WO2007118751A2 - Verfahren zur veränderung des atp-adp-verhältnisses in zellen - Google Patents

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WO2007118751A2
WO2007118751A2 PCT/EP2007/052655 EP2007052655W WO2007118751A2 WO 2007118751 A2 WO2007118751 A2 WO 2007118751A2 EP 2007052655 W EP2007052655 W EP 2007052655W WO 2007118751 A2 WO2007118751 A2 WO 2007118751A2
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polypeptide
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Thorsten Zank
Oliver Oswald
Jörg BAUER
Helene Vigeolas
Peter Geigenberger
Mark Stitt
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Max Planck Institut Für Molekulare Pflanzenphysiologie
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins

Definitions

  • the invention relates to a method for altering the ATP / ADP ratio in a cell, tissue, organ, microorganism or plant by altering the hemoprotein activity in the cell and its use.
  • Adenosine triphosphate is formed in the process of both photosynthesis and respiration from ADP (adenosine diphosphate) and high-energy phosphate bonds. These are endergonic reactions. The energetic ATP is hydrolyzed by ATPases releasing energy. Since most processes in the cell are endergonic, they become possible only through the coupling with a second exergonic reaction, which in most cases involves the hydrolysis of ATP.
  • hydrolysis of ATP to ADP serves as a driving force in many biochemical processes such.
  • ATP in the cell is an energy carrier that provides the energy for ultimately any activity of the cell or organism.
  • Each organism thus uses ATP as its primary source of energy.
  • ATP plays a key role in the metabolism of the cell.
  • ATP has a very short half life ("lifetime”) and therefore virtually no storage capacity.
  • the ATP-ADP ratio is an important parameter of energy metabolism.
  • a high ATP-ADP ratio means an energy surplus.
  • the intracellular ATP reserves are consumed and the ATP-ADP ratio is shifted towards ADP.
  • hemoglobin or related proteins The expression of hemoglobin or related proteins is known in the art.
  • US Patent 6,372,961 discloses the expression of genes coding for hemoglobin, thereby increasing oxygen metabolism in plants. This increased oxygen or ATP content may affect biosynthesis in the plants.
  • WO 98/12913 a method for increasing oxygen assimilation is known which is based on expression of hemoglobin proteins. Further, this document discloses that an increase in the production of secondary metabolites can be attributed to a simultaneous increase in the ATP concentration. Furthermore, it is known from WO 00/00597 that the expression of non-symbiotic hemoglobin in cells leads to an increase in the ATP content. The expression of hemoglobin and related proteins was used according to WO 99/02687 A to increase the iron content in cells.
  • leghemoglobin in plant cells is also known from Barata et al .: (Plant Science, Vol.155, June 2000, 193-202), wherein oxygen availability is examined.
  • Object of the present invention is to provide a method by which the cell or the organism more ATP and thus more energy is available.
  • ATP should also be used as energy storage, that is, it should be achieved an increase in the ATP-ADP ratio.
  • Another object of the present invention is the energy thus provided specifically for the synthesis of fatty acids, in particular alpha-linolenic acid (ice, ice, cis-9,12,15-Octadecatrien Acid (ice, ice, cis-9,12,15-Octadecatrien Acid (ice, ice, cis-9,12,15-Octadecatrienklad)
  • the ATP-ADP ratio is meant the ratio of the concentration of ATP to the concentration of ADP.
  • concentrations can be determined by the customary methods known to the person skilled in the art, for example by 31 P-NMR spectroscopy in intracellular measurement or as described below in the examples.
  • the term cell comprises cells, parts of plants such as organs or tissues, as well as whole plants and microorganisms.
  • Hemoproteins are proteins capable of binding oxygen via a prosthetic group, such as non-symbiotic hemoglobin, myoglobin or leghemoglobin, preferably leghemoglobin and nonsymbiontic hemoglobin, most preferably leghemoglobin.
  • Hemoprotein activity means the ability of the polypeptide to bind oxygen to the prosthetic group (hem). These are understood according to the invention iron-II complexes of protoporphyrin. Altering the activities of a hemprotein in a cell means the ability to bind more or less oxygen in the cell compared to cells of the wild type of the same genus and species to which the methods of the invention have not been applied, all other conditions being equal (such as culture conditions, age the cells etc.).
  • the change, increase or decrease, preferably increase, in comparison to the wild type is at least 1%, 2%, 5%, 10%, preferably at least 10% or at least 20%, particularly preferably at least 40% or 60%, completely more preferably at least 70% or 80%, most preferably at least 90%, 95% or more.
  • the ATP-ADP ratio is at least 200%, preferably 300%, more preferably at least 400% or more, based on the wild-type ATP-ADP ratio.
  • Analogous conditions means that all framework conditions such as culture or breeding conditions, assay conditions (such as buffer, temperature, substrates, concentration, etc.) are kept identical between the experiments to be compared and the approaches are determined solely by the activity of Distinguish Hemproteins.
  • Altering according to the invention means a de novo introduction of the activity of a polypeptide according to the invention into a cell, tissue, organ, microorganism or plant or a reduction or, preferably, an increase in an already existing activity of the polypeptide according to the invention.
  • the concentration of the hemoproteins is increased.
  • Altering the activity of a hemoprotein can be achieved by altering the structure of the proteins, by altering the stability of the hemoproteins or by altering the concentration of hemoproteins in a cell.
  • a preferred variant of the present invention is characterized in that the activities of a hemoprotein, preferably a non-symbiotic hemoglobin or a leghemoglobin is increased.
  • nucleic acid molecule comprising at least one nucleic acid molecule selected from the group consisting of: a) nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 , 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and / or 40; b) nucleic acid molecule which comprises at least one polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and / or 31; c) a nucleic acid molecule which encodes a polypeptide whose sequence has an identity of at least 40% to the sequences SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39 and / or 40; d) Nucleic acid molecule according to (a) to (c) which is suitable for a fragment of the sequences according
  • Sequence Nos. 41 and 42 amplifies f) a nucleic acid molecule encoding a polypeptide having hemoprotein activity which hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule according to (a) to (c); and g) a nucleic acid molecule encoding a hemoprotein which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions; h) nucleic acid molecule coding for a polypeptide containing an amino acid sequence according to the consensus sequence of the hemprotein sequences, SEQ ID NO 46 and / or 47, preferably SEQ ID NO 43 and / or 44, particularly preferably SEQ ID NO 43 and / or 45.
  • nucleic acid molecule which encodes a polypeptide with hemoprotein activity which under stringent conditions with a Nucleic acid molecule according to (a) to (c) hybridized; and g) a nucleic acid molecule encoding a hemoprotein which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions; h) Nucleic acid molecule coding for a polypeptide containing an amino acid sequence according to the consensus sequence of the hemprotein sequences, SEQ ID NO 46 and / or 47, preferably SEQ ID NO 43 and / or 44, particularly preferably SEQ ID NO 43 and / or 45 includes.
  • Nucleic acids means biopolymers of nucleotides which are linked together via phosphodiester bonds (polynucleotides, polynucleic acids) Depending on the type of sugar in the nucleotides (ribose or deoxyribose), a distinction is made between the two classes of ribonucleic acids (RNA) and deoxyribonucleic acids ( DNA).
  • RNA ribonucleic acids
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • transformed cells are produced by expression of a non-symbiotic hemoglobin, preferably plants having an increased ATP-ADP ratio.
  • Non-symbiotic hemoglobin belongs to the family of hemoglobin proteins whose function is reversible oxygen binding and supply. In contrast to leghemoglobin, it does not occur in the root nodules of legumes (legumes). You are u.a. involved in the detoxification of nitrite oxide and in the detection of oxygen availability.
  • cells transformed by expression of a leghemoglobin are produced, preferably plants having an increased ATP-ADP ratio.
  • Leghemoglobin belongs to the family of hemoglobin proteins whose function is reversible oxygen binding and supply. It comes from root nodules of legumes (legumes) and is an isolable red substance that resembles the vertebrate myoglobin. Due to the reversible binding of O2, leghemoglobin can ensure the high oxygen demand during nitrogen fixation by the nodule bacteria.
  • the apoprotein is formed by the plant cells and the hem by the bacteria (Source: CD Römpp Chemie Lexikon - Version 1.0, Stuttgart / New York: Georg Thieme Verlag 1995).
  • Expression in the present application means the transfer of genetic information starting from DNA or RNA into a gene product (polypeptide or protein, here leghemoglobin) and is also intended to include the term overexpression, by which is meant enhanced expression, such that the foreign protein or the naturally occurring protein is produced to a greater extent or makes up a large part of the total protein content of the host cell.
  • hemoproteins according to the invention is achieved by transformation of cells.
  • Transformation describes a process for introducing heterologous DNA into a pro- or eukaryotic cell. With a transformed cell, not only the product is the transformation process per se, but also all the transgenic ones
  • Transformation thus means the transfer of genetic information into an organism, in particular a plant. Including all known to those skilled opportunities for the introduction of information, z. As microinjection, electroporation, particle bombardment (particle bombardment), Agrobakterien or Che- mediated uptake (eg, polyethylene glycol-mediated DNA uptake or via the silicon carbonate fiber technique).
  • the genetic information can be z. B. as DNA, RNA, plasmid and otherwise introduced into the cells and incorporated either by recombination into the host genome, in free form or independently present as a plasmid.
  • the transformation can be carried out by means of vectors containing the abovementioned nucleic acid molecules, preferably vectors containing expression cassettes which contain the abovementioned nucleic acid molecules.
  • An expression cassette contains a nucleic acid sequence according to the invention operably linked to at least one genetic control element, such as a promoter, and advantageously to another control element, such as a terminator.
  • the nucleic acid sequence of the expression cassette may be, for example, a genomic or a complementary DNA sequence or an RNA sequence and semisynthetic or fully synthetic analogs thereof. These sequences may be linear or circular, extra-chromosomal or integrated into the genome.
  • nucleic acid sequences can be prepared synthetically or obtained naturally, or contain a mixture of synthetic and natural DNA components, as well as consist of different heterologous gene segments of different organisms.
  • the term "genetic control sequences" is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the production or the function of the expression cassette according to the invention. Genetic control sequences, for example, modify transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the expression cassettes according to the invention 5'-upstream of the respective transgene to be expressed nucleic acid sequence comprise a promoter with one of the specificity described above and 3'-downstream terminator sequence as an additional genetic control sequence, and optionally further conventional regulatory elements, respectively functionally linked to the transgenic nucleic acid sequence to be expressed.
  • homologs of the nucleic acid molecules of the invention are used.
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • SEQ ID NO: 1, 3, 5 functional equivalents of SEQ ID NO: 1, 3, 5 are used.
  • Inventive functional equivalents of SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and / or 31 derived by backtranslating an amino acid sequence having an identity of at least 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% or 66%, preferably at least 67%, 68%, 69%, 70% , 71%, 72% or 73%, preferably at least 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% or 80%, preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% , 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92% or 93%, more preferably at least 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% with SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and
  • SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and / or 31 are described by encodes an amino acid sequence having an identity with SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and / or 40 of at least 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% or 66% preferably at least 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% or 73%, preferably at least 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% or 80%, preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92% or 93% more preferably at least 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • “Functional equivalents” here describe nucleic acid sequences which hybridize under standard conditions with a nucleic acid sequence or parts of a nucleic acid sequence and are capable of effecting the expression of the hemoproteins in a cell or an organism.
  • oligonucleotides For hybridization, it is advantageous to use short oligonucleotides with a length of about 10-50 bp, preferably 15-40 bp, for example of the conserved or other regions which are known to the person skilled in the art via comparisons with other related genes. ter way can be determined used. However, it is also possible to use longer fragments of the nucleic acids according to the invention with a length of 100-500 bp or the complete sequences for the hybridization. Depending on the nucleic acid / oligonucleotide used, the length of the fragment or the complete sequence or whichever type of nucleic acid, ie DNA or RNA, are used for the hybridization, these standard conditions vary. For example, the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are about 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 x SSC and temperatures between approximately 2O 0 C to 65 0 C, preferably between about 3O 0 C to 45 0 C.
