WO2007085461A2 - Antikoagulation von humanem blut ex vivo - Google Patents

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    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96463—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups

Definitions

  • the present invention relates generally to a method for anticoagulating human blood ex vivo and the use of the anticoagulated blood for the diagnosis of cellular blood components, such as platelets.
  • the present invention relates to a kit for the diagnosis of cellular blood components.
  • the present invention further relates to an inhibitor of the blood coagulation factor Xa and the use of this inhibitor for the anticoagulation of human blood ex vivo.
  • the invention relates to a method for anticoagulation of human blood ex vivo, in which this inhibitor is used.
  • the invention relates to the use of the inhibitor of the blood coagulation factor Xa for the anticoagulation of human blood ex vivo for diagnostic purposes or for the preservation and storage of blood products, such as platelet pheresekonzentraten.
  • the present invention relates to a tube containing this inhibitor for taking blood samples, an apher tube / bag system containing this inhibitor, and a platelet concentrate containing this inhibitor.
  • the present invention relates to a kit for the diagnosis of cellular blood components, such as platelets.
  • the human body suffers hundreds of smaller, but sometimes larger, internal and external injuries day after day. In order for these injuries to remain without major health consequences, the blood clotting system ensures that wounds become wound-tight in the event of injury and the blood solidifies upon exiting the blood vessel.
  • This blood clotting system consists essentially of two components: primary hemostasis, which is due to the function of the platelets, and the plasmatic coagulation, which requires the interaction of a variety of blood coagulation factors.
  • the blood clotting system may be due to acquired or congenital Platelet dysfunction may be altered. This results in bleeding risks of various kinds and can lead to acute life-threatening blood clotting disorders spontaneously or perioperatively.
  • the blood clotting is based on a cascade-like reaction sequence.
  • inactive proenzymes are proteolytically converted into active proteases, which in turn activate the proenzyme following in the cascade.
  • blood coagulation can proceed in two initially different ways, the intrinsic pathway and the extrinsic pathway.
  • the blood coagulation factors XII, XI and IX are first activated.
  • activation of the blood coagulation factor Xa takes place.
  • the extrinsic pathway leads via thromboplastin and the blood coagulation factor VIIa to the activated blood coagulation factor Xa.
  • thrombin blood coagulation factor IIa
  • thrombin causes the soluble plasma protein fibrinogen to be converted into polymerizable fibrin and this deposits as a fibrous network in the primary thrombus.
  • thrombin is not only responsible for the formation of fibrin, but is a potent activator of the platelets.
  • the thrombin formed in the blood coagulation cascade binds to the platelet's high-affinity thrombin receptor, eventually leading to a change in the shape of the platelets from their aggregation and release of procoagulant ingredients.
  • Heparin and hirudin are used as alternative anticoagulants, which do not exert their effect on the complexation of calcium.
  • the inhibitory effect of heparin on the blood clotting system is based on the binding to antithrombin III.
  • Antithrombin III highly irreversibly inactivates serine proteases such as thrombin and other coagulation factors such as XIIa, XIa, Xa and IXa.
  • the interaction of antithrombin III with heparin leads to an increase in the speed of these reactions caused by antithrombin III and thus effectively prevents coagulation.
  • heparin has a high affinity for certain receptors necessary for the activation of platelets, with the result that heparin-treated blood, for example, can not be used for platelet function tests.
  • Hirudin is a high affinity, natural inhibitor of the fibrinogen-cleaving coagulation enzyme thrombin.
  • a sufficient hirudin concentration is able to keep human blood unattended for an extended period of time.
  • hirudin inhibits thrombin exclusively and thus suppresses fibrin formation
  • the coagulation cascade is increasingly activated up to thrombin formation.
  • the thrombin formed is largely bound by the hirudin, some of it is nevertheless able to bind to the high affinity thrombin receptor of the platelets. This leads to the activation of platelets by transforming their form, aggregate and release ingredients. It has been shown that with blood anticoagulation by hirudin no improvement in the diagnosis of platelet function is possible.
  • Citrated whole blood or platelet-rich plasma (PRP) from citrated whole blood is used for the current standard procedures for platelet function diagnostics. Since platelets require calcium ions for their normal functioning, the results of platelet function tests in citrated whole blood do not reflect the conditions in vivo. This circumstance stands in the way of broader use of platelet function tests. If clinically meaningful functional tests could be performed reproducibly in a physiological environment, a screening test for platelet function would be performed prior to each surgical or invasive procedure in order to reliably detect the frequent platelet dysfunctions (thrombocytopathies).
  • platelet function tests to detect platelet function as a risk factor for myocardial infarction and Stroke as well as for monitoring therapy with antiplatelet agents (for example, aspirin, clopidigrel, parenteral antiplatelet agents) are greatly facilitated.
  • antiplatelet agents for example, aspirin, clopidigrel, parenteral antiplatelet agents
  • the invention is therefore based on the object to find a new method for the anticoagulation of human blood, wherein neither the calcium concentration in the blood is changed, nor a formation of thrombin occurs, and wherein the function of the platelets is not affected, so that such anticoagulated blood can be used for the diagnosis of cellular blood components, such as platelets.
  • Another task was to find a connection that would allow the successful completion of this procedure.
  • this inhibitor is a compound according to formula (I),
  • n 2, 3 or 4
  • This method is characterized in that at least one agent with a direct inhibitory action on the blood coagulation factor Xa is added to the withdrawn blood.
  • this agent is a compound according to formula (I).
  • the invention relates to a tube for taking blood samples, an apheresis tube / bag system and a platelet concentrate containing this compound.
  • anticoagulation means that the formation of new thrombin in the withdrawn blood is inhibited.
  • the thrombin formation is inhibited when not more than 1 nM thrombin is newly formed in the blood removed.
  • the prothrombin fragment 1 + 2 (F 1 + 2) is released in equivalent amounts.
  • the concentration of the prothrombin fragment F 1 + 2 formed can be determined, for example, immunologically with commercial enzyme immunoassays (for example Enzygnost F 1 + 2 micro, Dade Behring GmbH, Marburg).
  • anticoagulation therefore means that no more than 1 nM prothrombin fragment F 1 + 2 is newly formed in the blood after it has been taken.
  • the blood present in the sample is anticoagulated for the purposes of the invention until the total concentration of the prothrombin fragment F 1 + 2 in the Blood sample in this example does not exceed 1.3 nM.
  • the concentration of the prothrombin fragment F 1 + 2 in this example will increase widely within a few minutes due to plasmatic coagulation above 1, 3 nM, ie the blood coagulates.
  • the concentration of the prothrombin fragment F 1 + 2 in this example does not exceed 1.3 nM over a long period of time (for example over 48 hours), ie the blood is anticoagulated over this period of time.
  • the duration with which anticoagulation of human blood ex vivo can be maintained using the method of the invention, d. H. the time from the time the blood is drawn to the time more than 1 nM of thrombin has been reconstituted is more than 8 hours, preferably more than 12 hours and more preferably more than 24 hours.
  • thrombin-induced platelet activation is also largely prevented due to the inhibition of thrombin generation.
  • Activation of platelets releases platelet components (for example, platelet factor 4 (PF 4), beta-thromboglobulin, serotonin, ADP / ATP and microparticles) from the platelet granules into the plasma and to express platelet activation markers (for example P-selectin, thrombospondin, multimerin, DC63, LAMP-I, PACl or 9F9).
  • platelet factor 4 PF 4
  • beta-thromboglobulin beta-thromboglobulin
  • serotonin ADP / ATP and microparticles
  • platelet activation markers for example P-selectin, thrombospondin, multimerin, DC63, LAMP-I, PACl or 9F9.
  • blood as used herein includes not only whole blood but also blood generally capable of coagulation in pure, dilute or concentrated form, which blood may have or deviate from its natural composition
  • blood may be platelet rich Plasma (PRP) or other blood products, such as platelet concentrates or platelet pheresekonzentrate.
  • PRP platelet rich Plasma
  • the human blood used for the method according to the present invention may be taken in any manner known to those skilled in the art. Preferably, the blood is removed by venipuncture.
  • ex vivo refers to processes external to the human or animal organism.For the purposes of the invention, “ex vivo” also includes the meaning of "in vitro.” Thus, “ex vivo” refers to both examinations of samples and still existing ones Connection between sample and human or animal, as well as on investigations in which this compound no longer exists. Expressly excluded from the term ex vivo are processes that take place in the human or animal body.
  • the anticoagulation of human blood is achieved ex vivo, when at least one agent with direct inhibitory action on the blood coagulation factor Xa is added to the withdrawn blood.
  • Direct inhibitory action here means that there is an immediate interaction between the inhibitor on the one hand and the molecule to be inhibited on the other hand.
  • the inhibitory effect of an indirect inhibitor is due to the fact that it binds to a direct inhibitor and enhances its inhibitory effect.
  • heparin for example, is an indirect inhibitor of coagulation factors because heparin binds antithrombin III and potentiates its inhibitory potency, but does not interact directly with the coagulation factors to be inhibited.
  • Another example of an indirect inhibitor is an inhibitor that does not bind the molecule to be inhibited, but interacts with a cofactor of that molecule to prevent its function.
  • Direct inhibitors of the blood coagulation factor Xa are therefore inhibitors which enter into a direct interaction with the blood coagulation factor Xa and thus inactivate it.
  • a direct inhibitor of the coagulation factor Xa may also be an inhibitor which directly inhibits the coagulation factor Xa and additionally inhibits further enzymes, for example in the coagulation cascade, before the coagulation factor Xa.
  • the at least one agent exerts a direct inhibitory effect on the blood coagulation factor Xa and at the same time does not impair the activability of the platelets. It is irrelevant what exact structural condition the agent has, as long as it meets these requirements.
  • the prior art recognizes a variety of direct inhibitors of coagulation factor Xa that can be used as an agent in this invention (reviewed in: Quan and Smallheer, Curr Opin In Drug Discovery & Development 7, 460, 2004, Pauls et al. Frontiers in Medicinal Chemistry - Online 1, 129, 2004; Maignan and Mikol, Curr Topics in Med. Chemistry 1, 161, 2001). Although these can not be limited to a few substance classes, some of them can be assigned to certain substance classes.
  • benzamidine derivatives (Song et al., Bioorg Med Med., 13, 297, 2003), bis-benzamidines, benzylamine derivatives, aminobenzisoxazole derivatives, naphthamidine derivatives, ketopiperazine derivatives, 5 Chlorothiophene derivatives, various compounds with bicyclic nuclei, triazole derivatives (Deng et al., 226th ACS National Meeting New York, USA, MEDI 80, 2003), chloroindole derivatives (Sheehan et al., Bioorg. Med. Chem.
  • inhibitors of the invention include BABCH (Pefabloc tPA / Xa, Stzebecher et al., Thromb. Res. 54, 245, 1989), ZK 807834 (Berlex Biosciences, Shaw et al., J. Med. Chem. 41, 3551, 1998 ), FXV 673 (otamixaban, Sanofi-Aventis, Guertin et al., Bioorg Med Chem. Lett 12, 1671, 2002), DPC 423 and DPC 602 (each from Bristol). Myers Squibb; Quan and Wexler, Curr. Topics Med.
  • Preferred inhibitors are otamixaban (2- (R) - (3-carbamimidoylbenzyl) -3 - (R) - [4- (1-oxypyridin-4-yl) benzoylamino] butyric acid methyl ester), Pefabloc tPA / Xa (2,7 Bis (4-amidinobenzylidene) -cycloheptanone (1); Pentapharm Ltd. Basel, Switzerland) and CJ-FXa (benzylsulfonyl-D-arginyl-glycyl-4-amidinobenzylamide).
  • a particularly preferred inhibitor is otamixaban.
  • Another particularly preferred inhibitor is a compound according to formula (I)
  • n 2, 3 or 4
  • MH independently of one another can be H, F, Cl, Br, I, NO 2 , NH 2 , OH, alkyl or alkoxy.
  • the inhibitors of blood coagulation factor Xa described herein may also be present in the form of salts, preferably physiologically acceptable salts, according to the invention.
  • the compounds may be used as salts with acids, such as. As mineral acids or suitable organic acids.
  • the inhibitors according to the invention of the blood coagulation factor Xa according to formula (I) are present as salts of trifluoroacetic acid (TFA).
  • the preferred inhibitor according to the invention of the blood coagulation factor Xa according to formula (I) has the structure P 4 -P 3 -P 2 -P 1 with the following four building blocks:
  • n 2, 3 or 4;
  • P3 a residue of a basic amino acid according to
  • P4 A Benzylsulfonylrest which may be monosubstituted or polysubstituted on the benzene ring, according to
  • Xi, X 2 , X 3 , X 4 , X 5 independently of one another may be H, F, Cl, Br, I, NO 2 , NH 2 , OH, alkyl or alkoxy.
  • the preparation of the preferred inhibitors of the blood coagulation factor Xa according to the invention can be carried out by the application or modification of methods known to the person skilled in the art, which include, for example, methods described in the literature.
  • methods known to the person skilled in the art which include, for example, methods described in the literature.
  • the synthesis of the inhibitors according to the invention in analogy to the synthesis of benzylsulfonyl-D-Arg-Gly-4-amidinobenzylamide described in the literature (Schweinitz et al., Medicinal Chemistry 2, 349-361, 2006).
  • the two blocks corresponding to P4-P3-OH and H-P2-P1 are synthesized.
  • the synthesis of the block P4-P3-OH for example benzylsulfonyl-D-Arg (Pbf) -OH, can be carried out according to Schweinitz et al. (Medicinal Chemistry 2, 349-361, 2006).
  • the block H-P2-P1 for example H-Pro-4-amidinobenzylamide x 2 HCl, can be synthesized according to Steinmetzer and Nowak (WO 02/059065).
  • the respective H-P2-4-amidinobenzylamide derivative is prepared by catalytic hydrogenation (with Pd / C) from the corresponding Cbz-P2-4-acetylhydroxyamidinobenzylamide, which is prepared by coupling the Cbz (carbobenzyloxy) -protected P2-amino acid and H- 4-acetylhydroxyamidinobenzylamine can be obtained.
  • the coupling of the blocks can be carried out, for example, by means of HBTU (2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium afexafluorophosphate) or PyBop (benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium afexafluorophosphate) and diisopropylethylamine in DMF (in the case from Arg in P3 with subsequent cleavage of the Pbf protecting group by means of trifluoroacetic acid).
  • the direct inhibition of the blood coagulation factor Xa is carried out competitively, the competitive inhibitor forming a stoichiometric, reversible complex with the coagulation factor to be inhibited. This is also the case, for example, with the inhibitors of the formula (I) according to the invention.
  • the agent with direct inhibitory action on the blood coagulation factor Xa is a synthetic molecule with a molecular weight ⁇ 1000. It is particularly advantageous that the inhibitors of the blood coagulation factor Xa according to the invention have a strong inhibitory effect on the blood coagulation factor Xa.
  • K 1 represents the dissociation constant of the enzyme inhibitor Complex stands, so for the quotient of the product of the concentrations of enzyme and inhibitor and the concentration of the enzyme-inhibitor complex. Strong inhibitors therefore form stable enzyme-inhibitor complexes and lead to smaller K 1 values than is the case with weaker inhibitors.
  • the K 1 value is preferably determined by measuring the enzyme activity at at least two substrate concentrations and in each case at least three different inhibitor concentrations.
  • the method for determining the K, values is carried out at 25 ° C in Tris buffer (0.05 mol / l, pH 8.0, containing 0.154 mol / 1 NaCl and 5% ethanol).
  • Tris buffer 0.05 mol / l, pH 8.0, containing 0.154 mol / 1 NaCl and 5% ethanol.
  • 200 ⁇ l of inhibitor solution dissolved in the abovementioned Tris buffer
  • the reaction started by addition of 50 ⁇ l of enzyme blood coagulation factor Xa, for example from Haemochrom Diagnostica GmbH, Essen, dissolved in 0.154 mol / 1 NaCl).
  • acetic acid 25 ⁇ l
  • the absorbance of the solution is measured at 405 nm with a Microplate Reader (for example, iEMS Reader MF 1401, Labsystems, Helsinki, Finland).
  • the evaluation is carried out graphically according to the method of Dixon (Biochem J. 55, 170, 1953).
  • the direct inhibitor of coagulation factor Xa acting as the agent in this invention additionally inhibits at least one further enzyme of the early phase of blood coagulation, such as plasma kallikrein and / or blood coagulation factors XIa, XIIa and / or VIIa.
  • the compounds of the formula (I) according to the invention are capable of inhibiting, in addition to the blood coagulation factor Xa, at least one further enzyme of blood coagulation, in particular thrombin.
  • the compound of formula (I) in addition to the blood coagulation factor Xa also inhibits thrombin and / or plasma kallikrein.
  • the inhibitor according to the invention of the blood coagulation factor Xa according to formula (I) shows an inhibitory effect on thrombin with Kj ⁇ 10 nM, preferably ⁇ 5 nM, and very preferably ⁇ 3 nM, or with plasma kallikrein with Kj ⁇ 20 nM, preferably ⁇ 10 nM, and more preferably ⁇ 5 nM.
  • the K; value also stands for the dissociation constant of the particular enzyme-inhibitor complex.
  • the determination of the K 1 values of the inhibitors according to the invention with respect to thrombin and plasma kallikrein is preferably carried out analogously to the above-described determination of the K 1 values of the inhibitors against the blood coagulation factor Xa, but using as substrates CH 3 SO 2 -D-HHT-Gly.
  • the method according to the invention can also be carried out by adding to the blood, in addition to a specific inhibitor of coagulation factor Xa according to formula (I), another inhibitor of coagulation factor Xa according to formula (I) and / or another inhibitor of coagulation factor Xa or of another, For example, in the blood clotting cascade before the blood coagulation factor Xa lying blood coagulation factor, added.
  • human blood can also be anticoagulated ex vivo if no direct inhibitor of the blood coagulation factor Xa is added to it, but at least one inhibitor of other blood coagulation factors (for example plasma kallikrein) which precede the blood coagulation factor Xa in the blood coagulation cascade.
  • these inhibitors usually only lead to success at relatively high concentrations, and in most cases only when the affinity of the inhibitor for the blood coagulation factor to be inhibited is very high.
  • the blood coagulation factor Xa is not inhibited, but, for example, a blood coagulation factor that is active on the intrinsic pathway, then, for example, the formation and activation of thrombin can still take place via the activation of the extrinsic pathway.
  • a blood coagulation factor that is active on the intrinsic pathway then, for example, the formation and activation of thrombin can still take place via the activation of the extrinsic pathway.
