WO2007141111A2 - Verfahren zur herstellung eines l-lysin enthaltende futtermitteladditives - Google Patents

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WO2007141111A2
WO2007141111A2 PCT/EP2007/054566 EP2007054566W WO2007141111A2 WO 2007141111 A2 WO2007141111 A2 WO 2007141111A2 EP 2007054566 W EP2007054566 W EP 2007054566W WO 2007141111 A2 WO2007141111 A2 WO 2007141111A2
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lysine
acid sequence
polypeptide
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Stephan Hans
Caroline Kreutzer
Hermann Lotter
Georg Thierbach
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Evonik Degussa Gmbh
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
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    • A23K40/10—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs by agglomeration; by granulation, e.g. making powders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of light and thermally stable, granulated animal feed additives based on fermentation broth with a high content of L-lysine and low-loss processes for the preparation of broths obtained by fermentation using selected coryneform bacteria.
  • Animal feeds are supplemented with individual amino acids according to the needs of the animals.
  • z. B. with L-lysine far predominantly the L-lysine monohydrochloride is used with an L-lysine content of about 80%. Since the L-lysine is produced by fermentation, it must be for
  • EP 0 533 039 relates to processes for the preparation of an amino acid animal feed supplement based on fermentation broth, which supplement can be obtained directly from the fermentation broth by spray drying. For this purpose, a part of the biomass is separated before spray drying in a variant. By a very clean fermentation, d. H. when obtaining a fermentation broth low in organic substances, the broth can be dried even without the biomass and without additional carrier excipient to a manageable granules.
  • L-lysine-containing solid concentrates Approximately 20 wt .-% L-lysine-containing solid concentrates are known from GB 1 439 121, in which also L-lysine-containing fermentation broths are described with a pH of 4.5 and addition of sodium bisulfite.
  • EP 0 615 693 discloses a process for the preparation of an animal feed additive based on fermentation broth, in which the fermentation broth, if appropriate after removal of some of the ingredients, is converted into a fine grain which contains at least 70% by weight has a maximum particle size of 100 microns, spray-dried, and that one builds up this fine grain in a second stage to a granulate containing at least 30 wt .-% of the fine grain.
  • a concentrate containing L-lysine is prepared from a fermentation broth which is acidified to a pH of about 6.4 with HCl prior to concentration and to which bisulfite is added for stabilization. After evaporation, the mixture is further acidified to pH 4.0 and the desired product is obtained by spray-drying.
  • EP-A 1 331 220 (US 2003/152633) relates to granulated feed additives which contain L-lysine as main component.
  • the object of the invention is to provide a method for producing a feed additive containing L-lysine with improved properties using selected coryneform bacteria.
  • the invention relates to a process for the preparation of a feed additive containing L-lysine, characterized in that the following steps are carried out
  • the mixture thus obtained is concentrated, dried and preferably granulated to give a product having an L-lysine content of 10 to 70% by weight (determined as lysine base based on the total amount), and
  • Nucleotide sequence preferably in the chromosome, which codes for a lysine insensitive aspartate kinase, and wherein the isolated coryneform bacterium contains one or more of the nucleotide sequences, preferably in the chromosome, selected from the group:
  • Phosphogluconate dehydrogenase which has an amino acid sequence which is ⁇ 95% identical to SEQ ID NO: 6 and at position 329 contains any proteinogenic amino acid except L-valine,
  • nucleotide sequence encoding a polypeptide having glucose-6-phosphate dehydrogenase activity which has an amino acid sequence which is ⁇ 95% identical to SEQ ID NO: 12 and contains at position 321 any proteinogenic amino acid except glycine and optionally at position 8 any proteinogenic amino acid except L-serine,
  • Position 107 of the amino acid sequence any proteinogenic amino acid except L-tyrosine, at position 219 of the amino acid sequence any proteinogenic amino acid except L-lysine at position 233 of the amino acid sequence any proteinogenic amino acid except L-proline and at position 261 of the amino acid sequence any proteinogenic amino acid except L-tyrosine contains, and
  • the OpcA subunit of glucose-6-phosphate dehydrogenase may also be referred to as OpcA polypeptide, Glc-6-phosphate dehydrogenase opcA polypeptide or OpcA polypeptide subunit.
  • the OpcA polypeptide is also referred to as "glucose 6-phosphate dehydrogenase assembly protein".
  • the isolated coryneform bacteria are preferably those of the genus Corynebacterium. Particularly preferred are strains which are based on the following types: Corynebacterium efficiens, such as the strain DSM44549,
  • Corynebacterium glutamicum such as strain ATCC13032,
  • thermoaminogenes such as strain FERM BP-1539, and
  • Corynebacterium ammoniagenes such as strain ATCC6871,
  • Corynebacterium glutamicum Some representatives of the species Corynebacterium glutamicum are also known in the art under other species names. These include, for example:
  • Strains designated "ATCC” can be purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, Va.) Strains designated “DSM” may be purchased from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ,
  • strains called "FERM” can be obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan).
  • the said strain of Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) is described in US-A 5,250,434.
  • Strains designated "NRRL” can be obtained from the Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Ill., US).
  • the chromosome of Corynebacterium glutamicum was completely sequenced some time ago (Kalinowski et al., Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003)). The chromosome of Corynebacterium efficiens has also been sequenced (Nishio et al., Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)).
  • Suitable databases are, for example, the database of the European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany or Cambridge, UK), the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA), that of the Swiss Institute of Bioinformatics (Swissprot , Geneve, Switzerland), the Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC, USA) and the DNA Data Bank of Japan (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japan).
  • Corynebacterium can be found in the articles by Ikeda, by Pfefferle et al. and by Mueller and Huebner in the book “Microbial Production of L-Amino Acids” (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), Springer Verlag, Berlin, Germany, publisher: T. Scheper), in the
  • Proteinogenic amino acids are understood to be the L-form amino acids found in natural proteins, that is to say in the proteins of microorganisms, plants, animals and humans.
  • L-aspartic acid L-asparagine, L-threonine, L-serine, L-glutamic acid, L-glutamine, glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L-methionine, L-isoleucine, L Leucine, L-tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan, L-proline and L-arginine and their salts.
  • protein and polypeptide are interchangeable.
  • L-lysine-producing coryneform bacteria coryneform bacteria which are able to precipitate L-lysine into the surrounding nutrient medium or into the surrounding fermentation broth and / or to enrich the L-lysine in its cells.
  • a lysine-insensitive aspartate kinase is understood as meaning a polypeptide or protein having aspartate kinase activity (EC No. 2.7.2.4), which has a lower sensitivity to inhibition by comparison with the wild-type
  • aspartate kinases are also referred to as "feed back" resistant or desensitized aspartate kinases, and the desensitized aspartate kinases or
  • Aspartate kinase variants encoding nucleotide sequences are also referred to as lysC FBR alleles. About Numerous lysC FBR alleles are available in public databases.
  • SEQ ID NO: 1 The coding region of the wild-type lysC gene of Corynebacterium glutamicum corresponding to accession number AX756575 of the NCBI database is shown in SEQ ID NO: 1 and the polypeptide encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 2. Also shown in SEQ ID NO: 3 are the nucleotide sequences located upstream of the 5 'end and downstream of the 3' end of the coding region. SEQ ID NO: 4 corresponds to SEQ ID NO: 2.
  • coryneform bacteria used for the measures of the invention preferably have a lysC allele which codes for an aspartate kinase variant which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, this one or more of the amino acid substitutions selected from the group:
  • lysC A279T replacement of L-alanine at position 279 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 against L-threonine, see US 5,688,671 and accession numbers E06825, E06826, E08178 and 174588 to 174597
  • lysC A279V replacement of L-alanine at position 279 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 against L-valine, see JP 6-261766 and accession number E08179
  • lysC L297Q replacement of L-leucine at position 297 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 against L-glutamine; see DE 102006026328,
  • lysC S301F replacement of L-serine at position 301 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 against L-phenylalanine, see US 6,844,176 and accession number E08180
  • lysC S301Y replacement of L-serine at position 301 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 against L-tyrosine, see Kalinowski et al (Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)) and accession number X57226)
  • lysC T308I exchange of L-threonine at position 308 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 for L-isoleucine, see JP 6-261766 and accession number E08181)
  • lysC S317A replacement of L-serine at position 317 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 against L-alanine, see US 5,688,671 and accession number 174589
  • lysC R320G replacement of L-arginine at position 320 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 against glycine; see Jetten et al
  • lysC G345D replacement of glycine at position 345 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 against L-aspartic acid, see Jetten et al (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) and accession number L16848),
  • lysC T380I exchange of L-threonine at position 380 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 for L-isoleucine, see WO 01/49854 and accession number AX192358
  • lysC S381F replacement of L-serine at position 381 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 2 against L-phenylalanine, see EP 0435132
  • the aspartate kinase variant contained in the isolated coryneform bacteria used may contain one (1) or more conservative amino acid substitutions in addition to the indicated amino acid substitutions.
  • the polypeptide contains at most two (2), at most three (3), at most four (4) or at most five (5) conservative amino acid substitutions.
  • the aromatic amino acids are called conservative exchanges when phenylalanine, tryptophan and tyrosine are interchanged.
  • the hydrophobic amino acids are called conservative exchanges when leucine, isoleucine and valine are exchanged.
  • the polar amino acids are called conservative exchanges when glutamine and asparagine are interchanged.
  • the basic amino acids are called conservative exchanges when arginine, lysine and histidine are interchanged.
  • the acidic amino acids are called conservative substitutions when aspartic acid and
  • Glutamic acid are exchanged for each other.
  • the hydroxyl-containing amino acids are called conservative substitutions when serine and threonine are interchanged.
  • Aspartate kinase variants are essentially unaffected. "Essentially unaffected” means that the enzymatic activity of said aspartate kinase variants is conservative Amino acid exchange increased or decreased by a maximum of 10%, a maximum of 7.5%, a maximum of 5%, a maximum of 2.5% or a maximum of 1%.
  • a) be obtained from the publicly accessible core collections, or
  • d) are obtained and identified by classical mutagenesis methods, optionally followed by selection on AEC-containing agar plates and sequencing of the lysC gene.
  • a mutant of Corynebacterium glutamicum, which contains the amino acid exchanges lysC A279T and lysC S381F in the aspartate kinase, is for example under the
  • a mutant of Corynebacterium glutamicum, which contains the amino acid substitutions lysC S301Y in the aspartate kinase, is described in EP 0387527 with the designation DM58-1 and deposited in the form of the strain DM58-l / pDM6 as DSM4697 (EP 0358940) in the DSM.
  • a mutant of Corynebacterium glutamicum containing the amino acid exchange lysC T311I in aspartate kinase is described in PCT / EP2005 / 012417 and deposited as DSM 16833 in the DSM.
  • a mutant of Corynebacterium glutamicum, which contains the amino acid substitution lysC S317A in aspartate kinase, is deposited, for example, under the name FERM P-6464 (JP 58-170487) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • a mutant of Corynebacterium glutamicum which contains the amino acid exchange lysC T380I in the aspartate kinase, for example, under the name ATCC21529 deposited with the ATCC.
  • a mutant of Corynebacterium glutamicum containing the amino acid substitution lysC S381F in aspartate kinase is known by the designation MH20-22B (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 55, 684-688 (1989)). This strain is deposited with the DSMZ under the designation DSM 16835.
  • nucleotide sequences of lysC FBR alleles can be found in the published publications and the sequences available in public databases.
  • a DNA fragment containing the mutation of interest is transferred to the desired strain of a coryneform bacterium, and the mutation is incorporated into the chromosome of the desired strain through at least two recombination events or crossover events, respectively relevant strain Existing sequence of a gene exchanged for the mutated sequence.
  • the desired alleles can be obtained from the deposited strains by means of the polymerase chain reaction or directly from stored plasmid DNA.
  • DNA of the lysC FBR allele coding for the aspartate kinase variant with the amino acid exchange lysC T311I is available in the form of the strain FERM BP-6689 (US Pat. No. 6,893,848).
  • Nucleotide sequence can be detected by sequencing or also by the fluorescence resonance energy transfer (FRET) method by melting curve analysis (Lay et al., Clinical Chemistry, 43: 2262-2267 (1997)).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • mutagenic oligonucleotides (TA Brown: Genetic Engineering for Beginners, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) or the method of Papworth et al. (Strategies 9 (3), 3-4 (1996)) using the Quik Change Site-directed Mutagenesis Kit from Stratagene (La Jolla, California, USA).
  • the DNA of the desired lysC FBR alleles can be prepared by chemical synthesis, for example, by the phosphoramidite method (Beaucage et al., Tetrahedon Letters 22, 1859-1862 (1981).
  • the obtained alleles can in turn be incorporated into the chromosome of coryneform bacteria by the method of allele exchange described above.
  • mutants For the preparation of mutants, classical in vivo mutagenesis methods with cell populations of coryneform bacteria using mutagenic substances such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methanesulfonate (EMS), 5-bromouracil or Ultraviolet light can be used. Mutagenesis methods are described, for example, in the Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) or Tosaka et al.
  • MNNG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • 5-bromouracil 5-bromouracil
  • Typical mutageneses using MNNG include concentrations of 50 to 500 mg / l or even higher concentrations up to a maximum of 1 g / l, an incubation time of 1 to 30 minutes at a pH of 5.5 to 7.5. Under these conditions, the number of viable cells is reduced by a proportion of about 50% to 90% or about 50% to 99% or about 50% to 99.9% or more.
  • mutants are taken from the mutagenized cell population. Subsequently, the lysC gene of the mutants is amplified by means of the polymerase chain reaction (PCR), the nucleotide sequence of the lysC gene of these mutants is determined and the amino acid sequence of the encoded aspartate kinase variant determined from the resulting nucleotide sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • primers are advantageously selected which bind to the DNA portion located upstream of the lysC gene and to the DNA portion located downstream of the complementary strand of the lysC gene (see SEQ ID NO: 3). Possibly It is also possible to select primers which bind within the coding region of the lysC gene.
  • the mutagenized cell population is previously subjected to selection for minimal agar supplemented with AEC or mixtures of AEC and L-threonine.
  • the corresponding strains resistant to AEC are used for the further selection procedure.
  • the activity of aspartate kinase can be characterized. It is also possible to characterize the strains by fermentation in a suitable medium. Instructions on this can be found, for example, in US Pat. No. 6,893,848.
  • suitable robotic systems such as Zimmermann et al. (VDI Reports No. 1841, VDI-Verlag, Dusseldorf, Germany 2004, 439-443) or Zimmermann (Chemie Ingenieurtechnik 77 (4), 426-428 (2005)) described, numerous mutants can be examined in a short time.
