WO2007097358A1 - Ｈｌａ－ａ＊３３０３拘束性ｗｔ１ペプチド、およびそれを含む医薬組成物 - Google Patents

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to an HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide, specifically, a peptide comprising an amino acid sequence consisting of nine consecutive amino acids derived from the WT1 protein, the nine consecutive amino acids.
  • the second amino acid in the amino acid sequence that is also a force is selected from the group forces Ala, Ile, Leu, Val, Ph e, Tyr, Ser, and Asp, and the ninth amino acid is Ar g. Relates to peptides.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding the peptide, a pharmaceutical composition for preventing cancer treatment Z comprising the same, and the like.
  • the WT1 gene (Wilms' tumor 1 gene) has been identified as a responsible gene for Wilms tumor, a childhood renal cancer (Non-patent Documents 1 and 2), and a transcription factor having a zinc finger structure. It is. Initially, the WT1 gene was considered to be a tumor suppressor gene, but subsequent studies (Non-Patent Documents 3, 4, 5 and 6) have shown that it functions as an oncogene in hematopoietic tumors and solid tumors. It was.
  • mice immunized with the WT1 peptide or WT1 cDNA reject the transplanted WT1 gene-expressing tumor cells with a high probability (Non-patent Documents 7 and 10), but the WT1 gene is expressed physiologically. It was also shown that normal tissues were not damaged by induced CTL (Non-patent Document 7).
  • HLA—A * 0201 high binding Dbl26 peptide and WH 187 peptide (amino acids 187-195 in SEQ ID NO: 1, SLGEQQYSV)
  • HLA—A * 0201 high binding Dbl26 peptide and WH 187 peptide (amino acids 187-195 in SEQ ID NO: 1, SLGEQQYSV)
  • WTl-specific CTLs that are specific injuries to tumor cells that are endogenously highly expressing the WT1 gene It has been shown that the activity and the damaging activity of CTL are HLA-A2 restricted (Non-patent Document 11).
  • HLA—A reels the most common HL A—A * 2402 WT1 peptide (WT1; amino acid 235 in SEQ ID NO: 1)
  • Non-patent Document 12 WT1-specific CTL
  • TAK-1 WT1-specific CTL
  • the WT1 gene product exists as a nuclear protein, is processed by the proteasome in the cytoplasm, and is fragmented into peptides. Fragmented peptides are displayed on the cell surface, forming a complex with the MHC class I molecule, TAP (transporter associated with antigen processing) force, forceful into the body cavity of the child / J cyst.
  • TAP transporter associated with antigen processing
  • the CTL progenitor cells recognize WT1 peptide MHC class I molecular complexes via TCR, leading to WT1-specific CTLs, and to tumor cells that present WT1 gene products via MHC class I molecules It exerts a cytotoxic effect (Non-patent Documents 7, 8 and 9).
  • the WT1 peptide used in cancer immunotherapy targeting the WT1 gene product must be in a form that binds to MHC class I molecules at least in vivo.
  • MHC class I molecules are diverse and the amino acid sequences of WT1 peptides that bind to each MHC class I molecule are different, it is necessary to prepare peptides that are suitable for each type of MHC class I.
  • the only known HLA molecule-restricted WT1 peptides are HLA-A * 2402 molecule, HLA-A * 0201 molecule, and HLA-A * 2601 molecule-restricted (Patent Document 1, respectively).
  • Non-patent document 11 and Patent document 2 To Japanese people! Next to HLA—A * 2402, there are many! HLA—A reel is HLA—A * 3303 Therefore, it was necessary to find HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2003Z106682
  • Patent Document 2 International Publication No. 2005Z095598
  • Non-Patent Literature l Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29; 61 (7): 1257-69.
  • Non-Patent Document 2 Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9; 60 (3): 509-20.
  • Non-Patent Document 3 Menke AL et al, Int Rev Cytol. 1998; 181: 151-212. Review.
  • Non-Patent Document 4 Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr l; 87 (7): 2878-84.
  • Non-Patent Document 5 Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15; 91 (8): 2969-76.
  • Non-Patent Document 6 Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May; 23 (5): 499-505.
  • Non-Patent Document 7 Oka Y et al., J Immunol. 2000 Feb 15; 164 (4): 1873-80.
  • Non-Patent Document 8 Melief CJ et al., Immunol Rev. 1995 Jun; 145: 167-77.
  • Non-Patent Document 9 Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb; 12 (2): 237-8.
  • Non-Patent Document 10 Tsuboi A et al., J Clin Immunol. 2000 May; 20 (3): 195-202.
  • Non-Patent Document 11 Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb; 51 (2): 99—107.
  • Non-Patent Document 12 Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1; 95 (1): 286-93.
  • Non-Patent Document 13 Gao L et al., Blood. 2000 Apr 1; 95 (7): 2198-203.
  • Non-Patent Document 14 Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1; 95 (1): 286-93.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide, a polynucleotide encoding the same, and a pharmaceutical composition for treating cancer Z containing the same, and the like.
  • the present inventor is a peptide containing an amino acid sequence having nine consecutive amino acid strengths derived from the WT1 protein, the amino acid comprising the nine consecutive amino acids.
  • a group force is selected in which the second amino acid in the sequence is Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser, and Asp, and the peptide in which the ninth amino acid is Arg is WT1.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising the peptide according to (1),
  • a method for treating or preventing cancer comprising administering an effective amount of the pharmaceutical composition according to (4) to an HLA-A * 3303-positive subject,
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising the polynucleotide according to (7) or the vector according to (8),
  • a method for treating or preventing cancer which comprises administering an effective amount of the pharmaceutical composition according to (9) to an HLA-A * 3303-positive subject,
  • Peripheral blood mononuclear cells are cultured in the presence of the peptide according to (1), from the peripheral blood mononuclear cells WT1-specific CTL induction method, characterized by inducing WT1-specific CTL,
  • An antigen presenting a WT1 peptide characterized by culturing immature antigen-presenting cells in the presence of the peptide according to (1), and inducing antigen-presenting cells that present the WT1 peptide from the immature antigen-presenting cells.
  • a method for inducing a presentation cell characterized by culturing immature antigen-presenting cells in the presence of the peptide according to (1), and inducing antigen-presenting cells that present the WT1 peptide from the immature antigen-presenting cells.
  • kits for inducing an antigen-presenting cell that presents a WT1 peptide comprising the peptide according to (1) as an essential component;
  • a method for determining the presence or amount of WT1-specific CTL in an HLA-A * 3303 positive subject comprising:
  • an HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide, a polynucleotide encoding the same, and a cancer treatment containing the same, and a pharmaceutical composition for preventing Z can be obtained.
  • In vivo and in vitro induction of WT1-specific CTLs is possible.
  • About 24% of Japanese have at least one HLA-A * 3303 molecule, which can induce WT1-specific CTL in a very wide range of subjects.
  • FIG. 1 shows the cytotoxic activity of CTL induced with WT1.
  • FIG. 2 shows the cytotoxic activity of CTL induced with WT1.
  • FIG. 3 shows the cytotoxic activity of CTL induced with WT1.
  • FIG. 4 shows the cytotoxic activity of CTL induced with WT1.
  • Fig. 5 shows a comparison of CTL-induced endogenous WT1 gene-expressing cells with WT1.
  • Fig. 6 shows the expression of CTL induced by WT1 against endogenous WT1 gene-expressing cells.
  • FIG. 7 shows that CTLs induced with WT1 were compared with cells expressing endogenous WT1 gene.
  • Fig. 8 shows the details of CTL induced by WT1 against cells expressing WT1 gene.
  • WT1 gene is, for example, leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma and other hematopoietic tumors, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, It is highly expressed in natural types in solid cancers such as uterine cancer, cervical cancer and ovarian cancer.
  • the HLA-A * 33 03 anchor motif has Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser, and Asp at the second position, and Arg at the ninth position.
