 59,2 (±2,3) 26,1 (±1,0) 33,1 (±1,3)
Oxyde chimique +
64,9 (±1,9) 16,9 (±0,7) 47,9 (±1,2) pNaSS
On constate que la valeur globale de l'énergie de surface augmente de plus en plus en passant du titane poli au titane greffé de polyNaSS. Ainsi, elle passe de 44,3 mN/m pour le titane non modifié à 59,2 mN/m pour le titane oxydé, et à 64,9 mN/m pour le titane greffé. Cette augmentation est principalement due à l'augmentation de la composante polaire de l'énergie dont la contribution est multipliée par 2 entre les états non modifié et oxydé ; cette même contribution augmente pratiquement d'un facteur 3 entre les états non modifié et greffé, tandis que celle de la composante dispersive diminue dans le même temps d'un facteur 1,6.
L'oxydation chimique au peroxyde d'hydrogène provoque en effet l'apparition de groupements TiOH augmentant ainsi le caractère hydrophile de la surface du titane.
Ensuite, le greffage du polyNaSS augmente légèrement l'énergie de surface par comparaison avec le titane oxydé chimiquement. L'énergie de surface passe de 59,2 à 64,9 mN/m, le NaSS étant une molécule polaire grâce à son groupement sulfonate ionique, et porteur de trois atomes d'oxygène.
Expérience annexe :
Le greffage de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) a été réalisé de manière identique à celui du poly NaSS. La mesure de l'angle de contact d'une goutte d'eau sur du titane greffé avec du PMMA a donné une valeur de 65° proche de la valeur de 70° obtenu sur du PMMA pur. Cette expérience confirme qu'il est possible de greffer différents polymères à la surface du titane.
Exemple 2 : Amélioration de Ia densité de greffage de polyNaSS
Afin d'optimiser la quantité de polymère greffé sur le titane, différents paramètres ont été modifiés dans le procédé de l'exemple 1 ci-dessus. Ainsi, une densité aussi élevée que 15,4 μg/cm2, telle que mesurée par dosage au Bleu de Toluidine, a été obtenue avec les paramètres suivants (procédé A) :
- oxydation par utilisation d'un mélange séquentiel : H2SO4 pendant 1 minute puis H2O2 pendant 2 minutes ; utilisation de sulfate de fer comme catalyseur dans le mélange H2SO4/ H2O2 ; et
- réaction de polymérisation à 70°C pendant 15 heures.
Avec un tel procédé, la densité de greffage obtenue est particulièrement élevée par rapport aux densités susceptibles d'être obtenues avec le procédé indirect par silanisation de l'art antérieur. De plus, le greffage obtenu avec le procédé A est stable puisque après 1 mois, aucune perte de polymère à la surface du titane n'a été observée (Tableau 6) Tableau 6 : stabilité du greffage par le procédé A
_. .. , , „. , , ,, Densité de greffage Densité de greffage
Densité de g ire .ffag 6e ( VμPg6/cm2 y) ( ,-μg//cm2,-)> , (μg/ ,cm «2)
1 J jour 2 ^r jours ' vt 17 moi •s
Procédé A 15.4±3.8 15.5±3.5 15.5±3.4
Exemple 3 : Activité cellulaire au contact des surfaces modifiées
A) Développement d'ostéoblastes à la surface de titane modifiés
Les cellules choisies pour étudier l'activité cellulaire au contact des surfaces de titane modifiées appartiennent à une lignée dérivée d'ostéoblastes humains MG-63. Nous avons réalisé des mesures d'adhérence, d'activité phosphatase alcaline et de quantités de phosphate de calcium précipité.
Les mesures d'adhérence des cellules MG63 ont été réalisées après 30 minutes d'incubation sous une force constante de 140 dynes/cm2. On constate que le pourcentage de cellules détachées diminue du titane oxydé (14%) au titane greffé de poly NaSS (8%). Les surfaces greffées de polyNaSS améliorent l'adhérence bien que leur caractère hydrophile soit d'un niveau assez proche de celui des surfaces seulement oxydées.
Des mesures d'adhérence réalisées 4 heures après l'incubation montre des résultats similaires bien que les différences soient moins marquées. La différenciation cellulaire a également été étudiée à travers deux marqueurs principaux : l'activité phosphatase alcaline et la minéralisation.