  • isolated coryneform bacteria whose aspartate kinase variants contain one or more of the amino acid substitutions selected from the group lysC A279T, lysC L297Q, lysC S317A, lysC T380I and lysC S381F.
  • SEQ ID NO: 31 describes the coding region of a lysC allele encoding an aspartate kinase variant containing L-threonine (lysC A279T) at position 279 and L-alanine at position 317 (lysC S317A).
  • SEQ ID NO: 32 shows the amino acid sequence of the polypeptide.
  • SEQ ID NO: 33 describes the coding region of a lysC allele encoding an aspartate kinase variant containing at position 297 L-glutamine (lysC L297Q) and at position 317 L-alanine (lysC S317A).
  • SEQ ID NO: 34 shows the amino acid sequence of the polypeptide.
  • the invention also relates to an isolated polynucleotide which codes for an aspartate kinase variant which, at position 297 of SEQ ID NO: 2, any proteinogenic amino acid except L-leucine, preferably L-glutamine and optionally one or more of the amino acid substitutions selected from the group lysC A279T , lysC A279V, lysC S301F, lysC S301Y, lysC T308I, lysC T311I, lysC S317A, lysC R320G, lysC G345D, lysC T380I, lysC S381F, and lysC S317A.
  • the invention also provides vectors which contain the polynucleotide.
  • the invention furthermore relates to coryneform bacteria, preferably of the genus Corynebacterium, more preferably of the species
  • Corynebacterium glutamicum which contain the polynucleotide and in which it is optionally overexpressed.
  • the invention also relates to processes for the production of feed additives containing L-lysine or L-lysine by fermentation of said bacteria in a suitable nutrient medium, wherein L-lysine accumulates in the cells of the bacteria or in the nutrient medium.
  • the L-lysine formed is then collected and optionally isolated or further processed together with the major part (> 50%) of the biomass by dehydration to a solid product.
  • the isolated coryneform bacteria used for the method according to the invention moreover comprise one or more, preferably at least two, more preferably at least three and most preferably four of the nucleotide sequences selected from the group:
  • a nucleotide sequence which codes for a polypeptide having glucose-6-phosphate dehydrogenase activity which has an amino acid sequence which is ⁇ 95%, preferably ⁇ 97%, ⁇ 98% or ⁇ 99% and most preferably 100% identical to SEQ ID NO: 12 and at position 321 any proteinogenic amino acid except glycine, preferably L-serine and optionally at position 8 any proteinogenic amino acid except L-serine, preferably L-threonine contains;
  • a nucleotide sequence encoding a polypeptide having malate quinone oxidoreductase activity which is a
  • nucleotide sequence encoding a polypeptide having 6-phosphogluconate dehydrogenase activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 containing at position 329 L-methionine instead of L-valine is> 90% or> 95% , preferably> 97% or> 98% identical to SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 9 shows an example of such a nucleotide sequence.
  • nucleotide sequence encoding a polypeptide having glucose-6-phosphate dehydrogenase activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is that at position 321 L-serine instead of glycine and optionally at position 8 L-threonine instead L-serine contains> 90% or> 95%, preferably> 97% or> 98% identical to SEQ ID NO: 11.
  • SEQ ID NO: 15 shows an example of such a nucleotide sequence.
  • nucleotide sequence encoding an OpcA subunit of glucose-6-phosphate dehydrogenase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 is one or more of the amino acid substitutions selected from the group at position 107 L-histidine L-tyrosine, at position 219 L-asparagine instead of L-lysine, at position 233 L-serine instead of L-proline and at position 261 contains L-histidine instead of L-tyrosine, to ⁇
  • SEQ ID NO: 21 an example of such a nucleotide sequence is shown.
  • the nucleotide sequence is for a polypeptide having malate quinone oxidoreductase activity which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, which contains at position 111 L-phenylalanine or L-alanine instead of L-serine and optionally at position 201 L-alanine instead of L-serine, to> 90% or> 95 %, preferably> 97% or> 98% identical to SEQ ID NO: 23.
  • SEQ ID NOS: 27 and 29 show examples of such nucleotide sequences.
  • Isolated coryneform bacteria containing a nucleotide sequence coding for a polypeptide with 6-phosphogluconate dehydrogenase, which is the indicated
  • SEQ ID NO: 5 shows the coding region of the wild-type 6-phosphogluconate dehydrogenase gene of Corynebacterium glutamicum.
  • the 6-phosphogluconate dehydrogenase gene is also commonly referred to as the gnd gene.
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of the encoded polypeptide. In SEQ ID NO: 7, in addition to the coding region, the upstream and downstream nucleotide sequences are indicated.
  • SEQ ID NO: 8 is identical to SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence of the coding region of the gnd allele present in the mutant DSM16834. In SEQ ID NO: 10, the amino acid sequence of the 6-phosphogluconate dehydrogenase variant is given.
  • Isolated coryneform bacteria containing a nucleotide sequence encoding a polypeptide having glucose-6-phosphate dehydrogenase activity containing the indicated amino acid substitution at position 321 and optionally at position 8 are described in PCT / EP2006 / 060851.
  • the mutant DSM17119 which contains a nucleotide sequence which codes for a glucose-6-phosphate dehydrogenase variant which contains the amino acid L-serine at position 321 instead of glycine and optionally the amino acid L-serine at position 8 instead of L-threonine.
  • Amino acid exchange at position 321 is also referred to as zwf G321S and that at position 8 as zwf S8T.
  • SEQ ID NO: 11 shows the coding region of the wild-type glucose-6-phosphate dehydrogenase gene of Corynebacterium glutamicum.
  • Phosphate dehydrogenase gene is also commonly referred to as the zwf gene.
  • SEQ ID NO: 12 shows the amino acid sequence of the encoded polypeptide. In SEQ ID NO: 13, in addition to the coding region, the upstream and downstream nucleotide sequences are indicated.
  • SEQ ID NO: 14 is identical to SEQ ID NO: 12.
  • SEQ ID NO: 15 shows the nucleotide sequence of the coding region of the zwf allele present in the mutant DSM17119.
  • SEQ ID NO: 16 indicates the amino acid sequence of the 6-phosphogluconate dehydrogenase variant.
  • Isolated coryneform bacteria containing a nucleotide sequence encoding an OpcA subunit of glucose-6-phosphate dehydrogenase having the indicated amino acid substitutions at one or more of positions 107, 219, 233 and 261 of the amino acid sequence are described in DE 102005023829 described.
  • This patent application describes the mutant DSM 17223 which codes for an OpcA polypeptide which is at position 107 L-histidine instead of L-tyrosine, at position 219 L-asparagine instead of L-lysine, at position 233 L-serine instead of L- Proline and at position 261 contains L-histidine instead of L-tyrosine.
  • These amino acid substitutions are also referred to as opcA Y107H, opcA K219N, opcA P233S and opcA Y261H.
  • SEQ ID NO: 17 shows the nucleotide sequence of the coding region of the wild-type OpcA polypeptide of Corynebacterium glutamicum.
  • the gene that for the OpcA polypeptide is also commonly referred to as the opcA gene.
  • SEQ ID NO: 18 shows the amino acid sequence of the encoded polypeptide. In SEQ ID NO: 19, in addition to the coding region, the upstream and downstream nucleotide sequences are indicated.
  • SEQ ID NO: 20 is identical to SEQ ID NO: 18.
  • SEQ ID NO: 21 shows the nucleotide sequence of the coding region of the opcA allele present in the mutant DSM17223.
  • SEQ ID NO: 22 indicates the amino acid sequence of the OpcA variant.
  • Isolated coryneform bacteria containing a nucleotide sequence encoding a malate quinone oxidoreductase polypeptide polypeptide having the indicated amino acid substitutions at position III and optionally at position 201 are described in PCT / EP2005 / 057216.
  • This patent application describes the mutant DSM 16937 which contains a nucleotide sequence which codes for a malate quinone oxidoreductase variant which contains the amino acid L-penylalanine at position III instead of L-serine. This amino acid exchange is also referred to as Mqo SlIF.
  • PCT / EP2005 / 057216 describes a mutant which contains a nucleotide sequence coding for a malate quinone oxidoreductase variant which, at position III instead of L-serine, contains the amino acid L-alanine and at position
  • 201 contains the amino acid L-serine instead of L-alanine. These amino acid substitutions are also referred to as Mqo SlIlA and mqo A201S.
  • SEQ ID NO: 24 shows the amino acid sequence of the encoded polypeptide.
  • SEQ ID NO: 25 in addition to the coding region, the upstream and downstream nucleotide sequences are specified.
  • SEQ ID NO: 26 is identical to SEQ ID NO: 24.
  • SEQ ID NO: 27 represents the nucleotide sequence of the coding region of the mqo allele present in the mutant DSM 16937.
  • SEQ ID NO: 28 reproduces the amino acid sequence of the malate quinone oxidoreductase variant.
  • SEQ ID NO: 29 describes the nucleotide sequence of the coding region of the mqo allele of a mutant containing the amino acid substitutions mqo SlIlA and mqo A201S.
  • SEQ ID NO: 30 the amino acid sequence of this malate quinone oxidoreductase variant is reproduced.
  • the isolated coryneform bacteria containing one or more of the indicated amino acid substitutions in the 6-phosphogluconate dehydrogenase, the glucose-6-phosphate dehydrogenase, the OpcA polypeptide and the malate quinone oxidoreductase, the classical mutagenesis methods given and in vitro mutagenesis and allelic exchange methods. If necessary, the methods are combined.
  • Polymerase chain reaction preferably using primers that bind to the upstream and downstream of the genes concerned polynucleotide sequences amplified and then sequencing the resulting PCR products.
  • the following isolated coryneform bacteria can be used for a method according to the invention:
  • the mutant DM1910 was prepared by two rounds of mutagenesis and screening from Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474.
  • the strain DM1910 contains besides the Apartatkinase-related mutations lysC A279T and lysC S381F a gnd allele encoding a 6-phosphogluconate dehydrogenase containing the amino acid exchange gnd V329M and a zwf allele encoding a glucose-6-phosphate dehydrogenase encoding the amino acid substitution Contains G321S.
  • strain DM1917 was prepared by the allele exchange method using the exchange vector pKl ⁇ mobsacB opcAaa4ex described in US Patent Application 60/710314.
  • This strain contains an opcA allele encoding an OpcA polypeptide containing the amino acid exchanges opcA Y107H, opcA K219N, opcA P233S and opcA Y261H.
  • the mutant DM1913 was isolated from ATCC14067 by several rounds of mutagenesis, screening and analysis of selected genes. It contains a gnd allele encoding a 6-phosphogluconate dehydrogenase containing the amino acid substitution gnd V329M, a zwf allele encoding a glucose-6-phosphate dehydrogenase containing the amino acid substitution zwf G321S, an opcA- Allele encoding an OpcA polypeptide containing the amino acid exchanges opcA Y107H and opcA K219N, an mqo allele encoding a malate quinone oxidoreductase containing the amino acid substitutions mqo SlIlA and mqo A201S and a lysC allele, which encodes an aspartate kinase containing the amino acid substitution lysC S317A.
  • a strain was prepared by the allele exchange method, the aspartate kinase of which contains the amino acid exchange lysC T279A in addition to the amino acid exchange lysC S317A.
  • This strain was named DM1918.
  • coryneform bacteria in which the mentioned variants of glucose-6-phosphate dehydrogenase, the OpcA subunit of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase are used individually or in combination with one another overexpressed.
  • Escherichia coli Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Streptomyces coeliclor, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Bifidobacterium longum, and Saccharomyces cerevisiae.
  • the endogenous genes or polynucleotides of coryneform bacteria are used.
  • Endogenous genes or polynucleotides are understood as meaning the open reading frame (ORF), genes or alleles or their polynucleotides present in the population of a species such as, for example, Corynebacterium glutamicum.
  • Uberexpression is generally understood to mean an increase in the intracellular concentration or activity of a ribonucleic acid, a protein or an enzyme.
  • the increase in concentration or activity can be achieved, for example, by increasing the copy number of the corresponding polynucleotides chromosomally or extrachromosomally by at least one copy.
  • a widely used method for increasing the copy number consists of incorporating the corresponding polynucleotide into a vector, preferably a plasmid, which is replicated by a coryneform bacterium.
  • Suitable plasmid vectors are, for example, pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) or those described by Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)) described pSELF vectors.
  • pZl Mach et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554
  • Tauch et al. Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)
  • transposons insertion elements
  • phages phages
  • Such genetic systems are described for example in the patents US 4,822,738, US 5,804,414 and US 5,804,414.
  • the IS element ISaB1 described in WO 92/02627 or the transposon Tn 45 of the plasmid pXZ10142 can be used.
  • Another common method for achieving overexpression is the method of chromosomal gene amplification.
  • this method at least one additional copy of the polynucleotide of interest is inserted into the chromosome of a coryneform bacterium.
  • Such amplification methods are described, for example, in WO 03/014330 or WO 03/040373.
  • Another method for achieving an overexpression is to link the corresponding gene or allele in a functional manner (operably linked) with a promoter or an expression cassette.
  • Suitable promoters for Corynebacterium glutamicum are described, for example, in the review article by Pätek et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003))
  • the well-known Amann et al. (Gene 69 (2), 301-315 (1988)) and Amann and Brosius (Gene 40 (2-3), 183-190 (1985)), such as T3, T7, SP6, M13, lac, tac, and trc.
  • Such a promoter may be, for example, upstream of the subject gene, typically in the Distance of about 1 - 500 nucleotides are inserted from the start codon.
  • the activity or concentration of the corresponding polypeptide will generally be at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, up to a maximum of 1000 % or 2000% based on the activity or concentration of the polypeptide in the strain prior to overexpression.
  • one or more of the genes or alleles is / are selected from the group
  • Very particularly preferred is the common overexpression of two or more of the genes selected from the group lysC FBR allele, dapA gene, dapB gene, ddh gene and lysA gene.
  • attenuation or “attenuation” in this context describes the reduction or elimination of the intracellular activity of one or more enzymes or proteins in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by using a weak promoter or a gene or allele which codes for a corresponding enzyme with a low activity or inactivates the corresponding gene or enzyme or protein and optionally combines these measures.
  • Gene expression can be reduced by appropriate culture or by genetic modification (mutation) of the signal structures of gene expression.
  • Signal structures of gene expression are, for example, repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon and Terminators.
  • An example of the targeted regulation of gene expression is the cloning of the gene to be attenuated under the control of an inducible by the addition of metered amounts of IPTG (isopropyl - /? - D-thiogalactopyranoside)
  • Promoter such as the trc promoter or the tac promoter.
