WO2007064038A1 - Lmp2を用いた子宮平滑筋肉腫の検出 - Google Patents

Lmp2を用いた子宮平滑筋肉腫の検出 Download PDF

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WO2007064038A1
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uterine
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leiomyosarcoma
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PCT/JP2006/324403
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Takuma Hayashi
Yukihiro Kobayashi
Kenji Sano
Akiko Horiuchi
Ikuo Konishi
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Shinshu University
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4739—Cyclin; Prad 1

Definitions

  • the present invention detects eclamptic leiomyosarcoma using LMP2 and cyclin E, and mutations in JAK1 kinase gene, STAT1 gene and LMP2 promoter involved in interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) signal transduction cascade as markers.
  • Uterine cancer is the most common gynecological cancer, but uterine leiomyosarcoma is less common and accounts for 2-5% of ectopic cancer.
  • Uterine leiomyosarcoma occurs more frequently in the muscular layer of the uterine body than in the child or cervix.
  • the myometrium is made of smooth muscle.
  • the benign tumor formed in the eclampsia layer is uterine leiomyoma, and the malignant tumor is uterine leiomyosarcoma. It was very difficult to distinguish between uterine leiomyoma and uterine leiomyosarcoma, and it was usually judged by a surgical examination of the tissue taken under a microscope and cell examination under a microscope.
  • Uterine leiomyosarcoma is often atypical and has a large proliferation of tumor cells that may become huge. However, there may be few cell atypia and the presence or absence of cell atypia is not a definitive differentiation criterion.
  • the distinction between uterine leiomyoma and uterine leiomyosarcoma is based solely on whether there is coagulative necrosis and whether the force V and cell division are increased. In principle, if the cell density is high, there are 10 or more cell divisions in the 10-fold high field of view, or if the tumor cells are atypical, there are 5 or more in the 10-fold high field of view. Diagnosed as uterine leiomyosarcoma.
  • LMP2 low molecular mass polypeptide 2
  • Non-Patent Document 1 Van Kaer L. et al. (1994) Immunity, 1, 533-541
  • Non-Patent Document 2 Hayashi T. et al. (2002) Cancer Res., 62, 24-27 Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting the presence of uterine leiomyosarcoma using the degree of transcription or expression of LMP2 in uterine smooth muscle tissue as an indicator, and a detection reagent therefor.
  • the present inventor tried to stain a mouse living body with anti-epileptic MP2.
  • the expression of LMP 2 specific to myogenic tissues such as smooth muscle, striated muscle, and myocardium was observed, indicating the origin of tumor cells observed in the eclampsia smooth muscle layer of LMP 2-deficient mice. It was newly found to be a myogenic cell (smooth muscle cell).
  • the present inventor examined the expression state of LMP2 in a biopsy tissue or a surgical tissue of a normal uterine smooth muscle layer, human eclampsia leiomyoma, and human uterine leiomyosarcoma. As a result, it was found that only a significant decrease in the expression of LMP2 was observed in the leiomyosarcoma which was a malignant tumor.
  • the inventor then examined whether the decrease in LMP2 expression was directly involved in transformation (carcinogenesis) in uterine smooth muscle cells.
  • LMP2 was forcibly expressed by gene recombination, and SKN cell morphology, cell growth rate, and changes in fibronectin expression in SKN cells were investigated.
  • the growth rate of morphological cells in SKN cells is normal. It was found that the expression of fibronectin was significantly induced by approaching smooth muscle cells.
  • the present inventor can differentially diagnose uterine leiomyoma and uterine leiomyosarcoma using LMP2 transcriptional expression as an indicator, and can treat eclamptic leiomyosarcoma by LMP2 expression. I found.
  • the present inventors further focused on the relationship between the expression of cyclin E and uterine leiomyosarcoma, and in uterine smooth muscle tissue, the transcription and expression of cyclin E was significantly reduced depending on the malignancy of uterine leiomyosarcoma. It was found to increase.
  • the present inventors examined the relationship between genes involved in the interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) signal transmission system involved in LMP2 expression and eclampsia leiomyosarcoma.
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • the present invention is as follows.
  • [-1] A method for detecting uterine leiomyoma using LMP2 as a marker.
  • a method for distinguishing whether a uterine smooth muscle tumor is a uterine leiomyoma or uterine leiomyosarcoma using the degree of transcription or expression of LMP2 in the uterine smooth muscle tissue as an index comprising:
  • the transcription or expression of LMP2 is measured, and if the transcription or expression of LMP2 is low compared to normal uterine smooth muscle tissue, it is determined to be uterine leiomyosarcoma.
  • [6] The method according to any one of [1] and [4], wherein LMP2 mRNA is extracted from collected eclampsia smooth muscle tissue or cells, and subjected to RT-PCR or Northern blot to measure LMP2 transcription.
  • this method uses myosin as a marker to detect the existence of eclamptic leiomyosarcoma using transcription or expression of LMP2 and myosin as an index, and LMP2 transcription or expression is normal eclampsia
  • the method according to [1] wherein it is determined that uterine leiomyosarcoma is present when the amount of transcription or expression of myosin is small compared to a tissue and compared to normal uterine smooth muscle tissue.
  • [1 0] A method to detect leiomyosarcoma using LMP-2 and cyclin E as markers.
  • [.1 1] A method for detecting the presence of uterine leiomyosarcoma using the degree of transcription or expression of LMP2 and cyclin E in eclampsia smooth muscle tissue as an index, and comprising LMP2 and cyclin in uterine smooth muscle tissue Uterine smooth muscle when E transcription or expression is measured and LMP2 transcription or expression is low compared to normal uterine smooth muscle tissue and cyclin E transcription or expression is high compared to normal uterine smooth muscle tissue A method of determining that a tumor is present.
  • [1 3] A method for determining the malignancy of uterine leiomyosarcoma using the degree of transcription or expression of LMP2 and cyclin E in uterine smooth muscle tissue as an index, and transcription of LMP2 and cyclin E in uterine smooth muscle tissue Or in patients with malignant uterine leiomyosarcoma when LMP2 transcription or expression is low compared to normal uterine smooth muscle tissue and cyclin E transcription or expression is high compared to normal uterine smooth muscle tissue How to determine that there is.
  • a detection reagent for detecting uterine leiomyosarcoma using LMP2 as a marker comprising at least an LMP2 gene fragment as a probe or primer.
  • a detection reagent for detecting leiomyosarcoma of eclampsia using LMP2 and cyclin E as a marker comprising at least an LMP2 gene fragment and a cyclin E gene fragment as a probe or primer.
  • [2 1] The detection reagent according to [1 8] or [20], further comprising a myosin gene fragment as a probe or primer, and detecting eclampsia leiomyosarcoma using LMP2 and myosin as markers.
  • the myosin gene fragment is included as a probe or primer, [19] or [20] detection reagent for detecting eclampsia leiomyosarcoma using LMP2, cyclin E and myosin as markers.
  • Detection reagent for detecting uterine leiomyosarcoma using LMP2 and cyclin E as markers including at least anti-LMP2 antibody and anti-cyclin E antibody.
  • the detection reagent for detecting leiomyosarcoma of eclampsia according to [ ⁇ 2 3] or [2 4], which is a reagent for immunohistochemistry or immune cell staining.
  • a pair of primers that can be used to amplify a DNA fragment is a pair of primer sets used for amplification of a DNA fragment containing a mutation site selected from a partial sequence consisting of 10 to 30 bases present on the 3 ′ side and the 5 ′ side of the mutation site.
  • a uterine leiomyosarcoma detection kit comprising the primer set of [3 1], the oligonucleotide of [28] or [29] or a label thereof, or the immobilized substrate of [30].
  • Fig. 1a is a photograph showing IFN- ⁇ -induced TAP1 and LMP2 expression defects in SKN cells.
  • Cytoplasmic extracts were prepared from HeLa, HeLa. S3, SKN cells and human normal uterine smooth muscle cells (Hu. USMC) treated with 250 u / ml IFN- ⁇ for the time shown in the photo, and 50 g of cytoplasm was prepared. Extracts were separated by 10% SDS-PAGE. The expression levels of TAP1, LMP2 and i3 lactin were examined by imnob mouth analysis using appropriate antibodies.
  • Figure 1b is a photograph showing defects in inducible TAP1 and LMP2 expression in SKN cells. TAP1 in HeLa, HeLa. S3, SKN cells and Hu. USMC cells by RT-PCR.
  • FIG. 1 c is a photograph showing a deficiency of LMP2 expression in uterine leiomyosarcoma, and a photograph showing the results of immunohistochemistry of LMP2 in normal eclampsia and uterine leiomyoma. Sections of tissue samples were stained with anti-LMP2 antibody and peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody.
  • FIG. 2 shows differential activity of IFN- ⁇ -induced TAP1 and LMP2 shared wt and IRF-E mt promoters in HeLa and SKN cells.
  • a diagram of TAP1 and LMP2 shared promoters wt (TAPl 593-l / pGL3 and LMP2 1-593 / pLG3) and the construction of a luciferase reporter gene containing their respective IRF-E mutant promoters are shown.
  • the reporter gene was transferred to HeLa and SKN cells, IFN-y was added 24 hours later, and the cells were incubated 24 hours before recovery. In order to standardize the transfer efficiency of the reporter gene, it was transferred simultaneously with PSMV- / 3 GAL.
  • Results are normalized to luciferase gene expression measured separately for HeLa and SKN cells and expressed as relative TAP1 and LMP2 activity. Results are shown as the average of three independent experiments, error bars represent SE.
  • Figure 3 is a photomicrograph of normal human uterine smooth muscle tissue.
  • Figure 4 is a photomicrograph of human eclampsia and leiomyosarcoma.
  • Figure 5 is a photomicrograph of human eclampsia intimal stromal sarcoma.
  • Fig. 6 shows immunohistochemically stained photographs of normal uterine smooth muscle, eclamptic leiomyoma, and eclampsia leiomyosarcoma. .
  • Fig. 7 is a photograph of immunohistochemical staining of a uterine leiomyosarcoma site and a normal uterine leiomyosarcoma site in the same tissue. Decreased expression of LMP2 is observed at the uterine leiomyosarcoma site.
  • Fig. 8 is a photograph showing changes in SKN cell morphology by forcedly expressing LMP2 by gene recombination in eclamptic leiomyosarcoma cells (SKN) in which LMP2 expression is not observed (Part 1).
  • Fig. 9 is a photograph showing changes in the morphology of SKN cells when LMP2 is forcibly expressed by gene recombination in uterine leiomyosarcoma cells (SKN) in which LMP2 expression is not observed (Part 2).
  • Fig. 10 shows changes in fibronectin expression in SKN cells when LMP2 is forcibly expressed by gene recombination in uterine leiomyosarcoma cells (SKN) in which LMP2 expression is not observed. It is a photograph.
  • Figure 11 shows photographs showing changes in fibronectin expression in normal human uterine smooth muscle cells (HuUSMC).
  • Fig. 12 shows a summary of changes in morphology, cell growth rate, and fibronectin expression in each cell.
  • Fig. 13 is a photograph showing LMP2 expression in mouse skeletal muscle tissue, myocardial tissue and smooth muscle tissue. '
  • Fig. 14 shows the expression of LMP2 in uterine leiomyosarcoma, uterine leiomyosarcoma, and leiomyosarcoma that developed in other organs.
  • FIG. 15 shows the relationship between the INF y signaling pathway and LMP2 expression.
  • FIG. 16 shows mutations in the JAK1 kinase gene, STAT1 gene, and LMP2 promoter derived from eclampsia leiomyosarcoma tissue.
  • FIG. 17 shows mutations in the JAKf kinase gene, STAT1 gene, and LMP2 promoter derived from uterine leiomyosarcoma tissue.
  • FIG. 18 shows the expression status of LMP2 in each tissue.
  • N indicates the number of cases in the tissue examined for LMP2 expression.
  • Figure 19 shows the transfer of pCEM9 vector (without LMP2 gene) or pCEM9-LMP2 vector (with LMP2 gene.) Into human human leiomyosarcoma cultured cells (SKN cells). It is a figure which shows the number of the colonies formed by the proliferation of the SKN cell at the time of taking in each selected vector. 1 / ig pCEM9 and pLMP2 DNA were transfected into 2 ⁇ 10 5 DT or SKN cells and selected in growth medium containing 0.5 or 0.4 mg / ral G418.
  • FIG. 20 is a photograph showing changes in the morphology of SKN cells when LMP2 is forcibly expressed by gene recombination in uterine leiomyosarcoma cells (SKN) in which LMP2 expression is not observed.
  • FIG. 21 shows a summary of morphological changes, cell growth rates, and fibronectin expression in each cell.
  • FIG. 22 is a photograph showing that SKN cells in which LMP2 is constitutively expressed remarkably reduced colony formation, which is an indicator of tumorigenicity.
  • Fig. 2 3 A shows an experiment in which SKN cells constitutively expressing LMP2 were transplanted into nude mice It is a photograph which shows that the tumor formation ability is reduced remarkably by.
  • FIG. 23B is a graph showing that SKN cells in which LMP2 is constitutively expressed have markedly reduced tumor-forming ability in transplantation experiments into nude mice.
  • Figure 2 3 C shows that colony # 121 of human uterine leiomyosarcoma cultured cells (SKN cells) transfected with pCEM9-LMP2 vector (which contains LMP2 gene) shows LMP2 gene compared to SKN cells. It is a photograph which shows that it has expressed remarkably.
  • Figure 24 shows that the expression of cyclin E, which induces cell proliferation, is significantly reduced in SKN cells (colony # 121) in which LMP2 is constitutively expressed as a result of gene expression analysis using a microarray.
  • FIG. 25 shows the structure of the luciferase reporter gene containing the cyclin E promoter.
  • FIG. 26 shows the activity of the cyclin E promoter in SKN cells (colony # 121 and # 122) that constitutively express SKN cells and LMP2.
  • SKN cells colony # 121 and # 122
  • Uterine leiomyosarcoma cultured cells The marked expression of cyclin E observed in SKN cells was markedly reduced by constitutive expression of LMP2.
  • Figure 27 is a tissue staining photograph showing prominent expression of cyclin E in human eclampsia leiomyosarcoma tissue. Cyclin E expression is not observed in normal uterine smooth muscle layers, but cyclin E is markedly expressed in human eclampsia leiomyosarcoma tissue, which is a malignant tumor.
  • Figure 28 is a tissue staining photograph showing the expression of cyclin E in mitotic nuclei in human eclampsia leiomyosarcoma tissue.
  • Cyclin E which induces cell proliferation, is normally overexpressed in the cytoplasm at the G1 phase, the initiation phase of cell proliferation, quickly translocates into the nucleus, and initiates chromosome synthesis in the S phase. Cyclin E is then immediately degraded from the second half of S period. Therefore, cyclin E expression is not observed in the G2 and M phases of normal cells. However, in chick leiomyosarcoma tissue, significant cyclin E expression is observed in the mitotic nucleus. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention detects uterine leiomyosarcoma using LMP2 as a marker.
  • Detection includes determining whether uterine leiomyosarcoma is present, determining whether the patient is suffering from uterine leiomyosarcoma, or whether the uterine leiomyosarcoma tumor is uterine leiomyoma or uterine flat. This includes identifying whether it is leiomyosarcoma, determining the malignancy of uterine leiomyosarcoma, etc.
  • LMP2 is a subunit of the proteasome, and in the method of the present invention, it is detected whether LMP2 is transcriptionally expressed in the eclampsia smooth muscle layer.
  • LMP2 expression is positive (moderate to strong positive) in normal uterine smooth muscle layer and uterine leiomyoma In uterine leiomyosarcoma, LMP2 expression is mostly negative and weakly positive.
  • LMP2 transcriptional expression is strong in uterine leiomyoma, a benign tumor, whereas LMP2 transcriptional expression is markedly attenuated in leiomyosarcoma, a malignant tumor. This indicates that transcriptional expression of LMP2 is an indicator of malignancy for tumors found in uterine smooth muscle cells.
  • the present invention includes a method for detecting uterine leiomyosarcoma using cyclin E as a marker.
  • Cyclin is a protein that plays an important role in the cell cycle that regulates the activity of cyclin-dependent kinases.
  • Cyclin E is one of the G1 cyclins that acts in the G1 phase of mammalian cells. Cyclin E is markedly elevated in uterine leiomyosarcoma tissue compared to normal tissue, but not in eclamptic leiomyoma tissue. In the present invention, as with LMP2, it is detected whether cyclin E is transcribed or expressed in the eclampsia smooth muscle layer. It is possible to differentially diagnose whether or not the patient has eclampsia leiomyosarcoma or whether the tumor of uterine leiomyosarcoma is uterine leiomyoma or uterine leiomyosarcoma using transcriptional expression of cyclin E as an index.
  • cyclin E in benign uterine leiomyomas is not changed compared to normal uterine leiomyosarcoma tissue, whereas the malignant tumor uterine leiomyosarcoma has cyclin E transcriptional expression. Increase. Furthermore, expression of cyclin E is not normally observed in the G2 and M phases of normal cells in the growth phase. However, in the human eclampsia leiomyosarcoma tissue, Significant cyclin E expression is observed. This indicates that transcriptional expression of cyclin E is an indicator of malignancy for tumors found in eclampsia smooth muscle cells. You can also detect LMP2 and cyclin E at the same time.
  • the transcriptional expression of LMP2 is attenuated and the transcriptional expression of cyclin E is increased, it can be determined that the patient has uterine leiomyosarcoma. It is possible to detect uterine leiomyosarcoma more accurately when both LMP-2 and cyclin E are used as indicators than when LMP2 or cyclin E alone is used as an indicator. '
  • uterine leiomyosarcoma it is determined whether or not uterine leiomyosarcoma is affected, differential diagnosis of whether the eclampsia leiomyosarcoma is a uterine leiomyoma or uterine leiomyosarcoma, and uterine leiomyosarcoma cells. This is referred to as detection of uterine leiomyosarcoma including an assessment of the malignancy of the observed tumor.
  • LMP2 or cyclin E transcription can be detected by measuring mRNA encoding LMP2 or cyclin E
  • LMP2 or cyclin E expression can be detected by measuring LMP2 or cyclin E protein .
  • tissue or cells of the uterine smooth muscle layer should be collected as a biological sample, and the mRNA encoding LMP2 and Z or cyclin E contained in the sample should be measured.
  • tissue or cells of the uterine smooth muscle layer should be collected as a biological sample, and the mRNA encoding LMP2 and Z or cyclin E contained in the sample should be measured.
  • mRNA a part of the tissue is collected from the uterine smooth muscle tissue by biopsy, or is collected from the uterine smooth muscle tissue with a cotton swab or the like and used as a material.
  • the tissue can be collected, for example, by inserting a biopsy cannula into the uterine lumen and collecting a piece of uterine tissue about 1 to 2 mm square during normal outpatient examination.
  • mRNA can be measured by extracting mRNA from the collected tissue or cells, or preparing a tissue section sample, or fixing the collected cells on a slide glass and staining by in situ hybridization. You may go there.
  • the extracted mRNA can be obtained by a known method such as Northern blotting or RT-PCR.
  • RNA measuring method What is necessary is just to measure by RNA measuring method. Extraction of mRNA is a known method, for example, Shinsei Chemistry Laboratory 2 Nucleic acid I Isolation and purification Tokyo Chemical Doujin July 10, 1991 Experimental Protocol I Maruzen Co., Ltd. Can be performed as described on June 30, 1997. In situ hybridization can be performed, for example, as described in Molecular Biology Experiment Protocol III Maruzen Co., Ltd., August 30, 1997. In this case, in order to specifically measure mRNA encoding LMP2 and / or cyclin E, a probe or primer consisting of a partial sequence complementary to the partial sequence of mRNA encoding LMP2 and / or cyclin E is used. .