  • the present invention in one embodiment, is a peptide comprising 9 consecutive amino acid power amino acid sequences derived from the WT1 protein, which is the second position of the 9 consecutive amino acid power amino acid sequences.
  • Amino acid power preferably selected from the group consisting of A1a, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser, and Asp, and the 9th amino acid power, preferably Arg, HLA—A * 3303 Sex WT1 peptide (hereinafter also referred to as WT1 peptide).
  • the nine amino acid sequences comprised by the peptide of the present invention preferred are Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg (SEQ ID NO: 2), Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys Arg ( SEQ ID NO: 3), Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID NO: 4), or Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (SEQ ID NO: 5), and most preferred is Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID NO: 4).
  • Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg SEQ ID NO: 4
  • any of SEQ ID NOs: 2 to 5 even if one to several, preferably 1 to 5 amino acids of the 9 amino acids are substituted with another amino acid Good.
  • any of the nine amino acids and other substituted amino acids may be appropriately modified. However, in any case, it is a condition that the peptide of the present invention retains the binding ability to the HLA-A * 3303 molecule.
  • the object of the present invention is to obtain a WT1 peptide having HLA-A * 3303 restriction as described above. Therefore, the peptide of the present invention is derived from WT1 protein,
  • the peptide of the present invention may be the peptide itself consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 5 or the WT1 protein or a part thereof including the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 5. May be.
  • the peptide of the present invention can also bind various substances to the N-terminus and Z- or C-terminus of the amino acid sequence having nine consecutive amino acid forces. For example, amino acids, peptides, analogs thereof and the like may be bound.
  • these substances are bound to the peptide of the present invention, these substances are treated with, for example, in vivo enzymes or by a process such as intracellular processing, and finally the amino acids having the above nine amino acid strengths.
  • these substances may be those that regulate the solubility of the peptides of the present invention or may improve their stability, such as protease resistance.
  • the peptide of the present invention may be delivered, or it may have an action of enhancing the uptake efficiency of antigen-presenting cells.
  • These substances may also be those that increase the ability to induce CTL, such as helper peptides.
  • the peptide of the present invention can be synthesized using a method usually used in the art or a modification thereof. For example, Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Drug development continued 14th 'Peptide synthesis, Hirokawa Shoten, 1991, etc.
  • the peptide of the present invention can also be produced using genetic engineering techniques based on the nucleotide sequence information encoding the peptide of the present invention. Such genetic engineering techniques are well known to those skilled in the art.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer, comprising the HLA-A * 3303 restricted WT1 peptide.
  • WT1 gene is, for example, hematopoietic tumors such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, Since it is highly expressed in solid cancers such as uterine cancer, cervical cancer and ovarian cancer, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment or prevention of cancer.
  • the WT1-specific CTL is induced by the HLA-A * 3 303-restricted WT1 peptide contained in the pharmaceutical composition, and is profitable. CTLs damage the cancer cells in the target.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain, for example, a carrier, an excipient and the like in addition to the above-mentioned HLA-A * 3303 restricted WT1 peptide as an active ingredient. Since the HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide contained in the pharmaceutical composition of the present invention induces WT1-specific CTL, the pharmaceutical composition of the present invention is suitable for increasing the induction efficiency. Or may be administered with a suitable adjuvant.
  • Preferred adjuvants include, but are not limited to, complete or incomplete Freund's adjuvant, aluminum hydroxide, and the like.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected according to conditions such as the type of disease, the state of the subject, the target site and the like.
  • Examples of the method include, but are not limited to, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, nasal administration, and oral administration.
  • the amount of peptide contained in the pharmaceutical composition of the present invention, the dosage form of the pharmaceutical composition, the number of administrations, etc. can be appropriately selected according to conditions such as the type of disease, the condition of the subject, the target site, etc.
  • Peptide dosage is usually 0. OOOlmg: LOOOmg, preferably ⁇ 0.00 lmg ⁇ : LOOOOmg.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing cancer, which comprises administering an effective amount of the above pharmaceutical composition to an HLA-A * 3303-positive subject.
  • the cancer to be treated or prevented may be any of, for example, hematopoietic tumors such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell Including solid cancers such as cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, and oval cancer.
  • the present invention relates to the use of HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide for producing the above pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a method for determining the presence or amount of WT1-specific CTL in an HLA-A * 3303-positive subject comprising:
  • the present invention relates to a method comprising the step of examining the presence or amount of CTL that recognizes the complex contained in the sample.
  • the subject-derived sample may be any sample that may contain lymphocytes. Examples thereof include body fluids such as blood and lymph, and tissues.
  • the complex of the WT1 peptide and the HLA-A * 3303 molecule may be in the form of, for example, a tetramer or a pentamer using a method known to those skilled in the art, such as the biotin streptavidin method. .
  • the presence or amount of CTL that recognizes a strong complex can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • the complex may be labeled.
  • label known ones such as a fluorescent label and a radioactive label can be used. Labeling makes it easier and faster to determine the presence or amount of CTL. Using the method of this aspect of the present invention, cancer diagnosis, prognosis, and the like are possible.
  • the present invention also provides a composition comprising a complex of a WT1 peptide and an HLA-A * 3303 molecule for determining the presence or amount of WT1-specific CTL in an HLA-A * 3303 positive subject I will provide a.
  • the present invention provides an HLA comprising a complex of a WT1 peptide and an HLA-A * 3303 molecule.
  • the present invention provides a method for obtaining WT1-specific CTL using a complex of a WT1 peptide and an HLA-A * 3303 molecule,
  • the present invention relates to a method including steps.
  • the complex of WT1 peptide and HLA-A * 3303 molecule is as described above.
  • the sample may be any sample as long as it may contain lymphocytes. Examples thereof include a subject-derived sample such as blood and a cell culture solution. Acquisition of CTL that recognizes the complex can be performed using methods known to those skilled in the art, such as FACS and MACS.
  • the obtained WT1-specific CTL can be cultured and used for treatment or prevention of various cancers.
  • the present invention also relates to a WT1-specific CTL that can be obtained by a method for obtaining a WT1-specific CTL using a complex of a WT1 peptide and an HLA-A * 3303 molecule.
  • the present invention relates to a kit for obtaining a WT1-specific CTL comprising a complex of a WT1 peptide and an HLA-A * 3303 molecule.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding the above-mentioned HLA-A * 3303 restricted WT1 peptide (hereinafter also referred to as WT1 polynucleotide).
  • the polynucleotide of the present invention may be DNA or RNA.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention can be determined based on the amino acid sequence of the HLA-A * 3303 restricted WT1 peptide.
  • the polynucleotide can be produced, for example, by a DNA or RNA synthesis method, a PCR method or the like.
  • the present invention relates to an expression vector (hereinafter also referred to as a WT 1 expression vector) comprising the above polynucleotide.
  • the type of expression vector, sequences contained other than the above-described polynucleotide sequences, and the like can be appropriately selected according to the type, purpose, etc. of the host into which the expression vector is introduced.
  • the expression vector of the present invention is administered to an HLA-A * 3303 positive subject to produce a WT1 peptide in vivo and induce WT1-specific CTL.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer, comprising the WT1 polynucleotide or the WT1 expression vector.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising the WT1 polynucleotide or the WT1 expression vector.
  • the composition, administration method and the like of the pharmaceutical composition of this aspect of the present invention are as described above.
  • the present invention provides a therapeutic or cancer treatment, characterized in that a pharmaceutical composition comprising an effective amount of the above WT1 polynucleotide or WT1 expression vector is administered to an HLA-A * 3303-positive subject. It relates to a method for prevention.
  • Cancers to be treated or prevented include hematopoietic tumors such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, Includes solid cancers such as prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer and ovarian cancer.
  • the present invention relates to the use of a WT1 polynucleotide or WT1 expression vector for producing a pharmaceutical composition comprising the WT1 polynucleotide or WT1 expression vector.
  • the present invention relates to a cell containing the WT1 expression vector.
  • the cells of the present invention can be produced, for example, by transforming host cells such as Escherichia coli, yeast, insect cells, and animal cells using the expression vector.
