WO2007080277A1 - Procede de preparation d' anticorps selectifs des recepteurs fc activateurs - Google Patents

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WO2007080277A1
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tumors
cells
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Sylvie Jorieux
Sophie Siberil
Jean-Luc Teillaud
Renée MENEZ
Enrico Stura
Frédéric Ducancel
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Lfb Biotechnologies
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Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of a selective antibody to Fc receptors of the ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) motif-promoting antibodies (FcRs), comprising the steps of obtaining monoclonal antibodies from a hybridoma, a heterohybridoma, or any animal, plant or human cell line, replacing each of the residues His 310 and His 435 (Kabat numbering) of the Fc region of said antibody by a residue chosen from lysine, alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, tryptophan, phenylalanine, serine or threonine, and then to select antibodies whose FcR patterned inhibitors ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) is decreased by at least 30%, preferably by at least 50%, 70%, 80% or at least 90% over the same antibody possessing a region Fc native.
  • FcRs Fc ⁇ RI (CD64, having isoforms A and B), Fc ⁇ RII receptor
  • Fc ⁇ RIII (CD16, possessing isoforms A and B).
  • the Fc ⁇ RRI and Fc ⁇ RIII receptors, as well as the Fc ⁇ RIIA receptor, are receptors qualified as "activators” because their activation, by via the ITAM motifs that their sequences or associated chain sequences comprise, allows the triggering of effector functions such as lysis of target cells.
  • the Fc ⁇ RIIB receptors are qualified as "inhibitory” receptors because they inhibit the activation receptor transduction pathways via their ITIM motifs that their sequences comprise and negatively modulate effector mechanisms such as those of the ADCC. induced by activating FcRs or other surface molecules such as antigen receptor B (BCR) or growth factor receptors like c-kit.
  • the diversity of FcR receptors in particular the existence of FcR activators and FcR inhibitors expressed on the same cells, is likely to modulate the efficacy of therapeutic antibodies, the commitment of FcR inhibitors counter-balancing the commitment of activating FcRs. .
  • the Applicant in the document WO 2005/040216, describes antibodies whose primary sequence is modified, of particular interest in IgG4 replacement therapy, or to prevent graft rejection, or as anti-tetanus, diphtheria or directed drugs. against certain pathogens or toxins derived.
  • the Applicant has surprisingly found that the modified antibody has retained its ability to induce an effector function dependent activating receptors, while it no longer has the ability to recruit inhibitory receptors.
  • the Applicant has sought to develop a method for providing therapeutic antibodies whose effectiveness, that is to say the ability to activate immune effector cells, is not modulated or limited by the diversity of FcR receptors, in particular by inhibitory FcRs.
  • the invention relates first of all to a method of preparing an antibody having the ability to recruit activating FcRs, but whose ability to recruit inhibitory FcRs is decreased relative to the same antibody having a native Fc region (c '). that is, whose Fc region selectively binds the Fc receptors of the activating antibodies (FcRs), comprising the following steps: a) obtaining monoclonal antibodies from hybridoma, heterohybridoma, or any animal, plant or human cell line, b) replacing each of the residues His 310 and His 435 (Kabat numbering) of the Fc region of the antibody with a residue chosen from lysine, alanine, glycine and valine , leucine, isoleucine, proline, methionine, tryptophan, phenylalanine, serine or threonine, c) selection of antibodies whose binding of the Fc region to the inhibitory FcR is decreased by at least 30%, preferably at least
  • antibody means any antibody, regardless of its specificity and its isotype, provided that it comprises an Fc region or a region having the same functions and characteristics as the Fc region. Thus, it may be a whole antibody or an antibody fragment, for example an antibody Fc fragment, or a fusion molecule comprising at one of its ends an Fc region.
  • the antibodies used in the method according to the invention may be IgG, that is to say any IgG1, any IgG2, any IgG3 (of G3m (s) or G3m (st) allotypes) and any IgG4, IgM, IgE, IgA or IgD, or a mixture of one or more them.
  • the antibodies used in the method of the invention may be monoclonal or polyclonal. In the case of monoclonal antibodies, these antibodies can be chimeric, humanized, human or of animal origin.
  • antibody also refers to an antibody composition, composed of antibody molecules having the same amino acid sequence, expressed in the same biological system, and comprising at least one pharmaceutically acceptable excipient or vehicle so that the composition may be formulated to allow pharmaceutical administration for prophylactic and / or therapeutic purposes.
  • the sequences coding for the modified antibody of the invention are expressed in a suitable biological system (step b ').
  • the term “same antibody” means an antibody not modified according to step b) of the process of the invention, and produced in the same biological production system as the modified antibody of the invention.
  • the "same antibody” has the same native primary sequence (apart from the His 310 and His 435 residues, which have been modified in the antibody of the invention) and has been subjected to the same post-translational modifications as the antibody obtained. by the process of the invention, since it has been produced in the same biological system.
  • the antibodies of step a) are obtained as monoclonal antibody compositions.
  • Each monoclonal antibody composition is composed of antibody molecules having the same amino acid sequence, and therefore the same specificity, expressed in the same biological system.
  • These compositions may, if appropriate, contain at least one excipient or a pharmaceutically acceptable vehicle so that these compositions may be formulated to allow pharmaceutical administration, for a prophylactic and / or therapeutic purpose.
  • the antibodies of step a) comprise a native Fc region, that is to say that they have histidine residues at position 310 and 435 (Kabat numbering) of their Fc region.
  • the Fc region of such antibodies binds to both activating and inhibitory receptors.
  • the term "native Fc region of the antibody” means any unmodified Fc region, by any chemical or biotechnological processes, on the residues His 310 and His 435.
  • Fc region is understood to mean Native of the antibody »any Fc region whose residues His 310 and His 435 have not been replaced, by chemical or biotechnological processes, a residue chosen from lysine, alanine, glycine, valine, leucine , isoleucine, proline, methionine, tryptophan, phenylalanine, serine or threonine.
  • the antibodies used in the invention may be chosen from anti-Ep-CAM, anti-KIR3DL2, anti-EGFR, anti-VEGFR, anti HER1, anti HER2, anti GD, anti GD2 Anti GD3, anti-CD20, anti CD-23, anti CD-25, anti-CD30, anti-CD33, anti-CD38, anti-CD44, anti CD52, anti CA125 and anti ProteinC, anti-HLA-DR, anti-virals: HBV, HCV, HIV and RSV, and more particularly from the antibodies of Table 1 below:
  • trastuzumab Genentech anti HER2 Mammal Carcinoma: HERCEPTIN Licensed to Ovarian Cancer
  • Epratuzumab Immuinedics / anti CD22 cancers Epratuzumab Immuinedics / anti CD22 cancers:
  • the antibodies of the invention possess the ability to recruit, that is to say to bind by their Fc region, activating FcR receptors, but their ability to engage, that is to say to bind by their Fc region, the inhibitory FcR receptors, is decreased or abolished with respect to the same antibody possessing a native Fc region.
  • activator FcR is meant Fc ⁇ RIIIA, Fc ⁇ RIIIB, Fc ⁇ RIIA, Fc ⁇ RIA and Fc ⁇ rib, Fc ⁇ R, Fc ⁇ RI and the human equivalent of Fc ⁇ RIV described in the mouse.
  • inhibitory FcR is meant Fc ⁇ RIIB.
  • the antibodies i.e., different antibody compositions, whose FcR binding is decreased relative to the same antibody having a native Fc region can be selected. This decrease can for example be measured by quantifying the number or percentage of cells expressing the FcRs to which the antibodies of the invention are bound, and comparing that number or percentage to that of the FcR expressing cells on which the antibodies having a native Fc region are bound .
  • the antibodies that is to say different antibody compositions, whose binding to inhibitory Fc ⁇ R is abolished with respect to the same antibody possessing a region, are selected in step c).
  • Native Fc according to a method similar to that described above.
  • the antibodies prepared according to the method of the invention have an Fc region which binds to the activating FcRs but does not bind to the inhibitory receptors, whereas the same antibody produced by the same biological system but having a region
  • Fc unmodified according to the method of the invention binds, by its Fc region, Fc ⁇ R activators and Fc ⁇ R inhibitors.
  • the His 310 and His 435 residues are replaced by a lysine residue. In a preferred embodiment of the invention, the His 310 and His 435 residues are replaced by site-directed mutagenesis or by molecular evolution.
  • residues His 310 and His 435 are modified by means of a chemical treatment, for example by DEPC treatment.
  • an antibody with a residue chosen from lysine, alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, tryptophan, phenylalanine, serine or threonine, and preferentially lysine has a major impact on fixation.
  • the antibody thus modified with inhibitory FcRs, and in particular with Fc ⁇ RIIB and has a moderate effect on its binding to activating FcRs, and in particular to Fc ⁇ RIIIAs.
  • the antibody of the invention thus modified no longer binds or almost no longer the human Fc ⁇ RIIB inhibitory receptor in an in vitro binding assay, whereas its attachment to the activating receptors Fc ⁇ RIIIA and Fc ⁇ RIIA is only very partially inhibited compared to the non-mutated antibody (see below).
  • This mutated antibody is an antibody capable of engaging the activating receptors (Fc ⁇ RIIA and Fc ⁇ RIIIA) involved in the ADCC-type cytotoxicity by avoiding engaging the inhibitory Fc ⁇ RIIB.
  • Such an antibody therefore makes it possible to induce an ADCC against target cells (red blood cells, tumor cells, allo-reactive cells, cells infected by microbial pathogens) without this ADCC being negatively modulated as a result of the Fc ⁇ RIIB commitment.