  • One reason for the particularly advantageous effect achieved with the inhibitor of the blood coagulation factor Xa according to formula (I) is that it exerts not only a strong inhibitory action on the blood coagulation factor Xa, but additionally also on other blood coagulation factors, such as thrombin and plasma kallikrein.
  • the optimum concentration of the inhibitor to be employed or of the inhibitors to be used for the method according to the invention for the anticoagulation of human blood varies ex vivo. It is dependent on factors known to those skilled in the art, such as the inhibitory potency and inhibitory specificity of the inhibitor. However, it is not a problem and does not require much effort to find out the optimal concentration of the direct inhibitor of the blood coagulation factor Xa for the anticoagulation of human blood ex vivo. This can be done, for example, by adding blood samples with different amounts of the inhibitor and thus adjusting different concentrations of the inhibitor in the blood samples.
  • the amount of prothrombin fragment 1 + 2 (F 1 + 2) in the samples can be determined using, for example, one of the commercially available immunological test kits to assess whether the formation of thrombin has been inhibited, ie Anticoagulation is carried out according to the invention.
  • the optimal concentration of the inhibitor for the method according to the invention can be determined easily and quickly.
  • the inhibitor of the blood coagulation factor Xa according to the invention may be present, for example, dissolved in a suitable solvent.
  • a suitable solvent has a physiological ionic strength and / or a physiological pH.
  • physiological salt solutions such as NaCl solutions, or buffers.
  • the inhibitor of the blood coagulation factor Xa according to formula (I) may also be offset with a preservative known to the person skilled in the art.
  • the anticoagulation is achieved by the method according to the invention by mixing 9 parts of blood and 1 part of a solution containing the inhibitor of the invention.
  • the tube may be, for example, one of the commercially available blood collection tubes known in the art.
  • Exemplary blood collection tubes include monovettes (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany), vacutainer systems (e.g., Becton-Dickinson, Heidelberg, Germany) and modified constructions thereof.
  • the inhibitor according to the invention or the inhibitors according to the invention are present in an amount or such a volume that the Concentration of the inhibitor or inhibitors after filling the tube with blood is sufficiently high to prevent coagulation of the blood according to the invention. In this way, it is possible for medical professionals to achieve anticoagulation of human blood ex vivo without time-consuming work steps.
  • the method according to the invention is used for the anticoagulation of human blood ex vivo for the preservation and storage of blood.
  • the blood that is to be preserved and stored is preferably blood products such as platelet concentrates or platelet pheres concentrates.
  • the respective blood products are prepared in the manner known to a person skilled in the art.
  • Platelet concentrates may be obtained, for example, from platelet-rich plasma (PRP) by high-speed centrifugation, the platelet-containing buffy coat (BC) from stored blood, or from ternary cytocaphenesis concentrates from individual donors.
  • PRP platelet-rich plasma
  • BC buffy coat
  • ternary cytocaphenesis concentrates from individual donors.
  • Platelet pheromone concentrates can be obtained, for example, by using a commercially available cell separator by means of platelet pheresis.
  • the human anticoagulation inhibitor of the present invention is present ex vivo in an amount effective for the method of the invention directly in a blood bag known in the art.
  • the inhibitor according to the invention is particularly preferably present in a collecting bag for receiving blood.
  • this collecting bag is part of an apheresis tube / bag system known to those skilled in the art.
  • This apheresis tube / bag system may have both one or more collection bags containing the inhibitor of the invention.
  • the inhibitor according to the invention can be present, for example, both in a bag in which The whole blood collected from the donor is introduced, as well as in a bag, in which finally the concentrates are collected.
  • the inventive human anticoagulation inhibitor ex vivo is present in a sterile, platelet-containing, infusion bag.
  • the inhibitor of the blood coagulation factor Xa according to the invention can be used to isolate the cellular components of the blood.
  • the inventive method for the anticoagulation of human blood ex vivo is preferably used for diagnostic purposes.
  • the agent with direct inhibitory action on the blood coagulation factor Xa or the blood anticoagulated with this agent according to the invention can be used for the diagnosis of cellular blood constituents.
  • diagnosis of cellular blood components relate in particular to examinations that allow the medical professional to make direct statements about the type, number, size, nature and functionality (eg activity and activability) of cellular blood components ,
  • cellular blood components is intended herein to include, for example, platelets, erythrocytes, reticulocytes and other erythrocytic precursors known to those skilled in the art, as well as leucocytes such as granulocytes, lymphocytes, monocytes, peripheral stem cells and other leukocyte precursors known to those skilled in the art.
  • the methods for the diagnosis of cellular blood components are well known to those skilled in the art. Examples include methods for assessing platelet functions, counting (for example microscopic counting), morphological characterization (for example on stained and unstained blood smears) and typing of cells in blood, preferably by microscopic, cytometric or flow cytometric methods, electronic particle counting, methods for detecting in vivo activation of hemostasis and fibrinolysis, quantification of activated platelet markers, such as platelet factor 4 (PF 4), ⁇ -thromboglobulin, serotonin, ADP / ATP, prothrombin fragment F 1 + 2, thrombin-antithrombin complexes, D-dimers, fibrinogen cleavage products, soluble fibrin or fibrin monomers, plasmin Plasmininhibitor- complexes, tP AP AI complexes, or the electronic and cytochemical (for example, peroxidase) -based morphological characterization and counting of, for example, peripheral le
  • the cellular components can be diagnosed by characterizing cell surface components with labeled antibodies (eg, fluorescently labeled monoclonal antibodies) and counting the cells so marked in the flow cytometer (e.g., by electronic counting).
  • labeled antibodies eg, fluorescently labeled monoclonal antibodies
  • the anticoagulated blood according to the method of the present invention can be used, for example, for all presently used methods for the evaluation of platelet functions.
  • Exemplary methods include spontaneous platelet aggregation following breddin induction
  • platelet components eg ADP / ATP, platelet factor 4, ß-thromboglobulin, serotonin
  • platelet spread for example, according to Breddin
  • Instruments preferred for measurement include the Clot Signature Analyzer (CSA), Cone and Platelet Analyzer (IMPACT), flow cytometer, Ichor-Platelet Works, Laser Platelet Aggregometer (PA-200), Hemostasis Analysis System, Hemostasis, Ultegra (RPFA), Thrombotic Status Analyzer (TSA), Hemodyne Platelet Analysis System, VerifyNow, Platelet-Stat, Multiplate analyzer, and other equipment for impedance aggregometry , as well as various devices for the turbidimetric determination of platelet aggregation according to Born.
  • CSA Clot Signature Analyzer
  • IMPACT Platelet Analyzer
  • flow cytometer Ichor-Platelet Works
  • Laser Platelet Aggregometer PA-200
  • Hemostasis Analysis System Hemostasis
  • Ultegra Ultegra
  • TSA Thrombotic Status Analyzer
  • VerifyNow Platelet-Stat
  • Multiplate analyzer and other equipment for impedance aggrego
  • the invention therefore also encompasses a method for the diagnosis of cellular blood constituents, in which the blood drawn is anticoagulated ex vivo by adding to the blood at least one agent having a direct inhibitory effect on the blood coagulation factor Xa and subsequently examining the cellular constituents of the blood.
  • the method is used for the diagnosis of platelets, wherein, for example, the platelet function tests described above are carried out with the anticoagulated blood according to the invention.
  • a further preferred embodiment of the invention is a kit which comprises at least one inhibitor of the blood coagulation factor Xa according to the invention and a means for the examination of cellular blood constituents.
  • the means for the examination of cellular blood components contained in the kit comprises in particular a unit suitable for the diagnosis of cellular blood components and optionally adapted to a device for the diagnosis of cellular blood components (for example a measuring cell or cartridge).
  • the kit contains an agent for platelet function diagnostics as a means of assaying cellular blood components.
  • This means for platelet function diagnostics may be, for example, a measuring cell, a cartridge or another unit which is adapted to conventional devices for measuring platelet function and can be used for the assessment of platelet function.
  • the kit comprises an activator of the platelets as an agent for platelet function diagnostics or as a further constituent of the kit. This activator can be dissolved in solid form, or dissolved on a medium
  • Platelet function diagnostics carrier present.
  • the carrier can be, for example, a measuring cell known to the person skilled in the art for the measurement of shutter times or another, suitable for the measurement of platelet activity, optionally to a Be adapted from the prior art measuring device adapted unit.
  • the activator itself may be a platelet activator known to those skilled in the art. Examples include ADP, arachidonic acid (AA), thrombospondin, TRAP (thrombin receptor activating protein), collagen or epinephrine called.
  • the inventive method for the anticoagulation of human blood ex vivo offers over the prior art the advantage that although completely the plasmatic coagulation (ie thrombin formation and consequently the fibrin formation by thrombin) is inhibited, but not the activability of the platelets by suitable inducers such as ADP, collagen, arachidonic acid, thrombospondin, epinephrine or TRAP (Thrombin Receptor Activating Protein).
  • suitable inducers such as ADP, collagen, arachidonic acid, thrombospondin, epinephrine or TRAP (Thrombin Receptor Activating Protein).
  • TRAP Thrombin Receptor Activating Protein
  • the inventive method for anticoagulating human blood ex vivo therefore has the significant advantage that the inhibitor according to the invention need not be removed or inactivated before performing tests for the diagnosis of cellular blood components, such as platelet function tests, since it does not affect the platelet function itself ,
  • an inhibitor of the blood coagulation factor Xa according to formula (I) was used as inhibitor.
  • the compound according to formula (II) BAPA 'was used for this purpose.
  • the inhibitors according to the invention are characterized by a very similar inhibitor spectrum.
  • the inhibitors of the blood coagulation factor Xa according to formula (I) inhibit, in addition to the coagulation factor Xa, other, same blood coagulation factors.
  • the K, values of the individual inhibitors according to the invention differ only minimally from these blood coagulation factors, if at all. However, these potential variations in no way compromise the ability of the compounds of formula (I) to successfully inhibit coagulation of human blood ex vivo in the method of the invention.
  • FIG. 1 shows the influence of Pefabloc tPA / Xa, an inhibitor of the blood coagulation factor Xa, on the formation of thrombin after activation with kaolin in hirudin-anticoagulated plasma.
  • control means A hirudin anticoagulated plasma without activation by kaolin addition
  • control + A hirudin anticoagulated plasma plus kaolin
  • the numerical values kaolin-added hirudin anticoagulated plasma plus Pefabloc tPA / Xa in the indicated concentrations.
  • FIG. 2 shows the effect of CJ-PK (benzylsulfonyl-D-seryl-carbobenzoxylysyl-4-amidinobenzylamide, Haemochrom GmbH, Essen), an inhibitor of plasma kallikrein, on the formation of thrombin after activation with kaolin in hirudin-anticoagulated plasma.
  • control means - A hirudin anticoagulated plasma without activation by kaolin addition
  • control + A hirudin anticoagulated Plasma plus kaolin
  • numerical values Kaolin-added, hirudin-anticoagulated plasma plus CJ-PK in the indicated concentrations.
  • FIG. 3 shows the effect of otamixaban, an inhibitor of the blood coagulation factor Xa, on the formation of thrombin after activation with kaolin in hirudin-anticoagulated plasma.
  • control means - A hirudin anticoagulated plasma without activation by kaolin addition
  • control + A kaolin-added, hirudin-anticoagulated plasma
  • the numerical values hirudin-anticoagulated plasma plus kaolin and otamixaban in the indicated concentrations.
  • Figure 6 shows the effect of BAPA 'on the formation of thrombin upon activation with kaolin in hirudin anticoagulated plasma.
  • control means - A hirudin anticoagulated plasma without activation by kaolin addition
  • control + A hirudin anticoagulated plasma plus kaolin
  • the numerical values kaolin-added, hirudin-anticoagulated plasma plus BAPA 'in the indicated concentrations.
  • FIG. 8 shows the platelet aggregation induced by various agonists in BAPA 'or citrate anticoagulated blood.
  • TPA means: Turbidimetric Platelet Aggregation
  • EPA Impedance Whole Blood Platelet Aggregation
  • AA Arachidonic Acid.
  • FIG 9 shows the proportion of aggregated platelets (platelets) in BAPA 'or citrate anticoagulated blood, wherein platelet aggregation was induced with various agonists.
  • PPA means particle number platelet aggregation
  • AA arachidonic acid.
  • FIG 10 shows the occlusion times of BAPA 'or citrate ano-coagulated blood for membranes coated with different agonists.
  • CADP means collagen ADP
  • CEPI collagen epinephrine
  • CT closure time
  • PFA-100 Platelet Function Analyzer 100.
  • Example 1 Inhibitory effect of exemplified inhibitors against the human coagulation factors Xa, VIIa, XIa, XIIa and plasma kallikrein (PK)
  • the inhibitors used here are the commercially available, exemplary inhibitors Pefabloc tPA / Xa (2,7-bis (4-amidinobenzylidene) -cycloheptanone- (1), Pentapharm Ltd. Basel, Switzerland), CJ-FXa (benzylsulfonyl -D-arginyl-glycyl-4-amidinobenzylamide, Haemochrom GmbH, Essen, Germany) and CJ-PK (benzylsulfonyl-D-seryl-carbobenzoxylysyl-4-amidinobenzylamide, Haemochrom GmbH, Essen, Germany).
  • Pefabloc tPA / Xa 2,7-bis (4-amidinobenzylidene) -cycloheptanone- (1), Pentapharm Ltd. Basel, Switzerland
  • CJ-FXa benzylsulfonyl -D-arginyl-glycyl-4-amidinobenzylamide
  • DX-9065a ((+) - (2S) -2- [4 - [[(3S) -l-acetimidoyl-3-pyrrodinyl] oxy] phenyl] -3 - [7-amidino-2-naphthyl] propanoic acid, Daiichi Pharmaceutical Company Ltd. Tokyo, Japan), and otamixaban (2- (R) - (3-carbamimidoylbenzyl) -3- (R) - [4- (1-oxypyridin-4-yl) benzoylamino] -butyric acid methyl ester, Sanofi-A ventis GmbH, Frankfurt, Germany), both of which are in clinical trials, research samples were available.
  • Kj values of the respective enzyme-inhibitor complexes were determined. Determination of Kj values was carried out at 25 ° C in Tris buffer (0.05 mol / l, pH 8.0, containing 0.154 mol / 1 NaCl and 5% ethanol).
  • the enzymes were from the company Haemochrom Diagnostica GmbH (Essen, D) and were dissolved in 0.154 mol / 1 NaCl.
  • the substrates (Pentapharm AG, Basel, CH) were dissolved in H 2 O, the inhibitor in the abovementioned Tris buffer. For the individual enzymes, the following substrates were used:
  • PK plasma kallikrein
  • Example 2 Inhibition of thrombin formation in hirudin-anticoagulated plasma after activation by kaolin by inhibitors of blood coagulation factors
  • thrombin formation in hirudin anticoagulated plasma was activated by the addition of kaolin and the ability of the inhibitors to inhibit thrombin generation was examined.
  • hirudin blood drawn from a patient was anticoagulated using the thrombin inhibitor hirudin.
  • 9 parts of blood were mixed with 1 part of hirudin solution (recombinant hirudin HBW 023, Hoechst, Frankfurt, 2000 U / ml of physiological NaCl solution) and then centrifuged for 10 minutes at 1300 revolutions per minute (rpm).
  • hirudin solution recombinant hirudin HBW 023, Hoechst, Frankfurt, 2000 U / ml of physiological NaCl solution
  • 900 ⁇ l of the supernatant, with hirudin anticoagulated plasma were in polypropylene tubes with 50 .mu.l inhibitor solution or 0.9% NaCl solution and 50 .mu.l of kaolin suspension (from APTT test of Roche Diagnostics, before use 1: 250 diluted with physiological NaCl solution) and at 37 ° C under gently shaking.
  • Kaolin acts as a nonphysiological surface that activates blood clotting, which ultimately stimulates thrombin formation.
  • the amount of thrombin formed was determined immunologically on the basis of the formation of the prothrombin fragment F 1 + 2 (Enzygnost F 1 + 2 micro, Dade Behring GmbH, Marburg). This determination is based on an enzyme immunoassay according to the sandwich principle. For this purpose, aliquot volumes (600 ⁇ l) were anticoagulated with 0.1 M EDTA (40 ⁇ l) at specific times and stored at -20 ° C.
  • prothrombin fragment F 1 + 2 50 ⁇ l of plasma (optionally diluted with PBS, phosphate-buffered saline) were incubated with monoclonal antibodies against the human prothrombin fragment F 1 + 2, which were fixed on a microtiter plate contained in the test kit. After a washing step with PBS, which was used to remove non-antibody-bound sample material, incubation with peroxidase-conjugated antibodies to human prothrombin binding to the free F 1 + 2 determinants was performed.
  • chromogen o-phenylenediamine / H 2 O 2 solution
  • the exemplary inhibitors are capable of effectively suppressing the activation of kaolin-stimulated thrombin generation.
  • inhibitors of the blood coagulation factor Xa with Kj values up to 10 nM such as the inhibitor Pefabloc tPA / Xa (FIG. 1) shown by way of example in FIG. 1, are able to totally suppress thrombin formation at a concentration of 100 ⁇ M.
  • Even very strong inhibitors of the enzymes of the early phase of coagulation, such as the plasma kallikrein inhibitor CJ-PK (Table 1) effectively suppress thrombin formation at a concentration of 100 ⁇ M (FIG. 2).
  • Example 3 Storage of human venous blood after anticoagulation with various inhibitors
  • blood was taken from 12 healthy volunteers within 1 hour. In each case, 1 aliquot of the 12 blood samples with citrate, 1 other aliquot of the 12 blood samples with a direct inhibitor of the blood coagulation factor Xa was anticoagulated. For this purpose, 9 parts of blood were mixed with 1 part citrate (0.106 mol / l) or 1 part inhibitor solution in the appropriate concentration. Platelet-rich plasma (PRP) was prepared by centrifugation at 164 x g for 10 minutes. The platelets were activated in PRP by induced aggregation according to Born with 5 ⁇ mol / 1 ADP, 2 ⁇ g / ml collagen and 0.5 mmol / 1 arachidonic acid.
  • PRP Platelet-rich plasma
  • Impedance whole blood aggregometry was performed with the Multiplate Aggregometer and at 6.5 ⁇ mol / 1 ADP, 3.2 ⁇ g / ml collagen and 0.5 mmol / 1 arachidonic acid. Analyzes were done 1, 2, 3, 4, 5, 10, and 24 hours after blood collection. While the induced aggregations in the citrate-anticoagulated blood had fallen to 20 to 30% of the original value 24 hours after the blood collection, the extent of aggregation in the anticoagulated blood according to the invention did not change.