  • As a method for introducing an expression vector into a host cell various methods can be appropriately selected and used.
  • the peptide of the present invention can also be produced by culturing transformed cells and recovering and purifying the produced WT1 peptide.
  • the present invention relates to a WT1-specific CTL induced by the HLA-A * 3303 restricted WT1 peptide.
  • the CTL of the present invention recognizes a complex of WT1 peptide and HLA-A * 3303 molecule. Therefore, using the CTL of the present invention, HLA-A * 3303-positive and WT1-highly expressing tumor cells can be specifically damaged.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing cancer, which comprises administering WT1-specific CTL to an HLA-A * 3303-positive subject.
  • the WT1-specific CTL administration method depends on conditions such as the type of disease, the condition of the subject, and the target site. It can be selected as appropriate according to the conditions. Examples of the method include, but are not limited to, intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, nasal administration, and oral administration.
  • the present invention provides a method in which peripheral blood mononuclear cells are cultured in the presence of the above-mentioned HLA-A * 3303-restricted WT 1 peptide.
  • the present invention relates to a method for inducing WT1-specific CTL characterized by induction.
  • the subject from which the peripheral blood mononuclear cells are derived may be any as long as it is HLA-A * 3303 positive.
  • WT1-specific CTLs are induced from CTL progenitor cells in peripheral blood mononuclear cells.
  • WT1-specific CTL obtained by the present invention to HLA-A * 3303-positive subjects, hematopoietic tumors and solid cancers in the subjects can be treated or prevented.
  • the present invention relates to a kit for inducing WT1-specific CTL comprising HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide as an essential component.
  • the kit is used in the above-described method for inducing WT1-specific CTL.
  • the kit of the present invention may contain, for example, means for obtaining peripheral blood mononuclear cells, an adjuvant, a reaction container, and the like.
  • an instruction manual is attached to the kit. WT1-specific CTL can be efficiently induced using the kit of the present invention.
  • the present invention provides an antigen-presenting cell (spider cell) that presents the WT1 peptide via the HLA-A * 3303 molecule, which is induced by the HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide. Etc.).
  • an antigen-presenting cell spike cell
  • the WT1-specific CTL is efficiently induced.
  • the present invention provides a method for treating cancer, characterized in that antigen-presenting cells that present the WT1 peptide via HLA-A * 3303 molecules are administered to HLA-A * 3303-positive subjects. Or it relates to a method for prevention.
  • the administration method of antigen-presenting cells can be appropriately selected according to conditions such as the type of disease, the state of the subject, and the target site. Examples of the method include, but are not limited to, intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, nasal administration, and oral administration.
  • immature antigen-presenting cells are cultured in the presence of the above-mentioned HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide, and WT1 peptide is converted from the immature antigen-presenting cells to HLA-A * 3303 molecules.
  • the present invention relates to a method for inducing an antigen-presenting cell that presents a WT1 peptide via an HLA-A * 3303 molecule.
  • An immature antigen-presenting cell refers to a cell that can mature to become an antigen-presenting cell, such as an immature rod-shaped cell.
  • the subject from which immature antigen-presenting cells are derived may be any subject as long as it is HLA-A * 3303-positive. Since immature antigen-presenting cells are contained in, for example, peripheral blood mononuclear cells, vigorous cells may be cultured in the presence of the WT1 peptide.
  • the present invention induces antigen-presenting cells that contain the above-mentioned HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide as an essential component and present the WT1 peptide via an HLA-A * 3303 molecule.
  • the kit is used for the method for inducing antigen-presenting cells.
  • Other components included in the kit of the present invention are as described above. Using the kit of the present invention, antigen-presenting cells that present the WT1 peptide via HLA-A * 3303 molecules can be efficiently induced.
  • the present invention relates to an antibody against an HLA-A * 3303 restricted WT1 peptide or an antibody against a polynucleotide encoding the peptide.
  • the antibody of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody
  • the present invention provides an WT1-specific CTL, an antigen-presenting cell that presents the WT1 peptide via an HLA-A * 3303 molecule, or an antibody against an HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide
  • the present invention relates to a method for diagnosing cancer, which comprises using an antibody against a polynucleotide encoding a peptide.
  • WT1-specific CTL is used in the diagnostic method of the present invention.
  • the CTL, antigen-presenting cell or antibody is incubated with a sample from an HLA-A * 3303-positive subject or administered to an HLA-A * 3303-positive subject, and then the CTL, antigen-presenting cell or For example, cancer can be diagnosed by determining the position, site, amount, etc. of the antibody.
  • the CTL, antigen-presenting cell or antibody may be labeled. By attaching a powerful sign Thus, the diagnostic method of the present invention can be performed efficiently.
  • the present invention provides an WT1-specific CTL, an antigen-presenting cell that presents the WTl peptide via an HLA-A * 3303 molecule, an antibody against an HLA-A * 3303-restricted WT1 peptide,
  • the present invention relates to a cancer diagnostic kit comprising an antibody against a polynucleotide encoding a peptide as an essential component.
  • the HLA-A * 3303 compatible anchor motif (the second amino acid from the N-terminus is Ala, Ile, A 9-amino-acid hydrophilic peptide with Leu, Val, Phe, Tyr, Ser, or Asp (Cg-terminal is Arg), and has a binding affinity for the HLA-A * 3303 molecule Peptides WTl and WT which are estimated to be high
  • Table 1 shows the binding affinity for A * 3303 molecules.
  • Peripheral blood power collected from HLA-A * 3303 positive healthy donors HLA-A * 3303/0207
  • Peripheral blood mononuclear cells PBM C
  • PBMC in a 24-well cell culture plate containing 10% FCS RP Seed at a density of about 1 x 10 7 cells in MI 1640 medium, add culture supernatant of B95-8 cells (EB virus producing cells), and culture at 37 ° C, 5% CO for about 1 month did. Due to EB virus
  • B-LCL cells B-cell lineage tumor cells, were obtained. It was confirmed that the obtained B-LCL cells did not express the WT1 gene.
  • B—LCL cells can be incubated with gZml WT1, WT1, WT1 or WT1 for 2 hours.
  • B-LCL cells pulsed with WT1 peptide were used as antigen-presenting cells in the following experiments.
  • PBMC HLA—A * 3303/1101
  • responder cells were obtained.
  • the obtained 2 ⁇ 10 6 responding cells were co-cultured with 1 ⁇ 10 6 B-LCL cells that had been nor- malized with the same WT1 peptide for 1 week in the complete medium (first stimulation).
  • PBMC were co-cultured with B—LCL cells pulsed with WT1 peptide three more times (2-4 stimulation), with 20 IUZml (final concentration) IL-2 under the following conditions;
  • 2nd stimulation After 3 days, a total of 2 times a day; 3rd and 4th stimulation: The next day after the start of stimulation, a total of 3 times a day was applied.
  • the obtained cells were concentrated using a Negative Selection Columns Gravity Feed Kit (StemSp) so that the CD8 positive T cells were about 80%, and then co-cultured with B-LCL cells pulsed with WT1 peptide ( 5th stimulation).
  • CD8 positive T cells (CTL) 5 days after the start of stimulation were used for the measurement of cytotoxic activity.
  • CTL cells (hereinafter also referred to as single effector cells) are mixed with the target cells that have been intensively incorporated with 51 Cr in a ratio of 1: 1, 5: 1, or 10: 1 (EZT ratio). Prepared to 200 ⁇ l and cultured in a 96-well cell culture plate at 37 ° C, 5% CO for 4 hours. WT1 used for CTL induction as target cell
  • B-LCL cells (BLCL-P) pulsed with the same peptide as the peptide and B-LCL cells (BLCL-NP) not pulsed with WT1 peptide were used. After incubation, centrifuge The supernatant was collected and the amount of 51 Cr released in the supernatant was measured using a liquid scintillation counter. Cytotoxic activity (%) in the following formula:
  • TF-1 cells Cytotoxic activity against tumor cells TF-1 cells (HLA-A * 3303 positive) was determined using the method described above.