  • vectors such as, for example, the Escherichia coli expression vector pXK99E (WO0226787, deposited under the Budapest Treaty on July 31, 2001 in DH5alpha / pXK99E as DSM14440 in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) or pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, reports of Anlagens congress Anlagen, Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Garlich, Germany (1997)), which enable an IPTG-dependent expression of the cloned gene in Corynebacterium glutamicum.
  • Another method for specifically reducing gene expression is the antisense technique, with short ones Oligodeoxynukleotide or vectors for the synthesis of longer antisense RNA are brought into the target cells.
  • the antisense RNA can there bind to complementary sections of specific mRNAs and reduce their stability or block the translatability. An example of this is found by the person skilled in Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 66 (10): 4366-4371 (2000)).
  • Mutations are transitions, transversions, insertions and deletions of at least one (1) base pair or nucleotide. Depending on the effect of the mutation caused
  • missense mutations Amino acid exchanges on enzyme activity are referred to as missense mutations or nonsense mutations.
  • the missense mutation results in the replacement of a given amino acid in one protein for another, in particular a non-conservative amino acid substitution.
  • the functionality or activity of the protein is impaired and reduced to a value of ⁇ 0 to 75%, ⁇ 0 to 50%,> 0 to 25%,> 0 to 10% or> 0 to 5%.
  • the nonsense mutation leads to a stop codon in the Coding of the gene and thus to a premature termination of translation.
  • Insertions or deletions of at least one base pair in a gene result in frameshift mutations that lead to the incorporation of incorrect amino acids or premature termination of translation, resulting in a stop codon in the coding region as a result of the mutation This also leads to a premature termination of the translation Deletions of at least one (1) or more codons also typically lead to a complete
  • the measures mentioned are preferably carried out in the 5 '-terminal part of the coding region which codes for the N-terminus of the polypeptide.
  • the total length of a polypeptide (measured as the number of chemically linked L-amino acids) is 100%, part of the amino acid sequence belonging to the N-terminus of the polypeptide, which is calculated starting from the starting amino acid L, belongs within the scope of the present invention -Formyl-methionine contains 80% of the subsequent L-amino acids.
  • the activity or concentration of the corresponding polypeptide is generally set at 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10%, 0 to 5% or 0 to 1% of the activity or concentration of the Wild-type protein, or activity, or
  • a “starting microorganism” is meant the microorganism on which the attenuation measures are carried out.
  • one or more of the genes is selected from the group
  • Oxidoreductase coding poxB gene (EP 1 096 013)
  • the fermentation of coryneform bacteria can be continuous - as in the PCT / EP
  • the culture medium or fermentation medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are set forth in the Manual of Methods for General Bacteriology, of the American Society for Bacteriology (Washington, DC, USA, 1981). contain. The terms culture medium and
  • Fermentation medium or medium are mutually exchangeable.
  • sugars and carbohydrates such as e.g. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose,
  • sucrose-containing solutions from sugarcane or sugar cane production starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats such as soya oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid,
  • Alcohols such as glycerin, methanol and ethanol and organic acids such as acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture.
  • the nitrogen source there may be used organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate, preferably ammonia or ammonium sulfate.
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea
  • inorganic compounds such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate, preferably ammonia or ammonium sulfate.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • phosphorus source can phosphoric acid
  • the culture medium must further contain salts, for example in the form of sulphates of metals such as, for example, sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, for example magnesium sulphate or iron sulphate, which are necessary for growth.
  • salts for example in the form of sulphates of metals such as, for example, sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, for example magnesium sulphate or iron sulphate, which are necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids such as homoserine and vitamins such as thiamine, biotin or pantothenic acid can be used in addition to the above-mentioned substances.
  • suitable precursors of the respective amino acid can be added to the culture medium.
  • the said starting materials can be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • pH of the culture basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water, preferably ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are used in a suitable manner.
  • the pH is generally adjusted to a value of 6.0 to 9.0, preferably 6.5 to 8.
  • Foaming can be used anti-foaming agents, such as Fettsaurepolyglykolester.
  • suitable selective substances such as antibiotics may optionally be added to the medium.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as air, are introduced into the culture.
  • the use of liquids enriched with hydrogen peroxide is also possible.
  • the fermentation is at
  • Overpressure for example, at a pressure of 0.03 to 0.2 MPa, driven.
  • the temperature of the culture is normally from 20 0 C to 45 0 C and preferably at 25 0 C to 40 0 C.
  • the cultivation is continued until a maximum of L-lysine has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours. In continuous processes longer cultivation times are possible.
  • the fermentation broth produced in this way is subsequently further processed according to the invention.
  • a fermentation broth is understood as meaning a fermentation medium in which a microorganism has been cultivated for a certain time and at a certain temperature.
  • the fermentation medium or the media used during the fermentation contains / contain all substances or components which ensure an increase of the microorganism and a formation of the desired amino acid.
  • Components of / the fermentation medium used / fermentation media or the starting materials such as vitamins such as biotin, amino acids such as homoserine or salts such as magnesium sulfate.
  • the organic by-products include substances which are optionally produced by the microorganisms used in the fermentation in addition to L-lysine and optionally excreted. These include L-amino acids, which are less than 30%, 20% or 10% compared to the desired L-lysine. These include organic Acids bearing one to three carboxyl groups such as acetic acid, lactic acid, citric acid, malic acid or fumaric acid. Finally, it also includes sugar such as trehalose.
  • Fermentation broths have an L-lysine content of 40 g / kg to 180 g / kg or 50 g / kg to 150 g / kg.
  • the content of biomass (as dried biomass) is generally 20 to 50 g / kg.
  • the biomass is partially or completely removed from the fermentation broth before the further process steps.
  • the resulting fermentation broth is then further processed according to the invention, by carrying out a process which comprises at least the following steps:
  • Steps b) and c) sets a sulfide / L-lysine ratio of 0.85 to 1.2, preferably 0.9 to 1.0, more preferably> 0.9 to ⁇ 0.95 in the broth, and
  • step c) can also be carried out before step b).
  • Sulfate-containing compounds in the sense of the abovementioned process steps are in particular ammonium sulfate and sulfuric acid.
  • a product having an L-lysine content of 10 to 70 wt .-% (calculated as lysine base, based on the total amount) and a molar sulfate / L-lysine ratio of 0.85 to 1.2 , preferably 0.9 to 1.0, more preferably> 0.9 to ⁇ 0.95.
  • V 2 ⁇ [SO 4 2 ] / [L-lysine].
  • the fermentation broth of one or more of the salts of sulphurous acid (sulphites) is selected from the group
  • Ammonium, alkali, and alkaline earth metal salt in an amount of 0.01 to 0.5 wt .-%, preferably 0.1 to 0.3 wt .-%, particularly preferably 0.1 to 0.2 wt .-% added to the fermentation broth. It is preferred Alkali hydrogen sulfite and particularly preferably used sodium hydrogen sulfite.
  • the sulfites in particular sodium hydrogen sulfite are preferably added as a solution before the concentration of the fermentation broth.
  • the amount used is preferably taken into account in the adjustment of the sulfide / L-lysine ratio.
  • the pH adjustment in the fermentation broth was found to be pH> 4 to 5.2, the sulphate / L-lysine ratio increased to 0.85 to 1.2 and the sulphite addition to 0.01 to 0.5 wt .-% in the fermentation broth loss of L-lysine during the
  • the biomass may be wholly or partially separated by separation methods such as e.g. centrifugation, filtration, decantation, or a combination thereof, from the fermentation broth or left completely in it.
  • separation methods such as e.g. centrifugation, filtration, decantation, or a combination thereof, from the fermentation broth or left completely in it.
  • the biomass or the biomass-containing fermentation broth is inactivated during a suitable process step.
  • the biomass is completely or almost completely removed so that no (0%) or at most 30%, at most 20%, at most 10%, at most 5%, at most 1% or at most 0.1% biomass remains in the manufactured product ,
  • the biomass is not removed or only in minor proportions, so that all (100%) or more than 70%, 80%, 90%, 95%, 99% or 99.9% biomass remains in the manufactured product.
  • Fermentation broths from which the biomass has been partially or totally removed can also be used for standardization in the production of the product.
  • this also applies to the pure compounds L-lysine base and lysine sulfate.
  • the fermentation broth obtained is acidified with sulfuric acid prior to concentration and, if appropriate, admixed with ammonium sulfate.
  • the broth may also be stabilized and lightened by the addition of preferably sodium bisulfite (sodium bisulfite) or another salt, for example, ammonium, alkali or alkaline earth salt of the sulfurous acid.
  • biomass is completely or partially separated, this is preferably carried out before the reduction of the pH according to the invention and the addition of ammonium sulfate and sulfite salt.
  • organic or inorganic solids are partially or completely removed.
  • the organic by-products dissolved in the fermentation broth and the dissolved non-consumed constituents of the fermentation medium (starting materials) remain at least partially (> 0%), preferably at least 25%, more preferably at least 50% and most preferably at least 75% in the product. If appropriate, these also remain completely (100%) or almost completely ie> 95% or> 98% in the product.
  • the term "fermentation broth base" means that a product contains at least a portion of the components of the fermentation broth.
  • the broth with known methods such as heating or heating, for example with the aid of a Rotary evaporator, Dunn Anlagenverdampfers or falling film evaporator, or withdrawn or thickened or concentrated by reverse osmosis or nanofiltration water.
  • This concentrated broth can then be worked up by freeze-drying, spray-drying, spray granulation or other methods, for example in the circulating fluidized bed according to PCT / EP 2004/006655, into free-flowing, fine-particle or coarse-grained products, in particular granules.
  • a product having the desired grain size is isolated from the resulting granules by sieving or dust separation.
  • the free-flowing, finely divided powder can in turn be converted by suitable compacting or granulating process into a coarse-grained, readily pourable, storable and substantially dust-free product.
  • the granules are z. B. can be prepared by the method according to EP-B 0 615 693 or EP-B 0809 940, US 5,840,358 or WO 2005/006875 or WO 2004/054381.
  • Free-flowing refers to powders that flow out of a series of glass outlet vessels with different sized outflow openings at least from the vessel with the opening 5 mm (millimeters) unhindered (Klein: Soaps, Ole, Fats, Wachse 94, 12 (1968)).
  • finely divided is meant a powder with a predominant proportion (> 50%) of a grain size of 20 to 200 ⁇ m in diameter.
  • coarse grained is meant a product having a predominant proportion (> 50%) of a grain size of 200 to 2000 ⁇ m in diameter.
  • dust-free means that the product contains only small amounts ( ⁇ 5%) of grain sizes below 100 microns in diameter.
  • the proportion of dust, ie particles having a particle size of ⁇ 100 ⁇ m, is preferably> 0 to 1% by weight, more preferably not more than 0.5% by weight.
  • the bulk density of the preferred products is generally 600 to 950 kg / m 3 , in particular 650 to 900 kg / m 3 .
  • auxiliaries such as starch, gelatin, cellulose derivatives or similar substances, such as are commonly used in food or feed processing as binders, gelling or thickening agents, or of other substances such as silicas, silicates (EP-A 0 743 016) or stearates.
  • oils mineral oils, vegetable oils or mixtures of vegetable oils can be used become. Examples of such oils are soya oil, olive oil, soyaol / lecithin mixtures. In the same way, silicone oils, polyethylene glycols or hydroxyethycellulose are also suitable.
  • the content of oil in the product is 0.02 to 2.0 wt .-%, preferably 0.02 to 1.0 wt .-%, and most preferably 0.2 to 1.0 wt .-% based on the Total amount of feed additive.
  • the product can also be applied to a known and customary in animal feed processing organic or inorganic carrier material such as silicas, silicates, shot, bran, flour, starch, sugar or other and / or with conventional organic or inorganic carrier material such as silicas, silicates, shot, bran, flour, starch, sugar or other and / or with conventional organic or inorganic carrier material such as silicas, silicates, shot, bran, flour, starch, sugar or other and / or with conventional
  • Thickening or binding agents are mixed and stabilized. Application examples and processes for this purpose are described in the literature (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, page 817).
  • Coating with film formers such as metal carbonates, silicas, silicates, alginates, stearates, starches, gums and cellulose ethers, as described in DE-C 41 00 920, be brought into a state in which it is stable to digestion by animal stomach in particular the stomach of Wiederkauern is.
  • the L-lysine may be added in the form of a concentrate or, if appropriate, a substantially pure substance or its salt in liquid or solid form. These can be added individually or as mixtures to the obtained or concentrated fermentation broth, or also during the drying or granulation process.
  • the solid products produced by the process according to the invention are preferably granules and have, inter alia, the following properties:
  • L-lysine ratio in the range of, for example, 0.75 to 0.87, as known in the art.
  • the color values or the "degree of whiteness" of the products are determined according to the tristimulus method (L * a * b * color measurement) defined in the German Industrial Standard 5033.
  • a 3-range color measuring instrument for dyeing and remission measurement such as, for example, the Micro Color II LMC colorimeter from Dr. Lange (Düsseldorf, Germany), in which the diffuse reflection of the sample is measured at an angle of 8 ° Transfer the device to the exactly defined standard color filters for splitting.
  • the color values are preferably in the ranges:
  • lysine base 10% by weight to 70% by weight, preferably 30 to 60% by weight or 30 to 65% by weight and very particularly preferably 40% by weight up to 60% by weight or 40% by weight to 65% by weight, based on the total amount of the product.
  • the ratio of sulfate to L-lysine in the product is 0.85 to 1.2, preferably 0.9 to 1.0, particularly preferably> 0.9 to ⁇ 0.95.
  • the water content is between 0.1 wt .-% and at most 5 wt .-%.
  • the water content is preferably at most 4% by weight, more preferably at most 3% by weight and most preferably at most 2.5% by weight. Water contents of a maximum of 2 wt .-% are also possible.
  • DM1913 was deposited on May 15, 2006 with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures under the Budapest Treaty (DSMZ, Braunschweig, Germany) as DSM 18256.
  • the lysC allele contained in strain DM1918 was duplicated by the method of tandem duplication at the lysC locus described in WO 03/014330. Another copy of the lysC allele was incorporated into the aecD gene of the resulting strain as described in WO 03/040373.
  • strain DM1918_3xlysC obtained in this way was then used in a fed batch process for the preparation of an L-lysine-containing fermentation broth.
  • the fermentation was carried out in accordance with the patent EP 0 533 039.
  • Corn steep liquor was used instead of corn gluten hydrolyzate.
  • Ammonium sulfate was added using a sterile ammonium sulfate solution (37% by weight) as needed.
  • the defoamer was also dosed separately according to requirements.
  • L-lysine By adding L-lysine, a content of L-lysine of 57.5% by weight in dry matter was adjusted.