  • target cells red blood cells, tumor cells, allo-reactive cells, cells infected by microbial pathogens
  • Such an antibody also makes it possible to optimize the antigenic presentation by dendritic cells because the immune complexes containing this mutated antibody are captured only by the Fc ⁇ R activators expressed on the dendritic cells, without activating the Fc ⁇ RIIB inhibitors, also present on these cells. .
  • This "differential" behavior on the activating and inhibitory receptors is an essential asset for using the antibodies of the invention in therapy, particularly in the context of cancer or infectious diseases. Indeed, such an antibody is capable of inducing ADCC mechanisms via the Fc ⁇ R activators without these being modulated negatively by the Fc ⁇ R inhibitors.
  • the Applicant has found that such an antibody recruits only Fc ⁇ R activators on dendritic cells and does not recruit Fc ⁇ R inhibitors on the surface of the same cells.
  • Fc ⁇ R inhibitors on the surface of dendritic cells has a negative effect on the maturation of these cells and on their ability to efficiently present an antigen to effector T cells, making these dendritic cells tolerogenic.
  • the resulting antigenic presentation by the dendritic cells will be optimal and the activation effect of the immune response specific optimized.
  • the Fc region of the antibody resulting from the process of the invention binds to the activating Fc receptors while it does not bind to the Fc inhibitory receptors.
  • the antibody of the method of the invention does not recruit inhibitory Fc receptors, especially inhibitory Fc receptors expressed by B lymphocytes.
  • the antibody of the method of the invention does not recruit the inhibitory Fc receptors but binds a molecule to the surface of B lymphocytes.
  • the antibody of the invention does not recruit inhibitory Fc receptors but binds a molecule to the surface of tumor cells, in particular to the surface of B tumor cells.
  • the antibody of the invention does not recruit the inhibitory Fc receptors but binds a molecule to the surface of the B-CLL tumor cells.
  • the antibody of the invention does not recruit Fc receptors. inhibitors but binds the CD20 molecule to the surface of tumor lymphocytes of LLC-B.
  • the antibody of the process of the invention binds to the Fc ⁇ RIII receptor (isoforms A and B) and / or to the Fc ⁇ RIIA receptor and / or to the Fc ⁇ RI receptor (isoforms A and B), while does not bind Fc ⁇ RIIB receptors (isoform B1 and B2).
  • the Fc ⁇ RIIB receptor is the Fc ⁇ RIIB1 receptor.
  • the receptors involved in the method of the invention are human receptors.
  • the receptors of the Fc region of the antibodies are found on monocytes, macrophages, dendritic cells, NK cells, B lymphocytes, monocytes, macrophages, B lymphocytes.
  • Fc antibodies are found on tumor cells, such as malignant melanoma cells, tumor B cells such as lymphomas, B-CLL cells (B-cell chronic leukemia) and myeloma cells.
  • tumor B cells such as lymphomas
  • B-CLL cells B-cell chronic leukemia
  • myeloma cells binds, by its variable region, the CD20 molecule on the surface of tumor lymphocytes of LLC-B.
  • Such an antibody of the invention does not recruit inhibitory Fc receptors, especially on the surface of tumor lymphocytes of LLC-B.
  • the antibodies used in the method of the invention are monoclonal antibodies.
  • These monoclonal antibodies can be produced by any suitable biological system, in the form of monoclonal antibody compositions, which compositions can contain at least one excipient or a pharmaceutically acceptable carrier so that these compositions can be formulated to allow pharmaceutical administration, in a prophylactic and / or therapeutic purpose.
  • biological system animal or plant cell lines transfected with one or more vectors to express said antibody, transgenic non-human plants or animals, as well as any hybridoma, heterohybridoma.
  • cells from cell lines transfected with a vector comprising the gene encoding said antibody, for example eukaryotic or prokaryotic cells, including mammalian cells, insect, ⁇ plants, bacteria or yeasts.
  • eukaryotic or prokaryotic cells including mammalian cells, insect, ⁇ plants, bacteria or yeasts.
  • rat myeloma cells such as YB2 / 0 (ATCC CRL 1662 0).
  • CHO cells in particular CHO-K, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO Pro-5, CHO dhfr- or other cell lines among Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS- 7, 293-HEK, K6H6, NSO, SP2 / O-Ag 14 and P3X63Ag8.653, PERC6 or BHK.
  • Another subject of the invention is the use of an antibody, each of whose residues His 310 and His 435 (Kabat numbering) of its Fc region has been replaced by a residue chosen from lysine, alanine and glycine.
  • an antibody is used, each of whose His 310 and His 435 residues (Kabat numbering) of its Fc region has been replaced by a lysine residue.
  • Another subject of the invention relates to the use of an antibody, each of whose residues His 310 and His 435 (Kabat numbering) is replaced by a residue chosen from lysine, alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, tryptophan, phenylalanine, serine or threonine, or an antibody produced from the process of the invention for obtaining a medicament for treatment of cancer, and more particularly to the treatment of lymphomas, leukemias, myelomas, sarcomas, solid tumors such as breast carcinomas, colorectal tumors, pancreatic tumors, prostate tumors, stomach tumors, pulmonary tumors, ovarian tumors, cervical tumors uterus, eye tumors, thyroid tumors, tumors of the ENT sphere melanoma malignant, nerve tumors such as glioblastoma, and neuroblastomas.
  • lymphomas leukemias, myelo
  • an antibody is used, each of whose His 310 and His 435 residues (Kabat numbering) of its Fc region has been replaced by a lysine residue.
  • Another subject of the invention is the use of an antibody, each of whose residues His 310 and His 435 (Kabat numbering) is replaced by a residue chosen from lysine, alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, tryptophan, phenylalanine, serine or threonine, or an antibody produced from the process of the invention, for obtaining a medicament for the treatment of infectious diseases such as HIV infection, HBV, HCV, RSV (respiratory syncytial virus), SARS virus, rotavirus, influenza viruses, smallpox, bacterial infections such as Koch's bacillus, meningococci, Criptoccocus neoformans, Clostridium, bacteria responsible for Botulism, Anthrax
  • anthrax tetanus, tuberculosis, and enterococcal infections.
  • an antibody is used, each of whose His 310 and His 435 residues (Kabat numbering) of its Fc region has been replaced by a lysine residue.
  • a final aspect of the invention relates to an antibody composition whose binding to inhibitory FcR is decreased by at least 30%, preferably by at least 50%, 70%, 80% or at least 90% or 100% with respect to the same antibody having a native Fc region.
  • the composition of the invention is a composition whose Fc region of the antibodies has a capacity for binding to inhibitory receptors abolished with respect to the same antibody having a native Fc region.
  • the composition of the invention is an anti-CD20 antibody composition.
  • Figure 2 Effect of mutation of histidines 310 and 435 of anti-RhD mAb Tl25 (YB2 / 0) in lysines on the ability of the antibody to bind human RFc ⁇ .
  • Figure 3 Effect of histidine mutation 310 and 435 of the anti-RhD mAb T125 (YB2 / O) on the ability of mAb to induce IL-2 production dependent on human RFc ⁇ lIIA.
  • FIG. 4 Comparison of the binding of Tl25 (YB2 / 0), the double mutant T125 (YB2 / O) His 310 LyS / His 435 Lys and T125 (CHO) to human RFc ⁇ lIIA and RFcylIB.
  • Figure 5 Effect of histidine mutation 310 and 435 of the anti-RhD monoclonal antibody T125 (YB2 / O) on the ability of the monoclonal antibody to induce a human RFc ⁇ IIIA-dependent ADCC relative to the wild-type antibody produced in YB2 / 0 and to the native antibody (wild-type) produced in CHO.
  • FIG. 6 Surface representation of crystallographic structures of Fc fragments of T125 (YB2 / O) in the presence of Zinc (A) and the double mutant T125 H310K-H435K (YB2 / 0) (B).
  • the YB2 / 0 (rat myeloma, ATCC line # CRL 1662) line transfected and producing the EMAB5 antibody (described in WO 2005/040216), which is a human IgG1 (Y) directed against the Rh antigen ( D), was adapted to culture in serum-free medium.
  • EMAB5 was purified by affinity chromatography on Protein A Sepharose.
  • the major glycanic structure is a biantennary-type oligosaccharide containing about 25% fucose.
  • the purified EMAB5 antibody is dialyzed overnight against 50 mM Tris buffer, pH 8.0.
  • the antibody solution adjusted to 50 mM CaC12 and 10 mM cysteine, is incubated
  • the reaction is stopped by the addition of diisopropyl fluorophosphate (1 mM final).
  • the hydrolyzate is dialyzed overnight against 50 mM Imidazole buffer, pH 7.8.
  • the dialyzed hydrolyzate is contacted with Affarose-protein L at a rate of 1 ml of gel per 3.6 mg of antibody.
  • the gel is mounted in a column and washed with 50 mM Imidazole buffer, pH 7.8.
  • the effluent and wash buffer which contain the Fc fragments are pooled, concentrated by centrifugation on Vivaspin 20 using the conditions described by the manufacturer.
  • the expression vector containing the cDNA encoding the amino acid sequence of the heavy chain of the anti-Rh (D) antibody EMAB5 served as a template for carrying out a double directed mutagenesis performed by PCR ("PCR-based site-directed mutagenesis "). The following four nucleotide substitutions were introduced:
  • the heavy chain of the mutated antibody has the nucleotide sequence sequence SEQ ID NO: 1, and for peptide sequence SEQ ID NO: 2 (the mutated amino acids appear on the sequence SEQ ID NO: 2 at position 338 and 463 respectively for the amino acids Lys310 and Lys435).
  • the numbering takes into account the leader sequences (338 and 463) or not (in the latter case, it is the so-called Kabat numbering which has been used: 310 and 435).