  • RNA hybrids the hybridization conditions are advantageous at 0.1 ⁇ SSC and temperatures between about 3O 0 C to 65 0 C, preferably between about 45 0 C to 55 0 C. These temperatures for the hybridization are exemplary calculated melting temperature values for a nucleic acid having a length of about 100 Nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are described in relevant textbooks of genetics, such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989, and can be determined by formulas known to those skilled in the art, for example, depending on the length of the nucleic acids that calculate type of hybrid or G + C content.
  • a functional equivalent is furthermore also understood as meaning nucleic acid sequences which are homologous or identical to a defined nucleic acid sequence ("original nucleic acid sequence") to a defined percentage and have the same activity of the original nucleic acid sequences, and in particular also natural or artificial ones Mutations of these nucleic acid sequences.
  • "Mutations" of nucleic acid or amino acid sequences include substitutions (substitutions), additions (additions), deletions (deletion), inversions (alterations) or insertions (insertions) of one or more nucleotide residues, whereby the corresponding amino acid sequence of the target protein is also expressed by subunits. institution, insertion or deletion of one or more amino acids, but overall the functional properties of the target protein are substantially retained.
  • nucleotide sequences are also included under the term of the functional equivalent by the present invention, which can be obtained by modification of the nucleic acid sequences SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and / or 31 receives.
  • modifications may be made by techniques known to those skilled in the art, such as Site Directed Mutagenesis, Error Prone PCR, DNA Shuffling (Nature 370, 1994, pp. 389-391) or Staggered Extension Process (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp. 258-261).
  • the aim of such a modification may e.g.
  • Proteins which are encoded via modified nucleic acid sequences must still have the desired functions despite deviating nucleic acid sequence.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. obtained by chemical synthesis, adapted to the codon use nucleic acid sequences or the amino acid sequences derived therefrom.
  • Nucleotide sequence is understood to mean all nucleotide sequences which (i) correspond exactly to the sequences shown; or (ii) at least one nucleotide sequence corresponding within the range of the degeneracy of the genetic code to the sequences shown; or (iii) at least one nucleotide sequence which hybridizes to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence (i) or (ii) and optionally (iiii) comprises functionally neutral sense mutations in (i).
  • the term "functionally neutral sense mutations” means the replacement of chemically similar amino acids, such. Glycine by alanine or serine by threonine.
  • modified forms are proteins in which there are changes in the sequence, for example at the N- and / or C-terminus of the polypeptide or in the region of conserved amino acids, but without the function of the protein. These changes can be made in the form of amino acid substitutions by known methods.
  • the coding regions (structural genes) preceding (5 " upstream or upstream) and / or subsequent (3 " or downstream) sequences are included.
  • this includes sequence regions with regulatory function. They can influence transcription, RNA stability or RNA processing as well as translation.
  • regulatory sequences include promoters, enhancers, operators, terminators or translation enhancers.
  • a further subject of the present invention is a nucleic acid molecule which codes for a polypeptide which comprises a polypeptide which is encoded by a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid molecule selected from the group consisting of a) nucleic acid molecule which encodes a polypeptide comprising those shown in SEQ ID NO 6 , 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and / or 40; b) nucleic acid molecule which comprises at least one polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID NO 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and / or 31; c) a nucleic acid molecule which encodes a polypeptide whose sequence has an identity of at least 40% to the sequences SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
  • nucleic acid molecule according to (a) to (c) which is suitable for a fragment of the sequences according to SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and / or 40 encoded; e) nucleic acid molecule which is obtained by amplifying a nucleic acid molecule from a cDNA database or from a genome database using the primers according to Sequence Nos.
  • nucleic acid molecule which encodes a polypeptide with hemoprotein activity which under stringent conditions with a Nucleic acid molecule according to (a) to (c) hybridized; and g) a nucleic acid molecule encoding a hemoprotein which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions; h) nucleic acid molecule coding for a polypeptide containing an amino acid sequence according to the consensus sequence of the hemprotein sequences, SEQ ID NO 46 and / or 47, preferably SEQ ID NO 43 and / or 44, particularly preferably SEQ ID NO 43 and / or 45.
  • a further subject of the present invention is a polypeptide which is encoded by a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid molecule selected from the group consisting of a) nucleic acid molecule which encodes a polypeptide comprising in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16 , 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and / or 40; b) nucleic acid molecule which comprises at least one polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID NO 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and / or 31; c) a nucleic acid molecule which encodes a polypeptide whose sequence has an identity of at least 40% to the sequences SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39 and / or 40; d) Nucleic acid molecule according to (a) to (c) which is suitable for a fragment of the sequences according to S
  • nucleic acid molecule which is obtained by amplifying a nucleic acid molecule from a cDNA database or from a genome database using the primers according to Sequence Nos. 41 and 42 f) nucleic acid molecule which encodes a polypeptide with hemoprotein activity which under stringent conditions with a Nucleic acid molecule according to (a) to (c) hybridized; and g) a nucleic acid molecule encoding a hemoprotein which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions; h) Nucleic acid molecule coding for a polypeptide containing an amino acid sequence according to the consensus sequence of the hemprotein sequences, SEQ ID NO 46 and / or 47, preferably SEQ ID NO 46 and
  • the subject of the present invention is a nucleic acid molecule which codes for a polypeptide which comprises a polypeptide which is encoded by a nucleic acid molecule which differs in one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten or more nucleic acids of a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid molecule selected from the group consisting of a) nucleic acid molecule which encodes a polypeptide comprising those shown in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 , 39 and / or 40 shown sequence; b) nucleic acid molecule which comprises at least one polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID NO 1, 3 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and / or 31; c) a nucleic acid molecule which encodes a polypeptide whose sequence has an identity of at least 40% to the sequences SEQ ID NO 2,
  • nucleic acid molecule which encodes a polypeptide with hemoprotein activity which under stringent conditions with a Nucleic acid molecule according to (a) to (c) hybridized; and g) a nucleic acid molecule encoding a hemoprotein which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions; h) Nucleic acid molecule coding for a polypeptide containing an amino acid sequence according to the consensus sequence of the hemprotein sequences, SEQ ID NO 46 and / or 47, preferably SEQ ID NO 43 and / or 44, particularly preferably SEQ ID NO 43 and / or 45 comprises; and encodes a polypeptide having a hemoprotein activity.
  • the present invention is a polypeptide activity of a Hemproteins which is encoded by a nucleic acid molecule which differs in one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten or more nucleic acids from a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid molecule selected from the group consisting of a) a nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising those shown in SEQ ID Nos.
  • nucleic acid molecule which comprises at least one polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID NO 1, 3 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and / or 31; c) a nucleic acid molecule which encodes a polypeptide whose sequence has an identity of at least 40% to the sequences SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39 and / or 40; d) Nucleic acid molecule according to (a) to (c) which is suitable for a fragment of the sequences according to SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and / or 40 encoded; e) Nucleic acid molecule obtained by mixing a nucleic acid molecule from a cDNA
  • Sequence Nos. 41 and 42 amplifies f) a nucleic acid molecule encoding a polypeptide having hemoprotein activity which hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule according to (a) to (c); and g) a nucleic acid molecule encoding a hemoprotein which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions; h) nucleic acid molecule coding for a polypeptide containing an amino acid sequence according to the consensus sequence of the hemprotein sequences, SEQ ID NO 46 and / or 47, preferably SEQ ID NO 43 and / or 44, particularly preferably SEQ ID NO 43 and / or 45; and encodes a polypeptide having a hemoprotein activity.
  • Another object of the present invention is a DNA expression cassette containing a nucleic acid sequence as described above.
  • Another object of the present invention is a vector containing an expression cassette containing a nucleic acid sequence as described above.
  • the present invention furthermore relates to a cell according to the invention, preferably a monocotyledonous organism or a dicotyledonous organism having an increased activity of at least one hemoprotein based on the expression of a nucleic acid sequence as described above.
  • An object of the present invention is further a cell prepared by the method according to the invention.
  • the oil content in the cells increased.
  • the oil content is the total fatty acid content in the cells according to the invention.
  • Oil includes in the. Meaning of the invention neutral and / or polar lipids and mixtures thereof. By way of example but not by way of limitation, those listed in Table 1 should be mentioned.
  • Neutral lipids preferably means triacylglycerides. Both neutral and polar lipids can contain a wide range of different fatty acids. By way of example, but not by way of limitation, the fatty acids listed in Table 2 should be mentioned.
  • the content of unsaturated fatty acids is increased, in particular to linolenic acid.
  • the total content of proteins is not or only slightly reduced. That is, the total content of fatty acids, expressed in mass to mass dry weight, is significantly increased over that of the wild-type.
  • the increase of the ATP-ADP ratio ie the increase of the energy status by storage of the energy in ATP, remains constant in cells which show an increased activity of hemproteins due to the method according to the invention. This means, the ATP-ADP ratio of the cells is not affected by a change in the external conditions.
  • external conditions are defined as the culture conditions for cells, tissues, organs, microorganisms or plants. This can z. For example, composition of the medium, temperature, composition of the atmosphere or other factors influencing the wild-type.
  • the ATP-ADP ratio of the cells with increased hemoprotein activity according to the invention when lowering the oxygen concentration in the surrounding atmosphere to 4% is at least 200%, 300%, preferably 400%, particularly preferably at least 500% or more related to the ATP-ADP ratio of the wild-type.
  • the lactam content formed under these anaerobic culture conditions is at most 80%, preferably 75%, 70%, more preferably 65%, 60%, 55%, 50% or less, based on the amount of wild-type lactate.
  • the change in the hemoprotein activity, the increased ATP-ADP ratio, the increased oil content and / or the reduced amount of lats is a stable feature of the cells of the invention which persists over several generations, preferably up to T2 , especially preferred for T3 generation.
  • the cells according to the invention are plant cells, organs, parts of plants or whole plants.
  • Plant in the context of the invention means all dicotyledonous or monocyledonous plants.
  • Plants in the context of the invention are plant cells, tissues, organs or whole plants such as seeds, tubers, flowers, pollen, fruits, seedlings, roots, leaves, stems or other parts of plants to understand.
  • plant propagation material such as seeds, fruits, seedlings, cuttings, tubers, cuts or rhizomes to understand.
  • plants are also the mature plants, seeds, shoots and seedlings, as well as derived parts, propagation material, plant organs, tissues, protoplasts, callus and other cultures, for example cell cultures, as well as all other types of groupings of Plant cells to functional or structural units.
  • Mature plants means plants at any stage of development beyond the seedling. Keimling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • Plant also includes annual and perennial dicotyledonous or monocotyledonous plants and includes, by way of example but not limitation, those of the genera Bromus, Asparagus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Tritiumum, Sorghum and Saccharum one.
  • the method is applied to monocotyledonous plants, for example from the family Poaceae, more preferably to the genera Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, and Saccharum, most preferably to plants of agricultural importance , such as Hordeum vulgare (barley), Triticum aestivum (wheat), Triticum aestivum subsp.spelta (spelled), triticale, Avena sative (oats), sea ale cereale (rye), sorghum bicolor (millet), Zea mays (corn), Saccha rum officinarum (sugarcane) or Oryza sative (rice) applied.
  • the family Poaceae more preferably to the genera Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, and Saccharum, most preferably to plants of agricultural importance , such as Hordeum vulgare (barley), Triticum a
  • Preferred monocotyledonous plants are in particular selected from monocotyledonous crops, such as, for example, the family of Gramineae such as rice, maize, wheat or other cereals such as barley, millet, rye, triticale or oats, as well as sugarcane and all types of grasses.
  • the family of Gramineae such as rice, maize, wheat and barley.
  • a transformed plant according to the invention is thus a genetically modified plant.
  • all plants are suitable for carrying out the method according to the invention.
  • Preference is given to potatoes, Arabidopsis thaliana, rapeseed, soybeans, peanuts, corn, manioc, purging nut, yams, rice, sunflower, rye, barley, hops, oats, hard and common wheat, lupins, peas, clover, beets, cabbage, vines, etc. as they are z.
