WO2007066627A1 - 多目的アシル化触媒とその用途 - Google Patents

Abstract

多様なカルボン酸をアシル基のドナーとするｔＲＮＡのアシル化を触媒することができる新規なリボザイム系及びその用途を提供する。 　（式１）で表されるＲＮＡ配列からなる構造を有する、ｔＲＮＡのアシル化を触媒するリボザイム。 （式１）Ｐ１－Z1Z2Z3Z4(N1)1(N1)2…(N1)p－Ｐ２－（N2)1(N2)2…(N2)qY1Y2Y3(N3)1(N3)2N4GGN [（Ｎ1)1～（Ｎ1)pはそれぞれ独立にＵ、Ｃ、Ａ及びＧのいずれかの任意のモノリボヌクレオチド、ｐは３又は４を表し、（Ｎ2)1～（Ｎ2)qはそれぞれ独立にＵ、Ｃ、Ａ及びＧのいずれかの任意のモノリボヌクレオチド、ｑは５又は６を表し、（Ｎ3)1～（Ｎ3)2はそれぞれ独立にＵ、Ｃ、Ａ及びＧのいずれかの任意のモノリボヌクレオチドを表し、Ｎ4はＵ、Ｃ、Ａ及びＧのいずれかの任意のモノリボヌクレオチドを表し、Ｚ1～Ｚ4はそれぞれ独立にＣ又はＧを表し、Ｙ1～Ｙ3はそれぞれ独立にＣ又はＧを表し、ＮはＡもしくはＧに相補的なモノリボヌクレオチドを表し、Ｐ１及びＰ２はステム・ループ構造を持ちうる任意のＲＮＡ配列からなる領域を表す。]

Description

細 書

多目的ア その

術分野

０００1 、 の を する新規な人工 である とその 途に関する。 ０００2 ア ノ 仝 A S

のも 伝情報は、遺伝 に基 てア ノ酸の配列に翻訳される。 訳の 、現存の 然の では、トランス ァ ans NA又 は )がア ノ を正し 合わ るアダプタ として使われる。アダプタ である は片側で ノ酸を、も 一方の側で を識別する。 然の は、 8 ク オ の さの さな である。

０００3 ア ノ酸はまず、 の3 端に結合し、次にタン ク 成の場である ソ ム ばれる。 ソ ムでは、ア ノ酸を運んできた のアンチ 遺伝情 報を転写したメッセンジ (messenge RNA又は )の3 とが することによ て、 特定の が対応し、さらには遺伝 定さ れた2 類のア ノ酸の ずれ される。

０００4 定のア ノ酸をそれに対応する に結合さ る反応を のア ノ

。 のア ノ 化はア ノ (amnoac RNAS n e ase又はA S)が する。 2 類の Sが2 類の ア ノ酸に対してそ れぞれ用意されて る。 ノ酸は、専用のA Sにより、 自分の 合できる 子の3 端の ン の ( ボ )の3又は2 に、 端 を介して ステ 合する。

０００5 Sが であるア ノ および を選択的に認識するメカ ズムは非常に精 巧 雑である。ほとんどの ではア ノ ごとにA Sが異なり、 Sの 位の ぼみに最も高 親和 を持 のは正し ア ノ酸である。このよ な 密な基 異性により、 自然界では、A Sは ア ノ酸を基 とできな 。また、A S と との 造的、 的な相補性は、アンチ ドン、ア ノ アクセプタ ステム ン ボ までの 領域に及び、A Sは の 特徴を感知 して対応する を厳密に他の 子種 ら 別して る。

０００6 ム

とは酵素 ( )を持 、すなわち のことである。 ボ (RNA) 酵素(Enz me)の の 語が 合して イム( boz me)とな た ０００7 然界における 表的な例としては、 白質の 成を行 て る ソ ム、またR NAの 断を するRNaseP、 ン ッド などが知られて る。これら は、生命の 階でRNAが として機能して たとする RNAワ ド を 指示して る重要な 存在である。RNAワ ド 説ではす ての 反 応はRNAで触媒できることが必要条件であるが、 自然界では以上のよ 2 類の し 見 て な 。そこで、この 説の 実性を確認するために、 性をも RNA 試験管内(nV o) により人工的に創成されて る。 ０００8 験管内分子 法は、無作為に人工合成された核酸ライ ラ ら、 目的の 性を有する核酸 子を新規に さ る手法である。この 、新規な するために、遺伝子プ を構築し、所望の 応を する分子 nV oで選 択して単離する方法がB ennenらにより 告されたことに始まる( )。この 法の 形である X ( s ema cEvo onO gandsb Exponen a en ch en)として知られる方法により、標的 子と特異 に相互 用する核酸 子を同 することができる( ～3)。 伝子プ として、 にも及ぶ なるラン ダム 基配列( 既知のプライ )を有するオ ク オ のプ ら活性分子を選択し、PC やその他の方法により増幅する 、選択およ び増幅の 程を繰り返すことにより、初めはご 数であ た所望の 性を有する分 子がプ 体にお て める 率を指数 に増加さ 、最終的には活性分 子を単離することが可能である。この 白質などの 子に対して結合 性を有する ガンド タ を単離するのに用 られるが、さらにこの 法の 念を拡張して、 ボ を試験管内で分子 化さ る方法も開発された。この 、ランダム 基配列を含む ら自己 ( ス ある は分子内型) として働 を選択し、上記 同様の 法で増幅さ る。この 法で、ホ ス ステラ ゼ 性を有する新規 が された(

3)

０００9 S イム

然では、 Sはタン ク質であり、A S は発見されて な 。そこで、 試験管内分子 を用 て、天然には存在しな A S イム(ア ノ

amnoac RNAS nhe aseとして機能する イム)を創製する みがなされて る( 2、4、5、 2、3)

００1０ らが先に創製したA S では、弱 ア ノ RNAを、 である イム(カラ に固定 してお ことができる) 混ぜるだけで、ア ノ RNAが合成できる。 らの 製したA S は の ( CC 3 、 は73位の識 基であり 又はG)を認識するよ に作られた ため、す ての を にすることができ、また、ア ノ としては

を有するものであれば になり、天然の ア ノ ( アラ ン、 ン、ト プト ァン)および ア ノ として アラ ン ラ位に様 を持 の ァ アラ ンアナ グが となる。この、 アラ ンアナ グおよび Aに対して キ 性 ら、 らはこの S を キ イム( exz e) 命名した。

００11 を参照して キ の 造に て説明する。 キ は45個の ク オ らなり( 22) GG チ ッチ 位を有して る。 GG チ (G43 45)は の3 (ア ノ )の CC 3 ちの 73 C75( が73位の識 ) 相補 であり、 位に相当する と考えられて る。 方、ア ノ酸の認 一本 ッチ ( 32 35)が 考えられて る。さらに、GGCG (G36 G39)が の 性に 重要であると考えられて る( 3)

００12 ア ノ

タン ク質は、2 類の ア ノ酸を構成 位とするポ であり、このア ノ のさまざまな組合わ により多 の 能を発現して る。タン ク質の機能を研究す る際に、しばしばア ノ酸の置換が行われるが、通常の では2 類の ア ノ酸の枠の中でし 変異ができな 。この枠を取り払 、天然のア ノ 外のさまざ まなア ノ酸を導入するために開発された方法が、 ア ノ である( 4、 5)

００13 ア ノ酸の部 な 、 898年の ch zとChambe nの、 グ プの 告 ら始ま た( 4、 5)。 らは終始 のひと であるアン ドン( G)に ア ノ酸を ドさ 、 白質 に導入した。こ の 、以下の3 の 階 らなる。まず、 ア ノ酸を導入した 位置の をアン ドン( G)に置換した 伝子を作成する。次に、 ア ノ酸 でア ノ 、 を作製する。この 伝子と プ

を える。このとき、 ア ノ酸でア ノ した が、対応するアン を 、 ョン( )することで、アン の 置に非 ア ノ酸が部位 に導入される。

００14 さらに2 上の非 ア ノ酸の導入を考えた場合、アン ドン 外に別の 非 ア ノ酸を ド が必要となる。し し 大 にお て、他の2 の は ア ノ酸を ド としては使用できな 。 (オ カ の 、 ョンの 低 、オ はしばしば け する。)また、 ドン表の他の は天然ア ノ酸の で埋ま て る。そこで、 らのグ プでは、 を4 基に拡張して、 ア ノ酸を4 に ドする方法を開発した( 6 )。 常、 ボソ ムは3 基を

としてア ノ酸を 長する。し し、アンチ に4 基を持 を使用する ことで、対応する4 ドン上でプ グラムされた ム トを起こし、4 に ア ノ酸を ドできる。 理的には、この 法により23 24 目と、さら なる ア ノ酸の拡 可能である。 の としては、別に、 基 を使用する方法も開発されて る( 7)

００15 白質 の ア ノ 、その 用性にも わらず特定の 究者 にし われて な 。その 大の 、 ア ノ酸でア ノ した の 成が難 とである。 のよ に、天然のA Sは、 に対する 識が 厳密であり ア ノ 関係な を とできな 。そのため、 ア ノ酸で をア ノ するには、非常に手間が る 的な方法( ア ノ )が用 られてきた。 ア ノ酸を基 とできるよ にした改変 Sタン ク 素を用 る方法も開発されて る。し し、現存のタン ク 素 を基に改変したA Sタン ク 素を用 て、細胞 で非 ア ノ

ためには、改変A Sタ ク 素の ア ノ酸に対する 異性を高 す る必要があるが、これまで報告されて る ア ノ酸の数は膨大で、す ての ア ノ酸に対して改変A Sタン ク 素を作製することは現実的でな 、す てのア ノ酸に対応できる方法は、現在のところ 価で 雑な ア ノ

し な 。 方、本 らは、 然のア ノ ( アラ ンのアナ グ)を に結合さ ることができる S を用 る方法を開発して る( らによる特許 4、5、 2、3)

００16 ア ノ 法は非常に合成が複雑 高価であり、世界では数 究室 のみが合成可能である。また、天然 素を改変した 白質A Sは使用するア ノ酸 の種 ごとに作製しなお なければならな 。さらに、改変 白質A S 素を用 る 方法では、試験管内 白質 成系に存在する 白質 素でア ノ されな プ RNAと、それをア ノ する 白質 素の が必要である。こ れは他の生物種 らスク ングする必要があるが、一般的に 白質 RNA に対する 識も厳格なことが多 、これを2０種のア ノ酸に てスク ングする ことは現実的でな 。

００17 意の RNA 意のア ノ酸を用 て をア ノ することができるよ

Sがあれば、部位 な ア ノ 自在に行 ことができるとほ、 われるが、そのよ Sは報告されて な 。

1 5475 96

2 599 42

3 6０63566

4 2 3 5 4572 1 e nene a 1992)Poc Na Aca c U A 89 5381 5383 2 H M akam H a o andH ga 2００3) Chems Boog V o ０ 655 662

3 H M akam D Ko o k s andH ga 2００3) Chems Boo g Vo ０ ０77 1０84

Ban ・D e a 1989) Am Che oc・ 8０13 8０14

No en C・ e a 1989) cence 244 82 188 Hosaka T・ 1996)Am Chem oc・ 18 9778 9779

7 H ao ・ 2００2)Na Bo echno 2０ 77 182 明の

明が解決しよ とする課題

００18 明が解決しょ とする課題は、 ア ノ 、乳酸及びその他のカ ボン酸を に結合さ る反応、すなわち、多様なカ ボン酸を 基のドナ とする の 化を触 することができる新規な イム系及びその 途を提供する ことである。

題を解決するための

００19 て、以下の 明が提供される。

( ) 下の

P Z

P P2はステム・ プ 造を持ち 意の 列 らなる 域を表し、 ( )～( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ

