WO2007064022A1 - 核酸の調製確認方法 - Google Patents

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WO2007064022A1
WO2007064022A1 PCT/JP2006/324317 JP2006324317W WO2007064022A1 WO 2007064022 A1 WO2007064022 A1 WO 2007064022A1 JP 2006324317 W JP2006324317 W JP 2006324317W WO 2007064022 A1 WO2007064022 A1 WO 2007064022A1
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WO
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nucleic acid
probe
prepared
microarray
rna
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PCT/JP2006/324317
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroyuki Ooshima
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Mitsubishi Chemical Corp
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a method for confirming the success or failure of preparation of a nucleic acid, preferably an miRNA.
  • miRNA is a short single-stranded RNA of 15-25 bases.
  • RNA fraction of the extra chain length in order to improve the labeling efficiency.
  • 200 bases including miRNA from total RNA in advance for the purpose of suppressing cross hypridation. It is necessary to collect only the short RNA fraction of the following grade, label it, and use it for hybridization.
  • Kit protocols for fractionating short RNAs are available from several companies including Ambion and Invitrogen.
  • Methods for fractionating short-chain RNAs include a method of fractionating short-chain RNA from a gel according to the mobility of nucleic acids after electrophoresis using a gel, a method using a silica gel membrane, etc.
  • a method for extracting only short-chain RNA based on the time difference required for passage through an acrylic gel is known.
  • the fractionation range may vary depending on the concentration of the salt solution, the EtOH content, temperature, time, and the like.
  • a method for determining the success or failure of the fractionation operation a method of performing electrophoresis using a high-concentration acrylamide gel and confirming the bun and the condensate can be considered.
  • the bands stained with intercalators etc. in the gel after electrophoresing them are mainly rRNA and tRNA. Since the amount of miRNA of about 20 bases contained in total RNA is very small, its presence cannot often be confirmed as a band unless a large amount of sample is used.
  • An object of the present invention is to provide a method for confirming the success or failure of an operation for preparing a nucleic acid such as miRNA from a sample.
  • the present inventor has conducted intensive research.
  • the present inventor prepared a short-chain nucleic acid containing miRNA from a sample such as total RNA in the presence of a control nucleic acid having approximately the same length as miRNA.
  • a control nucleic acid having approximately the same length as miRNA.
  • the present invention is as follows.
  • a method for confirming the success or failure of a nucleic acid preparation operation comprising the following steps:
  • a method for confirming the success or failure of a nucleic acid preparation operation comprising the following steps:
  • nucleic acid from a sample comprising a control nucleic acid having a length equivalent to the length of the nucleic acid to be prepared and a control nucleic acid having a length of 10 to 100 times the length of the nucleic acid to be prepared;
  • the nucleic acid to be prepared includes, for example, miRNA.
  • the step of preparing the nucleic acid includes, for example, purifying the nucleic acid and labeling the nucleic acid.
  • nucleic acid to be prepared when a nucleic acid to be prepared is prepared from a sample, it is possible to confirm the success or failure of the preparation operation by allowing a control nucleic acid having a length equivalent to the nucleic acid to be present in the sample. .
  • FIG. 1 is a view showing an arrangement fixing device for producing a hollow fiber bundle.
  • FIG. 2 is a diagram showing an image of the microarray after the hybridization in Example 2.
  • the box image shows the positions of probe contl, probe cont2, probe cont4, probe coht5, probe cont6, probe cont7, YLR377C 21W and YLR377C 21b'2 (upper), and YLR377C 21b-3 (lower) in order of left force (Upper panel, lower panel).
  • the present invention is a method for confirming the success or failure of a nucleic acid preparation operation. Specifically, in the present invention, first, a nucleic acid preparation operation is performed in the presence of a control nucleic acid (hereinafter also referred to as “short-chain spike control”) having substantially the same length as the nucleic acid to be prepared. Next, using a microphone array with a captive probe having a sequence complementary to the spike control, the prepared nucleic acid is hybridized, and then the signal of the short spike control exceeds a certain level. If the value can be detected, it is confirmed that there is no problem in the nucleic acid preparation operation, or if the signal is not detected, it is confirmed that the nucleic acid has been lost in the pre-hybridization preparation operation. It is.
  • a control nucleic acid hereinafter also referred to as “short-chain spike control”
  • a nucleic acid preparation operation if an appropriate preparation operation is performed, it is empirically clear that the sample is not mixed with the prepared sample (hereinafter referred to as “long”). There may also be additional chain spike control). In this embodiment, if the signal of the long chain spike control is not detected, it is confirmed that there is no problem in the preparation operation itself, or if the signal of the long chain spike control is detected at a certain value or more. During the preparation operation, it is confirmed that a nucleic acid longer than the length to be fractionated is mixed in the prepared nucleic acid.