  • K562 cells which are HLA-A * 3303-negative cells expressing the WT1 gene, were used. The results are shown in Figs. In the figure, the vertical axis indicates specific lysis (%), and the horizontal axis indicates the EZT ratio.
  • TF-1 is indicated by a solid line and K562 is indicated by a dotted line.
  • CTL force induced by WT1, WT1 and WTl WTl gene is endogenous
  • WT1-expressing B- LCL cells are B- LCL cells into which the human WT1 gene has been introduced, which expresses the WT1 protein in the cell and is processed to produce a peptide with about 9 amino acid strength. Refers to a cell that presents with the HLA-A * 3303 molecule.
  • B-LCL cells B-LCL-CV
  • FIG. 1 the vertical axis shows specific lysis (%), and the horizontal axis shows the EZT ratio.
  • B—LCL—WT1 , B—LCL—CV is indicated by a dotted line.
  • CTL induced with WT1 is HLA-A * 3
  • a WT1 peptide restricted by HLA-A * 3303 a polynucleotide encoding the peptide, a pharmaceutical composition containing the same, and the like are provided. Therefore, in the field of pharmaceuticals, for example, the WT1 gene is highly expressed. It can be used in the development and manufacturing fields of various hematopoietic tumors, solid cancer preventives or therapeutics.

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Abstract

　本発明は、ＷＴ１タンパク質由来の９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、該９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、およびＡｓｐからなる群から選択されるものであり、第９位のアミノ酸がＡｒｇである、ペプチド、およびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらを含む医薬組成物等に関する。

Description

明 細 書
HLA_A*3303拘束性 WT1ペプチド、およびそれを含む医薬組成物 技術分野
[0001] 本発明は、 HLA— A* 3303拘束性 WT1ペプチド、詳細には、 WT1タンパク質由 来の 9個の連続するアミノ酸力 なるアミノ酸配列を含むペプチドであって、該 9個の 連続するアミノ酸力もなるアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸が Ala、 Ile、 Leu, Val、 Ph e、 Tyr、 Ser、および Asp力 なる群力 選択されるものであり、第 9位のアミノ酸が Ar gである、ペプチドに関する。さらに本発明は、該ペプチドをコードするポリヌクレオチ ド、それらを含む癌治療 Z予防用医薬組成物などに関する。
背景技術
[0002] WT1遺伝子 (Wilms' tumor 1 gene)は、小児の腎癌であるウィルムス腫瘍の責任遺 伝子として同定された遺伝子であり（非特許文献 1および 2)、ジンクフィンガー構造を 有する転写因子である。当初、 WT1遺伝子は癌抑制遺伝子であるとされたが、その 後の研究 (非特許文献 3、 4、 5および 6)により、造血器腫瘍や固形癌においてはむ しろ癌遺伝子として働くことが示された。
[0003] WT1遺伝子が多くの悪性腫瘍において高発現していることから、変異のない自己 タンパク質である WT1遺伝子産物の生体内における免疫原性の有無が検証されて きた。その結果、腫瘍細胞で高発現している WT1遺伝子由来のタンパク質は細胞内 プロセッシングにより断片化され、生じたペプチドが MHCクラス I分子と複合体を形成 して細胞表面に提示されること、およびカゝかる複合体を認識する CTLが WT1ぺプチ ドヮクチネーシヨンにより誘導され得ることが明ら力となった (非特許文献 7、 8および 9 )。さらに、 WT1ペプチドまたは WT1 cDNAで免疫されたマウスは、移植された W T1遺伝子発現腫瘍細胞を高 ヽ確率で拒絶するが (非特許文献 7および 10)、 WT1 遺伝子を生理的に発現して ヽる正常組織は誘導された CTLによって傷害されな 、こ とも示された (非特許文献 7)。ヒト細胞を用いたインビトロの実験において、ヒト MHC クラス I分子の 1つである HLA—A*0201分子高結合性 Dbl26ペプチドおよび WH 187ペプチド（配列番号： 1におけるアミノ酸 187— 195、 SLGEQQYSV)を用いて HLA— A*0201を持つヒト末梢血単核球を刺激すると、 WTl特異的 CTLが誘導さ れ、誘導された CTLは内因性に WT1遺伝子を高発現している腫瘍細胞に対し特異 的な傷害活性を有すること、およびカゝかる CTLの傷害活性は HLA—A2拘束性であ ることが示された (非特許文献 11)。 HLA—Aァリールのうち、日本人に最も多い HL A— A*2402に適合する WT1ペプチド (WT1 ；配列番号： 1におけるアミノ酸 235
235
243、 CMTWNQMNL)を用いたヒト細胞でのインビトロの実験において、 WT1 特異的 CTL (TAK— 1)が誘導され (非特許文献 12)、誘導された CTLは、一部 WT 1遺伝子を生理的に発現している正常造血幹細胞のコロニー形成能を抑制しないこ とが示された (非特許文献 13および 14)。これらの報告から、マウスだけでなくヒトに おいても WT1特異的 CTLの誘導が可能であり、カゝかる CTLが WT1遺伝子を高発 現する腫瘍細胞に対しては傷害活性を有するが、 WT1遺伝子を生理的に発現する 正常細胞には傷害活性を有さない可能性が強く示唆された (非特許文献 7、 10、 11 、 12、 13および 14)。
WT1遺伝子産物は核内タンパク質として存在し、細胞質内でプロテアソームによつ てプロセッシングを受け、ペプチドに断片化される。断片化されたペプチドは、 TAP ( transporter associated with antigen processing)力、子によつ飞 /Jヽ胞体内腔へと ¾力れ 、 MHCクラス I分子と複合体を形成し、細胞表面に提示される。 CTL前駆細胞が TC Rを介して WT1ペプチド MHCクラス I分子複合体を認識することによって、 WT1 特異的 CTLが誘導され、 MHCクラス I分子を介して WT1遺伝子産物を提示する腫 瘍細胞に対して細胞傷害作用を発揮する (非特許文献 7、 8および 9)。そうすると、 W T1遺伝子産物を標的とした癌免疫療法にお 、て用いられる WT1ペプチドは、少な くとも生体内で MHCクラス I分子に結合する形態となる必要がある。しかし、 MHCク ラス I分子には多様性があり、それぞれの MHCクラス I分子に結合する WT1ペプチド のアミノ酸配列は異なるため、 MHCクラス Iの型別に適合するペプチドを用意する必 要がある。しかしながら、現在分かっている HLA分子に拘束性の WT1ペプチドは、 HLA— A*2402分子、 HLA— A*0201分子、 HLA— A*2601分子拘束性のもの のみである（それぞれ、特許文献 1、非特許文献 11、および特許文献 2)。 日本人に お！、て、 HLA— A* 2402に次 、で多!ヽ HLA— Aァリールは HLA— A* 3303である ため、 HLA— A* 3303拘束性 WT1ペプチドを見出す必要があった。
特許文献 1：国際公開 2003Z106682号公報
特許文献 2：国際公開 2005Z095598号公報
非特許文献 l : Daniel A. Haber et al.， Cell. 1990 Jun 29;61(7):1257-69.
非特許文献 2 : Call KM et al.， Cell. 1990 Feb 9;60(3):509- 20.
非特許文献 3 : Menke AL et al, Int Rev Cytol. 1998;181:151-212. Review.
非特許文献 4 :Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr l;87(7):2878-84.
非特許文献 5 : Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15;91(8):2969- 76.
非特許文献 6 : Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May;23(5):499- 505.
非特許文献 7 : Oka Y et al., J Immunol. 2000 Feb 15;164(4):1873- 80.
非特許文献 8 : Melief CJ et al., Immunol Rev. 1995 Jun;145:167-77.
非特許文献 9 : Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb;12(2):237-8.
非特許文献 10 : Tsuboi A et al., J Clin Immunol. 2000 May;20(3): 195-202.