2 2

を表し、 は3又は4を表し、 ( )～( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの

3 3 ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は5又は6を表し、 ( )～( )はそれ ぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、Z～Zはそれぞれ 立にC又はGを表し、 ，～ はそれぞれ 立にC又はGを表し、 は もし はGに 相補 な ノ ク オ を表し、 は ク オ 、Cは ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表す。

で表される 列 らなる構造を有する、 の を する であ て、

ボ の3 端のGG チ で を認識して結合し、 GG チ は に結合する の3 端の75～73 目の 基配列 相補 で ある、前記 イム。

(2) 下の

P P2はステム・ プ 造を持ち 意の 列 らなる 域を表し、 ( )～( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ

2

を表し、 は3又は4を表し、 ( )～ 2

( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの

3 3 ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は5又は6を表し、 ( )～( )はそれ ぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は ク オ 、Cは ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表し、互は もし はGに相補 な ノ ク オ を表す。

で表される 列 らなる構造を有する、 の を する であ て、

ボ の3 端のGG チ で を認識して結合し、 GG チ は に結合する の3 端の75～73 目の 基配列 相補 で ある、前記 イム。

(3) 下の ㈲又は(11)

P G GG P2 G G G GG ( )

P G P2 GG G GG ( )

㈲ (11)にお て、P P2はステム・ プ 造を持ち 意の 列 らなる 域を表し、 は ク オ 、Cは、 ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表し、互は もし はGに相補 な ノ ク オ を表す

で表される 列 らなる構造を有する、 の を する であ て、

ボ の3 端のGG チ で を認識して結合し、 GG チ は に結合する の3 端の75～73 目の 基配列 相補 で ある、前記 イム。

(4) ( ) ら(3)の にお て、P P2が、それぞれ 立して以下の ００2０ Q ，

3

e o e

R ００21 は 、C、 又はG ら選択される ク オ らなる 基数 ～8の 意の プ を表し、 ～Q はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 ～ はQ ～Q 完全もし は一部

を形成することにより優先的に2 をとり に選択される 、C、 Gの ずれ の ノ ク オ を表し、 は ～ の 数を表す。

表される 列 らなる、 ボ イム。

(5) で表される プ 1 が安定テトラ プである、 (4)に記載の イム。 (6) ( ) ら(5)の にお て、P が GG CG A G P2 が CCCGA GGG、で表される 列 らなる、 ボ イム。

(7) 下の(a)～(d)の ずれ の 列 らなる、 の 化を触 す る

(c) (a)にお て、3 端の が、ア される における73 目の 基に相補 になるよ にデザインされた任意の 基に置換された

にお て、3 端の が、ア される における73 目の 基に相補 になるよ にデザインされた任意の 基に置換された 。 (8) ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 による の を する である、上記( ) ら(7)の イム。

(9) の を する であ て、

(a) を認識して結合する

(b) 部分にお て された ステ 合を有し、

を有する ドナ を認識して結合する ドナ 位、

(c) ドナ 質 ら の3 端 の 応を する活性 を有する 位、を含み、

の3 端のGG チ らなり、 GG チ は に結合する の3 端の アクセプタ ステム 分の7 5～73 目の 基配列 相補 であり、これにより、 ボ が の3 端の アクセプタ ステム 分と 成により結合し、ア ドナ 位に結合した ドナ 質 ら の3 端 の 応 が速や に起こり、

の73 目の 基と を形成する イム上の塩 は、 もし はG に相補 な 基であるが、 の 類によ て相補 になるよ に変異をすること が可能であり、これにより、 ボ は任意の を することができること を特徴とする、前記 イム。

( ) (9)の にお て、ア を有する ド ナ 下の

O

R A「 S A「 、Rは のある官能 を表し、R2は にあたる化学 造を表し R3は脱離 に相当し、電子 を有するア ( )を有する

ステ 又は オベンジ ステ を表す

で表される構造を有し、 ボ の ドナ 、

である の 分を認識し、これにより、 ボ は、任意の を有するカ ボン酸を ドナ として を することができることを特徴とす る、 ボ イム。

( ) (9)又は( )に記載の にお て、ア を 有する ドナ 、ア を持 ア ノ酸の ステ 導体、ア を持 ア ノ酸の ステ 導体、ア を持 ステ 導体 ら選択される、 ボ イム。 ( 2) 下の(a)～(d)の ずれ を分子中に含む ク オ

(a) ( ) ら( )の ずれ に記載の 明の を構成する

(b) (a)の に相補 な配列 らなる

(c) (a)の にお て が に置換されて る配列 らなる

(d) (b)の にお て が に置換されて る配列 らなる

( 3) 下の( ) ら(d)の 程を含む、ア されたR の

(a) 明の を 上 供する工程

(b) を提供する工程

(c) されたカ ボン酸を提供する工程

(d) 、前記 された ボン とを接触さ て、 を する工程、

(e) された を単離する工程。

( 4) ボン酸が、天然ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 である、 ( 3)に記載の 。

( 5) されたカ ボン酸が、ア ノ酸の ステ 導体、ア ノ酸の ステ 導体、又は ボン酸の ステ 導体である、 ( 3)に記載の 。 ( 6) された ボン酸が、以下 ら選択される、 ( 3)に記載の

を持 ア ノ ア ノ酸の アノメチ ステ ア ノ ア ノ酸の3 5 ト ベンジ ステ ア ノ

ア ノ酸の4 ク ベンジ チオ ステ アノメチ ステ 、 ア キ 3 5 ト ベンジ ステ 。 ( 7) が に固定 されて る、上記( 3) ら( 6)に記載の 。 ( 8) ( ) ら( )の ずれ に記載の 明の を構成する の 3 端に 上の ン を付加した配列 らなる、固定 イム。 ( 9) 下の(a) ら(c)の ずれ の 程を含む、 明の に対する となるア ノ酸の ステ 導体の

(a)ア ノ基をBoc 護したア ノ酸を、ベンジ 位に ゲ を持ち に電子 を持 物と反応して ステ を形成さ 、その 、酸を用 てBoc 護基を 除

(b)ア ノ基をBoc 護したア ノ酸を、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 物と、一般的な 合剤を用 て 合さ て ステ を形成さ 、そ の 、酸を用 てBoc 護基を除 程、又は

(c)ア ノ基をBoc 護したア ノ酸を活性 したものを、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 物と混合することにより ステ を形成さ 、その 、酸を用 てB。。 護基を除 程

であ て、これにより、ア ノ酸の ステ 導体の による 位となることを特徴とする、前記 。

(2 ) 下の(a)又は(b)の 程を含む、 明の に対する となる、 ノ酸の ステ 導体の

(a)ア ノ基をBoc 護したア ノ酸を、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子

を持 物と、一般的な 合剤を用 て 合さ て ステ を形成さ 、そ の 、酸を用 てBoc 護基を除 程、又は

(b)ア ノ基をBoc 護したア ノ酸を活性 したものを、ベンジ 位にチオ 基を 持 物と混合することにより ステ を形成さ 、その 、酸を用 てBoc 護 基を除 程

であ て、これにより、ア ノ酸の ステ 導体の による 位となることを特徴とする、前記 。

(2 ) 下の(a) ら(c)の ずれ の 程を含む、 明の に対する となるカ ボン酸の ステ 導体の

( )カ ボン と ジ 位に ゲ を持ち に電子 を持 物と 反応して ステ を形成さ る工程

(b)カ ボン と ジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 合物と、 一般的な 合剤を用 て 合さ て ステ を形成さ る工程、又は

(c)カ ボン酸を活性 したものを、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 物と混合することにより ステ を形成さ る工程

であ て、これにより、カ ボン酸の ステ 導体の による 、 位となることを特徴とする、前記 。

(22) 下の( ) ら(。)の 程を含む、ア された の

(a)それぞれ以下の( )又は(2)の 列 らなる、 の 化を触 す る2 の を提供する工程

(b) を提供する工程

(c) ア ノ 、 ア ノ ステ 導体 ステ 導体を提供する工程

(d) 、前記 ア ノ 、 ア ノ ステ 導体 ステ 導体とを接触さ て、 を す る工程、

(e) された を単離する工程

(23)2 の がそれぞれ に固定 されて る、上記(22)の 。 (24) の を する を に固定 するために

能な 意の ク オ を 子の3 端に付加さ た、以下の( )又 は(2 )の 基配列の ク オ を含む らなる

( )GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU (3 端のNは付加さ た任意の ク オ )

(2 )GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGG UN

(3 端のNは付加さ た任意の ク オ )

(25)アデ を3 端に付加さ た上記(24)に記載の であ て、以下の( )又は(2 )の 基配列の ク オ を含む らなる ( )GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU (3 端のAは付加さ た ン)

(2 )GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGG UA

(3 端のAは付加さ た ン)

(26) 下の( ) ら(。)の 程を含む、ア された の

(a) 24の( N)又は請求 25の( A)で示される 基配列の ク オ を含む 、 24の(2 N)又は請求 25の(2 A)で示される 基配 列の ク オ を含む らなる2 の を提供し、それらを に固定 する工程

(b) を提供する工程 (c) ア ノ 、 ア ノ ステ 導体 ステ 導体を合成する工程

(d) に固定 された 、前記 ア ノ 、 ア ノ ステ 導体とを接触さ て、 を

、

(e) を単離する工程。

(27 下の(a (b (c を含む、天然ア ノ 、 ア ノ 、又は乳

された 子を得るために使用できるキット

(a) 上の本 明の イム

(b) の となる、天然ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 ステ 導体 ステ 導体

(c)

(28) が に固定化されて る、 (27)のキット。

(29) 下の(a) ら(d)の 程を含む、任意の ア ノ またはその他の ボ ン酸が所望の 位に導入された を製造する方法

(a) 明の を 上 供する工程 工程

(c) のアンチ に対応する を所望の 位に有する を提 供する工程

(d) 記の された および を翻訳 に加えて、 ア ノ またはカ ボン酸が所望の 位に導入された を製造する工程。 (3 ) ボン酸が である、 (29)の 。

(3 ) が終始 に対応するアンチ ドン、4 基 らなるアンチ ドン、人工 基を含むアンチ ドン、又は天然ア ノ酸を ド に対するアンチ を 有する、 (29)又は(3 )の 。

(32 (d にお て、 に加える前に、ア された を

ら分離する工程をさらに含む、 (29) ら(3 )の 。 (33) が に固定 されて る、 (29) ら(32)の 。

明の

００24 明の により、安価・ 便 時間にす ての 類のア ノ酸を人 工 を含むす ての に連結できる。さらに、 明の はア ノ 外の ボン酸も 基のドナ にできる。また、一種類の イム 子 で様 RNA ア ノ (カ ボン )に対応 能である。 の 非常に 単であり、ア 応も である。

００25 明の を用 た方法では、 RNAの 通配列がある3 端に認識 位 を特定して るため、す ての RNAをア ノ できる。す ての を にできるため、 の に対応 能であり、 な ア ノ 自在に行 ことができる。このよ な特徴は が完全な人工 であるがため に可能なことである。

００26 キ の ( )である。

2 の である ・ 監修 化学 897 r(a) アラ ン のク Ⅲ 同人、第3 、 1998 )を 引用 。

3 明の の2 造を模式的に示す図である。

4 然におけるア ノ 応を示す図である Abe s Johnson ews Ra R。b。 W 。 、中村 ・ MO ECU ARBO OGYO TH E 胞の 子生物学 339 g 6 56ア ノ酸の活性化Ⅲ トンプ ス 、 4 、2００4 )を引用 。