  • the pH of the broth was 7.8 and the sulfate / L-lysine ratio V was 0.80.
  • the broth was then heated to about 60 0 C, concentrated under vacuum and then, as in the
  • Patent EP 0 809940 described, granulated.
  • the content of L-lysine in the obtained product (product 1) was 52.6 wt .-%.
  • the residual water content in the product was about 2% by weight.
  • the lysine loss was thus about 4.9 wt .-%.
  • the sulphate / L-lysine ratio V was increased to about 0.90 (based on the dry mass) by adding ammonium sulfate using a 37 percent solution. Subsequently, the pH was adjusted to about 5.1 by addition of concentrated sulfuric acid. As a result, the sulphate / L-lysine ratio V increased to about 0.92 (based on the dry mass). The content of L-lysine in the dry matter decreased due to the dilution effect to a value of 55.4 wt .-%.
  • the broth was then heated to about 60 0 C, concentrated under vacuum and then granulated as described in the patent EP 0809940.
  • the content of L-lysine in the obtained product (product 2) was 52.7% by weight.
  • the residual water content in the product was about 2% by weight.
  • the lysine loss was thus about 2.4 wt .-%.
  • Product 2 was optically brighter than product 1.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermitteladditiven auf Fermentationsbrühebasis mit einem hohen Gehalt an L-Lysin und verlustärmere Verfahren zur Herstellung aus durch Fermentation erhaltenen Brühen unter Verwendung von coryneformen Bakterien die ausgewählte Mutationen enthalten und diese Futtermitteladditive selbst.

Description

Verfahren zur Herstellung eines L-Lysin enthaltende
Futtermitteladditives
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung heller und thermisch stabiler, granulierter Tierfuttermitteladditive auf Fermentationsbrühebasis mit einem hohen Gehalt an L-Lysin und verlustarme Verfahren zur Herstellung aus durch Fermentation erhaltenen Brühen unter Verwendung ausgewählter coryneformer Bakterien.
Stand der Technik
Tierfuttermittel werden mit einzelnen Aminosäuren entsprechend dem Bedarf der Tiere supplementiert . Zur Supplementierung von Tierfuttermitteln, z. B. mit L-Lysin, wird bisher weit überwiegend das L-Lysin-monohydrochlorid mit einem L-Lysin-Gehalt von ca. 80 % eingesetzt. Da das L- Lysin durch Fermentation hergestellt wird, muß es zur
Herstellung des Monohydrochlorids zunächst einmal von allen übrigen Bestandteilen der rohen Fermentationsbrühe in aufwendigen Verfahrensschritten abgetrennt, dann in das Monohydrochlorid umgewandelt und letzteres zur Kristallisation gebracht werden. Dabei fallen eine große Anzahl von Nebenprodukten und die zur Aufarbeitung notwendigen Reagentien als Abfall an. Da eine hohe Reinheit des Tierfuttermittelsupplements nicht immer notwendig ist und zudem in den Nebenprodukten der Fermentation oft noch nutritiv wirksame Wertstoffe enthalten sind, hat es daher in der Vergangenheit nicht an Versuchen gefehlt, die aufwendige Herstellung von Futter-Aminosäuren, insbesondere von reinem L-Lysin-Monohydrochlorid, zu vermeiden und die rohe Fermentationsbrühe kostengünstiger in ein festes Tierfuttermittel zu überführen.
Als gravierender Nachteil hat sich die komplexe Zusammensetzung solcher Medien erwiesen, denn diese sind generell nur schlecht zu trocknen, dann hygroskopisch, praktisch nicht rieselfähig, verklumpungsgefährdet, und für die technisch anspruchsvolle Verarbeitung in Mischfutterwerken nicht geeignet. Dies trifft vor allem auf L-Lysin enthaltende Fermentationsprodukte zu. Die einfache Entwässerung der rohen Fermentationsbrühe durch Sprühtrocknung führte zu einem staubigen, stark hygroskopischen und nach kurzer Lagerzeit klumpigen
Konzentrat, das in dieser Form nicht als Tierfuttermittel eingesetzt werden kann.
Die EP 0 533 039 betrifft Verfahren zur Herstellung eines Aminosäure-Tierfuttermittelsupplements auf Fermentationsbrühebasis, wobei das Supplement direkt durch Sprühtrocknung aus der Fermentationsbrühe gewonnen werden kann. Hierzu wird bei einer Variante ein Teil der Biomasse vor der Sprühtrocknung abgetrennt. Durch eine sehr saubere Führung der Fermentation, d. h. bei Erhalt einer an organischen Substanzen rückstandsarmen Fermentationsbrühe, kann die Brühe sogar ohne die Biomasse und ohne zusätzlichen Trägerhilfsstoff zu einem handhabbaren Granulat getrocknet werden.
Ca. 20 Gew.-% L-Lysin enthaltende feste Konzentrate sind aus der GB 1 439 121 bekannt, in der auch L-Lysin-haltige Fermentationsbrühen mit einem pH-Wert von 4,5 und Zusatz von Natriumbisulfit beschrieben werden.
In der EP 0 615 693 wird ein Verfahren zur Herstellung eines Tierfuttermittel-Additives auf Fermentationsbrühe- Basis offenbart, bei dem man die Fermentationsbrühe, ggf. nach Entfernung eines Teils der Inhaltsstoffe, zu einem Feinkorn, das zu mind. 70 Gew.-% eine maximale Partikelgröße von 100 μm hat, sprühtrocknet, und dass man dieses Feinkorn in einer zweiten Stufe zu einem Granulat aufbaut, das zu mind. 30 Gew.-% das Feinkorn enthält.
Gemäß GB 1 439 728 wird ein L-Lysin enthaltendes Konzentrat aus einer Fermentationsbrühe hergestellt, die man vor der Aufkonzentration mit HCl auf einen pH von ca. 6,4 ansäuert und der man zur Stabilisierung Bisulfit zusetzt. Nach der Eindampfung wird weiter auf einen pH-Wert von 4,0 angesäuert und das gewünschte Produkt durch Sprühtrocknung erhalten .
Die EP-A 1 331 220 (≡ US 2003/152633) betrifft granulierte Futtermitteladditive, die L-Lysin als Hauptkomponente enthalten.
Dort wurde gefunden, dass die Menge der Gegenionen für das Lysin wie z. B. die der Sulfationen verringert werden kann, indem man während der Fermentation entstehendes Kohlendioxid als Gegenion benutzt. Insgesamt wird ein
Anionen/Lysin-Verhältnis von 0,68 bis 0,95 beansprucht.
Die Verringerung der Gegenionen wie z. B. Sulfat im L-Lysin enthaltenden Produkt soll zu einer Verbesserung der hygroskopischen Eigenschaften und der Verbackungsneigung führen.
Weiterhin wird ständig an der Verbesserung der Leistungseigenschaften der L-Lysin ausscheidenden coryneformen Bakterien gearbeitet, um kostengünstig L- Lysin-haltige Fermentationsbrühen herzustellen, aus denen die gewünschten L-Lysin-haltigen Produkte hergestellt werden können.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditives mit verbesserten Eigenschaften unter Verwendung ausgewählter coryneformer Bakterien.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditives, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt
a) Fermentation eines isolierten L-Lysin produzierenden coryneformen Bakteriums, bevorzugt der Gattung Corynebacterium, ganz besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen für eine bestimmte Zeit, wobei man nach Abschluss der Fermentation,
b) gegebenenfalls das SuIfat/L-Lysin-Verhältnis bestimmt,
c) anschließend gegebenenfalls Ammoniumsulfat zusetzt,
d) den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,9 bis 5,2 absenkt, wobei man durch die Zugabe der Sulfat-haltigen Verbindung (n) in den Schritten c) und d) ein SuIfat/L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2 in der Brühe einstellt,
e) das so erhaltene Gemisch aufkonzentriert, trocknet und dabei bevorzugt granuliert und ein Produkt mit einem L-Lysin-Gehalt von 10 bis 70 Gew.-% (bestimmt als Lysinbase, bezogen auf die Gesamtmenge) erhält, und
f) wobei das isolierte coryneforme Bakterium eine
Nukleotidsequenz, bevorzugt im Chromosom, enthält, die für eine Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, und wobei das isolierte coryneforme Bakterium eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen, bevorzugt im Chromosom, enthält, ausgewählt aus der Gruppe :
g) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6-
Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 6 und an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin enthält,
h) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose- 6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 12 und an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin enthält,
i) Nukleotidsequenz, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95%, identisch ist mit SEQ ID NO: 18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe: an
Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin und an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, enthält, und
j) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Malat- Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95%, identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin, enthält.
Die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kann ebenfalls als OpcA-Polypeptid, OpcA-Polypeptid der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase oder als OpcA-Polypeptid Untereinheit bezeichnet werden. In der EP 1 108 790 (siehe SEQ ID NO: 1744 in Tabelle 1) wird das OpcA-Polypeptid auch als „glucose 6-phosphate dehydrogenase assembly protein" bezeichnet .
Bei den isolierten coryneformen Bakterien handelt es sich bevorzugt um solche der Gattung Corynebacterium. Besonders bevorzugt sind Stämme, die auf folgenden Arten beruhen: Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Stamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,
Corynebacterium thermoaminogenes wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539, und
Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871,
wobei die Art Corynbacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.
Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Artbezeichnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium lilium DSM20137
Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al . (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991) und in der US-A-5,250,434.
Stämme mit der Bezeichnung „ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Der genannte Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) ist in der US-A 5,250,434 beschrieben. Stämme mit der Bezeichnung „NRRL" können von der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, US) bezogen werden.
Das Chromosom von Corynebacterium glutamicum wurde vor einiger Zeit vollständig sequenziert (Kalinowski et al . , Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003)). Das Chromosom von Corynebacterium efficiens wurde ebenfalls bereits sequenziert (Nishio et al . , Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003) ) .
Entsprechende Sequenzangaben können den öffentlichen Datenbanken entnommen werden. Geeignete Datenbanken sind beispielsweise die Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) , die Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA), die des Swiss Institute of Bioinformatics (Swissprot, Geneve, Switzerland) , die Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC, USA) und die DNA Data Bank of Japan (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japan) .
Zusammenfassende Darstellungen zur Genetik, zum Stoffwechsel und zur technischen Bedeutung von
Corynebacterium findet man in den Aufsätzen von Ikeda, von Pfefferle et al. und von Mueller und Huebner im Buch „Microbial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), Springer Verlag, Berlin, Deutschland, Herausgeber: T. Scheper) , in der
Spezialausgabe „A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" des Journal of Biotechnology (Band 104 (1- 3), 2003, Herausgeber: A. Pühler und T. Tauch) und im „Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Herausgeber: L. Eggeling und M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA, 2005) . Mit dem Begriff „isoliertes coryneformes Bakterium" sind durch klassische Mutageneseverfahren erzeugte Mutanten, durch Rekombinationstechniken hergestellte Bakterien und solche Bakterien gemeint, zu deren Herstellung beide Verfahren eingesetzt wurden.
Unter proteinogenen Aminosäuren versteht man die Aminosäuren in der L-Form, die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen.
Hierzu gehören insbesondere L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L- Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L- Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin und deren Salze.
Die Begriffe Protein und Polypeptid sind gegenseitig austauschbar .
Unter „L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien" versteht man coryneforme Bakterien, die in der Lage sind L- Lysin in das sie umgebende Nährmedium bzw. in die sie umgebende Fermentationsbrühe auszuscheiden und/oder das L- Lysin in ihren Zellen anzureichern.
Unter einer Lysin insensitive Aspartatkinase versteht man ein Polypeptid bzw. Protein mit Aspartatkinase-Aktivität (EC Nr 2.7.2.4), die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch
Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC (Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin allein oder AEC allein aufweisen. Derartige Aspartatkinasen werden auch als „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte Aspartatkinasen bezeichnet. Die für diese desensibilisierten Aspartatkinasen bzw.
Aspartatkinasevarianten kodierenden Nukleotidsequenzen werden auch als lysCFBR-Allele bezeichnet. Informationen zu zahlreichen lysCFBR-Allelen sind in den öffentlichen Datenbanken verfügbar.
Die Kodierregion des Wildtyp lysC-Gens von Corynebacterium glutamicum entsprechend der Zugangsnummer AX756575 der NCBI Datenbank ist in SEQ ID NO: 1 und das von diesem Gen kodierte Polypeptid in SEQ ID NO: 2 dargestellt. In der SEQ ID NO: 3 sind außerdem die stromaufwärts des 5 '-Endes und stromabwärts des 3 ' -Endes der Kodierregion gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO: 4 entspricht SEQ ID NO: 2.
Die für die Massnahmen der Erfindung eingesetzten coryneformen Bakterien verfügen bevorzugt über ein lysC- Allel, das für eine Aspartatkinasevariante kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 besitzt, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe:
lysC A279T (Austausch von L-Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Threonin; siehe US 5,688,671 und Zugangsnummern E06825, E06826, E08178 und 174588 bis 174597) ,
lysC A279V (Austausch von L-Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Valin, siehe JP 6-261766 und Zugangsnummer E08179),
lysC L297Q (Austausch von L-Leucin an Position 297 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Glutamin; siehe DE 102006026328,
lysC S301F (Austausch von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Phenylalanin; siehe US 6,844,176 und Zugangsnummer E08180), lysC S301Y (Austausch von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Tyrosin, siehe Kalinowski et al . (Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)) und Zugangsnummer X57226),
lysC T308I (Austausch von L-Threonin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Isoleucin; siehe JP 6-261766 und Zugangsnummer E08181)
lysC T311I (Austausch von L-Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Isoleucin; siehe WO 00/63388 und US 6,893,848) ,
lysC S317A (Austausch von L-Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Alanin; siehe US 5,688,671 und Zugangsnummer 174589) ,
lysC R320G (Austausch von L-Arginin an Position 320 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen Glycin; siehe Jetten et al . (Applied
Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) und Zugangsnummer L27125) ,
lysC G345D (Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Asparaginsäure; siehe Jetten et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) und Zugangsnummer L16848),
lysC T380I (Austausch von L-Threonin an Position 380 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Isoleucin; siehe WO 01/49854 und Zugangsnummer AX192358), und lysC S381F (Austausch von L-Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Phenylalanin; siehe EP 0435132)
umfasst .
Es ist bekannt, dass konservative Aminosäureaustausche die Enzymaktivität nur unwesentlich verändern. Dementsprechend kann die in den verwendeten isolierten coryneformen Bakterien enthaltene Aspartatkinasevariante, zusätzlich zu den angegebenen Aminosäureseaustauschen einen (1) oder mehrere konservative Aminosäureaustausch (e) enthalten. Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche.