  • Preferred dicotyledonous plants are in particular selected from the dicotyledonous crop plants, such as, for example
  • Cruciferae especially the genus Brassica, in particular the species napus (rapeseed), campestris (turnip), oleracea cv Tastie (cabbage), oleracea cv Snowball Y (cauliflower) and oleracea cv Emperor (broccoli) and other types of cabbage; and the genus Arabidopsis, especially the species thaliana and cress or canola,
  • Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini
  • Leguminosae especially the genus Glycine, especially the species Glycine max (soybean) as well as alfalfa, pea, bean plants or peanut.
  • Rubiaceae preferably of the subclass Lamiidae such as Coffea arabica or Coffea liberica (coffee shrub),
  • Solanaceae especially the genus Lycopersicon, especially the species esculentum (tomato) and the genus Solanum, especially the species tuberosum (potato) and melongena (eggplant) and tobacco or paprika,
  • Sterculiaceae preferably of the subclass Dilleniidae such as Theobroma cacao (cocoa bush),
  • Theaceae preferably of the subclass Dilleniidae such as Camellia sinensis or Thea sinensis (tea shrub),
  • angiosperms such as Hepaticae (liverwort) and Musci (Moose); Pteridophytes such as ferns, horsetail and lycopene; Gymnosperms such as Conifers, Cycads, Ginkgo and Gnetalen, the Rosaceae families such as Rose, Ericaceae such as Rhododendrons and Azaleas, Euphorbiaceae such as Poinsettias and Cronoton, Caryophyllaceae such as Cloves, Solanaceae such as Petunia, Gesneriaceae such as African Violet, Balsaminaceae such as the Springwort Orchidaceae such as orchids, iridaceae such as gladioli, iris, freesia and crocus, compositae such as calendula,
  • Oil plants ie plants that already naturally have a high oil content and / or are used for industrial extraction of oils. These plants may have a high oil content and / or a particular, industrially interesting fatty acid composition. Preference is given to plants which have a lipid content of at least 1% by weight.
  • Oil plants include, by way of example: Bovago oficinalis (borage); Brassica species such as B. campestris, B. napus, B.
  • rapa (mustard or rapeseed); Cannabis sativa (hemp); Curthamus tinctorius (Dyer's Thistle); Cocos nucifera (coconut); Crambe abyssinica (Krambe); Cuphea species (Cuphea species provide fatty acids of medium chain length, especially for industrial applications); Elaeis guinensis (African oil palm); Ekeis oleiferu (American oil palm); Glycine max (soybean); Gossypium hirisfum (American cotton); Gossypium barbadense (Egyptian cotton); Gossypium herbaceous (Asian Cotton Cotton); Helianthus annus (sunflower); Jatropha curcas (purging nut or vomit nut); Linum usitatissimum (flax or flax); Oenethera biennis (Evening primrose); Ozea europea (olive); Oryza sativa (Rice);
  • leghemoglobins or naturally non-symbiotic hemoglobins or alteration of the plants is such that they are natural overexpressing leghemoglobin or non-symbiotic hemoglobin.
  • leghemoglobin selected from the group consisting of leghemoglobin from the plants Lupinus luteus (LGB1_LUPLU, LGB2_LUPLU), Glycine max (LGBA_SOYBN, LGB2_SOYBN, LGB3_SOYBN), Medicago sativa (LGB1-4_MEDSA), Medicago trunculata (LGB1_MEDTR ), Phaseolus vulgaris (LGB1_PHAVU, LGB2_PHAVU), Vicia faba
  • the abovementioned plants are a non-symbiotic hemoglobin selected from the group consisting of hemoglobin from the plants Arabidopsis thalina (AT_AHB2), Brassica napus (BN_AHB2), Linum usitatissimum (LU_AHB2), Glycine max (GM_AHB2), Helianthus annus (HA_AHB2), Triticum aestivum (TA_AHB2), Hordeum vulgaris (HV_AHB2), Oryza sativa (OS_AHB2) and Zea mays (ZM_AHB2).
  • AZA_AHB2 Arabidopsis thalina
  • BN_AHB2 Brassica napus
  • L_AHB2 Linum usitatissimum
  • Glycine max Glycine max
  • HA_AHB2 Helianthus annus
  • TA_AHB2 Triticum aestivum
  • HV_AHB2 Hordeum vulgaris
  • plants which have the sequence no. 1 (AT-AHB2) coding for non-symbiotic hemoglobin.
  • plants expressing the Hemprotein memory organ specifically are plants expressing the Hemprotein memory organ specifically.
  • the hemprotein is expressed in a tuber-specific or seed-specific manner.
  • tuber-producing plants in particular potato plants or seed-producing plants, in particular Arabidopsis thaliana or oilseed rape.
  • the tissue-specific expression can, for. B. be achieved by using a tissue-specific promoter.
  • a tissue-specific expression is known, for example, from US Pat. No. 6,372,961 B1, column 11, lines 44 ff.
  • the present invention relates to the use of the above-described nucleic acid molecules coding for polypeptides with the activity of hemoproteins for the production of cell, tissue, organ, microorganism or plant with increased ATP-ADP ratio and / or altered oil content, preferably increased fatty acid content, preferably increased linolenic acid content
  • the invention will be described by way of example with reference to the following experiments.
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the carried out in the context of the present invention cloning steps such.
  • B. restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking DNA fragments, transformation of E. coli cells, growth of bacteria, propagation of phages and sequence analysis of recombinant DNA are as in Sambrook et al , (1989) CoId Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 described.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules is carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5 547).
  • the isolated Arabidopsis cDNA was used in a PCR reaction with the oligonucleotide primers AHb2f and AHb2r.
  • PC R preparations were then separated by agarose gel electrophoresis and the amplified DNA fragments of AHB2 were excised from the gel and purified with Qiagen's gel gelification kit according to the manufacturer's instructions and eluted with 50 ⁇ l elution buffer.
  • the DNA fragments were cloned into the pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions, resulting in the vector pCR2.1-AHB2 and the sequence was checked by sequencing.
  • the coding sequences for AHB2 were cloned into a binary plant vector, such as pBIN, behind the seed-specific USP promoter (Bäumein et al. (1991) Mol Gen Genet 225 (3): 459-467).
  • a binary plant vector such as pBIN
  • the vector pCR2.1-AHB2 was digested with the restriction enzymes Kpnl and BamHI.
  • the resulting DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis and the AHB coding fragments were excised from the gel and purified with the. Gelpurification'Kit from Qiagen according to the manufacturer and eluted with 50 .mu.L elution buffer.
  • the Agrobacterium -mediated plant transformation can be carried out, for example, using the Agrobacterium tumefaciens strains GV3101 (pMP90) (Koncz and Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383-396) or LBA4404 (Clontech).
  • the transformation can be performed by standard transformation techniques (Deblaere et al., (1984) Nucl Acids Res 13: 4777-4788).
  • the Agrobacterium -mediated transformation of Arabidopsis thaliana was carried out using standard transformation and regeneration techniques (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2nd ed., Dordrecht: Kluwer Academic Publ. 1995, in Sect, Ringbuc Central Signature: BT1 1-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 p., ISBN 0-8493-5164-2).
  • Plant selection depends on the binary vector and Agrobacterium strain used for the transformation.
  • the selection of AHB2-transformed Arabidopsis thaliana plants was carried out with hygormycin.
  • the Agrobacterium -mediated transformation of oilseed rape can e.g. By cotyledon or hypocotyl transformation (Moloney et al., Plant Cell Report 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701).
  • the use of antibiotics for Agrobacterium and plant selection depends on the binary vector and Agrobacterium strain used for the transformation.
  • the Agrobacterium-mediated gene transfer in flax can be determined using, for example, one of Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285.
  • Transformation of soy may be accomplished using, for example, a technique described in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) or in EP-A-0 039 7 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo).
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the gene is the performance of a Northern blot as set forth below (for reference, see Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, or the example part above), wherein a primer designed to bind to the gene of interest is labeled with a detectable label (usually radioactive or chemiluminescent), such that when the total RNA of a culture of the organism is extracted, separated on a gel, transferred to a stable matrix and incubated with this probe, the binding and extent of binding of the probe is the presence as well as the amount of mRNA for this Gene indicates. This information indicates the degree of transcription of the transformed gene.
  • Total cellular RNA may be prepared from cells, tissues or organs by a variety of methods, all known in the art, such as that described by Bormann, E.R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • RNA hybridization total RNA was extracted from maturing seeds using the Concert RNA Plant Reagent (Invitrogen GmbH, Düsseldorf, Germany). 20 ⁇ g total RNA or 1 ⁇ g poly (A) + RNA was separated by gel electrophoresis in 1.25% strength agarose gels using formaldehyde as described in Amasino (1986, Anal. Biochem.
  • Standard techniques such as western blotting, can be used to study the presence or relative amount of protein translated from this mRNA (see, for example, Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).
  • the total cellular proteins are extracted, separated by gel electrophoresis, transferred to a matrix such as nitrocellulose, and incubated with a probe such as an antibody that specifically binds to the desired protein.
  • This probe is usually provided with a chemiluminescent or colorimetric label which is easily detected. The presence and amount of label observed indicates the presence and amount of the desired protein present in the cell.
  • Figure 1 shows the results of the Northern blot of 3 independent transgenic Arabidopsis lines transformed with the AHB2 construct as well as the
  • Example 6 Analysis of the effect of the recombinant proteins on the production of the desired product
  • the effect of genetic modification in plants or on the production of a desired compound can be determined by culturing the modified plant under appropriate conditions (such as those described above) and increasing the medium and / or cellular components Production of the desired product (ie of lipids or a fatty acid) is examined.
  • a desired compound such as a fatty acid
  • These analytical techniques are well known to those skilled in the art and include spectroscopy, thin layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods, and analytical
  • FAME fatty acid methyl ester
  • GC-MS gas-liquid chromatography-mass spectrometry
  • TAG triacylglycerol
  • TLC thin-layer chromatography
  • the unambiguous evidence for the presence of fatty acid products can be obtained by analysis of recombinant organisms by standard analytical methods: GC, GC-MS or TLC as variously described by Christie and the references therein (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Fourth Edition. Christie, Oliver Press, Dundee, 1 19-169, 1998, Gas Chromatography Mass Spectrometry Method, Lipids 33: 343-353).
  • the material to be analyzed may be broken up by sonication, milling in the glass mill, liquid nitrogen and milling or other applicable methods.
  • the material must be centrifuged after rupture.
  • the sediment is distilled in aqua. re-suspended, heated at 100 ° C for 10 min, cooled on ice and recentrifuged, followed by extraction into 0.5 M sulfuric acid in methanol with 2% dimethoxypropane for 1 h at 90 ° C resulting in hydrolyzed oil and lipid compounds. which give transmethylated lipids.
  • These fatty acid methyl esters are extracted in petroleum ether and finally added to a GC.
  • Plant material is first mechanically homogenized by mortars to make it more accessible to extraction.
  • the extraction of the lipids from seeds is carried out according to the method of Bligh & Dyer (1959) Can J Biochem Physiol 37:91 1.
  • 5 mg Arabidopsis Brassica seeds are weighed in 1.2 ml Qiagen microtubes (Qiagen, Hilden) on a Sartorius (Göttingen) microbalance.
  • the seed material is homogenized with 1 ml of chloroform / methanol (1: 1, Sigma's mono-C15-glycerin as internal standard) in the Röschmühle MM300 from Retsch (Haan) and incubated for 20 min at RT.
  • the supernatant was transferred to a new vessel and the sediment extracted again with 1 ml of chloroform / methanol (1: 1). The supernatants were combined and concentrated to dryness.
  • the derivatization of the fatty acid was carried out by acid methanolysis. For this purpose, the extracted lipids were treated with 0.5 M sulfuric acid in methanol and 2% (v / v) dimethoxypropane and for 60 min. incubated at 80 ° C. This was followed by extracting twice with petroleum ether, followed by washing steps with 100 mM sodium bicarbonate and water. The fatty acid methyl esters thus prepared were concentrated to dryness and taken up in a defined volume of petroleum ether.
  • the quantification of the oil was carried out by comparing the signal strengths of the derivatized fatty acids with those of the internal standard mono-C15-glycerol (Sigma).
  • the determination of the fatty acid profile was made by relative comparison of the signal strengths to each other.