  • YB2 / 0 cells co-transfected by electroporation with the mutated vector EMAB5-H-K338-K463-1 and the EMAB5-dhfr-K-SpeI vector encoding the light chain of the EMAB5 antibody, are cultured in RPMI medium supplemented with 5% dialyzed SVF, 0.5% G418 and 25 nM methotrexate (MTX). Clones secreting the highest levels of human IgG are cultured in 24-well plates in medium without MTX. The supernatants, harvested after 7 days of culture, are used to make the tests described below.
  • RPMI medium supplemented with 5% dialyzed SVF, 0.5% G418 and 25 nM methotrexate (MTX).
  • EXAMPLE 2 Effect of modification of histidines of the CH2 / CH3 interface of a monoclonal anti-RhD IgG1 by diethylpyrocarbonate (DEPC) on human IgG1 / RF0 ⁇ interactions.
  • DEPC diethylpyrocarbonate
  • T125 (YB2 / O) was treated with diethylpyrocarbonate
  • DEPC modifies the histidine residues by creating a covalent bond between a nitrogen atom of the histidine ring and a carbon atom of the DEPC molecule.
  • Monoclonal antibodies treated or not treated with DEPC are fractionated on a protein A-Sepharose column. Histidine 435 being important for the binding of IgG to protein A, the monoclonal antibody fraction treated with DEPC and not retained on protein A corresponds to IgG1 of which at least His 435 have been modified.
  • Monoclonal antibodies Tl25 (YB2 / 0) untreated or treated with DEPC and not retained on protein A were compared for their attachment to different types of human RFc ⁇ ( Figure 1).
  • the indicator cells Jurkat-huRFcylIIA (A) r K562 (B) IIA.1.6-huRFc ⁇ IIB1 (C) and Tf2-13 (D) are incubated with different concentrations of T125 (YB2 / O) treated or not treated with DEPC.
  • T125 binds to RFc ⁇ lIIA at low concentration (from 0.05 ⁇ g / ml) and has a very high binding at 0.5 ⁇ g / ml (95% of positive cells).
  • this monoclonal antibody is treated with DEPC, its binding is decreased at a high concentration (between 1 and 5 ⁇ g / ml) (approximately 90% reduction at 1 ⁇ g / ml) and becomes marginal at low concentration (between 0.025 ⁇ g / ml).
  • Example 3 Effect of mutations of His 435 and His 310 residues of an anti-RM) monoclonal IgG1 on human IgG1 / RFcy interactions. Previous results indicate that modification of His residues of a monoclonal IgG1 affects its interactions with human RFcy. However, treatment with DEPC does not make it possible to determine which His have been modified.
  • the indicator cells Jurkat-huRFc ⁇ IIIA (A), K562 (B), IIA.1.6-huRFc ⁇ IIB1 (C) and Tf2-13 (D) are incubated with different concentrations of T125 (YB2 / O) or of the double mutant Tl25 ( YB2 / 0) His 310 Lys / His 435 Lys.
  • the binding of the mAbs is detected by F (ab ') 2 fragments of anti-human IgG (H + L) mice coupled to FITC).
  • IL-2 production induced by 1, 5 and 10 ⁇ g / ml of mutated T125 (YB2 / O) is reduced by 61%, 53%, and 54%, respectively, compared to IL-2 release induced by the same doses of the non-mutated monoclonal antibody (Figure 3).
  • RFc ⁇ IIIA + are stimulated during 151a at 37 ° C. by different concentrations of T125 (YB2 / O) or of the double mutant Tl25 (YB20) His 310 Lys / His 435 Lys, in the presence of rabbit F (ab ') 2 fragments anti-human IgG (H + L) allowing the aggregation of anti-RhD human monoclonal antibodies.
  • IL-2 production by Jurkat-huRFc ⁇ IIIIA cells is then detected by ELISA. Induced IL-2 production in the presence of different concentrations of the two mAbs is reported as a percentage of that induced by 10 ⁇ g / ml T125 (YB2 / O)).
  • T125 YB2O
  • His 310 Lys / His 435 Lys is an antibody capable of engaging the activating receptors (RFc ⁇ lIA and RFc ⁇ IIIA), but whose ability to fix the inhibiting RFc ⁇ lIB is abolished.
  • RFc ⁇ lIA and RFc ⁇ IIIA activating receptors
  • T125 (YB2 / O), T125 (YB2 / 0) HiS 310 LyS / HiSH 435 LyS and T125 (CHO) mAbs to human RFcyIIIA (A), and RFcyIIBl (C) a was analyzed by indirect immunofluorescence.
  • the indicator cells Jurkat-huRFc ⁇ lIIA (A), or HA.1.6-huRFc ⁇ lIB1 (C) are incubated with different concentrations of T125 (YB2 / O), T125 (YB2 / O) His 310 Lys / His 435 Lys and T125 (CHO) .
  • the binding of the monoclonal antibodies is detected by human anti-IgG (H + L) mouse F (ab ') 2 fragments coupled to FITC. (B) and (D), the capacities of the monoclonal antibodies T125 (YB2 / 0), T125 (YB2 / O) His 310 Lys / His 435 Lys and
  • the indicator cells Jurkat-huRFc ⁇ lIIA (B) or IIA.1.6-huRFc ⁇ IIB1 (D) are incubated with different concentrations of T125 (YB2 / O), or of Tl25 (YB2 / 0) His 310 Lys / His 435 Lys or T125 ( CHO), then with 40 ng / ml 3G8-PE (B) or 40 ng / ml AT10-FITC (D), respectively.
  • T125 (CHO) which is more fucosylated than T125 (YB2 / O)
  • T125 (YB2 / O)
  • T125 YB2 / O
  • RFc ⁇ IIBl-dependent inhibitory functions On the other hand, it only weakly binds human RFc ⁇ lIIAs and is a bad inducer of the RFc ⁇ lIIA-dependent activating functions.
  • Concentrations of approximately 15 ⁇ g / ml for T125 (YB2 / O) and 40 ⁇ g / ml for T125 (YB2 / O) His 310 Lys / His 435 Lys are required to induce a 50% inhibition of uptake.
  • monoclonal antibody to the RFcylIIA 3G8-PE expressed on the surface of Jurkat-huRFc ⁇ lIIA cells are required to induce a 50% inhibition of uptake.
  • a dose of T125 (CHO) greater than 100 ⁇ g / ml (approximately 130 ⁇ g / ml) is necessary to achieve 50% inhibition of the binding of 3G8-PE.
  • the double mutant Tl25 (YB20) His 310 Lys / His 435 Lys is incapable of inhibiting the binding of 40 ng / ml of the ATlO-FITC antibody (anti-RFc ⁇ IIA / RFc ⁇ IIB mAb). human) to HA.1.6-huRFc ⁇ IIB1 cells, whereas T125 (CHO) is capable of inducing inhibition of binding of ATlO-FITC antibody to RFc ⁇ lIB1, although this is lower than that induced by T125 (YB2). / O) ( Figure 4D).
  • T125 (YB2O) His 310 Lys / His 435 Lys behaves differently from that of T125 (CHO), in terms of interactions with the RFc ⁇ : T125 (YB2O) His 310 Lys / His 435 Lys effectively recruits RFc ⁇ lIIA activators.
  • this monoclonal antibody is unable to engage RFcylIB.
  • the ability to induce ADCC lysis of Rh-positive RBCs induced by different anti-Ds in the presence of mononuclear cells (effector cell source) and Tegeline (2500 ⁇ g / ml) was compared for different anti-D antibodies.
  • the antibody AD1 is an anti-D antibody that does not trigger an ADCC response and thus serves as a negative control.
  • T125 antibody has been expressed in two different cell types: YB2 / 0
  • T125 antibody was mutated to replace each of its His 310 and His 435 residues with lysine residues (T125 (YB2 / O) His310Lys / His435Lys).
  • the mutated antibody Histidine (H310K H435K) induces an ADCC of Rhesus positive red cells, slightly lower than that obtained with the non-mutated antibody T125 (YB2 / O), but much higher AD1. It should be noted that under these experimental conditions, the anti-D control antibody expressed in CHO does not induce or very little ADCC
  • Example 7 Structural impact of the mutation of histidines 310 and 435 in Lysine

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un anticorps sélectif envers les récepteurs de la région Fc des anticorps (FcR) activateurs à motif (s) ITAM ( immunoreceptor tyrosine- based activât ion motif) , comprenant les étapes d'obtention d'anticorps monoclonaux à partir d'hybridome, d'hétérohybridome, ou de toute lignée cellulaire animale, végétale ou humaine, de remplacement de chacun des résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) de la région Fc dudit anticorps par un résidu choisi parmi la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, l ' isoleucine, la proline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine, puis de sélection des anticorps dont la fixation aux FcR inhibiteurs à motifs ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) est diminuée d'au moins 30%, de préférence d'au moins 50%, 70%, 80% ou encore d'au moins 90% par rapport au même anticorps possédant une région Fc native. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un anticorps issu du procédé de l'invention dans l'obtention d'un médicament destiné notamment au traitement du cancer et de pathologies infectieuses .

Description

Procédé de préparation d' anticorps sélectifs des récepteurs Fc activateiirs
La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un anticorps sélectif envers les récepteurs de la région Fc des anticorps (FcR) activateurs à motif (s) ITAM (immunoreceptor tyrosine- based activation motif) , comprenant les étapes d'obtention d'anticorps monoclonaux à partir d'un hybridome, d'un hétérohybridome, ou de toute lignée cellulaire animale, végétale ou humaine, de remplacement de chacun des résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) de la région Fc dudit anticorps par un résidu choisi parmi la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 1 ' isoleucine, la proline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine, puis de sélection des anticorps dont la fixation aux FcR inhibiteurs à motifs ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) est diminuée d'au moins 30%, de préférence d'au moins 50%, 70%, 80% ou encore d'au moins 90% par rapport au même anticorps possédant une région Fc native. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un anticorps issu du procédé de l'invention dans l'obtention d'un médicament destiné notamment au traitement du cancer et de pathologies infectieuses.