  • nucleic acid to be prepared or “nucleic acid to be prepared” means a nucleic acid that is targeted to be obtained from a starting sample by a preparation operation.
  • the present invention provides a means for confirming whether or not a nucleic acid to be prepared has actually been prepared.
  • a nucleic acid preparation operation can be performed from the spike control and the detection result of the microarray using the probe mounted on the microarray. It becomes possible to confirm whether or not. For example, if the signal cannot be confirmed in the microarray analysis of the target nucleic acid (for example, miRNA) by the method of the present invention, the target nucleic acid can be detected in the original starting sample. It can be confirmed whether or not the nucleic acid for preparation was lost in the preparation operation. '
  • a spita control is a nucleic acid added to a starting sample.
  • the spike control of the present invention may be either DNA or RNA, but those skilled in the art can appropriately select the type of nucleic acid in consideration of the nucleic acid to be prepared, the preparation conditions, and the like.
  • the spike control of the present invention is preferably the same type as the nucleic acid in terms of matching efficiency with the nucleic acid to be prepared.
  • the spike control is preferably DNA.
  • the spike control may be either RNA or DNA.
  • RNA is preferable in that the labeling efficiency coincides with the nucleic acid to be prepared, and the signal intensity is strong, and DNA is preferable in terms of production stability and ease of operation.
  • a person skilled in the art can appropriately select the type of nucleic acid to be used for spike control from DNA and RNA.
  • the spike chondrol of the present invention can be synthesized by a known method.
  • it can be synthesized using a commercially available nucleic acid synthesizer such as Applied Biosystems 3400 DNA synthesizer.
  • the spike control of the present invention can also be obtained by using PCR in which a nucleic acid containing the spike control sequence is in the form of a cage.
  • a nucleic acid containing the spike control sequence is in the form of a cage.
  • Fowa one de primer one used for PCR 5 'end by using the primer phosphorylated, one may obtain single-stranded DNA by exonuclease treatment
  • the resulting PCR products were obtained c may chains DNA can be used as a spike control.
  • the spike control of the present invention is RNA, a transcript is used. It is also possible. ⁇ '
  • the spita control added to the starting sample may be one type of nucleic acid or a plurality of types of nucleic acid.
  • each control may be added in the same amount, or different amounts may be added for each control.
  • Each spike control may be added separately to the starting sample, or mixed prior to the starting sample. .
  • a short spike control may be added to the starting sample.
  • a long chain spike control may be further added to the starting sample. The short chain spike control and long chain spike control are described below.
  • a control nucleic acid having the same or almost the same length as the nucleic acid to be prepared is also referred to as a “short spike control”. '
  • “equivalent length” or “approximately the same length” means the same length as the length of the nucleic acid to be prepared or the length of the nucleic acid ⁇ 100 to 0 bases, preferably ⁇ 10 ⁇ 0 bases, more preferably ⁇ 6-0 bases, more preferably ⁇ 1-0 bases in length
  • the short spike control is prepared with the nucleic acid to be prepared and analyzed by microarray.
  • the short spike control is added to the starting sample to determine the presence or absence of the nucleic acid to be prepared in the sample to be analyzed by microarray. Therefore, it is desirable that the short spike control is a sequence that does not cross-hybridize with the probe corresponding to the nucleic acid to be prepared mounted on the array in the microarray analysis. That is, it is preferable to design the short spike control tool so as to have a low homology with the nucleic acid to be prepared in consideration of the homology with the nucleic acid to be prepared. Homology can be obtained by obtaining known sequence information from an existing database and using a known homology search software. wear.
  • the short spike control role with low homology to the nucleic acid to be prepared is designed based on the sequence of a gene that is specifically expressed in a species different from the species from which the starting sample is derived.
  • short-chain spike control is also possible for nucleic acids that are highly hybridized under stringent conditions with nucleic acids containing a base sequence complementary to the spike control as described above, and that have low homology to the nucleic acids that are to be prepared. Can be used as
  • the stringent conditions are the conditions at the time of washing after hybridization, and the salt concentration is 100 to 1000 mM, the temperature is 40 to 75 ° C., preferably the salt concentration is 100 to 500 mM, This means that the temperature is between 40 ° C and 60 ° C.