  • the unsaturation / saturation index (USI) was determined as described in Gutierrez et al. ((2005) Food Chemistry 90, 341-346) and reflects the ratio of unsaturated to saturated fatty acids in the Seed oil.
  • Table 3 Oil content (total fatty acid content) in mature and maturing (13-14 DAF) seeds of transgenic Arabidopsis lines transformed with the USP AHB2 construct and in mature and ripening (13-14 DAF) seeds of untransformed wild-type plants. In mature seeds, the oil content was determined over three consecutive generations. The listed values correspond to mean values and standard errors from 6 independent measurements. Significant changes to the wild-type (based on the statistical t-test analysis, p ⁇ 0.05) are highlighted by asterisks ( * ).
  • Table 3 shows, almost by way of example, the course of the oil pastes in mature seeds of 3 independent transgenic Arabidopsis lines over 3 generations transformed with the construct USP-AHB2 and the untransformed wild-type plants.
  • the values correspond to the mean values from 6 independent measurements. The standard errors are also indicated.
  • Significant changes to the wild type are highlighted by asterisks ( * ).
  • In all 3 generations could in the mature seeds of the transgenic Lines are shown a significant increase in oil content. The phenotype achieved is accordingly stable over several generations.
  • a significantly higher oil content in the transgenic lines was also found in maturing T3 seeds during the oil storage phase (see Table 1).
  • Figure 2 shows, by way of example, the results for the quantitative determination of the oil and protein contents in T3 seeds of 3 independent transgenic Arabidopsis lines (9, 10, 11) which had been transformed with the construct USP-AHB2 and in the seeds of the untransformed wild-type Plants.
  • the values correspond to the mean values from 10 independent measurements. The standard errors are also indicated.
  • Significant changes to the wild type are highlighted by asterisks ( * ).
  • asterisks * a significant increase in oil content by 15% (line 9), 31% line (line 10) and 40% (line 1 1).
  • the different oil increases in the different lines correlate with the expression levels shown in Figure 2.
  • overexpression of AHB2 has no effect on the oil content
  • FIG. 3 shows, by way of example, the results of the qualitative oil analysis in the mature seeds of transgenic Arabidopsis lines which had been transformed with the construct USP-AHB2 and in the seeds of the untransformed wild-type plants (A. linoleic acid content, B. linolenic acid content , C. linoleic acid / linolenic acid ratio and D. USI (unsaturation / saturation index)). The values correspond to the mean and standard errors from 10 independent measurements. Significant changes to the wild type (based on the statistical t-test analysis) are highlighted by asterisks ( * ).
  • Semen-specific overexpression of AHB2 in seed oil leads to a significant increase of alpha-linolenic acid (C18: 3) from 25% in the wild-type plant to more than 30% in transgenic lines 10 and 11.
  • the content of linoleic acid (C18: 2) precursor of C18 : 3 is unchanged. This is also reflected in the ratio of C18: 3 to C18: 2 (0.8 in the seed oil of the wild-type plants and> 1 in the seed oil of the transgenic plants.)
  • Overexpression of AHB2 consequently leads to an increased de-saturation of the fatty acids in the Seeds of the transgenic lines are also reproduced by the USI, which increases from 9 in the wild-type seeds up to 12 in the transgenic seeds.
  • Example 7 Determination of the ATD / ADP ratio and the lactic acid content.
  • the plants were grown in a greenhouse (21 ° C / day and 17 ° C / night, 50% humidity day and night, photoperiod 16 h day / 8 h night, night intensity 180 ⁇ mol photons n ⁇ 2 s "1 )
  • puffed stems were packed in a transparent plastic bag in the air with an oxygen content of 21% and 4% (v / v
  • the air mixtures from Messer Griesheim GmbH (Magdeburg, Germany) contained 350 ppm CO2, oxygen concentrations as indicated above and nitrogen After 2 hours, the pods were harvested and flash frozen immediately in liquid nitrogen Seeds were lyophilized from 13-14 days old Prepared pods as described in Gibon et al. (2002) Plant J 30: 221-235.
  • Figure 4 shows the effect of seed specific expression of AHB2 on the ATP / ADP ratio (A) and lactic acid content (B) in ripening seeds cultured under normal (21%) oxygen conditions or under hyoxic conditions (4%). The results correspond to mean and standard errors from 6 independent measurements. Significant changes to the wild type (based on the statistical t-test analysis) are highlighted by asterisks ( * ).
  • the seed-specific overexpression of AHB2 leads to a 2-4-fold higher ATP to ADP ratio in the seeds of the transgenic lines (4-8) than in the wild-type seeds under natural oxygen concentrations in the environment (2). This indicates an improved energy supply through the respiratory chain in the transgenic seeds even under the low oxygen concentrations within the seed.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Veränderung des ATP/ADP-Verhältnisses in einer Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder Pflanze durch Änderung der Hemprotein Aktivität in der Zelle sowie dessen Verwendung.

Description

Verfahren zur Veränderung des ATP-ADP-Verhältnisses in Zellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Veränderung des ATP/ADP-Verhältnisses in einer Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder Pflanze durch Änderung der Hemprotein Aktivität in der Zelle sowie dessen Verwendung.
Adenosintriphosphat (ATP) wird sowohl im Prozeß der Photosynthese als auch bei der Atmung aus ADP (Adenosindiphosphat) und energiereichen Phosphatsbindungen gebildet. Dabei handelt es sich um endergonische Reaktionen. Das energiereiche ATP wird mittels ATPasen hydrolisiert, wobei Energie frei wird. Da die meisten Prozesse in der Zelle endergonisch verlaufen werden sie erst durch die Kopplung mit einer zweiten exergonischen Reaktion möglich, bei der es sich in den meisten Fällen die Hydrolyse von ATP handelt.
Die Hydrolyse von ATP zu ADP dient dabei als treibende Kraft bei vielen biochemischen Prozessen wie z. B. aktiver Transport durch Membranen, Biosynthese von Lipi- den, Proteinen, Kohlenhydraten oder Nukleinsäuren.
Somit ist ATP in der Zelle ein Energieüberträger der die Energie für letztendlich jede Aktivität der Zelle oder des Organismus liefert . Jeder Organismus verwendet somit ATP als primäre Energiequelle. Dadurch kommt ATP eine Schlüsselrolle in den Stoffwechsel der Zelle zu. ATP hat aber andererseits eine sehr kurze Halbwertszeit ("Lebensdauer") und deshalb praktisch keine Speicherkapazität.
Das ATP-ADP-Verhältnis ist ein wichtiger Parameter des Energiemetabolismus. Ein hohes ATP-ADP-Verhältnis bedeutet einen Energieüberschuß. Bei Energiemangel in der Zelle verbrauchen sich die intrazellulären ATP Reserven und das ATP-ADP- Verhältnis wird in Richtung ADP verschoben.
Die Expression von Hemoglobin oder verwandter Proteine ist aus dem Stand der Technik bekannt.
Aus dem US Patent 6,372,961 ist die Expression von Genen kodieren für Hemoglobin bekannt, wodurch der Sauerstoff Metabolismus in Pflanzen erhöht wird. Dieser erhöhte Sauerstoff oder ATP Gehalt kann die Biosynthese in den Pflanzen beeinflussen.
Aus der WO 98/12913 ist ein Verfahren zur Erhöhung der Sauerstoff-Assimilation bekannt welches auf Expression von Hemoglobin - Proteinen basiert. Ferner wird in dieser Druckschrift offenbart, daß eine Erhöhung der Produktion von Sekundärmetaboliten auf einer gleichzeitigen Erhöhung der ATP-Konzentration zurückgeführt werden kann. Des weiteren ist aus der WO 00/00597 bekannt, daß die Expression von nichtsymbioti- schen Hemoglobin in Zellen zu einer Erhöhung des ATP - Gehalts führt. Die Expression von Hemoglobin und Verwandtenproteinen wurde gemäß WO 99/02687 A eingesetzt um den Eisengehalt in Zellen zu erhöhen.
In der WO 2004/057946 A wird durch die Expression von Leghemoglobin ein höherer Ertrag von Stärke und Öl in Pflanzen erreicht.
Aus der Druckschrift WO 2004/087755 ist ein Verfahren bekannt zur Erhöhung der Streßresistenz von Pflanzen und der daraus gewonnenen Ausbeute beruhend auf der Expression von pflanzlichen der Klasse zwei.
Die Expression von Leghemoglobin in Pflanzenzellen ist ferner aus Barata et al: (Plant Science; Vol.155; June 2000, 193-202) bekannt, worin die Sauerstoff-Verfügbarkeit untersucht wird.
Eine Erhöhung des ATP-ADP-Verhältnisses ist aus dem Stand der Technik nicht be- kannt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren bereitzustellen, durch welches der Zelle bzw. dem Organismus mehr ATP und somit mehr Energie zur Verfügung steht. Insbesondere sollte ATP auch als Energiespeicher genutzt werden, das heißt es soll eine Erhöhung des ATP-ADP-Verhältnisses erzielt werden. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es die so zur Verfügung gestellte Energie gezielt für die Synthese von Fettsäuren, insbesondere alpha-Linolensäure (eis, eis, cis-9,12,15-Octadecatriensäuere)
Diese Aufgaben werden dadurch gelöst, daß im erfindungsgemäßen Verfahren zur Veränderung des ATP-ADP-Verhältnisses in einer Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorga- nismus oder Pflanze die Aktivität mindestens eines Hemproteins verändert wird.
Überraschenderweise konnte festgestellt werden, daß durch die Veränderung der Aktivitäten mindestens eines Hemproteins Zellen, Organe, Gewebe, Mikroorganismen oder Pflanzen hergestellt werden, die ein erhöhtes ATP-ADP-Verhältnis aufweisen.
Unter dem ATP-ADP-Verhältnis ist das Verhältnis der Konzentration von ATP zu der Konzentration von ADP zu verstehen. Die Konzentrationen können mit den gängigen, dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt werden, z.B. mittels 31 -P-NMR- Spektroskopie in intrazellulärer Messung oder wie nachfolgend in den Beispielen beschrieben. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff Zelle: Zellen, Teile von Pflanzen wie Organe oder Gewebe so wie ganze Pflanzen und Mikroorganismen.
Hemproteine sind Proteine die in der Lage sind Sauerstoff über eine prosthetische Gruppe zu binden, wie zum Beispiel nichtsymbiontisches Hemoglobin, Myoglobin oder Leghemoglobin, bevorzugt Leghemoglobin und nichtsymbiontisches Hemoglobin, besonders bevorzugt Leghemoglobin.
"Aktivität eines Hemproteins", bedeutet die Fähigkeit des Polypeptids Sauerstoff an die prosthetische Gruppe (hem) zu binden. Darunter werden erfindungsgemäß Eisen-Il- Komplexe des Protoporphyrins verstanden. Eine Änderung der Aktivitäten eines Hemproteins in einer Zelle meint die Fähigkeit mehr oder weniger Sauerstoff in der Zelle zu binden im Vergleich zu Zellen des Wildtyps derselben Gattung und Art auf weiche die erfindunggemäßen Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Zellen etc.). Die Änderung, Erhöhung oder Erniedrigung, bevorzugt Erhöhung, im Vergleich zu dem Wildtyp beträgt dabei mindestens 1 %, 2%, 5%, 10 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 %, 95 % oder mehr. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung beträgt das ATP-ADP-Verhältnis mindestens 200%, bevorzugt 300%, besonders bevorzugt mindestens 400% oder mehr bezogen auf das ATP-ADP-Verhältnis des Wildtyps.
Der Vergleich wird bevorzugt unter analogen Bedingungen durch geführt. "Analoge Bedingungen" bedeutet, dass alle Rahmenbedingungen wie beispielsweise Kultur- o- der Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate, Kon- zentration etc.) zwischen den zu vergleichenden Versuchen identisch gehalten werden und die Ansätze sich allein durch die Aktivität von Hemproteinen unterscheiden.
Verändern bedeutet erfindungsgemäß eine de-novo-Einführung der Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids in eine Zelle, Gewebe , Organ, Mikroorganismus oder Pflanze oder eine Erniedrigung oder, bevorzugt, eine Erhöhung einer schon vorhande- nen Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration der Hemproteine erhöht.