Introduction et art antérieur
De nombreuses préparations d'anticorps à usage thérapeutique, d'origine plasmatique ou biotechnologique, sont actuellement sur le marché, ou en phase de développement clinique. Leurs propriétés sont exploitées pour obtenir des outils thérapeutiques capables de se lier de manière spécifique à leur cible, et de recruter de manière efficace les cellules de l ' immunité .
Ces dernières années, la recherche s'est orientée sur l'amélioration de l'efficacité des anticorps, et plus particulièrement vers la manipulation de leur région constante Fc. C'est cette dernière gui est responsable des propriétés « effectrices » des anticorps, car elle permet la mobilisation des cellules immunitaires effectrices et des molécules du complément. Cette faculté est rendue possible par la présence, sur certaines cellules immunitaires, de glycoprotéines , les récepteurs Fc ou FcR. Ces récepteurs sont capables de se lier à la région constante des anticorps, en particulier une fois que ces derniers ont fixé, par leur région variable, l'antigène cible. Au contact de ces cellules, les anticorps déclenchent différents mécanismes cellulaires comme la phagocytose et l 'ADCC
(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) .
Toutefois, il existe différentes classes de FcR humains. Ceux-ci sont codés par huit gènes humains, tous localisés sur le chromosome 1. Certains de ces gènes présentent un polymorphisme allélique générant différents allotypes de récepteurs ayant alors différentes propriétés de fixation aux IgG (Hulett M. D. & Hogarth P.M. , Advances in Immunology, vol. 57, pp.1-127, 1994) conduisant à des propriétés effectrices différentielles (Carton et al. (2002) Blood, vol. 99, n°3, 754-758). Les principales classes de FcR humains identifiées sont le FcγRI (CD64, possédant les isoformes A et B) , le récepteur FcγRII
(CD32, possédant les isoformes A et B) et le récepteur
FcγRIII (CD16, possédant les isoformes A et B) . Les récepteurs FcyRI et FcγRIII, ainsi que le récepteur FcγRIIA sont des récepteurs qualifiés d'« activateurs », car leur activation, par l'intermédiaire des motifs ITAM que leurs séquences ou les séquences de chaînes associées comportent, permet le déclenchement de fonctions effectrices comme la lyse des cellules cibles. A l'inverse, les récepteurs FcγRIIB sont qualifiés de récepteurs « inhibiteurs », car ils inhibent les voies de transduction des récepteurs activateurs par l'intermédiaire de leurs motifs ITIM que leurs séquences comportent et modulent négativement les mécanismes effecteurs comme ceux de l'ADCC induits par l'intermédiaire des FcR activateurs ou d'autres molécules de surface comme le récepteur B de l'antigène (BCR) ou des récepteurs de facteurs de croissance comme c-kit.
Ainsi, la diversité des récepteurs FcR, notamment l'existence de FcR activateurs et de FcR inhibiteurs exprimés sur les mêmes cellules est susceptible de moduler l'efficacité des anticorps thérapeutiques, l'engagement des FcR inhibiteurs contre-balançant 1 ' engagement des FcR activateurs .
Il était donc dans l'intention du Demandeur de fournir un anticorps thérapeutique dont l'efficacité, c'est-à- dire la capacité à activer les cellules immunitaires effectrices, n'est pas ou peu modulée par la diversité des récepteurs FcR, en- particulier par les FcR inhibiteurs .
Le Demandeur, dans le document WO 2005/040216, décrit des anticorps dont la séquence primaire est modifiée, présentant un intérêt particulier en thérapie en remplacement des IgG4, ou pour prévenir les rejets de greffe, ou encore comme anti-tétaniques, antidiphtériques ou dirigés contre certains agents pathogènes ou toxines dérivées . Toutefois, le Demandeur a constaté de manière surprenante que l'anticorps ainsi modifié a conservé sa capacité à induire une fonction effectrice dépendante des récepteurs activateurs, tandis qu'il ne possède plus la capacité de recruter les récepteurs inhibiteurs .
Ainsi, le Demandeur a cherché à mettre au point un procédé permettant de fournir des anticorps thérapeutiques dont l'efficacité, c'est-à-dire la capacité à activer les cellules immunitaires effectrices, n'est pas ou peu modulée par la diversité des récepteurs FcR, en particulier par les FcR inhibiteurs .
Description détaillée de l'invention
L'invention se rapporte en premier lieu à un procédé de préparation d'un anticorps possédant la capacité de recruter les FcR activateurs, mais dont la capacité à recruter les FcR inhibiteurs est diminuée par rapport au même anticorps possédant une région Fc native (c'est-à-dire dont la région Fc lie sélectivement les récepteurs de la région Fc des anticorps (FcR) activateurs), comprenant les étapes suivantes : a) obtention d'anticorps monoclonaux à partir d'hybridome, d'hétérohybridome, ou de toute lignée cellulaire animale, végétale ou humaine, b) remplacement de chacun des résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) de la région Fc de l'anticorps par un résidu choisi parmi la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, l ' isoleucine, la proline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine, c) sélection des anticorps dont la fixation de la région Fc aux FcR inhibiteurs est diminuée d'au moins 30%, de préférence d'au moins 50%, 70%, 80% ou encore d'au moins 90% par rapport au même anticorps possédant une région Fc native. Aux fins de l'invention, on entend par « anticorps » tout anticorps, quelle que soit sa spécificité et son isotype, à condition qu'il comporte une région Fc ou une région possédant les mêmes fonctions et les mêmes caractéristiques que la région Fc. Ainsi, il peut s'agir d'un anticorps entier ou d'un fragment d'anticorps, par exemple un fragment Fc d'anticorps, ou une molécule de fusion comprenant à l'une de ses extrémités une région Fc. De plus, les anticorps mis en œuvre dans le procédé selon l'invention peuvent être des IgG, c'est-à-dire toute IgGl, toute IgG2, toute IgG3 (d'allotypes G3m(s) ou G3m(st) ) et toute IgG4, des IgM, des IgE, des IgA ou des IgD, ou encore un mélange d'un ou plusieurs entre eux. De plus, les anticorps mis en œuvre dans le procédé de l'invention peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. Dans le cas où il s'agit d'anticorps monoclonaux, ces anticorps peuvent être chimériques, humanisés, humains ou d'origine animale.
Par ailleurs , le terme « anticorps » désigne également une composition d'anticorps, composée de molécules d'anticorps possédant la même séquence en acides aminés, exprimées dans le même système biologique, et comprenant au moins un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable de sorte que la composition puisse être formulée pour permettre une administration pharmaceutique, dans un but prophylactique et/ou thérapeutique.
A l'issue de l'étape b) , les séquences codant pour l'anticorps modifié de l'invention sont exprimées dans un système biologique adapté (étape b') . Aux fins de l'invention, on entend par « même anticorps », un anticorps non modifié selon l'étape b) du procédé de l'invention, et produit dans le même système de production biologique que l'anticorps modifié de l'invention. Le « même anticorps » possède la même séquence primaire native (en dehors des résidus His 310 et His 435, qui ont été modifié dans l'anticorps de l'invention) et a été soumis aux mêmes modifications post-traductionnelles que l'anticorps obtenu par le procédé de l'invention, puisqu'il a été produit dans le même système biologique. Aux fins de l'invention, les anticorps de l'étape a) sont obtenus sous forme de compositions d'anticorps monoclonaux. Chaque composition d'anticorps monoclonaux est composée de molécules d'anticorps possédant la même séquence en acides aminés, et donc la même spécificité, exprimées dans le même système biologique. Ces compositions peuvent, le cas échéant, contenir au moins un excipient ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable de sorte que ces compositions puissent être formulées pour permettre une administration pharmaceutique, dans un but prophylactique et/ou thérapeutique.
Les anticorps de l'étape a) comportent une région Fc native, c'est-à-dire qu'ils possèdent des résidus histidine en position 310 et 435 (numérotation de Kabat) de leur région Fc. De préférence, la région Fc de tels anticorps se lie à la fois aux récepteurs activateurs et aux récepteurs inhibiteurs . Aux fins de l'invention, on entend par « région Fc native de l'anticorps » toute région Fc non modifiée, par tous procédés chimiques ou biotechnologiques, sur les résidus His 310 et His 435. Plus particulièrement, on entend par « région Fc native de l'anticorps » toute région Fc dont les résidus His 310 et His 435 n'ont pas été remplacés , par des procédés chimiques ou biotechnologiques, un résidu choisi parmi la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, l' isoleucine, la proline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine.