Bei den aromatischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Leucin, Isoleucin und Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Glutamin und Asparagin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den sauren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Asparaginsäure und
Glutaminsäure gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Serin und Threonin gegeneinander ausgetauscht werden.
Durch die genannten konservativen Aminosäureaustausche wird die enzymatische Aktivität der genannten
Aspartatkinasevarianten im wesentlichen nicht berührt. „Im wesentlichen nicht berührt" bedeutet, dass sich die enzymatische Aktivität der genannten Aspartatkinasevarianten durch den konservativen Aminosäureaustausch um maximal 10%, maximal 7,5%, maximal 5%, maximal 2,5% oder maximal 1% erhöht oder verringert .
Stämme, welche die für die Massnahmen der Erfindung bevorzugten Aspartatkinasevarianten enthalten, können
a) von den öffentlich zugänglichen Stammsammlungen bezogen werden, oder
b) durch Rekombinationstechniken ausgehend von den
Nukleotidsequenzen bekannter Aspartatkinase-Allele erzeugt werden, oder
c) durch in-vitro Mutagenesetechniken oder durch chemische Synthese gefolgt von Rekombinationstechniken erzeugt werden, oder
d) durch klassische Mutageneseverfahren, gegebenenfalls gefolgt von Selektion auf AEC haltigen Agarplatten und Sequenzierung des lysC Gens erhalten und identifiziert werden .
Ausführungen zu a) :
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die die Aminosäureaustausche lysC A279T und lysC S381F in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der
Bezeichnung NRRL B-11474 (US 4,275,157) bei der ARS Patent Culture Collection hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC A279T in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der Bezeichnung FERM P- 1987 (US 5,688,671) beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die die Aminosäureaustausche lysC S301Y in der Aspartatkinase enthält, ist in der EP 0387527 mit der Bezeichnung DM58-1 beschrieben und in Form des Stammes DM58-l/pDM6 als DSM4697 (EP 0358940) bei der DSM hinterlegt. Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC T311I in der Aspartatkinase enthält, ist in der PCT/EP2005/012417 beschrieben und als DSM 16833 bei der DSM hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC S317A in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der Bezeichnung FERM P- 6464 (JP 58-170487 ) beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC T380I in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der Bezeichnung ATCC21529 bei der ATCC hinterlegt.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch lysC S381F in der Aspartatkinase enthält, ist unter der Bezeichnung MH20-22B (Menkel et al . Applied and Environmental Microbiology 55, 684-688 (1989) )) bekannt . Dieser Stamm ist unter der Bezeichnung DSM 16835 bei der DSMZ hinterlegt.
Ausführungen zu b) :
Rekombinationstechniken zum Einbau von identifizierten Mutationen in das Chromosom coryneformer Bakterien sind unter dem Begriff „AIIeI-Austausch" (gene replacement) bekannt .
Angaben zu Nukleotidsequenzen von lysCFBR-Allelen können den angegebenen Veröffentlichungen und den in öffentlichen Datenbanken zugänglichen Sequenzangaben entnommen werden.
Bei dem Verfahren des Allelaustausches wird ein DNA- Fragment, welches die interessierende Mutation enthält, in den gewünschten Stamm eines coryneformen Bakteriums überführt und die Mutation durch wenigstens zwei Rekombinationsereignisse beziehungsweise „cross over"- Ereignisse in das Chromosom des gewünschten Stammes inkorporiert, beziehungsweise die im betreffenden Stamm vorhandene Sequenz eines Gens gegen die mutierte Sequenz ausgetauscht .
Die gewünschten Allele können aus den hinterlegten Stämmen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion oder direkt aus hinterlegter Plasmid DNA gewonnen werden. So ist DNA des lysCFBR-Allels, das für die Aspartatkinasevariante mit dem Aminosäureaustausch lysC T311I kodiert in Form des Stammes FERM BP-6689 (US 6,893,848) verfügbar.
Das Verfahren des Allelaustausches ist unter anderem bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), bei Schäfer et al . (Gene 145, 69-73 (1994)), in der EP 1108790, WO 02/070685 und WO 03/014362 beschrieben. In der US 6,844,176 ist der Einbau von lysC S301F in Corynebacteriun glutamicum DM1636 beschrieben.
Der erfolgte Einbau der erwünschten Mutation bzw.
Nukleotidabfolge kann durch Sequenzierung oder auch mit Hilfe der „Fluorescence Ressonance Energy Transfer"-Methode (FRET) durch Schmelzkurvenanalyse (Lay et al . , Clinical Chemistry, 43:2262-2267 (1997)) nachgewiesen werden.
Ausführungen zu c) :
Da die Nukleotidsequenz des Wildtyps coryneformer Bakterien bekannt ist und die DNA der Bakterien einfach zu isolieren ist, können auch in-vitro Methoden zur Herstellung der gewünschten lysCFBR-Allele verwendet werden. Hierzu können beispielsweise mutagene Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) oder die Methode von Papworth et al. (Strategies 9(3), 3-4 (1996)) unter Verwendung des "Quik Change Site-directed Mutagenesis Kit" von Stratagene (La Jolla, California, USA) eingesetzt werden.
Weiterhin kann die DNA der gewünschten lysCFBR-Allele durch chemische Synthese, beispielsweise mit der Phosphoramidit- Methode (Beaucage et al . , Tetrahedon Letters 22, 1859-1862 (1981) hergestellt werden. Die erhaltenen Allele können wiederum durch das oben beschrieben Verfahren des Allelaustauschs in das Chromosom coryneformer Bakterien eingebaut werden.
Ausführungen zu d) : Zur Herstellung von Mutanten können klassische in-vivo Mutageneseverfahren mit Zellpopulationen coryneformer Bakterien unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N ' -Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), Ethylmethansulfonat (EMS) , 5-Bromuracil oder ultraviolettes Licht verwendet werden. Mutagenesemethoden sind beispielsweise im Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al . (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) oder bei Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978)) oder bei Konicek et al (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)) beschrieben. Typische Mutagenesen unter Verwendung von MNNG umfassen Konzentrationen von 50 bis 500 mg/1 oder auch höhere Konzentrationen bis zu maximal 1 g/l, eine Inkubationszeit von 1 bis 30 Minuten bei einem pH von 5,5 bis 7,5. Unter diesen Bedingungen wird die Zahl der lebensfähigen Zellen um einen Anteil von ca. 50% bis 90% oder ca. 50% bis 99% oder ca. 50% bis 99,9% oder mehr reduziert .
Zur Identifizierung von Stämmen, welche die gewünschte Aspartatkinase-Variante enthalten, werden der mutagenisierten Zellpopulation Mutanten entnommen. Anschließend wird das lysC-Gen der Mutanten mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, die Nukleotidsequenz des lysC-Gens dieser Mutanten bestimmt und aus der erhaltenen Nukleotidsequenz die Aminosäuresequenz der kodierten Aspartatkinasevariante bestimmt.
Für die Polymerase-Kettenreaktion werden vorteilhafterweise Primer ausgewählt, die an den stromaufwärts des lysC-Gens gelegenen DNA-Abschnitt und an den stromabwärts des komplementären Stranges des lysC-Gens gelegenen DNA- Abschnitts binden (siehe SEQ ID NO:3). Gegebenenfalls können auch Primer ausgewählt werden, die innerhalb der Kodierregion des lysC-Gens binden.
Gegebenenfalls wird die mutagenisierte Zellpopulation vorher einer Selektion auf Minimalagar unterworfen, der mit AEC oder Mischungen von AEC und L-Threonin supplementiert worden ist. Bei dieser Vorgehensweise werden die entsprechenden gegenüber AEC resistenten Stämme für das weitere Auswahlverfahren verwendet. Weiterhin kann die Aktivität der Aspartatkinase charakterisiert werden. Es ist außerdem möglich, die Stämme durch Fermentation in einem geeignetem Medium zu charakterisieren. Anleitungen hierzu finden sich beispielsweise in der US 6,893,848. Bei Verwendungen von geeigneten Roboteranlagen, wie beispielsweise bei Zimmermann et al . (VDI Berichte Nr. 1841, VDI-Verlag, Düsseldorf, Deutschland 2004, 439-443) oder Zimmermann (Chemie Ingenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005) ) beschrieben, können zahlreiche Mutanten in kurzer Zeit untersucht werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden ganz besonders isolierte coryneforme Bakterien bevorzugt, deren Aspartatkinasevarianten einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe lysC A279T, lysC L297Q, lysC S317A, lysC T380I und lysC S381F enthalten .
In der SEQ ID NO: 31 ist die Kodierregion eines lysC-Allels beschrieben, das für eine Aspartatkinasevariante kodiert, die an Position 279 L-Threonin (lysC A279T) und an Position 317 L-Alanin (lysC S317A) enthält. SEQ ID NO:32 zeigt die Aminosäuresequenz des Polypeptids.
In der SEQ ID NO: 33 ist die Kodierregion eines lysC-Allels beschrieben, das für eine Aspartatkinasevariante kodiert, die an Position 297 L-Glutamin (lysC L297Q) und an Position 317 L-Alanin (lysC S317A) enthält. SEQ ID NO:34 zeigt die Aminosäuresequenz des Polypeptids. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein isoliertes Polynukleotid, das für eine Aspartatkinasevariante kodiert, die an Position 297 von SEQ ID NO:2 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Leucin, bevorzugt L-Glutamin und gegebenenfalls einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe lysC A279T, lysC A279V, lysC S301F, lysC S301Y, lysC T308I, lysC T311I, lysC S317A, lysC R320G, lysC G345D, lysC T380I, lysC S381F, und lysC S317A enthält. Gegenstand der Erfindung sind auch Vektoren die das Polynukleotid enthalten. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin coryneforme Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art
Corynebacterium glutamicum, die das Polynukleotid enthalten und in denen es gegebenenfalls überexprimiert ist. Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin enthaltenen Futtermitteladditiven durch Fermentation der genannten Bakterien in einem geeignetem Nährmedium wobei sich in den Zellen der Bakterien oder im Nährmedium, L-Lysin akkumuliert. Das gebildete L-Lysin wird anschließend gesammelt und gegebenenfalls isoliert oder zusammen mit dem grössten Teil (> 50 %) der Biomasse durch Wasserentzug zu einem festen Produkt weiterverarbeitet.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten isolierten coryneformen Bakterien enthalten darüber hinaus eine oder mehrere, bevorzugt mindestens zwei, besonders bevorzugt mindestens drei und ganz besonders bevorzugt vier der Nukleotidsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe:
1. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6- Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95%, bevorzugt zu ≥ 97%, ≥ 98% oder ≥ 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist mit SEQ ID NO: 6 und an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin, bevorzugt L-Methionin, enthält; 2. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95%, bevorzugt zu ≥ 97%, ≥ 98% oder ≥ 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist mit SEQ ID NO: 12 und an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin, bevorzugt L-Serin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin, bevorzugt L-Threonin enthält;
3. Nukleotidsequenz, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95%, bevorzugt zu ≥ 97%, ≥ 98% oder ≥ 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist mit SEQ ID NO: 18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin
enthält; und
4. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Malat- Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches eine
Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95%, bevorzugt zu ≥ 97%, ≥ 98% oder ≥ 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin, bevorzugt L-Phenylalanin oder L-Alanin, und gegebenenfalls an Position 201 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin, bevorzugt L-Serin, enthält.
Insbesondere ist die Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 besitzt, wobei diese an Position 329 L-Methionin anstelle L-Valin enthält, zu > 90% oder > 95%, bevorzugt zu > 97% oder > 98% identisch mit SEQ ID NO:5. In SEQ ID NO:9 ist ein Beispiel für eine derartige Nukleotidsequenz dargestellt .
Insbesondere ist die Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12 besitzt, wobei diese an Position 321 L-Serin anstelle Glycin und gegebenenfalls an Position 8 L-Threonin anstelle L-Serin enthält, zu > 90% oder > 95%, bevorzugt zu > 97% oder > 98% identisch mit SEQ ID NO: 11. In SEQ ID NO: 15 ist ein Beispiel für eine derartige Nukleotidsequenz dargestellt .
Insbesondere ist die Nukleotidsequenz, die für eine OpcA- Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 18 besitzt, wobei diese einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe an Position 107 L-Histidin anstelle L-Tyrosin, an Position 219 L-Asparagin anstelle L- Lysin, an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin und an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin enthält, zu ≥
90% oder > 95%, bevorzugt zu > 97% oder > 98% identisch ist mit SEQ ID NO: 17. In SEQ ID NO:21 ist ein Beispiel für eine derartige Nukleotidsequenz dargestellt.
Insbesondere ist die Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24 besitzt, wobei diese an Position 111 L-Phenylalanin oder L- Alanin anstelle L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 L-Alanin anstelle L-Serin enthält, zu > 90% oder > 95%, bevorzugt zu > 97% oder > 98% identisch mit SEQ ID NO:23. In SEQ ID NO:27 und 29 sind Beispiele für derartige Nukleotidsequenzen dargestellt.
Isolierte coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, welches den angegebenen
Aminosäureaustausch an Position 329 besitzt, sind in der PCT/EP2005/012417 beschrieben. In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM16834 beschrieben, welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Variante kodiert, welche an der Position 329 anstelle L-Valin die Aminosäure L-Methionin enthält. Dieser Aminosäureaustausch wird auch als gnd V329M bezeichnet.
In SEQ ID NO : 5 ist die Kodierregion des 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Gens des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Gen wird allgemein auch als gnd-Gen bezeichnet. In SEQ ID NO: 6 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO: 7 sind zusätzlich zur Kodierregion die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO: 8 ist identisch mit SEQ ID NO: 6. In SEQ ID NO : 9 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des in der Mutante DSM16834 vorhandenen gnd- Allels wiedergegeben. In SEQ ID NO: 10 ist die Aminosäuresequenz der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Variante angegeben.
Isolierte coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches den angegebenen Aminosäureaustausch an Position 321 und gegebenenfalls den an Position 8 enthält, sind in der PCT/EP2006/060851 beschrieben. In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM17119 beschrieben, welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Variante kodiert, welche an der Position 321 anstelle Glycin die Aminosäure L-Serin und gegebenenfalls an Position 8 anstelle L-Threonin die Aminosäure L-Serin enthält. Der
Aminosäureaustausch an Position 321 wird auch als zwf G321S und der an Position 8 als zwf S8T bezeichnet.