  • the base sequence of LMP2 is known (for example, GenBank accession number U01025, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of LMP2 protein), and probes or primers are designed based on the known base sequence information can do.
  • the base sequence of cyclin E is also known (eg, GenBank accession number M73812, SEQ ID NO: 8).
  • the primer or probe is a fragment of the above LMP2 and Z or cyclin E gene, and the number of bases. 5-50, preferably 10-30, more preferably 15-25
  • tissues or cells of the uterine smooth muscle layer may be collected as a biological sample, and LMP2 and / or cyclin E protein contained in the sample may be measured.
  • the tissue or cells of the uterine smooth muscle layer may be collected as described above.
  • LMP2 and no- or cyclin E protein may be measured by extracting a protein from a tissue or cell and measuring LMP2 and no- or cyclin E protein in the extract, or immunohistochemistry or immune cells. You may carry out by the method of chemistry.
  • a known immunoassay method such as ELISA or radioimmunoassay may be used.
  • anti-LMP2 antibody and Z or anti-cyclin E antibody may be prepared as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody by a known method.
  • Commercially available anti-LMP2 antibodies and anti- or anti-cyclin E antibodies can also be used.
  • the antibody is labeled with an enzyme, a fluorescent substance, or a radioisotope, if necessary, and can be labeled by a known method.
  • Measurement by immunohistochemistry or immunocytochemistry is performed by preparing a collected uterine smooth muscle tissue section sample or fixing the collected cells on a slide glass. For measurement by immunohistochemistry, compare tissues For example, fix it with formalin, embed it in paraffin, and use a thin cutting device such as a microtome.
  • a section sample with a thickness of about 1 to 5 ⁇ um is prepared, and paraffin is removed by treatment with xylene or ethanol at the time of measurement, and it is made hydrophilic by immersing it in physiological saline or buffer.
  • an anti-LMP2 antibody and / or an anti-cyclin antibody labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope, etc. may be used.
  • a secondary antibody that binds to the anti-LMP2 antibody and the ⁇ or anti-cycline ⁇ antibody and labeled with an enzyme, a fluorescent substance, or the like may be used.
  • Enzymes used for labeling include, for example, horse radish peroxidase, alkaline phosphatase and the like, and examples of fluorescent substances include fluorescein and rhodamine.
  • staining may be carried out using a known piotin-avidin complex.
  • the collected cells may be fixed on a slide glass with formalin or the like, and LMP2 and / or cyclin residues in the cells may be visualized by the same method as immunohistochemistry. In immunohistochemistry or immunocytochemistry, staining can be judged with a microscope or the naked eye, or an appropriate optical measuring device may be used.
  • Staining by immunohistochemistry can be performed, for example, as described in the molecular biology experiment protocol II I Maruzen Co., Ltd. published on August 30, 1997.
  • LMP2 transcription or expression is detected in uterine smooth muscle tissue or cells, and LMP2 transcription or expression is lost, decreased, or decreased, uterine leiomyosarcoma Can be determined.
  • transcription or expression of cyclin ⁇ is detected in uterine smooth muscle tissue or cells and cyclin ⁇ ⁇ transcription or expression is increased, it can be determined that the patient is suffering from uterine leiomyosarcoma. it can.
  • transcription or expression of both LMP2 and cyclin ⁇ ⁇ may be detected simultaneously.
  • LMP2 transcription or expression is lost or decreased, and cyclin ⁇ ⁇ transcription or expression is increased, it can be determined that the patient has uterine leiomyosarcoma.
  • LMP2 mRNA or LMP2 protein or cyclin E mRNA or cyclin E protein in a tissue or cell extract, the unit of a normal person who has not previously suffered from uterine leiomyosarcoma Weight tissue or unit Measure LMP2 mRNA or LMP2 protein or cyclin E mRNA or cyclin E protein per cell number.
  • LMP2 than normal value If the mRNA or LMP2 protein is significantly lower, it can be determined that the patient has uterine leiomyosarcoma, and if the cyclin E mRNA or cyclin E protein is significantly higher than the normal value, the patient has uterine leiomyosarcoma. Can be determined.
  • tissue or cell when detecting transcription or expression of LMP2 in a tissue or cell by in situ hybridization, immunohistochemistry, or immunocytochemistry, if the tissue or cell is not stained and LMP2 transcription or expression is not observed, The portion of tissue or cells is uterine leiomyosarcoma tissue or cells, and the patient from whom the tissue or cells were collected can be determined to be afflicted with uterine leiomyosarcoma.
  • tissue or cell cyclin E transcription or expression is detected by in situ hybridization, immunohistochemistry, or immunocytochemistry, the tissue or cells are strongly stained and cyclin E transcription or expression is If strongly recognized, the tissue or cell of the part is uterine leiomyosarcoma tissue or cell, and the patient from whom the tissue or cell is collected can be determined to have uterine leiomyosarcoma. At this time, a stained specimen or a stained cell specimen of normal tissue that is not uterine leiomyosarcoma and uterine leiomyosarcoma tissue may be prepared in advance and compared with the specimen.
  • the detection of LMP2 transcription or expression can also be used to distinguish whether a patient suffering from an eclampsia smooth muscle tumor is malignant or benign, ie, uterine leiomyosarcoma or eclampsia leiomyoma.
  • the tissue in which the transcription or expression of LMP2 is lost or significantly decreased compared to normal tissue can be determined to be malignant leiomyosarcoma.
  • the detection of cyclin E transcription or expression can also be used to differentiate whether a patient suffering from uterine leiomyosarcoma is malignant or benign, ie, uterine leiomyosarcoma or eclampsia leiomyoma.
  • tissue in which the transcription or expression of cyclin E is significantly increased as compared with the normal tissue is malignant uterine leiomyosarcoma.
  • tissue in situ hybridization or immunohistochemistry can be used to distinguish which part of tissue is normal and which part is uterine leiomyosarcoma.
  • LMP2 and / or cycle per unit volume of tissue section or per unit cell number By measuring the number of cells in which transcription or expression of protein E is lost or decreased, the grade of uterine smooth muscle tumor can be determined.
  • detection can be performed with higher accuracy It can be performed.
  • Conventional methods include observing cell morphology, density, etc., or diagnosing uterine leiomyosarcoma using myosin transcription or expression as an indicator, and these methods are mainly performed with tissue or cells fixed. I have been.
  • tissue section specimen or a cell slide glass specimen is prepared, the cell morphology and density of the specimen are measured, the transcription or expression of myosin is further measured, and the transcription or expression of LMP2 and / or cyclin E is further measured. What should I do?
  • the present invention further includes a method of treating eclamptic leiomyosarcoma by administering the LMP2 gene to a uterine leiomyosarcoma patient, and a gene therapy agent for gene therapy containing the LMP2 gene.
  • the gene of interest in gene therapy can be introduced into a uterine leiomyosarcoma patient by a known method.
  • a method for introducing a gene into a patient there are a method using a viral vector and a method using a non-viral vector, and various methods are known (separate volume experimental medicine, basic technology of gene therapy, Yodosha, 1996; Separate volume experimental medicine, Gene transfer & expression analysis experiment method, Yodosha, 1997; Edited gene therapy research handbook, Japan TS, 1999).
  • Representative examples of viral vectors for gene transfer include adenoviruses, adeno-associated viruses, and lettuce viruses. Detoxification
  • Retrovirus (herpes virus that does not replicate itself), herpes virus, ⁇ cinnainois, boxuinores, polioinores, symbiosis, sendai virus, SV40, immunodeficiency virus ( It is possible to introduce a gene into a cell by introducing the gene of interest into a DNA virus (such as HIV) or RNA virus and infecting the cell with a recombinant virus.
  • the LMP2 gene can be introduced into cells and tissues using a gene expression vector such as a plasmid vector.
  • a gene expression vector such as a plasmid vector.
  • gene transfer using internal liposomes gene transfer using electrostatic liposomes, HVJ-ribosome method, improved HVJ-ribosome method (HVJ-AVE) Ribosome method), method using HVJ-E (envelope) vector, receptor-mediated gene transfer method, method of transferring DNA molecule together with carrier (metal particles) with particle gun, direct introduction of naked-DNA Recombinant expression vectors can be incorporated into cells by the methods, introduction methods using various polymers, and the like.
  • any expression vector can be used as long as it can express the target gene in vivo.
  • pCAGGS Gene 108, 193-200 (1991)
  • PBK-CMV pcDNA3, pZeoSV
  • pVAXl Gene transfer using electrostatic liposomes
  • HVJ-ribosome method improved HVJ-ribosome method (HVJ-AVE) Ribosome method)
  • receptor-mediated gene transfer method receptor-mediated gene transfer method
  • receptor-mediated gene transfer method receptor-mediated
  • a vector containing the LMP2 gene may contain a promoter or enhancer for transcription of the gene, a poly A signal, a marker gene for labeling and / or selection of cells into which the gene has been introduced, and the like.
  • a known promoter can be used as the promoter at this time.
  • the gene therapy agent containing the LMP2 gene includes a vector containing the LMP2 gene and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a carrier diluent, and excipient, those commonly used in the pharmaceutical field can be used.
  • lactose and magnesium stearate are used as carriers and excipients for tablets.
  • aqueous solutions for injection physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants are used, and appropriate solubilizers such as polyalcohols such as alcohol and propylene glycol, nonionic surfactants. You may use together. Sesame oil, soybean oil, etc.
  • the gene therapy agent of the present invention is preferably locally administered to the uterine leiomyosarcoma site, for example, it may be administered to the uterine leiomyosarcoma site by injection.
  • the dose varies depending on symptoms, age, body weight, etc., but the LMP2 gene inserted into an expression vector that expresses LMP2 in patients with uterine leiomyosarcoma is once every several days, weeks, or months. Injection of 0.001 mg to 100 mg into the uterine leiomyosarcoma site For example, it may be administered directly.
  • the present invention further addresses whether or not a person has uterine leiomyosarcoma due to a mutation in a specific factor involved in the interferon gamma (IFN- ⁇ ) signaling cascade, or the risk of suffering from leiomyosarcoma. It also includes a method for determining whether or not it has.
  • IFN- ⁇ interferon gamma
  • LMP2 activation by IFN- ⁇ is hardly observed.
  • the activation of LMP2 by IFN- ⁇ induces the expression of IRF-1 via JAK1 kinase, JAK2 kinase, STAT1, etc., as shown in Fig. 15 and binds to the promoter of LMP-2 gene.
  • mutations in the JAK1 kinase and STAT 1 genes, as well as mutations in the LMP2 promoter region block signal transduction and inhibit LMP-2 expression.
  • the mutations are as follows: Hereinafter, for example, when a gene mutation is represented by A210G, it indicates that 21st A in the base sequence of the gene is substituted with G. In addition, when the amino acid sequence mutation of the protein encoded by the gene is represented by G871E, it indicates that the 871st glycine (G) is substituted with glutamic acid (E) in the amino acid sequence. Mutations in JAK1 kinase
  • JAK1 kinase gene The nucleotide sequence of JAK1 kinase gene is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of JAK1 kinase is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of the STAT1 gene is SEQ ID NO: 5 i: The amino acid sequence of STAT1 is shown in SEQ ID NO: 6. '
  • LMP2 promoter The gene sequence of LMP2 promoter is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the present invention relates to a method for detecting whether or not one of the above-mentioned JAK1 kinase gene, STAT1 gene or LMP2 promoter is affected by uterine leiomyosarcoma, or the risk of suffering from uterine leiomyosarcoma.
  • a method for determining whether or not the disease is high, and a method for detecting whether or not the above-described JAK1 kinase or STAT1 amino acid mutation is present to detect whether or not the patient has eclampsia leiomyosarcoma Includes a method of determining whether or not.
  • the base mutation in the gene may be used by using the gene fragment containing the mutation site as a probe, or as DNA to be immobilized on a DNA chip or DNA microarray technology.
  • the base length of the fragment may be the full length, but is usually preferably 15 bp to lOObp, more preferably 15 bp to 50 bp, and particularly preferably 18 bp to 30 bp.
  • DNA having a sequence complementary to the above fragment is also within the scope of the present invention.
  • Complementary DNA can also be obtained based on the disclosure herein.
  • the probe of the present invention may be labeled with a fluorescent substance, an enzyme, a radioisotope, a chemiluminescent substance or the like for detection.
  • a labeling substance used for labeling a known substance can be used and labeled by a known method.
  • the fluorescent substance include Cy3, Cy5, oral damine, fluorescein and the like.
  • primers used in PCR such as PCR-RFLP for detecting the above gene mutation are also within the scope of the present invention. That is, the present invention can be used for amplification of a DNA fragment consisting of a partial sequence consisting of 10 to 30 bases present on the 3 ′ side and 5 ′ side of the mutation sites of the above-mentioned JAK1 kinase gene, STAT1 gene and LMP2 promoter. Includes a pair of primer sets.
  • Mutations can be performed using the DNA of the present invention by PCR, Southern hybridization method, Northern hybridization method, quantitative PdR method, in situ hybridization method, FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), PCR-RFLP method, PCR-SSCP method, etc.
  • a probe complementary to a nucleotide sequence containing a mutated base portion of the JAK1 kinase gene, STAT1 gene or LMP2 promoter, and a nucleotide sequence containing a portion corresponding to the mutated base portion of a wild type gene prepare the probe.
  • the total length good even les amplification to Utosuru nucleic acid fragments in nucleic acid amplification method to be described later, but, usually l 5 bp ⁇ 100bp children preferred, further l 5 bp
  • the probe may be labeled with a radioisotope, a fluorescent substance, an enzyme or the like.
  • a gene fragment containing a mutated base portion in a tissue sample or cell sample collected from uterine smooth muscle tissue is amplified by a nucleic acid amplification method, and this amplified fragment is reacted with a probe.
  • the probe of the present invention detects a single-base mismatch, the hybridization conditions must be stringent.
  • Hybridization conditions can be selected. Depending on the length of the probe DNA used, for example, the sodium concentration is 150-900 mM, preferably 600-900 mM, and the temperature is 60-68 ° C, preferably 65 ° C. Can be done under conditions.
  • a primer used for nucleic acid amplification a sequence complementary to the end of the region to be amplified across the mutation site of the above gene can be used.
  • the base length of the region to be amplified is not limited, but can be several tens to several hundred bases.
  • the amplification base length may be set so that only one mutation of the above-mentioned JAK1 kinase gene, STAT1 gene or LMP2 promoter DNA is included in the amplification region, or multiple mutations, i.e. 2, 3, 4 It may be set to contain 5 or 6 mutations. It is also possible to set the primer to a region including the mutation site.
  • the length of the primer is not limited, but it is preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 20 bp to 30 bp.
  • a DNA chip can also be created to determine the risk of suffering from a myoma.
  • a DNA fragment complementary to a portion containing a mutation in the JAK1 kinase gene, STAT1 gene or LMP2 promoter site of the present invention may be immobilized on a membrane such as nitrocellulose or nylon, a slide glass or the like.
  • the base length of the DNA fragment to be immobilized is usually preferably 15 bp to 100 bp, more preferably 15 bp to 50 bp, and particularly preferably 15 bp to 25 bp.
  • Mutations can be detected by extracting nucleic acids from tissue pieces or cells collected from uterine smooth muscle tissue.
  • Example 1 Transcriptional expression of LMP2 in human eclampsia leiomyosarcoma
  • SKN cells (RCB0513), a human eclampsia leiomyosarcoma cell line, were purchased from RIKEN Cell Bank, with 0.6% L-glutamine (Invitrogen) and 15% fetal calf serum (Sigma-Onoredori). Maintained in F-12 Nutrient Mixture (Ham) medium (Invitrogen). HeLa and HeLa.S3 cells were maintained in Dulbecco's MEM supplemented with 0.6% L-glutamine and 10% fetal calf serum. Human uterine smooth muscle cells were purchased from Cambrex Bioscience Wai lersville and maintained by the manufacturer's protocol.
  • RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
  • Transcripts of TAP1, LMP2, j3 2 -m and 0-actin were examined by RT-PCR.
  • Cells were either not treated with 250 units / ml human IFN- ⁇ (Pepro Tech) or treated for 48 hours to recover RNA.
  • Tota nore RNA was prepared from 5 ⁇ 10 6 cells using TRIzol reagent (Invitrogen) according to the best protocol.
  • RNA was reverse transcribed using Superscript II enzyme (Invitrogen), and single-stranded cDNA was used to amplify TAP1, LMP2, 32m, and 3-actin transcripts.
  • IHC was performed using the avidin-biotin complex by the method described in Hsu SM. Et al. (1981) J. Histochem. Cytochem. 29, 577-580. Specifically, six representative 5 / m tissue sections were prepared from paraffin-embedded samples of hysterectomy specimens obtained from patients with uterine leiomyosarcoma. The sections were deparaffinized, rehydrated in alcohol, and incubated with normal mouse serum for 20 minutes. The sections were then incubated for 1 hour at room temperature with an anti-LMP2 antibody (Affinity Res. Products, dilution 1/100). Thereafter, the sections were incubated with a biotinylated secondary antibody (Dako).
  • Cytoplasmic and ⁇ extracts were prepared from 5 x 10 6 cells treated or untreated with 250 unit / ml human IFN- ⁇ (Brucet. Et al. (2004) Genes Iramun. , 5, 26-35) 0 cells were collected by centrifugation at 1200 rpm for 10 minutes, washed with 5 ml of ice-cold PBS, and centrifuged for 5 minutes at 12000 rpm at 4 ° C. Pellet the cells and add 0.4 ml buffer A (lOmM Hepes, pH 7.8; lOmM KC1; 2m MgCl 2 .; ImM DTT; 0.
  • buffer A lOmM Hepes, pH 7.8; lOmM KC1; 2m MgCl 2 .; ImM DTT; 0.
  • the cell lysate or cytoplasmic extract is separated on a 10% SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) STAT 1 antibody, anti-oxidation STAT1 antibody (Santa-Cruz Biotechnol.), Anti-JAK1, anti-JAK2 antibody (Chemicon Int '1), antibody TAP1 antibody (Stressgen) or anti-LMP2 antibody (Af initi Res. Products)
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel
  • IRF1 or IRF2 expression For detection of IRF1 or IRF2 expression, separate the nuclear extract on 10% SDS-PAGE page and use anti-IRF1 antibody (Transduct ion Lab.), Anti-IRF2 antibody (Santa-Cruz Biotechnol.) Immunoblotting was performed using standard methods. The expression of the protein of interest was visualized and examined by using a secondary antibody conjugated with Alforce phosphatase to develop Alforce phosphatase color according to the manufacturer's protocol.
  • Immunoprecipitation was performed using JAK1 or anti-JAK2 antibody. Samples were separated by 10% SDS-PAGE and transferred to I ⁇ obilon-P Menplan. Phosphorylated protein can be visualized by reacting anti-tyrosine phosphorylated antibody as the primary antibody, followed by alforce phosphatase color development using a secondary antibody bound with alforce phosphatase according to the manufacturer's protocol. It was examined. To detect IFN-T / RI chain expression, whole cell lysates were separated as described above. The blot is anti-
  • IFN-y Rl chain antibody (PBL Biomedical Laboratory) was used.
  • SKN cells were transformed into pRK5 control (2 ⁇ g) or JAKl expression vector (2 g) (St. Jude Children Research
  • IFN- ⁇ is added 24 hours after the transfection, and the cells are further collected before harvesting.
  • TAP1 and LMP2wt TAP1 and LMP2wt (TAPl 593_l / pGL3 and LMP2 1-593 / pLG3) and the structure of their IRF-E mutant promoter constructs are shown in FIG. A total of 2 // g of these plasmid DNAs (University of South Florida (provided by Dr. K. L. Wright)) according to the manufacturer's recommendations, FuGENE 6 Transfection
  • RNA preparation step did not affect the non-induction of TAP1 and LMP2 expression following IFN- ⁇ treatment ( Figure lb).