非特許文献 11 : Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99— 107.
非特許文献 12 : Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1;95(1):286- 93.
非特許文献 13 : Gao L et al., Blood. 2000 Apr 1;95(7):2198- 203.
非特許文献 14 : Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1;95(1):286- 93.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の解決課題は、 HLA— A* 3303拘束性 WT1ペプチド、およびそれをコー ドするポリヌクレオチド、ならびにそれらを含む癌の治療 Z予防用医薬組成物などを 提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、 WT1タンパク質由来の 9個 の連続するアミノ酸力 なるアミノ酸配列を含むペプチドであって、該 9個の連続する アミノ酸からなるアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸が Ala、 Ile、 Leu、 Val、 Phe、 Tyr、 S er、および Asp力もなる群力も選択されるものであり、第 9位のアミノ酸が Argであるべ プチドが、 WT1特異的 CTLを高い確率で誘導することを見出し、本発明を完成する に至った。
すなわち、本発明は、
(1) WT1タンパク質由来の 9個の連続するアミノ酸力 なるアミノ酸配列を含むぺプ チドであって、該 9個の連続するアミノ酸力もなるアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸が A1 a、 Ile、 Leu、 Val、 Phe、 Tyr、 Ser、および Aspからなる群から選択されるものであり
、第 9位のアミノ酸が Argである、ペプチド、
(2)アミノ酸配列が以下の群：
Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg (配列番号： 2)、
Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys Arg (配列番号： 3)、
Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (配列番号： 4)、および
Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (配列番号： 5)
力ら選択されるものである、（1)記載のペプチド、
(3)アミノ酸配列が Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (配列番号： 4) である、（2)記載のペプチド、
(4) (1)記載のペプチドを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物、
(5)有効量の (4)記載の医薬組成物を HLA— A*3303陽性対象に投与することを 特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
(6) (4)記載の医薬組成物を製造するための（1)記載のペプチドの使用、
(7) (1)記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(8) (7)記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
(9) (7)記載のポリヌクレオチドまたは（8)記載のベクターを含む、癌を治療または予 防するための医薬組成物、
(10)有効量の（9)記載の医薬組成物を HLA—A* 3303陽性対象に投与することを 特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
(11) (9)記載の医薬組成物を製造するための（7)記載のポリヌクレオチドまたは（8) 記載のベクターの使用、
(12) (1)記載のペプチドにより誘導される、 WT1特異的 CTL、
(13)末梢血単核球を（1)記載のペプチドの存在下で培養し、該末梢血単核球から WT1特異的 CTLを誘導することを特徴とする、 WT1特異的 CTLの誘導方法、
(14) (1)記載のペプチドを必須構成成分として含む、 WT1特異的 CTLを誘導する ためのキット、
(15) (1)記載のペプチドにより誘導される、 WT1ペプチドを提示する抗原提示細胞
(16)未熟抗原提示細胞を（1)記載のペプチドの存在下で培養し、該未熟抗原提示 細胞から WT1ペプチドを提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、 WT1 ペプチドを提示する抗原提示細胞の誘導方法、
(17) (1)記載のペプチドを必須構成成分として含む、 WT1ペプチドを提示する抗原 提示細胞を誘導するためのキット、
(18) (12)記載の CTLまたは（ 15)記載の抗原提示細胞を用 、ることを特徴とする、 癌の診断方法、
(19) HLA— A*3303陽性対象における WT1特異的 CTLの存在または量を決定 する方法であって、
(a) WTlペプチドと HLA— A*3303分子との複合体を該対象由来試料と反応さ せ;次に、
(b)該試料に含まれる該複合体を認識する CTLの存在または量を調べる、 工程を含む方法、
(20)複合体がテトラマーの形態である、（19)記載の方法、
を提供するものである。
発明の効果
本発明により、 HLA— A*3303拘束性 WT1ペプチド、およびそれをコードするポリ ヌクレオチド、ならびにそれらを含む癌の治療 Z予防用医薬組成物などが得られるの で、 HLA—A* 3303を有する対象におけるインビボおよびインビトロでの WT1特異 的 CTLの誘導が可能となる。 日本人の約 24%が少なくとも 1つの HLA—A* 3303 分子を有していることから、非常に広範囲の対象において WT1特異的 CTLを誘導 できる。
図面の簡単な説明 [0009] [図 1]図 1は、 WT1 を用いて誘導された CTLの細胞傷害活性を示す。
337
[図 2]図 2は、 WT1 を用いて誘導された CTLの細胞傷害活性を示す。
364
[図 3]図 3は、 WT1 を用いて誘導された CTLの細胞傷害活性を示す。
367
[図 4]図 4は、 WT1 を用いて誘導された CTLの細胞傷害活性を示す。
409
[図 5]図 5は、 WT1 を用いて誘導された CTLの内因性 WT1遺伝子発現細胞に対
364
する細胞傷害活性を示す。
[図 6]図 6は、 WT1 を用いて誘導された CTLの内因性 WT1遺伝子発現細胞に対
367
する細胞傷害活性を示す。
[図 7]図 7は、 WT1 を用いて誘導された CTLの内因性 WT1遺伝子発現細胞に対
409
する細胞傷害活性を示す。
[図 8]図 8は、 WT1 を用いて誘導された CTLの WT1遺伝子発現細胞に対する細
367
胞傷害活性を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0010] ヒト WT1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 1に示す。 WT1遺伝子は、例えば、 白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌 、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮 頸癌、卵巣癌などの固形癌において天然型で高発現している。また、 HLA—A*33 03アンカーモチーフは、第 2位に Ala、 Ile、 Leu、 Val、 Phe、 Tyr、 Ser、および Asp のいずれか、第 9位に Argを有する。従って、本発明は、 1の態様において、 WT1タ ンパク質由来の 9個の連続するアミノ酸力 なるアミノ酸配列を含むペプチドであって 、該 9個の連続するアミノ酸力 なるアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸力 好ましくは A1 a、 Ile、 Leu、 Val、 Phe、 Tyr、 Ser、および Aspからなる群から選択されるものであり 、第 9位のアミノ酸力 好ましくは Argである、 HLA— A*3303拘束性 WT1ペプチド（ 以下、 WT1ペプチドともいう）に関するものである。
[0011] 本発明のペプチドが含む該 9個のアミノ酸力 なるアミノ酸配列のうち好ましいもの は、 Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg (配列番号： 2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys Arg (配列番号： 3)、 Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (配列番号： 4)、または Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (配列番号： 5)であり、最も好ましいものは、 Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (配列番号： 4)である。さらに、配列番号： 2〜5のいずれかにお いて、該 9個のアミノ酸のうち 1個ないし数個、好ましくは 1個ないし 5個のアミノ酸が別 のアミノ酸に置換されたものであってもよい。また、該 9個のアミノ酸および置換された 別のアミノ酸のいずれ力が、適宜修飾されたものであってもよい。但し、いずれの場 合にも、本発明のペプチドが HLA—A* 3303分子との結合能を保持していることが 条件となる。
[0012] 本発明は、上述の通り HLA—A* 3303拘束性を有する WT1ペプチドを得ることを 目的としている。ゆえに、本発明のペプチドは、 WT1タンパク質由来であって、上記