  • conditions such as 50 ° C with 2xSSC can be mentioned.
  • a short spike control can be designed based on either or both of the following conditions (i) and (ii).
  • a sequence that meets the conditions (i) and (ii) may be searched from a random 21-base sequence composed of A, T, G, and C.
  • a homology search may be performed with miRBase, a miRNA database, to confirm that the similarity to miRNA is sufficiently low.
  • miRBase a miRNA database
  • a long control nucleic acid which is empirically clear that it will not be mixed into the prepared sample if it is appropriately prepared, is also referred to as “long-chain spike control”.
  • Appropriate preparation operations include, for example, operations according to the instructions attached to the kit used for the preparation operation.
  • Nucleic acid lengths that are empirically apparent not to be contaminated can be, for example, nucleic acid lengths outside the fractional range described in the instructions attached to the kit.
  • the long spike control is a control having a length of 10 to 100 times, preferably 10 to 5 times, more preferably 10 to 20 times the length of the nucleic acid to be prepared. It is a nucleic acid.
  • Long-chain spike control is used to determine whether or not a nucleic acid of a length that is empirically clear from the appropriate preparation procedure in the process of preparing the nucleic acid to be prepared has been mixed by actual operation. Is added to the sample to determine Therefore, the base length of the long-chain spike control needs to be sufficiently longer than the expected length to be fractionated by the preparation operation, or in some cases, sufficiently short.
  • Nucleic acid lengths that are not contaminated by appropriate preparation operations depend on the nature of the preparation operation. For example, when performing a preparative operation using a column, if the amount of ethanol input is less than expected, longer RNA strands may be mixed into short RNA. The temperature during the preparation operation and the time required for the preparation may also affect the fractionation range.
  • the long-chain spike control is a sequence that does not cross-hybridize with the probe corresponding to the nucleic acid to be prepared mounted on the array in the microarray analysis. That is, the long-chain spike control is preferably designed to have low homology with the nucleic acid to be prepared in consideration of homology with the nucleic acid to be prepared. Homology can be determined as described above.
  • the long spike control with low homology to the nucleic acid to be prepared is designed based on the sequence of a gene that is specifically expressed in a species different from the species from which the starting sample is derived.
  • nucleic acid that is hybridized under stringent conditions with a nucleic acid containing a complementary base sequence to the spike control as described above, and a nucleic acid with low homology to the nucleic acid to be prepared should also be used as a long-chain spike control. Can do.
  • a long-chain spita control can be designed based on the sequence information of yeast YLR377C.
  • yeast YLR377C When the genomic DNA of yeast YLR377C is amplified by PCR using the following primer, a 300 base pair PCR product can be obtained. At this time, if a forward primer whose 5 'end is phosphorylated is used, the resulting PCR product is treated with strandase TM ⁇ Exonuclease (manufactured by Novagen) etc. to make a single strand. Troll (ssYLR377C 300b).
  • Reverse primer CTACTGTGACTTGCCAATATGGTCTAAAAA (SEQ ID NO: 1 4)
  • nucleic acid to be prepared means a nucleic acid targeted for acquisition from a starting sample by a preparation operation.
  • the nucleic acid to be prepared is not limited as long as it can be fractionated from the whole nucleic acid contained in the sample using a certain nucleic acid length as an index, but includes short-chain nucleic acids such as short-chain RNA. be able to.
  • the short-chain nucleic acid include a nucleic acid having 150 to 15 bases, preferably 50 to 15 bases, more preferably 25 to 15 bases.
  • the nucleic acid to be prepared is, for example, miRNA.
  • the above spike control is added to the starting sample, and nucleic acid is prepared from the sample containing the spike control.
  • the origin of the starting sample is not particularly limited, and examples thereof include mammals, plants, insects, nematodes, and other derived samples.
  • the starting sample used in the present invention may be a tissue, a cell, a cell extract or the like as long as it is derived from the above, and, like the total RNA obtained from the cell extract, an intermediate stage of nucleic acid purification operation It may be a sample.
  • total RNA derived from a mouse can be extracted by a known method such as AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol chloroform) method. ',
  • the amount of spike control added to the starting sample is appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the amount or concentration of the nucleic acid to be prepared in the starting sample, the detection limit of the detection device used, the dynamic range, etc. can do.
  • an amount that can be sufficiently detected after hybridization is added based on the performance of the detection device used.
  • the long chain control should be added so that the amount of the labeling substance involved in the detection can be sufficiently detected by a predetermined method. ⁇ . If too much spike control is added, non-specific signals may be generated, or long spike control may be mixed into the short nucleic acid fraction. When these phenomena are resolved as a result of hybridization, the amount of spike control added can be adjusted.