  • IHC experiments showed that normal uterine smooth muscle cells markedly expressed LMP2 in 6 cases but not uterine leiomyosarcoma cells (Fig. Lc;). IHC results demonstrated non-induction of TAP1 and LMP2 in SN cells.
  • IRF-1 directly binds to a cis element called IRF-E in a bidirectional promoter shared by the TAP1 and LMP2 genes (Wright KL. Et al. (1995) J. Exp. Med., 181, 1459-1471; Whi te IX. Et al. (1996) Immunity, 5, 365-376; Dovhey SE. Et al. (2000) Cancer Res., 60, 5789-5796; Brucet M. et al. (2004) Genes Immun., 5, 26-35). As shown in Figure 2, IRF-E is located upstream of the NF ⁇ B-like binding site and the GC1 box. It has been shown that IRF- ⁇ is required for enhanced expression of TAP1 and LMP2 by IFN- ⁇ treatment (Wright KL.
  • IFN- ⁇ reliably activates a shared bidirectional promoter of TAP1 / LMP2 in SKN cells.
  • IRF-E was used to induce TAP1 or LMP2 expression in SKN and HeLa cells. Promoter-luciferase construct DNA in which is wt or mut was transferred.
  • IFN- ⁇ treatment induced 11-fold LMP2 promoter activity, and further 10-fold ⁇ 1 promoter activity (Fig. 2).
  • IFN- ⁇ treatment did not induce activation of a shared bidirectional promoter of TAP 1 / LMP2.
  • Mutations in IRF-E lost the ability of IFN- ⁇ to induce TAP1 / LMP2 gene expression observed in HeLa cells ( Figure 2). These results are consistent with endogenous mRNA levels, indicating that the activity of TAP1 and LMP2 genes in HeLa cells is emphasized, but not in SKN cells. Mutations at the IRF-E site somewhat reduced the base expression level in both HeLa and SKN cells.
  • eclampsia smooth muscle tissue was collected by biopsy or surgery and observed under a microscope.
  • Fig. 3 shows normal human uterine smooth muscle tissue.
  • Fig. 4 shows human eclampsia leiomyoma and human eclampsia.
  • Figure 5 shows a photomicrograph of human eclampsia intimal stromal sarcoma.
  • Figure 6 shows immunohistochemically stained photographs of normal uterine smooth muscle, uterine leiomyoma, and uterine leiomyosarcoma. As shown in the figure, normal uterine leiomyoma and uterine leiomyoma were stained and it was confirmed that LMP2 was expressed. However, LMP2 expression was not confirmed because it was not stained in uterine leiomyosarcoma.
  • Figure 7 shows a photograph of immunohistochemical staining of uterine leiomyosarcoma. As shown in the figure, there were stained and unstained parts in the same tissue.
  • LMP2 The expression status of LMP2 in each tissue was as follows. + Indicates exposure,-indicates negative,-/ + indicates gray zone. ,.
  • LMP2-expressing plasmid vector (2 / g) was introduced into SKN cells (5 x 10 5 ) using FuGene6 (Roche, Indianapol is, IN) according to the manufacturer's protocol. Three days after the plasmid vector was introduced into the cells, G418 (neomycin) was added to the culture medium (final concentration 200 ⁇ / ⁇ 1), and only SKN cells into which the LMP2-expressing plasmid vector was introduced were selected. The cell proliferation and cell morphology of SKN cells in which LMP2 was forcibly expressed were examined. The results are shown in Fig. 8, Fig. 9 and Fig. 21. As shown in Fig. 8, Fig. 9 and Fig.
  • LMP2 was forcedly emitted in the same manner as in Example 3.
  • Expression of fibronectin was examined by immunostaining using an anti-fibronectin antibody (Rockland).
  • an anti-fibronectin antibody Rockland
  • HuUSMC human normal uterine smooth muscle cells
  • FIG. 10 The results for SKN cells are shown in FIG. 10, and the results for human HuUSMC are shown in FIG. Figure 12 shows a summary of morphological changes in each cell, cell growth rate, and expression of five-mouthed nectin.
  • LMP2 expression is found not only in uterine and smooth muscle tissues but also in skeletal and myocardial tissues. However, LMP2 deficiency causes smooth muscle sarcoma only in uterine smooth muscle tissue. Therefore, we examined LMP2 expression in skeletal muscle, cardiac muscle and smooth muscle. We also examined LMP2 expression in skeletal muscle, cardiac muscle and smooth muscle of mice lacking the Ragl gene, which is essential for the immune system.
  • Immunohistochemistry was performed by the method described above using paraffin-embedded samples of newborn mice on the first day of life.
  • Fig. 13 shows a photograph of immunohistochemical staining.
  • uterine leiomyosarcoma high grade 4 cases
  • uterine leiomyosarcoma low grade 4 cases
  • uterine epithelial leiomyosarcoma 1 case Kotei's intima stromal sarcoma 1 case
  • uterine leiomyosarcoma 1 Cases Normal uterine smooth muscle 1 case, retroperitoneal primary leiomyosarcoma 1 case, omental primary leiomyosarcoma 1 case, small intestine primary leiomyosarcoma 1 case
  • the expression of LMP2 in various tissues was examined by immunohistochemical staining using anti-human LMP2 antibody.
  • LMP2 expression is remarkably induced by IFN- ⁇ stimulation as shown in FIG.
  • the significant decrease in LMP2 expression observed specifically in uterine leiomyosarcoma is due to inactivation due to mutations or deletions in the promoter regions of IFN- ⁇ signaling factors: JAK1, JAK2, STATU PKC ⁇ PI3K, and LMP2.
  • JAK1, JAK2, and STATU LMP2 There is a possibility that. Therefore, we examined mutations in the promoter region of IFN- ⁇ signaling factors: JAK1, JAK2, and STATU LMP2.
  • a total of 14 samples including one sample were used to examine mutations in the promoter region of JAK1, JAK2, and STATU LMP2. Each sample was mixed with HMW solution (lOm Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl,
  • the DNA fragment amplified by PCR was extracted and purified by agarose gel electrophoresis, and the nucleotide sequence was determined with a sequencer (ABI Prism3100 Genetic. Analyzer). Furthermore, using a method similar to the method for determining the base sequence of JAK1, the gene region (C) encoding the ATP-binding region and the tyrosine kinase activation region (D) in the JAK 2 molecule (D ) Nucleotide sequence, transcription factor activation region in the STAT1 molecule (701 tyrosine and 727 serine) coding gene region (E) base sequence, LMP2 promoter region gene region (F ) was determined.
  • the cells were transferred to SKN cells using FuGENE6 (Roche). After incubation for 48 hours at 37 ° C for at populate C0 2 Inkyubeta in one of SKN cells was performed for each vector, the SKN cells peeled by trypsin treatment in lOOram culture dishes (: 0 There Contact 2 Inkyubeta in one Incubated for 48 hours at 37 ° C. After that, G418 (neomycin) 100 containing g / ml Culture was performed with HamF-12-15% Fcs culture solution.
  • cancer cells with metastatic potential and high malignancy become loosely connected to each other and can grow with only one cell.
  • fibronectin which forms a matrix structure between cells
  • SKN cells are highly malignant leiomyosarcoma cells with metastatic potential, the expression of fibronectin appears to be extremely low. Therefore, SKN cells belonging to each category (A) (B) (C) are labeled as Labtech Chamber Slides.
  • fibronectin expression was observed by constitutive expression of LMP2, but formation of a fibronectin matrix structure was not confirmed (Fig.
  • SKN_lmp2 cells (# 121) (1 xlO 4 cells) or SKN-pCEM9 cells (1 xlO 4 cells) are cultured per well, and colony formation is observed under a microscope. did. As can be seen in Fig. 2-2, SKN-pCEM9 cells were confirmed to have grown and formed large colonies at 3 weeks after the start of culture, whereas SKN-lmp2 cells formed colonies. However, when compared with SKN-pCEM9 cells, the colonies were clearly smaller and less proliferative. Low Attachment Flat
  • SKN-lm P 2 cells colony # 121
  • nude mice deficient in immune CLAA Japan
  • SKN- P CEM9 cells SKN- P CEM9 cells
  • SKN-pCEM9 cells (1 xlO 6 cells) on the right side of the back of mice
  • SKN-lmp2 cells #1 121) (1 xlO 5
  • tumor formation was observed timely.
  • SKN-pCEM9 cells (1 xlO 6 cells) proliferate in the skin of nude mice and show significant tumor formation (tumor volume).
  • LMP2 LMP2
  • SKN cells of human uterine smooth muscle cultured cells the constitutive expression of LMP2 (l) changes the SKN cell morphology to flatrevertant, and (2) significantly increases the proliferation rate of SKN cells.
  • the following three biological features were observed: (3) Remarkably reduce the ability of SKN cells to form tumors. Therefore, profiling of gene expression was performed between SKN-pCEM9 cells and SKN-lmp2 cells to determine what factors are markedly changed by constitutive expression of LMP2 in SKN cells.
  • SKN-pCEM9 cells and SKN_lmp2 cells in 4 x 100 mm dishes at 37 ° C in a C0 2 ink beta up to 80% confluent (2 xlO 6 cells per dish) did. Each cell was removed by detachment and collected, and the cells were washed with .1 XPBS. Each cell was dissolved in TRIsol at a ratio of 2 ml of TRIsol (Invitrogen) per dish (shake gently for 10 minutes so that the cells were completely dissolved in TRIsol). Add mouth-opening form to the TRIsol solution at a rate of 200 // 1 TRIsol per ml, and shake gently for 10 minutes.
  • RNA 152.3 ⁇ SKN-lrap2 cells were obtained from SKN-pCEM9 cells 128 ⁇ 8 ⁇ g of Tota Nore RNA. Each Tota Nore RNA was adjusted to 100 ⁇ g, and gene expression profiling was performed.
  • Cyclin E force S which is markedly expressed in SKN-pCEM9 cells, is hardly expressed in SKN-lmp2 cells.
  • the expression of cyclin E which induces cell proliferation by constitutive expression of LMP2, was significantly reduced in SKN cells.
  • the DNA contained 200 ng DCMV 0-GaUTropix) as an internal drain fract efficiency control. After Toransufueku, Individual cells were cultured for 48 hours at Oite 37 ° C in a C0 2 incubator. Finally, the cells were washed, lysed with a 500 zl lysis buffer, and analyzed using the Dua-Luciferase Reporter Assay. System (Promega) according to the best instructions.
  • Cyclin E which is markedly expressed in SKN-pCEM9 cells, is hardly expressed in SKN-Imp2 cells. In other words, the expression of cyclin E, which induces cell proliferation by constitutive expression of LMP2, was significantly reduced in SKN cells. Then
  • FIG. 26 shows the cyclin E promoter activity in SKN cells (clones # 121 and # 122) that constitutively express SKN cells and LMP2.
  • SKN cells clones # 121 and # 122
  • Uterine leiomyosarcoma cultured cells The marked expression of cyclin E observed in SKN cells was markedly reduced by constitutive expression of LMP2.
  • LMP2 expression is not induced in SKN cells, and thus it is considered that the expression of cyclin E, a cell growth inducing factor, is not suppressed.
  • Cells deficient in the cyclin E gene normally proliferate, but are clearly resistant to transformation by external stimuli.
  • cyclin E expression is not regulated because significant LMP2 expression induction does not occur, and this is involved in the development of human eclampsia leiomyosarcoma. Therefore, we examined the expression of cyclin E in human eclampsia leiomyosarcoma tissue by immunohistochemical staining using anti-histocycline E antibody. As shown in Fig. 27, the expression of cyclin E, which is not observed in the normal human uterine flat bone muscle tissue site, is detected in the human slice. It was clearly recognized. Cyclic E expression was not observed in normal eclampsia smooth muscle layer, but cyclin E was found to be malignant in human uterine leiomyosarcoma tissue. It became clear that remarkable expression was recognized.
  • - Figure 28 is a tissue staining photograph showing the expression of cyclin E in the fissure nucleus in human uterine leiomyosarcoma tissue.
  • cyclin E which induces cell proliferation
  • Cyclin E is then immediately degraded from the second half of S period. Therefore, cyclin E expression is not observed in the G2 and M phases of normal cells.
  • cyclin E expression is not observed in the mitotic nucleus.
  • the expression of cyclin E is useful as a differentiation marker for human eclampsia leiomyosarcoma.
  • uterine leiomyosarcoma Detect whether uterine leiomyosarcoma is present in uterine smooth muscle tissue by examining transcription or expression of LMP2 and Z or cyclin E in uterine smooth muscle It can be determined that leiomyosarcoma is present when LMP2 transcription or expression is significantly low and Z or cyclin ⁇ ⁇ transcription or expression is high. Conventionally, eclampsia leiomyosarcoma was detected using cell morphology, density, growth rate, etc. as an index. However, according to the method of the present invention, uterine leiomyosarcoma can be detected easily and reliably. .
  • the method of the present invention it is possible to distinguish whether the uterine leiomyoma tumor is a uterine leiomyoma or a child leiomyosarcoma, and to determine the degree of aggravation of the uterine leiomyosarcoma. be able to.

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Abstract

　本発明は、子宮平滑筋組織におけるLMP2および／またはサイクリンEの転写または発現の程度を指標に子宮平滑筋肉腫の存在を検出する方法の提供を目的とする、LMP2および／またはサイクリンEをマーカーとして用い、子宮平滑筋肉腫を検出する方法である。

Description

LMP2を用いた子宮平滑筋肉腫の検出
技術分野
本発明は、 LMP2およびサイクリン E、 ならびにインタ一フエロン γ (IFN- γ ) シ グナル伝達カスケ一ドに関与する JAK1キナーゼ遺伝子、 STAT1遺伝子および LMP2 プロモーターにおける変異をマーカーとして用いる、 子宫平滑筋肉腫の検出方法 明
および子宮平滑筋腫と子宮平滑筋肉腫の鑑別検出方法に関する。
田 背景技術
子宮癌は婦人科の癌で最も多いが、 子宮平滑筋肉腫は発症頻度が低く子宫体部 癌の 2〜 5 %であ,る。 子宮平滑筋肉腫は、 子、宫頸部よりも子宮体部の筋肉層から 多く発生する。 子宮筋層は平滑.筋よりできており、 子宫筋層の中にできる良性の 腫瘍が子宮平滑筋腫であり、 悪性の腫瘍が子宮平滑筋肉腫である。 子宮平滑筋腫 と子宮平滑筋肉腫を鑑別することは非常に難しく、通常手術をして組織を採取し、 顕微鏡下での細胞検査により判断していた。 子宮平滑筋肉腫は異型性が強く巨大 化することもある腫瘍細胞が増殖していること力,多い。 しかし、 ほとんど細胞異 型性を示さない場合もあり、細胞異型性の有無は決定的な鑑別基準とはならない。 子宮平滑筋腫と子宮平滑筋肉腫との鑑別は、 専ら凝固壊死があるかどう力 Vおよ. び細胞分裂像が増大しているかどうかにより行う。 原則的には、 細胞密度が高い 場合には 10倍高視野で 10個以上の細胞分裂がある場合、 腫瘍細胞に異型性が認 められる場合には 10倍高視野で 5個以上ある場合に、子宮平滑筋肉腫と診断され る。 現実的には、 腫瘍細胞の細胞異型度、 細胞密度、 細胞分裂の数、 腫瘍内の壊 死、 出欠の有無等を参考に、 主として顕微鏡および肉眼で組織の形態を観察して 鑑別していた。 しかしながら、 このような鑑別を行うためには熟練を要し、 必ず しも確実に鑑別できない場合もあった。
本発明者は、 先にィムノプロテア一ゼの構成因子である LMP2 (low molecular mass polypeptide2)を欠損したマウスのメスにおいて、 生後 6ヶ月以降に子宫平 滑筋肉腫（leiomyosarcoma)が認められ、生後 12ヶ月までの発症率が全 LMP 2欠損 マウスのメスの約 35%にまでおよぶことを報告した （非特許文献 1および 2参 照）。 LMP2の機能は、 組織特異的であり、 CTLsによる MHCクラス I仲介腫瘍拒絶 に不可欠の役割を持っている （非特許文献 1参照）。
このように、 LMP2の欠損が何らかの機能で子宮平滑筋肉腫の発症のファクター になっていることは予測できた。 しかしながら、 LMP2が含まれる 26Sプロテアソ ームは、 転写調節因子や細胞周期調節因子等の活性化、 MHC クラス I分子のぺプ チド抗原の産生等に複雑に関与しており、 LMP2と子宮平滑筋肉腫の発症との直接 の関係は不明であり、 子宫平滑筋肉腫が発症した場合に、 26S プロテアソームの 機能がどう変化し、 また LMP2の転写発現がどう変化するかは不明であった。
非特許文献 1 Van Kaer L. et al. (1994) Immunity, 1, 533-541
非特許文献 2 Hayashi T. et al . (2002) Cancer Res.， 62, 24-27 発明の開示
本発明は、子宮平滑筋組織における LMP2の転写または発現の程度を指標に子宮 平滑筋肉腫の存在を検出する方法およびそのための検出試薬の提供を目的とする。 本発明者は、筋肉層における LMP2の発現を調べるためにマウスの生体を抗丄 MP 2で染色してみた。 その結果、 平滑筋、 横紋筋、ノ心筋等の筋原性組織に特異的な LMP 2の発現が認められることから、 LMP 2欠損マウスの子宫平滑筋層で認められ た腫瘍細胞の起源が筋原性細胞 （平滑筋細胞） であることを新たに見出した。 さらに、 本発明者は正常子宮平滑筋層、 ヒ ト子宫平滑筋腫おょぴヒ ト子宮平滑 筋肉腫の生検組織または手術組織における LMP2の発現状況を調べた。 その結果、 悪性腫瘍である子宫平滑筋肉腫のみにおいて、顕著な LMP2の発現低下が認められ ることを見出した。
本発明者は、 次いで LMP2の発現低下が、 子宮平滑筋細胞において形質転換 （癌 化） に直接的に関与しているか検討するため、 LMP2の発現が認められない子宮平 滑筋肉腫細胞 （SKN) に、 遺伝子組換えにより LMP2 を強制発現させ、 SKN細胞の 形態、 細胞増殖速度および SKN細胞におけるファイブロネクチンの発現変化につ いて検討した。 その結果、 SKN 細胞において、 形態おょぴ細胞増殖速度が正常子 宫平滑筋細胞に近づき、 さらに有意なファイブロネクチンの発現誘導が起こるこ とを見出した。
本発明者は上記の新知見から、 LMP2の転写発現を指標に子宮平滑筋腫と子宮平 滑筋肉腫の鑑別診断をし得ること、および LMP2の発現により子宫平滑筋肉腫の治 療を行い得ることを見出した。
本発明者らは、さらにサイクリン Eの発現と子宮平滑筋肉腫との関係に着目し、 子宮平滑筋組織において、 子宮平滑筋肉腫の悪性度に依存してサイクリン Eの転 写 ·発現が'著しく亢進することを見出した。
また、 本発明者らは、 LMP2 の発現に関与するインターフェロン γ (IFN- γ ) シ グナル伝達系に関与する遺伝子と子宫平滑筋肉腫との関係について検討を行なつ た。 その結果、 子宮平滑筋肉腫組織の細胞において同シグナル伝達因子である JAK1キナーゼ、 STAT1をコードする遺伝子および LMP2プロモータ一に変異が生じ .ていることを見出 、 該変異を検出すること より、 子宫平滑筋肉腫に罹患して .いるか否か、 および子宮平滑筋肉腫に罹患するリスクが高いか否かを判定するこ とを見出した。
以上のようにして、 本発明者らは本発明を完成させた。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
[- 1 ] LMP2をマーカーとして用い、 子宮平滑筋 腫を検出する方法。
[ 2 ] 子宫平滑筋組織における LMP2 の転写または発現の程度を指標に子宮平滑 筋肉腫の存在を検出する方法であって、子宫平滑筋組織における LMP2の転写また は発現を測定し、 LMP2の転写または発現が正常子宮平滑筋組織に比較して少ない 場合に子宮平滑筋肉腫が存在すると判定する方法。
[ 3 ] 子宮平滑筋組織における LMP2 の転写または発現の程度を指標に子宮平滑 筋の腫瘍が子宮平滑筋腫であるかまたは子宮平滑筋肉腫であるかを鑑別する方法 であって、 子宮平滑筋組織における LMP2の転写または発現を測定し、 LMP2の転 写または発現が正常子宮平滑筋組織に比較して少ない場合に子宮平滑筋肉腫であ ると判定する方法。
[ 4 ] 子宮平滑筋組織における LMP2 の転写または発現の程度を指標に子宮平滑 筋肉腫の悪性度を判定する方法であって、子宫平滑筋組織における LMP2の転写ま たは発現を測定し、 LMP2の転写または発現が正常子宮平滑筋組織に比較して少な い場合に悪性子宫平滑筋肉腫であると判定する方法。
[5] 採取した子宮平滑筋組織または細胞を用い in situ ハイブリダィゼ一ショ ンを行い LMP2の転写を測定する、 [ 1」〜[4]のいずれかの方法。
[6] 採取した子宫平滑筋組織または細胞から LMP2の mRNAを抽出し RT- PCRまた はノーザンブロッ トを行い LMP2の転写を測定する、 [1]ベ [4]のいずれかの方法。
[7] 採取した子宫平滑筋組織または細胞を用い免疫組織化学染色または免疫細 胞化学染色'を行い LMP2の発現を測定する、 [ 1 ]〜[4]のいずれかの方法。.