9個の連続するアミノ酸力もなるアミノ酸配列を含んでいればよい。従って、本発明の ペプチドは配列番号： 2〜5に示すアミノ酸配列からなるペプチドそのものであっても よぐあるいは配列番号： 2〜5に示すアミノ酸配列を含む、 WT1タンパク質またはそ の一部であってもよい。本発明のペプチドはまた、上記 9個の連続するアミノ酸力もな るアミノ酸配列の N末端および Zまたは C末端に、種々の物質を結合させることがで きる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。本発明の ペプチドにこれらの物質が結合している場合、これらの物質が例えば、生体内酵素な どにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的に上記 9 個のアミノ酸力もなるアミノ酸配列を生じ、 HLA—A* 3303分子との複合体として細 胞表面に提示されることにより、 CTL誘導効果を得ることができる。これらの物質は、 本発明のペプチドの溶解性を調節するものであってもよぐ耐プロテアーゼ作用等そ の安定性を向上させるものであってもよぐまた例えば、所定の組織'器官に特異的 に本発明のペプチドをデリバリーするようなものであってもよぐあるいはまた抗原提 示細胞の取込み効率を増強させる作用などを有するものであってもよい。これらの物 質はまた、 CTL誘導能を増大させるもの、例えば、ヘルパーペプチドなどであっても よい。
[0013] 本発明のペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの 変法を用いて合成することができる。力かる合成方法は、例えば、 Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976 ;ペプチド合成、丸善 (株）， 1975 ;ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株）， 1985 ；医薬品の開発 続 第 14卷'ペプチド合成、広川書店， 1991などに記載されている
[0014] 本発明のペプチドはまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に 基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手 法は、当業者に周知のものである。
[0015] 本発明は、もう 1つの態様において、上記 HLA— A*3303拘束性 WT1ペプチドを 含む、癌を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。 WT1遺伝子 は、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血 器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、 子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において高発現しているため、本発明の医 薬組成物を癌の治療または予防のために用いることができる。本発明の医薬組成物 が HLA— A*3303陽性対象に投与されると、該医薬組成物に含まれる HLA— A*3 303拘束性 WT1ペプチドにより、 WT1特異的 CTLが誘導され、カゝかる CTLにより対 象中の癌細胞が傷害される。
[0016] 本発明の医薬組成物は、有効成分としての上記 HLA— A* 3303拘束性 WT1ぺ プチド以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物 に含まれる HLA— A*3303拘束性 WT1ペプチドは、 WT1特異的 CTLを誘導する ことから、その誘導効率を増強させるために、本発明の医薬組成物は適当なアジュバ ントを含むか、あるいは適当なアジュバントと共に投与されてもよい。好ましいアジュ バントとしては、例えば、完全または不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニゥ ムなどが挙げられるがこれらに制限されない。
[0017] 本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの 条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、皮内投与、皮下投与 、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限ら ない。本発明の医薬組成物に含まれるペプチドの量、医薬組成物の剤形、投与回数 などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択できるが 、 1回あたりのペプチド投与量は、通常、 0. OOOlmg〜： LOOOmg、好まし <は、 0. 00 lmg〜： LOOOOmgである。
[0018] 本発明は、別の態様において、有効量の上記医薬組成物を HLA—A* 3303陽性 対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するもの である。治療または予防される癌は、いずれのものであってもよぐ例えば、白血病、 骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌 、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵 巣癌などの固形癌を含む。
[0019] 本発明は、なお別の態様において、上記医薬組成物を製造するための HLA—A* 3303拘束性 WT1ペプチドの使用に関する。
[0020] 本発明は、さらなる態様において、 HLA— A* 3303陽性対象における WT1特異 的 CTLの存在または量を決定する方法であって、
(a) WTlペプチドと HLA— A*3303分子との複合体を該対象由来試料と反応さ せ;次に、
(b)該試料に含まれる該複合体を認識する CTLの存在または量を調べる、 工程を含む方法に関するものである。対象由来試料は、リンパ球が含まれている可 能性があればいずれのものであってもよぐ例えば、血液、リンパ液などの体液、組織 などが挙げられる。 WT1ペプチドと HLA— A*3303分子との複合体は、例えば、ビ ォチンストレプトアビジン法などの当業者に既知の方法を用いて、例えば、テトラマー 、ペンタマ一などの形態にされていてもよい。力かる複合体を認識する CTLの存在ま たは量は、当業者に既知の方法により測定することができる。本発明のこの態様にお いて、上記複合体は標識されたものであってもよい。標識としては、蛍光標識、放射 性標識などの公知のものを使用することができる。標識することで、 CTLの存在また は量の決定が容易かつ迅速になる。本発明のこの態様の方法を用いて、癌の診断、 予後診断などが可能になる。
[0021] 従って、本発明はまた、 HLA— A*3303陽性対象における WT1特異的 CTLの存 在または量を決定するための、 WT1ペプチドと HLA—A* 3303分子との複合体を 含む組成物を提供する。
[0022] さらに、本発明は、 WT1ペプチドと HLA— A*3303分子との複合体を含む、 HLA — A*3303陽性対象における WT1特異的 CTLの存在または量を決定するための キットを提供する。
[0023] 本発明は、さらなる態様において、 WT1ペプチドと HLA—A* 3303分子との複合 体を用いて、 WT1特異的 CTLを得る方法であって、
(a)試料と複合体を反応させ、
(b)該試料中に含まれる該複合体を認識する CTLを得る、
工程を含む方法に関するものである。 WT1ペプチドと HLA—A* 3303分子との複 合体については上述の通りである。試料は、リンパ球が含まれている可能性があれば いずれのものであってもよぐ例えば、血液などの対象由来試料、細胞培養液などが 挙げられる。複合体を認識する CTLの取得は、例えば、 FACS、 MACSなど当業者 に既知の方法を用いて行うことができる。得られた WT1特異的 CTLを培養し、種々 の癌の治療または予防に用いることも可能になる。
[0024] 従って、本発明はまた、 WT1ペプチドと HLA— A*3303分子との複合体を用いて 、 WT1特異的 CTLを得る方法により得ることのできる、 WT1特異的 CTLに関するも のである。
[0025] さらに、本発明は、 WT1ペプチドと HLA— A*3303分子との複合体を含む、 WT1 特異的 CTLを得るためのキットに関するものである。
[0026] 本発明は、さらにもう 1つの態様において上記 HLA— A*3303拘束性 WT1ぺプチ ドをコードするポリヌクレオチド（以下、 WT1ポリヌクレオチドともいう）に関するもので ある。本発明のポリヌクレオチドは、 DNAであっても RNAであってもよい。本発明の ポリヌクレオチドの塩基配列は、上記 HLA— A*3303拘束性 WT1ペプチドのァミノ 酸配列に基づき決定できる。該ポリヌクレオチドは、例えば、 DNAまたは RNA合成 方法、 PCR法などにより製造することができる。
[0027] 本発明は、別の態様において上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、 WT 1発現ベクターともいう）に関するものである。発現ベクターの種類、上記ポリヌクレオ チド配列以外で含まれる配列等は、当該発現ベクターを導入する宿主の種類、目的 等に応じて適宜選択できる。本発明の発現ベクターを HLA— A*3303陽性対象に 投与し、生体内において WT1ペプチドを産生させ、 WT1特異的 CTLを誘導し、これ により対象中の造血器腫瘍細胞、固形癌細胞などを傷害することで、該造血器腫瘍 、固形癌の治療または予防を行うことができる。
[0028] 本発明は、さらに別の態様において上記 WT1ポリヌクレオチドまたは上記 WT1発 現ベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。 本発明のこの態様の医薬組成物の組成、投与方法等は、上述の通りである。