  • both short-chain spike control and long-chain spike control are 0.1 pg to 10000 ng / 50/1, preferably lpg to: l000 ng / 50 1, more preferably 10 pg to 100 ng / 50 / l can be added to the starting sample.
  • the starting sample is 12.5 g of total RNA and the purification scale is 50 ⁇ l start
  • the amount of each short spike control added is 50 pg to 500 pg
  • the amount of each long spike control is 5 ng. (Example 2).
  • the spike concentration of each spike control can be changed as appropriate.
  • the nucleic acid preparation operation includes a nucleic acid purification operation and a Z or nucleic acid labeling operation.
  • the order of the nucleic acid purification operation and the nucleic acid labeling operation is not particularly limited, and any operation may be performed first or simultaneously.
  • Nucleic acid This preparation operation may include a purification operation or a labeling operation multiple times, such as when a labeling operation is performed subsequent to the purification operation and a further purification operation is performed.
  • a known nucleic acid purification method can be used for the purification operation.
  • the nucleic acid to be prepared can be purified from the sample by the guanidine hydrochloride method or the phenol extraction method.
  • a nucleic acid to be prepared can be purified using a commercially available kit.
  • a total RNA extraction kit such as ISOGEN, Trizol, or RNeasy or an RNA purification kit can be purchased and used for the purification operation of the present invention.
  • the nucleic acid to be prepared can be purified according to the instructions attached to the kit.
  • the prepared nucleic acid is supplied to a microarray, the prepared nucleic acid is used in a cross-hyperpreparation from the viewpoint of improving the detection sensitivity of the microarray and by reducing the number of self-rows contained in the sample. From the viewpoint of suppressing dialysis, it is preferable to obtain a nucleic acid within the range of at least ⁇ 500 bases from the length of the target nucleic acid by fractionation. In order to obtain a nucleic acid having a desired length, column fractionation or ethanol precipitation can be used. Nucleic acids can be fractionated into short-chain nucleic acids and long-chain nucleic acids by the method described in Example 2 if they are arranged.
  • the nucleic acid to be prepared is miRNA
  • the known guanidine hydrochloride method X can be converted to low molecular weight RNA of 200 bases or less by column fractionation after phenol extraction.
  • it can be prepared with mirVana miRNA Isolation kit (Ambion).
  • nucleic acid labeling method can be used for the labeling operation.
  • nucleic acid samples such as a method that incorporates aminoallyl-dUTP at the time of reverse transcription using a random primer, a method that incorporates a labeling substance via aminoallyl, a method that uses a T4 RNA Ligase to label nucleic acid, and a method that uses end-labeling with piotin hydrazide.
  • the nucleic acid to be prepared can be labeled using a commercially available kit.
  • nucleic acids may be directly labeled using ULYSIS Alexa Fluor from Invitrogen or PlatinaBright from KREATECH Biotechnology BV,
  • a kit such as mirVana miRNA Labeling Kit manufactured by Ambion may be purchased and used for the labeling operation of the present invention.
  • the nucleic acid to be prepared can be labeled according to the instructions attached to the kit.
  • the nucleic acid is labeled with a radioisotope, a fluorescent label, an enzyme label or the like.
  • fluorescent labeling for example, labeling with Cy3, Cy5, FAM, Alexa Flour (registered trademark), DY-647, PacificBlue TM can be mentioned.
  • the microarray is used to immobilize oligonucleotide probes, cDNA probes (hereinafter also referred to as “probes”) in a plurality of sections, monitor gene expression patterns, and novel genes.
  • probes cDNA probes
  • Various forms of microarrays are known. For example, a microarray in which probes are fixed at high density on a substrate using optical lithography technology, a microarray in which probes are fixed on a glass substrate by spotting, and the like are known.
  • a fiber type microarray is also known (see Japanese Patent No. 3 5 10 8 8 2).
  • microarray a microarray in which a plurality of through holes exist in the substrate and the probes are fixed by using gels in the through holes is preferably used.
  • examples of such a microarray include a microarray described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 20:00 — 6055 4 and a fiber type microarray.
  • the fiber-type microarray can be produced, for example, through the following steps a) to d). a) A step of producing an array by arranging a plurality of hollow fibers in three dimensions so that the longitudinal directions of the hollow fibers are the same.