[8] 採取した子宮平滑筋組織または細胞から LMP2 タンパク質を抽出しィムノ ァッセィを行い LMP2の発現を測定する、 [ 1 ]〜[4]のいずれかの方法。
[9] さらに、 ミオシンをマ一カーとして用い、 LMP2およびミオシンの転写また は発現を指標に子宫平滑筋肉腫の存车を検出する方法であって、 LMP2の転写また は発現が正常子宫 滑筋組織に比較して少な 、 かつミオシンの転写または発現 が正常子宮平滑筋組織に比較して多い場合に子宮平滑筋肉腫が存在すると判定す る [1]の方法。
[1 0] LMP- 2およびサイクリン Eをマーカ一として用い、 子宫平滑筋肉腫を検 出する方法。
[.1 1] 子宫平滑筋組織における LMP2およびサ ク リン Eの転写または発現の程 度を指標に子宮平滑筋肉腫の存在を検出する方法であって、 子宮平滑筋組織にお ける LMP2およびサイクリン Eの転写または発現を測定し、 LMP2の転写または発 現が正常子宮平滑筋組織に比較して少なく、 かつサイクリン Eの転写または発現 が正常子宮平滑筋組織に比較して多い場合に子宮平滑筋肉腫が存在すると判定す る方法。
[1 2] 子宮平滑筋組織における LMP2およびサイクリン Eの転写または発現の程 度を指標に子宮平滑筋の腫瘍が子宮平滑筋腫であるかまたは子宮平滑筋肉腫であ るかを鑑別する方法であって、子宮平滑筋組織における LMP2およびサイクリン E の転写または発現を測定し、 LMP2の転写または発現が正常子宮平滑筋組織に比較 して少なく、 かつサイク リン Eの転写または発現が正常子宮平滑筋組織に比較し て多い場合に子宮平滑筋肉腫であると判定する方法。 [1 3] 子宮平滑筋組織における LMP2およびサイクリン Eの転写または発現の程 度を指標に子宮平滑筋肉腫の悪性度を判定する方法であって、 子宮平滑筋組織に おける LMP2およびサイクリン Eの転写または発現を測定し、 LMP2の転写または 発現が正常子宮平滑筋組織に比較して少なく、 かつサイクリン Eの転写または発 現が正常子宮平滑筋組織に比較して多い場合に悪性子宮平滑筋肉腫であると判定 する方法。
[1 4] 採取した子宫平滑筋靼織または細胞を用い in situ ハイプリダイゼ一シ ョンを行い LMP2およびサイクリン Eの転写を測定する、 [ 1 0]〜[1 3]のいずれ かの方法。
[1 5] 採取した子宮平滑筋組織または細胞から LMP2 およびサイクリ ン E の mRNAを抽出し RT- PCRまたはノーザンブロッ トを行い LMP2およびサイクリン Eめ 転写を測定する、 [1 0]〜[： 1 3]のいずれかの方法。
[1 6] 採取した子宮平滑筋組織または細胞を用い免疫組織化学染色または免疫 細胞化学染色を行い LMP2およびサイク リ ン Eの発現を測定する、 [ 1 0]〜[ 1 3] のいずれかの方法。
[1 7] 採取した子宮平滑筋組織または細胞から LMP2およびサイク リン Eタンパ ク質を抽出しィムノアッセィを行い LMP2および'サイク リ ン Eの発現を測定する、 [1 0]〜[1 3]のいずれかの方法。 ノ
[1 8] 少なく とも LMP2 遺伝子断片をプローブまたはプライマーとして含む、 LMP2をマ一カーとして用い子宮平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。
[1 9] 少なく とも LMP2遺伝子断片およびサイクリン E遺伝子断片をプローブま たはプライマ一として含む、 LMP2およびサイクリン Eをマ一カーとして用い子宫 平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。
[20] in situ ハイブリダイゼーション用試薬である [1 8]または[1 9]の子 宫平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。
[2 1] さらに、 ミオシン遺伝子断片をプローブまたはプライマーとして含み、 LMP2 およびミオシンをマーカ一として用い子宫平滑筋肉腫を検出するための [1 8 ]または [20]の検出試薬。
[22] さらに、 ミオシン遺伝子断片をプローブまたはプライマーとして含み、 LMP2、 サイクリン Eおよびミオシンをマーカーとして用い子宫平滑筋肉腫を検出 するための [ 1 9]または [2 0]の検出試薬。
[2 3] 少なく とも抗 LMP2抗体を含む、 LMP2 をマ一力一として用い子宫平滑筋 肉腫を検出するための検出試薬。
[2 4] 少なく とも抗 LMP2抗体および抗サイク リ ン E抗体を含む、 LMP2および サイクリン Eをマーカーとして用い子宮平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。
[2 5] 免疫組織化学または免疫細胞染色用試薬である [·2 3]または [2 4]の子 宫平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。
[2 6] さらに、 抗ミオシン抗体を含み、 LMP2およびミオシンをマーカーとして 用い子宮平滑筋肉腫を検出するための [2 3]または [2 5]の検出試薬。
[2 7] さらに、 抗ミオシン抗体を含み、 LMP2、 サイク リン Eおよびミオシンを マーカ一として用い子宮平滑筋肉腫を検出するための [2 4]または [2 5]の検出
[2 8] JAK1キナ ゼ遺伝子の以下の （Al)〜 （A6)の変異部位の少なく とも 1つ を含む JAK1キナーゼ遺伝子の部分配列、および LMP2プロモーターの以下の （B1) 〜 （B5)の変異部位の少なくとも 1つを含む LMP2プロモーターの部分配列からな る群から選択される部分配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその標識物であ つて、 1 0から 3 0塩基からなる部分配列また その部分配列に相補的な配列か らなるオリゴヌクレオチドまたはその標識物 ：
(A1) A2612A
(A2) G2626A
(A3) G2642T
(A4) A2967C
(A5) A2960C
(A6) A2985T
(B1) A210G
(B2) C214T
(B3) ■ A216G
(B4) A217G (B5) G219A。
[29] プローブとして用いられる [28]のオリゴヌクレオチドまたはその標識 物。
[30] [28]のオリゴヌグレオチドまたはその標識物を固定化し'た固定化基板。
[3 1] JAK1キナーゼ遺伝子の以下の（Al)〜（A6)の変異部位の少なく とも 1つ、 および LMP2プロモーターの以下の （Bl)〜（B5)の変異部位の少なく とも 1つから なる群から選択される変異部位を含む DNA断片の増幅に用いる少なく とも一対の プライマーセッ 卜であって、上記変異部位の 3' 側および 5' 側に存在する 1 0か ら 30塩基からなる部分配列からなる、 DNA 断片の増幅に用い得る一対のプライ マ— lrッ ト ：
(Al) A2612A
(A2) . G2626A
(A3) G2642T ,
(A4) A2967C
(A5) A2960C
(A6) A2985T
(Bl) A210G
- (B2) C214T ノ
(B3) A216G
(B4) A217G
(B5) G219A。
[3 2] [3 1 ]のプライマーセッ ト、 [28]もしくは [29]のオリゴヌクレオチ ドもしくはその標識物、 または [30]の固定化基板を含む子宮平滑筋肉腫検出キ ッ卜。
[3 3] 動物から採取した子宮平滑筋組織または細胞における JAK1 キナーゼ遺 伝子の以下の （Al)〜 （A6)の変異部位の少なく とも 1つ、 および LMP2プロモータ 一の以下の （Bl)〜 （B5)の変異部位の少なく とも 1つからなる群から選択される 変異部位の検出を行い、 その結果に基づいて、 上記変異が存在する場合に、 前記 動物が子宮平滑筋肉腫に罹患しているか、 または罹患するリスクが高いと判断す る、 子宮平滑筋肉腫の検出方法：
(Al) A2612A
(A2) G2626A
(A3) G2642T
(A4) A2967C
(A5) A2960C
(A6) A2985T
(B1)' A210G
(B2) C214T
(B3) A216G
(B4) A217G
(B5) G219A。
[ 3 4 ] JAK1キナーゼ遺伝子、 または MP2ブライマーの変異の検出を [ 3 1 ]のプ ライマーセッ ト、 [ 2 8 ]もしくは [ 2 9 ]のプローブ'または [ 3 0 ]の固定化基板を 用いて行う [ 3 3 ]の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-347227号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 aは、 SKN細胞の中での IFN- γ誘導性 TAP1および LMP2発現の欠損を示す 写真である。写真に示す時間 250ュ-ッ ト /mlの IFN- γで処理した HeLa、HeLa. S3、 SKN細胞およびヒ ト正常子宮平滑筋細胞（Hu. USMC)から細胞質抽出を調製し、 50 gの細胞質抽出物を 10%の SDS-PAGEで分離した。 TAP1、 LMP2および i3ァクチンの 発現レベルは適切な抗体を用いたィムノブ口ッ ト分析で調べた。
図 1 bは、 SKN細胞の中での 誘導性 TAP1および LMP2発現の欠損を示す 写真であり、 RT-PCRによる HeLa、 HeLa. S3、 SKN細胞および Hu. USMC細胞中の TAP1、
L P2および /3ァクチンの mRNA発現の試験の結果を示す写真である。 IFN- γ (250 ュ -ッ.卜/ ml)の非存在下または存在下で細胞を 48時間培養した後に、プライマー を用いて RT- PCRを行った。 RT- PCRにより増幅された DNA製品をァガロース · ゲ ルにより分離した。 DNAサイズマーカ一は写真の左側に示す。
図 1 cは、子宮平滑筋肉腫の中での LMP2発現の欠損を示す写真であり、正常子 宫平滑筋および子宮平滑筋腫中の LMP2の免疫組織化学の結果を示す写真である。 組織標本の 5 ιη の切片を抗 LMP2 抗体およびペルォキシダーゼ結合抗ゥサギの IgG抗体を用いて染色した。
図 2は、 HeLaおよび SKN細胞中での IFN- γ誘導 TAP1 と LMP2共有の wtおよび IRF-E mtプロモーターの示差活性を示す図である。 TAP1 と LMP2共有のプロモ一 ター wt (TAPl 593- l/pGL3および LMP2 1- 593/pLG3)の図ならびにそれらのそれぞれ の IRF- E変異体プロモーターを含んだルシフェラーゼレポータ一遺伝子の構築物 を示す。 HeLaおよび SKN細胞に同レポーター遺伝子を移入し、 IFN- yを 24時間 後に添加しさらに回収の前 24時間細胞をィンキュベー卜した。レポーター遺伝子 の移入効率の標準化のために PSMV- /3 GAL との同時に移入した。 結果は、 HeLaお よび SKN細胞につ て別々に測定されたルシ エラーゼ遺伝子発現に標準化され、 相対的 TAP1および LMP2活性として示される。 結果は 3つの独立している実験の 平均で示され、 エラーバーは SEを表す。
図 3は、 ヒ ト正常子宮平滑筋組織の顕微鏡写真である。
図 4は、 ヒ ト子宫平滑筋腫およびヒ ト子宫平滑筋肉腫の顕微鏡写真である。 図 5は、 ヒ ト子宫内膜間質肉腫の顕微鏡写真 ある。
図 6は、 正常子宮平滑筋、 子宫平滑筋腫および子宫平滑筋肉腫の免疫組織化学 染色写真である。.
図 7は、 同一組織における子宮平滑筋肉腫部位と正常子宮平滑筋部位の免疫組 織化学染色写真である。子宮平滑筋肉腫部位において LMP2の発現低下が認められ る。
図 8は、 LMP2の発現が認められない子宫平滑筋肉腫細胞 （SKN)に、 遺伝子組換 えにより LMP2を強制発現させ、 SKN細胞の形態の変化を示す写真である（その 1 )。 図 9は、 LMP2の発現が認められない子宮平滑筋肉腫細胞 （SKN)に、 遺伝子組換 えにより LMP2を強制発現させ、 SKN細胞の形態の変化を示す写真である（その 2 )。 図 1 0は、 LMP2の発現が認められない子宮平滑筋肉腫細胞 （SKN)に、 遺伝子組 換えにより LMP2を強制発現させ、 SKN細胞のファイブロネクチンの発現変化を示 す写真である。
図 1 1は、 ヒ ト正常子宮平滑筋細胞 （HuUSMC) におけるファイブロネクチンの 発現変化を示す写真である。
図 1 2は、 各細胞における形態の変化、 細胞増殖速度、 およびファイブロネク チンの発現状況のまとめを示す図である。
図 1 3は、マウス骨格筋組織、心筋組織および平滑筋組織における LMP2発現を 示す写真である。 '
図 1 4ば、 子宮平滑筋肉腫、 子宮平滑筋腫および他臓器で発症した平滑筋肉腫 における LMP2の発現を示す図である。
図 1 5は、 INF yシグナル伝達経路と LMP2の発現の関係を示す図である。
図 1 6は、 子宫平滑筋肉腫組織由来の JAK1キナーゼ遺伝子、 STAT1遺伝子およ び LMP2プロモーターの変異を示す図である。
図 1 7は、 子宮平滑筋肉腫組織由来の JAKf キナーゼ遺伝子、 STAT1遺伝子およ び LMP2プロモータ一の変異を示す図である。
図 1 8は、 各組織における LMP2の発現状況を示す図である。 図 1 8において、 Nは、 LMP2の発現を検査した組織の症例数を示す。
図 1 9は、 pCEM9 ベクター（LMP2 遺伝子が含まれていない）または pCEM9- LMP2 ベクター（LMP2 遺伝子.がふくまれている）をヒトチ宮平滑筋肉腫培養細胞（SKN 細 胞）に移入し、ネオマイシンにより選択された各べクタ一を取り込んだ場合の、 SKN 細胞の増殖により形成されたコロニーの数を示す図である。 1 /i g の pCEM9およ び pLMP2 DNAを 2 X 105細胞の DT細胞又は SKN細胞にトランスフエク トし、 0. 5 または 0. 4mg/ralの G418を含む成長培地中でセレクトした。
図 2 0は、 LMP2 の発現が認められない子宮平滑筋肉腫細胞 （SKN) に、 遺伝子 組換えにより LMP2を強制発現させ、 SKN細胞の形態の変化を示す写真である。 図 2 1は、 各細胞における形態の変化、 細胞増殖速度、 およびファイブロネク チンの発現状況のまとめを示す図である。
図 2 2は、 LMP2を恒常的に発現させた SKN細胞が腫瘍形成能の指標であるコロ ニー形成を著しく低下していることを示す写真である。
図 2 3 Aは、 LMP2を恒常的に発現させた SKN細胞がヌードマウスへの移植実験 により腫瘍形成能を著しく低下していることを示す写真である。
図 2 3 Bは、 LMP2を恒常的に発現させた SKN細胞がヌードマウスへの移植実験 により腫瘍形成能を著しく低下していることを示す図である。
図 2 3 Cは、 pCEM9 - LMP2べクター（LMP2遺伝子が含まれている）を移入したヒ ト 子宮平滑筋肉腫培養細胞（SKN細胞）のコロニー #121が、 SKN細胞と比較して LMP2 遺伝子を著しく発現していることを示す写真である。
図 2 4は、 マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析の結果、 LMP2を恒常的に発 現させた SKN細胞（コロニー #121)では、 細胞増殖を誘導するサイクリン Eの発現 が著しく低下していることを示す図である。
図 2 5は、 サイクリン Eプロモーターを含んだルシフェラーゼレポーター遺伝 子の構造を示す図である。
図 2 6は、 SKN細胞と LMP2を恒常的に発現している SKN細胞（コロニー #121 と # 122)での、 サイク リ ン Eプロモータ一活性を示す図である。 子宮平滑筋肉腫培 養細胞 SKN細胞で認められた顕著なサイク リン Eの発現は、 LMP2の恒常的な発現 により著しく低下した。
図 2 7は、 ヒト子宫平滑筋肉腫組織におけるサイクリン Eの顕著な発現を示す 組織染色写真である。 正常な子宮平滑筋層においては、 サイクリン Eの発現は認 められないが、 悪性腫瘍であるヒ ト子宫平滑筋肉腫組織では、 サイク リン Eの顕 著な発現が認められる。
図 2 8は、 ヒ ト子宫平滑筋肉腫組織における分裂期の核内でのサイクリン Eの 発現を示す組織染色写真である。 通常、 細胞増殖を誘導するサイク リ ン Eは、 細 胞増殖の開始期である G1期に細胞質において過剰に発現し、速やかに核内へと移 行し S期において染色体の合成を開始させる。 その後、 サイクリン Eは、 S期の 後半から即座に分解される。 したがって、 正常な細胞の G2期と M期においては、 サイクリン Eの発現は認められない。しかし、ヒ ト子宫平滑筋肉腫組織において、 分裂期の核内での顕著なサイクリン Eの発現が認められる。 発明を実施するための最良の形態
本発明は LMP2をマーカ一として用いて、 子宮平滑筋肉腫を検出する。 ここで、 検出とは、 子宮平滑筋肉腫が存在するかどうかを判定すること、 患者が子宮平滑 筋肉腫に罹患しているかどうか判定すること、 子宮平滑筋の腫瘍が子宮平滑筋腫 であるかまたは子宮平.滑筋肉腫であるかを鑑別すること、 子宮平滑筋肉腫の悪性 度を判定すること等を含む。
LMP2は、 プロテアソームのサブュニッ トであり、 本発明の方法においては、 子 宫平滑筋層において、 LMP2が転写発現しているかどうかを検出する。 ヒ 卜の子宮 平滑筋層の組織での LMP2の転写発現を調べると、正常な子宮平滑筋層と子宮平滑 筋腫では、' LMP2の発現は陽性 （中程度から強陽性） であるのに対して、 子宮平滑 筋肉腫では、 LMP2の発現は陰性の部分が多く弱陽性の部分が若干認められる。 従 つて、 LMP2の転写発現を指標に子宮平滑筋肉腫に罹患しているかどうか、 あるい は子宮平滑筋の腫瘍が子宮平滑筋腫か子宮平滑筋肉腫のいずれかであるかを鑑別 診断す.ることができる。 また、良性腫瘍である子宮平滑筋腫では LMP2の転写発現 は強いのに対して、悪性化した腫瘍である子 平滑筋肉腫では LMP2の転写発現が 著しく減弱する。 このことは、 LMP2の転写発現が子宮平滑筋細胞に認められる腫 瘍に対して悪性度の指標になることを示す。
さらに、 本発明は、 サイク リン E (Cycl inE) をマ一カーとして用いて、 子宮平 滑筋肉腫を検出する方法を包含する。 サイク リ ンは、 サイクリン依存性キナーゼ の活性を調節する細胞周期で重要な役割を果たすタンパク質であり、 サイク リ ン
Eは、 ほ乳類細胞の G1期において作用する G1サイクリンの一つである。 サイク リ ン Eは、 子宮平滑筋肉腫組織において、 正常組織に比較して発現が著しく上昇 するが、 子宫平滑筋腫組織においては上昇しない。 本発明においては、 LMP2 と同 様に子宫平滑筋層において、 サイクリン Eが転写発現しているかどうかを検出す る。 サイクリン Eの転写発現を指標に子宫平滑筋肉腫に罹患しているかどう力、、 あるいは子宮平滑筋の腫瘍が子宮平滑筋腫か子宮平滑筋肉腫のいずれかであるか を鑑別診断することができる。 また、 良性腫瘍である子宮平滑筋腫ではサイクリ ン Eの転写発現は正常子宮平滑筋組織と比べて変化がないのに対して、 悪性化し た腫瘍である子宮平滑筋肉腫ではサイクリン Eの転写発現が亢進する。 さらに、 通常、増殖期にある正常な細胞の G2期と M期においては、サイクリン Eの発現は 認められない。 しかし、 ヒ ト子宫平滑筋肉腫組織において、 分裂期の核内での顕 著なサイク リン Eの発現が認められる。 このことは、 サイク リン Eの転写発現が 子宫平滑筋細胞に認められる腫瘍に対して悪性度の指標になることを示す。 また、 LMP2とサイクリン Eを同時に検出してもよレ、。 LMP2の転写発現が減弱し、 かつサイクリン Eの転写発現が亢進している場合、 子宮平滑筋肉腫に罹患してい ると判断することができる。 LMP2またはサイクリン E単独を指標とする場合より も、 LMP-2およびサイク リ ン Eの両方を指標とした場合に、 より正確に子宮平滑 筋肉腫を検出することが可能である。 '
本発明においては、 子宮平滑筋肉腫に罹患しているかどうかの判断、 子宫平滑 筋の腫瘍が子宮平滑筋腫か子宮平滑筋肉腫のいずれかであるかの鑑別診断、 およ び子宮平滑筋細胞に認められる腫瘍の悪性度の評価を含めて子宮平滑筋肉腫の検 出と呼ぶ。