  • a platelet pheromone concentrate consisting of platelets suspended in plasma was prepared by thrombocytopheresis using a commercially available cell separator using first citrate as the anticoagulant.
  • a satellite bag was integrated containing calcium chloride and a direct inhibitor of the blood coagulation factor Xa according to the invention in physiological solution.
  • the solution in the satellite bag was added to the platelet pheromone concentrate.
  • the addition of calcium ions (recalcification) set a physiological calcium ion concentration in the platelet pheromone concentrate, which served to ensure optimal platelet function.
  • the anticoagulation of the now reginnable plasma, in which the platelets were suspended was prevented according to the invention by the addition of the direct inhibitor of the blood coagulation factor Xa.
  • the platelet pheromone concentrate was stored under 22 ⁇ 2 ° C under constant agitation. After storage for 10 days, the thrombocytapheresis concentrate, which according to the invention was anticoagulated with a direct inhibitor of the blood coagulation factor Xa, still had the same efficacy as conventional thrombocytapheresis concentrates after 5 days.
  • the anticoagulated platelet-pheresis concentrates according to the invention still exhibit the "swirling phenomenon" (the “swirling phenomenon” is based on the light scattering of moving platelets having a normal morphology, and disappears if the normally disc-shaped platelets become abnormal, take spherical shape) and had a pH> 6.7.
  • the platelet count was always greater than> 2 x 10 ⁇ / unit.
  • the aggregation of the platelets was triggered by induction with 2 ug / ml collagen, the maximum amplitude was 25%. Furthermore, the platelet aggregation could also be induced with 5 or 10 .mu.mol / 1 ADP.
  • the inhibitor of the formula (II) 'BAPA' used by way of example for the subsequent investigations was prepared by coupling benzylsulfonyl-D-Arg (Pbf) -OH (prepared according to Schweinitz et al., Med. Chem. 2006, 2, 349-361 ) and H-Pro-4-amidinobenzylamide x 2 HCl (prepared according to WO 02/059065), wherein Pbf is a 2, 2 ', 4, 6, 7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl protecting group.
  • the mixture was stirred at 0 ° C for 30 min and at room temperature (22 ⁇ 2 ° C) for a further 5 h. With vacuum, the solvent was removed and the oily residue was added without further purification with 10 ml of trifluoroacetic acid. After stirring for 1.5 h at room temperature (22 ⁇ 2 ° C), the solvent was concentrated in vacuo and the residue then treated with ether. The precipitated crude product was separated by preparative RP-HPLC. The fractions containing BAPA 'were pooled and lyophilized after partial removal of the solvent.
  • Example 7 Inhibitory effect of BAPA 'on the human coagulation factors Xa, VIIa, XIa, XIIa, plasma kallikrein (PK) and thrombin
  • K. values were carried out at 25 ° C. in Tris buffer (0.05 mol / l, pH 8.0, containing 0.154 mol / l NaCl and 5% ethanol).
  • the enzymes were from the company Haemochrom Diagnostica GmbH (Essen, D), only thrombin was produced in our own laboratory according to Walsmann (Pharmacy 23, 401-402, 1968). All enzymes were dissolved in 0.154 mol / 1 NaCl.
  • the substrates (Pentapharm AG, Basel, CH) were dissolved in H 2 O, the inhibitor in the abovementioned Tris buffer. For the individual enzymes, the following substrates were used:
  • PK plasma kallikrein
  • Example 8 Inhibition of thrombin formation in hirudin-anticoagulated plasma after activation by kaolin by BAPA '
  • thrombin formation in hirudin anticoagulated plasma was activated by the addition of kaolin and the ability of inhibitor BAPA 'to inhibit thrombin generation was examined.
  • hirudin recombinant hirudin HBW 023, Hoechst, Frankfurt, 2000 U / ml of physiological NaCl solution
  • hirudin solution recombinant hirudin HBW 023, Hoechst, Frankfurt, 2000 U / ml of physiological NaCl solution
  • 900 ⁇ l of the supernatant, anticoagulated with hirudin Plasmas were in polypropylene tubes with 50 .mu.l inhibitor solution or 0.9% NaCl solution and 50 .mu.l of kaolin suspension (from APTT test of Roche Diagnostics, before use 1: 250 diluted with physiological NaCl solution) and at Incubated at 37 ° C with gentle shaking. Kaolin prevents this as an unphysiological surface that activates blood clotting, which ultimately stimulates thrombin formation. At certain times, the amount of thrombin formed was determined immunologically on the basis of the formation of the prothrombin fragment F 1 + 2 (Enzygnost F 1 + 2 micro, Dade Behring GmbH, Marburg).
  • This determination is based on an enzyme immunoassay according to the sandwich principle. For this purpose, aliquot volumes (600 ⁇ l) were anticoagulated with 0.1 M EDTA (40 ⁇ l) at specific times and stored at -20 ° C. To determine the concentration of the prothrombin fragment F 1 + 2, 50 ⁇ l of plasma (optionally diluted with PBS, phosphate-buffered saline) were incubated with monoclonal antibodies against the human prothrombin fragment F 1 + 2, which were fixed on a microtiter plate contained in the test kit.
  • BAPA ' is capable of effectively suppressing thrombin formation stimulated by activation with kaolin.
  • BAPA ' which inhibits the blood coagulation factor Xa with a Kj value of 2.4 nM (Table 3), is able to block thrombin formation after kaolin activation> 97% even at a concentration of 0.1 ⁇ M.
  • Example 9 Storage of human venous blood after anticoagulation with BAPA '
  • blood taken from a patient (9 parts) was mixed with inhibitor solution (0.05 mM, 0.5 mM or 5 mM in physiological NaCl solution, 1 part) and incubated at room temperature (about 22 ⁇ 2 ° C ).
  • the amount of thrombin formed was determined immunologically during storage on the basis of the formation of the prothrombin fragment F 1 + 2 (Enzygnost F 1 + 2 micro, Dade Behring GmbH, Marburg). It has been shown that BAPA 'is capable of keeping anticoagulated blood at a concentration in the blood of 500 or 50 ⁇ M for more than 48 hours (Table 4). At a concentration of 5 ⁇ M, BAPA 'prevents coagulation for more than 8 hours.
  • the transmission of light through the respective blood cell suspension is determined quantitatively by means of photometric measurement. Since PRP has only a low transmission for long-wave light due to the light scattering on the suspended, individual platelets, PPP long-wave light, however, almost unhindered the relative percent transmission of light through the sample serves as a measure of aggregation of the platelets. Aggregation of the platelets results in a decrease in the number of light-scattering particles and thus increases the transmission of the sample compared to PRP with non-aggregated platelets.
  • Platelet-rich and platelet-poor plasma (PRP or PPP) was produced for the TPA assays.
  • Platelet-rich plasma was obtained by centrifuging the anticoagulated blood 2, 4, 6, 8, 10 and 24 hours after blood collection at 150 x g for 10 minutes and then removing the supernatant.
  • Low-platelet plasma was obtained by centrifugation at 3500 g for 10 minutes and removal of the supernatant. The platelet count has not been set.
  • AA arachidonic acid
  • ADP arachidonic acid
  • collagen a substance that influences the production of collagen
  • the impedance whole-blood platelet aggregometry is based on the measurement of the change in electrical resistance between two platinum electrodes due to the accumulation of platelets during current flow.
  • the change in resistance is proportional to platelet aggregation.
  • 300 ⁇ l of anticoagulated whole blood were diluted with 300 ⁇ l of physiological saline and prewarmed at 37 ° C. for 3 minutes. Thereafter, 20 ⁇ l of the agonists were added to obtain final concentrations of 0.5 mmol / 1 AA, 6.5 ⁇ mol / 1 ADP and 333.2 ⁇ g / ml collagen.
  • the IPA assays were performed with a Multiplate Analyzer (Instrumentation Laboratory, Kirchheim). Maximum aggregation was recorded at 2, 4, 6, 8, 10, and 24 h after blood collection for 6 minutes each and expressed in arbitrary units (AU). The results are also shown in FIG.
  • PPA Particle number platelet aggregation
  • the closure times were measured using the Platelet Function Analyzer 100 (PFA-100). Measuring cells with membranes coated with different agonists were filled with anticoagulated whole blood. The platelets attached to the membranes, where aggregation of the platelets was activated by contact with the agonists. The resulting aggregation led to a reduction in blood flow.
  • the PFA-100 determined the time to complete membrane occlusion (shutter speed).
  • the measuring cells used were the collagen-epinephrine (CEPI) and the collagen-ADP (CADP) cartridge. The results are shown in FIG.
  • Example 10 The studies carried out in Example 10 show that anticoagulation with the inhibitor according to the invention over citrate allows a significantly higher storage stability of the samples with regard to platelet aggregability. With the method according to the invention, it is thus possible to preserve and store blood products over a long period of time, without causing anticoagulation, and without impairing the activability of the platelets.
  • blood products such as platelet pheresis concentrates can be stored and stored ex vivo over a long period of time using the method of the invention for anticoagulating human blood.
  • a platelet pheromone concentrate consisting of platelets suspended in plasma was prepared by thrombocytopheresis using a commercially available cell separator using first citrate as the anticoagulant.
  • a satellite bag was integrated which contained calcium chloride and a direct inhibitor of the blood coagulation factor Xa according to the invention in physiological solution.
  • the solution in the satellite bag was added to the platelet pheromone concentrate.
  • the addition of calcium ions (recalcification) set a physiological calcium ion concentration in the platelet pheromone concentrate, which was used to ensure optimal Platelet function served.
  • the anticoagulation of the now reginnable plasma, in which the platelets were suspended was prevented by the addition of the direct inhibitor of the blood coagulation factor Xa according to the invention.
  • the platelet pheromone concentrate was stored under 22 ⁇ 2 ° C under constant agitation. After storage for 10 days, the thrombocytapheresis concentrate, which according to the invention was anticoagulated with the direct inhibitor of the blood clotting factor Xa, still had the same efficacy as conventional thrombocytapheresis concentrates after 5 days.
  • the anticoagulated platelet-pheresis concentrates according to the invention still exhibit the "swirling phenomenon" (the “swirling phenomenon” is based on the light scattering of moving platelets having a normal morphology, and disappears if the normally disc-shaped platelets become abnormal, take spherical shape) and had a pH> 6.7.
  • the platelet count was always greater than> 2 x 10 1 '/ unit.
  • the aggregation of the platelets was triggered by induction with 2 ug / ml collagen, the maximum amplitude was 25%. Furthermore, the platelet aggregation could also be induced with 5 or 10 .mu.mol / 1 ADP.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo vor, bei dem die Calcium-Konzentration im Blut unverändert bleibt, es zu keiner Bildung von Thrombin kommt und die Funktion der Thrombozyten nicht beeinflusst wird. Die Erfindung betrifft ferner auch einen für dieses Verfahren vorteilhaften Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa, ein Agens, das einen Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa enthält, und einen Kit zur Diagnosik von zellulären Blutbestandteilen. Das erfindungsgemäß antikoagulierte Blut kann für die Untersuchung von zellulären Blutbestandteilen, wie zum Beispiel für die Thrombozytenfunktionsdiagnostik, eingesetzt werden.

Description

Antikoagulation von humanem Blut ex vivo
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo und die Verwendung des antikoagulierten Bluts für die Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen, wie zum Beispiel Thrombozyten. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit für die Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa und die Verwendung dieses Inhibitors zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo, bei dem dieser Inhibitor verwendet wird. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung des Inhibitors des Blutgerinnungsfaktors Xa zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo für diagnostische Zwecke bzw. für die Haltbarmachung und Lagerung von Blutprodukten, wie Thrombozytapheresekonzentraten. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein diesen Inhibitor enthaltendes Röhrchen zur Entnahme von Blutproben, ein diesen Inhibitor enthaltendes Aphereschlauch-/beutelsystem sowie ein diesen Inhibitor enthaltendes Thrombozytenkonzentrat. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit für die Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen, wie zum Beispiel Thrombozyten.
Der menschliche Körper erleidet Tag für Tag Hunderte meist kleinere, manchmal aber auch größere, innerliche und äußerliche Verletzungen. Damit diese Verletzungen ohne größere Folgen für die Gesundheit bleiben, sorgt das Blutgerinnungssystem dafür, dass es im Fall einer Verletzung zu einem Wundverschluss kommt und das Blut nach dem Austritt aus dem Blutgefäß erstarrt. Dieses Blutgerinnungssystem besteht im Wesentlichen aus zwei Komponenten: der primären Blutstillung, die auf die Funktion der Thrombozyten zurückzuführen ist, und der plasmatischen Gerinnung, die das Zusammenspiel von einer Vielzahl von Blutgerinnungsfaktoren erfordert. Allerdings kann das Blutgerinnungssystem bei vielen Menschen aufgrund von erworbenen oder angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen verändert sein. Dies hat Blutungsrisiken unterschiedlichster Ausprägungen zur Folge und kann spontan oder perioperativ zu akut lebensbedrohlichen Blutgerinnungsstörungen fuhren.
Aus diesem Grund ist es gerade vor operativen oder invasiven Eingriffen notwendig, an vom Patienten stammenden Blutproben die Funktionstüchtigkeit der Thrombozyten zu überprüfen. Allerdings bereitet dabei die plasmatische Gerinnung des Blutes (Fibrinbildungssystem) in der Probe außerordentlich große Schwierigkeiten. Diese führt dazu, dass das Blut nach der Abnahme nur für kurze Zeit vollständig ungeronnen bleibt, und über die Bildung von Thrombin eine rasche Aggregation der Blutplättchen (Thrombozyten) induziert wird. In einer Probe mit aktivierten bzw. aggregierten Thrombozyten lassen sich jedoch keine zuverlässigen Thrombozytenfunktionstests mehr durchfuhren.
Die Blutgerinnung basiert auf einer kaskadenartigen Reaktionsfolge. Dabei werden inaktive Proenzyme proteolytisch in aktive Proteasen umgewandelt, die wiederum das in der Kaskade folgende Proenzym aktivieren. Prinzipiell kann die Blutgerinnung auf zwei anfänglich verschiedenen Wegen verlaufen, dem intrinsischen Weg und dem extrinsischen Weg.
Beim intrinsischen Weg werden ausgehend von der Protease Kallikrein zunächst die Blutgerinnungsfaktoren XII, XI und IX aktiviert. In einer von der Gegenwart von Calciumionen, anionischen Phospholipiden und dem aktivierten Blutgerinnungsfaktor Villa abhängigen Reaktion erfolgt daraufhin die Aktivierung des Blutgerinnungsfaktors Xa. Auch der extrinsische Weg führt über Thromboplastin und den Blutgerinnungsfaktor VIIa zum aktivierten Blutgerinnungsfaktor Xa. Dieser ist bei Anwesenheit von Calciumionen, anionischen Phospholipiden und dem Blutgerinnungsfaktor Va in der Lage, die Bildung von Thrombin (Blutgerinnungsfaktor IIa) aus dem Proenzym Prothrombin zu katalysieren. Thrombin bewirkt schließlich, dass das lösliche Plasmaprotein Fibrinogen in polymerisierbares Fibrin umgewandelt wird und dieses sich als faserartiges Netzwerk im Primärthrombus ablagert. Thrombin ist allerdings nicht nur für die Bildung von Fibrin verantwortlich, sondern stellt einen starken Aktivator der Thrombozyten dar. Dabei bindet das in der Blutgerinnungskaskade gebildete Thrombin an den hochaffinen Thrombin-Rezeptor der Thrombozyten, wodurch schließlich eine Formveränderung (shape change) der Thrombozyten, gefolgt von deren Aggregation und Freisetzung prokoagulatorischer Inhaltsstoffe, induziert wird.
Aus dem Stand der Technik sind mehrere Verfahren bekannt, mit denen sich wirksam eine Verhinderung der Koagulation, also eine Antikoagulation erreichen lässt. Standardmäßig wird dabei Citrat bzw. EDTA eingesetzt. Aufgrund der Komplexierung der Calciumionen wird dabei die Aktivierung der Blutgerinnungsfaktoren VII, IX, X und Prothrombin zunächst völlig unterbunden, so dass es im Blut zu keiner Gerinnung kommt, d. h. es wird weder Fibrin aus Fibrinogen gebildet noch eine Aggregation der Thrombozyten induziert. Nach einiger Zeit wird die Antikoagulation durch Aktivierung des Gerinnungssystems über die Calcium-unabhängigen Faktoren Kallikrein, XII und XI teilweise überspielt, sodass sich letztlich Spuren von Thrombin bilden. Während die Gegenwart von Citrat oder EDTA keinen direkten Einfluss auf die verschiedenen Komponenten des Gerinnungssystems hat, wirkt sich der Entzug von Calciumionen negativ auf die im Blut befindlichen zellulären Bestandteile aus. Jede lebende Zelle benötigt einen intrazellulären Calciumspiegel zur Aufrechterhaltung ihrer normalen Funktionalität. Durch den fortschreitenden Entzug des Calciums nach der Antikoagulation von Blut mittels Citrat oder EDTA kommt es zunächst zur Veränderung bzw. Einschränkung der normalen Funktion der Zellen, was schließlich zum Absterben der Zellen führen kann. Dies betrifft insbesondere die Thrombozyten, gilt aber ebenso für Leukozyten und Erythrozyten.
So zeigt sich bei Thrombozyten sehr deutlich, dass diagnostische Funktionstests in Citrat- bzw. EDTA-Blut/Plasma nur über wenige Stunden nach der Blutabnahme zuverlässige Ergebnisse liefern und diese Ergebnisse nicht die in vivo Verhältnisse widerspiegeln, wo Calciumionen anwesend sind.
Als alternative Antikoagulanzien, die nicht über die Komplexierung von Calcium ihre Wirkung entfalten, werden Heparin und Hirudin eingesetzt. Der Hemmeffekt von Heparin auf das Blutgerinnungssystem beruht auf der Bindung an Antithrombin III. Antithrombin III inaktiviert in hohem Maße irreversibel Serinproteasen, wie Thrombin und weitere Blutgerinnungsfaktoren wie XIIa, XIa, Xa und IXa. Die Interaktion von Antithrombin III mit Heparin führt zur einer Erhöhung der Geschwindigkeit dieser durch Antithrombin III bedingten Reaktionen und unterbindet somit wirksam die Koagulation. Allerdings besitzt Heparin eine hohe Affinität zu bestimmten, für die Aktivierung von Thrombozyten notwendigen Rezeptoren, was dazu führt, dass mit Heparin behandeltes Blut zum Beispiel nicht für Thrombozytenfunktionstests eingesetzt werden kann.