5 の 計を説明する図である。

6 表的な基 (ア ノ 、カ ボン ) を示す図である。

7ス キ の2 造を模式的に示す図である。

8 のア ノ における キ ス キ イム2の 示すスト プトアビジンゲ ト法の結果を示す図である。

g のア ノ における キ イム、ス キ イム 、 ス キ イム2の 示すスト プトアビジンゲ ト法の結果であ る。

1０ 又は イク ック の における、ス キ イム 2の 価を示すスト プトアビジンゲ ト法の結果である。

1 又は イク ック の における、ス キ イム 2の 価を示すスト プトアビジンゲ ト法の結果である。

12 のカ ボン G P の部 入を示す。

物のS S P G の 果であり、下のグラ は プ ョン 率を示す。

13 のカ ボン G P の部 入を示す。

物のS S P G の 果であり、下のグラ は プ ョン 率を示す。

明を実施するための 良の

００27 明の 解のために、まず めに語句の 明をする。

００28 ボ イム は、 反応を することができる ( )である。 ００29 ポ ク オ は、 ボ ク オ 、デオキ ボ ク オ 、又はこれらの とも8 基の ク オ のポ である。

００3０ ボ ク オ は、 分が ボ ら成る ク オ を 、 の 分である。 ク オ の 基部分は 、グア 、 ト ン又は ら成り、それぞれに対応する ク オ を ク オ ( )、グ ア ク オ (G)、 ト ン ク オ (C)、ウラ ク オ ( ) 。

はそれぞれの ク オ ある は 基に対応する慣用のア ァベット 字の である。

００31 とは核酸の 基の ま た組合わ の2個が互 に水素 合により したものを 。 を形成し得るよ 基の 合わ は互 に で あると 。 では ン( ) チ ン( )、 、グア ン(G) ト ン( 、 では ( )、 、GとCが する。さらに、 ではG G のよ な わゆる ワトソン ク ック 熱力学的に安定な として 在 するので、本明細書にお てはこれらの 合わ も である 。 ００32 は、 素によ て触媒 用を受ける 物または分子を 。 明の は、 R ア ノ その他のカ ボン酸を基 とする。し し 、 明の はR に ては なる も とすることができるた め、本明細書中で単に 合、文脈によ ては ア ノ その他の ボン酸を専 指す場合がある。

００33 は天然の A 人工的に構築した の 方を指す。ク

造に類似する2 造の 成に対応する配列を有する 子であ て、さらに 形の ン クトな 造をとり、 造の 方の端にあたる3 端にア ノ その他のカ ボン酸を結合し(ア )、も 一方の端に位置するアンチ に よ て 上の を認識すると 能をも 子を指す。

をさらに した構造を有する ック イク ック を含めて

や 称することもある。

００34 ア ノ は、 を正常にア ノ する2 ア ノ酸の ち の 意のア ノ酸を 。このよ なア ノ酸は、 ア ノカ ボン (または置換 ア ノカ ボン )である、アラ ン(Aa)、 ン(Va)、 イ ン( e )、イソ イ ン e)、プ ン(P o)、ト プト ァン(Tp)、 アラ ン(Phe)、メチオ ン( e )、グ ン(G )、セ ン( e )、ト オ ン(Th)、 ン(T )、 ステイン(C s) 、グ タ ン(Gn)、アス ラギン(Asn)、 ジン( s)、ア ギ ン( 9)、ヒス ジン( Hs)、アス ラギン (Asp)、およびグ タ ン (G )である。したが て、 ア ノ は、上記2 類の ア ノ 外の 意のア ノ (またはその 導体) を意味する。 ア ノ酸は人工的に合成したものであ ても、 自然界に存在する ものであ てもよ 。また、ここでは ア ノ酸は天然ア ノ酸の誘導体であ ても よ 。

００35 ア ノ とは、分子内にア ノ ( ) ( OO )の の を持 物を指す。 えば、ア ノ酸には、ア ノ基がア キ ア ノ ( ) ア ノ ( C )とな て る ア ノ酸も含まれる。ま た、 ア ノ酸には ア ノ 、 ア ノ 、 ア ノ酸も含まれる。

００36 ボン とは、分子内に力 基を持 物のことを が、 に置 ては特に分子内に水酸基を併 持 カ ボン ( キ )が 重要である。その として、 カ ボン酸に代表される や

カ ボン酸に代表される がある。ア ノ酸も ボン酸の 種であると える 。 明細書にお て、別途の 釈を けな 限りは、 カ ボン の語はア ノ酸を 含むものとして る。

００37 の とは、 に ( CO )が結合することを 。こ の 、 の3 端の ク オ の ボ 酸基(2又は3 O )に ア ノ やその他のカ ボン酸の 基が ステ 合したものである。

００38 ア ドナ ある はア ドナ とは、 の にお て 基を与える 物を 。 明細書にお ては、分子内に 基を有する 物である、ア ノ その他のカ ボン酸が 当する。

００39 ポ は、 2 上のア ノ酸が 合によ て連結した一連のア ノ 酸の鎖を 。 (ア ド )は、第一のア ノ酸の 基の炭 素原子と第二のア ノ酸のア ノ基の窒素原子との間の共 ( O )で ある。さらに、本明細書にお ては、一部のア ノ酸が カ ボン また は カ ボン酸で 換された ポ も 称するこ とがある。この 合、一部の 、 と水酸基との ( CO O )によることになる。

００4０ 明の 施のための 料及び方法は、特に断らな ぎり、 学及び 子生物 学の 術分野でよ 知られる慣用の 法に従 て、 一般的な教科書や専門 的な 献に記載されて る方法を用 る。 子生物学に ての 献とし ては、例えばSa b oo oec a Co abo a o a a 2 Cod S abo abo a o Pess Cod S abo

( 989)および s be C e Po oco s oec a oo G ee e P b s ssoca e ( 992) および a o および a e s bodes abo a o a a Cod S abo abo a o Pess Cod S abo ( 999)を参照された 。

００41 の であり、 の 通配列がある3 ( CC 3 、 は 基と呼ばれる73 位の塩基であり 又はGの ずれ である)に認識 位を特定して る。 明の 解のために、以下では の 造に て説明する。

００42 これまでに決定されたR の ク オ 列 ら二次 造を組み立てると一 の 通の 造が得られる( 2)。この 造がク の葉の形に似て ること ら これをク 造とよび、 の 造を表す デ 造として られ て る。ク の茎にあたる部分の ク オ 鎖は塩 を形成して2 と な ており、これをステム(s em)とよぶ。また、葉に相当する部分の ク オ 鎖は 塩 を形成 ず、 (oop)とよばれる。ステム・ プを合わ た構造をア ム( m)とよんでおり、アンチ ア ム、 ア ム、 のCア ムがある。 の ア ムがさらに 曲がり、 ン クトな 造とな て る。 ００43 ステム プのサイズには規則 がある。たとえば3枚の葉の ち、先端に位置 する葉であるアンチ ン プは7 の ク オ ら 成されて る。この プの 央に位置する3 鎖がアンチ で、 の 識に関与して る。ア ンチ ン プに対応する葉に なが た茎がアンチ ドンステムで、 5 対 ら て る。ク の にあたる部分がアクセプタ ステムで、7 対 ら て る。 の3 4 にな ており、末端の3 はす て の でCC 列にな ており、末端の ン 2 O または3 O 基にア ノ酸が ステ 合する。 の3 端 ら4 目の ( CC 端の 、73 )は、 (デイスク ネ タ )とよばれており、 のア ノ 異性に関与して る。

００44 明の はR の ( 又はG)を含む3 通配列(73～ 75 目の 基配列)を認識するよ に設計されて る。

００45 明の イム

明の は、背景 術にお て説明した キ イム を基にして構 築された人工 である。 体的には、 キ の 列を部分的にラン ダム した を ドメインとして、 ボ ドメインの3 端に インを付加した配列 らなる 用 て、試験管内分子 により さ れた。まず、 適当な ドナ を加えて反応を進行さ て、 ドメインを することができる活性 ( 子内型)を選択した。さらに、 ドメインを除 たもの( ボ ドメイン)を用 て分子 で活性を評価し、 率で を ことができるものを 明の とした。なお、人工

の 製に ての 般的な説明は、 白質 vo 48No 1(2００3)15 15 18を参照された 。

００46 明の の2 造を図 すると 3のよ になる。

3にお て、P およびP2で表される部分は、A S の2 造を活性 な形に固定する 基配列 域であり、ステム・ プ 造をも 。 はそれぞれ 立 に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 3 4個の ク オ 、 (2)の部 5 6個の ク オ 、 (3)の部 2個の ク オ 、 (4)は 個の ク オ らなる。z又は はそれぞれ 立 にC又はGを表す。 3 端の は の 基である 又はG(73位の塩 )に 相補 な ノ ク オ であり、 、C、 Gの ずれ ら選択される。 ００47 すなわち、 明の は、以下の ( )で表される 列 らな る構造を有する、 の を する である。

にお て、 ( )～( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の

2 2

ノ ク オ を表し、 は3又は4を表し、 ( )～( ) それぞれ 立に 、 C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は5又は6を表し、 ( 3 ( 3

)～ )はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、z～ z4はそれぞれ 立にC又はGを表し、 ～ 3はそれぞれ 立にC又はGを表し、 は もし はGに相補 な ノ ク オ を表し、 は ク オ 、Cは ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表し、P 2はステム・ プ 造を持ち 意の 列 らなる 域を表す 先に述 た通り、 明の が を認識する際には、 RNAの 通配 列がある3 端が認識 位となる。すなわち、 ボ の3 端のGG チ で の3 端を認識して結合する。 GG チ が に結合する の3 端の73～75 目の 基配列 相補 であるよ に を設計し て る らである。 の73 目の ( ) を形成する 、 又はGに相補 な 基であるが、 ボ に結合する の 類によ て相補 になるよ に変異をすることが可能である。 又はGに相補 な 基とは、 ワトソン ク ック を含む 念として広 対 能な ことであり、 に相補 な 又はG、Gに相補 な C、 又は である。

００48 次に、 P P2はステム・ プ 造を持ち 意の 列 らなる 域 である に て説明する。P およびP2 、 S の2 造を特 定する 基配列 域であり、ステム・ プ 造をも 。P 域及びP2 域にある ステム 造とは、 2 列にお て完全もし は一部 を形成することに より優先的に2 をとり 構造を 。 プ 造とは、ステム 造を なげる形 で存在する 意の プ である。 安定 造をも プ 造としては GA 、GAGA UUCG等で代表される4 プ(テトラ プ)が挙げられる。P およびP2 域のステム・ プ 造としては、塩基配列およびステムの さや プの きさには左右されず、優先的にステム・ プ 造を持ち 基配列を全て 。し し、 ボ イム 体の きさ ら考えて 当な長さをあえて 定するならば 、 ( )のP 又はP2に ては、 ～24 度の ク オ らなる 列が望ま 。P P2 の 造を活性な形に固定する役割を 担 、P 又はP2の 域の 体的な 、ステム・ プ 造を持ち 配 列であれば なる配列でもよ 。このよ 配列は の 列 ら任意に選択 能であり、例えば、 ～24 度の ク オ らなる 列である場合 に2 造で表すと次の式で できる。

００49 3

，

3

R 5 ００5０ にお て、 は 、C、 又はG ら選択される ク オ らなる 基数 ～8の 意の プ を表し、 ～Q と ～ はステム 造の 分であ り、Q ～Q はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 ～ 完全もし は一部 を形成することにより優先的に2 をとり 。 て ～ の Q～Qの 列にそれぞれ相補 もし は 部 である。 は ～ の 数を表す。

００51 の 例は安定テトラ プである。 テトラ プの 例としては

GA A、GAGA UUCG等が挙げられる。 えば、安定テトラ プがGⅣ である 場合のP 又はP2の 域の 体的な 2 造で表すと次の式で で きる。

００52 4

A o o o Q 3

R 5， ００53 ある は、安定テトラ プがUUCGである場合のP 又はP2の 域の 体的な

2 造で表すと次の式で できる。

００54 3

5， ００55 にお て、Q ～Q はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 ～ はQ～Qにそれぞれ相補 もし は一部 ノ ク オ を表す。

００56 ステム プ 造を取り得るこのよ 配列のさらに 体的な例として、5 GGAUC GA㌦ GAUCC 3 5 CCCUUCGGGG 3 ( 部位は相補 な )等が挙 げられるがこれらに限定されな 。