本発明の方法においては、子宮平滑筋層における LMP2および もしくはサイク リン Eの転写もしくは発現のいずれかまたは、両方を検出することにより、 子宫平 滑筋肉腫を検出することができる。 LMP2またはサイクリン Eの転写は LMP2また はサイクリン E をコードする mRNA を測定することにより検出することができ、 LMP2またはサイクリン Eの発現は LMP2またはサイクリン Eタンパク質を測定す ることにより検出することができる。
- LMP2および またはサイクリン Eの転写を検 する場合、子宮平滑筋層の組織 または細胞を生体試料として採取し、該試料中に含まれる LMP2および Zまたはサ イクリン Eをコードする mRNAを測定すればよい。 mRNAの測定のためには、 子宮 平滑筋組織からバイオプシーにより組織の一部を採取し、 また子宮平滑筋組織よ り綿棒等を用いて採取し、 材料として用いる。 組織の採取は、 例えば通常の外来 診察中に、 子宮内腔にバイオプシー用のかん子を挿入し、 1〜 2 mm角程度の子宮 組織片を採取すればよい。 mRNAの測定は採取した組織または細胞から mRNAを抽 出して行ってもよいし、 組織切片標本を作製するか、 または採取した細胞をスラ ィ ドガラス上に固定し、 in s i tu ハイブリダイゼーション法により染色して行つ てもよい。 あるいは、 抽出した mRNAをノーザンブロッ ト法や RT-PCR等の公知の
RNA測定法により測定すればよい。 mRNAの抽出は公知の方法、 例えば、 新生化学 実験講座 2 核酸 I 分離精製 東京化学同人 1991年 7月 10日や分子生物学実 験プロ トコール I 丸善株式会社 平成 9年 6月 30 日の記載に従って行うことが できる。 in s i tu ハイブリダィゼーシヨンは、 例えば分子生物学実験プロ トコ ル I I I 丸善株式会社. 平成 9年 8月 30 日の記載に従って行うことができる。 こ の際、 LMP2および またはサイクリン Eをコードする mRNA .を特異的に測定する ために、 LMP2および/またはサイク リン Eをコードする mRNAの部分配列に相補 的な部分配列からなるプローブまたはプライマーを用いる。 LMP2の塩基配列は公 知であり （例えば、 GenBank ァクセッション番号 U01025、 配列番号 1、 配列番号 2は LMP2 タンパク質のアミノ酸配列を示す）、 公知の塩基配列情報に基づいて、 プローブまたはプライマーを設計することができる。 同様に、 サイクリン Eの塩 基配列も公知であり （例えば、 GenBankァクセッション番号 M73812、 配列番号 8 ) 該プライマーまたはプローブは、上記の LMP2および Zまたはサイクリン E遺伝子 の断片であり、 塩基の数は 5〜50、 好ましぐは 10〜30、 さらに好ましくは 15〜25
,である。 ，
. LMP2および/またはサイク リン Eの発現を検出する場合、子宮平滑筋層の組織 または細胞を生体試料として採取し、該試料中に含まれる LMP2およびノまたはサ イクリン Eタンパク質を測定すればよい。 子宮平滑筋層の組織または細胞は上記 のようにして採取すればよい。 また、 LMP2およびノまたはサイクリン Eタンパク 質の測定も、組織または細胞からタンパク質を抽ノ出し、該抽出物中の LMP2および ノまたはサイクリン Eタンパク質を測定してもよいし、 免疫組織化学または免疫 細胞化学の手法により行ってもよい。 抽出したタンパク質の測定は、 ELISA、 ラジ オイムノアツセィ等の公知の免疫測定法 （ィムノアツセィ） を用いればよい。 こ の際、 LMP2および/またはサイクリン Eに対する抗体が必要であるが、 抗 LMP2 抗体および Zまたは抗サイクリン E抗体は公知の手法によりモノクロ一ナル抗体 またはポリク口一ナル抗体として作製すればよい。 また、市販の抗 LMP2抗体およ びノまたは抗サイクリン E抗体を用いることもできる。 抗体は必要に応じて、 酵 素、 蛍光物質、 放射性同位元素により標識して用いるが、 抗体の標識は公知の方 法により行うことができる。 免疫組織化学または免疫細胞化学の手法による測定 は、 採取した子宮平滑筋組織切片標本を作製するか、 採取した細胞をスライ ドガ ラス上に固定して行う。 免疫組織化学の手法による測定のためには、 組織を例え ば、 ホルマリ ンで固定し、 パラフィン中に包埋し、 ミクロ トーム等の薄切装置で
1 ~ 5 ^u m 程度の厚さの切片標本を作製し、 測定時にキシレンやエタノール処理 等によりパラフィンを除去し、 生理食塩水または緩衝液に浸して親水化すればよ い。 染色は、 酵素、 蛍光物質、 放 #ί性同位元素等で標識した坑 LMP2抗体および/ または抗サイクリン Ε抗体を用いてもよいし、 抗 LPM2抗体を切片標本中の LMP2 およびノまたはサイクリン Εに結合させた後に、抗 LMP2抗体および Ζまたは抗サ イクリ ン Ε抗体に結合する 2次抗体であって酵素、 蛍光物質等で標識した 2次抗 体を用いてもよい。 標識に用いる酵素として、 例えば西洋ヮサビペルォキシダ一 ゼ、 アルカリフォスファターゼ等が挙げられ、 蛍光物質と して、 例えばフルォレ セイン、 ローダミン等が挙げられる。 また、 公知のピオチン-アビジン複合体を利 用して染色してもよい。 免疫細胞化学は採取した細胞を'ホルマリン等によりスラ ィ ドガラス上に固定し、免疫組織化学の手法と同様の方法で細胞中の LMP2および /またはサイクリン Εを可視化すればよい。 免疫組織化学または免疫細胞化学に おいて、 染色は顕微鏡や肉眼で判断することもできるし、 適当な光学的測定装置 を用いてもよい。 免疫組織化学による染色は、 例えば分子生物学実験プロ トコ一 ル II I 丸善株式会社 平成 9年 8月 30日刊行の記載に従って行うことができる。 上記のように、子宮平滑筋組織または細胞における LMP2の転写または発現を検 出し、 LMP2の転写または発現が喪失しているか、ノまたは低下している場合、 子宮 平滑筋肉腫に罹患していると判定することができる。 また、 子宮平滑筋組織また は細胞におけるサイク リン Εの転写または発現を検出し、 サイクリン Εの転写ま たは発現が亢進している場合、 子宮平滑筋肉腫に罹患していると判定することが できる。 さらに、 LMP2とサイク リン Εの両方の転写または発現を同時に検出して もよい。 LMP2の転写または発現が喪失しているか、 または低下しており、 なおか つサイクリン Εの転写または発現が亢進している場合、 子宮平滑筋肉腫に罹患し ていると判定することができる。例えば、組織または細胞の抽出物中の LMP2 mRNA もしくは LMP2タンパク質またはサイク リン E mRNAもしくはサイク リン Eタンパ ク質を測定する場合、 あらかじめ子宮平滑筋肉腫に罹患していない正常人の単位 重量組織または単位細胞数当りの LMP2 mRNAもしくは LMP2タンパク質またはサイ クリン E mRNAもしくはサイクリン Eタンパク質を測定する。正常人の値より LMP2 mRNAまたは LMP2 タンパク質が有意に低い場合、 子宮平滑筋肉腫に罹患している と判定し得、正常人の値よりサイクリン E mRNAまたはサイクリン Eタンパク質が 有意に高い場合、 子宮平滑筋肉腫に罹患してい.ると判定し得る。
また、 組織または細胞の LMP2の転写または発現を in situ ハイブリダィゼー シヨン、 免疫組織化学、 免疫細胞化学により検出する場合、 組織または細胞が染 色されず、 LMP2の転写、 発現が認められない場合は、 その部分の組織または細胞 は子宮平滑筋肉腫組織または細胞であり、 組織または細胞を採取した患者は子宮 平滑筋肉腫に罹患していると判定することができる。 さらに、 組織または細胞の サイクリン Eの転写または発現を in situ ハイブリダィゼーシヨン、 免疫組織化 学、 免疫細胞化学により検出する場合、 組織または細胞が強く染色され、 サイク リン Eの転写、 発現が強く認められる場合は、 その部分の組織または細胞は子宮 平滑筋肉腫組織または細胞であり、 铒織または細胞を採取した患者は子宮平滑筋 肉腫に罹患していると判定することができる。、 この際、 子宮平滑筋肉腫でない正 常組織および子宮平滑筋肉腫組織の染色組 切片標品または染色細胞標品をあら かじめ作製しておき、 該標品と比較してもよい。
LMP2の転写または発現の検出は、子宫平滑筋腫瘍に罹患した患者の腫瘍が悪性 か良性か、 すなわち、 子宮平滑筋肉腫かそれとも子宫平滑筋腫かの鑑別に利用す ることもできる。 この場合、 LMP2の転写または 現が喪失しているか、 正常組織 に比較して有意に低下している部分の組織は、 悪性の芋宫平滑筋肉腫であると判 定することができる。 また、 サイクリン Eの転写または発現の検出は、 子宮平滑 筋腫瘍に罹患した患者の腫瘍が悪性か良性か、 すなわち、 子宮平滑筋肉腫かそれ とも子宫平滑筋腫かの鑑別に利用することもできる。 この場合、 サイクリン Eの 転写または発現が、 正常組織に比較して有意に亢進している部分の組織は、 悪性 の子宮平滑筋肉腫であると判定することができる。 この際、 LMP2およびサイクリ ン Eの両方を検出することにより、悪性度についてより正確な判断が可能になり、 また、 より正確に鑑別を行なうことができる。 さらに、 組織を用いた in situ ハ イブリダィゼーションまたは免疫組織化学の手法によれば、 組織のどの部分が正 常でどの部分が子宮平滑筋肉腫部分かを鑑別することもできる。さらに、例えば、 組織切片の単位体積当り、または単位細胞数当りの LMP2および/またはサイクリ ン Eの転写または発現が喪失しているかまたは低下している細胞の数を測定する ことにより、 子宮平滑筋腫瘍の悪性度を判定することができる。
さらに、従来の子宮平滑筋肉腫の診断方法と本発明の LMP2および/ ^またはサイ クリン Eの転写または発現を指標に子宫平滑筋肉腫を診断する方法を組合せるこ とにより、より精度の高い検出を行うことができる。従来法として、細胞の形態、 密度等を観察する方法、 またはミオシンの転写または発現を指標に子宮平滑筋肉 腫を診断する方法が挙げられ、 これらの方法は主に組織または細胞を固定して行 われてきた。 すなわち、 組織切片標本または細胞スライ ドガラス標本を作製し、 該標本の細胞の形態や密度を測定し、 さらに、 ミオシンの転写または発現を測定 し、 さらに、 LMP2および またはサイクリン Eの転写または発現を測定すればよ レ、。
本発明は、 さらに LMP2遺伝子を子宮平滑筋肉腫患者に投与することにより、子 寅平滑筋肉腫を治 する方法、 LMP2遺伝子を含む遺伝子治療のための遺伝子治療 剤も包含する。 遺伝子治療における目的の遺伝子の子宮平滑筋肉腫患者への導入 は公知の方法により行うことができる。 遺伝子を患者へめ導入する方法として、 ウィルスべクターを用いる方法および非ウィルスベクターを用いる方法があり、 種々の方法が公知である（別冊実験医学、 遺伝子治療の基礎技術、 羊土社、 1996 ; 別冊実験医学、 遺伝子導入 &発現解析実験法、 羊土社、 1997 ; 日本遺伝子治療学会 編、 遺伝子治療開発研究ハンドブック、 ェヌ ·ティー ·エス、 1999)。 遺伝子導入 のためのウィルスベクターと しては、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス、 レ ト口ウィルス等のウィルスベクターを用いた方法が代表的なものである。 無毒化
(ウィルス自身の複製が起こらなレ、）したレトロウイルス、 ヘルぺスウィルス、 ヮ クシニアゥイノレス、 ボックスゥイノレス、 ポリオゥイノレス、 シンビスウイゾレス、 セ ンダイウィルス、 SV40、 免疫不全症ウィルス（HIV)等の DNA ウィルスまたは RNA ウィルスに目的とする遺伝子を導入し、 細胞に組換えウィルスを感染させること によって、 細胞内に遺伝子を導入することが可能である。 また、 プラスミ ドべク ター等の遺伝子発現ベクターを用いて、 LMP2遺伝子を細胞や組織に導入すること ができる。 例えば、 リポフエクシヨン法、 リン酸-カルシウム共沈法、 DEAE-デキ ス トラン法、 微小ガラス管を用いた DNAの直接注入法などにより細胞内へ遺伝子 を導入することができる。 また、 内包型リポソ一ム（internal l iposome)による遺 伝子導入法、 静電気型リポソーム（electrostat ic type l iposome)による遺伝子導 入法、 HVJ-リボソーム法、 改良型 HVJ -リボソーム法（HVJ- AVE リボソーム法）、 HVJ-E (エンベロープ）ベクターを用いた方法、 レセプタ一介在性遺伝子導入法、パ 一ティクル銃で担体（金属粒子）とともに DNA 分子を細胞に移入する方法、 naked-DNA の直接導入法、 種々のポリマーによる導入法等によっても、 組換え発 現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。 この場合に用いる発現べ クタ一としては、 生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれ ば如何なる発現ベクターも用いることができるが、 例えば pCAGGS (Gene 108， 193-200 (1991) ) や、 pBK- CMV、 pcDNA3、 pZeoSV (インビトロゲン社、 ストラタジー ン社）、 pVAXlなどの発現べクタ一が挙げられる。
LMP2遺伝子を含むベクターは、遺伝子を転写するためのプロモ ターやェンハ ンサ一、 ポリ Aシグナル、 遺伝子が導入され'た細胞の標識および または選別の ためのマーカ一遺伝子等を含んでいてもよい。 この際のプロモーターとしては、 公知のプロモーターを用いることができる。
LMP2遺伝子を含む遺伝子治療剤は、 LMP2遺伝子を含むベクターならびに薬理学 的に許容され得る担体、 希釈剤もしぐは賦形剤を含む。 担体、 希釈剤、 賦形剤と しては、 製剤分野において通常用いられるもの 用いることができる。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 ステアリン酸マグネシウムなどが使用さ れる。 注射用の水性液としては、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む 等張液などが使用され、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール、 プロピレング リコールなどのポリアルコール、 非イオン界面活性剤などと併用しても良い。 油 性液としては、 ゴマ油、 大豆油などが使用され、 溶解補助剤としては安息香酸べ ンジル、 ベンジルアルコールなどを併用しても良い。 本発明の遺伝子治療剤は、 子宮平滑筋肉腫部位に局所投与することが好ましく、 例えば子宮平滑筋肉腫部位 に注射により投与すればよい。
投与量は、 症状、 年齢、 体重などによって異なるが、 子宮平滑筋肉腫患者体内 で LMP2を発現する発現ベクター等に挿入された LMP2遺伝子は、 数日または数週 間または数ケ月おきに 1回あたり、 0. 001mg〜100mgを子宮平滑筋肉腫部位に注射 等により直接投与すればよい。
本発明は、 さらにインターフェロン γ (IFN- γ ) シグナル伝達カスケードに関 与する特定の因子における変異により子宮平滑筋肉腫に罹患しているか否か、 ま たは芋宫平滑筋肉腫に罹患するリスクを有しているか否かを判定する方法をも包 含する。
正常糸田胞においては、 IFN- γにより LMP2の遺伝子は活性化されるのに対して、 子宫平滑筋肉腫細胞においては、 IFN- γによる LMP2の活性化はほとんど認められ なレ、。 IFN- γによる LMP2の活性化は、 図 1 5にメカニズムを示すように JAK1キ ナーゼ、 JAK2キナーゼ、 STAT1などを介して、 IRF- 1が発現誘導され、 LMP- 2遺伝 子のプロモーターに結合することにより生じる。 IFN- γシグナル伝達に関与する 因子のうち、 JAK1キナーゼ及び STAT 1遺伝子の変異、 並びに LMP2のプロモータ 一領域の変異によりシグナル伝達が遮断され、 LMP- 2の発現が阻害.される。
変異は以下のとおりである。以下、例えば遺伝子の変異を A210Gで表した場合、 遺伝子の塩基配列の 21番目の Aが Gに置換していることを示す。 また、遺伝子の コードするタンパク質のアミノ酸配列の変異を G871Eで表した場合、 アミノ酸配 列中、 871番目のグリシン（G)がグルタミン酸 （E) に置換していることを示す。 JAK1キナーゼにおける変異
遺伝子変異 対応アミノ酸変異 変 の存在するドメイン
A2612A G781E ATP binding
G2626A G876R ATP binding
G2642T C881F ATP binding
A2967C G986P act ive site
A2960C Y987S active site
A2985T R995S act ive site
JAK1キナーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号 3に、 JAK1キナーゼのアミノ酸配列 を配列番号 4に示す。
STAT1における変異
遺伝子変異 対応アミノ酸変異 変異の存在するドメイン A2104C I702L non kinase active region
T2128G S710A non kinase act ive region
T2078G L693R non kinase active region
A2148C . R716S non kinase active region
STAT1遺伝子の塩基配列を配列番号 5 i: STAT1のアミノ酸配列を配列番号 6に 示す。 '
LMP2プロモーター
遺伝子変異 対応アミノ酸変異 変異の存在するドメイン
A210G IRF-E site
C214T IRF-E s ite
A216G IRF-E site
A217G k IRF-E s ite
G219A IRF-E site
LMP2プロモーターの遺伝子配列を配列番号 7に示す。
JAK1キナーゼ遺伝子、 STAT1遺伝子および LMP2プロモーターの全長 DNAまたは その断片は塩基配列情報に基づいて容易に得ることができる。
- 本発明は、 上記の JAK1キナーゼ遺伝子、 STAT1遺伝子または LMP2プロモータ 一の塩基の変異を検出し、 子宮平滑筋肉腫に罹患しているか否かを検出する方法 若しくは子宮平滑筋肉腫に罹患するリスクが高いか否かを判定する方法、 並びに 上記の JAK1キナーゼまたは STAT1のアミノ酸の変異を検出し、子宫平滑筋肉腫に 罹患しているか否かを検出する方法若しくは子宫筋肉腫に罹患するリスクが高い か否かを判定する方法を包含する。
遺伝子における塩基の変異は、 上記変異部位を含む遺伝子の断片をプローブと して、 または DNAチップ、 DNAマイクロアレイ技術において固相化する DNAとし て用いればよい。 その場合の、 断片の塩基長は全長でもよいが、 通常は 15bp〜 lOObpが好ましく、さらに 15bp〜50bpが好ましく、特に 18bp〜30bpが好ましい。 断片に含まれる変異部位は、 1つだけでもよいし、 複数、 すなわち 2個、 3個、 4個、 5個または 6個でもよレ、。 また、上記断片に相補的な配列を有する DNAも本発明の範囲である。相補的な DNA も本願明細書の開示に基づいて得ることができる。
本発明のプローブは、 検出のために蛍光物質、 酵素、 放射性同位体、 化学発光 物質等で標識されていてもよい。 標識に用いる標識物質は、 公知のものを用い、 公知の方法で標識することができる。 蛍光物質としては、 例えば、 Cy3、 Cy5、 口 ーダミン、 フルォレセイン等が挙げられる。
さらに、上記の遺伝子変異を検出する PCR- RFLP等の PCRに用いるプライマーも 本発明の範囲である。 すなわち、 本発明は上記の JAK1キナーゼ遺伝子、 STAT1遣 伝子及び LMP2プロモーターの変異部位の 3 ' 側および 5 ' 側に存在する 10から 30塩基からなる部分配列からなる、 DNA断片の増幅に用い得る一対のプライマー セッ トを包含する。