Hirudin ist ein hochaffiner, natürlicher Inhibitor des Fibrinogen-spaltenden Gerinnungsenzyms Thrombin. Tatsächlich ist eine ausreichende Hirudin-Konzentration in der Lage, humanes Blut über einen längeren Zeitraum ungeronnen zu halten. Da allerdings Hirudin ausschließlich Thrombin hemmt und damit die Fibrin-Bildung unterdrückt, kommt es zunehmend zur Aktivierung der Gerinnungskaskade bis hin zur Thrombin-Bildung. Obwohl das gebildete Thrombin zum größten Teil durch das Hirudin gebunden wird, ist trotzdem ein Teil in der Lage, an den hochaffinen Thrombin-Rezeptor der Thrombozyten zu binden. Dies führt zur Aktivierung der Thrombozyten, indem diese ihre Form wandeln, aggregieren und Inhaltsstoffe freisetzen. Es hat sich gezeigt, dass mit einer Antikoagulation des Blutes durch Hirudin keine Verbesserung der Diagnostik der Thrombozytenfunktion möglich ist.
Für die derzeit üblichen Verfahren zur Thrombozytenfunktionsdiagnostik wird Citrat- Vollblut oder plättchenreiches Plasma (PRP) aus Citrat- Vollblut verwendet. Da Thrombozyten für ihre normale Funktionstüchtigkeit Calciumionen benötigen, spiegeln die Ergebnisse der Thrombozytenfunktionstests in Citratvollblut nicht die Verhältnisse in vivo wider. Dieser Umstand steht einer breiteren Anwendung von Thrombozytenfunktionstests sehr im Wege. Gelänge es, klinisch aussagekräftige Funktionstests reproduzierbar im physiologischen Milieu durchzuführen, würde vor jedem operativen oder invasiven Eingriff ein Screeningtest auf die Thrombozytenfunktion hin durchgeführt werden, um die häufigen Thrombozytenfunktionsstörungen (Thrombozytopathien) sicher zu erfassen. Weiterhin würde die Implementierung von geeigneten Thrombozytenfunktionstests zur Erkennung einer Thrombozytenüberfunktion als Risikofaktor für Herzinfarkt und Schlaganfall sowie zur Überwachung einer Therapie mit Thrombozytenfunktionshemmern (zum Beispiel Aspirin, Clopidigrel, parenterale verabreichte Thrombozytenfunktionshemmer) erheblich erleichtert.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein neues Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut zu finden, wobei weder die Calcium-Konzentration im Blut verändert wird, noch eine Bildung von Thrombin erfolgt, und wobei die Funktion der Thrombozyten nicht beeinflusst wird, so dass das derart antikoagulierte Blut für die Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen, wie zum Beispiel Thrombozyten, eingesetzt werden kann. Eine weitere Aufgabe war es, eine Verbindung zu finden, die die erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens ermöglicht.
Überraschend wurde nun gefunden, dass humanes Blut über einen längeren Zeitraum ungeronnen bleibt, ohne dass es zur Bildung von Thrombin oder zur Beeinflussung der Thrombozytenfunktion kommt, wenn die Blutgerinnungskaskade durch einen Hemmstoff des Blutgerinnungsfaktors Xa unterbrochen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser Hemmstoff eine Verbindung gemäß Formel (I),
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(I)
wobei n = 2, 3 oder 4 sein kann, R = -(CH2)m-NH-Y, mit m = 1, 2, 3, 4 oder 5, und Y = H oder sein kann, und Xi, X2, X3, X4, X5
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unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, NO2, NH2, OH, Alkyl oder Alkoxy sein können. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, mit dem sich die Antikoagulation von humanem Blut ex vivo erreichen lässt und das es erlaubt, das antikoagulierte Blut für die Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen, wie zum Beispiel für Thrombozytenfunktionstests, einzusetzen. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass dem entnommenen Blut wenigstens ein Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa zugesetzt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieses Agens eine Verbindung gemäß Formel (I). Weiterhin betrifft die Erfindung ein Röhrchen zur Entnahme von Blutproben, ein Aphereseschlauch- /beutelsystem und ein Thrombozytenkonzentrat, die diese Verbindung enthalten.
Im Sinne der Erfindung bedeutet Antikoagulation, dass die Neubildung von Thrombin in dem entnommenen Blut inhibiert wird. Erfindungsgemäß wird die Thrombin-Neubildung inhibiert, wenn im entnommenen Blut nicht mehr als 1 nM Thrombin neu gebildet wird. Wie oben beschrieben, stellt die Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin einen wesentlichen Schritt in der Blutgerinnungskaskade dar. Dabei wird das Prothrombinfragment 1+2 (F 1+2) in äquivalenten Mengen freigesetzt. Somit wird durch die Bestimmung des entstandenen Fragments die Quantifizierung des tatsächlich entstandenen Thrombins möglich, wodurch das Prothrombinfragment F 1+2 als indirekter Marker einer Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin dienen kann. Die Konzentration des gebildeten Prothrombinfragments F 1+2 kann zum Beispiel immunologisch mit kommerziellen Enzymimmunoassays (zum Beispiel Enzygnost F 1+2 micro, Dade Behring GmbH, Marburg) bestimmt werden.
Erfϊndungsgemäß bedeutet Antikoagulation also, dass nicht mehr als 1 nM Prothrombinfragment F 1+2 im Blut nach dessen Entnahme neu gebildet wird. Beträgt zum Beispiel die anfängliche Konzentration des Prothrombinfragments F 1+2 in der Blutprobe unmittelbar nach der Blutentnahme 0,3 nM, dann ist das in der Probe vorhandene Blut im Sinn der Erfindung solange antikoaguliert, bis die Gesamtkonzentration des Prothrombinfragments F 1+2 in der Blutprobe in diesem Beispiel 1,3 nM nicht überschreitet. Ohne geeignete Behandlung des Bluts zur Verhinderung der Koagulation kommt es aufgrund der plasmatischen Gerinnung innerhalb von wenigen Minuten zu einer Zunahme der Konzentration des Prothrombinfragments F 1+2 in diesem Beispiel auf weit über 1 ,3 nM, d. h. das Blut koaguliert. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erreicht, dass die Konzentration des Prothrombinfragments F 1+2 in diesem Beispiel über einen langen Zeitraum (zum Beispiel über 48 Stunden) 1,3 nM nicht übersteigt, d. h. das Blut ist über diesen Zeitraum antikoaguliert.
Die Dauer, mit der unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Antikoagulation von humanem Blut ex vivo aufrecht erhalten werden kann, d. h. der Zeitraum von der Blutentnahme bis zu dem Zeitpunkt, zu dem mehr als 1 nM Thrombin neu gebildet worden ist, beträgt mehr als 8 Stunden, vorzugsweise mehr als 12 Stunden und noch bevorzugter mehr als 24 Stunden.
Aufgrund der Inhibierung der Thrombin-Bildung wird schließlich auch die durch Thrombin induzierte Aktivierung der Thrombozyten weitgehend verhindert. Bei der Aktivierung der Thrombozyten kommt es zur Freisetzung von Thrombozyten- Inhaltsstoffen (zum Beispiel Plättchenfaktor 4 (PF 4), beta-Thromboglobulin, Serotonin, ADP/ ATP und Mikropartikeln) aus den Thrombozytengranula in das Plasma und zur Expression von Aktivierungsmarkern an der Thrombozytenoberfläche (zum Beispiel P- Selectin, Thrombospondin, Multimerin, DC63, LAMP-I, PACl oder 9F9). Durch die Messung der Konzentration dieser Thrombozyten-Inhaltsstoffe bzw. dieser Aktivierungsmarker (zum Beispiel mittels Testkits, wie beispielhaft für PF4: ELISA PF4, Haemochrom Diagnostica GmbH, Essen) kann die Inhibierung der Aktivierung der Thrombozyten durch Hemmung der Thrombinbildung nachgewiesen werden.
Der hierin verwendete Begriff „Blut" umfasst nicht nur Vollblut, sondern auch allgemein zur Koagulation befähigtes Blut in reiner, verdünnter oder konzentrierter Form, wobei das Blut seine natürliche Zusammensetzung aufweisen oder auch von dieser abweichen kann. Der Begriff Blut kann also zum Beispiel auch plättchenreiches Plasma (PRP) oder andere Blutprodukte, wie Thrombozytenkonzentrate oder Thrombozytapheresekonzentrate umfassen. Das für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete humane Blut kann auf jede, dem Fachmann bekannte Art und Weise entnommen werden. Bevorzugt erfolgt die Entnahme des Blutes durch Venenpunktion.
Erfindungsgemäß verwendet bezieht sich „ex vivo" auf Vorgänge außerhalb des menschlichen oder tierischen Organismus. Im Sinne der Erfindung umfasst „ex vivo" auch die Bedeutung von „in vitro". Somit bezieht sich „ex vivo" sowohl auf Untersuchungen an Proben bei noch bestehender Verbindung zwischen Probe und Mensch oder Tier, als auch auf Untersuchungen, bei denen diese Verbindung nicht mehr besteht. Ausdrücklich ausgenommen von der Bezeichnung ex vivo sind Vorgänge, die sich im menschlichen oder tierischen Körper abspielen.
Erfindungsgemäß wird die Antikoagulation von humanem Blut ex vivo erreicht, wenn dem entnommenen Blut wenigstens ein Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa zugesetzt wird.
Direkte Inhibitorwirkung bedeutet hierbei, dass es zu einer unmittelbaren Interaktion zwischen dem Inhibitor einerseits und dem zu inhibierenden Molekül andererseits kommt. Im Gegensatz dazu ist die Hemmwirkung eines indirekten Inhibitors zum Beispiel darauf zurückzuführen, dass dieser an einen direkten Inhibitor bindet und dessen Hemmwirkung verstärkt. Heparin ist demnach zum Beispiel ein indirekter Inhibitor von Blutgerinnungsfaktoren, da Heparin Antithrombin III bindet und dessen inhibitorische Wirksamkeit potenziert, nicht aber direkt mit den zu inhibierenden Blutgerinnungsfaktoren interagiert. Ein weiteres Beispiel für einen indirekten Inhibitor ist ein Inhibitor, der nicht das zu inhibierende Molekül selbst bindet, sondern mit einem Cofaktor dieses Moleküls interagiert und so dessen Funktion verhindert.
Direkte Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa sind demnach Inhibitoren, die eine direkte Interaktion mit dem Blutgerinnungsfaktor Xa eingehen und diesen somit inaktivieren. Ein Inhibitor, der ein Enzym oder mehrere Enzyme inhibiert, die in der Blutgerinnungskaskade vor dem Blutgerinnungsfaktor Xa stehen, wie zum Beispiel die Blutgerinnungsfaktoren XIIa, XIa, IXa oder VIIa, aber nicht mit dem Blutgerinnungsfaktor Xa interagiert, um dessen Funktion in der Blutgerinnungskaskade zu inhibieren, ist demnach ein indirekter Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa. Andererseits kann ein direkter Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa auch ein Inhibitor sein, der den Blutgerinnungsfaktor Xa direkt inhibiert, und zusätzlich weitere, zum Beispiel in der Blutgerinnungskaskade vor dem Blutgerinnungsfaktor Xa liegende Enzyme inhibiert.
Erfindungsgemäß ist es wesentlich, dass das wenigstens eine Agens eine direkte Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa ausübt und zugleich die Aktivierbarkeit der Thrombozyten nicht beeinträchtigt. Unerheblich ist es dabei, welche genaue strukturelle Beschaffenheit das Agens aufweist, solange es diese Voraussetzungen erfüllt.
Der Stand der Technik kennt eine Vielzahl von direkten Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa, die als Agens in dieser Erfindung verwendet werden können (Übersichtsartikel: Quan und Smallheer, Curr. Opin. In Drug Discovery & Development 7, 460, 2004; Pauls et al., Frontiers in Medicinal Chemistry - Online 1, 129, 2004; Maignan und Mikol, Curr. Topics in Med. Chemistry 1, 161, 2001). Obwohl sich diese nicht auf wenige Stoffklassen beschränken lassen, können einige von ihnen bestimmten Stoffklassen zugeordnet werden. Diese Stoffklassen umfassen zum Beispiel Benzamidin-Derivate (Song et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 297, 2003), Bis-Benzamidine, Benzylamin- Derivate, Aminobenzisoxazol-Derivate, Naphthamidin-Derivate, Ketopiperazine-Derivate, 5-Chlorthiophen-Derivate, verschiedene Verbindungen mit bizyklischen Kernen, Triazol- Derivate (Deng et al. 226th ACS National Meeting New York, USA, MEDI 80, 2003), Chlorindol-Derivate (Sheehan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 2043, 2002), Chlornapthyl-Derivate (Jia et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 1229, 2004), Chlorpyridyl- Derivate (Zhang et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 989, 2004), 1-Aminoisochinolin- Derivate (Song et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 1229, 2004) oder Benzoxazinon- Derivate.
Beispiele für erfindungsgemäße Inhibitoren umfassen BABCH (Pefabloc tPA/Xa; Stürzebecher et al., Thromb. Res. 54, 245, 1989), ZK 807834 (Berlex Biosciences, Shaw et al., J. Med. Chem. 41, 3551, 1998), FXV 673 (Otamixaban, Sanofi- Aventis; Guertin et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 1671, 2002), DPC 423 und DPC 602 (jeweils von Bristol- Myers-Squibb; Quan und Wexler, Curr. Topics Med. Chem. 1, 137, 2001), DPC 906 (Razaxaban; Batt et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 5269, 2004), DX-9065a (Daiichi; Katakura et al., Biochem. Biophys. Res. Chem. 197, 965, 1993), YM-60828 (Yamanouchi Pharmaceutical Co.; Hirayama et al., Bioorg. Med. Chem. 11, 367, 2003), RPR 209685 (Sanofi-Aventis; Choi-Sledeski et al., J. Med. Chem. 46, 68, 2003), BAY 59-7939 (Bayer; Perzborn et al., J. Thromb. Haemost. 3, 514, 2005), EMD 495235 (Merck Darmstadt; Mederski et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 3763, 2004; Mederski et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 5817, 2004), PD-198961 (Pfizer; Willardsen et al., J. Med. Chem. 47, 4089, 2004), Pefabloc tPA/Xa (Pentapharm Ltd. Basel, Schweiz) und CJ-FXa (Haemochrom Diagnostica GmbH, Essen). Als bevorzugte Inhibitoren stellen sich Otamixaban (2-(R)-(3 -carbamimidoylbenzyl)-3 -(R)- [4-( 1 -oxypyridin-4- yl)benzoylamino]buttersäuremethylester), Pefabloc tPA/Xa (2,7-Bis(4- amidinobenzyliden)-cycloheptanon-(l); Pentapharm Ltd. Basel, Schweiz) und CJ-FXa (Benzylsulfonyl-D-arginyl-glycyl-4-amidinobenzylamid) heraus. Als besonders bevorzugter Inhibitor erweist sich Otamixaban.
Ein weiterer besonders bevorzugter Inhibitor ist eine Verbindung gemäß Formel (I)
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(I),
wobei n = 2, 3 oder 4 sein kann, R = -(CH2)m-NH-Y, mit m = 1, 2, 3, 4 oder 5, und Y = H oder / sein kann, und X1, X2, X3, X4, X5
MH unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, NO2, NH2, OH, Alkyl oder Alkoxy sein können. Ein weiterer für das Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugter Inhibitor ist ein Inhibitor gemäß Formel (I), wobei n = 3 oder 4 ist, R = -(CH2)m-NH-Y, mit m = 2, 3 oder 4, und Y = H oder ist > und χi> X2, X3, X4 und X5
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unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, NO2, NH2, OH, Alkyl oder Alkoxy sind.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung ist der Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa eine Verbindung gemäß Formel (I), wobei n = 3 ist, R = -(CH2)m-NH- Y, mit m = 3 und Y = /** ist, und X1 , X2, X3, X4, X5
NH jeweils H sind. Diese Verbindung besitzt die Struktur gemäß Formel (II)
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(H)
und wird im Folgenden auch als Benzylsulfonyl-D-Argininyl-Prolyl-4- Amidinobenzylamid oder kurz BAPA' bezeichnet.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa eine Verbindung gemäß Formel (I), wobei n = 2 ist, R = -(CH2)B1-NH-Y, mit m = 3 und Y = -i KUL ist, und X1, X2, X3, X4 und X5
NH jeweils H sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa eine Verbindung gemäß Formel (I), wobei n = 3 ist, R = - (CH2)m-NH-Y, mit m = 4 und Y = H ist, und Xi, X2, X3, X4 und X5 jeweils H sind.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa eine Verbindung gemäß Formel (I), wobei n = 3 ist, R = -(CH2)m-NH-Y, mit m = 3 und ist, X1, X2, X4 und X5 jeweils H sind, und X3
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Cl ist.
Die hierin beschriebenen Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa können gemäß der Erfindung auch in der Form von Salzen, bevorzugt physiologisch akzeptablen Salzen vorliegen. Beispielsweise können die Verbindungen als Salze mit Säuren, wie z. B. Mineralsäuren oder geeigneten organischen Säuren vorliegen. Bevorzugt liegen die erfindungsgemäßen Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) als Salze der Trifluoressigsäure (TFA) vor.
Grob vereinfacht weist der bevorzugte erfindungsgemäße Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) die Struktur P4-P3-P2-P1 mit den folgenden vier Bausteinen auf:
P 1 : Ein 4- Amidinobenzylaminrest gemäß
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P2: Ein Rest einer zyklischen Aminosäure gemäß (Ctfe)n
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mit n = 2, 3 oder 4;
P3: Ein Rest einer basischen Aminosäure gemäß
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mit R = -(CH2)m-NH-Y, wobei m = 1, 2, 3, 4 oder 5, und Y = H oder
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P4: Ein Benzylsulfonylrest, der am Benzolring einfach oder mehrfach substituiert sein kann, gemäß
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wobei Xi, X2, X3, X4, X5 unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, NO2, NH2, OH, Alkyl oder Alkoxy sein können.