Die Änderung der Aktivität eines Hemproteins kann durch eine Veränderung der Struktur der Proteine es zielt werden, durch Änderung der Stabilität der Hemproteine oder durch Änderung der Konzentration der Hemproteine in einer Zelle. Eine bevorzugte Variante der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet daß die Aktivitäten eines Hemproteins, bevorzugt eines nichtsymbiontischen Hemoglobins oder eines Leghemoglobins erhöht wird.
Besonders bevorzugt wird die Aktivität eines Polypeptids erhöht, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß
Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurense- quenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführung erfolgt die Erhöhung der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Hemproteins durch Expression, bevorzugt Überexpression im Vergleich zum Wildtyp wie oben beschrieben, mindestens eines Nukleinsäuremoleküls umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.
„Nukleinsäuren" meint Biopolymere aus Nukleotiden, die über Phosphodiesterbindun- gen miteinander verknüpft sind (Polynukleotide, Polynukleinsäuren). Je nach dem Zuckertyp in den Nukleotiden (Ribose oder Desoxyribose), unterscheidet man zwischen den beiden Klassen der Ribonukleinsäuren (RNA) und den Desoxyribonukleinsäuren (DNA).
Die Begriffe "Protein" und Polypeptid" sind gleichbedeutend und gegenseitig austauschbar im Sinne der vorliegenden Erfindung. In einer bevorzugen Ausführung der vorliegenden Erfindung werden durch Expression eines nichtsymbiontischen Hemoglobins transformierte Zellen, bevorzugt Pflanzen hergestellt, die ein erhöhtes ATP-ADP-Verhältnis aufweisen.
Nichtsymbiontsches Hemoglobin gehört zur Familie der Hemoglobin-Proteine, deren Funktion die reversible Sauerstoffbindung und Versorgung ist. Im Gegensatz zum Leg- hemoglobin kommt es nicht in den Wurzelknöllchen von Hülsenfrüchten (Leguminosen). Sie sind u.a. in die Detoxifizierung von Nitritoxid und in die Erkennung der Sauerstoffverfügbarkeit involviert.
In einer weiteren bevorzugten Ausfürung der vorliegenden Erfindung werden durch Ex- pression eines Leghemoglobins transformierte Zellen, bevorzugt Pflanzen hergestellt, die ein erhöhtes ATP-ADP-Verhältnis aufweisen.
Das Leghemoglobin gehört zur Familie der Hemoglobin-Proteine, deren Funktion die reversible Sauerstoffbindung und Versorgung ist. Es stammt aus Wurzelknöllchen von Hülsenfrüchten (Leguminosen) und ist eine isolierbare rote Substanz, die dem Myoglo- bin der Wirbeltiere ähnelt. Durch die reversible Bindung von O2 kann Leghemoglobin den hohen Sauerstoff-Bedarf bei der Stickstoff-Fixierung durch die Knöllchenbakterien gewährleisten. Das Apoprotein wird von den Pflanzenzellen und das hem von den Bakterien gebildet (Quelle: CD Römpp Chemie Lexikon - Version 1.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1995). Unter Expression wird in der vorliegenden Anmeldung die Übertragung einer genetischen Information ausgehend von DNA oder RNA in ein Genprodukt (Polypeptid oder Protein, hier Leghemoglobin) verstanden und soll auch den Begriff der Überexpression beinhalten, womit eine verstärkte Expression gemeint ist, so dass das Fremdprotein oder das natürlich vorkommende Protein verstärkt produziert werden oder einen gro- ßen Teil des gesamten Protein-Gehaltes der Wirtszelle ausmachen.
Die Expression der erfindungsgemäßen Hemproteine wird durch Transformation von Zellen erzielt.
"Transformation" beschreibt einen Prozess zur Einführung heterologer DNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle. Mit einer transformierten Zelle ist nicht nur das Produkt das Transformationsprozesses an sich beschrieben, sondern auch alle transgenen
Nachkommen des durch die Transformation hergestellten transgenen Organismus. Unter Transformation wird also die Übertragung einer genetischen Information in einen Organismus, insbesondere Pflanze verstanden. Darunter sollen alle dem Fachmann bekannten Möglichkeiten zur Einschleusung der Information fallen, z. B. Mikroinjektion, Elektroporation, Teilchenbeschuss (Partikelbombardement), Agrobakterien oder Che- mikalien vermittelte Aufnahme (z. B. Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme o- der über die Siliziumcarbonatfaser-Technik). Die genetische Information kann z. B. als DNA, RNA, Plasmid und auf sonstige Weise in die Zellen eingebracht und entweder durch Rekombination ins Wirtsgenom eingebaut, in freier Form oder unabhängig als Plasmid vorliegen.
Die Transformation kann mittels Vektoren enthaltend die obengenannten Nukleinsäu- remoleküle durchgeführt werden, bevorzugt Vektoren enthaltend Expressionskassetten welche die die oben genannten Nukleinsäure Moleküle beinhalten. Eine Expressionskassette enthält eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz funkti- onell verknüpft mit mindestens einem genetischen Kontrollelement, wie einem Promotor, sowie vorteilhaft mit einem weiteren Kontrollelement, wie einem Terminator. Die Nukleinsäuresequenz der Expressionskasette kann beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon sein. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulä- rer Form, extra-chromosomal oder integriert in das Genom vorliegen. Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukary- otischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressi- onskasset-ten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen Promotor mit einer der vorab beschriebenenen Spezifität und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle eingesetzt.
"Homologie" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, die durch Vergleich mit Hilfe des BESTFIT-Alignments (nach Needleman and Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48; 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10.000 Average Mismatch: -9.000
berechnet wird,
und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10.000 Average Mismatch: 0.000
Anstelle des Begriff "homolog" oder "Homologie" wird im Folgenden auch gleichbedeutend der Begriff "Identität" verwendet.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO: 1 , 3, 5, verwendet. Erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 werden durch Rückübersetzung einer Aminosäuresequenz abgeleitet, die eine Identität von mindestens 40%, 50%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65% oder 66% vorzugsweise mindestens 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist. Funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 werden durch eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine Identität mit der SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 von mindestens 40%, 50%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65% oder 66% vorzugsweise mindestens 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt min- destens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% o- der 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% aufweist.
"Funktionelle Äquivalente" beschreiben hier Nukleinsäuresequenzen, die unter Standardbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz oder Teilen einer Nukleinsäurese- quenz zu hybridisieren und befähigt sind, die Expression der Hemproteine in einer Zelle oder einem Organismus zu bewirken.
Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 10-50 bp, vorzugsweise 15-40 bp beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekann- ter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Länge von 100-500 bp oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure/Oligonukleotid, der Länge des Fragmentes oder der vollständi- ge Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart, d.h. DNA oder RNA, für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardhybridisierungsbbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 580C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedin- gungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 2O0C bis 650C, bevorzugt zwischen etwa 3O0C bis 450C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 3O0C bis 650C, bevorzugt zwischen etwa 450C bis 550C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, "Current Proto- cols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford Univer- sity Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Ap- proach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man weiterhin auch Nukleinsäurese- quenzen die mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz („ursprüngliche Nukleinsäure- sequenz) bis zu einem definierten Prozentsatz homolog bzw. identisch sind und die gleiche Aktivität der ursprünglichen Nukleinsäuresequenzen aufweisen, ferner insbe- sondere auch natürliche oder künstliche Mutationen dieser Nukleinsäuresequenzen. Entsprechende Definitionen finden sich an geeigneten Stellen der Beschreibung. "Mutationen" von Nuklein- oder Aminosäuresequenzen umfassen Substitutionen (=Ersetzungen), Additionen (Hinzufügung), Deletionen (Löschung), Inversion (Veränderungen) oder Insertionen (Einfügungen) eines oder mehrerer Nukleotidreste, wodurch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Sub- stitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann, wobei jedoch insgesamt die funktionellen Eigenschaften des Zielproteins im wesentlichen beibehalten werden.
Es werden weiterhin auch solche Nukleotidsequenzen unter den Begriffes des funktionellen Äquivalentes durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 erhält. Beispielhaft können solche Modifikationen durch dem Fachmann geläufige Techniken, wie "Site Directed Mutagenesis", "Error Prone PCR", "DNA-shuffling" (Nature 370, 1994, pp.389-391 ) oder "Staggered Extension Process" (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261 ) erzeugt werden. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung von DNA zur Verkürzung der Sequenz, der Austausch von Nukleotiden zur Codon-Optimierung oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über modifizierte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, müssen trotz abweichender Nukleinsäuresequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen.
Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch adaptierte Nukleinsäuresequenzen bzw. die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
Unter Nukleotidsequenz werden alle Nukleotidsequenzen verstanden, die (i) exakt den dargestellten Sequenzen entsprechen; oder (ii) mindestens eine Nukleotidsequenz um- faßen, die innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes den dargestellten Sequenzen entspricht; oder (iii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit einer zur Nukleotidsequenz (i) oder (ii) komplemetären Nukleotidsequenz hybridisiert, und gegebenenfalls (iiii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfasst. Dabei bedeutet der Begriff "funktionsneutrale Sinnmutationen" den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z. B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threonin.
Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Proteine zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Proteins zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach bekannten Methoden vorgenommen werden.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5" -oder upstream) und/oder nachfolgenden (3"-oder downstream) Se- quenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA Processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Teminatoren oder Translationsverstärker.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäuremolekül das für ein Polypeptid kodiert welches ein Polypeptid umfasst, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 um- fasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder
40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.
Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäuremolekül das für ein Polypeptid kodiert welches ein Polypeptid umfasst, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül das sich in ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehreren Nukleinsäuren unterscheidet von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; und für ein Polypeptid mit Aktivität eines Hemproteins kodiert.
Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid Aktivität eines Hemproteins, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül das sich in ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehreren Nukleinsäuren unterscheidet von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Se- quenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß
Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurense- quenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; und für ein Polypeptid mit Aktivität eines Hemproteins kodiert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz wie oben beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor enthaltend eine Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz wie oben beschrieben.
Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Zelle im Sinne der Erfindung, bevorzugt ein monokotyledoner Organismus oder ein dikotyledoner Organismus mit einer erhöhten Aktivität mindestens eines Hemproteins beruhend auf der Expression einer Nukleinsäuresequenz wie oben beschrieben.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Zelle hergestellt mit dem erfindunsgemäßen Verfahren.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird durch die Änderung der Aktivität eines Hemproteins, neben der Erhöhung des ATP-ADP-Verhältnisses, der Ölgehalt in den Zellen erhöht.
Als Ölgehalt wird der Gesamt- Fettsäuregehalt in den erfindungsgemäßen Zellen bezeichnet.
"Öl" umfasst im. Sinne der Erfindung neutrale und/oder polare Lipide und Mischungen derselben. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 1 aufgeführten zu nennen.
Tabelle 1 : Pflanzliche Lipidklassen
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Neutrale Lipide meint bevorzugt Triacylglyceride. Sowohl die neutralen als auch die polaren Lipide können ein breites Spektrum an verschiedenen Fettsäuren enthalten. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 2 aufgeführten Fettsäuren zu nennen.
Tabelle 2: Übersicht über verschiedene Fettsäuren (Auswahl)
1 Kettenlänge:Anzahl der Doppelbindungen * nicht natürlicherweise in Pflanzen vorkommend
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Für weitergehende Informationen wird ebenfalls auf das Römpp Chemie Lexikon - CD Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1999 verwiesen.
In einer bevorzugten Variante wird dabei der Gehalt an ungesättigten Fettsäuren er- höht, insbesondere an Linolensäure.
Durch die Erhöhung des Gesamtölgehalts der erfindungsgemäßen Zelle wird der Gesamtgehalt an Proteinen jedoch nicht oder nur kaum verringert. Das heißt, der Gesamtgehalt an Fettsäuren, ausgedrückt in Masse auf Masse Trockengewicht, ist gegenüber jenem des Wildtyps signifikant erhöht. Der Gesamtgehalt an Proteinen im Vergleich zum jenem des Wildtyps, ebenfalls in Masse auf Masse Trockengewicht ausgedrückt, bleibt jedoch konstant oder wird minimal verringert. Die Verringerung ist prozentuell, bezogen auf den Wildtyp, kleiner als die Erhöhung des Ölgehalts.