In SEQ ID NO: 11 ist die Kodierregion des Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Gens des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das Glucose-6-
Phosphat-Dehydrogenase Gen wird allgemein auch als zwf-Gen bezeichnet. In SEQ ID NO: 12 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO: 13 sind zusätzlich zur Kodierregion die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO: 14 ist identisch mit SEQ ID NO: 12. In SEQ ID NO: 15 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des in der Mutante DSM17119 vorhandenen zwf-Allels wiedergegeben. In SEQ ID NO : 16 ist die Aminosäuresequenz der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Variante angegeben.
Isolierte coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche die angegebenen Aminosäureaustausche an einer oder mehrerer der Positionen 107, 219, 233 und 261 der Aminosäuresequenz besitzt, sind in der DE 102005023829 beschrieben. In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM 17223 beschrieben, die für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welche an Position 107 L- Histidin anstelle L-Tyrosin, an Position 219 L-Asparagin anstelle L-Lysin, an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin und an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin enthält. Diese Aminosäureaustausche werden auch als opcA Y107H, opcA K219N, opcA P233S und opcA Y261H bezeichnet.
In SEQ ID NO: 17 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des OpcA-Polypeptids des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das Gen das für das OpcA-Polypeptid kodiert wird allgemein auch als opcA-Gen bezeichnet. In SEQ ID NO: 18 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO: 19 sind zusätzlich zur Kodierregion die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:20 ist identisch mit SEQ ID NO: 18. In SEQ ID N0:21 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des in der Mutante DSM17223 vorhandenen opcA-Allels wiedergegeben. In SEQ ID NO: 22 ist die Aminosäuresequenz der OpcA Variante angegeben.
Isolierte coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit Malat-Chinon- Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches die angegebenen Aminosäureaustausche an Position 111 und gegebenenfalls den an Position 201 besitzt, sind in der PCT/EP2005/057216 beschrieben. In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM 16937 beschrieben, welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase Variante kodiert, welche an Position 111 anstelle L-Serin die Aminosäure L- Penylalanin enthält. Dieser Aminosäureaustausch wird auch als mqo SlIlF bezeichnet. In der PCT/EP2005/057216 wird außerdem eine Mutante beschrieben, welche eine Nukleotidsquenz enthält, die für eine Malat-Chinon- Oxidoreduktase Variante kodiert, welche an Position 111 anstelle L-Serin die Aminosäure L-Alanin und an Position
201 anstelle L-Alanin die Aminosäure L-Serin enthält. Diese Aminosäureaustausche werden auch als mqo SlIlA und mqo A201S bezeichnet.
In SEQ ID NO: 23 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion der Malat-Chinon-Oxidoreduktase des Wildtyps von
Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das Gen, das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodiert wird allgemein auch als mqo-Gen bezeichnet. In SEQ ID NO:24 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO:25 sind zusätzlich zur Kodierregion die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:26 ist identisch mit SEQ ID NO:24. In SEQ ID NO: 27 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des in der Mutante DSM 16937 vorhandenen mqo-Allels wiedergegeben. In SEQ ID NO:28 ist die Aminosäuresequenz der Malat-Chinon-Oxidoreduktase Variante wiedergegeben. In der SEQ ID NO: 29 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des mqo-Allels einer Mutante beschrieben, die die Aminosäureaustausche mqo SlIlA und mqo A201S enthält. In der SEQ ID NO: 30 ist die Aminosäuresequenz dieser Malat- Chinon-Oxidoreduktase Variante wiedergegeben.
Zur Herstellung der isolierten coryneformen Bakterien, welche eine oder mehrere der angegebenen Aminosäureaustausche in der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase, der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, dem OpcA-Polypeptid und der Malat-Chinon-Oxidoreduktase enthalten, können die angegebenen klassischen Mutageneseverfahren und die angegebenen in vitro Mutageneseverfahren und Allelaustauschverfahren eingesetzt werden. Gegebenenfalls werden die Methoden miteinander kombiniert. Zur Identifizierung der Mutationen werden die Polynukleotidsequenzen der entsprechenden Gene beziehungsweise Allele mit Hilfe der
Polymerasekettenreaktion, vorzugsweise unter Verwendung von Primern, die an die stromaufwärts und stromabwärts der betreffenden Gene liegenden Polynukleotidsequenzen binden, amplifiziert und die erhaltenen PCR-Produkte anschließend sequenziert .
Für ein erfindungsgemäßes Verfahren können unter anderem beispielsweise folgende isolierte coryneforme Bakterien eingesetzt werden:
Die Mutante DM1910, die unter der Bezeichnung DSM 18255 bei der DSMZ hinterlegt wurde.
Die Mutante DM1910 wurde durch zwei Runden von Mutagenese und Screening ausgehend von Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474 hergestellt. Der Stamm DM1910 enthält neben den die Apartatkinase betreffenden Mutationen lysC A279T und lysC S381F ein gnd-Allel, das für eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch gnd V329M enthält und ein zwf-Allel, das für eine Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch zwf G321S enthält.
Ausgehend von der Mutante DM1910 wurde durch das Verfahren des Allelaustausches unter Verwendung des in der US Patentanmeldung 60/710314 beschriebenen Austauschvektors pKlδmobsacB opcAaa4ex der Stamm DM1917 hergestellt. Dieser Stamm enthält ein opcA-Allel, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das die Aminosäureaustausche opcA Y107H, opcA K219N, opcA P233S und opcA Y261H enthält.
Die Mutante DM1913, die unter der Bezeichnung DSM 18256 bei der DSMZ hinterlegt wurde.
Die Mutante DM1913 wurde ausgehend von ATCC14067 durch mehrere Runden Mutagenese, Screening und Analyse ausgewählter Gene isoliert. Sie enthält ein gnd-Allel, das für eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch gnd V329M enthält, ein zwf-Allel, das für eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch zwf G321S enthält, ein opcA-Allel, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das die Aminosäureaustausche opcA Y107H und opcA K219N enthält, ein mqo-Allel, das für eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodiert, die die Aminosäureaustausche mqo SlIlA und mqo A201S enthält und ein lysC-Allel, das für eine Aspartatkinase kodiert, die den Aminosäureaustausch lysC S317A enthält.
Ausgehend von diesem Stamm wurde durch das Verfahren des Allelaustauschs ein Stamm hergestellt, dessen Aspartatkinase zusätzlich zum Aminosäureaustausch lysC S317A den Aminosäureaustausch lysC T279A enthält. Dieser Stamm wurde als DM1918 bezeichnet. In einem erfindungsgemaßen Verfahren können auch coryneforme Bakterien verwendet werden, in denen die genannten Varianten der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, der OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase einzeln, oder in Kombination miteinander uberexprimiert vorliegen.
Für das erfindungsgemaße Verfahren kann es außerdem vorteilhaft sein, verschiedene Enzyme der Lysinbiosynthese ausgehend von L-Asparaginsaure zu uberexprimieren . Hierzu können die im Stand der Technik bekannten Gene von
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Streptomyces coeliclor, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Bifidobacterium longum, und Saccharomyces cerevisiae verwendet werden. Vorzugsweise werden die endogenen Gene beziehungsweise Polynukleotide coryneformer Bakterien verwendet.
Unter endogenen Genen beziehungsweise Polynukleotiden versteht man die in der Population einer Art wie zum Beispiel Corynebacterium glutamicum vorhandenen offenen Leserahmen (ORF) , Gene oder Allele beziehungsweise deren Polynukleotide .
Unter Uberexpression versteht man allgemein eine Erhöhung der intrazellularen Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins oder eines Enzyms.
Die Erhöhung der Konzentration oder Aktivität lasst sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden Polynukleotide chromosomal oder extrachromosomal um mindestens eine Kopie erhöht.
Eine weit verbreitete Methode zur Erhöhung der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende Polynukleotid in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem coryneformen Bakterium repliziert wird. Geeignete Plasmidvektoren sind beispielsweise pZl (Menkel et al . , Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) oder die von Tauch et al . (Journal of Biotechnology 99, 79- 91 (2002)) beschriebenen pSELF-Vektoren . Ein Ubersichtsartikel zum Thema Plasmide in Corynebacterium glutamicum findet sich bei Tauch et al . (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).
Weiterhin kann man als Vektoren Transposons, Insertionselemente (IS-Elemente) oder Phagen einsetzen. Derartige genetische Systeme sind beispielsweise in den Patentschriften US 4,822,738, US 5,804,414 und US 5,804,414 beschrieben. In gleicher Weise kann das in der WO 92/02627 beschriebene IS-Element ISaBl oder das Transposon Tn 45 des Plasmids pXZ10142 (zitiert im „Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Herausgeber: L. Eggeling und M. Bott) ) verwendet werden.
Eine andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Uberexpression ist das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation . Bei dieser Methode wird mindestens eine zusatzliche Kopie des interessierenden Polynukleotids in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums eingefugt.
Derartige Amplifikationsverfahren sind beispielsweise in der WO 03/014330 oder WO 03/040373 beschrieben.
Eine weitere Methode zur Erzielung einer Uberexpression besteht darin, das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette zu verknüpfen. Geeignete Promotoren für Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in dem Ubersichtsartikel von Pätek et al . (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003) beschrieben. Weiterhin können die hinlänglich bekannten von Amann et al . (Gene 69(2), 301-315 (1988)) und Amann und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts des betreffenden Gens, typischerweise im Abstand von ungefähr 1 - 500 Nukleotiden vom Startkodon eingefugt werden.
Durch die Maßnahmen der Uberexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Polypeptids im Stamm vor der zur Uberexpression fuhrenden Massnahme erhöht.
Vorzugsweise wird/werden ein oder mehrere der Gene beziehungsweise Allele ausgewählt aus der Gruppe
a) ein für eine L-Lysin insensitive Aspartatkinase kodierendes lysCFBR-Allel,
b) ein für eine Aspartatsemialdehyd Dehydrogenase kodierendes asd-Gen,
c) ein für eine Dihydrodipicolinat Synthase kodierendes dapA-Gen (EP 0 197 335)
d) ein für eine Dihydrodipicolinat Reduktase kodierendes dapB-Gen,
e) ein für eine Tetrahydrodipicolinat Succinylase kodierendes dapD-Gen,
f) ein für eine Succinylaminopimelat Transaminase kodierendes dapC-Gen,
g) ein für eine Succinylaminosuccinylase kodierendes dapE- Gen,
h) ein für eine Diaminopimelate Epimerase kodierendes dapF-Gen (US 6,670,156),
i) ein für eine Diaminopimelat Dehydrogenase kodierendes ddh-Gen (US 6,090,597) j ) ein für eine Diaminopimelat Decarboxylase kodierendes lysA-Gen (US 4,861,722; US 6,090,597), und
k) ein für eine Lysin-Permease kodierendes lysE-Gen (US 6,858,406)
uberexprimiert .
Ganz besonders bevorzugt wird die gemeinsame Uberexpression zweier oder mehrerer der Gene ausgewählt aus der Gruppe lysCFBR-Allel, dapA-Gen, dapB-Gen, ddh-Gen und lysA-Gen.
Für das erfindungsgemaße Verfahren kann es außerdem vorteilhaft sein verschiedene Enzyme der Glykolyse und des Citronensaurezyklus oder der L-Threonin-Biosynthese abzuschwächen oder coryneforme Bakterien zu verwenden, in denen diese abgeschwächt vorliegen.
Der Begriff „Abschwachung" bzw. „Abschwachen" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellularen Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym bzw. Protein inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Zur Erzielung einer Abschwachung können entweder die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.
Die Genexpression kann durch geeignete Kulturfuhrung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z.B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949-5952 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3584-3590 (1998), bei Pätek et al . (Microbiology 142: 1297-309 (1996) und Journal of Biotechnology 104: 311-323 (2003)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
Ein Beispiel für die gezielte Regulation der Genexpression ist die Klonierung des abzuschwächenden Gens unter die Kontrolle eines durch Zugabe dosierter Mengen von IPTG (Isopropyl-/?-D-thiogalactopyranosid) induzierbaren
Promotors wie zum Beispiel des trc-Promotors oder des tac- Promotors . Hierzu eignen sich Vektoren wie beispielsweise der Escherichia coli Expressionsvektor pXK99E (WO0226787; hinterlegt gemäß Budapester Vertrag am 31. Juli 2001 in DH5alpha/pXK99E als DSM14440 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)) oder pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Deutschland (1997)), die eine IPTG- abhängige Expression des klonierten Gens in Corynebacterium glutamicum ermöglichen.
Eingesetzt wurde diese Methode beispielsweise in der Patentschrift WO0226787 zur regulierten Expression des deaD-Gens durch Integration des Vektors pXK99EdeaD in das Genom von Corynebacterium glutamicum und von Simic et al . (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) zur regulierten Expression des glyA-Gens durch Integration des Vektors pK18mobglyA' in Corynebacterium glutamicum.
Eine weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxynukleotide oder Vektoren zur Synthese längerer Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA kann dort an komplementäre Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet der Fachmann bei Srivastava et al . (Applied Environmental Microbiology 66 (10): 4366 - 4371 (2000)).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al . (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel („Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekular- biologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen von mindestens einem (1) Basenpaar bzw. Nukleotid in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des durch die Mutation hervorgerufenen
Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Die Fehlsinnmutation führt zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nicht-konservativen Aminosäureaustausch handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins beeinträchtigt und auf einen Wert von ≥ 0 bis 75%, ≥ 0 bis 50%, > 0 bis 25%, > 0 bis 10% oder > 0 bis 5% reduziert. Die Nichtsinnmutation führt zu einem Stop-Kodon im Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations") , die dazu führen, dass falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Deletionen von mindestens einem (1) oder mehreren Kodonen führen typischerweise ebenfalls zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Die genannten Massnahmen werden vorzugsweise im 5 ' -terminalen Teil der Kodierregion durchgeführt, welcher für den N-Terminus des Polypeptids kodiert. Bezeichnet man die Gesamtlänge eines Polypeptids (gemessen als Anzahl der chemisch verbundenen L- Aminosäuren) mit 100%, so gehört - im Rahmen der vorliegenden Erfindung - zum N-Terminus des Polypeptids der Teil der Aminosäuresequenz, welcher, gerechnet ab der Start-Aminosäure L-Formyl-Methionin 80% der nachfolgenden L-Aminosäuren enthält.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids im Allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10%, 0 bis 5% oder 0 bis 1% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder
Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt. Unter einem „Ausgangsmikroorganismus" versteht man den Mikroorganismus, an dem die Massnahmen der Abschwächung durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird/werden ein oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
a) ein für eine Pyruvatkinase kodierendes pyk-Gen,
b) eines oder beide der für die Untereinheiten der Pyruvat-Dehydrogenase kodierenden Gene aceE und aceF (DE 102005045301) , c) ein für die Citratsynthase kodierendes gltA-Gen,
d) ein für die Homoserin-Dehydrogenase kodierendes hom- Gen,
e) ein für die Homoserin-Kinase kodierendes thrB-Gen,
f) ein für die Threonin-Synthase kodierendes thrC-Gen,
g) ein für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierendes pck-Gen (US 6,872,553),
h) ein für die Pyruvat-Oxidase (= Pyruvat-Chinon
Oxidoreduktase) kodierendes poxB-Gen (EP 1 096 013), und
i) ein für das malic enzyme (EC 1.1.1.40) kodierendes mez- Gen (= malE-Gen) (EP 1 367 130)
abgeschwächt .