Die Darstellung der bevorzugten erfindungsgemäßen Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa kann durch die Anwendung oder Abwandlung von dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen, wobei darunter zum Beispiel in der Literatur beschriebene Verfahren zu verstehen sind. Zum Beispiel kann die Synthese der erfindungsgemäßen Inhibitoren in Analogie zu der in der Literatur beschriebenen Synthese von Benzylsulfonyl-D-Arg-Gly-4-Amidinobenzylamid erfolgen (Schweinitz et al., Medicinal Chemistry 2, 349-361, 2006). Dazu werden zunächst die zwei Blöcke entsprechend P4-P3-OH und H-P2-P1 synthetisiert. Die Synthese des Blockes P4-P3-OH, beispielsweise Benzylsulfonyl-D-Arg(Pbf)-OH kann gemäß Schweinitz et al. (Medicinal Chemistry 2, 349-361, 2006) erfolgen. Der Block H-P2-P1, beispielsweise H-Pro-4- Amidinobenzylamid x 2 HCl, kann gemäß Steinmetzer und Nowak (WO 02/059065) synthetisiert werden. Dabei wird das jeweilige H-P2-4-Amidinobenzylamid-Derivat durch katalytische Hydrierung (mit Pd/C) aus dem entsprechenden Cbz-P2-4- Acetylhydroxyamidinobenzylamid hergestellt, das durch Kopplung der Cbz (Carbobenzyloxy) -geschützten P2- Aminosäure und H-4- Acetylhydroxyamidinobenzylamin erhalten werden kann.
Die Kopplung der Blöcke kann zum Beispiel mittels HBTU (2-(lH-Benzotriazol-l-yl)- 1,1,3,3-tetramethyluronium Ηexafluorophosphat) oder PyBop (Benzotriazol-1- yloxytripyrrolidinophosphonium Ηexafluorophosphat) und Diisopropylethylamin in DMF (im Falle von Arg in P3 mit anschließender Abspaltung der Pbf-Schutzgruppe mittels Trifluoressigsäure) erfolgen. Dem Fachmann ist klar, dass die Synthese der erfindungsgemäßen Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) selbstverständlich auch auf einem anderen als dem vorstehend beschriebenen Weg erfolgen kann, beispielsweise unter Verwendung eines P2-P1 -Bausteins, bei dem die Amidinogruppe als Acetylhydroxyamidin oder als Cbz-geschütztes Amidin vorliegt (Schweinitz et al., J. Biol. Chem. 279, 33613-33622, 2004).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die direkte Inhibierung des Blutgerinnungsfaktors Xa kompetitiv, wobei der kompetitive Inhibitor mit dem zu hemmenden Blutgerinnungsfaktor einen stöchiometrischen, reversiblen Komplex bildet. Dies ist bspw. auch bei den erfindungsgemäßen Inhibitoren gemäß Formel (I) der Fall.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa ein synthetisches Molekül mit einem Molekulargewicht < 1000. Besonders vorteilhaft ist, dass die erfindungsgemäßen Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa eine starke Inhibitorwirkung gegenüber dem Blutgerinnungsfaktor Xa aufweisen. Für das erfindungsgemäße Verfahren sind insbesondere solche Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa vorteilhaft, die eine direkte Inhibitorwirkung gegenüber dem Blutgerinnungsfaktor Xa mit K1 < 10 nM, vorzugsweise < 5 nM, insbesondere < 3 nM erzielen, wobei K1 für die Dissoziationskonstante des Enzym-Inhibitor-Komplexes steht, also für den Quotienten aus dem Produkt der Konzentrationen von Enzym und Inhibitor und der Konzentration des Enzym-Inhibitor- Komplexes. Starke Inhibitoren bilden demnach stabile Enzym-Inhibitor-Komplexe und führen zu kleineren K1- Werten als dies bei schwächeren Inhibitoren der Fall ist. Die Bestimmung des K1- Wertes erfolgt bevorzugt durch die Messung der Enzymaktivität bei wenigstens zwei Substratkonzentrationen und jeweils wenigstens drei unterschiedlichen Inhibitor-Konzentrationen. Das Verfahren zur Bestimmung der K,-Werte erfolgt bei 25°C in Tris-Puffer (0,05 mol/1, pH 8,0, enthaltend 0,154 mol/1 NaCl und 5% Ethanol). Dazu werden 200 μl Inhibitor-Lösung (gelöst im oben genannten Tris-Puffer) mit 25 μl Substrat (CH3OCO-D-Cha-Gly-Arg-pNA; mit Cha = Cyclohexylalanin und pNA = para- Nitroanilin; vertrieben von Pentapharm AG, Basel, Schweiz unter dem Handelsnamen Pefachrome FXa; gelöst in H2O) gemischt und die Reaktion durch Zugabe von 50 μl Enzym (Blutgerinnungsfaktor Xa, zum Beispiel von Haemochrom Diagnostica GmbH, Essen; gelöst in 0,154 mol/1 NaCl) gestartet. Nach einer Reaktionszeit von 3 - 5 Minuten wird Essigsäure (25 μl) zugegeben und die Extinktion der Lösung bei 405 nm mit einem Microplate Reader (zum Beispiel iEMS Reader MF 1401, Labsystems, Helsinki, Finnland) gemessen. Die Auswertung erfolgt graphisch gemäß der Methode von Dixon (Biochem J. 55, 170, 1953).
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform inhibiert der als Agens in dieser Erfindung fungierende direkte Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa zusätzlich wenigstens ein weiteres Enzym der Frühphase der Blutgerinnung, wie zum Beispiel Plasma-Kallikrein und/oder die Blutgerinnungsfaktoren XIa, XIIa und/oder VIIa. Dadurch kann die beginnende Blutgerinnungsaktivierung schon auf einer frühen Stufe beeinflusst werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formel (I) sind überraschenderweise in der Lage, neben dem Blutgerinnungsfaktor Xa wenigstens ein weiteres Enzym der Blutgerinnung, insbesondere Thrombin zu hemmen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hemmt die Verbindung gemäß Formel (I) neben dem Blutgerinnungsfaktor Xa auch Thrombin und/oder Plasma-Kallikrein. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform zeigt der erfindungsgemäße Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) eine Inhibitorwirkung gegenüber Thrombin mit Kj < 10 nM, bevorzugt < 5 nM, und ganz bevorzugt < 3 nM, bzw. gegenüber Plasma- Kallikrein mit Kj < 20 nM, bevorzugt < 10 nM, und ganz bevorzugt < 5 nM. Der K;- Wert steht auch hier für die Dissoziationskonstante des jeweiligen Enzym-Inhibitor-Komplexes. Die Bestimmung der K;- Werte der erfindungsgemäßen Inhibitoren gegenüber Thrombin und Plasma-Kallikrein erfolgt bevorzugt analog zu der oben beschriebenen Bestimmung der Kj- Werte der Inhibitoren gegenüber dem Blutgerinnungsfaktor Xa, wobei jedoch als Substrate CH3 SO2-D-HHT-GIy- Arg-pNA (mit HHT = Hexahydrotyrosin, und pNA = para-Nitroanilin; vertrieben unter dem Handelsnamen Pefachrome tPA) im Fall von Thrombin bzw. Bz-Pro-Phe-Arg-pNA (mit Bz = Benzyl-, und pNA = para-Nitroanilin; vertrieben unter dem Handelsnamen Chromozym PK) im Fall von Plasma-Kallikrein eingesetzt werden.
Weiterhin kann es bevorzugt sein, nicht nur einen, sondern mehrere verschiedene Inhibitoren mit unterschiedlich spezifischer Inhibitorwirkung gegenüber dem Blutgerinnungsfaktor Xa und gegebenenfalls weiteren Blutgerinnungsfaktoren für das erfindungsgemäße Verfahren einzusetzen. Dadurch lässt sich zum Beispiel eine kombinierte Hemmaktivität erreichen, die die Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens verstärkt. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren auch durchgeführt werden, indem man dem Blut zusätzlich zu einem bestimmten Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) einen weiteren Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) und/oder einen anderen Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa oder eines anderen, zum Beispiel in der Blutgerinnungskaskade vor dem Blutgerinnungsfaktor Xa liegenden Blutgerinnungsfaktors, zusetzt. Es soll an dieser Stelle ausdrücklich angemerkt werden, dass sich die Antikoagulation von humanem Blut ex vivo auch erreichen lässt, wenn dem entnommenen Blut wenigstens ein Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf einen anderen Blutgerinnungsfaktor als Xa zugesetzt wird. So kann humanes Blut ex vivo erfindungsgemäß auch antikoaguliert werden, wenn diesem kein direkter Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa, sondern wenigstens ein Inhibitor von anderen, zum Beispiel in der Blutgerinnungskaskade vor dem Blutgerinnungsfaktor Xa stehenden Blutgerinnungsfaktoren (zum Beispiel Plasma- Kallikrein) zugesetzt wird. Allerdings führen diese Inhibitoren in der Regel erst in relativ hohen Konzentrationen zum Erfolg, und meistens auch nur dann, wenn die Affinität des Inhibitors zu dem zu inhibierenden Blutgerinnungsfaktor sehr hoch ist. Es hat sich gezeigt, dass die Inhibierung des Blutgerinnungsfaktors Xa zwar nicht der einzige Ansatzpunkt für eine effektive Antikoagulation von humanem Blut ex vivo ist, allerdings gegenüber der Inhibierung anderer Blutgerinnungsfaktoren der weitaus bevorzugteste. Obwohl diese Erfindung nicht durch den zugrunde liegenden Mechanismus eingeschränkt sein soll, könnten die oben beschriebenen Phänomene darauf zurückzuführen sein, dass sowohl der intrinsische als auch der extrinsische Weg der Blutgerinnung zum aktivierten Blutgerinnungsfaktor Xa führen. Somit ist die Aktivität des Blutgerinnungsfaktors Xa für die Bildung und Aktivierung von Thrombin unerlässlich, wodurch dessen Inhibierung zur Antikoagulation führt. Wird dagegen jedoch nicht der Blutgerinnungsfaktor Xa inhibiert, sondern zum Beispiel ein auf dem intrinsischen Weg aktiver Blutgerinnungsfaktor, dann kann zum Beispiel die Bildung und Aktivierung von Thrombin immer noch über die Aktivierung des extrinsischen Wegs erfolgen. Ein Grund für die besonders vorteilhafte Wirkung, die mit dem Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) erzielt wird, ist, dass dieser nicht nur eine starke Hemmwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa ausübt, sondern zusätzlich auch auf weitere Blutgerinnungsfaktoren, wie zum Beispiel Thrombin und Plasma-Kallikrein.
Dem Fachmann ist klar, dass die optimale Konzentration des einzusetzenden Inhibitors oder der einzusetzenden Inhibitoren für das erfindungsgemäße Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo variiert. Sie ist von dem Fachmann bekannten Faktoren abhängig, wie zum Beispiel der Hemmstärke und der Hemmspezifität des Inhibitors. Allerdings ist es kein Problem und erfordert auch keinen großen Aufwand, die optimale Konzentration des direkten Inhibitors des Blutgerinnungsfaktors Xa zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo herauszufinden. Dies kann zum Beispiel geschehen, indem man Blutproben mit unterschiedlichen Mengen des Inhibitors versetzt und so unterschiedliche Konzentrationen des Inhibitors in den Blutproben einstellt. Danach kann zu gewünschten Zeitpunkten einfach die Menge des Prothrombinfragments 1+2 (F 1+2) in den Proben mit Hilfe von zum Beispiel einem der kommerziell erhältlichen immunologischen Testkits bestimmt werden, um zu beurteilen, ob die Bildung von Thrombin inhibiert worden ist, also Antikoagulation erfindungsgemäß erfolgt ist. Auf diese Weise kann die optimale Konzentration des Inhibitors für das erfindungsgemäße Verfahren einfach und schnell ermittelt werden.
Für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann der erfindungsgemäße Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa zum Beispiel in einem geeigneten Solvens gelöst vorliegen. Vorzugsweise weist ein geeignetes Solvens eine physiologische Ionenstärke und/oder einen physiologischen pH- Wert auf. Beispiele hierfür sind physiologische Salzlösungen, wie zum Beispiel NaCl-Lösungen, oder Puffer. Ferner kann der Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) auch mit einem dem Fachmann bekannten Konservierungsmittel versetzt vorliegen.
Vorzugsweise wird die Antikoagulation nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erreicht, indem 9 Teile Blut und 1 Teil einer den erfindungsgemäßen Inhibitor enthaltenden Lösung gemischt werden.
Aus praktischen Gründen ist es oft vorteilhaft, wenn der erfindungsgemäße Inhibitor direkt in einem Röhrchen zur Entnahme von Blutproben vorliegt. Das Röhrchen kann zum Beispiel eines der aus dem Stand der Technik bekannten und kommerziell erhältlichen Blutentnahmeröhrchen sein. Beispielhafte Blutentnahmeröhrchen umfassen Monovetten (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland), Vacutainer-Systeme (z. B. der Firma Becton-Dickinson, Heidelberg, Deutschland) und modifizierte Bauweisen davon.
Vorzugsweise legt man den erfindungsgemäßen Inhibitor bzw. die erfindungsgemäßen Inhibitoren in einer solchen Menge oder einem solchen Volumen vor, dass die Konzentration des Inhibitors oder der Inhibitoren nach dem Befullen des Röhrchens mit Blut ausreichend hoch ist, um die Koagulation des Blutes erfindungsgemäß zu verhindern. Auf diese Weise wird es dem medizinischen Fachpersonal ermöglicht, eine Antikoagulation von humanem Blut ex vivo ohne aufwändige Arbeitsschritte zu erreichen.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo zur Haltbarmachung und Lagerung von Blut verwendet. Bevorzugt handelt es sich bei dem haltbar zu machenden und zu lagernden Blut um Blutprodukte, wie Thrombozytenkonzentrate oder Thrombozytapheresekonzentrate.
Die jeweiligen Blutprodukte werden auf die für einen Fachmann bekannte Weise hergestellt.
Thrombozytenkonzentrate können zum Beispiel aus plättchenreichem Plasma (PRP) durch Zentrifugation bei hoher Umdrehungszahl, dem thrombozytenhaltigen Buffy-Coat (BC) von Blutkonserven oder aus Tnrombozytapheresekonzentraten von einzelnen Spendern gewonnen werden.
Thrombozytapheresekonzentrate können zum Beispiel unter Verwendung eines handelsüblichen Zellseparators mittels Thrombozytapherese gewonnen werden.
Es ist zum Beispiel in diesen Fällen oft bevorzugt, wenn der erfindungsgemäße Inhibitor zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo in einer für das erfindungsgemäße Verfahren wirksamen Menge direkt in einem, aus dem Stand der Technik bekannten Blutbeutel vorliegt. Besonders bevorzugt liegt der erfindungsgemäße Inhibitor in einem Auffangbeutel zur Aufnahme von Blut vor. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn dieser Auffangbeutel Teil eines dem Fachmann bekannten Aphereseschlauch-/beutelsystems ist. Dieses Aphereseschlauch-/beutelsystem kann sowohl einen als auch mehrere Auffangbeutel aufweisen, die den erfindungsgemäßen Inhibitor enthalten. Der erfindungsgemäße Inhibitor kann zum Beispiel sowohl in einem Beutel vorliegen, in dem das vom Spender entnommene Vollblut eingebracht wird, als auch in einem Beutel, in dem schließlich die Konzentrate aufgefangen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt der erfindungsgemäße Inhibitor zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo in einem sterilen, ein Thrombozytenkonzentrat enthaltenden Auffangbeutel für die Infusion vor.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der erfindungsgemäße Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa zur Isolierung der zellulären Bestandteile des Blutes eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo vorzugsweise für diagnostische Zwecke eingesetzt. Beispielsweise kann das Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa bzw. das mit diesem Agens erfindungsgemäß antikoagulierte Blut zur Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen eingesetzt werden.
Der Begriff „Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen" oder Synonyme hiervon, beziehen sich erfindungsgemäß insbesondere auf Untersuchungen, die es dem medizinischen Fachmann erlauben, unmittelbar Aussagen über Art, Anzahl, Größe, Beschaffenheit und Funktionsfähigkeit (zum Beispiel Aktivität und Aktivierbarkeit) von zellulären Blutbestandteilen zu treffen.
Der Begriff zelluläre Blutbestandteile soll hierin zum Beispiel Thrombozyten, Erythrozyten, Retikulozyten und andere, dem Fachmann bekannte erythrozytäre Vorstufen, sowie Leukozyten, wie zum Beispiel Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten, periphere Stammzellen und andere, dem Fachmann bekannte leukozytäre Vorstufen umfassen.
Die Verfahren zur Diagnose von zellulären Blutbestandteilen sind dem Fachmann gut bekannt. Beispielhaft genannt seien Verfahren zur Beurteilung der Thrombozytenfunktionen, die Zählung (zum Beispiel mikroskopische Zählung), morphologische Charakterisierung (zum Beispiel an gefärbten und ungefärbten Blutausstrichen) und Typisierung von Zellen im Blut, vorzugsweise mittels mikroskopischer, zytometrischer oder durchflusszytometrischer Verfahren, die elektronische Partikelzählung, Verfahren zur Erkennung einer in vivo Aktivierung der Hämostase und Fibrinolyse, Quantifizierung von Markern der aktivierten Thrombozyten, wie zum Beispiel Plättchenfaktor 4 (PF 4), ß-Thromboglobulin, Serotonin, ADP/ ATP, Prothrombin-Fragment F 1+2, Thrombin- Antithrombin-Komplexe, D-Dimere, Fibrinogen- Spaltprodukte, lösliches Fibrin bzw. Fibrinmonomere, Plasmin-Plasmininhibitor- Komplexe, tP A-P AI-Komplexe, oder die elektronisch und zytochemisch (zum Beispiel Peroxidase) gestützte morphologische Charakterisierung und Zählung von beispielsweise periphären Leukozyten und anderen Zellen im Blut. Mittels Durchflusszytometrie lassen sich die zellulären Bestandteile beispielsweise diagnostizieren, indem Bestandteile von Zelloberflächen mit markierten Antikörpern (zum Beispiel fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern) charakterisiert und die derart markierten Zellen im Durchflusszytometer gezählt (zum Beispiel durch elektronische Zählung) werden.
Das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung antikoagulierte Blut kann beispielsweise für alle derzeit gebräuchlichen Verfahren zur Beurteilung der Thrombozytenfunktionen eingesetzt werden. Beispielhafte Verfahren umfassen die spontane Thrombozytenaggregation nach Breddin, die induzierte
Thrombozytenaggregation nach Born, die Impedanz- Vollblutaggregometrie, die Sekretion (Freisetzung) von thrombozytären Inhaltsstoffen (zum Beispiel ADP/ ATP, Plättchenfaktor 4, ß-Thromboglobulin, Serotonin), die Thrombozytenausbreitung (zum Beispiel nach Breddin), die Thrombozytenadhäsion, die Bestimmung von Thrombozytenoberflächen- Proteinen nach Aktivierung (zum Beispiel durch Durchflusszytometrie), die Messung der „In vitro-Blutungszeit" zum Beispiel mit dem Platelet Function Analyzer 100 (PFA-100; Dade Behring), die Thrombelastographie, die Gerinnsel-Retraktion, den Platelet Reactivity Index (zum Beispiel nach Grotemeyer, Wu & Hoak) und den Platelet Adhesion Assay (zum Beispiel nach Nowak et al. Semin. Thromb. Hemost. 31, 470, 2005).