変異は、 本発明の DNAを用いて PCR法、 サザンハイブリダィゼーシヨン法、 ノ ーザンハイブリダィゼーシヨン法、 定量的 PdR法、 in situ ハイブリダィゼーシ ヨン法、 FISH (Fluorescence In Situ Hybridi zation) , PCR- RFLP 法、 PCR- SSCP 法等により、 検出することができる。
例えば、 まず JAK1キナーゼ遺伝子、 STAT1遺伝子または LMP2プロモータ一の 変異塩基部分を含むヌクレオチド配列に相補的なプローブ、 ならびに野生型遺伝 子の該変異塩基部分に対応する部分を含むヌク オチド配列に相補的なプローブ を調製する。 用いるプローブの長さに制限はなく、 後述の核酸増幅法で増幅しよ うとする核酸断片の全長でもよレ、が、通常は l5bp〜100bpが 子ましく、さらに l5bp
〜50bpが好ましく、特に 18bp〜30bpが好ましい。 プローブは、放射性同位元素、 蛍光物質、 酵素等で標識したものを用いてもよい。 次いで、 子宮平滑筋組織から 採取した組織または細胞検体試料中の変異塩基部分を含む遺伝子断片を核酸増幅 法により増幅し、 この増幅断片とプローブを反応させる。 検体試料中の DNAが野 生型、 変異型のいずれのプローブとハイブリダィズするか調べることにより、 上 記遺伝子 DNAに変異が生じているか否かを検出することができる。 本発明のプロ ーブは、 1塩基のミスマッチを検出するため、 そのハイブリダィゼ一シヨン条件 は、 ストリンジェントなものであることが必要である。 ハイブリダィゼーシヨン 時の温度、 塩濃度を調節することにより 1塩基のミスマッチのみを検出し得るハ イブリダイゼーション条件を選択することが可能である。 用いるプローブ DNAの 長さにも依存するが、 例えば具体的には、 ナトリゥム濃度が 150〜900mM、 好まし くは 600〜900mMであり、温度が 60〜68°C、好ましくは 65°Cでの条件で行い得る。 核酸増幅の際に用いるプライマーとしては、 上記遺伝子の変異部位を挟み増幅 しょうとする領域の端部と相補的な配列を用いることができる。 増幅する領域の 塩基長に制限はないが、 数十から数百塩基とすることができる。 増幅領域に上記 JAK 1キナーゼ遺伝子、 STAT1遺伝子または LMP2プロモーター DNAの変異を 1つだ け含むように増幅塩基長を設定してもよいし、 複数の変異、 すなわち、 2個、 3 個、 4個、 5個または 6個の変異を含むように設定してもよい。 また、 プライマ 一を変異部位を含む領域に設定することも可能である。 プライマーの長さに制限 はないが、 好ましくは 15bp〜50bp、 さらに好ましぐは 20bp〜30bpである。
さらに、 本発明の JAK1キナーゼ遺伝子、 STAT1遺伝子または LMP2プロモータ —部位の変異を含む DNA配列またはその断片、に相補的な DNAを用いて、 子宮平滑 筋肉腫に罹患しているか否か、 または子宮平滑筋肉腫患の罹患のリスクを決定す るための DNAチッ.プを作製することもできる。 この際、本発明の JAK1キナーゼ遺 伝子、 STAT1遺伝子または LMP2プロモーター部位の変異を含む部分に相補的な DNA 断片をニ トロセルロース、 ナイロン等のメンブレン、 スライ ドグラス等に固相化 すればよい。 この際、 固相化する DNA断片の塩基長は、 通常は 15bp〜100bpが好 ましく、 さらに 15bp〜50bpが好ましく、 特に 15bp〜25bpが好ましい。 次いで、 該 DNAチップを放射性同位元素、 酵素、 蛍光色素等で標識した被験体由来の DNA または RNAと接触させ、 ハイブリダィズを形成するか否かにより検体中に変異を 有する核酸が含まれているかどうかがわかる。
変異の検出は子宮平滑筋肉組織から採取した組織片、 細胞から核酸を抽出して 行なえばよレ、。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によって限定されるものではない。 実施例 1 ヒ ト子宫平滑筋肉腫における LMP2の転写おょぴ発現
本実施例においては、 以下に記載する材料及び方法を用いて検討を行った。 細胞株および培地
ヒ ト子宫平滑筋肉腫細胞株である SKN細胞（RCB0513)は、理化学研究所セルバン クから購入し、 0. 6%の L-グルタミン（Invitrogen社）および 15%の牛胎児血清（シ グマ-オノレドリ ツチ社）をネ甫足した F- 12Nutrient Mixture (Ham)培地（Invitrogen 社）で維持した。 HeLa細胞および HeLa. S3細胞は 0. 6%の L-グルタミンぉよぴ 10% の牛胎^血清を補足したダルベッコの MEM で維持した。 ヒ ト子宮平滑筋細胞は Cambrex Biosc ience Wai lersvi l le 社力 ら購入し、 メーカーのプロ トコノ 1 こ従つ て維持しだ。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT - PCR)分析
TAP1、 LMP2、 j3 2 -mおよび 0ァクチンの転写物を RT- PCRにより調べた。 細胞 を 250ユニッ ト/ mlのヒ ト IFN- γ (Pepro Tech社）で処理しないかまたは 48時間 処理し、 RNAを回収した。 トータノレ RNAは TRIzol試薬（Invi trogen社）を用いメ一 力一のプロ トコルに従って 5 X 106細胞から調製した。 RNA は、 Superscript I I enzyme (Invi trogen社）を用いて逆転写し、 1本鎖 cDNAを TAP1、 LMP2、 3 2mおよ ぴ] 3ァクチン転写物を増幅するのに用いた。 PCR は適切なプライマ一を用いて、 30秒 94°C35サイクル、 30秒 60°C、 1. 5分 72°Cおよび追加の 5分のプログラムで 行い、 転写物を伸長させた（Cabrera CM. et al . (2003) Ti ssue Ant igens, 61, 211-219； Miyagi T.. et al. (2003) J. Gastroenterol. Hepatol. , 18, 32—40)。 免疫組織ィ匕学（Immunohistchemi stry = IHC)
IHCは、 Hsu SM. et al. (1981) J. Hi stochem. Cytochem. 29， 577-580に記載の 方法によりアビジン -ビォチン複合体を用いて行った。すなわち、子宮平滑筋肉腫 患者から得られた子宮摘出標本のパラフィン包埋サンプルから代表的な 6つの 5 / m 組織切片を作製した。 切片はパラフィン除去しアルコール中で再水和し、 正 常マウス血清を用いて 20分間インキュベートした。 次いで、 切片を抗 LMP2抗体 (Aff ini ty Res. Products社、 希釈 1/ 100)を用いて 1時間室温でインキュベート した。その後、切片をビォチン化 2次抗体（Dako社）とともにィンキュベートした。 反応を 3、 3' -ジァミノベンジジンを用いて完了し、 スライ ドをへマトキシリンで 対比染色した。 標本中の正常子宮平滑筋組織を陽性対照として用いた。 組織切片 からなる陰性対照も、 1次抗体の代わりに正常ゥサギ IgGとともにインキュベー トした。
免疫沈降反応およびィムノブロッ ト
細胞質抽出物および^抽出物は 250ュニッ ト /mlのヒ ト IFN- γで処理したか、 または処理しなレ、 5 X 106細胞から調製した（Brucet . et al. (2004) Genes Iramun. , 5, 26-35) 0 細胞を 1200rpm、 10分間の遠心分離により回収し、 5mlの氷冷 PBSで 洗浄し、 5 分間、 12000rpm、 4 °Cで遠心分離した。 細胞をペレッ ト化し、 0. 4m l のバッファー A ( lOmM Hepes, pH7. 8； lOmM KC1 ; 2m MgCl2.; ImM DTT ; 0. ImM EDTA ; およびコンプリ一トプロテア一ゼインヒビタ一カクテル（Kirkegaard&Perr Lab 社） 中で一度洗浄し、 2時間、 4 °Cでインキュベートした。次いで、 10%の Nonidet P-40溶液 25 1を添加し、細胞を 1時間、 4 °Cで激しく混ぜ、次に、 5分間、 12000rpm で遠心分離した。遠心分離の後に上清を細胞質抽出物として回収し、 - 80°Cで保存 した。ペレツ トイ匕核は、 40 1のバッファ一 C (50mM Hepes、 pH7. 8； 50mM KC1； 300mM NaCl ; 0. ImM EDTA ; ImM DTT ; 10% (v/v)グリ ロール） に再懸濁し、 4 °Cで 2時 間混ぜて、 5分間、 4°Cで 12000rpm遠心分離した。 核タンパク質を含む上清を回 収し、 - 80°Cで保存した。
STAT1、 リン酸化状態の STAT1、 JAK1、 .TAK2、 TAP1および LMP2発現を検出する ために、 細胞可溶化液または細胞質抽出物を 10%SDS-ポリアクリルアミ ドゲル (SDS- PAGE)で分離し、 抗 STAT 1 抗体、 抗リ 酸化 STAT1 抗体（Santa- Cruz Biotechnol.社）、 抗 JAK1、 抗 JAK2 抗体（Chemicon Int' 1 社）、 抗体 TAP1 抗体 (Stressgen社）または抗 LMP2抗体（Af f initi Res. Products社）を用レ、て標準方法 でィムノブロッ トを行った。 IRF1 または IRF2発現の検出のために、 核抽出物を 10%の SDS- PAGEページで分離し、 抗 IRF1 抗体（Transduct ion Lab.社）、 抗 IRF2 抗体（Santa-Cruz Biotechnol.社）を用いて標準方法でィムノブロッ トを行った。 目的のタンパク質の発現は、 アル力リフォスファターゼを結合した 2次抗体を用 いてアル力リフォスファターゼ発色をメーカーのプロ トコ一ルに従って行うこと で、 可視化して検討された。
図に示す時間 250ュニット /mlの IFN- で処理するか処理しなかった 5 X 106細 胞からの細胞全体の抽出物を、 50mM Tri s_HCl、 0. ImM EDTA、 200ra NaC 10%グ リセロール、 0. 5%NP- 40、 I mM DTT およびコンプリートプロテアーゼインヒビタ —カクテル（Kirkegaard&Perr Lab.社）を含むバッファーで溶解した。 細胞可溶化 液は、 正常ゥサギの血清（Santa- Cruz Biotechnol.社）および 20mlのプロティン G
Sepharose (Amersham Biosciences 社）であらかじめ清澄化し、 次に、 2 の抗
JAK1 または抗 JAK2抗体を用いて免疫沈降を行った。 サンプルを 10%の SDS-PAGE で分離し、 I瞧 obilon-P メンプランにトランスファーした。 リン酸化タンパク質 は、 抗チロシンリン酸化抗体を 1次抗体として反応させた後アル力リフォスファ ターゼを結合した 2次抗体を用いてアル力リフォスファターゼ発色をメーカーの プロ トコールに従って行うことで、 可視化して検討された。 IFN-T/ RI鎖発現を検 出するために、 細胞全体のライセートは上述のように分離した。 ブロッ トは抗
IFN-y Rl鎖抗体（PBL Biomedical研究所）を用いて行った。 SKN細胞を pRK5 コン ト口ール（ 2 μ g) または JAKl発現べクタ一'（ 2 g) (St. Jude Children Research
Hospital (テネシー州メンフィスの J. Ihle博士から提供された）でトランスフエ ク トした。 IFN- γをトランスフエク ト 24時間、後に添加し、細胞を回収の前さらに
24時間ィンキュベ一トした。 pCMV/3 -Gal との同時トランスフエク トをトランスフ ェク ト効率を標準化するために行った。
トランスフエク トおよびレポーターアツセィ
TAP1および LMP2wt(TAPl 593_l/pGL3および LMP2 1- 593/pLG3)の構造ならびに それらの IRF-E 変異体プロモーター構築物の構 を図 2に示す。 トータル 2 // g のこれらのプラスミ ド DNA (University of South Florida (D K. L. Wright博士力 ら提供を受けた）を、 メーカーの推奨に従って、 FuGENE 6 Transfection
Reagent(Roche社）により HeLaまたは SKN細胞中に移入した。 すべての移入され た DNAには 200ngの pCMV ]3 _Gal (Tropix社）を内部トランスフヱク ト効率コント口 ールとして含んでいた。 IFN- γ (最終濃度 250 ュニッ ト /ml)をトランスフエク ト
24時間後に添加し、 細胞をさらに 24時間インキュベートした。 最終的に、 細胞 を洗浄し、 500μ 1の溶解バッファ一で溶解し、 Dual- Luciferase Reporter Assay
System (Promega 社）を用いてメーカ一の指示に従って分析した。 LMP2 または
TAPl/pGL3の代わりに pGL3ベースで移入した細胞のルシフェラーゼ活性をバック グラウンドとして差し引いた。
上記材料および方法を用いた検討により以下の結果が得られた。 ヒ ト子宫平滑筋肉腫細胞中における INF- γによる TAP1および LMP2発現の非誘導 LMP2欠損マウスは子宮平滑筋肉腫を発症した（Hayashi T. et al. (2002) Cancer Res. , 62, 24-27)。 次いで、 ヒ ト子宮平滑筋肉腫が TAP1および LMP2の弱ぃ発現 を示すか否かを示す必要がある。 TAP1および LMP2発現に対する IFN- γの効果は、 4種の細胞株を用いたィムノブロッ トにより調べた。 IFN- γ処理に続く HeLa、 HeLa. S3、 および Hu. USMC (対照） は TAP1および LMP2の強い誘導を受けたが、 ヒ ト平滑筋肉腫細胞株 SKNにおける I FN- γ処理では TAP 1および LMP2発現はそれほ ど誘導されなかった（図 la)。 SKN細胞は、 HeLa、 HeLa. S3細胞の両方と Hu. USMC (対照） と比べると、 同じような )3ァクチン発現が認められたので、 抽出物の調 製工程は IFN- γ処理に続く TAP1および LMP2発現の非誘導に影響しなかった。 こ の IFN- γの量は、 HeLa、 HeLa. S3細胞の両方と Hu. USM 中（図 la)の TAP1および LMP2 遺伝子の両方に共有されている双方向プロモータ一を最大限に誘導するの に十分であった （図 l a)。 INF- γ量を 500 ゴニッ ト /ml まで増加させても、 SKN 細胞中で TAP1 および LMP2発現を顕著に誘導する'ことはなかった。 従って、 SKN 細胞は IFN- γ処理により TAP1および LMP2発現を增強する能力を失っていた。
IFN- γ処理に続ぐ TAP1および LMP2発現の非誘導を立証するために、 4種の細 胞株を用いて RT- PCR 分析を行った。 IFN- γ処理により誘導された TAP1 または LMP2のいずれかの mRNA発現は HeLa、 HeLa. S3細胞および Hu. USMCにおいて明確 に検出されたが、 IFN y処理は SKN細胞中で TAP1および LMP2の mRNA発現をそれ ほど誘導しなかった（図 lb)。 0ァクチン対照の mRNA発現は'試験したすべての細 胞中で同様の高いレベルで検出された。 このことは RNA調製ステップが IFN- γ処 理に続く TAP1および LMP2発現の非誘導に影響しなかったことを示す（図 lb)。IHC 実験により、 正常子宮平滑筋細胞が 6ケースにおいて LMP2を著しく発現したが、 子宮平滑筋肉腫細胞では発現しなかったことが示された （図 lc；)。 IHCの結果は、 S N細胞中での TAP1および LMP2の非誘導を立証した。
TAP1および LMP2遺伝子の IFN- γに誘導される共通の双方向性プロモーター活性 化の喪失
IRF-1 は TAP1および LMP2遺伝子に共有される双方向プロモーター中の IRF-E と呼ばれるシスエレメントに直接結合する （Wright KL. et al. (1995) J. Exp. Med. , 181， 1459-1471； Whi te IX. et al. (1996) Immuni ty, 5, 365-376； Dovhey SE. et al. (2000) Cancer Res. , 60, 5789-5796； Brucet M. et al . (2004) Genes Immun. , 5， 26-35)。 IRF- Eは図 2に表されるように、 NF κ B様結合部位および GC1ボック スの上流に位置する。 IFN- γ処理による TAP1および LMP2の発現増強に IRF- Εが 必要であるこ とが示された（Wright KL. et al. (1995) J. Exp. Med. , 181， 1459-1471； White LC. et al. (1996) Immunity, 5， 365-376 ; Dovhey SE. et al. (2000) Cancer Res. , 60, 5789 - 5796 ; Brucet . et al. (2004) Genes Immun. , 5, 26 - 35)。 IFN- γが SKN細胞において TAP1/LMP2の共有された双方向のプロモータ 一を確実に活性化するかどうかを調べるために、 SKN細胞および HeLa細胞に TAP1 または LMP2の発現を誘導すべく IRF- Eが wt もしくは mutであるプロモータ一- ルシフェラ一ゼコンストラク ト DNAを移入した。 HeLa細胞の場合、 IFN- γ処理に より 11倍の LMP2プロモーター活性が誘導され、 さらに 10倍の ΤΑΡ1プロモータ 一活性が誘導された（図 2 )。 しかしながら、 SKN細胞中では、 IFN- γ処理の結果、 TAP 1 /LMP2 の共有された双方向のプロモーターの活性化誘導は認められなかった。 IRF-Eの変異により、 HeLa細胞中で認められた IFN- γの TAP1/LMP2遺伝子発現を 誘導する能力が失われた（図 2 )。これらの結果は内在性の mRNA レベルと一致して おり、 HeLa細胞中での TAP1および LMP2遺伝子の活性が強調しているが、 SKN細 胞では強調していないことを示す。 IRF- E部位の変異は HeLa細胞および SKN細胞 の両方でベースとなる発現レベルをいく らか減少させた。 このことはこの部位が LMP- 2の発現において一定の役割を果たすことを示す。 これらの結果は、 IFN y処 理が、 HeLa細胞中で TAP1/LMP2の共有されたプロモーター活性を強く誘導し得る が、 SKN細胞中では誘導しないことを示す（図 2 )。 実施例 2 免疫組織化学によるヒ ト正常子宫平滑筋層、 ヒ ト子宫平滑筋腫および ヒ ト子宮平滑筋肉腫の生検組織または手術摘出組織における LMP2の発現状況 ヒ ト正常子宮平滑筋層、 ヒ ト子宫平滑筋腫およびヒ ト子宮平滑筋肉腫の顕微鏡 観察
ヒ ト子宫平滑筋組織をバイォプシ一または手術により採取し、顕微鏡観察した。 図 3はヒ ト正常子宮平滑筋組織を、 図 4は、 ヒ ト子宫平滑筋腫およびヒ ト子宫 平滑筋肉腫を、 図 5はヒ ト子宫内膜間質肉腫の顕微鏡写真を示す。
上記顕微鏡観察により判定した、 正常子宫平滑筋 10例、 子宮平滑筋腫 6例、 子 宮内膜肉腫 6例およぴ子宫平滑筋肉腫 （悪性度低） 3例、 子宮平滑筋肉腫 （悪性 度高） 4例を用いて、 免疫組織化学により各組識の LMP2発現を調べた。
免疫組織化学は、 前記の方法で行った。
図 6に、 正常子宮平滑筋、 子宮平滑筋腫および子宮平滑筋肉腫の免疫組織化学 染色写真を示す。 図に示すように、 正常子宮平滑筋および子宮平滑筋腫は染色さ れ、 LMP2が'発現されていることが確認された。 しかし、 子宮平滑筋肉腫では染色 されなかったため、 LMP2の発現が確認されなかった。
図 7に、 子宮平滑筋肉腫の免疫組織化学染色写真を示す。 図に示すように、 同 じ組織内で染色された部分と染色されない部分が存在した。
各組織における LMP2の発現状況は以下のとおりであった。 +は曝性、 -は陰性、 -/+はグレーゾーンであることを示す。 、 .