  • a gel precursor polymerizable solution containing a nucleic acid probe is introduced into the hollow part of each hollow fiber of the block body, a polymerization reaction is performed, and the gel-like substance containing the nucleic acid probe is held in the hollow part.
  • hollow fiber materials include nylon 6, nylon 66, polyamide hollow fibers such as aromatic polyamide, polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, polylactic acid, polyglycolic acid, and polycarbonate.
  • Polyester hollow fibers acrylic hollow fibers such as polyacrylonitrile, polyolefin hollow fibers such as polyethylene polypropylene, polymethacrylate hollow fibers such as methyl polymethacrylate, and polyvinyl alcohol hollow fibers
  • Polyvinylidene chloride hollow fiber, polyvinyl chloride hollow fiber, polyurethane hollow fiber, phenol 3 ⁇ 4 hollow fiber, polyvinylidene fluoride is a fluorine-based hollow fiber made of polytetrafluoroethylene, polyalkylene, etc. Paraoxybenzoate hollow fiber Etc.
  • the hollow fibers are arranged three-dimensionally so that their longitudinal directions are the same.
  • an arrangement method for example, a method in which a plurality of hollow fibers are arranged in parallel at a predetermined interval on a sheet-like material such as an adhesive sheet to form a sheet, and then the sheet is wound spirally (Japanese Patent Laid-Open No. 11). 1 0 8 9 2 8).
  • two perforated plates each having a plurality of holes provided at a predetermined interval are overlapped so that the hole portions coincide with each other, hollow fibers are passed through the hole portions, and the interval between the two perforated plates is increased.
  • There is a method of opening and filling the periphery of the hollow fiber between the two porous plates with a curable resin raw material and curing see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-133-4553).
  • the array is then embedded so that the array is not disturbed.
  • Examples of the embedding method include a method of pouring a polyurethane resin, an epoxy resin or the like into a gap between fibers, and a method of bonding fibers by heat fusion.
  • a gel precursor polymerizable solution containing a nucleic acid probe is introduced into the hollow part of each hollow fiber of the embedded array, and a polymerization reaction is performed in the hollow part. As a result, the gel is held in the hollow portion, and the nucleic acid probe is fixed to the gel.
  • gel precursor solutions include acrylic amide, N, N-dimethyl attaly Noreamide, N-isopropylacrylamide, N-acryloylaminoethoxy alcohol, N-acryloylaminobromanol, N-methyl linoleoamide, N_vinylpyrrolidone, hydroxyl
  • monomers such as shetyl methacrylate, (meth) acrylic acid, allyldextrin, and methylene bis (meth) allylamide, polyethylene dairy coal (crosslinkable monomer) Meta) Atallate is included.
  • the nucleic acid probe is chemically bonded to the gel structure by copolymerizing with the gel precursor via the end of the nucleic acid probe (Japanese Patent Laid-Open No. 20-210). 4-1 6 3 2 1 1).
  • the block is cut into thin pieces in the direction crossing the longitudinal direction of the hollow fiber.
  • the slices produced here can be used as micro and array.
  • the thickness of the microarray is about 0.1 mm to 1 mm. The cutting can be performed by, for example, a microtome or a laser.
  • the probe is fixed to the hollow portion of the hollow fiber, that is, the gel in the through hole of the microarray. Therefore, since the probe is fixed to the three-dimensional structure, the probe is fixed in a certain space.
  • the surrounding environment, where the probe is fixed has spatial freedom, and different types of probes are fixed across a physical partition. Therefore, the above microarray is different from a microarray in which probes are fixed at a high density on a flat substrate, and the probes mounted on it function sufficiently as probes, and further, with different types of adjacent probes. There is no non-specific reaction. Therefore, the probe can be designed and fixed to the microarray without the need to bind extra sequences that are not involved in the hyper-precipitation such as linkers and spacers.
  • the probe mounted on the microarray includes a nucleic acid which is a preparation object, for example, a nucleic acid containing a sequence complementary to miRNA.
  • a microarray equipped with a probe containing a sequence complementary to the nucleic acid to be prepared When the nucleic acid to be prepared is miRNA, the sequence is complementary to miRNA, particularly mature miRNA. My with a probe containing a complementary sequence It is preferable to use a chromoarray. '''
  • nucleic acid sequence information can be obtained from Genbank.
  • miRNA sequence information can be obtained by accessing miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/).
  • miRBase http://microrna.sanger.ac.uk/.
  • a person skilled in the art can appropriately design and synthesize a probe to be mounted on the microarray of the present invention from known sequence information.
  • a nucleic acid having a random sequence can also be used as the probe.