Zur Messung bevorzugt eingesetzte Instrumente umfassen den Clot Signature Analyser (CSA), den Cone and Platelet Analyser (IMPACT), Durchflusszytometer, Ichor-Platelet Works, Laser Platelet Aggregometer (PA-200), Hemostasis Analysis System, Hemostasus, Ultegra (RPFA), Thrombotic Status Analyser (TSA), Hemodyne Platelet Analysis System, VerifyNow, Platelet-Stat, Multiplate analyzer und andere Geräte für die Impendanz- Aggregometrie, sowie diverse Geräte zur turbidimetrischen Bestimmung der Thrombozytenaggregation nach Born.
Die Erfindung umfasst daher auch ein Verfahren zur Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen, bei dem man entnommenes Blut ex vivo antikoaguliert, indem man dem Blut wenigstens ein Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa zusetzt, und anschließend die zellulären Bestandteile des Bluts untersucht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Diagnostik von Thrombozyten eingesetzt, wobei mit dem erfindungsgemäß antikoagulierten Blut zum Beispiel die vorstehend beschriebenen Thrombozytenfunktionstests durchgeführt werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Kit, der wenigstens einen erfindungsgemäßen Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa und ein Mittel zur Untersuchung von zellulären Blutbestandteilen umfasst. Das in dem Kit enthaltene Mittel zur Untersuchung von zellulären Blutbestandteilen umfasst insbesondere eine zur Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen geeignete und gegebenenfalls an ein Gerät zur Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen angepasste Einheit (zum Beispiel eine Messzelle oder Kartusche). In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit als Mittel zur Untersuchung von zellulären Blutbestandteilen ein Mittel zur Thrombozytenfunktionsdiagnostik. Dieses Mittel zur Thrombozytenfunktionsdiagnostik kann bspw. eine Messzelle, eine Kartusche oder eine andere Einheit sein, die an herkömmliche Geräte zur Messung der Thrombozytenfunktion angepasst ist und für die Beurteilung der Thrombozytenfunktion eingesetzt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit als Mittel zur Thrombozytenfunktionsdiagnostik oder als weiteren Bestandteil des Kits einen Aktivator der Thrombozyten. Dieser Aktivator kann in fester Form, gelöst oder auf einem als Mittel zur
Thrombozytenfunktionsdiagnostik fungierenden Träger vorliegen. Der Träger kann zum Beispiel eine dem Fachmann bekannte Messzelle zur Messung von Verschlusszeiten oder eine weitere, für die Messung der Thrombozytenaktivität geeignete, gegebenenfalls an eine aus dem Stand der Technik bekannte Messvorrichtung angepasste Einheit sein. Der Aktivator selbst kann ein dem Fachmann bekannter Aktivator der Thrombozyten sein. Beispielhaft seien ADP, Arachidonsäure (AA), Thrombospondin, TRAP (Thrombin Receptor Activating Protein), Collagen oder Epinephrin genannt.
All die oben aufgeführten Tests zur Messung der Thrombozytenfunktionen werden derzeit in plättchenreichem Citratplasma oder in Citrat- Vollblut durchgeführt. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo bietet gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil, dass zwar komplett die plasmatische Gerinnung (also die Thrombinbildung und in der Folge die Fibrinbildung durch Thrombin) gehemmt wird, nicht aber die Aktivierbarkeit der Thrombozyten durch geeignete Induktoren wie zum Beispiel ADP, Collagen, Arachidonsäure, Thrombospondin, Epinephrin oder TRAP (Thrombin Receptor Activating Protein). Im Gegensatz dazu entstehen im Citratmilieu immer mit der Zeit Spuren von Thrombin, das ebenfalls ein starker Aktivator der Thrombozyten ist bzw. verlieren die Thrombozyten ihre Funktionsfähigkeit durch Calcium-Entzug. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo hat daher den wesentlichen Vorteil, dass der erfindungsgemäße Inhibitor vor der Durchführung von Tests zur Diagnose von zellulären Blutbestandteilen, wie zum Beispiel Thrombozytenfunktionstests, weder entfernt noch inaktiviert werden muss, da er die Thrombozytenfunktion selbst nicht beeinflusst.
Die oben genannten Analyseverfahren werden grundsätzlich wesentlich gestört, wenn bei oder nach der Blutabnahme ex vivo bzw. in vitro eine zusätzliche Aktivierung der Thrombozyten erfolgt. Dadurch werden fälschlicherweise zu hohe Werte gemessen, die eine falsche Laborbefundinterpretation zur Folge haben, nämlich eine vermeintlich starke Aktivierung der Hämostase (Blutstillung) in vivo. Durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo wird die Aggregabilität der Thrombozyten vollständig erhalten und die Bildung von Thrombin und Fibrin und damit die Aktivierung der Thrombozyten derart verhindert, dass die mit dem erfindungsgemäß antikoagulierten Blut gemessenen Werte am ehesten die Verhältnisse in vivo widerspiegeln. Beispiele:
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen illustriert, wobei diese jedoch nicht als einschränkend verstanden werden sollen.
In den Beispielen 1-5 wurden als Inhibitoren kommerziell erhältliche Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa eingesetzt.
In den Beispielen 6-11 wurde als Inhibitor ein Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) verwendet. Exemplarisch wurde hierfür die Verbindung gemäß Formel (II), BAPA', eingesetzt. Es soll an dieser Stelle jedoch ausdrücklich angemerkt sein, dass die erfindungsgemäßen Inhibitoren durch ein äußerst ähnliches Inhibitorspektrum gekennzeichnet sind. Die Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa gemäß Formel (I) inhibieren neben dem Blutgerinnungsfaktor Xa weitere, gleiche Blutgerinnungsfaktoren. Zudem unterscheiden sich die K,-Werte der einzelnen erfindungsgemäßen Inhibitoren gegenüber diesen Blutgerinnungsfaktoren, wenn überhaupt, nur minimal. Diese etwaigen Abweichungen beeinträchtigen jedoch in keiner Weise die Fähigkeit der Verbindungen gemäß Formel (I), die Koagulation von humanem Blut ex vivo in dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgreich zu inhibieren.
Figur 1 zeigt den Einfiuss von Pefabloc tPA/Xa, einem Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa, auf die Bildung von Thrombin nach Aktivierung mit Kaolin in mit Hirudin antikoaguliertem Plasma. In der Legende bedeuten Kontrolle - A: Hirudin- antikoaguliertes Plasma ohne Aktivierung durch Kaolin-Zugabe, Kontrolle + A: Hirudin- antikoaguliertes Plasma plus Kaolin, und die Zahlenwerte: Mit Kaolin versetztes, Hirudin- antikoaguliertes Plasma plus Pefabloc tPA/Xa in den angegebenen Konzentrationen.
Figur 2 zeigt den Einfiuss von CJ-PK (Benzylsulfonyl-D-seryl-carbobenzoxylysyl-4- amidinobenzylamid, Haemochrom GmbH, Essen), einem Inhibitor von Plasma-Kallikrein, auf die Bildung von Thrombin nach Aktivierung mit Kaolin in mit Hirudin antikoaguliertem Plasma. In der Legende bedeuten Kontrolle - A: Hirudin-antikoaguliertes Plasma ohne Aktivierung durch Kaolin-Zugabe, Kontrolle + A: Hirudin-antikoaguliertes Plasma plus Kaolin, und die Zahlenwerte: Mit Kaolin versetztes, Hirudin-antikoaguliertes Plasma plus CJ-PK in den angegebenen Konzentrationen.
Figur 3 zeigt den Einfluss von Otamixaban, einem Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa, auf die Bildung von Thrombin nach Aktivierung mit Kaolin in mit Hirudin antikoaguliertem Plasma. In der Legende bedeuten Kontrolle - A: Hirudin-antikoaguliertes Plasma ohne Aktivierung durch Kaolin-Zugabe, Kontrolle + A: Mit Kaolin versetztes, Hirudin-antikoaguliertes Plasma, und die Zahlenwerte: Hirudin-antikoaguliertes Plasma plus Kaolin und Otamixaban in den angegebenen Konzentrationen.
Figur 4 zeigt die Bildung des Prothrombinfragments F 1+2 (F 1+2) nach der Antikoagulation von humanem Venenblut mit Otamixaban (Konzentration im antikoagulierten Blut = 500 μM, 50 μM und 5,0 μM).
Figur 5 zeigt die Bildung des Prothrombinfragments F 1+2 (F 1+2) nach der Antikoagulation von humanem Venenblut mit CJ-FXa (Konzentration im antikoagulierten Blut = 500 μM und 50 μM).
Figur 6 zeigt den Einfluss von BAPA' auf die Bildung von Thrombin nach Aktivierung mit Kaolin in mit Hirudin antikoaguliertem Plasma. In der Legende bedeuten Kontrolle - A: Hirudin-antikoaguliertes Plasma ohne Aktivierung durch Kaolin-Zugabe, Kontrolle + A: Hirudin-antikoaguliertes Plasma plus Kaolin, und die Zahlenwerte: Mit Kaolin versetztes, Hirudin-antikoaguliertes Plasma plus BAPA' in den angegebenen Konzentrationen.
Figur 7 zeigt die Bildung des Prothrombinfragments F 1+2 (F 1+2) nach der Antikoagulation von humanem Venenblut mit BAPA' (Konzentration im antikoagulierten Blut = 500 μM, 50 μM und 5,0 μM).
Figur 8 zeigt die von verschiedenen Agonisten induzierte Thrombozytenaggregation in mit BAPA' bzw. Zitrat antikoaguliertem Blut. In der Legende bedeuten TPA: Turbidimetrische Plättchenaggregation, EPA: Impedanz- Vollblut-Plättchenaggregation und AA: Arachidonsäure.
Figur 9 zeigt den Anteil an aggregierten Thrombozyten (Plättchen) in mit BAPA' bzw. Zitrat antikoaguliertem Blut, wobei die Thrombozytenaggregation mit verschiedenen Agonisten induziert wurde. In der Legende bedeuten PPA: Partikelzahl- Plättchenaggregation und AA: Arachidonsäure.
Figur 10 zeigt die Verschlusszeiten von mit BAPA' bzw. Zitrat anikoaguliertem Blut für mit verschiedenen Agonisten beschichteten Membranen. In der Legende bedeuten CADP: Collagen-ADP, CEPI: Collagen-Epinephrin, CT: Closure Time (Verschlusszeit), und PFA- 100: Platelet Function Analyzer 100.
Beispiel 1; Hemmwirkung von beispielhaft eingesetzten Inhibitoren gegenüber den humanen Gerinnungsfaktoren Xa, VIIa, XIa, XIIa und Plasma-Kallikrein (PK)
Bei den hierbei verwendeten Inhibitoren handelt es sich um die kommerziell erhältlichen, beispielhaften Inhibitoren Pefabloc tPA/Xa (2,7-Bis(4-amidinobenzyliden)-cycloheptanon- (1), Pentapharm Ltd. Basel, Schweiz), CJ-FXa (Benzylsulfonyl-D-arginyl-glycyl-4- amidinobenzylamid, Haemochrom GmbH, Essen, Deutschland) und CJ-PK (Benzylsulfonyl-D-seryl-carbobenzoxylysyl-4-amidinobenzylamid, Haemochrom GmbH, Essen, Deutschland). Von DX-9065a ((+)-(2S)-2-[4-[[(3S)-l-Acetimidoyl-3- pyrrodinyl]oxy]phenyl] -3 - [7-amidino-2-naphthyl]propansäure, Daiichi Pharmaceutical Company Ltd. Tokio, Japan), und Otamixaban (2-(R)-(3-carbamimidoylbenzyl)-3-(R)-[4- (1 -oxypyridin-4-yl)benzoylamino]-buttersäure-methylester, Sanofi- A ventis GmbH, Frankfurt, Deutschland), die sich beide in klinischen Prüfungen befinden, standen Forschungsproben zur Verfügung. Um die Hemmwirkung dieser beispielhaft eingesetzten Inhibitoren auf die Blutgerinnungsfaktoren Plasma-Kallikrein, VIIa, Xa, XIa und XIIa zu untersuchen, wurden die Kj- Werte der jeweiligen Enzym-Inhibitor-Komplexe ermittelt. Die Bestimmung der Kj- Werte wurde bei 25 °C in Tris-Puffer (0,05 mol/1, pH 8,0; enthält 0,154 mol/1 NaCl und 5 % Ethanol) durchgeführt. Die Enzyme stammten von der Firma Haemochrom Diagnostica GmbH (Essen, D) und waren in 0,154 mol/1 NaCl gelöst. Die Substrate (Pentapharm AG, Basel, CH) waren in H2O, der Inhibitor im obengenannten Tris-Puffer gelöst. Für die einzelnen Enzyme wurden die folgenden Substrate benutzt:
Figure imgf000028_0001
Bz = Benzyl-, Lys(Cbo) = Omega-Carbobenzoxylysin, HHT, Hexahydrotyrosin, Cha, Cyclohexylalanin, pNA = para-Nitroanilin
Für die Bestimmung wurden 200 μl Inhibitor-Lösung mit 25 μl Substrat gemischt und die Reaktion durch Zugabe von 50 μl Enzym gestartet. Nach einer Reaktionszeit von 3 - 5 min wurden 25 μl Essigsäure (50 %) zugegeben und die Extinktion bei 405 nm mit einem microplate reader (iEMS Reader MF 1401, Labsystems, Helsinki, Finnland) gemessen. Die Auswertung erfolgte graphisch entsprechend Dixon (Biochem. J., 55, 170, 1953).
Die für die beispielhaft eingesetzten Inhibitoren bestimmten Kj- Werte sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
Figure imgf000029_0001
PK = Plasma-Kallikrein
Beispiel 2: Hemmung der Thrombin-Bildung in Hirudin-antikoaguliertem Plasma nach Aktivierung mittels Kaolin durch Inhibitoren von Blutgerinnungsfaktoren
In diesem Beispiel wurde die Thrombin-Bildung in mit Hirudin antikoaguliertem Plasma durch Zugabe von Kaolin aktiviert und die Fähigkeit der Inhibitoren, die Thrombin- Bildung zu inhibieren, untersucht.
Zunächst wurde von einem Patienten entnommenes Blut mit Hilfe des Thrombin- Inhibitors Hirudin antikoaguliert. Dazu wurden 9 Teile Blut mit 1 Teil Hirudin-Lösung (rekombinantes Hirudin HBW 023, Hoechst, Frankfurt, 2000 E/ml physiologischer NaCl- Lösung) gemischt und danach 10 Minuten bei 1300 Umdrehungen pro Minute (U/min) zentrifugiert. 900 μl des sich im Überstand befindlichen, mit Hirudin antikoagulierten Plasmas wurden in Polypropylen-Röhrchen mit 50 μl Inhibitorlösung bzw. 0,9 %iger NaCl-Lösung sowie 50 μl Kaolin-Suspension (aus APTT-Test von Roche Diagnostics, vor Gebrauch 1 :250 verdünnt mit physiologischer NaCl-Lösung) versetzt und bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Kaolin fungiert dabei als unphysiologische Oberfläche, die die Blutgerinnung aktiviert, wodurch die Thrombin-Bildung schließlich stimuliert wird. Zu bestimmten Zeitpunkten wurde die Menge des gebildeten Thrombins anhand der Bildung des Prothrombinfragments F 1+2 immunologisch bestimmt (Enzygnost F 1+2 micro, Dade Behring GmbH, Marburg). Diese Bestimmung basiert auf einem Enzymimmunoassay nach dem Sandwich-Prinzip. Dazu wurden zu bestimmten Zeitpunkten aliquote Volumina (600 μl) mit 0,1 M EDTA (40 μl) antikoaguliert und bei - 20 °C aufbewahrt. Zur Bestimmung der Konzentration des Prothrombinfragments F 1+2 wurden 50 μl Plasma (gegebenenfalls verdünnt mit PBS, phosphate-buffered saline) mit monoklonalen Antikörpern gegen das humane Prothrombinfragment F 1+2, die auf einer im Testkit enthaltenen Mikrotiterplatte fixiert waren, inkubiert. Nach einem Waschschritt mit PBS, der zur Entfernung von nicht von den Antikörpern gebundenem Probenmaterial diente, wurde mit Peroxidase- konjugierten Antikörpern gegen humanes Prothrombin, die an die freien F 1+2- Determinanten binden, inkubiert. Nach einem weiteren Waschvorgang, bei dem die ungebundenen Enzym-konjugierten Antikörper entfernt werden, wurde Chromogen (o- Phenylendiamin/H2O2-Lösung) zugesetzt, um mit der an die Antikörper gegen humanes Prothrombin gebundene Peroxidase eine Farbreaktion zu erzeugen, deren Intensität proportional zur Konzentration des Prothrombinfragments F 1+2 in der Probe ist. Diese wurde im Anschluss photometrisch bei einer Wellenlänge von 492 nm bestimmt.
Wie aus den Figuren 1 bis 3 ersichtlich ist, sind die beispielhaften Inhibitoren in der Lage, die durch die Aktivierung mit Kaolin stimulierte Thrombin-Bildung effektiv zu unterdrücken. So sind Hemmstoffe des Blutgerinnungsfaktors Xa mit Kj- Werten bis 10 nM, wie der in Tabelle 1 beispielhaft gezeigte Inhibitor Pefabloc tPA/Xa (Fig. 1) in der Lage bei einer Konzentration von 100 μM die Thrombin-Bildung total zu unterdrücken. Auch sehr starke Hemmstoffe der Enzyme der Frühphase der Gerinnung wie der Plasma- Kallikrein-Hemmstoff CJ-PK (Tabelle 1) unterdrücken bei einer Konzentration von 100 μM die Thrombin-Bildung effektiv (Fig. 2). Als besonders geeignet zur Blockade der Thrombin-Bildung nach Kaolin- Aktivierung erweisen sich Substanzen, die wie Otamixaban den Blutgerinnungsfaktor Xa mit einem Kj-Wert < 0,1 nM hemmen (Fig. 3). Bei der Interpretation der in diesem Beispiel erhaltenen Ergebnisse muss berücksichtigt werden, dass die Versuche in diesem Beispiel nicht in physiologischem Milieu durchgeführt wurden, sondern unter Verwendung von Kaolin, dass ein unphysiologischer, starker Aktivator der Thrombin-Bildung ist. Diese Ergebnisse zeigen daher eindrucksvoll, dass Blutplasma trotz der starken unphysiologischen Aktivierung der Thrombin-Bildung durch Kaolin mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgreich antikoaguliert werden kann.