A titre d'exemple, les anticorps mis en œuvre dans l'invention, peuvent être choisis parmi les anti-Ep- CAM, anti-KIR3DL2, anti-EGFR, anti-VEGFR, anti HERl, anti HER2, anti GD, anti GD2 , anti GD3 , anti-CD20, anti CD-23, anti CD-25, anti-CD30, anti-CD33, anti- CD38, anti-CD44, anti CD52 , anti CA125 et anti ProteinC, anti-HLA-DR, les anti-viraux: HBV, HCV, HIV et RSV, et plus particulièrement parmi les anticorps du Tableau 1 ci-après :
Tableau 1 :
Nom et Société cible indication marque commerciale de l ' anticorps Edrecolomab Centocor anti Ep- cancer colorectε
PANOREX CAM
Rituximab Idée anti CD20 lymphome des cellul
RITUXAN Licencié à Genentech/ purpura thrombocytop' Hoffman la roche
Trastuzumab Genentech anti HER2 Carcinome mammai: HERCEPTIN Licencié à cancer ovarien
Hoffman la roche/Immunog en
Palivizumab Medimmune RSV SYNAGIS Licencié à
Abott
Alemtuzumab BTG anti CD52 Leucémies (LLC-E CAMPATH Licensié à Schering ibritumomab IDEC anti CD20 NHL tiuxetan Licencié à
ZEVALIN Schering
Cetuximab Merck /BMS / anti EGFR Cancers ovariens
IMC-C225 Imclone coloréetaux, mamma
Bevacizumab Genentech/ anti Cancers colorectε
AVASTIN Hoffman la VEGFR roche
Epratuzumab Immuinedics/ anti CD22 cancers :
Amgen lymphome non hogkd
Hu Ml95Mab Protein Anti cancers
Design Labs CD33
MDX-210 Immuno- ND cancers
Designed
Molécules
BEC2 Imclone anti GD3 Cancers (glioblasti
Mitumomab mélanome malin, neuroblastome)
Oregovomab Altarex anti cancer ovarien
OVAREX CAl25
Ecromexinaab Kyowa-Hakko anti GD3 mélanome malir
KW-2971
ABX-EGF Abgenix EGF cancers
MDXOlO Medarex Anti Cancers
CD4R
XTL 002 XTL ND anti-viral : HC1 biopharmaceut icals
HIl SCFV viventia ND cancers biotech
4B5 viventia anti GD2 cancers biotech
XTL 001 XTL ND anti-viral : ΗB\ biopharmaceut icals
MDX-070 MEDAREX Anti-PSMA cancer de la Prosi
• TNX-901 TANOX anti IgE Allergies
IDEC-114 IDEC inhibition lymphome non-Hodgk: ProteinC
Aux fins de l'invention, on entend par « anticorps sélectif envers les récepteurs de la région Fc des anticorps (FcR) activateurs » ou « anticorps dont la région Fc lie sélectivement les récepteurs de la région Fc des anticorps (FcR) activateurs » tout anticorps gui possède la capacité de recruter les FcR activateurs mais qui possède une capacité d'engager les FcR inhibiteurs diminuée, voire nulle, par rapport au même anticorps possédant une région Fc native. Ainsi, les anticorps de l'invention possèdent la capacité de recruter, c'est-à-dire de lier par leur région Fc, les récepteur FcR activateurs, mais leur capacité d'engager, c'est-à-dire de lier par leur région Fc, les récepteurs FcR inhibiteurs, est diminuée ou abolie par rapport au même anticorps possédant une région Fc native.
Par FcR activateur on entend désigner les FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcyRIIA, FcγRIA et FcγRIB, le FcγR, le FcγRI et l'équivalent humain du FcγRIV décrit chez la souris. Par FcR inhibiteur, on entend désigner les FcγRIIB.
Lors de l'étape c) , on peut sélectionner les anticorps, c'est-à-dire différentes compositions d'anticorps, dont la fixation aux FcR est diminuée par rapport au même anticorps possédant une région Fc native. Cette diminution peut par exemple être mesurée par la quantification du nombre ou du pourcentage de cellules exprimant les FcR sur lesquelles les anticorps de l'invention sont liés, et en comparant ce nombre ou ce pourcentage à celui des cellules exprimant les FcR sur lesquelles les anticorps possédant une région Fc native sont liés. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on sélectionne à l'étape c) les anticorps c'est-à-dire différentes compositions d'anticorps, dont la fixation aux FcγR inhibiteurs est abolie par rapport au même anticorps possédant une région Fc native, selon une méthode similaire à celle décrite précédemment. Ainsi, les anticorps préparés selon le procédé de l'invention possèdent une région Fc qui se fixe sur les FcR activateurs mais ne se fixe pas sur les récepteurs inhibiteurs, alors que le même anticorps produit par le même système biologique mais possédant une région
Fc non modifiée selon le procédé de l'invention se fixe, par sa région Fc, aux FcγR activateurs et aux FcγR inhibiteurs .
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on remplace les résidus His 310 et His 435 par un résidu lysine. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on remplace les résidus His 310 et His 435 par mutagenèse dirigée ou par évolution moléculaire.
Dans un autre mode de réalisation, on modifie les résidus His 310 et His 435 au moyen d'un traitement chimique, par exemple par traitement par le DEPC
(Diéthylpyrocarbonate, qui est un agent modifiant les histidines) .
Le Demandeur a constaté de manière surprenante que la mutation des deux résidus histidines particuliers His
310 et His 435 situés à l'interface CH2/CH3 d'un anticorps par un résidu choisi parmi la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 1 'isoleucine, la proline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine, et de manière préférentielle par la lysine, a un impact majeur sur la fixation de l'anticorps ainsi modifié aux FcR inhibiteurs, et en particulier aux FcγRIIB, et a un effet modéré sur sa fixation aux FcR activateurs, et notamment aux FcγRIIIA. Le Demandeur a mis en évidence que l'anticorps de l'invention ainsi modifié ne lie plus ou quasiment plus le récepteur inhibiteur FcγRIIB humain dans un test de liaison in vitro alors que sa fixation aux récepteurs activateurs FcγRIIIA et FcγRIIA n'est que très partiellement inhibée par rapport à l'anticorps non muté (voir ci-dessous) . Cet anticorps muté est un anticorps capable d'engager les récepteurs activateurs (FcγRIIA et FcγRIIIA) impliqués dans la cytotoxicité de type ADCC en évitant d'engager le FcyRIIB inhibiteur. Un tel anticorps permet donc d'induire une ADCC contre des cellules cibles (globules rouges, cellules tumorales, cellules allo-réactives, cellules infectées par des pathogènes microbiens) sans que cette ADCC ne soit modulée négativement à la suite de l'engagement du FcyRIIB. Un tel anticorps permet aussi d'optimiser la présentation antigénique par des cellules dendritiques du fait que les complexes immuns contenant cet anticorps muté ne sont capturés que par les FcγR activateurs exprimés sur les cellules dendritiques, sans activer les FcγRIIB inhibiteurs, également présents sur ces cellules.
Ce comportement « différentiel » sur les récepteurs activateurs et inhibiteurs est un atout essentiel pour utiliser les anticorps de l'invention en thérapeutique, notamment dans le cadre de pathologies cancéreuses ou infectieuses. En effet, un tel anticorps est capable d'induire des mécanismes d'ADCC par l ' intermédiaire des FcγR activateurs sans que ceux-ci soient modulés négativement par les FcγR inhibiteurs. De plus, le Demandeur a constaté qu'un tel anticorps ne recrute que les FcγR activateurs sur les cellules dendritiques et ne recrutent pas les FcγR inhibiteurs à la surface des mêmes cellules . Or il a été montré récemment que 1 ' engagement des FcγR inhibiteurs à la surface des cellules dendritiques a un effet négatif sur la maturation de ces cellules et sur leur capacité à présenter efficacement un antigène aux lymphocytes T effecteurs, rendant ces cellules dendritiques tolérogènes . Si un tel anticorps complexé à un antigène ne reconnaît que les FcγR activateurs exprimés à la surface des cellules dendritiques et non les FcγR inhibiteurs, la présentation antigénique par les cellules dendritiques qui en résulte sera optimale et l'effet d'activation de la réponse immune spécifique optimisée.
De manière avantageuse, la région Fc de l'anticorps issu du procédé de l'invention se fixe aux récepteurs Fc activateurs tandis qu'elle ne se fixe pas aux récepteurs Fc inhibiteurs.
De manière avantageuse, l'anticorps du procédé de l ' invention ne recrute pas les récepteurs Fc inhibiteurs, notamment les récepteurs Fc inhibiteurs exprimés par les lymphocytes B. De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps du procédé de l'invention ne recrute pas les récepteurs Fc inhibiteurs mais lie une molécule à la surface des lymphocytes B.
De manière avantageuse, l'anticorps de l'invention ne recrute pas les récepteurs Fc inhibiteurs mais lie une molécule à la surface de cellules tumorales, notamment à la surface de lymphocytes tumoraux B. De manière avantageuse, l'anticorps de l'invention ne recrute pas les récepteurs Fc inhibiteurs mais lie une molécule à la surface de lymphocytes tumoraux de LLC- B. De manière avantageuse, l'anticorps de l'invention ne recrute pas les récepteurs Fc inhibiteurs mais lie la molécule CD20 à la surface de lymphocytes tumoraux de LLC-B.
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps du procédé de l'invention se fixe au récepteur FcyRIII (isoformes A et B) et /ou au récepteur FcγRIIA et/ou au récepteur FcγRI (isoformes A et B) , tandis qu'il ne se fixe pas aux récepteurs FcγRIIB (isoforme Bl et B2) . Dans un mode de réalisation particulier, le récepteur FcγRIIB est le récepteur FcyRIIBl.
De manière préférentielle, les récepteurs mis en jeu dans le procédé de l'invention sont des récepteurs humains .
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les récepteurs de la région Fc des anticorps se trouvent sur les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules NK, les lymphocytes B, les monocytes, les macrophages, les lymphocytes B.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les récepteurs inhibiteurs de la région
Fc des anticorps se trouvent sur des cellules tumorales, telles que des cellules de mélanomes malins, des lymphocytes B tumoraux comme les lymphomes , les cellules de LLC-B (leucémie lymphoïde chronique B) et les cellules de myélome. De manière avantageuse, l'anticorps du procédé de l'invention lie, par sa région variable, la molécule CD20 à la surface de lymphocytes tumoraux de LLC-B. Un tel anticorps de l'invention ne recrute pas les récepteurs Fc inhibiteurs, notamment à la surface des lymphocytes tumoraux de LLC-B .