LMP2発現
正常子宮平滑筋組織 ++++
子宮平滑筋腫組織 ++++
子宮内膜肉腫組織 ノ -/+ '
子宫平滑筋肉腫 （悪性度低） 組織 -/+
子宮平滑筋肉腫 （悪性度高） 組織 - 上記表に示されるように、 悪性腫瘍である子宮平滑筋肉腫のみにおいて、 顕著 な LMP2の発現低下が認められた。 また、 子宮平滑筋肉腫の組織での LMP2の発現 低下度は、 悪性度に依存していており、 LMP2の発現低下度合いは、 子宮平滑筋肉 腫の悪性度の指標と成り うることが明らかとされた。 実施例 3 SKN細胞における LMP2の強制発現
1 . SKN細胞における LMP2の強制発現による細胞形態の変化
LMP2の発現低下が、 子宮平滑筋細胞において形質転換 （癌化） に直接的に関与 しているかについて検討を行った。 LMP2の発現が認められない子宫平滑筋肉腫細 胞 （SKN)に、 遺伝子組換えにより LMP2を強制発現させ、 SKN細胞の形態を観察し た。
方法 .
LMP2 発現プラスミ ドべクダー（2 / g)を SKN 細胞（5 x 105)内に FuGene6 (Roche, Indianapol is, IN)を用いメーカーのプロ トコールに従って導入した。 同 プラスミ ドベクターを細胞に導入した 3 日後に、 G418 (ネオマイシン）を培養液に 加えて（最終濃度 200 ^/πι1)、 LMP2発現プラスミ ドべクターが導入された SKN細 胞のみを選択した。 LMP2の強制発現された SKN細胞の細胞増殖能、 細胞形態能に ついて検討を行った。 結果を図 8、 図 9および図 2 1に示す。 図 8、 図 9および 図 2 1に示すように、 SKN細胞の増殖能は、 倍加時間 15. 2時間だったの対して、 LMP2の強制発現された SKN細胞の細胞増殖能は、 倍加時間 17. 5時間となった。 . LMP2の発現により、 SKN細胞の増殖速度が、 倍加時間 2時間遅くなった。 また、 鉀長い斜方形の細胞形態を持っている SKN細胞が、 LMP2の強制発現により繊維芽 細胞様（菱形）の細胞形態に変化したことが認められた。
2 . SKN細胞における LMP2の強制発現によるファイブロネクチンの発現の変化 一般的に転移能を有する悪性度の高い癌細胞は、 細胞と細胞との接着因子 （フ アイプロネクチン） の著しい発現低下が認められる。 LMP2の発現が認められない 子宫平滑筋肉腫細胞 （SKN)に、 遺伝子組換えによ J LMP2を強制発現させ、 フアイ ブロネクチンの発現変化について検討を行った。 '
LMP2の強制発 は実施例 3と同様の方法で行った。 フアイプ 'ロネクチンの発現 は、 抗ファイブロネクチン抗体 （Rockland社） を用いた免疫染色法により検討し た。 また、 コントロールとして、 ヒ ト正常子宮平滑筋細胞： HuUSMCを用いた。
SKN細胞における結果を図 1 0に、 ヒ ト HuUSMCにおける結果を図 1 1に示す。 また、 図 1 2には各細胞における形態の変化、 細胞増殖速度、 およびファイブ口 ネクチンの発現状況のまとめを示す。
図に示すように、 SKN細胞に LMP2を強制発現させた場合、 SKN細胞の形態と增 殖速度が、 正常の子宫平滑筋細胞に近づいた。 また、 SKN細胞に LMP2を強制発現 させた場合、 有意なファイブロネクチンの発現誘導が認められた。 つまり、 LMP2 の強制発現により誘導されたファイブロネクチンの発現は、 SKN 細胞の持つ転移 能の減弱の可能性を示唆している。
実施例 4 各組織における LMP2の発現
LMP2の発現は、 子宮.平滑筋組織のみならず、 本来骨格筋組織および心筋組織に おいても認められる。 ところが、 LMP2の欠損により、 平滑筋.肉腫が ¾症するのは 子宮平滑筋組織のみである。 そこで、 骨格筋、 心筋および平滑筋における LMP2 発現を調べた。 また、免疫機構に必須である Ragl遺伝子を欠損させたマウスの骨 格筋、 心筋および平滑筋における LMP2発現を調べた。
免疫組織化学は、 生後 1 日目のマウス新生児のパラフィン包埋サンプルを用い て、 前記の方法で行った。
図 1 3に免疫組織化学染色写真を示す。 実施例 5 子宮及び他の器官での平滑筋肉腫における LMP2の発現
ヒ ト子宮平滑筋内腫の組織において LMP2め発現の著しい消失が確認された。平 滑筋肉腫は、 子宮以外にも種々の臓器にいても発症するが、 LMP2の発現の消失は 子宮平滑筋肉腫に特異的に認められるものか検討した。
方法
病理ファイルより、子宮平滑筋肉腫（悪性度高い） 4症例、子宮平滑筋肉腫（悪性 度低い） 4症例、 子宮上皮平滑筋肉腫 1症例、 子亭内膜間質肉腫 1症例、 子宮平滑 筋腫 1症例、 正常子宮平滑筋 1症例、 後腹膜原発平滑筋肉腫 1症例、 大網原発平 滑筋肉腫 1症例、 小腸原発平滑筋肉腫 1症例、 腸管膜原発平滑筋肉腫 1症例を選 び、 各疾患の組織における LMP2の発現を抗ヒ ト LMP2抗体を用いた免疫組織染色 により検討した。
図 1 4に示されるように、 正常な子宮平滑筋組織や子宮平滑筋腫（良性腫瘍）に おいて認められた顕著な LMP2の発現が、子宮平滑筋肉腫（悪性腫瘍）では著しく減 弱していることを再確認した。子宫内膜間質肉腫 1症例では LMP2の発現が認めら れなかったが、子宮上皮平滑筋肉腫 1症例においては LMP2の発現が有意に認めら れた。 腹部 ·消化器系組織に発症した平滑筋肉腫においては、 顕著な LMP2の発現 が認めもれる場合もあるが、 著しい LMP2の発現の減弱が認められる場合もある。 これまでの Gene Copy Number Profi l ingのゲノム解析より、 子宫平滑筋肉腫の発 症機序は、 他の臓器における平滑筋肉腫の発症機序とは大きく異なっている可能 性が示されている。 実施例 5の結果より、 LMP2の発現の消失は子宮平滑筋肉腫に. 特異的に認められる現象と思われる。 実施例 6 IFN- 7シグナル伝達因子の変異と子宮平滑筋肉腫の関係
「子宮平滑筋肉腫において特異的に認められる LMP2発現の著しい減弱」 につい て再検討し、 その特異性を確立した。 具体的には、 ヒ ト正常子宮平滑筋組織 21 症例、 子宮平滑筋腫 24症例、 子宮内膜間質肉腫 6症例、 子宮平滑筋肉腫 29症例 について LMP2の発現を抗ヒ ト LMP2抗体を用いた免疫組織染色により検討した。 図 1 8に示されるように、子宮平滑筋肉腫において特異的に認められる LMP2発現 の著しい減弱性を確認した。
LMP2の発現は、 図 1 5に示される様に IFN- γの刺激により顕著に誘導される。 子宮平滑筋肉腫において特異的に認められる LMP2発現の著しい減弱は、 IFN- γの シグナル伝達因子： JAK1、 JAK2、 STATU PKC · 、 PI3K、 LMP2の promoter領域の 変異や欠損による不活性化に起因している可能性が考えられる。 そこで、 IFN - γ のシグナル伝達因子： JAK1、 JAK2、 STATU LMP2の promoter領域の変異について 検討した。
方法 ノ
手術により摘出されたヒ ト子宫体部組織 13 症例から平滑筋肉腫組織部位のみ と正常な平滑筋組織部位のみをレーザ一マイクロダイセクジョンにより切り取り 回収した。正常な子宮平滑筋組織 13検体にヒ ド正常子宮平滑筋培養細胞 1検体を 加えた合計 14検体、 子宮平滑筋肉腫組織 13検体にヒ ト子宫平滑筋肉腫培養細胞
1検体を加えた合計 14検体を用いて JAK1、 JAK2、 STATU LMP2の promoter領域 の変異について検討した。 各検体を HMW溶液（lOm Tri s-HCl pH8. 0、 150mM NaCl、
10mMEDTA-Na0H pH8. 0、 0. 1% SDS) -proteinase K (100 · g/ml)に加えて 55。Cで 24 時間保温し、フエノール/クロロホルムにより不純物を取り除きゲノム DNAを精製 した。 JAK1分子内の ATP結合領域をコードする遺伝子領域（A)とチロシンリン酸 化酵秦活性化領域をコードする遺伝子領域（B)の塩基配列を決定するために、遺伝 子領域（A)と遺伝子領域（B)の各領域に対する PCR- primer を用いてそれぞれの領 域を含む DNA断片を各検体より得られたゲノム DNAを用いて PCRにより増幅させ た。 PCRにより増幅された DNA断片をァガロースゲル電気泳動法により抽出し精 製し、 シークェンサ一（ABI Prism3100 Genetic. Analyzer)により塩基配列を決定 した。 さらに、 JAK1の塩基配列を決 した方法と同様の手法を用いて、 JAK2分子 内の ATP 結合領域をコードする遺伝子領域（C)とチロシンリン酸化酵素活性化領 域をコードする遺伝子領域（D)の塩基配列、 STAT1分子内における転写因子活性化 領域（701番目のチロシンと 727番目のセリン）コ一ドする遺伝子領域（E)の塩基配 列、 LMP2の promoter領域をコードする遺伝子領域（F)の塩基配列を決定した。 子 宮平滑筋肉腫における特異的な変異を検出するために、 同一子宮体部における子 宫平滑筋肉腫組織部位と正常子宮平滑筋組織部位での塩基配列（Aから E領域）を 比較検討した。
IFN- γのシグナル伝達因子： JAK1、 JAK2、 STAT1、 各因子における.リン酸化酵素 あるいは転写因子の活性化領域、 LMP2の proinoter領域の変異解析の結果は、 図 1 6 (変異を各検体ごとにまとめた図）と図 1 7 (変異を各因子ごとにまとめた図） に示している。 実施例 7 ヒ ト子宫平滑筋肉腫細胞における、 LMP-2 の恒常的発現による細胞形 態と細胞増殖への影響. ノ
ヒ ト子宫平滑筋肉腫の組織において顕著な LMP2 の発現低下が認められるが、 LMP2の発現低下が、 子宮平滑筋肉腫の発症に関与しているのか検討した。 . 方法
SKN 細胞を 6穴プレー トにおいて培養し、 70 %コ ンフルェン トの際、
1¼11^-12-15%?じ5培養液2 1111 を交換した。 培養液を交換した次ぎの日、 Roche社 のプロ トコールに従って、 1穴に対して 2 μ gの pCEM9ベクター（LMP2の遺伝子を 含まない）または pCEM- LMP2 ベク ター（LMP2 の遺伝子を含んでいる） を
FuGENE6 (Roche社）により SKN細胞に移入した。各ベクターの移入を行った SKN細 胞を C02ィンキュベータ一内において 37°Cで 48時間培養した後、 SKN細胞をトリ プシン処理によって剥がして lOOram培養シャーレで（：02ィンキュベータ一内にお いて 37°Cで 48時間培養した。 その後、 G418 (ネオマイシン） 100 ; g/ml を含んだ HamF-12-15%Fcs培養液で培養を行った。 C02インキュベーター内において 37°Cで 2週間培養すると、 pCEM9ベクターまたは pCEM- LMP2ベクターが移入された SKN 細胞のみが G418 によって選択的に生き残り増殖しコロニーを形成しているのが 確認された。 G418 (ネオマイシン）含 培養液にて選択培養の 3週間後、 100mm 培 養シャーレ内における各べクタ一が移入された SKN細胞により形成されたコロニ —数を数え、 かつ SKN細胞の細胞形態を観察した。
図 9および図 2 0に示される様に、 pCEM- LMP2べクタ-が.移入された SKN細胞の 形態が、線維芽細胞様（Flatrevertant)に変化していることが確認された。全般的 に、 （A) SKN細胞のもともとの形態を維持している細胞のみで形成されているコ口 ニー、 （B)線維芽細胞様（Flatrevertant)に形態が変化している細胞が一部存在し ているコロニー、 （C)線維芽細胞様（Flatrevertant)に形態が変化している細胞 みで形成されているコロニーが確認された。（A) (B) (C)の各カテゴリーに属するコ ロニーの数は、 図 1 9に示している。 また、 （A) (B) (C)の各カテゴリーに属する細 胞の増殖速度をトリパンブル一により染色法により検討を行ったところ、（A)カテ ゴリーでは、 P. D. T. (Population doubl ing time = 倍加時間） 15. 2時間、 （B)カテ ゴリーでは、 P. D. T. =16. 8時間、（C)カテゴリーでは、 P. D. T. =17. 8時間となった。 ヒ ト子宫平滑筋肉腫培養細胞 SKN細胞において、恒常的な LMP2の発現は、細胞形 態が線維芽細胞様（Flatrevertant)に変化させ、細胞速度が遅くなることが確認さ れた（図 9、 図 2 0およぴ図 2 1 )。 '
通常、 転移能を有する悪性度の高い癌細胞は、 細胞と細胞との繋がりが粗にな り 1つの細胞のみでも増殖が可能となる。 特に、 細胞間のマ トリ ックス構造を形 成するファイブロネクチンの発現が、 転移能を有する悪性度の高い癌細胞におい て著しく低下することが知られている。 SKN 細胞は、 転移能を有する悪性度の高 い平滑筋肉腫細胞であるため、 ファイブロネクチンの発現が著しく低いと思われ る。そこで、（A) (B) (C)の各カテゴリ一に属する SKN細胞を Labtech Chamber Sl ide
(IWAKI社）において培養し、 顕微鏡下において 80%コンフルェントの状況を確認 した後、 公知の方法に従って抗ヒ ト-フアイプロネクチン抗体（Rockland 社）によ りファイブロネクチンの発現状況を確認した。 図 1 0と図 1 1で示されている様 に、 正常なヒ ト子宫平滑筋培養細胞： N. HuUSMC では、 ファイブロネクチンが顕著 に発現しマ トリ ックス構造を形成していることが確認されたが、 ヒ ト子宫平滑筋 肉腫培養細胞： SKN 細胞では、 ファイブロネクチンの発現は僅かでありマトリツ クス構造の形成が認められなかった。 しかし、 線維芽細胞様（Flatrevertant)の
SKN細胞において、 LMP2の恒常的な ¾現によりファイブロネクチンの発現が認め られたが、ファイブロネクチンのマトリ ックス構造の形成は確認されなかった（図
1 0 )。 SKN細胞における LMP2 の恒常的な発現による細胞形態、 細胞増殖とファ イブロネクチンの発現状況への影響に関する結果が、，図 2. 1に纏められている。 図 2 1に示されているように、 SKN細胞が本来有する腫瘍形成能が、 LMP2の発 現により有意に低下すると予測される。 そこで、 Low Attachment Flat Chamber 24 穴 (Costor社）を用いて、線維芽細胞様 (Flatrevertant)の SKN細胞 (SKN-lmp2細胞） と SKN細胞（SKN- PCEM9細胞）における腫瘍形成能の指標となるコロニー形成能^ 検討した。 Low Attachment Flat Chamber 24穴. (Costor社）の 1穴あたり SKN_lmp2 細胞（#121) ( 1 xlO4個）あるいは SKN- pCEM9細胞（ 1 xlO4個）を培養して、 コロニー 形成を顕微鏡下で観察した。 図 2 2で認められる様に、 培養開始 3週間目におい て、 SKN- pCEM9細胞が大きなコロニーを形成して増殖しているのを確認出来たが、 一方、 SKN-lmp2細胞はコロニーを形成しているが、 SKN- pCEM9細胞と比較すると 明らかにコロニーは小さく増殖能が低いことが認められた。 Low Attachment Flat
Chamberを用いた実験では、 SKN- lmP2細胞（コロニー #121)は、 コロニー形成能が 低いことから、 腫瘍形成能が著しく低下していることが認められた。 そこで、 免 疫が欠損しているヌードマウス（日本クレア社）を用いて、 SKN-PCEM9 細胞と
SKN-lmp2細胞（コロニー #121)における腫瘍形成能の検討を行った。 ヌードマウス
(日本クレア社）メス（6週齢） 5匹を購入し、 SKN- pCEM9 細胞（ 1 xlO6個）をマウス の背中の右側に皮内接種し、 SKN- lmp2細胞（#121) ( 1 xlO5個）をマウスの背中の左 側に皮内接種し計時的に腫瘍形成を観察した。 皮内接種 4週間後、 SKN- pCEM9 細 胞（ 1 xlO6個）はヌードマウスの皮内において増殖し顕著な腫瘍形成（腫瘍体積
980謹3)が認められた。 一方、 SKN- lmp2 細胞（コロニー #121) ( 1 xlO5個）はヌード マウスの皮内において増殖せず、 顕著な腫瘍形成（腫瘍体積 90mm3)が認められな かった.（図 2 3 Aおよび 2 3 B)。 ヒ ト子宫平滑筋培養細胞 SKN細胞において、 LMP2 の恒常的な発現は、腫瘍形成能を顕著に低下させることを認めた （図 2 3 A〜 2 3 0 実施例 8 子宮平滑筋肉腫における顕著なサイクリン Eの発現
ヒ ト子宮平滑筋培養細胞 SKN 細胞において、 LMP2 の恒常的な発現は、 （l) SKN の細胞形態を線維芽細胞様（Flatrevertant)に変化させる、 （2) SKN 細胞の増殖速 度を有意に低下させる、 （3) SKN細胞の有する腫 形成能を顕著に低下させる、 以 上 3つの生物学的特長を認めた。 そこで、 SKN細胞において、 LMP2の恒常的な発 現によりどのような因子の発現に顕著な変化が認められるのか、 SKN- pCEM9 細胞 と SKN-lmp2細胞間において遺伝子発現のプロフアイリングを行った。
方法
SKN-pCEM9細胞と SKN_lmp2細胞とを 100mmディッシュ 4枚ずつで C02インキ ベータ一内において 37°Cで、 80%コンフルェントの状況まで（シャーレ 1枚あた り 2 xlO6個の細胞が増殖）培養した。各細胞を リプシンによって剥がして回収し、 .1 XPBSによつて細胞を洗つた。シャーレ 1枚あたり TRIsol (ィンビトロジェン社） 2 ml の割合で、 各細胞を TRIsol に溶かした（細胞が完全に TRIsolに溶けるよう に 10分間穏やかに振揺させる）。 TRIsol l mlあたりク口口ホルム 200 // 1の割合 で、 TRIsol溶液にクロ口ホルムを加えて 10分間穏やかに振揺させる。 10分間の 振摇後、 7000rpm、 室温、 20 分間の条件で遠心を行い、 水層と有機層に分離して 中間層を採取しない様に水層を採取した。 水層に含まれているトータル RNAを公 知の方法を精製した。 上記の手法により、 SKN-pCEM9細胞より トータル RNA 152. 3 μ SKN— lrap2細胞より トータノレ RNA 128· 8 μ g得られた。 各トータノレ RNA 100 μ g を調整して、 遺伝子発現のプロフアイリングを行った。