[0029] 本発明は、別の態様において、有効量の上記 WT1ポリヌクレオチドまたは WT1発 現ベクターを含む医薬組成物を HLA— A*3303陽性対象に投与することを特徴と する、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防され る癌は、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫 瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮 癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌を含む。
[0030] 本発明は、なお別の態様において、上記 WT1ポリヌクレオチドまたは WT1発現べ クタ一を含む医薬組成物を製造するための WT1ポリヌクレオチドまたは WT1発現べ クタ一の使用に関するものである。
[0031] 本発明は、別の態様において、上記 WT1発現ベクターを含有する細胞に関するも のである。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿 主細胞を上記発現ベクターを用いて形質転換することにより製造することができる。 宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、種々の方法を適宜選択して用いることが できる。形質転換した細胞を培養し、産生された WT1ペプチドを回収'精製すること により、本発明のペプチドを製造することもできる。
[0032] 本発明は、さらなる態様において、上記 HLA— A* 3303拘束性 WT1ペプチドによ り誘導される、 WT1特異的 CTLに関するものである。本発明の CTLは、 WT1ぺプ チドと HLA—A* 3303分子との複合体を認識する。従って、本発明の CTLを用いて 、 HLA— A*3303陽性、かつ WT1高発現腫瘍細胞を特異的に傷害することができ る。
[0033] 本発明は、別の態様において、 WT1特異的 CTLを HLA— A* 3303陽性対象に 投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである 。 WT1特異的 CTLの投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件 に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、 皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない
[0034] 本発明は、別の態様において、末梢血単核球を上記 HLA— A*3303拘束性 WT 1ペプチドの存在下で培養し、該末梢血単核球カゝら WT1特異的 CTLを誘導すること を特徴とする、 WT1特異的 CTLの誘導方法に関するものである。末梢血単核球が 由来する対象は、 HLA—A* 3303陽性であればいずれであってもよい。末梢血単 核球を HLA—A* 3303拘束性 WT1ペプチドの存在下で培養することで、末梢血単 核球中の CTL前駆細胞から WT1特異的 CTLが誘導される。本発明により得られた WT1特異的 CTLを HLA— A*3303陽性対象に投与することで、対象の造血器腫 瘍、固形癌を治療または予防することができる。
[0035] 本発明は、さらに別の態様において、 HLA— A*3303拘束性 WT1ペプチドを必 須構成成分として含む、 WT1特異的 CTLを誘導するためのキットに関するものであ る。好ましくは、該キットは上記 WT1特異的 CTLの誘導方法に用いられる。本発明 のキットは、上記 HLA— A*3303拘束性 WT1ペプチドのほかに、例えば、末梢血単 核球の取得手段、アジュバント、反応容器等を含んでいてもよい。一般的には、キット には取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、 WT1特異的 CTLを効率よく 誘導できる。
[0036] 本発明は、さらなる態様において、上記 HLA— A* 3303拘束性 WT1ペプチドによ り誘導される、 WT1ペプチドを HLA—A* 3303分子を介して提示する抗原提示細 胞 (榭状細胞など）に関するものである。本発明の抗原提示細胞を用いることで、上 記 WT1特異的 CTLが効率よく誘導される。
[0037] 本発明は、別の態様において、上記 WT1ペプチドを HLA— A* 3303分子を介し て提示する抗原提示細胞を HLA— A*3303陽性対象に投与することを特徴とする 、癌を治療または予防するための方法に関するものである。抗原提示細胞の投与方 法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することが できる。当該方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経 鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。 [0038] 本発明は、別の態様において、未熟抗原提示細胞を上記 HLA—A* 3303拘束性 WT1ペプチドの存在下で培養し、該未熟抗原提示細胞から WT1ペプチドを HLA —A* 3303分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、 WT1 ペプチドを HLA— A*3303分子を介して提示する抗原提示細胞の誘導方法に関す るものである。未熟抗原提示細胞は、未熟榭状細胞などの成熟して抗原提示細胞と なり得る細胞をいう。未熟抗原提示細胞が由来する対象は、 HLA— A* 3303陽性で あればいずれのものであってもよい。未熟抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核球 などに含まれて 、るため、力かる細胞を上記 WT1ペプチドの存在下で培養してもよ い。
[0039] 本発明は、さらに別の態様において、上記 HLA— A*3303拘束性 WT1ペプチド を必須構成成分として含む、 WT1ペプチドを HLA— A* 3303分子を介して提示す る抗原提示細胞を誘導するためのキットに関するものである。好ましくは、該キットは 上記抗原提示細胞の誘導方法に用いられる。本発明のキットに含まれるその他の構 成成分等は上述の通りである。本発明のキットを用いて、 WT1ペプチドを HLA— A* 3303分子を介して提示する抗原提示細胞を効率よく誘導できる。
[0040] 本発明は、別の態様において、 HLA— A*3303拘束性 WT1ペプチドに対する抗 体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体に関するものである。 本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい
[0041] 本発明は、さらなる態様において、上記 WT1特異的 CTL、 WT1ペプチドを HLA —A* 3303分子を介して提示する抗原提示細胞、または HLA— A*3303拘束性 W T1ペプチドに対する抗体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗 体を用いることを特徴とする、癌の診断方法に関するものである。好ましくは、 WT1特 異的 CTLが本発明の診断方法に用いられる。例えば、上記 CTL、抗原提示細胞ま たは抗体を HLA— A*3303陽性対象由来の試料とインキュベーションする、あるい は HLA— A*3303陽性対象に投与し、次に該 CTL、抗原提示細胞または抗体の 例えば、位置、部位、量等を決定することで、癌の診断が可能となる。上記 CTL、抗 原提示細胞または抗体は、標識されたものであってもよい。力かる標識を付すことで 、本発明の診断方法を効率よく行うことができる。
[0042] 本発明は、別の態様において、上記 WT1特異的 CTL、 WTlペプチドを HLA— A * 3303分子を介して提示する抗原提示細胞、または HLA— A*3303拘束性 WT1 ペプチドに対する抗体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体を 必須構成成分として含む、癌の診断用キットに関するものである。
[0043] 以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明 を限定するものと解してはならな 、。
実施例 1
[0044] WT1ペプチドの選択
NetMHC2.0プログラム（Technical University of Denmark)を用いて、 WTlタン パク質（配列番号： 1)由来のペプチドから、 HLA— A* 3303適合アンカーモチーフ（ N末端より 2番目のアミノ酸が Ala、 Ile、 Leu、 Val、 Phe、 Tyr、 Ser、または Aspであ り、 C末端が Argである）を有する 9個のアミノ酸力もなる親水性ペプチドであって、 H LA—A* 3303分子に対する結合親和性が高いと推測されるペプチド WTl 、 WT
337
1 、 WT1 および WT1 を選択した。これらのペプチドのアミノ酸配列、 HLA—
364 367 409
A* 3303分子に対する結合親和性を表 1に示す。
[0045] [表 1]
ぺプチド 配列番号 ： 1 ァミノ酸配列 HLA A* 3
における 分子に対する ァミノ酸番号 結合親和性
WT 1337 337〜 345 L SHLQMH S R 1 8. 827
(配列番号： 2)
WT 1364 364〜 372 F SR SDQLKR 1 5. 143
(配列番号： 3)
WT 1367 367〜 375 S DQ LKRHQR 14. 496
(配列番号： 4)
WT 1 409〜 4 17 T SEKPFS CR 1 5. 310
(配列番号： 5)
B— LCL細胞の調製
HLA—A* 3303陽性健常人ドナー（HLA—A* 3303/0207)より採取した末梢 血力 bFicoU— Hypaque gradient density centrifugation法により末梢血単核球（PBM C)を分離した。次に、 PBMCを 24ゥエル細胞培養用プレートに 10% FCS含有 RP MI 1640培地中約 1 X 107個の密度で播種し、 B95— 8細胞（EBウィルス産生細胞 )の培養上清を添カ卩して、 37°C、 5% COで約 1ヶ月間培養した。 EBウィルスにより