Die Erhöhung des ATP-ADP-Verhältnis, also die Erhöhung des Energiestatus durch Speicherung der Energie in ATP, bleibt bei Zellen die aufgrund des erfindungsgemä- ßen Verfahrens eine erhöhte Aktivität von Hemproteinen zeigen, konstant. Das heißt, das ATP-ADP-Verhältnis der Zellen wird durch eine Veränderung der Außenbedingungen nicht beeinflußt.
Unter Außenbedingungen versteht man im Sinne der Erfindung die Kulturbedingungen für Zellen, Gewebe, Organe, Mikroorganismen oder Pflanzen. Dies können z. B. Medi- umszusammensetzung, Temperatur, Zusammensetzung der Atmosphäre oder andere, den Wildtyp beeinflussenden Faktoren sein.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung beträgt das ATP-ADP-Verhältnis der Zellen mit erfindungsgemäßen erhöhter Aktivität von Hämoproteins bei einer Absenkung der Sauerstoffkonzentration in der umgebenden Atmosphäre auf 4% mindestens 200 %, 300 %, bevorzugt 400%, besonders bevorzugt mindestens 500% oder mehr bezogen auf das ATP-ADP-Verhältnis des Wildtyps.
Zusätzlich beträgt die unter diesen anaeroben Kulturbedingungen gebildete Lactamen- ge maximal 80%, bevorzugt 75%, 70%, besonders bevorzugt 65%, 60%, 55%, 50% oder weniger bezogen auf die Lactatmenge des Wildtyps. In einer weiteren Ausführung der Erfindung ist die Veränderung der Hemprotein - Aktivität, das erhöhte ATP-ADP-Verhältnis, der erhöhte Ölgehalt und/oder die verringerte Latatmenge ein stabiles Merkmal der erfindungsgemäßen Zellen, welches über mehrere Generationen erhalten bleibt, bevorzugt bis zu der T2, besonders bevorzugt zur T3- Generation.
In einer bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Zellen Pflanzenzellen, Organe, Teile von Pflanzen oder ganze Pflanzen.
"Pflanzen" im Rahmen der Erfindung meint alle dicotyledonen oder monokyledonen Pflanzen. "Pflanzen" im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen, -gewebe, -organe o- der ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsmaterial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte o- der Wurzelstöcke zu verstehen.
Eingeschlossen unter dem Begriff "Pflanzen" sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenor- gane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. "Pflanze" umfaßt auch einjährige und mehrjährige dicotyledone oder monokotyledone Pflanzen und schließt, beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, solche der Gattungen, Bromus, Asparagus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triti- cum, Sorghum und Saccharum ein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren auf monokotyle Pflanzen, beispielsweise aus der Familie der Poaceae, besonders bevorzugt auf die Gattungen Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, und Saccharum, ganz besonders bevorzugt auf Pflanzen mit landwirtschaftlicher Bedeu-tung, wie z.B. Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccha-rum officinarum (Zuckerrohr) oder Oryza sative (Reis) angewendet.
Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern. Besonders bevorzugt aus der Familie der Gramineae sind Reis, Mais, Weizen und Gerste.
Eine transformierte Pflanze im Sinne der Erfindung ist also eine gentechnisch veränderte Pflanze.
Erfindungsgemäß eignen sich alle Pflanzen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bevorzugt werden Kartoffeln, Arabidopsis thaliana, Raps, Sojabohnen, Erdnüsse, Mais, Maniok, Purgiernuss, Yams, Reis, Sonnenblumen, Roggen, Gerste, Hopfen, Hafer, Hart und Weichweizen, Lupinen, Erbsen, Klee, Rüben, Kohl, Reben usw. wie sie z. B. aus der Verordnung über das Artenverzeichnis zum Saatgutver- kehrsgesetz (Blatt für PMZ 1986 S. 3, zuletzt geändert Blatt für PMZ 2002 S. 68) entnehmbar sind, eingesetzt.
1. Bevorzugte dikotyledone Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den diko- tylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula,
- Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa
(Salat),
Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola,
Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,
Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art Glycine max (Sojabohne) sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss.
Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea ara- bica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch),
Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika,
Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch),
Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch),
- Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota
(Karrotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Seiarie)) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer),
sowie Lein, Soja, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi.
Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moo- se); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Erica- ceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kro- ton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Gera- niaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr. Besonders interessant ist der Einsatz von Ölpflanzen, d.h. Pflanzen, die bereits natürlicherweise einen hohen Ölgehalt aufweisen und/oder zu industriellen Gewinnung von Ölen verwendet werden. Diese Pflanzen können einen hohen Ölgehalt und/oder aber eine besondere, industriell interessante Fettsäurezusammensetzung aufweisen. Be- vorzugt sind Pflanzen, die einen Lipidanteil von mindestens 1 Gew.-% aufweisen. Ölpflanzen umfassen beispielhaft: Bovago oficinalis (Borretsch); Brassica Arten wie B. campestris, B. napus, B. rapa (Senf oder Raps); Cannabis sativa (Hanf); Curthamus tinctorius (Färberdiestel); Cocos nucifera (Kokusnuss); Crambe abyssinica (Krambe); Cuphea Arten (Cuphea Arten liefern fettsäuren von mittlerer Kettenlänge insbesondere für industrielle Anwendungen); Elaeis guinensis (Afrikanische Ölpalme); Ekeis oleiferu (Amerikanische Ölpalme); Glycine max (Sojabohne); Gossypium hirisfum (Amerikanische Baumwolle); Gossypium barbadense (Ägyptische Baumwolle); Gossypium herba- ceum (Asiatische Baumwolle Cotton ); Helianthus annus (Sonnenblume); Jatropha cur- cas (Purgiernuss oder Brechnuss); Linum usitatissimum (Lein oder Flachs); Oenethera biennis (Evening primrose); Ozea europea (Olive); Oryza sativa (Rice); Ricinus com- munis (Castor); Sesamum indicum (Sesam); Glycine max (Sojabohne); Triticum Arten (Weizen); Zea maize (Mais) sowie verschiedene Nussarten wie beispielsweise WaI- nuss oder Mandel.
Wenn es sich bei den verwendeten Pflanzen um solche zur Gattung der Leguminosen (Hülsenfrüchte) gehörenden Pflanzen handelt, so fällt unter die Erfindung die Expression von Fremdproteinen Leghemoglobinen oder in der Natur nicht-symbiontisch vorkommenden Hemoglobinen oder die Veränderung der Pflanzen derart, dass sie das natürlich vorkommende Leghemoglobin oder nicht-symbiontisches Hemoglobin übe- rexprimieren.
Höchst bevorzugt sind Kartoffeln, Arabidopsis thaliana, Raps und Soja.
Vorteilhaft ist es, wenn die vorgenannten Pflanzen ein Leghemoglobin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Leghemoglobin aus den Pflanzen Lupinus luteus (LGB1_LUPLU, LGB2_LUPLU), Glycine max (LGBA_SOYBN, LGB2_SOYBN, LGB3_SOYBN), Medicago sativa (LGB1-4_MEDSA), Medicago trunculata (LGB1_MEDTR), Phaseolus vulgaris (LGB1_PHAVU, LGB2_PHAVU), Vicia faba
(LGB1_VICFA, LGB2_VICFA), Pisum sativum (LGB1_PEA, LGB2_PEA), Vigna ungui- culata (LGB1_VIGUN), Lotus japonicus (LGB_LOTJA), Psophocarpus tetragonolobus (LGB_PSOTE), Sesbania rostrata (LGB1_SESRO), Casuarina glauca (HBPA_CASGL) und Canvalaria lineata (HBP_CANLI) exprimieren. In Klammern sind die jeweiligen Swiss-Prot Datenbankeinträge vermerkt. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die vorgenannten Pflanzen ein nicht-symbiontisches Hemoglobin ausgewählt aus der Gruppe bestehen aus Hemoglobin aus den Pflanzen Arabidopsis thalina (AT_AHB2), Brassica napus (BN_AHB2), Linum usitatissimum (LU_AHB2), Glycine max (GM_AHB2), Helianthus annus (HA_AHB2), Triticum aesti- vum (TA_AHB2), Hordeum vulgäre (HV_AHB2), Oryza sativa (OS_AHB2) und Zea mays (ZM_AHB2).
Besonders vorteilhaft sind Pflanzen, die die Sequenz Nr. 1 (AT-AHB2) codierend für nicht symbiontische Hemoglobin aufweisen.
In einer bevorzugten Variante der Erfindung handelt es sich um Pflanzen, die das Hemprotein speicherorganspezifisch exprimieren.
Dies sind z. B. Zwiebeln, Knollen, Samen, Körner, Nüsse, Blätter usw. Unter Speicherorgane im Sinne der Erfindung sind auch Früchte zu verstehen. Früchte sind die Sammelbezeichnung für die den Samen als Nährgewebe umhüllenden Organe der Pflanzen. Dabei ist nicht nur an die eßbaren Früchte, insbesondere an das Obst, aber auch an Hülsenfrüchte, Getreide, Nüsse, Gewürze zu denken, sondern auch an offiziell genutzte Drogen (s. Fructus, Semen). Natürlich kann auch eine Speicherung der Speicherstoffe in der gesamten Pflanze stattfinden.
Bevorzugterweise wird das Hemprotein knollenspezifisch oder samenspezifisch expri- miert.
Als Pflanzen kommen alle zuvor genannten in Betracht. Es ist besonders bevorzugt, wenn es sich um knollenproduzierende Pflanzen, insbesondere Kartoffel-Pflanzen oder um samenproduzierende Pflanzen, insbesondere Arabidopsis thaliana oder Raps handelt.
Die gewebespezifische Expression kann z. B. durch Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erreicht werden. Eine solche gewebespezifische Expression ist beispielsweise bekannt aus der US 6,372,961 B1 Spalte 11 , Zeilen 44 ff.
In einer weiteren Ausführung betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der o- ben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen kodierend für Polypeptide mit der Aktivität von Hemoproteinen zur Herstellung von Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder Pflanze mit erhöhtem ATP-ADP-Verhältnis und/oder verändertem Ölgehalt, bevorzugt erhöhtem Fettsäure-Gehalt, bevorzugt erhöhtem Linolensäure-Gehalt Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Versuche beispielhaft beschrieben.
Beispiele
Allgemeine Methoden:
Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, stammen von den Firmen Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen). Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den Firmen Amersham— Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, LISA), Perkin— Eimer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen (Amsterdam, Niederlan- de), Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire, United Kingdom). Die verwendeten Reagenzien wurden entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt.
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA— Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA— Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) CoId Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0—87969—309—6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA— Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463- 5467).
Beispiel 1 : Klonierung der Gene AHB1 und AHB2 aus Arabidopsis thaliana
Zur Klonierung des Gens AHB2 wurde Gesamt-RNA aus 6 wochen alten Arabidopsis- Pflanzen extrahiert. Die Herstellung der entsprechenden cDNA erfolgte durch RT-PCR mit Hilfe der SUPERSCRIPT Il (Invitrogen).
Für die Klonierung des AHB2-Gens wurde die isolierte Arabidopsis cDNA in einer PCR-Reaktion mit den Oligonukleotidprimern AHb2f und AHb2r eingesetzt.
Sequenz Primer Ahb2f SEQU.ID.No : δ'-TTTGGTACCATGGGEGAGATTGGGTTTACAGAG-S' Sequenz Primer Ahb2r SEQU.ID.No : δ'-TTTGGATCCTTATGACCTTTCTTGTTTCATCTCGG-S'
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 uL):
5,00 μl_ cDNA aus Arabidopsis thaliana
5,00 μL 10x Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25mM MgCI2
5,00 μL 2mM dNTP
1 ,25 μL je Primer (10 pmol/uL)
0,50 μL Advantage-Polymerase
Die Advantage-Polymerase von Clontech wurden eingesetzt.
PCR-Programm:
Anfangsdenaturierung für 2 min bei 95°C, dann 35 Zyklen mit 45 sec 95°C, 45 sec 55°C und 2 min 72°C. Abschliessende Extension von 5 min bei 72°C.
Das PC R-Ansätze wurden anschließend über Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die amplifizierten DNA-Fragmente von AHB2 aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem .Gelpurification'Kit von Qiagen nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit 50 μL Elutionspuffer eluiert.