００57 明の は、 キ イム を原型として、 キ の 性に重 要であると考えられる 基をランダムにして作成した ら試験管内分子 法により された。 ( )で表される一般 キ の 含す るが、 キ にお ては、Z～Zの部分の 列がCCGCであり、 ( )

4 ～( 2 2

)の 分の G であり、 ( )～( )の部分の Gであり、 P q

3

～ の部分の 列がGCGであり、 ( )～ 3

( )の部分の 列が で 4

あり、 が であり、 P の部分の 列がGGAUCG GAUUUであり、 P2の部分の 列がCCCG AGGGである。

００58 明の は、特に ( )で表される部分の 列を変 さ ること により、原型の キ よりも ドナ の 異性が飛躍 に拡大し 、 性が向上した。 て、 明の の 、上記の( )にお

3 3 4

て、 ( )～( ) ( 2

)～ 2

( ) ( )～( ) の ク オ を規定し P q 2

列 らなる構造を有する、 の 化を触 する である。

2 2

この 合、一 の 体例として、 ( )～( )がGGC、 ( )

P ～( )が

q G 3 3 4

、 ( )～( )が 、 が である。ある は、も の 体例として

2 2 3 3

( )～( )が C ( )～( )が C G ( )～( )が

P q

4

が である。

００59 別の態様では、 明の は、上記の( )にお て、Z～Z4 ～

4

びに の ク オ を規定した、以下の (2)で表される 列 らなる構造を有する、 の を する である。

( 2)P

2にお て、 ( )～( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の

2 2

ノ ク オ を表し、 は3又は4を表し、 ( )～( ) それぞれ 立に 、 C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は5又は6を表し、 ( 3 )～ 3

( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は ク オ 、Cは ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表し、匝は もし はGに相補 な ノ ク オ を表し、P P2はステム・ プ 造を持ち 意の 列 らなる 域 を表す 別の態様では、 明の は、上記の (2)にお て、さらに、 ( )～( 2 2 3

)、 ( )～( ) ( )～ 3

( )の ク オ を規定した 列 らなる q

造を有する、 の を する である。そのよ な

以下の㈲又は(11)で表される。

００6０ P CCGCGGC P2 G GCG GG ( )

P G P2 GG G GG ( )

(1) (11)にお て、 は ク オ 、 、 ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表し、 は もし はGに相補 な ノ ク オ を表し、 P2はステム・ プ 造を持ち る 意の 列 らなる 域を表す

㈲又は(11)にお てP 域及びP2 域の 列を規定することもで きる。この 合、P がGG CG G であり P2がCCCG GGG であることができる。ある は、P がGG CGA G であり、P2が任意の 列 らなることができる。ある は、P が任意の 列 らなり、P2が C CG GGGであることができる。

００61 明の は、以下の(a)～(d)の ずれ の 列 らなる、

の を する であ てもよ 。

(a) GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU 3 (b) GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU (c) (a)にお て、3 端の が、ア される における73 目の 基に相補 になるよ にデザインされた任意の 基に置換された

にお て、3 端の が、ア される における73 目の 基に相補 になるよ にデザインされた任意の 基に置換された 。

００62 (a)と(b)にお て、ステム・ プ 造にあたる部分は下線で示しており、 RNAとの 位にあたる 3 端のGG チ である。 は ク オ 、Cは ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表す。 ００63 (a)の ( 7) らなる をス キ イム 、 (b)の ( 8) らなる をス キ イム2 称し、後述の でさらに詳し 説明する( 7)。ス キ 2は、P P2 びに の 位である3 端のGG チ を、原型とな た キ のものとほぼ同一にして創製されたものである。さらに、ス キ 又は2のGG チ をGG (互は の73 目の 基に相当する 基と をとる相補 な 意の ) チ に改変することにより、 なる にも対応できる と人工 能である。 て、3 端の は(c) (d)の イム 列では する の 基に応じて置換できる 基として る。なお、 (a)～(d)の 列にお ても、P (GGAUCG GAUUU) P2 (CCCG GGG)は、他の任意のステム・ プ 造に置換することが できることは当然である。

００64 業者は、以上で説明した配列を有する を合成することにより、 明の を製造することができる。 の 当業者に慣用される 意の 法で行 ことができる。 えば、 明の を構成する 列に相当する を 合成し、それをPC で増幅した を 7 ポ メ スにより 写して 目的の を合成する方法は簡便であ 。

００65 また、 の 当な に固定 するための として、 ボ イム にさらに 上の酸化 能な 意の ク オ を付加した核酸 子と することもできる。

００66 て、 明の を構成する 子に関連して、以下の(a)～(d)の 子の ずれ を分子中に含む ク オ も 明に含まれる a) 明の を構成する (b) (a)の に相補 な配列 らなる c (a)の にお て が に置換されて る配列 らなる (d) (b)の にお て が に置換されて る配列 らなる

００67 明の の ドナ

明 は、天然ア ノ 、 ア ノ 、乳酸、 びその他の ボ ン酸を 基を介してR に結合さ る反応、すなわち の 、を する である。この 、 の3 端の ク オ の ボ 酸基(2又は3 O )に天然ア ノ 、 ア ノ 、乳酸、 びその他のカ ボ ン酸の 部分が ステ 合したものである。

００68 際には、天然ア ノ 、 ア ノ 、乳酸、 びその他のカ ボン酸は、 ボ 接触する前に、あら じめ された ステ 又は ステ 導体とされており、 明の はそのよ された

基を の3 分に転移する反応を する。この 応にお て 基のドナ となる天然ア ノ 、 ア ノ 、乳酸、 びその他のカ ボ ン酸の ステ 又は ステ 導体に て詳し 説明する。

００69 然界では、 Sタン ク 素が、 Pの 水分解と共役したア ノ の 、ア ノ の 合の2 階の 応を してア ノ の 成を行 て る。まず、ア ノ酸の 基が P部分と結合して活 性 され、アデ ア ノ となる。次に、アデ ア ノ酸 ら Pが脱離し、 ア ノ酸のカ ボ 基は の3 端の ボ 酸基に移される。この によりア ノ酸が 活性 ステ 合を形成し、ア ノ された が生じる( 4を参照)。 されたア ノ との ステ 、加水分解 により大きな自由 ネ ギ を放出する ネ ギ 合であり、この 合の ネ ギ はその後のタン ク 成の 階で、ア ノ酸を共有 合で な で

鎖を伸長さ るのに使われる。

００7０ 方、本 明にお ては、 2 階の 応の 性を同時に求めることは ず、あ ら じめ した を使用することで活性 の スキップ 、 である ア ノ その他のカ ボン酸を に結合さ る反応(ア めの 程 を する を構築した。 まり、 素による をスキップする わ りに、ア が進行するカ ボ 基にお て された ステ 合を持 ア ノ その他のカ ボン酸の誘導体を基 として使用する。 般に 基の活性化は電子 をも ステ 合さ ることで 成できる が、あまり強力な電子 を有する ステ では水中で加水分解が起きる ば り 、ランダム RNA の が 発してしま 。したが て、このよ 応が起きに よ に ドナ を用 る必要がある。 明の は、無触媒 態では反応を起こさな 性化したア ノ その他 のカ ボン 導体 ステ 等に結合し、 RNA の を できる である。このよ ステ 合の 性化は、例えば、 アノメチ ステ 、 ステ 、 ト ッ その他の電 の をも た ステ 等を使用して ことができる。 明細書で ドナ に て記載する場合 、このよ に 基を弱 する電子 の ア ある は単に 称する。

００71 を持 (ア ノ カ ボン )を許容さ るためには、さらに、 の の面 らの 夫が必要であ た。 来の キ では、ア ノ としては を有するものが好適な基 とな て た。これは、 キ が となるア ノ の を認識して る らであ 考えられた。 そこで、 明にお ては、 位がア ノ その他のカ ボン の 分となるよ に を最適 した。 位を脱離 とし、 に対する の 識をな すことで、 を持 ア ノ ボン酸が許容できるよ になると考えられた らである。 体的には、原型の キ が を認識すると考えられたため、ア となる部分にの 分 が認識 位となる)に を導入したものを作製し、これを用 て分子 を行 た。

００72 5を参照して、このよ の 体的な設計 法の 様を説明する。 5 の 従来 の の 例である ア ノ酸の アノメチ ステ で あるが、 キ による本来の ア ノ の

００73 6

００74 であり、脱離 ( アノメチ 部分)

H 7 ００76 は キ による 識を受けて な と考えられた。 来の キ に ての 験結果によると としてAMP、 ステ 、 アノメチ ステ など なものが受け入れられて た らである。そこで、 明にお ては、認識 位 が基 ではな に位置し、 が従来の の に位置 するよ に転換することにより、 ア ノ 外の にも対応 能となるよ に、 対応 能な基質の数を増やすことを意図した。

００77 体的には、 キ が を認識すると考えられたため、脱離 となる 位に を導入した。 5 の で一例(ア ノ酸の ステ 導体)を示すがこれに限定されるものではな 。この 、認識 位の と反 応部位( )の 素とは にほぼ同じ 離を保 にするのが好ま 。また、脱離 には電子 性の基を導入することで ステ 合を弱 さ てお 。 としての ステ 合を活性 さ る電子 の として は、複数の ト ッ素の導入、ベンジ の 位の炭素 ら直接 ッ アノ 基を用 て電子を吸引する等が考えられる。 ステ の わりに ステ を使用 することで、 の を〒 こともできる。

００78 後 の にお ては、 アノメチ ステ (C )、 3 5 ト ベンジ ステ ( )やP ク ベンジ チオ ステ (C )を持 の ( 6)を 具体的に示すが、これに限定されな 。 ステ 合を十分に活性 できる、反応 率の スクリ ングして ることが可能である。

００79 が認識されるよ に最適 されたア ノ はその他のカ ボン酸の ステ 導体の 、次のよ にして ことができる。

００8０ ア ノ の 合、まず( ) を oc 護したア ノ酸を、ベンジ 位に ゲ を持ち に電子 を持 合物と反応し、 ステ を形成さ る。次に、 酸を用 てBoc 護基を除 ことでア ノ を合成する。また、この ステ は、 ( 2) をBoc 護したア ノ酸を、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 物と、一般的な 合剤を用 て 合さ ることでも合成できる。さらに( ) oc 護したア ノ酸を活性 したものを、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 合物と混ぜることでも合成できる。 記の3種の方法の 、 ( )の 法が簡便であり、実施 では( )の 法を用 てア ノ を合成して る。また カ ボン 同様であるが、ア は存在しな ため、上記の 路の酸によ る 不必要である。

００81 ステ の 、上記の(2)又は(3)の 法を用 て ことができる。ただ し、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 物の わりに、ベン ジ 位にチオ 基を持 物を用 る。 ステ は、活性が比較的 の で、 の 必ずしも必要ではな 。また上記2種の方法の (2)の 法が比較的 便なため、実施 では(2)の 法を用 た。

００82 の である、 として をも ア ノ酸の アノメチ ステ の 成に ては、 2 5 528 9 (W 2 3 7 74 )を参照された 。

００83 らは、具体的な一 の ドナ を用 て

の を〒 ことにより、その 体的な ドナ のみならず、他の広範 な ドナ にも適応した を得ることができることを実証した。 え ば、従来 の である アラ ンの アノメチ ステ (P e C )又 は を導入した である キ ト ベンジ ステ ( )を用 て分子 を行 た結果、2 類の ア ノ 9 上の非 ア ノ びに 適応した を得た。 来の キ にお ては、 分に を有するア ノ酸の ステ 又は ステ 導体が好適な基 とな て たが、これらに加えて、 明の に対 しては、ア を有するア ノ酸の ステ 導体、ア