De manière avantageuse, les anticorps mis en œuvre dans le procédé de l'invention sont des anticorps monoclonaux. Ces anticorps monoclonaux peuvent être produits par tout système biologique approprié, sous forme de compositions d'anticorps monoclonaux, lesquelles compositions peuvent contenir au moins un excipient ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable de sorte que ces compositions puissent être formulées pour permettre une administration pharmaceutique, dans un but prophylactique et/ou thérapeutique. On entend par « système biologique » des lignées cellulaires animale ou végétale transfectées à l'aide d'un ou plusieurs vecteurs de manière à exprimer ledit anticorps, des plantes ou animaux transgéniques non humains, ainsi que tout hybridome, hétérohybridome. Parmi les cellules, on peut choisir des cellules provenant de lignées cellulaires, transfectées à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour ledit anticorps, par exemple des cellules eucaryotes ou procaryotes, notamment des cellules de mammifères, d'insectes,^ de plantes, de bactéries ou de levures. Préférentiellement, on utilise des cellules de myélome de rat telle que YB2/0 (ATCC n0 CRL 1662) .
On peut également utiliser des cellules CHO, notamment CHO-K, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO Pro-5, CHO dhfr- ou d'autres lignées cellulaires parmi Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653, PERC6 ou BHK. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps dont chacun des résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) de sa région Fc a été remplacée par un résidu choisi parmi la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 1 ' isoleucine, la proline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine, ou un anticorps produit a partir du procédé de l'invention, pour l'obtention d'un médicament destiné à la vaccination anti-infectieuse et antitumorale, l'anticorps de l'invention étant engagé dans un complexe immun qui ne pourra être fixé que par les RFcγ activateurs des cellules présentant l'antigène (monocytes , macrophages, cellules dendritiques, cellules épidermiques de Langerhans , lymphocytes B) .
De préférence, on utilise pour la préparation d'un tel médicament un anticorps dont chacun des résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) de sa région Fc a été remplacée par un résidu lysine.
Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'un anticorps, dont chacun des résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) est remplacé par un résidu choisi parmi la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, l' isoleucine, la proline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine, ou un anticorps produit à partir du procédé de l'invention, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement du cancer, et plus particulièrement au traitement des lymphomes, leucémies, myélomes, sarcomes, tumeurs solides telles que carcinomes mammaires, tumeurs colorectales, tumeurs du pancréas, tumeurs de la prostate, tumeurs stomacales, tumeurs pulmonaires, tumeurs ovariennes, tumeurs du col de l'utérus, tumeurs oculaires, tumeurs de la thyroïde, tumeurs de la sphère ORL mélanomes malins, tumeurs nerveuses telles que glioblastome, et neuroblastomes .
De préférence, on utilise pour la préparation d'un tel médicament un anticorps dont chacun des résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) de sa région Fc a été remplacée par un résidu lysine.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps, dont chacun des résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) est remplacé par un résidu choisi parmi la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine, ou un anticorps produit à partir du procédé de l'invention, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement des maladies infectieuses telles que l'infection par le VIH, le VHB, le VHC, le VRS (virus respiratoire syncytial) , le virus SRAS, les rotavirus, les virus de la grippe, la variole, les infections bactériennes telles que les infections dues au bacille de Koch, aux méningocoques , à Criptoccocus neoformans, à Clostridium, aux bactéries responsables du Botulisme, de l'Anthrax
(charbon) , le tétanos, la tuberculose, et les infections à entérocoques .
De préférence, on utilise pour la préparation d'un tel médicament un anticorps dont chacun des résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) de sa région Fc a été remplacée par un résidu lysine.
Enfin, un dernier aspect de l'invention se rapporte à une composition d'anticorps dont la fixation aux FcR inhibiteurs est diminuée d'au moins 30%, de préférence d'au moins 50%, 70%, 80% ou encore d'au moins 90% ou de 100% par rapport au même anticorps possédant une région Fc native. De préférence, la composition de l'invention est une composition dont la région Fc des anticorps possède une capacité de fixation aux récepteurs inhibiteurs abolie par rapport au même anticorps possédant une région Fc native.
De manière particulièrement avantageuse, la composition de l'invention est une composition d'anticorps anti-CD20.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l ' étendue de l ' invention .
Description des figures
Figure 1 : Effet de la modification par le
Diéthylpyrocarbonate des histidines de l 'AcM anti-RhD T125(YB2/O) sur la capacité de l'anticorps à recruter les RFcy humains.
Figure 2 : Effet de la mutation des histidines 310 et 435 de l'AcM anti-RhD Tl25(YB2/0) en lysines sur la capacité de l'anticorps à fixer les RFcγ humains.
Figure 3 : Effet de la mutation des histidines 310 et 435 de l'AcM anti-RhD T125(YB2/O) sur la capacité de l'AcM à induire une production d'IL-2 dépendante des RFcγlIIA humains.
Figure 4 : Comparaison de la fixation de Tl25(YB2/0), du double mutant T125(YB2/O) His310LyS/His435Lys et de T125 (CHO) aux RFcγlIIA et RFcylIB humains.
Figure 5 : Effet de la mutation des histidines 310 et 435 de l'anticorps monoclonal anti-RhD T125(YB2/O) sur la capacité de l'anticorps monoclonal à induire une ADCC dépendante des RFcγIIIA humains par rapport à l'anticorps natif (wild-type) produit dans YB2/0 et à l'anticorps natif (wild-type) produit dans CHO.
Figure 6 : Représentation en surface des structures cristallographiques des fragments Fc de T125(YB2/O) en présence de Zinc (A) et du double mutant T125 H310K- H435K(YB2/0) (B).
Exemples
Exemple 1 : Obtention d/ un anticorps portant la double mutation His310-435Lys
La lignée YB2/0 (myélome de rat, lignée ATCC n° CRL 1662) transfectée et produisant l'anticorps EMAB5 (décrit dans le document WO 2005/040216), qui est une IgGl (Y) humaine dirigée contre l'antigène Rh(D), a été adaptée à la culture en milieu sans sérum.
EMAB5 a été purifié par chromâtographie d'affinité sur Sépharose-protéine A.
Par HPCE-LIF, il a été montré que la structure glycanique majoritaire est un oligosaccharide de type biantenné, contenant environ 25 % de fucose.
Préparation du fragment Fc :
L'anticorps purifié EMAB5 est dialyse une nuit contre du tampon Tris 50 mM, pH 8,0. La solution d'anticorps, ajustée à 50 mM CaC12 et 10 mM cystéine, est incubée
30 min à 370C avant d'ajouter la solution de trypsine
(1 mg/ml) dans un rapport enzyme/substrat de 1/25.
Après 5 h d'incubation à 37°C, la réaction est arrêtée par l'addition de diisopropyl fluorophosphate (1 mM final) . L'hydrolysat est dialyse une nuit contre du tampon Imidazole 50 mM, pH 7,8. Pour la purification du fragment Fc, 1 'hydrolysat dialyse est mis en contact avec de l 'Affarose-protéine L à raison de 1 ml de gel pour 3,6 mg d'anticorps. Après 4 h d'incubation à température ambiante sous agitation, le gel est monté en colonne et lavé par le tampon Imidazole 50 mM, pH 7,8. L'effluent et le tampon de lavage qui contiennent les fragments Fc sont réunis, concentrés par centrifugation sur Vivaspin 20 en utilisant les conditions décrites par le fabricant.
Mutagenèse dirigée :
Le vecteur d'expression contenant l 'ADNc codant la séquence d'acides aminés de la chaîne lourde de l'anticorps anti-Rh(D) EMAB5, a servi de matrice pour la réalisation d'une double mutagenèse dirigée réalisée par PCR (« PCR-based site-directed mutagenesis ») . Les quatre substitutions nucléotidiques suivantes ont été introduites:
C1229A et C1301G pour le changement du résidu His338 en Lys (position 310 selon la numérotation de Kabat) , soit CAC-^ AAG ; C1674A et C1676G pour la mutation du résidu His463 en Lys (position 435 selon la numérotation de Kabat) , soit CAC -^ AAG. La chaîne lourde de l'anticorps muté a pour séquence nucléotidique la séquence SEQ ID NO : 1, et pour séquence peptidique SEQ ID NO : 2 (les acides aminés mutés apparaissent sur la séquence SEQ ID NO : 2 en position 338 et 463 respectivement pour les acides aminés Lys310 et Lys435) . La numérotation tient compte des séquences leaders (338 et 463) ou non (dans ce dernier cas, c'est la numérotation dite de Kabat qui a été utilisée : 310 et 435) .
Les cellules YB2/0, co-transfectées par électroporation avec le vecteur muté EMAB5-H-K338- K463-1 et le vecteur EMAB5-dhfr-K-SpeI codant pour la chaîne légère de l'anticorps EMAB5, sont cultivées en milieu RPMI additionné de 5% de SVF dialyse, 0,5% de G418 et 25 nM de Méthotrexate (MTX) . Les clones sécrétant les plus forts taux d'IgG humaines sont cultivés en plaques de 24 puits en milieu sans MTX. Les surnageants, récoltés après 7 jours de culture, sont utilisés pour faire les essais décrits ci- dessous .
Exemple 2 : Effet: de la modification des histidines de l'interface CH2/CH3 d'une IgGl monoclonale anti-RhD par le Diéthylpyrocarbonate (DEPC) sur les interactions IgGl/RFoγ humains .