Anschließend wurden die DNA Fragment in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem Vektor pCR2.1-AHB2 und die Sequenz wurde durch Sequenzierung überprüft.
Anschließend wurden die codierenden Sequenzen für AHB2 in einen binären Pflanzen vektor, wie pBIN, hinter den samenspezifischen USP Promoter (Bäumein et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-467) kloniert. Hierfür wurde der Vektor pCR2.1- AHB2 mit den Restriktionsenzymen Kpnl und BamHI verdaut. Die resultierenden DNA- Fragmente über Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die AHB codierenden Fragmente aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem .Gelpurification'Kit von Qiagen nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit 50 μL Elutionspuffer eluiert. Die eluierten DNA Fragment wurden mit dem mit den gleichen Enzymen verdauten binären Vektor über Nacht bei 16°C ligiert (T4 Ligase von New England Biolabs). Die Ligationsprodukte werden dann in TOP10 Zellen (Stratagene) nach Herstellerangaben transformiert und entsprechend selektioniert. Positive Klone werden mit den Primern AHb2f und AHb2r durch PCR und Sequenzierung verifiziert. Beispiel 3: Transformation von Agrobacterium
Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-Stämme GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383- 396) oder LBA4404 (Clontech) durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standard-Transformationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al.(1984) Nucl Acids Res 13:4777-4788).
Beispiel 4: Pflanzentransformation
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana wurde unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect, Ringbuc Zentrale Signatur: BT1 1-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0- 8493-5164-2). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und
Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Selektion der mit AHB2 transformierten Arabidopsis thaliana Pflanzen erfolgte mit Hygormycin.
Die Agrobakterium-vermittelte Transformation von Raps kann z. B. durch Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation erfolgen (Moloney et al., Plant Cell Report 8 (1989) 238- 242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701 ). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab.
Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usitatissimum) lässt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13:282-285 beschriebenen Technik durchführen.
Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispielsweise einer in EP- A-O 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP-A-O 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.
Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchenbeschuss,
Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser- Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).
Beispiel 5: Untersuchung der Expression eines rekombinanten Genproduktes in einem transformierten Organismus
Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Transkription des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA, die für die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht) ist die Durchführung eines Northern— Blots wie unten ausgeführt (als Bezugsstelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, oder den oben erwähnten Beispielteil), wobei ein Primer, der so gestaltet ist, dass er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung (gewöhnlich radioaktiv oder chemilumineszent) markiert wird, so dass, wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der Transkription des transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren, die alle im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel das von Bormann, E. R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317—326 beschriebene, präpariert werden.
Northern-Hybridisierung:
Für die RNA-Hybridisierung wurde Gesamt-RNA mit Hilfe des Concert RNA Plant Reagent (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland) aus reifenden Samen extrahiert. 20 μg Gesamt-RNA oder 1 μg poly(A)+-RNA wurden mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit einer Stärke von 1 ,25 % unter Verwendung von Formaldehyd, wie beschrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) aufgetrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 x SSC auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) übertragen, mittels UV- Licht immobilisiert und 3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridisierungspuffer (10 % Dextransulfat Gew.A/ol., 1 M NaCI, 1 % SDS, 100 mg Heringssperma-DNA) vorhybridisiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit dem
Highprime DNA labeling-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) erfolgte während der Vorhybridisierung unter Verwendung von alpha-32P-dCTP (Amersham Pharmacia, Braunschweig, Deutschland). Die Hybridisierung wurde nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgeführt. Die Waschschritte wurden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 X SSC und zweimal für 30 min unter Verwendung von 1 X SSC, 1 % SDS, bei 68°C durchgeführt. Die Exposition der verschlossenen Filter wurde bei -70°C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt.
Zur Untersuchung des Vorliegens oder der relativen Menge an von dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt- Proteine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrozellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte Protein bindet, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszenten oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen lässt. Das Vorliegen und die Menge der beobachteten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gewünschten, in der Zelle vorliegenden Proteins an.
Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse des Northern Blots von 3 unabhängigen transgenen Arabidopsis-Linien die mit dem AHB2 Konstrukt transformiert wurden sowie des
Wildtyps. Die Pflanzen der Linien 9, 10 und 11 zeigen ein starkes Detektionssignal auf dem Northern Blot . Die Pflanzen exprimieren demzufolge das AHB2 Gen in reifenden Samen. In den Samenprobe des Wildtyps konnte dagegen nur ein schwaches Signal detektiert werden, welches auf der Expression des endogenen AHB2 Gens beruhte.
Beispiel 6: Analyse der Auswirkung der rekombinanten Proteine auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen oder auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet wird und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische
Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel IM: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 1 1 , S. 1 -27, VCH: Weinheim; und Dechow, FJ. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W.,
Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: OiIy Press (OiIy Press Lipid Library; 2);
Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: OiIy Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (OiIy Press Lipid Library; 1);
"Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T.:
Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie).
Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, OiIy Press, Dundee, 1 19-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie- Verfahren, Lipide 33:343-353).
Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC- Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP- Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d.h. Sigma), definiert werden.
Pflanzenmaterial wird zunächst mechanisch durch Mörsern homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen.
Für die quantitative und qualtitive Ölanalyse der mit den Konstrukten ADH1 und ADH2 transformierten Arabidopsis Pflanzen wurde folgendes Protokoll angewendet:
Die Extraktion der Lipide aus Samen wird nach der Methode von Bligh & Dyer (1959) Can J Biochem Physiol 37:91 1 durchgeführt. Dazu werden 5 mg Arabidopsis Brassica Samen in 1 ,2 ml Qiagen-Microtubes (Qiagen, Hilden) auf einer Sartorius (Göttingen) Mikrowaage abgewogen. Das Samenmaterial wird mit 1 ml Chloroform/Methanol (1 :1 ; enthält Mono-C15-glycerin von Sigma als internen Standard) in der Rätschmühle MM300 der Firma Retsch (Haan) homogenisiertund 20 min bei RT inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand in ein neues Gefäß überführt und das Sediment erneut mit 1 ml Chloroform/Methanol (1 :1) extrahiert. Die Überstände wurden vereinigt und bis zu Trockene eingeengt. Die Derivatisierung der Fettsäure erfolgte durch saure Methanolyse. Hierzu wurden die extrahierten Lipide mit 0,5 M Schwefelsäure in Methanol und 2 % (v/v) Dimethoxypropan versetzt und für 60 min. bei 80°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine zweimalige Extraktion mit Petrolether gefolgt von Waschschritten mit 100 mM Natriumhydrogencarbonat und Wasser. Die so hergestellten Fettsäuremethylester wurden bis zur Trockene eingeengt und in einem definierten Volumen Petrolether aufgenommen. 2 μl_ der Fettsäuremethylester-Lösung wurden schließlich gaschromatographisch (HP 6890, Agilent Technologies) auf einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0.32 mm) aufgetrennt und über einen Flamenionisationsdetektor analysiert.
Die Quantifizierung des Öls erfolgte durch einen Vergleich der Signalstärken der derivatisierten Fettäuren mit denen des internen Standards Mono-C15-glycerin (Sigma).
Die Bestimmung des Fettsäureprofils erfolgte durch relativen Vergleich der Signalstärken zueinander. Die Bestimmung der unsaturierungs-/saturierungs-index (USI) erfolgte wie in Gutierrez at al. ((2005) Food Chemistry 90, 341-346) beschrieben und reflektiert das Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren in dem Samenöl.
Die quantitative Proteinanalyse der mit dem Konstrukt USP-AHB2 transformierten Arabidopsis Pflanzen wurde das Protokoll von Bradford (1976) angewendet. Rinderserumalbumin diente hierbei als Standard.
Tabelle 3: Ölgehalt (Gesamtfettsäuregehalt) in reifen und reifenden (13-14 DAF) Samen transgener Arabidopsis Linien, die mit dem USP-AHB2-Konstrukt transformiert worden waren sowie in reifen und reifenden (13-14 DAF) Samen untransformierter Wildyp-Pflanzen. In reifen Samen wurde der Ölgehalt über drei aufeinanderfolgende Generationen bestimmt. Die aufgeführten Werte entsprechen Mittelwerten und Stan- dardfehelern aus 6 unabhängigen Messungen. Signifikante Änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse; p < 0.05) sind durch Sternchen (*) hervorgehoben.
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Tabelle 3 fast beispielhaft den Verlauf der Ölgahlte in reifen Samen von 3 unabhängigen transgenen Arabidopsis Linien über 3 Generationen zusammen, die mit dem Konstrukt USP-AHB2 transformiert worden waren sowie den untransformierten Wildty-Pflanzen. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus 6 unabhängigen Messungen. Die Standardfehler sind ebenfalls angegeben. Signifikante Änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse) sind durch Sternchen (*) hervorgehoben. In allen 3 Generationen konnte in den reifen Samen der transgenen Linien eine deutliche Erhöhung im Ölgehalt gezeigt werden. Der erzielte Phänotyp ist dementsprechend stabil über mehrere Generationen. Darüber hinaus konnte auch in reifenden T3 Samen während der Phase der Ölspeicherung ein deutliche höhere Ölgehalt in den transgenen Linien festgestellt werden (siehe Tabelle 1 ).
Abbildung 2 zeigt beispielhaft die Ergbnisse für die quantitative Bestimmung der Öl- und Proteingehalte in T3 Samen von 3 unabhängigen transgenen Arabidopsis Linien (9, 10, 11 ), die mit dem Konstrukt USP-AHB2 transformiert worden waren sowie in den Samen der untransformierten Wildtyp-Pflanzen. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus 10 unabhängigen Messungen. Die Standardfehler sind ebenfalls angegeben. Signifikante Änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse) sind durch Sternchen (*) hervorgehoben. In allen 3 transgenen Linien konnte eine signifikante Erhöhung des Ölgehalts um 15 % (Linie 9), 31 % Linie (Linie 10) und 40 % (Linie 1 1). Die unterschiedlichen Ölsteigerungen in den verschiedenen Linien korrelieren hierbei mit der in Abbildung 2 gezeigten Expressionsstärken. Im Gegensatz dazu hat die Überexpression von AHB2 keinen Einfluss auf den Ölgehalt
Abbildung 3 zeigt beispielhaft die Ergebnisse der qualitativen Ölanalyse in den reifen Samen transgener Arabidopsis Linien, die mit dem Konstrukt USP-AHB2 transformiert worden waren sowie in den Samen der untransformierten Wildtyp-Pflanzen (A. Linol- säure-Gehalt, B. Linolensäure-Gehalt, C. Linolsäure/Linolensäure-Verhältnis und D. USI (Unsaturierungs / Saturierungs Index)). Die Werte entsprechen den Mittelwerten und Standardfehlern aus 10 unabhängigen Messungen. Signifikante Änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse) sind durch Sternchen (*) hervorgehoben. Samenspezifische Überexpression von AHB2 führt im Samenöl zu einer deutlichen Erhöhung von alpha-Linolensäure (C18:3) von 25 % in den Wildtyppflanze auf über 30 % in den transgenen Linien 10 und 11. Der Gehalt an Linolensäure (C18:2) Vorstufe von C18:3 ist dagegen unverändert. Dies spiegelt sich auch im Verhältnis von C18:3 zu C18:2 wieder (0,8 im Samenöl der Wildtyp-Pflanzen und >1 im Samenöl der transgenen Pflanzen. Die Überexpression von AHB2 führt folglich zu eine erhöhte De- saturierung der Fettsäuren in den Samen der transgenen Linien wie auch durch den USI wiedergegeben der von 9 in den Wildtyp-Samen auf bis zu 12 in den transgenen Samen ansteigt.