を有するア ノ酸の ステ 導体、ア

を有する ステ 導体 好適な基 となり得る。この 徴により、 に任意の 造を有する上記の 導体に対応 能とな た。また、 明の にお ては、 分に を有するア ノ酸の アノメチ ステ に ても 来の キ 比較して活性が向上した例もある。

００84 すなわち、 明の に対する ドナ 、ア 部分に お て された ステ 合を有し、 を 有する カ ボン ( えばア ノ )の 導体である。

００85 用 た R A 反応

明の を用 れば、 の にお てす てのア ノ酸を基 とすることが可能となる。したが て天然ア ノ としては、従来の キ で は とできな た アラ ン、 ン、ト プト ァン 外の 7 類の ア ノ酸も用 ることができ、 ア ノ としては、 外の をも ア ノ酸も用 ることができる。その 、本 明の は、ア ノ基の代わり に水酸基を持 カ ボン 、例えば とすることができる。これは 明の の 要な特徴の であり、従来のA S らは全 像も な 、生物 学の 識を覆す 徴である。A Sは特定のア ノ酸をそれに対応する に結合 さ る( をア ノ酸で する、すなわちア ノ する) 素であり、 その 果、 の 号がア ノ と される。ところが、 明の は、ア ノ 外の カ ボン までも に結合さ る( を ボ ン酸で する とができる。その 果、非 ア ノ酸を含むす てのア ノ 、さらには、ヒド ボン酸 の 号の 可能となるのである。 ００86 さらに、 明の の 、す ての に対して、ア 応を 行 ことができることである。これは、 明の が を認識して結合する 部位( )が、 3 端のGG チ のみを必要とするため、このGG チ の GGがす ての 子に共通の 列である3 端の Cを認 識し、 が3 端 ら4 目の 基を認識して る らである( まり、 は の 基に相補 な )。これは、天然のタン ク S S 素を改変して得られた 素との 著な相違である。 然の Sは、 との 造 的、化学的な相補性が広範な領域に及ぶことにより、 の 特徴を感知し て特異 な のみを厳格に認識する。 方、本 明の は、

位であるGG チ フ のアクセプタ ステム上の共通配列との ク オ 士の 補性により、 を認識して結合する。

００87 明の は、 である 来の キ を基にして構築され、 位としてのGG チ 、 P P2 域を有する。P P2 ス テム・ プ 造 らなり、 性に必要な配列を固定する部分である。 性 に必要な配列には、 応に必要な部位が含まれる。

００88 すなわち、 明の は、 位を構成するGG チ 、構 造を固定するP P2 域、ア ドナ を認識して結合し

位、 ドナ 質 ら の 応を する活性を 有する 位を含む。このよ 構造により、 に結合し、ア ドナ にも結合し、ア ドナ 質 ら の 応を し て 基を の3 端に特異 に結合 しめる、すなわち、 を する。

００89 明の が ドナ に結合して を す る際には、 ボ の (3 端のGG )は、相補 な に より に結合する。 時に、 明の はあら じめ された ドナ を認識して結合する。この 、本 明の は、ア ド ナ の の 分を認識すると思われる。 イ ム上に ドナ が適正に結合することにより、ア ドナ 質 ら の3 端 の 応が速や に起こると考えられる。ア ドナ 質 ら の3 端 の 応にお て、

脱離し、ア 基が の3 端の ボ 酸基に移される。この によりア ノ カ ボン酸が 活性 ステ 合を形成し、ア された が生じる。ア された が生成すると、 ボ は生成 物 ら離脱し、新たな に結合できるよ になる。

００9０ て、 明の の 徴は次のよ に表すことができる。

の を する であ て、

(a) を認識して結合する

(b) 部分にお て された ステ 合を有し、

を有する ドナ を認識して結合する ドナ 位、 (c) ドナ 質 ら の3 端 の 応を する活性 を有する 位、を含み、

の3 端のGG チ らなり、 GG チ は に結合する の3 端の アクセプタ ステム 分の7 3～75 目の 基配列 CC( は 基であり、G又は である) 相補 であり、 これにより、 ボ が R の3 端の アクセプタ ステム 分と

成により結合し、ア ドナ 位に結合した ドナ 質 ら の3 端 の 応が速や に起こり、

の73 目の (ディスク ネ タ ) を形成する イム 上の塩 は、 もし はGに対応できる 基であるが、 の 類によ て相補 になるよ に変異をすることが可能であり、これにより、 ボ は任意の を することができることを特徴とする、前記 イム。

００91 明の は 子上の芳 を認識すると考えられる。 て、ア ドナ を有する 、ある は を有 するものである。

００92 ドナ を有するものである場合には、ア ドナ 以下の で表すことができる。

００93 8

O

R， R R Ar Ar S Ar

００94 、R R2 R3は任意の 造を示す。 えば、R はア ノ 、水酸基、チオ 基など のある官能 、R2はア キ 、ア 基など に あたる 造を示す。 R3は脱離 に相当し、ここでは特に電子 を有 ア ( )を有する ステ オベンジ ステ を示す。 の ドナ の ( )の部分を認識し、これ により、 ボ は、任意の を有するカ ボン酸を ドナ として を することができる。

００95 を有する ドナ の 体例としては、ア

を持 ア ノ酸の ステ 導体、ア を 持 ア ノ酸の ステ 導体、ア を持 ス テ 導体が挙げられる。

００96 明の を用 た の仝

明の を用 て、所望の ドナ された を 合成できる。

００97 明の による、ア された の 以下の 程を含む (a) 上の本 明の を提供する工程 (b) を提供する工程 (c) されたカ ボン酸を合成する工程 (d) 、前記

されたカ ボン とを接触さ て、 を する工程 (e) された を単離する工程。

００98 この 法にお て ドナ として るのは、あら じめ された カ ボン酸である。ア ドナ としてのカ ボン酸は、例えば、天然ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 である。 性化は、 ステ 合を弱 さ るよ の 入により、 されたカ ボン酸の例は、ア ノ酸の ステ 導体、ア ノ酸の ステ 導体、又はカ ボン酸の ステ 導 体である。このよ ドナ の 例は、 を持 ア ノ ア ノ酸の アノメチ ステ 、天然ア ノ ア ノ酸 の3 5 ト ベンジ ステ 、天然ア ノ ア ノ酸の4 ク ベ ンジ チオ ステ 、 アノメチ ステ 、

ア キ 3 5 ト ベンジ ステ 等、のア ノ 乳酸の ステ 導体 ステ 導体である。

００99 明の による、ア された の 法にお て、 とし ては なるものも用 ることができる。 は、天然の でも人工的に構築し た でもよ 、ク 造に類似する2 造の 成に対応する配列を有 する 子であ て、さらに 3 造を形成し、一方の端にあたる3 端にア ノ その他のカ ボン酸を結合し(ア )、も 一方の端に位置するア ンチ によ て 上の を認、 すると 能をも 子であれば よ 。 の にお ては、アン に対応した人工サプ 、

のひと であ A。

る を した例を記載

uA して る

c 。

０1００ 明の による の 、 液中で行 てもよ し、 に固定 を用 た を用 て反応さ てもよ 。 えば、もし 訳の スケ が 4 下の な 量であれば、 液中で による の を 、反応 液を タノ した 、 を適当な ( えば の カ ウム、 5等)に溶解し、 に添加すれば良 。 スケ の 件の としては、実施 3に記載の 法を参照された 。 般的な反 応 件としては、例えば、最終 度で０・5～2 の RNA、０・5～2 の 明の イム、2～ Mの ドナ 、０・6MのMgC

2を含むp 7・5、０・ Mの 、 Cで ～24 間、反応さ る。

０1０1 訳の スケ が 4 を超える場合は、 ボ の 利用を考慮し、 に固定 を用 たほ が好都合である。 として、例えば、 脂、ア ガ ス、 ァ ス、磁器ビ ズなどを用 ることもできるが、特に限定されな 。

を に固定 して反応を行わ る場合は、例えば、M akam H・ Bonz ag N・ and ga H 2００2) Amnoac RNAS nhes sb a esn mmob zed boz e・ ・Am Che oc 24(24) 6834 6835に記載の 法に従 て行 ことが できる。 物である の 、 方法で行える。 例として は、 O 度の を含有する ら 出する方法がある。

を固定 した樹脂は、例えば ッ ァ で平衡 することにより、十数回 サイク することができる。

０1０2 このよ に 明の を用 た 簡便であり、 と組合わ て を得るためのキット 製品とすることもできる。キットの 低限の 容としては、 (a) 上の本 明の イム( に固定化され てもよ 、 (b ) の となる、天然ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 ステ 導体 ステ 導体、 (c) を含んで ればよ が、さらに、 反応 、反応 器、使用 明書 含んで てもよ 。

０1０3 ス キ を用 た の

明の の 、ス キ は、原型の キ イム 様に、脱離 として アノメチ 基を、 として をも ア ノ酸に対応できる。 また、脱離 として4 ク ベンジ チオ を、 としては芳香 外の をも ア ノ酸に対しても活性を有する。特に、4 ク ベンジ チオ との み 合わ により 位に 分かれ をも ア ノ ( えば ン ソ イ ン)に対し て、活性を有する点が有用である。さらに、 アノメチ 基もし は4 ク ベンジ チオ で活性 された もし はア キ 導体にも活性を示す ０1０4 ス キ イム2は、脱離 として3 5 ト ベンジ ア を、 には芳香 外の をも ア ノ酸に対し活性を有する。この の 、他の に比較すると ( )の 記の ドナ に対しても活 性を保持できることである。また、 3 5 ト ベンジ ア は活性 として 、これにより無触媒による な のア ノ 化は完全に避けら れる。 方、ス キ イム2の 、脱離 として4 ク ベンジ チ オ をも ア ノ酸に対してス キ に比較して活性が低 こと、 また3 5 ト ベンジ ア を脱離 にもち 位に 分 れ をも ア ノ酸に対して活性が低 ことである。

０1０5 て、これら2 類のス キ を組み合わ ることにより、実質的 には なる を有するア ノ酸にも対応できる。 般的には、 位に 分 れ を持たな ア ノ酸に関しては、 3 5 ト ベンジ ア を脱離 にも ドナ に対して、ス キ イム2を用 ることで対応できる。 位に 分 れ を持 ア ノ酸に関しては、4 ク ベンジ チオ を脱離 にも ドナ に対して、ス キ を用 ることで対応できる。 ０1０6 て、ス キ 2を組合わ て る以下の 法により、 される。

(a)それぞれ以下の( ) (2)の 列 らなる、 の 化を触 す る2 の を提供する工程

(b) を提供する工程

(c) ア ノ 、 ア ノ ステ 導体 ステ 導体を合成する工程

(d) 、前記 ア ノ ア ノ とを接触 さ て、 をア ノ する工程、

(e) された を単離する工程

を含む、ア された の 。

０1０7 2 のス キ はそれぞれ に固定 して ることもできる。

の際には、 能な 意の ク オ を 子の3 端に付 加さ た、以下の( )又は(2 )の 基配列の ク オ を含む らなる ス キ を用 ると好都合である。

( )GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU ( 9)

(3 端のNは付加さ た任意の ク オ )

(2 )GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGG UN( )

(3 端のNは付加さ た任意の ク オ )

意の ク オ が である場合、以下の( )又は(2 )の 基 配列の ク オ を含む らなる ス キ を ( )GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU ( )

(3 端のAは付加さ た ン)

(2 )GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGG UA( 2)

(3 端のAは付加さ た ン)