Afin d'étudier l'impact d'une modification des histidines d'une IgGl humaine sur les interactions
IgGl/RFcγ humains, l'anticorps monoclonal anti-RhD,
T125(YB2/O) a été traité par le Diéthylpyrocarbonate
(DEPC) . Le DEPC modifie les résidus histidines par la création d'une liaison covalente entre un atome d'azote du cycle de l'histidine et un atome de carbone de la molécule de DEPC. Les anticorps monoclonaux traités ou non par le DEPC sont fractionnés sur une colonne de protéine A-Sépharose. L'histidine 435 étant importante pour la fixation des IgG à la protéine A, la fraction d'anticorps monoclonaux traitée par le DEPC et non retenue sur protéine A correspond à des IgGl dont au moins les His435 ont été modifiées. Les anticorps monoclonaux Tl25(YB2/0) non traités ou traités par le DEPC et non retenus sur protéine A ont été comparés pour leur fixation aux différents types de RFcγ humains (Figure 1) . La fixation de l'anticorps monoclonal anti-RhD, Tl25(YB2/0), traité ou non par le diéthylpyrocarbonate (DEPC) aux RFcγlIIA (A) , RFcylIA (B), RFcγlIBl (C) et RFcγl (D) humains (hRFcγ) a été analysée par immunofluorescence indirecte. Les cellules indicatrices Jurkat-huRFcylIIA (A) r K562 (B) , IIA.1.6-huRFcγIIBl (C) et Tf2-13 (D) sont incubées avec différentes concentrations de T125(YB2/O) traité ou non par le DEPC. La fixation de l' anticorps monoclonal est détectée par des P(ab')2 de souris anti- IgG (H+L) humaines couplés au FITC). T125(YB2/O) se fixe aux RFcγlIIA à faible concentration (dès 0,05 μg/ml) et présente une fixation très importante à 0,5 μg/ml (95% de cellules positives). Lorsque cet anticorps monoclonal est traité par le DEPC, sa fixation est diminuée à forte concentration (entre 1 et 5 μg/ml) (environ 90% de réduction à 1 μg/ml) et devient marginale à faible concentration (entre 0,025 μg/ml et 0,05 μg/ml) (Figure IA). Le traitement par le DEPC induit également une réduction de 76% et de 64% de la fixation de T125 (YB2/0) aux RFcγlIA (à 50 μg/ml et 100 μg/ml, respectivement) (Figure IB) . De même, la fixation de T125(YB2/O) traité par le DEPC aux RFcγlIBl est réduite : à 50 μg/ml, la fixation de T125(YB2/0) traité par le DEPC est marginale alors qu'environ 40% de cellules sont positives pour la même concentration de T125(YB2/0) non traité (Figure IC). En revanche, la modification de l'AcM par le DEPC a un effet modéré sur sa fixation aux RFcγl . Le traitement par le DEPC induit une réduction de 15% de la fixation de T125(YB2/O) aux RFcγI à 0,5 μg/ml et 1 μg/ml. (Figure ID) .
En conclusion, le blocage des histidines présentes dans Tl25(YB2/0) par le DEPC diminue sa fixation aux RFcylIIA (Figure IA) , RFcylIA (Figure IB) , RFcγIIB (Figure IC) et, dans une moindre mesure, aux RFcγl humains (Figure ID) .
Exemple 3 : Effet des mutations des résidus His435 et His310 d'une IgGl monoclonale anti-RM) sur les interactions IgGl/RFcy humains . Les résultats précédents indiquent que la modification des résidus His d'une IgGl monoclonale affecte ses interactions avec les RFcy humains . Cependant le traitement par le DEPC ne permet pas de déterminer quelles sont les His qui ont été modifiées.
Les études structurales ont montré l'importance des résidus His435 et His310 situés de part et d'autre de la région charnière des IgGl dans les interactions IgGl/RFcγ. Nous avons donc étudié l'effet de la mutation des His435 et His310 de T125(YB2/O) en lysine sur la fixation de l'anticorps monoclonal aux RFcγ humains (Figure 2). La fixation de l'anticorps monoclonal T125(YB2/O) ou du double mutant T125(YB2/O) HiS310LyS/His435Lys aux RFcyIIIA (A), RFcyIIA (B), RFcγlIBl (C) et RFcγl (D) humains (hRFcγ) a été analysée par immunofluorescence indirecte. Les cellules indicatrices Jurkat-huRFcγlIIA (A), K562 (B), IIA.l.6-huRFcγIIBl (C) et Tf2-13 (D) sont incubées avec différentes concentrations de T125(YB2/O) ou du double mutant Tl25(YB2/0) His310Lys/His435Lys . La fixation des AcM est détectée par des fragments F(ab')2 de souris anti-IgG (H+L) humaines couplés au FITC) . La fixation du double mutant T125(YB2O) His310Lys/His435Lys aux RFcγlIIA humains exprimés par les cellules Jurkat- CD16 par rapport à celle de l'anticorps monoclonal non muté est légèrement diminuée (Figure 2A) . Cette fixation est également diminuée lorsque les expériences sont faites avec des cellules indicatrices
(K562) exprimant le RFcγlIA humain (Figure 2B) . Par contre, la mutation des His310 et His435 de Tl25(YB2/0) abolit complètement la fixation de cet anticorps au RFcyIIBl humain (Figure 2C). La fixation de T125(YB2O) His310Lys/His435Lys aux RFcγl humains n'est pas affectée (Figure 2D) . Exemple 4 : Effet des mutations des résidus His435 et His310 d'une IgGl monoclonale anti-RhD sur ses propriétés effectrices
Nous avons analysé l'effet de la mutation des His310 et His435 de T125(YB2/O) sur l'une des fonctions effectrices activatrices de cet anticorps. Les capacités du double mutant et de l'anticorps monoclonal non muté à induire une production d'IL-2 par les cellules Jurkat-huRFcγIIIA RFcγIIIA+ ont été comparées par ELISA (Figure 3) . Afin de normaliser les résultats issus de trois expériences différentes, la production d' IL-2 induite par différentes doses d'anticorps monoclonal est rapportée en pourcentage de celle induite par 10 μg/ml de Tl25(YB2/0). Cette dose de T125 (YB2/0) , correspond à la production maximale d'IL-2 détectée dans toutes les expériences réalisées. La production d'IL-2 induite par 1, 5 et 10 μg/ml de T125(YB2/O) muté est réduite de 61%, 53%, et 54%, respectivement, par rapport à la libération d'IL-2 induite par les mêmes doses de l'anticorps monoclonal non muté (Figure 3) . Les cellules Jurkat-huRFcγlIIA
(RFcγIIIA+) sont stimulées pendant 151a à 370C par différentes concentrations de T125(YB2/O) ou du double mutant Tl25(YB20) His310Lys/His435Lys, en présence de fragments F(ab')2 de lapin anti-IgG (H+L) humaines permettant l'agrégation des anticorps monoclonaux humains anti-RhD. La production d'IL-2 par les cellules Jurkat-huRFcγlIIA est ensuite détectée par ELISA. La production d'IL-2 induite en présence de différentes concentrations des deux AcM est rapportée en pourcentage de celle induite par 10 μg/ml de T125(YB2/O) ) . Ces résultats indiquent que la modification des His310 et His435 de l'interface CH2/CH3 d'une IgGl monoclonale diminue partiellement la fixation de cet AcM aux RFcylIIA humains ainsi que sa capacité à induire une production de cytokine dépendante de ces RFcy activateurs . Néanmoins , l ' anticorps monoclonal double mutant T125(YB20) His310Lys/His435Lys est encore capable de recruter les RFcγlIIA activateurs et d'induire des fonctions effectrices activatrices dépendantes de ces récepteurs .
Exemple 5 : Comparaison des profils d' engagement des RFcγ humains de T125 (YB2/0) , du double mutant T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys et de T125 (CHO) .
Les expériences précédentes montrent que l'anticorps monoclonal double mutant T125(YB2O) His310Lys/His435Lys est un anticorps capable d'engager les récepteurs activateurs (RFcγlIA et RFcγIIIA) , mais dont la capacité à fixer les RFcγlIB inhibiteurs est abolie. • Afin de mieux caractériser le comportement de cet anticorps monoclonal, nous avons comparé sa fixation aux RFcylIIA et RFcγlIB humains à celle de T125 (CHO) dont les propriétés structurales et le profil d'engagement aux différents types de RFcγ ont été précisément définis (Figure 4) . (A) et (C) , la fixation des AcM T125(YB2/O), T125 (YB2/0) HiS310LyS/HiS435LyS et T125 (CHO) aux RFcyIIIA (A), et RFcyIIBl (C) humains a été analysée par immunofluorescence indirecte. Les cellules indicatrices Jurkat-huRFcγlIIA (A), ou HA.1.6- huRFcγlIBl (C) sont incubées avec différentes concentrations de T125(YB2/O), T125(YB2/O) His310Lys/His435Lys et T125 (CHO) . La fixation des anticorps monoclonaux est détectée par des fragments F(ab')2 de souris anti-IgG (H+L) humaines couplés au FITC. (B) et (D) , les capacités des anticorps monoclonaux T125(YB2/0), T125(YB2/O) His310Lys/His435Lys et
T125 (CHO) à inhiber la fixation des anticorps 3G8-PE
(anti-RFcγlIIA/IIIB humains) (B) ou ATlO-FITC (anti- RFcγlIA/IIB humains) (D) ont été comparées. Les cellules indicatrices Jurkat-huRFcγlIIA (B) ou IIA.1.6-huRFcγIIBl (D) sont incubées avec différentes concentrations de T125(YB2/O), ou de Tl25(YB2/0) His310Lys/His435Lys ou de T125 (CHO), puis avec 40 ng/ml de 3G8-PE (B) ou 40 ng/ml d'ATlO-FITC (D), respectivement. Le pourcentage d'inhibition de la fixation de 3G8-PE ou d'ATlO-FITC en fonction de la concentration des anticorps monoclonaux compétiteurs est calculé: T125 (CHO), qui est plus fucosylé que T125(YB2/O) , est capable d'induire des fonctions inhibitrices dépendantes des RFcγIIBl. En revanche, il ne lie que faiblement les RFcγlIIA humains et est un mauvais inducteur des fonctions activatrices dépendantes des RFcγlIIA.