Beispiel 7: Bestimmung des ATD/ADP Verhältnisses und des Milchsäuregehalts. Um den Einfluss von unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen auf den Metabolismus in den Samen von Wildtyp und AHB2-überexprimierenden Arabidopsis-Pflanzen zu untersuchen wurden die Pflanzen im Gewächshaus (21 °C/Tag und 17 °C/Nacht, 50 % Feuchtigkeit Tag und Nacht, Photoperiode 16 h Tag / 8 h Nacht, Nachtinensität 180 μmol Photons nτ2s"1). Für die Inkubationsexperimente mit verschiednen Konzentrationen Sauerstoff wurde Schotentragende Stängel in eine transparente Plastiktüte verpackt in der Luft mit einem Sauerstoffgehalt von 21 % bzw. 4 % (v/v) zirkulierte. Die Luftgemische der Firma Messer Griesheim GmbH (Magdeburg, Germany) enthielten 350 ppm CO2, Sauerstoffkonzentrationen wie oben angegeben und Stickstoff. Nach 2 Stunden wurden die Schoten geerntet und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Samen wurden von 13-14 Tagen alten lyophilisierten Schoten wie in Gibon et al. (2002) Plant J 30:221-235 beschrieben präpariert.
Zur Analyse der Metaboliten ATP, ADP und Milchsäure wurden Samen in einer mit flüssigem Stickstoff gekühlten Schwingmühle der Firma Retch (Haan, Germany) ho- mogenisiert und anschließend einer Extraktion mit Trichloressigsäure unterzogen. Die Quantifizierung der Metaboliten erfolgte anschließend wir in Gibon et al. (2002) Plant J 30: 221-235 beschrieben.
Abbildung 4 zeigt den Effekt der samenspezifischen Expression von AHB2 auf das ATP/ADP Verhältnis (A) und den Milchsäuregehalt (B) in reifenden Samen die unter normalen (21 %) Sauerstoffbedingungen oder unter hyoxischen Bedingungen (4 %) kultiviert wurden. Die Ergebnisse entsprechen Mittelwerte und Standardfehler aus 6 unabhängigen Messungen. Signifikante Änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse) sind durch Sternchen (*) hervorgehoben.
Die samenspezifische Überexpression von AHB2 führt unter natürliche Sauerstoffkon- zentrationen in der Umgebung zu einem 2-4fach höheren ATP zu ADP Verhältnis in den Samen der transgenen Linien (4-8) als in den Wildtyp-Samen (2). Dies deutet auf eine verbesserte Energieversorgung durch die Atmungskette in den transgenen Samen auch unter den niedrigen Sauerstoffkonzentrationen innerhalb des Samens hin.
Eine Absenkung der Sauerstoffkonzentration in der Umgebung auf 4 % führt in den Wildtypsamen zu einer Reduktion des Energiestatus, welches sich in der Reduktion des ATP zu ADP Verhältnisses von 2 auf 0,4 wiederspiegelt. Die Absenkung des E- nergiestatus ging mit einer Akkumulation von Milchsäure in den Samen einher (20 μmol gDW"1 bei 21 % O2; 50 μmol gDW"1). Dies demonstriert, dass die Wildtyp-Samen fehlende Energie partiell durch energetisch ungünstigere, anaerobe Fermentation kompensieren. Eine Absenkung der Sauerstoffkonzentration in der Umgebung auf 4 % führt in den AHB2 überexprimierenden Samen ebenfalls zu einer Reduktion des Energiestatus. Allerdings beläuft sich das ATP zu ADP Verhältnis in diesen Pflanzen auf 0,8 - 2 und ist damit signifikant höher als in den Wildtyp-Samen (0,4). Dies deutet auf eine weiterhin ausreichende aerobe Energieversorgung bei einer Sauerstoffkonzentration in der Umgebung von 4 % hin. Bestätigt wird dies dadurch, dass es in den transgenen Samen nicht zu einer Steigerung der durch aerobe Fermentation gebildeten Milchsäure kommt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Veränderung des ATP-ADP-Verhältnisses in mindestens einer Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder Pflanze, dadurch gekennzeich- net, daß die Aktivität mindestens eines Hemproteins verändert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität mindestens eines Leghemoglobin verändert wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität eines Hemproteins erhöht wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß in die Aktivität mindestens eines Polypeptids erhöht wird, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder
40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA- Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder de- ren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Amino- säurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß in die Aktivität mindestens eines Hemproteins durch Expression, bevorzugt Über- expression, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Iden- tität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,
16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA- Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Amino- säurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; erhöht wird
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Leghemoglobin und Hemoglobin aus Pflanzen aus der Gruppe bestehend aus Arabidopsis thaliana, Lupinus luteus, Glycine max, Medicago sativa, Medi- cago trunculata, Phaseolus vulgaris, Vicia faba, Pisum sativum, Vigna unguicu- lata, Lotus japonicus, Psophocarpus tetragonolobus, Sesbania rostrata, Casua- rina glauca und Canvalaria lineata ausgewählt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Hemprotein aus Lotus japonicus oder bevorzugt Arabidopsis thaliana stammt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen derart transformiert werden, dass sie das Hemprotein speicheror- ganspezifisch exprimiert.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzen derart transformiert werden, dass sie das Hemprotein knollenspe- zifisch und/oder samenspezifisch exprimiert.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass monokotyle Kulturpflanzen, insbesondere der Art Gramineae transformiert werden.
1 1. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass dikotyledone Kulturpflanzen, insbesondere der Familie
Asteraceae, Brassicacea, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Legumino- sae, Rubiaceae, Solanaceae, Sterculiaceae, Theaceae oder Umbelliferae transformiert werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch ge- kennzeichnet, dass Kartoffeln, Arabidopsis thaliana, Soja oder Raps transformiert werden.
13. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls umfassend mindestens ein Nuklein- säuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Iden- tität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,
16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA- Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; zur Herstellung eines Polypeptids mit Hemprotein-Aktivität in mindestens einer
Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder Pflanze.
14. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder
40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Iden- tität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,
16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA- Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; zur Veränderung des ATP-ADP-Verhältnisses in mindestens einer Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder Pflanze.
15. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder
40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA- Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; zur Herstellung mindestens einer Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder
Pflanze mit verändertem ATP-ADP-Verhältnisses, bevorzugt erhöhtem ATP- ADP-Verhältnisses.
16. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls umfassend mindestens ein
Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID
NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA- Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, beson- ders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; zur Herstellung mindestens einer Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder Pflanze mit verändertem Ölgehalt, bevorzugt erhöhtem Fettsäure-Gehalt, bevorzugt erhöhtem Linolensäure-Gehalt.
17. Nukleinsäuremolekül das für ein Polypeptid kodiert welches ein Polypeptid um- fasst, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA- Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Amino- säurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.
18. Nukleinsäuremolekül das für ein Polypeptid kodiert welches ein Polypeptid um- fasst, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül das sich in ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehreren Nukleinsäuren unterscheidet von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Iden- tität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,
16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA- Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; und für ein Polypeptid mit Aktivität eines Hemproteins kodiert.
19. Protein kodiert durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Protein nicht aus der in SEQ ID. NO. 2 und 4 gezeigten Sequenz besteht.
20. DNA Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz die im wesentlichen identisch ist zu einem Nukleinsäuremolekül gemäss Anspruch 17 oder 18 und für ein Protein nach Anspruch 19 kodiert.
21. Vektor enthaltend eine Expressionskassette gemäss einem der Anspruch 20.
22. Transgene Zelle, enthaltend eine Expressionskassette gemäss Anspruch 20 oder einen Vektor gemäss Anspruch 21.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008031684A1 (de) * 2006-09-13 2008-03-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Extrakt aus apium graveleons zur stimulierung des haarwuchses
US9700067B2 (en) 2011-07-12 2017-07-11 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US9808029B2 (en) 2011-07-12 2017-11-07 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US9826772B2 (en) 2013-01-11 2017-11-28 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US10039306B2 (en) 2012-03-16 2018-08-07 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US10172380B2 (en) 2014-03-31 2019-01-08 Impossible Foods Inc. Ground meat replicas
US10986848B2 (en) 2013-01-11 2021-04-27 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110742128A (zh) 2011-07-12 2020-02-04 非凡食品有限公司 用于消费品的方法和组合物
LT3044320T (lt) * 2013-09-11 2020-06-10 Impossible Foods Inc. Hemo turinčių polipeptidų sekrecija
JP2022531140A (ja) 2019-04-25 2022-07-06 インポッシブル フーズ インコーポレイテッド ヘム含有タンパク質の作製のための株および方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000000597A2 (en) * 1998-06-26 2000-01-06 The University Of Manitoba Non-symbiotic plant hemoglobins to maintain cell energy status
WO2004057946A2 (de) * 2002-12-23 2004-07-15 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft e.V. Verfahren zur veränderung des gehalts von speicherstoffen in pflanzen
WO2004087755A2 (en) * 2003-04-01 2004-10-14 Cropdesign N.V. Plant haemoglobin

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6372961B1 (en) * 1998-08-20 2002-04-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Hemoglobin genes and their use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000000597A2 (en) * 1998-06-26 2000-01-06 The University Of Manitoba Non-symbiotic plant hemoglobins to maintain cell energy status
WO2004057946A2 (de) * 2002-12-23 2004-07-15 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft e.V. Verfahren zur veränderung des gehalts von speicherstoffen in pflanzen
WO2004087755A2 (en) * 2003-04-01 2004-10-14 Cropdesign N.V. Plant haemoglobin

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARATA R M ET AL: "Targeting of the soybean leghemoglobin to tobacco chloroplasts: Effects on aerobic metabolism in transgenic plants" PLANT SCIENCE, LIMERICK, IE, Bd. 155, Nr. 2, 29. Juni 2000 (2000-06-29), Seiten 193-202, XP002283115 ISSN: 0168-9452 *
DORDAS C ET AL: "Expression of a stress-induced hemoglobin affects NO levels produced by alfalfa root cultures under hypoxic stress" PLANT JOURNAL, BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATIONS, OXFORD, GB, Bd. 35, 2003, Seiten 763-770, XP003001104 ISSN: 0960-7412 *
DOWNIE J A: "Legume Haemoglobins: Symbiotic Nitrogen Fixation Needs Bloody Nodules" CURRENT BIOLOGY, CURRENT SCIENCE,, GB, Bd. 15, Nr. 6, 29. März 2005 (2005-03-29), Seiten R196-R198, XP004818980 ISSN: 0960-9822 *
FREY ALEXANDER D ET AL: "Dissection of central carbon metabolism of hemoglobin-expressing Escherichia coli by 13C nuclear magnetic resonance flux distribution analysis in microaerobic bioprocesses" APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Bd. 67, Nr. 2, Februar 2001 (2001-02), Seiten 680-687, XP002440436 ISSN: 0099-2240 *
OTT T ET AL: "Symbiotic Leghemoglobins Are Crucial for Nitrogen Fixation in Legume Root Nodules but Not for General Plant Growth and Development" CURRENT BIOLOGY, CURRENT SCIENCE,, GB, Bd. 15, Nr. 6, 29. März 2005 (2005-03-29), Seiten 531-535, XP004818992 ISSN: 0960-9822 *

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008031684A1 (de) * 2006-09-13 2008-03-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Extrakt aus apium graveleons zur stimulierung des haarwuchses
US9700067B2 (en) 2011-07-12 2017-07-11 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US9808029B2 (en) 2011-07-12 2017-11-07 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US10863761B2 (en) 2011-07-12 2020-12-15 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US9943096B2 (en) 2011-07-12 2018-04-17 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US10327464B2 (en) 2011-07-12 2019-06-25 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US10039306B2 (en) 2012-03-16 2018-08-07 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US10314325B2 (en) 2013-01-11 2019-06-11 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US10172381B2 (en) 2013-01-11 2019-01-08 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US9826772B2 (en) 2013-01-11 2017-11-28 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US10986848B2 (en) 2013-01-11 2021-04-27 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US10993462B2 (en) 2013-01-11 2021-05-04 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US11013250B2 (en) 2013-01-11 2021-05-25 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US11219232B2 (en) 2013-01-11 2022-01-11 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US11224241B2 (en) 2013-01-11 2022-01-18 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
US10172380B2 (en) 2014-03-31 2019-01-08 Impossible Foods Inc. Ground meat replicas
US10798958B2 (en) 2014-03-31 2020-10-13 Impossible Foods Inc. Ground meat replicas
US11439166B2 (en) 2014-03-31 2022-09-13 Impossible Foods Inc. Ground meat replicas
US11819041B2 (en) 2014-03-31 2023-11-21 Impossible Foods Inc. Ground meat replicas

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