マイクロアレイ遺伝子発現のプロフアイリングの結果の一部を図 2 4に示す。 SKN-pCEM9細胞において顕著な発現が認められたサイク リ ン E力 S、 SKN-lmp2細胞 においては殆ど発現が認められない。 つまり、 SKN細胞では、 LMP2を恒常的に発 現により細胞増殖を誘導するサイクリン Eの発現が著しく低下された。 トランスフエク トおよびレポ一ターアツセィ
サイクリン Eのプロモター領域の活性化によりルシフェラーゼ遺伝子が発現誘 導されるレーポータープラスミ ド（p lO - 4 - Luc) (Department of Cancer Biology,
Mayo Cl in i c Comprehens i ve Cancer Center CO E A. Thompson博士力 ら提供を受け た）の構造を図 2 5に示す。 p lO- 4- Luc レーポータープラスミ ドと LMP2発現プ スミ ド pCEM9 - Lmp2とを図に示した内容にしたがって、 トータノレ 2〃gのプラスミ ドをメ一カーの推奨に従って、 FuGENE 6 Transfect i on Reagent (Roche)により SKN . 細胞、 SKN- lmp2 細胞（クローン #121 と #122)中に移入した。 すべての移入された
DNAには 200ngの DCMV 0 - GaUTropi x社）を内部ドランスフヱク ト効率コントロー ルとして含んでいた。 トランスフエク ト後、 各細胞を C02インキュベーター内に おいて 37°Cで 48時間培養した。 最終的に、 細胞を洗浄し、 500 z lの溶解バッフ ァ一で溶角 し、 Dua l-Luc i ferase Reporter Assay. System (Promega社)を用レヽてメ 一力一の指示に従って分析した。
上記材料および方法を用いた検討により以下の結果が得られた。
ヒ ト子宫平滑筋 腫培養 SKN細胞において： LMP2の恒常的発現によりサイクリ ン Eのプロモーター活性が顕著に低下された。
マイクロアレイ遺伝子発現のプロフアイリングの結果の一部を図 2 4に示す。
SKN-pCEM9細胞において顕著な発現が認められたサイクリン Eが、 SKN- lmp2細胞 においては殆ど発現が認められない。 つまり、 SKN細胞では、 LMP2を恒常的に発 現により細胞増殖を誘導するサイクリン Eの発現が著しく低下された。 次いで、
SKN細胞において、 LMP2の恒常的発現がサイク リ ン Eのプロモーター活性を有意 に抑えることを確認する必要がある。 サイクリン Eのプロモーター活性に対する
LMP2 の恒常的発現の効果は、 3種の SKN 細胞株（SKN- pCEM9, SKN- lmp2#121 ,
SKN-lmp2#122)を用いたレポーターァッセィにより検討された。 SKN細胞において、
LMP2の発現の無い環境では、顕著に活性化されたサイクリン Eのプロモーターが 認められた（図 2 6 )。 し力 し、 LMP2が発現している環境では、 サイクリン Eのプ 口モーターの著しい活性化が認められなかった（図 2 6 )。 また、 SKN-pCEM9 細胞 においては、 サイクリン E のプロモーターの著しい活性化が認められたが、
SKN-lmp2細胞においては、サイク リ ン Eのプロモータ一の著しい活性化が認めら れなかった（図 2 6 )。 ヒ ト子宮平滑筋肉腫培養 SKN細胞において、 LMP2の恒常的 発現によりサイクリン Eのプロモータ一活性が顕著に低下されることが確認され た。
図 2 6は、 SKN細胞と LMP2を恒常的に発現している SKN細胞（クローン #121 と # 122)での、 サイク リ ン Eプロモーター活性を示す図である。 子宮平滑筋肉腫培 養細胞 SKN細胞で認められた顕著なサイクリン Eの発現は、 LMP2の恒常的な発現 により著しく低下した。 つまり、 SKN細胞では、 LMP2の発現誘導が起こらないた め、細胞增殖誘導因子であるサイクリン Eの発現抑制が認められないと思われる。 サイクリン Eの遺伝子を欠損させた細胞は、 通常に細胞増殖するが、 外部からの 刺激等による形質転換には耐性であることが明らかである。 したがって、 顕著な LMP2 の発現誘導が起こらないためサイク リン Eの発現制御が起こらないこと力 ヒ ト子宫平滑筋肉腫の発症に関与していると考えられる。 そこで、 ヒ ト子宫平滑 筋肉腫の組織でのサイクリン Eの発現状況を、 抗ヒ トサイクリン E抗体を用いた 免疫組辚染色法によって検討した。図 2 7で示されている様に、同一切片内にて、 ,正常なヒ ト子宮平†骨筋組織部位では認められないサイク リン Eの発現が、 ヒ ト子 .宮平滑筋肉腫組織部位に鮮明に認められた。ヒ ト子宫平滑筋肉腫 14症例において 検討した結果、 正常な子宫平滑筋層においては、 サイク リン Eの発現は認められ ないが、 悪性腫瘍であるヒ ト子宮平滑筋肉腫組織では、 サイク リン Eの顕著な発 現が認めちれることが明かとなった。
- 図 2 8は、 ヒ ト子宮平滑筋肉腫組織における 裂期の核内でのサイクリン Eの 発現を示す組織染色写真である。 通常、 細胞增殖を誘導するサイク リン Eは、 細 胞増殖の開始期である G1期に細胞質において過剰に発現し、速やかに核内へと移 行し S期において染色体の合成を開始させる。 その後、 サイクリン Eは、 S期の 後半から即座に分解される。 したがって、 正常な細胞の G2期と M期においては、 サイクリン Eの発現は認められない。しかし、ヒ ト子宫平滑筋肉腫組織において、 分裂期の核内での顕著なサイク リ ン Eの発現が認められる。 つまり、 サイク リ ン Eの発現は、 ヒ ト子宫平滑筋肉腫の鑑別マーカーとして有用である。 産業上の利用可能性
子宮平滑筋における LMP2および Zまたはサイクリン Eの転写または発現を調べ ることにより、 子宮平滑筋組織に子宮平滑筋肉腫が存在するかどうかを検出する ことができ、 LMP2の転写または発現が著しく低い場合および Zまたはサイクリン Ε の転写または発現が高い場合に平滑筋肉腫が存在すると判定することができる。 従来は、 細胞の形態、 .密度、 増殖速度等を指標に子宫平滑筋肉腫を検出していた が、 本発明の方法によれば、 容易にかつ確実に子宮平滑筋肉腫を検出することが できる。 さらに、 本発明の方法によれば、 子宮平滑筋の腫瘍が子宮平滑筋腫であ るか子 ^平滑筋肉腫であるか鑑別することができ、 さらに、 子宮平滑筋肉腫の悪 性度を判定することができる。
また、本発明の LMP2および Ζまたはサイクリン Εをマ一カーとして用いる方法 と、 従来から用いられていた細胞の形態、 密度等を指標にする方法および また はミオシンをマーカーとして用いる方法を組合せることにより、 確実に子宮平滑 筋肉腫を検出することができる。 ·
さらに、 IFN- γシグナル伝達因子： Cある JAK1キナーゼ遺伝子、 STAT1遺伝子お よび LMP2プロモーターの変異と子宮平滑筋^腫の発症が密接に関連しており、上 記遺伝子またはプロモーターの変異を検出することにより、 子宮平滑筋肉腫に罹 患しているか否か、 および子宫平滑筋肉腫に罹患するリスクがあるか否かを判定 することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . LMP2をマーカーとして用い、 子宮平滑筋肉腫を検出する方法。
2 . 子宮平滑筋組織における LMP2の転写または発現の程度を指標に子宮平滑筋 肉腫の存在を検出する方法であって、子宫平滑筋組織における LMP2の転写または 発現を測定し、 LMP2の転写または発現が正常子宮平滑筋組織に比較して少ない場 合に子宮平滑筋肉腫が存在すると判定する方法。
3 . 子宮平滑筋組織における LMP2の転写または発現の程度を指標に子宮平滑筋 の腫瘍が子宮平滑筋腫であるかまたは子宮平滑筋肉腫であるかを鑑別する方法で あって、 子宫平滑筋組織における LMP2 の転写または発現を測定し、 LMP2 の転写 または発現が正常子宮平滑筋組織に比較して少ない場合に子宮平滑筋肉腫である と判定する方法。
4 . 子宮平滑筋組織における LMP2の転写または発現の程度を指標に子宮平滑筋 肉腫の悪性度を判牢する方法であって、子宮平滑筋組織における LMP2の転写また は発現を測定し、 LMP2の転写または発現が正常子宮平滑筋組織に比較して少ない 場合に悪性子宫平滑筋肉腫であると判定する方法。
5 . 採取した子宮平滑筋組織または細胞を用い in s i tu ハイプリダイゼーショ ンを行い LMP2の転写を測定する、 請求項:！〜 4のいずれか 1項に記載の方法。
6 . 採取した子宮平滑筋組織または細胞から LM^2の mRNAを抽出し RT- PCRまた はノーザンブロッ トを行い LMP2の転写を測定する、請求項 1〜4のいずれか 1項 に記載の方法。 .
7 . 採取した子宮平滑筋組織または細胞を用い免疫組織化学染色または免疫細 胞化学染色を行い LMP2の発現を測定する、請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の 方法。
8 . 採取した子宮平滑筋組織または細胞から LMP2タンパク質を抽出しィムノア ッセィを行い LMP2の発現を測定する、請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の方法。
9 . さらに、 ミオシンをマ一カーとして用い、 LMP2およびミオシンの転写また は発現を指標に子宮平滑筋肉腫の存在を検出する方法であって、 LMP2の転写また は発現が正常子宮平滑筋組織に比較して少なく、 かつミオシンの転写または発現 が正常子宮平滑筋組織に比較して多い場合に子宮平滑筋肉腫が存在すると判定す る請求項 1記載の方法。
1 0 . LMP2およびサイクリン Eをマーカーとして用い、 子宮平滑筋肉腫を検出 する方法。
1 1 . 子宮平滑筋組織における LMP2およびサイクリン Eの.転写または発現の程 度を指標に子宮平滑筋肉腫の存在を検出する方法であって、 子宮平滑筋組織にお ける LMP2およびサイク リン Eの転写または発現を測定し、 LMP2の転写または発 現が正常子宮平滑筋組織に比較して少なく、 かつサイクリン Eの転写または発現 が正常子宮平滑筋組織に比較して多い場合に子宮平滑筋肉腫が存在すると判定す る方法。
1 2 . 子宫平滑筋組織における LMP2およびサイクリン Eの転写または発現の程 度を指標に子宮平滑筋の腫瘍が子宮平滑筋腫であるかまたは子宮平滑筋肉腫であ るかを鑑別する方法であって、子宮平滑筋駔織における LMP2およびサイクリン E の転写または発現 測定し、 LMP2の転写また 発現が正常子宮平滑筋組織に比較 .して少なく、 かつサイクリン Eの転写または発現が正常子宮平滑筋組織に比較し て多い場合に子宮平滑筋肉腫であると判定する方法。
1 3 . 子宮平滑筋組織における LMP2およびサイクリン Eの転写または発現の程 度を指標に子宮平滑筋肉腫の悪性度を判定する方法であって、 子宮平滑筋組織に おける LMP2およびサイクリン Eの転写または発現を測定し、 LMP2の転写または 発現が正常子宮平滑筋組織に比較して少なく、 かつサイクリン Eの転写または発 現が正常子宫平滑筋組織に比較して多い場合に悪性子宮平滑筋肉腫であると判定 する方法。
1 4 . 採取した子宮平滑筋組織または細胞を用い in situ ハイブリダィゼーシ ョンを行い LMP2およびサイク リ ン Eの転写を測定する、請求項 1 0〜 1 3のいず れか 1項に記載の方法。
1 5 . 採取した子宮平滑筋組織または細胞から LMP2およびサイクリン Eの mRNA を抽出し RT- PCRまたはノーザンブロッ トを行い LMP2およびサイク リン Eの転写 を測定する、 請求項 1 0〜 1 3のいずれか 1項に記載の方法。
1 6 . - 採取した子宮平滑筋組織または細胞を用い免疫組織化学染色または免疫 細胞化学染色を行い LMP2およびサイクリン Eの発現を測定する、請求項 1 0〜 1 3のいずれか 1項に記載の方法。
1 7 . 採取した子宮平滑筋組織または細胞から LMP2およびサイクリン Eタンパ. ク質を抽出しィムノアツセィを行い LMP2およびサイクリン Eの発現を測定す.る、 請求項 1 0〜 1 3のいずれか 1項に f己載の方法。
1 8 . 少なく とも LMP2 遺伝子断片をプローブまたはプライマ一として含む、 LMP2をマ一カーとして用い子宮平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。
1 9 . 少なく とも LMP2遺伝子断片およびサイクリン E遺伝子断片をプローブま たはプライ'マーとして含む、 LMP2およびサイクリン Eをマーカーとして用い子宫 平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。
2 0 . in situ ハイプリダイゼーション用試薬である請求項 1 8または 1 9に 記載の子宫平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。 .
2 1 . さらに、 ミオシン遺伝子断片をプローブまたはプライマーとして含み、 LMP2 およびミオシンをマ一カーとして用い子宮平滑筋肉腫を検出するための請. 求項 1 8または 2 0に記載の検出試薬。
2 2 . さらに、 ミオシン遺伝子断片をプローブまたはプライマ一として含み、 LMP2、 サイクリン Eおよびミオシンをマーカーとして用い子宫平滑筋肉腫を検出 するための請求項 1 9または 2 0に記載の検出試薬。
2 3 . 少なくとも抗 LMP2抗体を含む、 LMP2 ^マ一カーとして用い子宮平滑筋 肉腫を検出するための検出試薬。
2 4 . 少なく とも抗 LMP2抗体および抗サイク リン E抗体'を含む、 LMP2および サイクリン Eをマーカーとして用い子宮平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。
2 5 . 免疫組織化学または免疫細胞染色用試薬である請求項 2 3または 2 4に 記載の子宮平滑筋肉腫を検出するための検出試薬。
2 6 . さらに、 抗ミオシン抗体を含み、 LMP2およびミオシンをマーカーとして 用い子宮平滑筋肉腫を検出するための請求項 2 3または 2 5に記載の検出試薬。
2 7 . さらに、 抗ミオシン抗体を含み、 LMP2、 サイク リ ン Eおよびミオシンを マーカーとして用い子宮平滑筋肉腫を検出するための請求項 2 4または 2 5に記 載の検出試薬。
2 8 . JA 1キナーゼ遺伝子の以下の （Al)〜 （A6)の変異部位の少なく とも 1つ を含む JAK1キナーゼ遺伝子の部分配列、および LMP2プロモーターの以下の （B1) 〜 （B5)の変異部位の少なく とも 1つを含む LMP2プロモーターの部分配列からな る群から選択される部分配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその標識物であ つて、 1 0から 3 0塩基からなる部 配列またはその部分配列に相補的な配列か らなるオリゴヌクレオチドまたはその標識物：
(Al) A2612A
(A2) G2626A
(A3) G2642T
(A4) A2967C
(A5) A2960C
(A6) A2985T
(Bl) A210G
(B2) C214T 、
(B3) A216G
(B4) A217G
(B5) G219A。
2 9 . プローブとして用いられる請求項 2 8に記載のオリゴヌクレオチドまた はその標識物。 ノ
3 0 . 請求項 2 8記載のオリゴヌクレオチドまたはその標識物を固定化した固 定化基板。
3 1 . JAK1キナーゼ遺伝子の以下の（Al)〜（A6)の変異部位の少なくとも 1つ、 および LMP2プロモーターの以下の （Bl)〜（B5)の変異部位の少なく とも 1つから なる群から選択される変異部位を含む DNA断片の増幅に用いる少なくとも一対の プライマーセッ トであって、上記変異部位の 3 ' 側および 5 ' 側に存在する 1 0か ら 3 0塩基からなる部分配列からなる、 DNA 断片の増幅に用い得る一対のプライ マ.— tッ ト ：
(Al) A2612A
(A2) G2626A
(A3) G2642T (A4) A2967C
(A5) A2960C
(A6) A2985T
(Bl) A210G
(B2) C214T
(B3) A216G
(B4) A217G
(B5) G219A。
3 2 . 請求項 3 1記載のプライマ一セッ ト、 請求項 2 8もしくは 2 9に記載の オリゴヌクレオチドもしくはその標識物、 または請求項 3 0記載の固定化基板を 含む子宮平滑筋肉腫検出キッ ト。
3 3 . 動物から锊取した子宮平滑筋組織または細胞における JAK1キナーゼ遺伝 子の以下の （Al)〜 （A6)の変異部位の少なく とも 1つ、 および LMP2プロモーター の以下の （Bl)〜 （B5)の変異部位の少なく とも 1つからなる群から選択される変 異部位の検出を行い、 その結果に基づいて、 上記変異が存在する場合に、 前記動 物が子宮平滑筋肉腫に罹患している力、、または罹患するリスクが高いと判断する、 子宮平滑筋肉腫の検出方法： ，
(A1) A2612A
(A2) G2626A
(A3) G2642T
(A4) A2967C
(A5) A2960C
(A6) A2985T
(B1) A210G
(B2) C214T
(B3) A216G
(B4) - A217G
(B5) G219A。
3 4 . JAKlキナーゼ遺伝子、 または MP2プライマーの変異の検出を請求項 3 1 記載のプライマ一セッ ト、 請求項 2 8もしくは 2 9に記載のプローブまたは請求 項 3 0記載の固定化基板を用いて行う請求項 3 3記載の方法。
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