このよ 固定 を用 る場合、ア された の 以 下の( ) ら(。)の 程を含む。

(a) N)又は( A)、 (2 N)又は(2 A 、で示される 基配列の ク オ をそれぞれ らなる2 の を提供し、それらを に 固定化する工程

(b) を提供する工程

(c) ア ノ 、 ア ノ ステ 導体 ステ 導体を合成する工程

(d) に固定 された 、前記 ア ノ 、 ア ノ ステ 導体とを接触さ て、 を

、

(e) を単離する工程

を含む。

０1０8 明の を用 た部位 典的変異ポ の

ア ノ カ ボン酸を結合した 当な プ を用 て、任意の ア ノ カ ボン酸が所望の 位に導入された

を製造することができる。

０1０9 ここで、 明の 解を助けるために、 プ ある は プ ョン( 抑圧)に て説明する。 型的には、 プ とは、遺伝子の 異による 換、塩基 入や 損による形質の 抑圧する であ る。 然にお ては 物にお て多 見出されて る。 換などによ て 上の翻 域に生じた を、あるア ノ酸に対応する として認識 )、あるア ノ酸に対応する をそれとは異な 来の 伝子 物を産生したり、 した遺伝子 物の 能をもとに戻すことができ る( 、 ョンある は抑制)。 入や 損によ て生じた遺伝 号の み取り枠のずれを抑圧できる ム ト 、 )もある。 ム ト 、 には、4 基をア ノ酸の として み取る がある。 ア ノ にお ては、例えば、 ア ノ酸でア ノ

プ により、変異 伝子上のアン ドン( G)を 、 ョン( )することで、アン の 置に非 ア ノ酸が導入される。

０11０ 明の を用 ることにより、 ア ノ酸を結合した 当な プ を簡単に合成することができる。さらに、ヒド カ ボン酸を結 合した プ の 成も可能である。

０111 て、 明の を用 た、部位 変異ポ の製

(a) 明の を提供する工程、 (b) を用 て を ア ノ または カ ボン酸で する工程、 (c) のアンチ に対応する を所望の 位に有する を提供する工程、 (d) 記の された および を翻訳 に加えて、 ア ノ または カ ボン酸が所望の 位に導入された を製造する工程、を含む。

程の 細に ては、これまでの 明を参照された 。 下では の製造 に特に関連する事項を説明する。

０112 明の を用 て、 を ア ノ または カ ボン酸 で する際、非 ア ノ としては、 なる ア ノ酸でも原理的には 可能である。また、 ア ノ だけでな 、 明の により

カ ボン や カ ボン酸を に さ て、これらの ボン 酸が所望の 位に導入された ポ を合成することも可能である。

０113 タン ク 成の 体的な方法は、基本的には、M akam H・ Ko o k s D・ an d ga H 2００3) UsngaSo d phase boz me a noac a onS s em o ep og a m hegene cCode・ Che Bo ０(11) ０77 84・に記載したのと同様に行 ことが できるが、 の 可能である。 般的には、以下の 従 て行 ことがで きる。

０114 、細胞質の 出物を用 て 白質を合成する系である を 用 るのが好適である。 そのものを用 な ので、より人工的な 作が可能であ る。このよ な系は一般的には、 ボソ ムタン ク 、 ボソ ム 、ア ノ 、 G P P、 および伸長 子、ならびに翻訳に必要なその他の因子 を含み、 率のものとしては、大腸 出液・ 出液が知られて る。こ れらは、 用 て連続的に ネ ギ を供給することで、数百 9 ら数mg m の 白質を生産する。 伝子 らの 併 て行 ための ポ メ ス を含む系もある。大 来の としては ッ ・ダイアグノスティッ 社の S ( )やPG社のP S S ( )等があり、小麦 出液 を用 た系としては ジ ン社のもの等が使用できる。

０115 ある は、ア ノ された 、 を細胞 入することにより、 ア ノ 細胞 でも行 ことができる。 えば、ア カツ ガ 胞や 乳類 、 イク インジ ク ョンある はトランス ク ョンにより、 明の 法によりア ノ された 当な 、 を導入することによ り、細胞 で非 ア ノ酸を含む 白質を発現できる。

０116 としては、 に存在する天然の Sとは 関係にあるもの を使用する。 然のA Sとは 関係にあるものとは、すなわち、 に存在する天然のA Sによ てはア ノ されることはな が、 ボソ ムでは 効率よ 変異 位の を 、 ョンして、所望の ア ノ ボン酸 を発現さ るよ な 、 である。このよ な として、例えば、異 なる種に由来する天然のアン サプ 、 を使用することができる。ある は、このよ な として人工的に構築した を使用することができる。 工 的に構築した の 例として、o (o hogona RNA ナ ) 。

が挙げられる。これは大腸 アン サプ 、 に由来し、G73 cuA

導入された人工 であり、 所に人工的な改変を施すことで大腸 Sによ て認識されな ため、大腸 の でもア ノ されな である。ある は、天然 来の 子として、細胞 とは異なる (ヒト など)に由来するアン サプ をこの 的で使用することができる。 ０117 明の に対して となる は自在に選択できるため、使用する タン ク 成系に最適な プ を自由に選択することができる。これ は、現存のA Sタン ク 素に比 て、大きな利点である。A Sタン ク

に対する 識が厳格であることが多 、 素が認識する構造を有する し ることができな 。 方、本 明のA S は、す ての を とすることができる。 明の は の 通配列を認識し、アンチ は認識しな 。したが て、所望の に対応するアンチ ン プ 分のみ を変えて、他の構 共通であるよ 人工 を 用することもできる。

０118 適な プ は、 白質 に応じてスク ングする。スク ングは、以下の 法で行 ことができる。まず、使用する 白質 に内在する Sタン ク 素でア ノ されな をスク ングする。もし が内在 の 白質 素でア ノ されると、 ア ノ カ ボン酸を導入した 所に他のア ノ酸が導入されてしま らである。また加えた は、使用する 白質 ソ ムに効率よ 取り込まれる必要が ある。このスク ングには、 明の で した を用 ること ができる。先にも述 た通り、 明の の の3 通配列のみを認識するよ に設定してある。 て 明の を用 て をア ノ 、これをスク ング 料として ることが可能で ある。

０119 ア ノ カ ボン酸が所望の 位に導入された を製 造する場合、 位を 上で指定する必要がある。そのためには、天然ア ノ酸を ド ドン 外に、 ア ノ カ ボン酸を ド

が必要である。 方、その に相補 なアンチ を持ち、所望の ア ノ カ ボン酸を担 した 当な プ を上述のよ に作 成する。これらを翻訳 加すると、 ボソ ムにお て 上の がアン チ を持 た によ て認識され、その 果、非 ア ノ ボン酸が伸長 鎖に取り込まれる。

０12０ ア ノ カ ボン酸を ドするには、従来の にお てア ノ酸を ドして な を割り当てる、 まり、遺伝 号とア ノ酸の を指定する を拡張すると 法がある。 えば、終始 に対応するアン チ を用 るアン サプ 、 、4 基 らなるアンチ ドン、人工 基の 入の ずれ を用 ることができる。また、4 よりも多 数の塩基 らなる ドン( えば5 ドンで ア ノ酸を ドすることも可能である。 ０121 の 張の として、 5 位のア ノ酸が ア ノ酸で 換された ポ の 、 5 位に の 有する と、 ア ノ酸でア ノ された相補 なアンチ を有する 、 とを翻訳 に加える ことにより ことができる。 えば、変異 としてアン ドン( G)を用 る 場合、相補 なアンチ を有する 、 。

は を用 ること

CUA

。

ができ、ある は、変異 が4 ドン(GGG )である場合、 を用

ACCC

る。 は、 5 目の 置に変異 を有するよ に設計された

らの によ て作成できる。ある は、 を作成して ら に加える わ りに、ア ノ された 、 のアンチ に相補 な を有 する を ドする を、転写 組合わ た系に添加して変異 ポ を合成することもできる。

０122 工的に拡張された は任意に決定することができ、 明の を用 れば なアンチ を持 に任意の ア ノ

ボン酸を担 さ ることができる。その 果、一 の 伝子 ら、使用する の 類に応じて、選択的に変異を起こした多種類の を合成することも 可能である。

０123 述した発明の 容を 下の によ てさらに詳し 説明するが、これは例示 であり 明の はこれに限定されな 。 細書及び 求の 囲の 基 き の 更、修飾が当業者には可能であり、これらの 更、修飾も 明に 含まれる。 ０124 この 、 子の 合成を記載する。

０125 この 態では、 子を合成した。 の 位を基 子の 鎖 ら脱離 に変換することで、す てのア ノ酸もし は による が可能 となるよ を設計した( 6)。 には芳香 を用 、 ステ 、 ステ で活性化(CB p cho o benz hoes e )、もし は芳香 に電子 の を持 たもの(DBE 35 dn 。b。n 。 。「)を使用して活性 した。

に持 に ては、従来通り アノメチ ステ (CM C anomeh es e )で活性 した。

０126 CBTをも の 成を 下に示す。まず、 ビス(2 3 ジ

) ス ィン ク ド( 27 、 ・ 5 o) ア ノ酸の oc ( 6 o) ト チ ア ン( 5 、 ・ 5 o)を ク メタン(3 )に加えた。この 合物に 4 ク ベンジ メ カプタン( 、 ・ 6 o)を添加し、反応 合物を 2 した。 3 の ク メタンを追加し、3 の N 酸水溶液で3 、 ・ 5N ナト ウム 溶液で 、4 酸水素ナト ウム 溶液で 、飽 和食塩水で した後、 グネ ウムで有機層の中の水を除 た。

グネ ウムを により除き 減圧 したのち、4N チ (2 ) を加え室温で2 した。 、 減圧 、ジ テ (3 )を加え した。この 作を2 繰り返した後、ジ テ (3 )を加 え 過または遠心 離により回収した。

０127 DBEをも の 成を 下に示す。まず3 5 ト ベンジ ク ド( 8 、 ・ 5 o) ア ノ酸の oc ( 6 o) ト チ ア ン(75 、O・ o 1)を メチ ホ ムア ド( 2 )に加えた。 2 さ た後、ジ

テ (8 )を加え、3 の N 酸水溶液で3 、4 酸水素ナト ウム 溶液で2 、飽和食塩水で した後、 グネ ウムで有機層の中の水を 除 た。 グネ ウムを により除き 減圧 したのち、4N

チ (2 )を加え室温で2 した。 、 減圧 、ジ テ (3 )を加え した。この 作を2 繰り返した後、ジ

テ (3 )を加え 過または遠心 離により回収した。 ０128 CMEをも 、記載の 法によ て合成した(S a 、J・ C e Soc 2 5 ～ 56 998)。ただし 、上記の 法と同様に行 た。

０129 アス ラギン 、グ タ ン 、 スチン、ア ギ ン、ト プト ァン、グ タ ンは 護を、下記の 法により行 た。 ステ の 、残 ト オ メチ ス イド (2 )を加え室温で3 した。 、 減圧 、 2 、4N チ (2 )を加え した。さらに3 、 テ (3 )を加え した。 テ (3 )を加え 過または遠心 離により回収した。

０13０ 6に例示された の の 味は次の通りである。 (E N ace s ne) b (6 N bo n ( ) H d ox b anoc acd) C ( C ne) ( N Bo n sne) (P odo Phen aanne) ( N meh e cne) a ( Aanne) (D e cne) (( ) 3 phen ac cacd) ( H d ox e cne) 2

０131 この 、ス キ および 子の 築を記載する( 7)

この 態の 示では、ス キ または2の 基配列に相当する 。

合成DNA(e xR45またはdn xR46)に対し、P3 ライ Taqポ メラ ゼで伸 長し( サイク 件下は95 Cで2 、5 Cで 、および72 Cで )、続 て相当する5および3プライ (P4およびe xR またはP4およびdn xR )を用 て増幅し( サイク 件下は95 Cで 、5 Cで 、および72 Cで ) 、その2 DNAを 型として 験管内で転写 (37 C、 )、 PAGE

A

製を経てス キ を提供した。 子に ても同様に、 。

に相当する合成DNA( RNAasnc a76)を5および3プライ ( RNAasnc a46 cuA

よびRNAasnc a2０)を用 て増幅し、同様の 程を経て目的の を提供した。 ス キ イム

e xR45 5 ACCTAACGCTAATCCCCTTTCGGGGCCGCGGAAATCTTTC GATCC 3 ( 3) P3 5 GTAATACGACTCACTATAGGATCGAAAGATTTCCGC 3 ( 4)