Les expériences d' immunofluorescence indirecte montrent que, bien que la fixation de l'anticorps monoclonal double mutant T125(YB20) His310Lys/His435Lys aux RFcγlIIA soit légèrement diminuée par rapport à celle de T125(YB2/O), sa fixation reste très supérieure à celle de T125 (CHO) (Figure 4A) . Nous avons confirmé cette différence de fixation aux RFcγIIIA humains entre le double mutant de T125(YB2/O) et T125 (CHO) par des expériences de compétition en utilisant 40 ng/ml de 3G8-PE, qui bloque les sites de liaison des RFcγlIIA et RFcγlIIB humains (Figure 4B) . Des concentrations d'environ 15 μg/ml pour T125(YB2/O) et de 40 μg/ml pour T125(YB2/O) His310Lys/His435Lys sont requises pour induire une inhibition de 50% de la fixation de l'anticorps monoclonal 3G8-PE aux RFcylIIA exprimés à la surface des cellules Jurkat-huRFcγlIIA. Par contre, une dose de T125 (CHO) supérieure à 100 μg/ml (environ 130 μg/ml) est nécessaire pour atteindre 50% d'inhibition de la fixation de 3G8-PE. Les expériences d' immunofluorescence indirecte montrent que la fixation du double mutant T125(YB2O) His310Lys/His435Lys aux cellules indicatrices HA.1.6- huRFcγllBl (RFcγIIBl+) est complètement abolie, tandis que celle de T125 (CHO) est maintenue malgré une diminution de la capacité de ce dernier AcM à se fixer aux RFcγlIBl par rapport à T125(YB2/O) (Figure 4C). De même, quelle que soit la concentration testée, le double mutant Tl25(YB20) His310Lys/His435Lys est incapable d'inhiber la fixation de 40 ng/ml de l'anticorps ATlO-FITC (AcM anti-RFcγIIA/RFcγIIB humains) aux cellules HA.1.6-huRFcγIIBl, alors que T125 (CHO) est capable d'induire une inhibition de la liaison de l'anticorps ATlO-FITC aux RFcγlIBl, bien que celle-ci soit inférieure à celle induite par T125(YB2/O) (Figure 4D).
Ainsi, ces expériences d' immunofluorescence montrent que le double mutant T125(YB2O) His310Lys/His435Lys a un comportement différent de celui de T125 (CHO), en termes d'interactions avec les RFcγ : T125(YB2O) His310Lys/His435Lys recrute efficacement les RFcγlIIA activateurs . En revanche, cet anticorps monoclonal est incapable d'engager les RFcylIB.
Exemple 6 : Comparaison de l'ADCC obtenue avec l'anticorps T125 (YB2/0) , l'anticorps double mutant T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys et l'anticorps T125 (CHO) .
La capacité à induire une lyse ADCC des hématies Rhésus positives induite par différents anti-D en présence de cellules mononucléées (source de cellules effectrices) et de Tégéline (2500μg/ml) a été comparée pour différents anticorps anti-D. L'anticorps ADl est un anticorps anti-D ne déclenchant pas de réponse ADCC et sert donc de témoin négatif. L'anticorps T125 a été exprimé dans deux types cellulaires différents : YB2/0
(donnant l'anticorps Tl25(YB2/0) et CHO (donnant l'anticorps T125 (CHO)). Par ailleurs, l'anticorps T125 a été muté pour remplacer chacun de ses résidus His 310 et His 435 par des résidus lysine (T125(YB2/O) His310Lys/His435Lys ) .
Les résultats apparaissent à la figure 5 : l'anticorps muté Histidine (H310K H435K) induit une ADCC des hématies Rhésus positives, légèrement inférieure à celle obtenue avec l'anticorps non muté T125(YB2/O), mais très supérieure ADl. A noter que dans ces conditions expérimentales, l'anticorps témoin anti-D exprimé dans CHO n'induit pas ou très peu d'ADCC
(résultats non présentés) .
Exemple 7 : Impact structural de la mutation des histidines 310 et 435 en Lysine
La comparaison des structures cristallographiques des fragments Fc de T125(YB2/O) et de T125 H310K- H435K(YB2/0) (cf exemple 6) montre que les mutations des histidines 310 et 435 en lysines n'ont pas modifié la conformation générale du fragment Fc. Dans le document WO 2005/040216 (qui est incorporé ici par référence) , le Demandeur montre que les anticorps non mutés, portant donc les résidus His 310 et His
435, possèdent la capacité de fixer des cations Zinc
(Zn2+) . Le fragment Fc portant les lysines a perdu sa capacité à fixer les cations Zn2+ ; cependant, la position de la chaîne latérale de ces résidus ainsi que leur encombrement se superposent avec . ceux des résidus histidines du fragment Fc de T125 (YB2/0) . Cette donnée est importante pour une utilisation de ce type d'anticorps en thérapeutique humaine puisque cela suggère que la fixation de l'anticorps T125 H310K- H435K(YB2/0) aux RFcn, et donc son catabolisme, ne seront pas modifiés. Par contre, la mutation des résidus histidines 310 et 435 en lysines a un impact sur l'orientation des domaines CH2 du fragment Fc. En effet, la comparaison des structures cristallographigues des fragments Fc de T125(YB2/O) (en présence de Zinc) et du double mutant T125 H310K-H435K(YB2/0) montre que ce dernier présente une conformation plus fermée dans laquelle les deux domaines CH2 sont plus proches l'un de l'autre par rapport aux domaines CH2 du fragment Fc de T125 (YB2/0) . Cette différence de conformation pourrait être à l'origine de l'impact des mutations H310K et H435K sur la fixation de l'anticorps aux RFcγ humains (cf exemples 3, 4 et 5) .

Claims

Revendications
1. Procédé de préparation d'un anticorps possédant la capacité de recruter les FcR activateurs, mais dont la capacité à recruter les FcR inhibiteurs est diminuée par rapport au même anticorps possédant une région Fc native, comprenant les étapes suivantes : a) obtention d'anticorps monoclonaux à partir d'hybridoine, d'hétérohybridome, ou de toute lignée cellulaire animale, végétale ou humaine, b) remplacement de chacun des résidus His 310 et
His 435 (numérotation de Kabat) de la région Fc dudit anticorps par un résidu choisi parmi la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, l ' isoleucine, la proline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine, c) sélection des anticorps dont la fixation aux FcR inhibiteurs est diminuée d'au moins 30%, de préférence d'au moins 50%, 70%, 80% ou encore d'au moins 90% par rapport au même anticorps possédant une région Fc native.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape c) , on sélectionne les anticorps dont la fixation aux FcR inhibiteurs est abolie.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 , caractérisé en ce que ledit résidu choisi est la lysine.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'anticorps issu de l'étape b) est exprimé dans YB2/0 (ATCC n0 CRL 1662) .
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisé en ce que ladite région Fc dudit anticorps sélectionné à l'étape c) se fixe aux récepteurs Fc activateurs tandis qu'elle ne se fixe pas aux récepteurs Fc inhibiteurs.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps se • fixe au récepteur FcγRIII (isoformes A et B) et /ou au récepteur FcγRIIA et/ou au récepteur FcγRI (isoformes A et B), tandis qu'il ne se fixe pas au récepteur FcyRIIB (isoforme Bl et B2) .
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits récepteurs sont des récepteurs humains.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisé en ce que lesdits récepteurs de la région Fc des anticorps se trouvent sur les cellules dendritiques, les monocytes, les macrophages, les lymphocytes B.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits récepteurs inhibiteurs de la région Fc des anticorps se trouvent sur des cellules tumorales, comme les cellules de mélanomes malins, les lymphocytes B tumoraux comme les lymphomes et les LLC- B et les cellules de myélome.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps lie la molécule CD20 à la surface de lymphocytes tumoraux de LLC-B.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits résidus sont remplacés par mutagenèse dirigée ou par évolution moléculaire.
12. Utilisation d'un anticorps fabriqué au moyen du procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour l'obtention d'un médicament destiné à la vaccination anti-infectieuse et anti-tumorale, ledit anticorps étant engagé dans un complexe immun qui ne pourra être fixé que par les RFCY activateurs des cellules présentant l'antigène
(monocytes, macrophages, cellules dendritiques, cellules épidermiques de Langerhans , lymphocytes B).
13. Utilisation d'un anticorps fabriqué au moyen du procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement du cancer.
14. Utilisation selon la revendication 13, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement d'un cancer choisi parmi les lymphomes, leucémies, myélomes, sarcomes, tumeurs solides telles que carcinomes mammaires , tumeurs colorectales , tumeurs du pancréas, tumeurs de la prostate, tumeurs stomacales, tumeurs pulmonaires, tumeurs ovariennes, tumeurs du col de l'utérus, tumeurs oculaires, tumeurs de la thyroïde, tumeurs de la sphère ORL mélanomes malins, tumeurs nerveuses telles que glioblastome, neuroblastomes .
15. Utilisation d'un anticorps d'un anticorps fabriqué au moyen du procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement des maladies infectieuses telles que l'infection par le VIH (virus de l' immunodéficience humaine), le VHB (virus de l'hépatite B), le VHC (virus de l'hépatite C), le VRS
(virus respiratoire syncytial) , le virus SRAS (virus de la pneumonie atypique), les rotavirus, les virus de la grippe, la variole, les infections bactériennes telles que les infections dues au bacille de Koch, aux méningocoques , à Criptoccocus neoformans , à
Clostridium, la tuberculose, et les infections à entérocoque.
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