Beispiel 3: Lagerung von humanem Venenblut nach Antikoagulation mit verschiedenen Inhibitoren
In diesem Experiment wurde untersucht, wie lange sich humanes Venenblut lagern lässt, ohne dass es dabei zur Bildung von Thrombin oder zur Aktivierung der Thrombozyten kommt.
Dazu wurde von einem Patienten entnommenes Blut (9 Teile) mit Inhibitor-Lösung (0,05 mM, 0,5 mM bzw. 5 mM in physiologischer NaCl-Lösung; 1 Teil) gemischt. Ein Teil des Blutes wurde bei 25 °C, der andere im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt. Die Menge des gebildeten Thrombins wurde im Verlauf der Lagerung anhand der Bildung des Prothrombinfragments F 1+2 immunologisch ermittelt (Enzygnost F 1+2 micro, Dade Behring GmbH, Marburg). Es konnte gezeigt werden, dass die beispielhaft eingesetzten Hemmstoffe CJ-FXa und Otamixaban in der Lage sind, antikoaguliertes Blut bei einer Konzentration im Blut von 500 μM über mehr als 48 Stunden ungeronnen zu halten (Tabelle 2). Dabei spielte es keine Rolle, ob die Blutproben bei Zimmertemperatur (ca. 25 °C) oder bei 4 °C aufbewahrt wurden. Bei einer Konzentration von 50 μM verhindert Otamixaban die Gerinnung für mehr als 24 Stunden, CJ-FXa nur für etwa 24 Stunden.
Wie beispielhaft für Otamixaban (Fig. 4) und CJ-FXa (Fig. 5) gezeigt wurde, wird in dem jeweiligen Zeitraum weniger als 1 nM Thrombin (Nachweis über Fl+2-Fragment) neu gebildet. Die anderen beispielhaft geprüften Hemmstoffe DX-9065a und Pefabloc tPA/Xa sind nicht in der Lage, in den angegebenen Konzentrationen die Gerinnung für mehr als 12 Stunden zu verhindern. Tabelle 2
Figure imgf000032_0001
Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Effektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo mit dem K1- Wert des Inhibitors gegenüber dem Blutgerinnungsfaktor Xa positiv korreliert. Es soll an dieser Stelle außerdem angemerkt werden, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren mit jedem direkten Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa durchführen lässt. So lässt sich die Antikoagulation von humanem Blut ex vivo auch mit direkten Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa erreichen, die K1- Werte über 10 nM aufweisen. In diesen Fällen muss lediglich die Konzentration dieses Inhibitors im Blut entsprechend erhöht werden. Daher ist es zum Beispiel aus Kostengründen oft vorteilhaft, wenn stärkere direkte Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa (K1- Wert < 10 nM) in geringeren Konzentrationen eingesetzt werden. Beispiel 4: Induzierte Aktivierung der Thrombozyten nach der Antikoagulation mit direkten Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors Xa
In diesem Experiment wird gezeigt, dass sich die Thrombozyten in dem erfindungsgemäß antikoagulierten Blut durch Induktion problemlos aktivieren lassen, während dies bei mit Citrat antikoaguliertem Blut nicht über einen längeren Zeitraum der Fall ist.
Dazu wurden von 12 gesunden Probanden innerhalb 1 Stunde Blut entnommen. Es wurde jeweils 1 Aliquot der 12 Blutproben mit Citrat, 1 anderes Aliquot der 12 Blutproben mit einem direkten Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa antikoaguliert. Dazu wurden 9 Teile Blut mit 1 Teil Citrat (0,106 mol/1) bzw. 1 Teil Inhibitor-Lösung in der geeigneten Konzentration vermischt. Plättchenreiches Plasma (PRP) wurde durch Zentrifugation bei 164 x g über 10 Minuten hergestellt. Die Aktivierung der Thrombozyten in PRP erfolgte durch induzierte Aggregation nach Born mit 5 μmol/1 ADP, 2 μg/ml Collagen und 0,5 mmol/1 Arachidonsäure. Impedanz- Vollblutaggregometrie wurde mit dem Multiplate Aggregometer und mit 6,5 μmol/1 ADP, 3,2 μg/ml Collagen und 0,5 mmol/1 Arachidonsäure durchgeführt. Die Analysen erfolgten 1, 2, 3, 4, 5, 10 und 24 Stunden nach der Blutentnahme. Während die induzierten Aggregationen in dem mit Citrat antikoagulierten Blut 24 Stunden nach der Blutabnahme auf 20 bis 30% des Ausgangswertes abgefallen waren, änderte sich das Ausmaß der Aggregation in dem erfindungsgemäß antikoagulierten Blut nicht.
24 Stunden nach der Blutabnahme zeigten wie 1 Stunde nach der Blutabnahme 70 % der Thrombozyten in dem erfindungsgemäß antikoagulierten RPR eine normale Ausbreitung auf Kunststoff-Objektträgern. Demgegenüber waren 24 Stunden nach der Blutabnahme weniger als 10 % der Thrombozyten in mit Citrat antikoaguliertem RPR noch ausgebreitet.
Beispiel 5: Haltbarmachung und Lagerung von Thrombozytapheresekonzentraten
In diesem Experiment wird gezeigt, dass sich Blutprodukte, wie zum Beispiel Thrombozytapheresekonzentrate unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo über einen langen Zeitraum haltbar machen und lagern lässt.
Ein Thrombozytapheresekonzentrat, das aus in Plasma suspendierten Thrombozyten besteht, wurde durch Thrombozytapherese mittels eines handelsüblichen Zellseparators unter Verwendung von zunächst Citrat als Antikoagulans hergestellt. In einem geschlossenen Thrombozytapherese-Beutelsystem wurde ein Satellitenbeutel integriert, der Calciumchlorid und einen erfϊndungsgemäßen direkten Inhibitor des Blugerinnungsfaktors Xa in physiologischer Lösung enthielt. Unmittelbar nach Beendigung der Thrombozytapherese wurde die Lösung im Satellitenbeutel dem Thrombozytapheresekonzentrat zugesetzt. Die Zugabe von Calciumionen (Recalcifizierung) stellte eine physiologische Calciumionenkonzentration im Thrombozytapheresekonzentrat ein, die zur Gewährleistung einer optimale Thrombozytenfunktion diente. Die Antikoagulation des nun wieder gerinnbaren Plasmas, in dem die Thrombozyten suspendiert waren, wurde erfindungsgemäß durch die Zugabe des direkten Inhibitors des Blutgerinnungsfaktors Xa verhindert.
Das Thrombozytapheresekonzentrat wurde unter bei 22 ± 2°C unter ständiger Agitation gelagert. Nach 10-tägiger Lagerung besaß das Thrombozytapheresekonzentrat, das erfindungsgemäß mit einem direkten Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa antikoaguliert wurde, noch die gleiche Wirksamkeit wie konventionelle Thrombozytapheresekonzentrate nach 5 Tagen.
So zeigten die erfindungsgemäß antikoagulierten Thrombozytapheresekonzentrate auch nach 10-tägiger Lagerung noch das „Swirling-Phänomen" (das „Swirling-Phänomen" basiert auf der Lichtstreuung von bewegten, eine normale Morphologie aufweisenden Thrombozyten, und verschwindet, wenn die normalerweise scheibenförmigen Thrombozyten eine abnormale, kugelförmige Gestalt annehmen) und wiesen einen pH- Wert > 6,7 auf. Die Thrombozytenzahl war dabei immer größer als > 2 x 10π/Einheit. Die Aggregation der Thrombozyten war durch Induktion mit 2 μg/ml Collagen auslösbar, wobei die Maximalamplitude 25 % betrug. Ferner konnte die Thrombozytenaggregation auch mit 5 bzw. 10 μmol/1 ADP induziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich Blutprodukte durch das erfindungsgemäße Verfahren über einen langen Zeitraum haltbar machen und lagern lassen, ohne dass es dabei zur Antikoagulation kommt, und ohne dass die Aktivierbarkeit der Thrombozyten dadurch beeinträchtigt wird.
Beispiel 6: Synthese des erfindungsgemäßen Inhibitors BAPA'
Der für die nachfolgenden Untersuchungen exemplarisch eingesetzte Inhibitor gemäß Formel (II), BAPA', wurde durch Kopplung von Benzylsulfonyl-D-Arg(Pbf)-OH (hergestellt entsprechend Schweinitz et al., Med. Chem. 2006, 2, 349-361) und H-Pro-4- Amidinobenzylamid x 2 HCl (hergestellt entsprechend WO 02/059065) synthetisiert, wobei Pbf eine 2, 2', 4, 6, 7-Pentamethyldihydro-benzofuran-5-sulfonyl-Schutzgruppe ist. Dazu wurden 0,5 g (0,861 mmol) Benzylsulfonyl-D-Arg(Pbf)-OH und 289 mg (0,904 mmol) H-Pro-4-Amidinobenzylamid x 2 HCl in 15 ml DMF gelöst. Danach wurden bei 0 0C 326 mg (0,861 mmol) 2-(lH-Benzotriazol-l-yl)l,l,3,3-Tetramethyluronium Hexafluorophosphat und 300 μl (1,722 mmol) Diisopropylethylamin dazugegeben. Die Mischung wurde 30 min bei 0 °C und weitere 5 h bei Zimmertemperatur (22 ± 2 °C) gerührt. Mit Vakuum wurde das Lösungsmittel entfernt und der ölige Rückstand ohne weitere Reinigung mit 10 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 1,5 h Rühren bei Raumtemperatur (22 ± 2 °C) wurde das Lösungsmittel im Vakuum eingeengt und der Rückstand anschließend mit Ether versetzt. Das ausfallende Rohprodukt wurde mit präparativer RP-HPLC getrennt. Die Fraktionen, die BAPA' enthielten, wurden vereint und nach teilweiser Entfernung des Lösungsmittels lyophilisiert.
Zur präparativen RP-HPLC wurde eine HPLC- Anlage der Firma Waters und eine Säule Saphir 110 (lOμm C 18) 50 x 300 mm der Firma Grom verwendet. Die Detektion erfolgte bei 220 nm. Als Elutionsmittel wurde Wasser mit 0,1 % TFA (A) und Acetonitril mit 0,1 % TFA (B) bei einer Flussrate von 10 oder 20 ml/min und einem geeigneten Gradienten eingesetzt. Die Massenspektren wurden auf einem ZQ 4000 der Firma Waters gemessen. Die Synthese lieferte eine Ausbeute an BAPA' (Molekulargewicht als 2 x TFA-SaIz: 784,7 g/mol) von 295 mg (entsprechend 0,376 mmol).
Die berechnete Molmasse beträgt MS = 556,26. Im Massenspektrum wurde eine Molmasse von MS = 557,3 (M+H)+ gefunden.
Beispiel 7: Hemmwirkung von BAPA' gegenüber den humanen Gerinnungsfaktoren Xa, VIIa, XIa, XIIa, Plasma-Kallikrein (PK) und Thrombin
Um die Hemm Wirkung des beispielhaft eingesetzten Inhibitors BAPA' auf die Blutgerinnungsfaktoren Plasma-Kallikrein, VIIa, Xa, XIa, XIIa und Thrombin zu untersuchen, wurden die K,- Werte der jeweiligen Enzym-Inhibitor-Komplexe ermittelt.
Die Bestimmung der K.-Werte wurde bei 25 °C in Tris-Puffer (0,05 mol/1, pH 8,0; enthält 0,154 mol/1 NaCl und 5 % Ethanol) durchgeführt. Die Enzyme stammten von der Firma Haemochrom Diagnostica GmbH (Essen, D), nur Thrombin wurde im eigenen Labor nach Walsmann (Pharmazie 23, 401-402, 1968) hergestellt. Alle Enzyme waren in 0,154 mol/1 NaCl gelöst. Die Substrate (Pentapharm AG, Basel, CH) waren in H2O, der Inhibitor im oben genannten Tris-Puffer gelöst. Für die einzelnen Enzyme wurden die folgenden Substrate benutzt:
Figure imgf000036_0001
Bz = Benzyl-, Lys(Cbo) = Omega-Carbobenzoxylysin, HHT = Hexahydrotyrosin, Cha = Cyclohexylalanin, pNA = para-Nitroanilin
Für die Bestimmung wurden 200 μl Inhibitor-Lösung mit 25 μl Substrat gemischt und die Reaktion durch Zugabe von 50 μl Enzym gestartet. Nach einer Reaktionszeit von 3 - 5 min wurden 25 μl Essigsäure (50 %) zugegeben und die Extinktion bei 405 nm mit einem microplate reader (iEMS Reader MF 1401, Labsystems, Helsinki, Finnland) gemessen. Die Auswertung erfolgte graphisch entsprechend Dixon (Biochem. J., 55, 170, 1953).
Die für BAPA' bestimmten K,- Werte sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
Figure imgf000037_0001
PK = Plasma-Kallikrein
Beispiel 8: Hemmung der Thrombin-Bildung in Hirudin-antikoaguliertem Plasma nach Aktivierung mittels Kaolin durch BAPA'
In diesem Beispiel wurde die Thrombin-Bildung in mit Hirudin antikoaguliertem Plasma durch Zugabe von Kaolin aktiviert und die Fähigkeit des Inhibitors BAPA', die Thrombin- Bildung zu inhibieren, untersucht.
Zunächst wurde von einem Patienten entnommenes Blut mit Hilfe des Thrombin- Inhibitors Hirudin antikoaguliert. Dazu wurden 9 Teile Blut mit 1 Teil Hirudin-Lösung (rekombinantes Hirudin HBW 023, Hoechst, Frankfurt, 2000 E/ml physiologischer NaCl- Lösung) gemischt und danach 10 Minuten bei 1300 Umdrehungen pro Minute (U/min) zentrifugiert. 900 μl des sich im Überstand befindlichen, mit Hirudin antikoagulierten Plasmas wurden in Polypropylen-Röhrchen mit 50 μl Inhibitorlösung bzw. 0,9 %iger NaCl-Lösung sowie 50 μl Kaolin- Suspension (aus APTT-Test von Roche Diagnostics, vor Gebrauch 1 :250 verdünnt mit physiologischer NaCl-Lösung) versetzt und bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Kaolin rungiert dabei als unphysiologische Oberfläche, die die Blutgerinnung aktiviert, wodurch die Thrombin-Bildung schließlich stimuliert wird. Zu bestimmten Zeitpunkten wurde die Menge des gebildeten Thrombins anhand der Bildung des Prothrombinfragments F 1+2 immunologisch bestimmt (Enzygnost F 1+2 micro, Dade Behring GmbH, Marburg). Diese Bestimmung basiert auf einem Enzymimmunoassay nach dem Sandwich-Prinzip. Dazu wurden zu bestimmten Zeitpunkten aliquote Volumina (600 μl) mit 0,1 M EDTA (40 μl) antikoaguliert und bei - 20 °C aufbewahrt. Zur Bestimmung der Konzentration des Prothrombinfragments F 1+2 wurden 50 μl Plasma (gegebenenfalls verdünnt mit PBS, phosphate-buffered saline) mit monoklonalen Antikörpern gegen das humane Prothrombinfragment F 1+2, die auf einer im Testkit enthaltenen Mikrotiterplatte fixiert waren, inkubiert. Nach einem Waschschritt mit PBS, der zur Entfernung von nicht von den Antikörpern gebundenem Probenmaterial diente, wurde mit Peroxidase- konjugierten Antikörpern gegen humanes Prothrombin, die an die freien F 1+2- Determinanten binden, inkubiert. Nach einem weiteren Waschvorgang, bei dem die ungebundenen Enzym-konjugierten Antikörper entfernt werden, wurde Chromogen (o- Phenylendiamin/H2θ2-Lösung) zugesetzt, um mit der an die Antikörper gegen humanes Prothrombin gebundene Peroxidase eine Farbreaktion zu erzeugen, deren Intensität proportional zur Konzentration des Prothrombinfragments F 1+2 in der Probe ist. Diese wurde im Anschluss photometrisch bei einer Wellenlänge von 492 nm bestimmt.
Wie aus der Figur 6 ersichtlich ist, ist BAPA' in der Lage, die durch die Aktivierung mit Kaolin stimulierte Thrombin-Bildung effektiv zu unterdrücken. BAPA', das den Blutgerinnungsfaktor Xa mit einem Kj- Wert von 2,4 nM hemmt (Tabelle 3), ist noch bei einer Konzentration von 0,1 μM fähig, die Thrombin-Bildung nach Kaolin- Aktivierung > 97 % zu blockieren.
Bei der Interpretation der in diesem Beispiel erhaltenen Ergebnisse muss berücksichtigt werden, dass die Versuche in diesem Beispiel nicht in physiologischem Milieu durchgeführt wurden, sondern unter Verwendung von Kaolin, dass ein unphysiologischer, starker Aktivator der Thrombin-Bildung ist. Diese Ergebnisse zeigen daher eindrucksvoll, dass Blutplasma trotz der starken unphysiologischen Aktivierung der Thrombin-Bildung durch Kaolin mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung des erfindungsgemäßen Inhibitors erfolgreich antikoaguliert werden kann.
Beispiel 9: Lagerung von humanem Venenblut nach Antikoagulation mit BAPA'
In diesem Experiment wurde untersucht, wie lange sich humanes Venenblut lagern lässt, ohne dass es dabei zur Bildung von Thrombin oder zur Aktivierung der Thrombozyten kommt.
Dazu wurde von einem Patienten entnommenes Blut (9 Teile) mit Inhibitor-Lösung (0,05 mM, 0,5 mM bzw. 5 mM in physiologischer NaCl-Lösung; 1 Teil) gemischt und bei Zimmertemperatur (ca. 22± 2 °C) aufbewahrt. Die Menge des gebildeten Thrombins wurde im Verlauf der Lagerung anhand der Bildung des Prothrombinfragments F 1+2 immunologisch ermittelt (Enzygnost F 1+2 micro, Dade Behring GmbH, Marburg). Es konnte gezeigt werden, dass BAPA' in der Lage ist, antikoaguliertes Blut bei einer Konzentration im Blut von 500 bzw. 50 μM über mehr als 48 Stunden ungeronnen zu halten (Tabelle 4). Bei einer Konzentration von 5 μM verhindert BAPA' die Gerinnung für mehr als 8 Stunden.