P4 GCATATGTAATACGACTCACTATAG 3 ( 5)

e xR g 5 TACCTAACGCTAATCCCCT 3 ( 6)

ス キ イム2

dn xR46 ACCTAACGCCATGTACCCTTTCGGGGATGCGGAAATCTTT CGATC C 3 ( 7)

P3 GTAATACGACTCACTATAGGATCGAAAGATTTCCGC 3

P4 5 GCATATGTAATACGACTCACTATAG 3

dn xR g 5 ACCTAACGCCATGTACCCT 3 ( 8)

。

cuA

RNAasnc a76 5 TGGTGCCTCTGACTGGACTCGAACCAGTGACATAC G

GATTTAGAGTCCGCCGTTCTACCGACTGAACTACAGAGGC

9)

RNAasnc a46 5 ACGCATATGTAATACGACTCACTATAGCCTCTGTAGT TCAGTCGGT 3 ( 2 )

RNAasn ca2０ 5 TGGTGCCTCTGACTGGACTC 3 ( 2 )

3

０132 この 、実施 2で構築したス キ および を用 て、実施 で合成した ドナ と反応さ る例を示す。

０133 5 の スケ で反応をさ た場合を例にと て記述するが、このスケ は任意に変えることができる。 1０～4０ の 度でRNAを し込んだ (０2MHEP・Kp ・5 ０・2 )25 を 95 Cに3 間加熱し、それを 5 間放置することで、 RNAの3 造を形成さ た。それに3Mの 度の MgC

2を 続 てス キ を5０～2００ の 度で し込 んだ水溶液を０・5 えた。これに1０～5０mMの Xの ドナ を加え、反応を 開始した。この 件での 素の 、０・5～2 の RNA、０・5～2 のス キ イム、2～ Mの ドナ 、０・6MのMgC を含むpH7 ・5、０・ Mの になる。これを Cで ～24 間、反応さ た。 応の 、 1・5 量の０・6MNaOAcを えた後、 タノ 、沈澱を7 タノ で した。 を翻訳などに用 る場合は、この 殿を水に溶 し、 に加えた。

4

０134 この 態では、ス キ イム 、2の 本的な活性の 価を行 た(

8 9)

０135 まず、 キ ス キ イム2を 較した( 8)。また、生成 で あるア ノ RNAは、一般に生成 オチン スト プトアビジン ポ アク ア ドゲ (PAGE) で確認する。まず、生成 ０・4MHEPE H8・０ 7mg m ク ン D オチンの (００ m )に し、 Cで さ ア ノ酸を結合したRNAを選択的に オチン した。これに 量の０・6MNa を加えた後、 タノ 行 、さらに沈澱を7 タノ で3 した。 収した生成 1・5 のスト プトアビジン ディング (０2mg S ep avdn 4０mMppe aznepH6 4０mMEDTA 6

)に し、 2 PAGEで電気 、スト プトアビジンゲ ト法により、 度が遅 ンドとして検出した。RNAの 、 be G een (CAMBREX)を 用 、検出には A ００( )を用 た。

０136 また、ビオチン の 率の 2 ア ノ基を有するア ノ 、ビオチン 件下で 加水分解が進行しやす ア ノ 、また オチン できな 乳酸に関しては、 RNA の わりに イク ックスRNAを使用し、 ， PAGEを用 て 生成 を直 接観測した。また、あら じめ オチンを導入してあるHB DBE( N オチン 3 キ 6 N Bo n (s) h d ox b anoc acd)に関しては、ビオチン 程なしで、スト プトアビジンゲ ト PAGEで解析した。

０137 8 9にお て、 (1)がア ノ スト プトアビジ の 合体、 (11)が

( 1)が イム、の ンドを示す。ア ノ の (Yed)は ンド 度 の (1) ( ) ( 1) ら計算した。

０138 ス キ イム2は、 キ に比 て e DBEに対する活性が大 幅に向上した( 8、 ン3と6)。また逆に、ス キ イム2は、Phe CME に対しての 性を低下さ て た( ン と4)。これらの 、ス キ イム2が、 ト ベンジ ステ を持 に対して最適 されたことを示す。 また、3 端が されたRNA( RNA 3( X))を使用することで活性が消失すること ら、これらの 化は3 に進行して ることが分 る( ン7、 、 2)

０139 次に、 キ ス キ イム 、2を 較した( 9)。

上記 同様である。ス キ は、 キ 比較して、Phe CM Eに対する活性を向上さ て た( ン 、3)。また、ス キ は、 ト ベンジ ステ を持 に対して活性を向上さ て たが、ス キ イム2に比 て、その 低 た( ン5と8)。ただ、ス キ イム2が ステ 合を持 ものを と出来な のに対して、ス キ は、これを と出来ることが分 た( ン7、 )。これは 分 岐 ア ノ酸に対して ト ベンジ ステ を持 、弱 し 持たな ( ン6、9)ことを考えると、ス キ イム2の 点を補 用な特徴で ある。

5

０14０ この 態では、実施 4に示すス キ イム 、2の 価を2 類の ア ノ 、9 類の ア ノ酸及び 対して行 た( 下の )

０14

０142 ア ノ の bs a es 、Tme 間、Yed

、実施 3 同様である。ただしア ノ酸によ て反応 率が異なると予 想されること ら、 度を mM ら5又は０mMに増加させた。また、反応 間 に ては (Tme)を参照された 。 スチンに ては、その ィ 合 ， をDTTで して ステインに変換した後に反応を行 た。 ン f が PAGE で、 ン57 69が ， PAGE(acdPAGE)である。 ， PAGEは実施 4 同様に 〒 、また 性酸， PAGEは イク ックス(大 来の 変型アン サプ 。

をさらに 素化した構造を有する )をRNAの わりに用 て、ア による分子 の 、プラス 荷の 加によ て トした生成 ンドを 検出 た。

０143 にお て、 (1)がア ノ スト プトアビジ の 合体、 (11)が

A ( 1)が イム、 ( )がア ノ イク ツクス、 ( )が イク ックス、の ンドを示す。

まず、 に持たな ア ノ酸の ト ベンジ ステ ( の 5 bs a es の欄ではア ノ DBE)に てス キ イム2の 性を 評価した。ス キ イム2 では、す てのア ノ酸にお て、ア されたRNAが合成できて ることが分 る( ン1 2 25 35 47)。また、ス キ イム 存在 では、全 RNAは されておらず( ン13 24 3 6 46 48)、この 応がス キ イム2によ て触媒されたものであることが わ る。ただし、そのア ノ の 一様ではな 。この ちMeは特異 ビ オチン の 程で ア ノ基の求 が弱 ため オチン できな 、またAspは 基が加水分解を促進するため け ア ノ の 率が下 が てしま たと考えられる。これを検証するため、 RNAの わりに イク ック を用 て ， PAGE(aPAGE)を行 た。 イク ック は RNAに比 て極めて小 さ 、ア ノ による分子 の 、電荷の による影響が相対的に大き な る。 M e Aspともに が5０ 上 行しており、効率のよ ア ノ 化が確認できた( ン75 77、 のaPAGE)。また他のア ノ酸に ても、その 動度は の きさと電荷を反映して しており、それぞれの によ て イク ック が されて ることが分 る。さらに、その の RNA に比 て 1・5 1・8倍である。これはRNAの の 、T NAポ メラ ゼによる余 分な 基の 加が、 イク ック では RNAに比 て少な ためであると考えら れる。 4０ RNAにお て、その3 端に余分な 基が付加して ることが 分 て る。さらに、比較的効率が低 た ア ノ (Va Ue Th)とG Hs BA に てス キ による反応で ステ (CBT)を試し た。す てのア ノ酸にお て収率の 上が見られた( ン57 62、 ン81、 ではア ノ CBT)。さらには を加えな たものでは、反応が進行し て な こと ら、これらはス キ イム1によ て触媒された反応であるこ とがわ る。さらに を持 ものに て、反応を行 た。 前の報告で はp位に置換 をも Phe 導体を報告して たが( ン49 5０ 52、 ではア ノ CME)、その後の研究でTp( ン51)のよ な を持 ア ノ 酸が となることが分 て る。さらには、 ア ノ基の代わりに水酸基を持 (HPh (s) 3 phen ac c acd)も となることが分 ており( ン8０) 、 ボ の 広 基質 の 用性が示されて る。

6

０145 この 、実施 3 5で調整した プ ア ノ RNAを

験管内 白質 成系であるRocheのRT ００に加え、 白質 成を行 た( 2 3)

０146 、G P(G eenF o escen Po e 白質)を デ 白質 として使用した以前の報告とほぼ同様である(M akam H・ Ko o k s D・ and g a H 2００3) USngaSO d phaSe bOZ me a nOaC a OnS S em O ep Og am h egene cCode・ Che Bo・ (11) ０77 84) G Pは 光で簡便に 白質の 成を検出できる。

０147 "ラベ したMe で合成した 白質を D PAGEで解析した。 プ ョ ン ( pp essone cenc ( ) 、完全長の 白質㈲の ンド 不完全長の ン ド(叫の強度を、それに含まれるMeの数で補正して、以下の より算出した。 (な お、 ンド( ) の 完全長 白質の ンドである。

、 ョン 率 ( ( ( )x3 5

０148 2 3にお て、W 、C ( ン2)は "。

、C2( ン3 CUA

)は "。

の

CUA みの 応の 果である。 ン4 24は天然ア ノ酸を担 した 。

、 ン25 33は修飾 ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 CUA

酸を担 した "。

の 応である。C3( ン35)は "。

CUA ACCC

。

C4( ン36)は A ACCのみの 応の 果である

C 。 ン37 38は

。

アラ ン(Phe)又は (HPh)を した の 応で

ACCC

ある。

０149 まず、 151位のT「の ドン(UAC)を終止 ドン(TAG)に置き換えたG Pの 伝子を 反応系に加えることで、反応系中でT NAポ メラ ゼにより RNAが合成される。 RNAを加えなければTAG が終止 として働き151位で 終結するため 、完全長の 白質は合成されな ( 2、 ン2)。また、ア されて な vR NAを加えても同様に完全長の 白質が合成されて な こと ら( ン3)、使用し た 、 RNAは、系中のA Sの にならな ことが分 る。これに対し、 e でア ノ プ ッサ RNAを加えたものでは、完全長のG Pの ンド が見られ、 151位に特異 e が導入された 白質が合成できて ることが分 る( ン 、8)。さらに他の天 ア ノ酸に ても、同様に導入が確認でき、その プ ッ ョン ア ノ の 率と相関があ た。ただしG に てはア ノ が確認されて るにも関わらず、今回は導入が確認できな た( 4) そこで、ス キ イム2の わりに、ス キ イム1を用 てG でア ノ されたRNAを調整して系中に加えたが、その 確認できな た( ン24) RNAの3 端を したものではア ノ が進行して な こと ら、ア ノ 化は3 端に特異 に確認できること ら、これは の 題であり の 題ではな と考えられる。この点に ては現在 査中であ り、今後その 因を明ら にした と考えて る。