Die Fermentation der coryneformen Bakterien, kann kontinuierlich - wie beispielsweise in der PCT/EP
2004/008882 beschrieben - oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch- (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Lysin durchgeführt werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.
Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology,, der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und
Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar .
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose,
Melasse, Saccharose-haltige Losungen aus der Zuckerruben- oder Zuckerrohrherstellung, Starke, Starkehydrolysat und Cellulose, Ole und Fette, wie zum Beispiel Sojaol, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsauren, wie zum Beispiel Palmitinsaure, Stearinsaure und Linolsaure,
Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Sauren, wie zum Beispiel Essigsaure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, bevorzugt Ammoniak oder Ammoniumsulfat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsaure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze beispielsweise in Form von Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensaure zusatzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen der jeweiligen Aminosäure zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise wahrend der Kultivierung zugefuttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser bevorzugt Ammoniak oder Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsaure oder Schwefelsaure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6, 0 bis 9, 0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle der
Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsaurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium gegebenenfalls geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefugt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird die Fermentation bei
Überdruck, beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20 0C bis 45 0C und vorzugsweise bei 25 0C bis 40 0C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Lysin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich.
Beispiele für geeignete Fermentationsmedien finden sich unter anderem in den Patentschriften US 5,770,409, US
5,840,551 und US 5,990,350, US 5,275,940 oder US 4,275,157. Weitere Beispiele für Fermentationsmedien finden sich bei Ozaki und Shiio (Agricultural and Biological Chemistry 47(7), 1569-1576, 1983) und Shiio et al . (Agricultural and Biological Chemistry 48(6), 1551-1558, 1984). Methoden zur Bestimmung von L-Lysin und anderer L- Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al .
(Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender
Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al .
(Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.
Die auf diese Weise hergestellte Fermentationsbrühe wird anschließend erfindungsgemäß weiterverarbeitet.
Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein Fermentationsmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten Medien enthält/enthalten sämtliche Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Vermehrung des Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten Aminosäure sicherstellt.
Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des coryneformen Bakteriums entstandene Biomasse (= Zellmasse) des Mikroorganismus, b) das im Laufe der Fermentation gebildete L-Lysin, c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten
Bestandteile des/der eingesetzten Fermentationsmediums/ Fermentationsmedien beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin, Aminosäuren wie Homoserin oder Salze wie Magnesiumsulfat.
Zu den organischen Nebenprodukte gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben L-Lysin erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu zählen L-Aminosäuren, die im Vergleich zum erwünschten L-Lysin weniger als 30 %, 20 % oder 10 % ausmachen. Hierzu gehören weiterhin organische Säuren, die ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Apfelsäure oder Fumarsäure. Schließlich gehören dazu auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.
Typische für industrielle Zwecke geeignete
Fermentationsbrühen haben einen L-Lysingehalt von 40 g/kg bis 180 g/kg oder 50 g/kg bis 150 g/kg. Der Gehalt an Biomasse (als getrocknete Biomasse) beträgt im Allgemeinen 20 bis 50 g/kg.
Gegebenenfalls wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe vor den weiteren Verfahrensschritten teilweise oder ganz entfernt .
Die erhaltene Fermentationsbrühe wird anschließend erfindungsgemäß weiterverarbeitet, in dem man ein Verfahren durchführt das mindestens folgende Schritte umfasst:
a) gegebenenfalls das Verhältnis SuIfat/L-Lysin misst,
b) anschließend gegebenenfalls Ammoniumsulfat zusetzt,
c) den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,0 bis 5,2 , insbesondere 4,9 bis 5,1 absenkt, wobei man durch die Zugabe der Sulfat-haltigen Verbindung (n) in den
Schritten b) und c) ein SuIfat/L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2, bevorzugt 0,9 bis 1,0 besonders bevorzugt >0,9 bis <0,95 in der Brühe einstellt, und
d) das so erhaltene Gemisch durch Wasserentzug aufkonzentriert, und bevorzugt granuliert,
wobei Schritt c) auch vor Schritt b) durchgeführt werden kann.
Unter Sulfat-haltigen Verbindungen im Sinne der oben genannten Verfahrensschritte sind insbesondere Ammoniumsulfat und Schwefelsäure gemeint. Auf diese Weise erhält man ein Produkt mit einem L-Lysin- Gehalt von 10 bis 70 Gew.-% (berechnet als Lysinbase, bezogen auf die Gesamtmenge) und einem molaren Sulfat/L- Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2 , bevorzugt 0,9 bis 1,0, besonders bevorzugt >0,9 bis <0,95.
Das molare SuIfat/L-Lysin-Verhältnis V wird nach der Formel: V = 2 x [SO4 2] / [L-Lysin] berechnet.
Diese Formel berücksichtigt die Tatsache, dass das SO4 2 Anion zweiwertig ist. Ein Verhältnis V = I bedeutet, dass ein stöchiometrisch zusammengesetztes Lys2 (SO4) vorliegt , während bei einem Verhältnis von V = 0,9 ein 10%iger SuIfatunterschuss und bei einem Verhältnis von V = 1,1 ein 10% SuIfatüberschuss gefunden wird.
Es ist möglich, die Fermentation in Gegenwart einer solchen Menge von Ammoniumsulfat durchzuführen, dass nach
Beendigung der Fermentation bereits ein SuIfat/Lysin- Verhältnis vorliegt, das im erfindungsgemäß beanspruchten Bereich liegt. Gegebenenfalls entfällt dann die Messung des L-Lysin/Sulfat Verhältnisses. Die weitere Zugabe von Ammoniumsulfat ist dann gegebenenfalls auch nicht mehr erforderlich .
Wird über die erfindungsgemäße pH-Wertabsenkung hinaus Säure zugesetzt, sind wegen der Pufferwirkung der in der Brühe enthaltenen Verbindungen erhöhte Mengen an Säure erforderlich, die dann zu einer unerwünschten Denaturierung und Auflösung der Zellen der coryneformen Bakterien führen können .
In einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante wird der Fermentationsbrühe eines oder mehrerer der Salze der schwefeligen Säure (Sulfite) ausgewählt aus der Gruppe
Ammonium-, Alkali-, und Erdalkalisalz in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugt 0,1 bis 0,3 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,1 bis 0,2 Gew.-% bezogen auf die Fermentationsbrühe zugesetzt. Bevorzugt wird Alkalihydrogensulfit und besonders bevorzugt Natriumhydrogensulfit eingesetzt .
Die Sulfite, insbesondere Natriumhydrogensulfit werden bevorzugt als Lösung vor der Aufkonzentration der Fermentationsbrühe zugesetzt. Die eingesetzte Menge wird bevorzugt bei der Einstellung des SuIfat-/L- Lysinverhältnisses berücksichtigt .
Der bei der Aufarbeitung von Fermentationsbrühen im Allgemeinen auftretende Verlust an L-Lysin wird durch die erfindungsgemäßen Masnahmen um bis zu ca. 50 % verringert.
So wurde festgestellt, dass die Einstellung des pH-Wertes in der Fermentationsbrühe auf Werte pH >4 bis £ 5,2, die Erhöhung des SuIfat/L-Lysin Verhältnisses auf 0,85 bis 1,2 und eine Sulfitzugabe von 0,01 bis 0,5 Gew.-% in der Fermentationsbrühe den Verlust an L-Lysin während der
Aufarbeitung der Fermentationsbrühe deutlich reduzierte.
Dabei führt die Kombination der verschiedenen Maßnahmen vor der Aufarbeitung zu einem synergistischen Effekt im Vergleich zur Summe der Einzeleffekte.
In nicht behandelten Fermentationsbrühen (keine Zugabe eines der Zuschlagstoffe, das heißt Ammoniumsulfat, Schwefelsäure oder Natriumhydrogensulfit) resultierte bei der Einengung zum Konzentrat ein mittlerer Lysinverlust von ca. 3,5 Gew.-% (ohne Granulationsschritt). Die Erhöhung des Sulfatverhältnisses durch Zugabe von Ammoniumsulfat führte zu einem mittleren Lysinverlust von ca. 3,2 Gew.-%, die alleinige pH-Werteinstellung reduzierte den Lysinverlust auf ca. 1,4 Gew.-%.
Die Kombination von pH-Werteinstellung und Erhöhung des Sulfat-Anteils zeigte eine höhere Schutzwirkung für das L- Lysin und resultierte in einem Lysinverlust von ca. 0,9 Gew.-%. Die Kombination aller drei Zuschlagstoffe ergab einen mittleren Lysinverlust von ca. 0,6 Gew.-% bzw. 0,7 Gew.-%. Dies entspricht einer relativen Reduktion des Lysinverlustes um ca. 80 %.
Bei der sich nach der Herstellung des Konzentrates anschließenden Granulation bleiben die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens weitgehend erhalten. Während bei der Granulation von Konzentraten aus unbehandelten Fermentationsbrühen Lysinverluste bis ca. 5 Gew.-% beobachtet wurden, ergaben sich bei Konzentraten aus erfindungsgemäß vorbehandelten Fermentationsbrühen ca. 2 Gew.-%. Dies entspricht einer relativen Reduktion des Lysinverlustes um ca. 60 %.
Als Folge der Vorbehandlung von L-Lysin-haltiger Fermentationsbrühe durch Erniedrigung des pH-Wertes, Erhöhung der Sulfatbilanz und Zugabe von Sulfit wird die Ausbeute an L-Lysin erhöht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Lysin enthaltenden Futtermitteladditiven werden solche Vorgehensweisen bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten.
Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z.B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse beziehungsweise die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes inaktiviert.
In einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt, so dass keine (0 %) oder höchstens 30 %, höchstens 20 %, höchstens 10 %, höchstens 5 %, höchstens 1 % oder höchstens 0,1 % Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer bevorzugten Verfahrensweise wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt, sodass sämtliche (100 %) oder mehr als 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % oder 99,9 % Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt.
Fermentationsbrühen, aus denen die Biomasse teilweise oder insgesamt entfernt wurde, können auch zur Standardisierung bei der Herstellung des Produkts eingesetzt werden. Dies gilt natürlich auch für die reinen Verbindungen L-Lysinbase und Lysinsulfat.
Erfindungsgemäß wird die erhaltene Fermentationsbrühe vor der Aufkonzentration mit Schwefelsäure angesäuert und gegebenenfalls mit Ammoniumsulfat versetzt. Schließlich kann die Brühe auch durch Zusatz von bevorzugt Natriumbisulfit (Natriumhydrogensulfit) oder einem anderen Salz beispielsweise Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalz der schwefligen Säure stabilisiert und aufgehellt werden.
Wird Biomasse ganz oder teilweise abgetrennt, erfolgt dies bevorzugt vor der erfindungsgemäßen Absenkung des pH-Werts und der Zugabe von Ammoniumsulfat und Sulfitsalz.
Bei der gegebenenfalls vorgenommenen Abtrennung der Biomasse werden gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene organische oder anorganische Feststoffe teilweise oder ganz entfernt. Die in der Fermentationsbrühe gelösten organischen Nebenprodukte und die gelösten nicht verbrauchten Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe) bleiben mindestens teilweise (> 0 %) , bevorzugt zu mindestens 25 %, besonders bevorzugt zu mindestens 50 % und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75 % im Produkt. Gegebenenfalls bleiben diese auch vollständig (100 %) oder nahezu vollständig das heißt > 95 % oder > 98 % im Produkt. In diesem Sinne bedeutet der Begriff „Fermentationsbrühebasis", dass ein Produkt mindestens einen Teil der Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält.
Anschließend wird der Brühe mit bekannten Methoden wie Erhitzen bzw. Aufheizen z.B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dunnschichtverdampfers oder Fallfilmverdampfers, oder durch Umkehrosmose oder Nanofiltration Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt bzw. aufkonzentriert . Diese aufkonzentrierte Brühe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Spruhgranulation oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden Wirbelschicht gemäß PCT/EP 2004/006655 beschrieben, zu rieselfahigen, feinteiligen oder grobkörnigen Produkten insbesondere zu Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls wird aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein Produkt mit der gewünschten Korngroße isoliert.
Es ist ebenfalls möglich, ein feinteiliges Pulver oder grobkörniges Produkt direkt d. h. ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung oder Spruhgranulation aus der erfindungsgemaß behandelten Fermentationsbruhe zu gewinnen.
Das rieselfahige, feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfahiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überfuhrt werden.
Die Granulate sind z. B. herstellbar nach den Verfahren gemäß EP-B 0 615 693 oder EP-B 0 809 940, US 5 840 358 oder WO 2005/006875 oder WO 2004/054381.
Unter „rieselfahig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefaßen mit verschieden großen Auslaufoffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Ole, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).
Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngroße von 20 bis 200 μm Durchmesser gemeint . Mit „grobkörnig" ist ein Produkt mit einem überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngroße von 200 bis 2000 μm Durchmesser gemeint.
Der Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5 %) an Korngroßen unter 100 μm Durchmesser enthalt.
Die Bestimmung der Korn- bzw. Teilchengroßen kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur „Teilchengroßenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Muller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch „Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben .
Bevorzugt sind Produkte mit einem Anteil von ≥ 97 Gew.-% einer Korngroße von 100 bis 1800 μm oder einem Anteil von ≥ 95 Gew.-% einer Korngroße von 300 bis 1800 μm Durchmesser. Der Anteil an Staub d. h. Partikeln mit einer Korngrosse < 100 μm liegt bevorzugt bei > 0 bis 1 Gew.-% besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%. Das Schüttgewicht der bevorzugten Produkte beträgt im Allgemeinen 600 bis 950 kg/m3, insbesondere 650 bis 900 kg/ m3.
Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Tragern wie Starke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ahnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsauren, Silikaten (EP-A 0 743 016) oder Stearaten.
Weiterhin ist es vorteilhaft die Oberflache der erhaltenen Granulate mit Ölen zu versehen, so wie es in der WO 04/054381 beschrieben ist. Als Ole können Mineralole, pflanzliche Ole oder Mischungen pflanzlicher Ole verwendet werden. Beispiele für derartige Ole sind Sojaol, Olivenöl, Soj aol/Lecithingemische . In gleicher Weise sind auch Silikonole, Polyethylenglykole oder Hydroxyethycellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflachen mit den genannten Ölen erzielt man eine erhöhte Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils. Der Gehalt an Ol im Produkt betragt 0,02 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditives.
Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Tragerstoff wie zum Beispiel Kieselsauren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Starken, Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen
Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Schließlich kann das Produkt auch durch
Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise Metallcarbonate, Kieselsauren, Silikate, Alginate, Stearate, Starken, Gummis und Celluloseether, wie in der DE-C 41 00 920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermagen insbesondere dem Magen von Wiederkauern ist .
Zur Einstellung einer gewünschten L-Lysin-Konzentration im Produkt kann je nach Anforderung wahrend des Verfahrens das L-Lysin in Form eines Konzentrates oder gebenenfalls einer weitgehend reinen Substanz beziehungsweise deren Salz in flussiger oder fester Form hinzugefugt werden. Diese können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder aufkonzentrierten Fermentationsbruhe, oder auch wahrend des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefugt werden. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten festen Produkte sind bevorzugt Granulate und haben unter anderem folgende Eigenschaften:
Sie haben einen pH-Wert von 3,5 bis 5,1, insbesondere 4,0 bis 5,0, bevorzugt 4,2 bis 4,8 gemessen in wässriger Suspension. (Für die pH-Messung wird eine 10 Gew.-%ige Suspension in entionisiertem Wasser hergestellt und der pH bei 25°C mit einer pH-Elektrode gemessen. Der Messwert stellt sich nach ca. 1 Minute konstant ein.)
Sie weisen trotz des erhöhten Sulfatgehalts einen deutlich höheren „Weissgrad", eine geringere Hygroskopizität und eine bessere Stabilität bei thermischer Belastung als Granulate mit demselben L-Lysingehalt auf, die suspendiert einen pH-Wert von 5,3 bis 5,7 und ein SuIfat/L-Lysin- Verhältnis im Bereich von z. B. 0,75 bis 0,87 zeigen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Die Farbwerte bzw. der „Weissgrad" der Produkte, bevorzugt Granulate, werden nach dem in der Deutschen Industrienorm 5033 (DIN 5033) definierten Dreibereichsverfahren (L*a*b*- Farbmessung) bestimmt. Hierfür kann ein 3-Bereichs- Farbmessgerät zur Färb- und Remissionsmessung wie beispielsweise das Farbmessgerät vom Typ Micro Color II LMC der Firma Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) verwendet werden. Hierbei wird die diffuse Reflexion der Probe unter einem Winkel von 8° gemessen. Das reflektierte Licht wird dabei über einen Lichtleiter in das Gerät zur Aufspaltung auf die exakt definierten Normfarbfilter übertragen. Gemessen wird gegen einen Kalibrierstandard.
Die Farbwerte liegen bevorzugt in den Bereichen:
ohne Hydrogensulfitzusatz: L* 65-70, a* 6-8, b* 20-25 mit Hydrogensulfitzusatz: L* >70-80, a* 4-<6, b* >25-30.
Sie haben einen Lysingehalt (gerechnet als Lysinbase) von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 bis 60 Gew.-% oder 30 bis 65 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 60 Gew.-% oder 40 Gew.-% bis 65 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Produkts.
Das Verhältnis von Sulfat zu L-Lysin im Produkt beträgt 0,85 bis 1,2, bevorzugt 0,9 bis 1,0, besonders bevorzugt >0, 9 bis <0, 95.
Im Allgemeinen liegt der Wassergehalt zwischen 0,1 Gew.-% und maximal 5 Gew.-%. Der Wassergehalt beträgt bevorzugt maximal 4% Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 3% Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 2,5 Gew.-%. Wassergehalte von maximal 2 Gew.-% sind ebenfalls möglich.
Eine Reinkultur des Corynebacterium glutamicum Stammes DM1910 wurde am 15. Mai 2006 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen gemäß Budapester Vertrag (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 18255 hinterlegt.
Eine Reinkultur des Corynebacterium glutamicum Stammes
DM1913 wurde am 15. Mai 2006 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen gemäß Budapester Vertrag (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 18256 hinterlegt.
Bei spiel 1 :
Herstellung einer L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühe
Das in Stamm DM1918 enthaltene lysC-Allel wurde mit dem in der Patentschrift WO 03/014330 beschriebenen Verfahren der tandem-Duplikation am lysC-Genort verdoppelt. Eine weitere Kopie des lysC-Allels wurde in das aecD-Gen des erhaltenen Stammes eingebaut so wie in der WO 03/040373 beschrieben.
Der auf diese Weise erhaltene Stamm DM1918_3xlysC wurde dann in einem fed batch Verfahren zur Herstellung einer L- Lysin-haltigen Fermentationsbrühe eingesetzt. Die Fermentation wurde in Anlehnung an die Patentschrift EP 0 533 039 durchgeführt. Anstelle von Maiskleberhydrolysat wurde Maisquellwasser verwendet. Ammoniumsulfat wurde unter Verwendung einer sterilen Ammoniumsulfat-Lösung (37 Gew.-%) entsprechend dem Bedarf hinzugefügt. Der Entschäumer wurde ebenfalls separat entsprechend dem Bedarf dosiert.
Beispiel 2:
Herstellung eines L-Lysin-haltigen Produktes nach dem Stand der Technik
In der erhaltenen Fermentationsbrühe wurde der Gehalt an L- Lysin und an Trockenmasse bestimmt und daraus der Anteil an L-Lysin in der Trockenmasse errechnet.
Durch Zugabe von L-Lysin wurde ein Gehalt an L-Lysin von 57,5 Gew.-% in der Trockenmasse eingestellt. Der pH der Brühe betrug 7,8 und das SuIfat/L-Lysin-Verhältnis V betrug 0,80.
Die Brühe wurde anschließend auf ca. 600C erhitzt, unter Vakuum aufkonzentriert und anschließend, wie in der
Patentschrift EP 0 809940 beschrieben, granuliert. Der Gehalt an L-Lysin in dem erhaltenen Produkt (Produkt 1) betrug 52,6 Gew.-%. Der Restwassergehalt in dem Produkt betrug ca. 2 Gew.-%. Der Lysinverlust betrug somit ca. 4,9 Gew.-%.
Beispiel 3:
Herstellung eines L-Lysin haltigen Produktes durch Zuschlag von Ammoniumsulfat und Absenkung des pH-Wertes
Zu der in Beispiel 2 beschriebenen Brühe wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat mittels einer 37 prozentigen Lösung das SuIfat/L-Lysin-Verhältnis V auf ca. 0,90 (bezogen auf die Trockenmasse) erhöht. Anschließend wurde durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure der pH-Wert auf ca. 5,1 eingestellt. Hierdurch erhöhte sich das SuIfat/L-Lysin- Verhältnis V auf ca. 0,92 (bezogen auf die Trockenmasse). Der Gehalt an L-Lysin in der Trockenmasse sank aufgrund des Verdünnungseffektes auf einen Wert von 55,4 Gew.-%.
Die Brühe wurde anschließend auf ca. 600C erhitzt, unter Vakuum aufkonzentriert und anschließend, wie in der Patentschrift EP 0809940 beschrieben, granuliert. Der Gehalt an L-Lysin in dem erhaltenen Produkt (Produkt 2) betrug 52,7 Gew.-%. Der Restwassergehalt in dem Produkt betrug ca. 2 Gew.-%. Der Lysinverlust betrug somit ca. 2,4 Gew.-%.
Das Produkt 2 war optisch heller als das Produkt 1.
Beispiel 4 :
Bestimmung der Wasseraufnahme (Hygroskopizität) in den hergestellten L-Lysin-haltigen Produkten
Die Produkte 1 und 2 wurden in einer Klimakammer einer relativen Luftfeuchte von 75 % und einer Temperatur von 400C ausgesetzt. Nach sechs Stunden Inkubation wurde gravimetrisch die Wasseraufnahme bestimmt. Während bei Produkt 1 aus Beispiel 2 die Gewichtszunahme ca. 13 % betrug, war sie bei Produkt 2 aus Beispiel 3 ca. 11 %. Bei spiel 5 :
L*a*b*-Farbmessung an den hergestellten L-Lysin-haltigen Produkten
Die L*a*b*-Farbmessung an den Proben 1 und 2 wurde so wie in der Patentschrift PCT/EP2006/066192 beschrieben unter
Verwendung des Farbmessgerätes Micro Color II LMC der Firma Lange und unter Verwendung des Weißstandards LZM076 durchgeführt .
Für das Produkt 1 ergaben sich folgende Werte: L* 61, a* 8 und b* 18. Für das hellere Produkt 2 ergaben sich folgende Werte: L* 68, a* 7 und b* 24.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines festen L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditives dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt
a) Fermentation eines isolierten L-Lysin produzierenden coryneformen Bakteriums in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen für eine bestimmte Zeit, wobei man nach Abschluss der Fermentation,
b) gegebenenfalls das SuIfat/L-Lysin-Verhältnis bestimmt,
c) anschließend gegebenenfalls Ammoniumsulfat zusetzt,
d) den pH-Wert durch die Zugabe von Schwefelsäure auf 4,9 bis 5,2 absenkt, wobei man durch die Zugabe der Sulfat-haltigen Verbindungen in den Schritten c) und d) ein SuIfat/L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2 in der Brühe einstellt,
e) das so erhaltene Gemisch durch Wasserentzug aufkonzentriert und trocknet, und
f) wobei das isolierte coryneforme Bakterium eine Nukleotidsequenz, die für eine Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, und eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen enthält, ausgewählt aus der
Gruppe :
g) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6- Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 6 und an Position
329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L- Valin enthält, h) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu > 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 12 und an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L- Serin enthält,
i) Nukleotidsequenz, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-
Tyrosin, an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin und an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, enthält, und
j) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit
Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥
95% identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin, enthält.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man die Reihenfolge der Zugaben von Ammoniumsulfat und Schwefelsäure umdreht.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem man vor der Aufkonzentration ein Alkalihydrogensulfit in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Fermentationsbruhe, zusetzt.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, bei dem man nach Abschluss der Fermentation 0 bis 100 % der wahrend der Fermentation gebildeten Biomasse entfernt und die Schritte b) bis j) anschließt.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem man die Oberflache des Granulats mit einem Ol in einer Menge von 0,02 bis 2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditives, belegt.
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, bei dem man ein coryneformes Bakterium der Gattung Corynebacterium einsetzt .
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem man das coryneforme Bakterium der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.
8. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aspartatkinase die Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei diese eine oder mehrere der Aminosaureaustausche ausgewählt aus der Gruppe A279T, A279V, S301F, S301Y, T308I, S317A, R320G, T311I, G345D, T380I und S381F aufweist .
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aspartatkinase den Aminosaureaustausch S317A aufweist .
10. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aspartatkinase den Aminosaureaustausch A279T aufweist .
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aspartatkinase zusatzlich den Aminosaureaustausch S381F aufweist.
12. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 6 und an Position 329 L-Methionin enthält.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 aufweist, wobei an Position 329 L-Methionin enthalten ist.
14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 12 und an Position 321 L-Serin enthält.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12 aufweist, wobei an Position 321 L-Serin enthalten ist.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12 aufweist, wobei an Position 321 L-Serin und wobei an Position 8 L-Threonin enthalten ist.
17. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die OpcA- Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche enthält ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 L-Histidin anstelle L-Tyrosin, an Position 219 L-Asparagin anstelle L-Lysin, an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin und an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 18 aufweist, und einen oder mehrere Aminosäureaustausche enthält ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 L- Histidin anstelle L-Tyrosin, an Position 219 L- Asparagin anstelle Lysin, an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin und an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 18 aufweist, wobei an Position 107 L-Histidin, an
Position 219 L-Asparagin, an Position 233 L-Serin und an Position 261 L-Histidin enthalten ist.
20. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität eine
Aminosäuresequenz aufweist, die zu ≥ 95% identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 L-Phenylalanin oder L-Alanin enthält.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase
Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24 aufweist, wobei an Position 111 L-Phenylalanin oder L- Alanin enthalten ist.
22. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase
Aktivität die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24 aufweist, wobei an Position 111 L-Phenylalanin oder L- Alanin und an Position 201 L-Serin enthalten ist.
23. Isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit Aspartatkinase-Aktivität kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 kodiert, wobei an Position 297 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Leucin enthalten ist und wobei das Polypeptid gegebenenfalls zusätzlich einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe lysC A279T, lysC A279V, lysC S301F, lysC S301Y, lysC T308I, lysC T311I, lysC R320G, lysC G345D, lysC T380I, lysC S381F, und lysC S317A enthält.
24. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid an Position 297 L- Glutamin enthält.
25. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid zusätzlich den
Aminosäureaustausch lysC S317A enthält.
26. Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 24 und 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid an Position 297 L-Glutamin und an Position 317 L-Alanin enthält.
27. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid von einem Polynukleotid kodiert wird, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 33 umfasst.
28. Vektor enthaltend ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 23-27.
29. Isolierte coryneforme Bakterien, die ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 23-27 enthalten.
30. Coryneforme Bakterien, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 28 transformiert worden sind.
31. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin- haltigen Futtermitteladditiven, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:
a) Fermentation der Bakterien gemäß den Ansprüchen 29 und 30 in einem geeignetem Nährmedium,
b) Akkumulation des L-Lysins in dem Nährmedium oder in den Zellen des coryneformen Bakteriums.
32. Das isolierte coryneforme Bakterium, das unter der Nummer DSM 18255 bei der DSMZ hinterlegt worden ist.
33. Das isolierte coryneforme Bakterium, das unter der
Nummer DSM 18256 bei der DSMZ hinterlegt worden ist.
34. Festes L-Lysin enthaltendes Tierfuttermittelsupplement auf Fermentationsbrühebasis wobei
a) das SuIfat/L-Lysin- Verhältnis im Supplement sich auf 0,85 bis 1,2 beläuft
b) das Supplement einen pH-Wert von 3,5 bis 5,1 aufweist und
c) 0 bis 100% der während der Fermentation gebildeten Biomasse aus coryneformen Bakterien im Supplement enthalten sind mit der Maßgabe
d) dass die coryneformen Bakterien eine Nukleotidsequenz, die für eine Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert und eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen enthalten, ausgewählt aus der Gruppe
e) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit 6- Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 6 und an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-
Valin enthält. f) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu > 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 12 und an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen Glycin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L- Serin enthält,
g) Nukleotidsequenz, die für eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95% identisch ist mit SEQ ID NO: 18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-
Tyrosin, an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin und an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, enthält, und
h) Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit
Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥
95% identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin, enthält.
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