2
形質転換された、 B細胞系腫瘍細胞である B— LCL細胞を得た。得られた B— LCL 細胞が WT1遺伝子を発現していないことを確認した。 B— LCL細胞を gZml WT1 、WT1 、WT1 または WT1 と共に 2時間インキュベーションすることで
337 364 367 409
パルスし、次に、放射線 80Gyを照射させた。得られた B— LCL細胞（以下、 WT1ぺ プチドでパルスした B— LCL細胞と、う)を抗原提示細胞として以下の実験に用いた
[0047] WT1特異的 CTLの誘導
PBMC (HLA— A* 3303/1101) 3 X 106個を、 24ゥエル細胞培養用プレートに Χ20 μ g/ml WT1 、WT1 、 WT1 または WT1 を含む完全培地（45%
337 364 367 409
RPMI、 45% AMI— V培地、および 10% ヒト AB血清）中、 37°C、 5% COで 1
2 週間培養し、応答細胞を得た。得られた応答細胞 2 X 106個を、同じ WT1ペプチド でノ ルスした B—LCL細胞 1 X 106個と完全培地中で 1週間共培養した（1回目刺 激）。 PBMCを WT1ペプチドでパルスした B— LCL細胞とさらに 3回共培養し（2〜4 回目刺激)、その際 20IUZml (最終濃度) IL— 2を、次の条件; 2回目刺激:刺激開 始の 3日後から 1日置き計 2回； 3回目および 4回目刺激：刺激開始の翌日力ら 1日置 き計 3回添カ卩した。得られた細胞を、 Negative Selection Columns Gravity Feed Kit (S temSp)を用いて CD8陽性 T細胞が約 80%となるよう濃縮し、次に、 WT1ペプチドで パルスした B— LCL細胞と共培養した（5回目刺激)。刺激開始 5日後の CD8陽性 T 細胞 (CTL)を細胞傷害活性の測定のために用いた。
[0048] CTLの細胞傷害活性
CTLの細胞傷害活性を51 Cr遊離試験を用いて測定した。 CTL細胞（以下、ェフエ クタ一細胞ともいう）を、あら力じめ51 Crを取り込ませた標的細胞と 1 : 1、 5 : 1、または 1 0： 1の比率 (EZT比）となるよう培地 200 μ 1に調製し、 96ゥエル細胞培養用プレー ト中、 37°C、 5% COで 4時間培養した。標的細胞として、 CTL誘導に用いた WT1
2
ペプチドと同じペプチドでパルスした B— LCL細胞（BLCL— P)、および WT1ぺプ チドをパルスしていない B— LCL細胞（BLCL— NP)を用いた。培養後、遠心して上 清を回収し、液体シンチレーシヨンカウンターを用いて、上清中に遊離した51 Cr量を 測定した。細胞傷害活性 (％)を次の式：
(試料上清中の51 Cr遊離量—自然発生51 Cr遊離量) Z (最大51 Cr遊離量-自然発 生51 Cr遊離量） X 100
(自然発生51 Cr遊離量は、 51Crを取り込ませた標的細胞のみを同様の条件で培養し たときの51 Cr遊離量であり、最大51 Cr遊離量は、 51Crを取り込ませた標的細胞を 1% トリトン X— 100を用いて全細胞を溶解させたときの51 Cr遊離量である） を用いて決定した。結果を図 1〜4に示す。図中、縦軸は特異的溶解 (％)を示し、横 軸は EZT比を示す。また、 BLCL— Pを実線、 BLCL— NPを点線で示す。 WT1
337
、WT1 , WTl および WTl を用いて誘導された CTLは、 BLCL— NP細胞と
364 367 409
比較して、 WT1ペプチドを HLA— A* 3303分子との複合体として提示して!/、る BLC L P細胞を特異的に傷害することが確認できた。以下で、 WTl 、WT1 および
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WT1 を用いて誘導された CTLにつ ヽてさらなる実験を行った。
409
[0049] CTLの内因性 WT1遺伝子発現細胞に対する細胞傷害活性
WTl 、WT1 および WTl を用いて誘導された CTLの WTl遺伝子発現腫
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瘍細胞 TF— 1細胞 (HLA— A*3303陽性）に対する細胞傷害活性を上述の方法を 用いて決定した。対照として、 WT1遺伝子を発現している力 HLA— A*3303陰性 細胞である K562細胞を用いた。結果を図 5〜7に示す。図中、縦軸は特異的溶解（ %)を示し、横軸は EZT比を示す。また、 TF— 1を実線、 K562を点線で示す。 WT 1 、WT1 および WTl を用いて誘導された CTL力 WTl遺伝子を内因性に
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発現している細胞に対しても傷害活性を有することが確認できた。
[0050] 次に、 WT1 を用いて誘導された CTLの WT1発現 B— LCL細胞に対する細胞
367
傷害活性を上述の方法を用いて決定した。 WT1発現 B— LCL細胞 (B— LCL W T1)は、ヒト WT1遺伝子を導入した B— LCL細胞であって、細胞内で WT1タンパク 質を発現し、プロセスされて約 9個のアミノ酸力 なるペプチドを HLA—A* 3303分 子と共に提示する細胞をいう。対照として、 WT1遺伝子ではないコントロール遺伝子 を導入した B— LCL細胞 (B— LCL— CV)を用いた。結果を図 8に示す。図中、縦軸 は特異的溶解（％)を示し、横軸は EZT比を示す。また、 B— LCL— WT1を実線で 、 B— LCL— CVを点線で示す。 WT1 を用いて誘導された CTLは、 HLA— A*3
367
303陽性かつ WT1陽性細胞のみを傷害することを確認した。
産業上の利用可能性
本発明により、 HLA— A*3303拘束性の WT1ペプチド、該ペプチドをコードする ポリヌクレオチドおよびそれらを含む医薬組成物等が提供されるので、医薬品等の分 野、例えば、 WT1遺伝子を高発現している種々の造血器腫瘍、固形癌の予防薬、ま たは治療薬の開発、製造分野において利用可能である。

Claims

請求の範囲
[I] WT1タンパク質由来の 9個の連続するアミノ酸力 なるアミノ酸配列を含むペプチド であって、該 9個の連続するアミノ酸力 なるアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸が Ala、 I le、 Leu、 Val、 Phe、 Tyr、 Ser、および Aspからなる群から選択されるものであり、第 9位のアミノ酸が Argである、ペプチド。
[2] アミノ酸配列が以下の群：
Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg (配列番号： 2)、
Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys Arg (配列番号： 3)、
Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (配列番号： 4)、および
Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (配列番号： 5)
力も選択されるものである、請求項 1記載のペプチド。
[3] アミノ酸配列が Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (配列番号： 4)で ある、請求項 2記載のペプチド。
[4] 請求項 1記載のペプチドを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物。
[5] 有効量の請求項 4記載の医薬組成物を HLA—A* 3303陽性対象に投与すること を特徴とする、癌を治療または予防するための方法。
[6] 請求項 4記載の医薬組成物を製造するための請求項 1記載のペプチドの使用。
[7] 請求項 1記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[8] 請求項 7記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[9] 請求項 7記載のポリヌクレオチドまたは請求項 8記載のベクターを含む、癌を治療ま たは予防するための医薬組成物。
[10] 有効量の請求項 9記載の医薬組成物を HLA—A* 3303陽性対象に投与すること を特徴とする、癌を治療または予防するための方法。
[II] 請求項 9記載の医薬組成物を製造するための請求項 7記載のポリヌクレオチドまた は請求項 8記載のベクターの使用。
[12] 請求項 1記載のペプチドにより誘導される、 WT1特異的 CTL。
[13] 末梢血単核球を請求項 1記載のペプチドの存在下で培養し、該末梢血単核球から WT1特異的 CTLを誘導することを特徴とする、 WT1特異的 CTLの誘導方法。
[14] 請求項 1記載のペプチドを必須構成成分として含む、 WT1特異的 CTLを誘導する ためのキット。
[15] 請求項 1記載のペプチドにより誘導される、 WT1ペプチドを提示する抗原提示細 胞。
[16] 未熟抗原提示細胞を請求項 1記載のペプチドの存在下で培養し、該未熟抗原提 示細胞から WT1ペプチドを提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、 W
T1ペプチドを提示する抗原提示細胞の誘導方法。
[17] 請求項 1記載のペプチドを必須構成成分として含む、 WT1ペプチドを提示する抗 原提示細胞を誘導するためのキット。
[18] 請求項 12記載の CTLまたは請求項 15記載の抗原提示細胞を用いることを特徴と する、癌の診断方法。
[19] HLA— A*3303陽性対象における WT1特異的 CTLの存在または量を決定する 方法であって、
(a) WTlペプチドと HLA— A*3303分子との複合体を該対象由来試料と反応さ せ;次に、
(b)該試料に含まれる該複合体を認識する CTLの存在または量を調べる、 工程を含む方法。
[20] 複合体がテトラマーの形態である、請求項 19記載の方法。
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