さらに ア ノ酸の導入を試みた。 Phは以前の研究で同じものを 量分析 置で解析し、その 入を直接的に確認して る( 3、 ン31) C 、 A は、効 率よ 入が確認できた( ン25 26)。これに対して、ビオチンを に持 ア ノ酸はその 率が減少して た( ン27)。ア ノ の 3０ C やA 変わらな こと ら、この 、 ョン 率の 、ビオチンが大き た めに、 ボソ ムに効率よ 受け入れられな たためと考えられる。また、 e D e、 BAの 入を試みたが、その 検出 下だ た( ン28 3０) 3 なア ノ 化は、その したRNAがア ノ されな こと ら 認でき て る。 前の報告では、 メチ ア ノ 、D体のア ノ 、 ア ノ酸の導 入が報告されて るが、少な とも今回の系ではこれらのア ノ酸は、 ボソ ムに効 率よ 取り込まれて な ことが分 た。さらに (HB)に ても導入を試みた 。 オチンを付けたものでは上記 同じ理由でその 確認できな た( ン33)。これに対し (Hph)に ては、効率の 入が確認でき た( 32 。ただし、完全長の 白質よりも 動度の 位置に ドが見られた 。これは、 ステ 合 の他の側 の 撃などにより があ たためと考え られる。そこで以前の研究で用意した、 178位に4 ドン(GGGT)を持 伝子を 用 て、 178位に (Hph)を導入した。この 置では、完全長の 白質の みが生成した( ン38)。 て上記の 動度の ンドは 何ら の 体的要 因により151位に特異 に生成するものであることがわ る。 ずれにしても、乳酸は でも ソ ム の り込みが高 基 であ た。

Claims

求の

下の

P Zzzz ) ) ( 2 3 3

N) P2 ( 2

N) 2

N) (N)YYY N) N)NGG

1 2 3 4 1 2 P 2 q 1 2 3 1 2 N P P2はステム・ プ 造を持ち 意の 列 らなる 域を表し、 ( )～( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ

2

を表し、 は3又は4を表し、 ( )～ 2

( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの

3 3 ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は5又は6を表し、 ( )～( )はそれ ぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、Z～Zはそれぞれ 立にC又はGを表し、 ～ 3はそれぞれ 立にC又はGを表し、 は もし はGに 相補 な ノ ク オ を表し、 は ク オ 、Cは ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表す。

で表される 列 らなる構造を有する、 の を する であ て、

ボ の3 端のGG チ で を認識して結合し、 GG チ は に結合する の3 端の75～73 目の 基配列 相補 で ある、前記 イム。

2 下の

P CCGCN

P P2はステム・ プ 造を持ち 意の 列 らなる 域を表し、 ( )～( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ

2

を表し、 は3又は4を表し、 ( )～ 2

( )はそれぞれ 立に 、C、 Gの

3 3 ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は5又は6を表し、 ( )～( )はそれ ぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 は ク オ 、Cは ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表し、互は もし はGに相補 な ノ ク オ を表す。

で表される 列 らなる構造を有する、 の を する であ て、 の3 端のGG チ で を認識して結合し、 GG チ は に結合する の3 端の75～73 目の 基配列 相補 で ある、前記 イム。

3 下の ㈲又は(11)

P G GG P2 G G G GG ( )

P G P2 GG G GG ( )

㈲ (11)にお て、P P2はステム・ プ 造を持ち 意の 列 らなる 域を表し、 は ク オ 、Cは、 ト ン ク オ 、 は ク オ 、Gは ク オ を表し、互は もし はGに相補 な ノ ク オ を表す

で表される 列 らなる構造を有する、 の を する であ て、

ボ の3 端のGG チ で を認識して結合し、 GG チ は に結合する の3 端の75～73 目の 基配列 相補 で ある、前記 イム。

4 P P2が、それぞれ 立して以下の

・ ・ Q 3

R 5 は 、C、 又はG ら選択される ク オ らなる 基数 ～8の 意の プ を表し、 ～Q はそれぞれ 立に 、C、 Gの ずれ の 意の ノ ク オ を表し、 ～ はQ ～Q 完全もし は一部

を形成することにより優先的に2 をとり に選択される 、C、 Gの ずれ の ノ ク オ を表し、 は ～ の 数を表す。

表される 列 らなる、請求 ～3の ずれ に記載の イム。

5 で表される プ 1 が安定テトラ プである、請求 4に記載の P が GG CG G

P2が CCCG A GGG

で表される 列 らなる、請求 ～5の ずれ に記載の イム。

下の(a)～(d)の ずれ の 列 らなる、 の 化を触 する

(c) (a)にお て、 3 端の が、ア される における73 目の 基に相補 になるよ にデザインされた任意の 基に置換された

にお て、 3 端の が、ア される における73 目の 基に相補 になるよ にデザインされた任意の 基に置換された 。

ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 による の を する である、請求 ～7の ずれ に記載の イム。

の を する であ て、

(a) を認識して結合する

(b) 部分にお て された ステ 合を有し、

を有する ドナ を認識して結合する ドナ 位、

(c) ドナ 質 ら の3 端 の 応を する活性 を有する 位、を含み、

の3 端のGG チ らなり、 GG チ は に結合する の3 端の アクセプタ ステム 分の7 5～73 目の 基配列 相補 であり、これにより、 ボ が の3 端の アクセプタ ステム 分と 成により結合し、ア ドナ 位に結合した ドナ 質 ら の3 端 の 応 が速や に起こり、

の73 目の 基と を形成する イム上の塩 は、 もし はG に相補 な 基であるが、 の 類によ て相補 になるよ に変異をすること が可能であり、これにより、 ボ は任意の を することができること を特徴とする、前記 イム。

０ を有する ドナ 下の

2

3

A「 S A「 、R は のある官能 を表し、R2は にあたる 造を表し R3は脱離 に相当し、電子 を有するア ( )を有する

ステ 又は オベンジ ステ を表す

で表される構造を有し、 ボ の ドナ 、

である の 分を認識し、これにより、 ボ は、任意の を有するカ ボン酸を ドナ として を することができることを特徴とす る、請求 9に記載の イム。

を有する ドナ 、ア

を持 ア ノ酸の ステ 導体、ア を持 ア ノ酸の ステ 導体、ア を持 ステ 導体 ら選択される、請求 9又は に記載の イム。

2 下の(a)～(d)の ずれ を分子中に含む ク オ

(a) ～皿の ずれ に記載の を構成する

(b) (a)の に相補 な配列 らなる

(c) (a)の にお て が に置換されて る配列 らなる

(d) (b)の にお て が に置換されて る配列 らなる 3 (a) ～皿の ずれ に記載の 上の を提供する工程

(b) を提供する工程

(c) されたカ ボン酸を提供する工程

(d) 、前記 されたカ ボン とを接触さ て、 を する工程、

(e) された を単離する工程

を含む、ア されたR の 。

4 カ ボン酸が、天然ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 である、請求 3に記載の 。

5 されたカ ボン酸が、ア ノ酸の ステ 導体、ア ノ酸の ステ 導体、又はカ ボン酸の ステ 導体である、請求 3に記載の 。6 された ボン酸が、以下 ら選択される、請求 3に記載の

を持 ア ノ ア ノ酸の アノメチ ステ 、 天然ア ノ ア ノ酸の3 5 ト ベンジ ステ 、

天然ア ノ ア ノ酸の4 ク ベンジ チオ ステ

アノメチ ステ 、

ア キ 3 5 ト ベンジ ステ 。

7 が に固定 されて る、請求 3～ 6の ずれ に記載の 。8 ～ の ずれ に記載の を構成する の3 端に 上 の ン を付加した配列 らなる、固定 イム。

9 下の(a) ら(c)の ずれ の 程を含む、請求 ～皿の ずれ に記載の に対する となるア ノ酸の ステ 導体の

(a)ア ノ基を oc 護したア ノ酸を、ベンジ 位に ゲ を持ち に電子 を持 物と反応して ステ を形成さ 、その 、酸を用 てBoc 護基を 除

(b)ア ノ基をBoc 護したア ノ酸を、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 合物と、一般的な 合剤を用 て 合さ て ステ を形成さ 、そ の 、酸を用 てBoc 護基を除 程、又は (c)ア ノ基をBoc 護したア ノ酸を活性 したものを、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 物と混合することにより ステ を形成さ 、その 、酸を用 てB。。 護基を除 程

であ て、これにより、ア ノ酸の ステ 導体の による 位となることを特徴とする、前記 。

2０ 下の(a)又は(b)の 程を含む、請求 ～皿の ずれ に記載の に 対する となる、ア ノ酸の ステ 導体の

(a)ア ノ基をBoc 護したア ノ酸を、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子

を持 物と、一般的な 合剤を用 て 合さ て ステ を形成さ 、そ の 、酸を用 てBoc 護基を除 程、又は

(b)ア ノ基をBoc 護したア ノ酸を活性 したものを、ベンジ 位にチオ 基を 持 物と混合することにより ステ を形成さ 、その 、酸を用 てBoc 護 基を除 程

であ て、これにより、ア ノ酸の ステ 導体の による 位となることを特徴とする、前記 。

2 下の(a) ら(c)の ずれ の 程を含む、請求 ～皿の ずれ に記載の に対する となるカ ボン酸の ステ 導体の

( )カ ボン と ジ 位に ゲ を持ち に電子 を持 物と 反応して ステ を形成さ る工程

(b)カ ボン と ジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 合物と、 一般的な 合剤を用 て 合さ て ステ を形成さ る工程、又は

(c)カ ボン酸を活性 したものを、ベンジ 位に水酸基を持ち に電子 を持 物と混合することにより ステ を形成さ る工程

であ て、これにより、カ ボン酸の ステ 導体の による 、 位となることを特徴とする、前記 。

22 (a)それぞれ以下の( )又は(2)の 列 らなる、 の 化を触 す る2 の を提供する工程 (b) を提供する工程

(c) ア ノ 、 ア ノ ステ 導体 ステ 導体を提供する工程

(d) 、前記 ア ノ 、 ア ノ

ステ 導体 ステ 導体とを接触さ て、 を す る工程、

(e) された を単離する工程

を含む、ア された の 。

23 2 の がそれぞれ に固定 されて る、請求 22に記載の 。24 の を する を に固定 するために 能な 意の ク オ を 子の3 端に付加さ た、以下の( )又は( 2 )の 基配列の ク オ を含む らなる

( )GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU (3 端のNは付加さ た任意の ク オ )

(2 )GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGG UN

(3 端のNは付加さ た任意の ク オ )

25 を3 端に付加さ た 24に記載の であ て、以 下の( )又は(2 )の 基配列の ク オ を含む らなる ( )GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU (3 端のAは付加さ た ン)

(2 )GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGG UA

(3 端のAは付加さ た ン) 26 (a) 24の( N)又は請求 25の( A)で示される 基配列の ク オ を含む 、 24の(2 N)又は請求 25の(2 A)で示される 基配 列の ク オ を含む らなる2 の を提供し、それらを に固定 する工程

(b) を提供する工程

(c) ア ノ 、 ア ノ ステ 導体 ステ 導体を合成する工程

(d) に固定 された 、前記 ア ノ 、 ア ノ ステ 導体とを接触さ て、 を

、

(e) を単離する工程

を含む、ア された の 。

27 ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 された 子を得るために 使用できるキットであ て

(a) ～皿の ずれ に記載の 上の イム

(b) の となる、天然ア ノ 、 ア ノ 、又は乳 ステ 導体 ステ 導体

(c)

を含む、前記キット。

28 が に固定 されて る、請求 27に記載のキット。

29 意の ア ノ またはその他のカ ボン酸が所望の 位に導入された

を製造する方法であ て、

(a) ～皿の ずれ に記載の 上の を提供する工程 (b) を用 て を ア ノ または ボン酸で す る工程

(c) のアンチ に対応する を所望の 位に有する を提 供する工程

(d) 記の された および を翻訳 に加えて、 ア またはカ ボン酸が所望の 位に導入された を製造する工程 を含む、前記 。

3０ カ ボン酸が である、請求 29に記載の 。

3 が終始 に対応するアンチ ドン、4 基 らなるアンチ ドン、人工 基 を含むアンチ ドン、又は天然ア ノ酸を ド に対するアンチ を有す る、請求 29又は3 に記載の 。

32 (dにお て、 に加える前に、ア された を ら分 離する工程をさらに含む、請求 29～3 の ずれ に記載の 。

33 が に固定 されて る、請求 29～32の ずれ に記載の 。