La première étape a été de mesurer l'activité de la phosphatase alcaline des cellules pour le rôle primordial de cette enzyme dans la formation de l'os et son effet inducteur sur le dépôt minéral car elle régule le transport de phosphate. La présence de poly NaSS greffé à la surface du titane augmente de manière significative l'activité phosphatase alcaline de l'ordre de 25% par rapport à la surface de titane oxydé.
La deuxième étape de la différenciation se caractérise par la formation d'os et de dépôt minéral : la calcification. Le dosage de phosphate de calcium a donc été réalisé pour déterminer le stade de différenciation atteint par les ostéoblastes MG-63. Il a été constaté que les quantités de calcium extraites des cellules sont augmentées de manière significative (environ 30%) lorsque les supports ont été greffés de polyNaSS par rapport aux surfaces oxydées.
Les derniers résultats obtenus concernent l'implantation de prothèse en titane modifié avec soit du polyNaSS, soit du poly acide méthacrylique ou le mélange des deux polymères. Ces essais préliminaires ont été faits avec des échantillons de titane qui n'ont pas été caractérisés de façon aussi pointue que les échantillons greffés de polyNaSS lors de l'étude de l'adhérence d'ostéoblastes humains MG-63. Le but de l'étude a été d'évaluer in vivo la réponse tissulaire du titane greffés avec des groupements sulfonate ou carboxylate. Pour atteindre cet objectif, des cylindres en titane modifié ou non modifié ont été implantés au niveau du condyle fémoral de lapins qui ont été sacrifiés au bout de 4 semaines. Une quantification de la surface osseuse néoformée autour des implants est évaluée à partir d'une coupe de chaque échantillon grâce à un analyseur d'image (figure 4).
D'une manière semi quantitative, on peut noter que sur l'échantillon recouvert de poly NaSS, l'os est réparti régulièrement le long de la surface osseuse avec des surfaces de contact relativement étendues. On n'observe pas de tissu fibreux et de nodules cartilagineux contrairement aux implants en titane non modifié.
Pour la composition qui contient uniquement des groupements carboxylate, les contacts entre l'os et l'implant sont présents mais les surfaces sont plus petites et moins nombreuses. Il existe des zones de tissu fibreux au contact de la surface implantée qui contiennent des cellules géantes.
La présence de groupement sulfonate augmente la quantité de tissu osseux en contact avec l'implant. Inversement, la présence de groupements carboxylate favorise la formation de tissu fibreux. Une évaluation plus quantitative du contact os/implant a été réalisée par histomorphométrie. Le pourcentage moyen de contact os/implant pour le titane non modifié était de 32% et de 38% pour le titane modifié avec du sulfonate. Le pourcentage de contact diminue fortement pour l'implant recouvert de groupement carboxylate (12%). Le pourcentage de contact cartilage/implant varie de 1.3% pour le titane SO3 " à 8% pour titane carboxylé. Le point important est que le pourcentage de contact os + cartilage pour le titane sulfonate est supérieur à celui mesuré pour le titane non modifié. B)- Inhibition de l'adhérence bactérienne
Au sujet de l'adhérence bactérienne quelques mesures avec Staphylococcus aureus ont été réalisées. Nous avons mesuré des taux d'inhibition d'adhérence bactérienne de 79% par rapport au titane poli et de 54% par rapport au titane oxydé. Ces premiers résultats très encourageants ont confirmé ceux obtenus lors de mesure d'adhérence de Staphylococcus aureus et de Streptococcus pyogenes sur du polyNaSS. Ils ont été confirmés récemment sur des implants en silicone recouverts de groupements sulfonate qui permettait de diminuer in vivo l'adhérence bactérienne de 2 unités de log.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de greffage de polymères bioactifs sur un matériau prothétique comprenant les étapes suivantes : - des espèces actives donneurs de radicaux libres sont générées à la surface du matériau prothétique ; et
- le matériau prothétique sur lequel des espèces actives ont été générées est mis en présence d'au moins un monomère porteur d'une fonction permettant une polymérisation radicalaire, sa polymérisation radicalaire permettant la formation d'un polymère bioactif, en l'absence d'oxygène.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le matériau prothétique est un matériau en métal, en céramique ou en verre.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le matériau prothétique est le titane, un de ses alliages, en particulier ses alliages à base de nickel, de vanadium, d'aluminium et/ou de molybdène, raluminium, le nickel, le tantale, riridium, le zirconium, l'or, ou l'acier.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le matériau prothétique est un matériau en titane ou un alliage du titane.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 4, dans lequel une étape d'obtention des radicaux libres à partir des espèces actives générées préalablement à la surface du matériau est réalisée.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les radicaux libres sont obtenus par réaction thermique, en particulier à une température comprise entre 25°C et 1600C, de préférence entre 4O0C et 1000C.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel les radicaux libres sont obtenus par réaction thermique entre 50 et 8O0C, de préférence entre 60 et 750C.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel les radicaux libres sont obtenus par réaction thermique à 7O0C.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les radicaux libres sont obtenus avant, de préférence pendant ou après l'étape de mise en contact des monomères avec ledit matériau.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 9, dans lequel le monomère présente au moins une double ou triple liaison.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le monomère porte un groupement vinylique.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel au moins un monomère porte une fonction carboxyle ou sulfonate.
13. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le monomère est l'acide acrylique, l'acide méthacrylate, le méthacrylate de méthyle (MMA), l'acrylamide de N-(sulfonate de sodium phényl) (NaAS), le méthacrylamide de N-(sulfonate de sodium phényi) (NaMS), le styrène sulfonate de sodium (NaSS), l'ethylène glycol methacrylateméthacrylate phosphate, le methacryloyl-di-isopropylidene, les monomères porteurs de groupements osidiques tels que le glucose, le glucofuranose, le saccharose, le polyose, le fructose ou tout mélange de ces composés.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le matériau prothétique sur lequel des espèces actives ont été générées est mis en présence d'au moins un monomère porteur d'une fonction permettant une polymérisation radicalaire, sa polymérisation radicalaire permettant la formation d'un polymère bioactif, en l'absence d'oxygène, pendant au moins approximativement 30 minutes.
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel le matériau prothétique sur lequel des espèces actives ont été générées est mis en présence d'au moins un monomère porteur d'une fonction permettant une polymérisation radicalaire, sa polymérisation radicalaire permettant la formation d'un polymère bioactif, en l'absence d'oxygène, pendant entre 1 et 48 heures, de préférence pendant approximativement 15 heures.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le matériau prothétique est poli avant formation des espèces actives à sa surface.
17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel le matériau est poli avec du papier abrasif.
18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel le matériau est poli avec différents papiers abrasifs de granulométries décroissante jusqu' à P 1200.
19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel les papiers abrasifs successifs sont de granulométrie P800, P1000 et P1200.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le matériau est oxydé par un mélange acide/H2θ2.
21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel le mélange acide/H2θ2 est un mélange séquentiel comprenant la mise en contact du matériau prothétique avec une solution d'acide puis la mise en contact avec H2O2.
22. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel l'acide est l'acide fluorhydrique, l'acide chlorhydrique ou H2SO4, de préférence H2SO4.
23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel le matériau prothétique est le titane ou un de ses alliages qui est mis en contact avec une solution acide de H2SO4 pendant 1 minute puis en contact d'une solution de H2O2 pendant 2 minutes, le rapport H2SO4ZH2O2 étant de préférence de 50/50 (v/v).
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, dans lequel des sels métalliques sont ajoutés au mélange acide/H2O2.
25. Procédé selon la revendication 24, dans lequel les sels métalliques sont ajoutés à une concentration allant de 10"4 mol/1 à 2 mol/1.
26. Procédé selon la revendication 24 ou 25, dans lequel les sels métalliques sont choisis parmi les sels de fer, de nickel, de chrome et de cuivre.
27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel le sel métallique est le sulfate de fer.
28. Matériau prothétique sur lequel est greffé un polymère bioactif susceptible d'être obtenu suivant le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 27.
29. Utilisation d'un matériau prothétique selon la revendication 28, pour la fabrication d'un implant prothétique.
30. Utilisation selon la revendication 29, pour la fabrication d'une prothèse articulaire.
31. Utilisation selon la revendication 29, pour la fabrication d'une prothèse dentaire.
32. Implant prothétique caractérisé en ce qu'il est fabriqué à partir d'un matériau prothétique selon la revendication 28.
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