Wie beispielhaft gezeigt wurde (Fig. 7), wird in dem jeweiligen Zeitraum weniger als 1 nM Thrombin (Nachweis über Fl+2-Fragment) neu gebildet.
Tabelle 4
Figure imgf000039_0001
Beispiel 10; Induzierte Aktivierung der Thrombozyten nach der Antikoagulation mit BAPA'
In diesem Experiment wird gezeigt, dass sich die Thrombozyten in dem erfindungsgemäß antikoagulierten Blut durch Induktion problemlos aktivieren lassen, während dies bei mit Citrat antikoaguliertem Blut nicht über einen längeren Zeitraum der Fall ist.
Die nachstehend beschriebenen Untersuchungen wurden an 12 Frauen und 12 Männern durchgeführt, die innerhalb der letzten 14 Tage vor der Blutentnahme kein Aspirin oder andere Medikamente eingenommen hatten, die mit einer Beeinträchtigung der Thrombozytenfunktion einhergehen. Probanden mit anamnestischen Hinweisen auf eine erhöhte Blutungsneigung wurden ausgeschlossen. Es wurden jeweils zwei verschiedene Versuchsreihen durchgeführt, wobei in der einen Versuchsreihe die Antikoagulation mittels Zitrat und in der anderen Versuchsreihe mittels des erfindungsgemäßen Inhibitors BAPA' erfolgte.
Nach einer 30minütigen Ruhepause in sitzender Position wurde den Probanden innerhalb von 2 Stunden mit einer 21 -gauge Butterfly-Nadel Blut aus der Kubitalvene entnommen, wobei möglichst wenig gestaut wurde. Das entnommene Blut wurde einerseits in Monovetten (Fa. Sarstedt) aspiriert, die 0,106 mol/1 Trinatriumzitrat enthielten (Endverhältnis: 1 Teil Zitrat + 9 Teile Blut) und andererseits in Monovetten, die mit 500 μmol/1 BAPA' vorbefüllt waren (Endverhältnis: 1 Teil BAPA' + 9 Teile Blut). Blut und Antikoagulans wurden sorgfaltig durch leichtes wiederholtes Kippen der Röhrchen vermischt. Alle Proben wurden bei Raumtemperatur (22 ± 2 °C) gelagert. Die Analysen erfolgten nach 2, 4, 6, 8, 10 und 24 h.
a) Turbidimetrische Plättchenaggregation (TPA)
Beim TPA-Assay wird mittels photometrischer Messung die Transmission von Licht durch die jeweilige Blutzellsuspension quantitativ bestimmt. Da PRP aufgrund der Lichtstreuung an den suspendierten, einzelnen Thrombozyten lediglich eine geringe Transmission für langwelliges Licht aufweist, PPP langwelliges Licht dagegen nahezu ungehindert passieren lässt, dient die relative prozentuale Transmission des Lichts durch die Probe als Maß für die Aggregation der Thrombozyten. Eine Aggregation der Thrombozyten hat eine Abnahme der Anzahl lichtstreuender Partikel zur Folge und lässt folglich die Transmission der Probe im Vergleich zu PRP mit nicht aggregierten Thrombozyten ansteigen.
Für die TPA-Assays wurde plättchenreiches und plättchenarmes Plasma (PRP bzw. PPP) hergestellt. Plättchenreiches Plasma wurde erhalten, indem das antikoagulierte Blut 2, 4, 6, 8, 10 und 24 h nach der Blutentnahme 10 Minuten bei 150 x g zentrifugiert und der Überstand anschließend abgenommen wurde. Plättchenarmes Plasma wurde durch 10- minütige Zentrifugation bei 3.500 g und Entnahme des Überstandes enthalten. Die Plättchenzahl wurde nicht eingestellt.
Für die TPA-Assays wurde die Thrombozyten- Aggregation in PRP durch Zugabe von Arachidonsäure (AA), ADP bzw. Collagen stimuliert. Dazu wurden 25 μl Arachidonsäure oder ADP zu 225 μl PRP (Endkonzentration von AA = 0,5 mmol/1 bzw. von ADP = 5 μmol/1) bzw. 10 μl Kollagen aus Pferdeseren zu 240 μl PRP (Endkonzentration von Collagen = 2 μg/ml) gegeben.
Die Aggregation der einzelnen Proben wurde mit Hilfe eines APACT 4 Aggregometers (Labitec, Arensburg) über 7 Minuten registriert. Als Referenz wurde die Differenz der Lichttransmission zwischen PRP und PPP auf einer linearen Skala gleich 100 % gesetzt. Anschließend wurde die durch die induzierte Plättchenaggregation hervorgerufene maximale Transmissionsänderung in der PRP-Probe registriert. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt.
b) Impedanz- Vollblut-Plättchenaggregation (IPA)
Die Impedanz- Vollblut-Plättchenaggregometrie basiert auf der Messung der Änderung des elektrischen Widerstandes zwischen zwei Platinelektroden infolge der Anlagerung von Thrombozyten bei Stromfluss. Die Widerstandsänderung ist dabei proportional zur Thrombozytenaggregation. Es wurden 300 μl antikoaguliertes Vollblut mit 300 μl physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und 3 Minuten bei 37°C vorgewärmt. Danach wurden 20 μl der Agonisten zugegeben, um Endkonzentrationen von 0,5 mmol/1 AA, 6,5 μmol/1 ADP und 333,2 μg/ml Collagen zu erhalten. Die IPA-Assays erfolgten mit einem Multiplate Analyzer (Instrumentation Laboratory, Kirchheim). Die maximale Aggregation wurde 2, 4, 6, 8, 10 und 24 h nach der Blutentnahme jeweils über 6 Minuten registriert und in arbiträren Units (AU) ausgedrückt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Fig. 8 dargestellt.
c) Partikelzahl-Plättchenaggregation (PPA)
Zur Partikelzahl-Plättchenaggregation wurde 2, 4, 6, 8, 10 und 24 h nach der Blutentnahme 1 ml antikoaguliertes Vollblut mit 1 ml 0,1 % (w/w) Glutaraldehyd in Saline- Phosphatpuffer, pH 7,4, versetzt und vorsichtig gemischt. In dieser Probe wurde die Ausgangs-Thrombozytenzahl bestimmt (ADVIA Analyzer, Bayer Vital, Fernwald). In ein zweites Röhrchen wurden 20 μl Agonist vorgelegt, um in 1 ml antikoaguliertem Vollblut Endkonzentrationen von z. B. 0,5 mmol/1 AA, 20 μmol/1 ADP bzw. 4 μg/ml Collagen zu erhalten. Anschließend wurden die Proben auf einen Blutbild- Agitator zum Durchmischen gelegt. Danach wurde jeweils 1 ml Glutaraldehyd-Puffer zugegeben, 3 Minuten gewartet, sorgfältig durchmischt und die Thrombozytenzahl bestimmt. Der Anteil aggregierter Thrombozyten in % wurde mit folgender Formel berechnet:
[(Thrombozytenzahl im Röhrchen ohne Agonist - Thrombozytenzahl im Röhrchen mit Agonist)/ Thrombozytenzahl im Röhrchen ohne Agonist]* 100.
Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt.
d) Messung der Verschlusszeiten
Die Messung der Verschlusszeiten (closure times, CT) wurde mit dem Platelet Function Analyzer 100 (PFA-100) durchgeführt. Dabei wurden Messzellen mit Membranen, die mit verschiedenen Agonisten beschichtet waren, mit antikoaguliertem Vollblut befüllt. Die Thrombozyten lagerten sich an den Membranen an, wo die Aggregation der Thrombozyten durch den Kontakt mit den Agonisten aktiviert wurde. Die dadurch induzierte Aggregation führte zu einer Verringerung des Blutflusses. Der PFA-100 ermittelte die Zeit bis zum vollständigen Membranverschluss (Verschlusszeit). Als Messzellen wurden die Collagen-Epinephrin (CEPI) und die Collagen- ADP (CADP) Cartridge verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt.
Die in Beispiel 10 durchgeführten Studien zeigen, dass sich durch die Antikoagulation mit dem erfindungsgemäßen Inhibitor gegenüber Zitrat eine wesentlich höhere Lagerungsstabilität der Proben hinsichtlich der Thrombozyten-Aggregabilität erreichen lässt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es somit möglich, Blutprodukte über einen langen Zeitraum haltbar zu machen und zu lagern, ohne dass es dabei zur Antikoagulation kommt, und ohne dass die Aktivierbarkeit der Thrombozyten dadurch beeinträchtigt wird.
Beispiel 11; Haltbarmachung und Lagerung von Thrombozytapheresekonzentraten
In diesem Experiment wird gezeigt, dass sich Blutprodukte, wie zum Beispiel Thrombozytapheresekonzentrate unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo über einen langen Zeitraum haltbar machen und lagern lassen.
Ein Thrombozytapheresekonzentrat, das aus in Plasma suspendierten Thrombozyten besteht, wurde durch Thrombozytapherese mittels eines handelsüblichen Zellseparators unter Verwendung von zunächst Citrat als Antikoagulans hergestellt. In einem geschlossenen Thrombozytapherese-Beutelsystem wurde ein Satellitenbeutel integriert, der Calciumchlorid und einen erfindungsgemäßen direkten Inhibitor des Blugerinnungsfaktors Xa in physiologischer Lösung enthielt. Unmittelbar nach Beendigung der Thrombozytapherese wurde die Lösung im Satellitenbeutel dem Thrombozytapheresekonzentrat zugesetzt. Die Zugabe von Calciumionen (Recalcifizierung) stellte eine physiologische Calciumionenkonzentration im Thrombozytapheresekonzentrat ein, die zur Gewährleistung einer optimale Thrombozytenfunktion diente. Die Antikoagulation des nun wieder gerinnbaren Plasmas, in dem die Thrombozyten suspendiert waren, wurde durch die Zugabe des erfindungsgemäßen direkten Inhibitors des Blutgerinnungsfaktors Xa verhindert.
Das Thrombozytapheresekonzentrat wurde unter bei 22 ± 2°C unter ständiger Agitation gelagert. Nach 10-tägiger Lagerung besaß das Thrombozytapheresekonzentrat, das erfindungsgemäß mit dem direkten Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa antikoaguliert wurde, noch die gleiche Wirksamkeit wie konventionelle Thrombozytapheresekonzentrate nach 5 Tagen.
So zeigten die erfindungsgemäß antikoagulierten Thrombozytapheresekonzentrate auch nach 10-tägiger Lagerung noch das „Swirling-Phänomen" (das „Swirling-Phänomen" basiert auf der Lichtstreuung von bewegten, eine normale Morphologie aufweisenden Thrombozyten, und verschwindet, wenn die normalerweise scheibenförmigen Thrombozyten eine abnormale, kugelförmige Gestalt annehmen) und wiesen einen pH- Wert > 6,7 auf. Die Thrombozytenzahl war dabei immer größer als > 2 x 101 '/Einheit. Die Aggregation der Thrombozyten war durch Induktion mit 2 μg/ml Collagen auslösbar, wobei die Maximalamplitude 25 % betrug. Ferner konnte die Thrombozytenaggregation auch mit 5 bzw. 10 μmol/1 ADP induziert werden.
Diese Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass sich Blutprodukte, wie zum Beispiel Thrombozytapheresekonzentrate, durch das erfindungsgemäße Verfahren über einen langen Zeitraum haltbar machen und lagern lassen, ohne dass es dabei zur Antikoagulation kommt, und ohne dass die Aktivierbarkeit der Thrombozyten dadurch beeinträchtigt wird.

Claims

Patentansprüche:
1. Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa mit der Formel (I),
Figure imgf000045_0001
oder ein Salz mit Säuren davon, wobei n = 2, 3 oder 4 sein kann,
R = -(CH2)m-NH-Y, mit m = 1, 2, 3, 4 oder 5, und Y = H oder
Figure imgf000045_0002
sein kann, und
X1, X2, X3, X4, X5 unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, NO2, NH2, OH, Alkyl oder Alkoxy sein können.
2. Inhibitor nach Anspruch 1 oder ein Salz mit Säuren davon, dadurch gekennzeichnet, dass n = 3 oder 4 ist,
NH2 m = 2, 3 oder 4 ist, Y = H oder ist, und
NH
X1, X2, X3, X4, X5 unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, NO2, NH2, OH, Alkyl oder Alkoxy sind.
3. Inhibitor nach Anspruch 1 oder ein Salz mit Säuren davon, dadurch gekennzeichnet, dass n = 3 ist, m = 3 ist, Y = ist, und X1, X2, X3, X4, X5 jeweils H
Figure imgf000045_0003
sind; oder
n = 2 ist, m = 3 ist, Y = — % ist, und X1, X2, X3, X4, X5 jeweils H
sind; oder n = 3 ist, m = 4 ist, Y = H ist, und X1, X2, X3, X4, X5 jeweils H sind; oder
NH2 n = 3 ist, m = 3 ist, Y = ist, X1, X2, X4, X5 = H sind, und X3 =
NH
Cl ist.
4. Inhibitor nach Anspruch 3 oder ein Salz mit Säuren davon, dadurch gekennzeichnet, dass
Figure imgf000046_0001
Xi, X2, X3, X4, X5 jeweils H sind.
5. Verfahren zur Antikoagulation von humanem Blut ex vivo, dadurch gekennzeichnet, dass dem entnommenen Blut wenigstens ein Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Salz mit Säuren davon zugesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Inhibitor oder ein Salz mit Säuren davon in Lösung, vorzugsweise in physiologischer NaCl-Lösung oder einer Pufferlösung mit physiologischer Ionenstärke und/oder physiologischem pH- Wert vorliegt.
7. Verwendung eines Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Salzes mit Säuren davon zur a) Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen, b) Isolierung der zellulären Bestandteile des Blutes und/oder c) Haltbarmachung und Lagerung von Blutprodukten, insbesondere von Thrombozytenkonzentraten oder Thrombozytapheresekonzentraten.
8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei a) die Diagnose der Funktion der Thrombozyten, die Zählung, morphologische Beurteilung und Typisierung von Zellen im peripheren Blut und/oder die Bestimmung von Markern der aktivierten Thrombozyten zur Analyse von Hämostase und Fibrinolyse umfasst.
9. Röhrchen zur Entnahme von Blutproben, aufweisend einen Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Salz mit Säuren davon.
10. Aphereseschlauch-/beutelsystem, aufweisend wenigstens einen Auffangbeutel zur Aufnahme von Blut, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Auffangbeutel eine wirksame Menge an einem Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Salz mit Säuren davon aufweist.
11. Thrombozytenkonzentrat in einem sterilen Auffangbeutel für die Infusion, aufweisend einen Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Salz mit Säuren davon.
12. Kit zur Untersuchung von zellulären Blutbestandteilen, wenigstens umfassend einen Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa nach einem der Ansprüche 1-4 und ein Mittel zur Untersuchung von zellulären Blutbestandteilen.
13. Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit für die Thrombozytenfunktionsdiagnosik bestimmt ist und das Mittel zur Untersuchung von zellulären Blutbestandteilen ein Mittel zur Thrombozytenfunktionsdiagnostik ist.
14. Verfahren zur Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen, wobei man a) entnommenes Blut ex vivo antikoaguliert, indem man dem Blut wenigstens ein Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktors Xa zusetzt, und b) die zellulären Blutbestandteile des antikoagulierten Bluts untersucht.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die zellulären Blutbestandteile Thrombozyten sind und mit dem antikoagulierten Blut in Schritt b) ein Thrombozytenfunktionstest durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei das wenigstens eine Agens aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Otamixaban, Pefabloc tPA/Xa und CJ-FXa besteht.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Agens in flüssiger Form, vorzugsweise in physiologischer NaCl- Lösung oder einem Puffer mit physiologischer Ionenstärke und/oder physiologischem pH- Wert gelöst vorliegt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Agens in fester Form, vorzugsweise fein verteilt vorliegt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibitorwirkung gegenüber dem Blutgerinnungsfaktor Xa mit K; < 10 nM erfolgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Agens neben seiner Inhibitorwirkung gegenüber dem Blutgerinnungsfaktor Xa zusätzlich Inhibitorwirkung gegenüber wenigstens einem weiteren Blutgerinnungsfaktor aufweist.
21. Verwendung von antikoaguliertem Blut für die ex vivo-Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen, dadurch gekennzeichnet, dass das antikoagulierte Blut wenigstens ein Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa enthält.
22. Verwendung nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die zellulären Bestandteile Thrombozyten sind und das antikoagulierte Blut für die Thrombozytenfunktionsdiagnostik verwendet wird.
23. Verwendung eines Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa, zur Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen.
24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Diagnostik der zellulären Blutbestandteile auf die Thrombozytenfunktionsdiagnostik bezieht.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Agens aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Otamixaban, Pefabloc tPA/Xa und CJ-FXa besteht.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Agens in flüssiger Form, vorzugsweise in physiologischer NaCl-Lösung oder einem Puffer mit physiologischer Ionenstärke und/oder physiologischem pH- Wert gelöst vorliegt.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Agens in fester Form, vorzugsweise fein verteilt vorliegt.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibitorwirkung gegenüber dem Blutgerinnungsfaktor Xa mit K1 < 10 nM erfolgt.
29. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Agens neben seiner Inhibitorwirkung gegenüber dem Blutgerinnungsfaktor Xa zusätzlich Inhibitorwirkung gegenüber wenigstens einem weiteren Blutgerinnungsfaktor aufweist.
30. Kit für die Diagnostik von zellulären Blutbestandteilen, enthaltend a) wenigstens ein Agens mit direkter Inhibitorwirkung auf den Blutgerinnungsfaktor Xa und b) ein Mittel zur Untersuchung von zellulären Blutbestandteilen.
31. Kit nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit für die Diagnostik von Thrombozyten bestimmt ist und als Bestandteil b) ein Mittel zur Thrombozytenfunktionsdiagnostik enthält.
32. Kit nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Thrombozytenfunktionsdiagnostik oder der Kit als weiteren Bestandteil einen Aktivator der Thrombozyten umfasst.
33. Kit nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Agens aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Otamixaban, Pefabloc tPA/Xa und CJ- FXa besteht.
34. Kit nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Agens in flüssiger Form, vorzugsweise in physiologischer NaCl- Lösung oder einem Puffer mit physiologischer Ionenstärke und/oder physiologischem pH- Wert gelöst vorliegt.
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