  • a nucleic acid having a random sequence can be appropriately designed and synthesized by those skilled in the art.
  • the probe mounted on the microarray includes a nucleic acid containing a sequence complementary to the spike control of the present invention as a probe for detecting the spike control of the present invention.
  • the probe sequence may be any sequence that specifically hybridizes to the spike control in the microphone array analysis. That is, the probe only needs to be a nucleic acid that hybridizes only with the spiter control in the prepared nucleic acid sample used for hybridization.
  • probe contl ATACTACGGTAACGGGCCTGT (SEQ ID NO: 7) probe cont2 GGAAGAAACGTCGACCCAAAG (-SEQ ID NO: 8) probe cont4 TACGGAAGGTCCGGCATACAA (SEQ ID NO: 9) probe cont5 TGCTCGACAACGATTGGCAAG (SEQ ID NO: 10) probe cont6 TTGCGGTACGACCGACGCGTGTT 2) Long-chain spike control when the nucleic acid to be prepared is miRNA
  • Examples of the probe for detecting include the following DNAs containing a sequence complementary to ssYLR377C.
  • the chain length of the probe mounted on the microarray is 10 to 100 bases, preferably 10 to 40 bases.
  • the probe may be a nucleic acid such as DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • the probe can be synthesized by a known method.
  • it can be synthesized by a method such as a phosphodiester method, a phosphotriester method, or a solid phase phosphoramidide method.
  • it can be synthesized by using a DNA automatic synthesizer sold by Toyo.
  • the probe is fixed to a plurality of sections of the microarray. Only one type of probe may be fixed to each section, or multiple types of probes may be fixed.
  • the fixing method differs depending on the form of the microarray.For example, if the microarray is manufactured using a photomask, it is not necessary to synthesize and prepare the probe in advance as described above. It can be synthesized sequentially. If the microarray is made by spotting, prepare probes in advance, attach appropriate functional groups to the probes, and spot the solution containing the probes on the substrate. At this time, the probe is fixed by a chemical bond between the functional group introduced into the probe and the substrate (the surface is modified if necessary). If necessary, a linker having an appropriate chain length can be bound to a probe complementary to miRNA.
  • RNA examples include endogenous small molecule RNA such as ribosomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA), small nucleolar ribonuleoprotein particle RNA (snoRNA), and small nuclear RNA (Ul to Ul8 snRNA).
  • endogenous small molecule RNA such as ribosomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA), small nucleolar ribonuleoprotein particle RNA (snoRNA), and small nuclear RNA (Ul to Ul8 snRNA).
  • rRNA ribosomal RNA
  • tRNA transfer RNA
  • snoRNA small nucleolar ribonuleoprotein particle RNA
  • small nuclear RNA Ul to Ul8 snRNA
  • 5SrRNA, 5.8SrRNA, UlsnRNA, U2snRNA, U3snRNA, U4snRNA, U5snRNA, U6snRNA, and Arg-tRNA are preferably used as the endogenous small RNA.
  • the prepared solution containing the nucleic acid sample is applied to the above microarray, and hybridization between the nucleic acid sample and the probe is performed. After the hybridization operation, necessary operations such as washing are performed to detect the labeled compartment on the microarray, that is, the compartment forming a hybrid with the probe.
  • the detection method the device and the detection method are appropriately selected according to the labeled sample.
  • the time of cleaning it may be changed step by step from a weak condition to a strong condition (step cleaning).
  • the washing strength means the strength of the action of dissociating the hybridization between the nucleic acid sample and the probe.
  • the cleaning conditions are adjusted to the probe with the lowest stringency among the probes mounted on the microarray, and cleaning and detection are performed.
  • the probe is washed step by step until the washing condition of the probe having the highest stringency, and the hybrid is detected each time.
  • the cleaning effect depends on the salt concentration of the cleaning solution, the cleaning temperature, the amount of the cleaning solution, the cleaning time, etc.
  • the influence of the salt concentration and temperature on the cleaning effect is determined by the relationship with the nucleic acid composition of the probe.
  • the salt concentration is kept constant and the temperature of the cleaning solution is changed stepwise.
  • the salt concentration is arbitrarily selected (however, a value within the applicable range of the Tm (melting temperature) calculation formula is selected).
  • the probe having the minimum Tm is calculated from the Tm calculation formula.
  • the minimum Tm value preferably a temperature of the cleaning solution which is lower than the minimum value by c or more, is selected as the first stage cleaning condition.
  • the maximum Tm value of the probes also mounted on the array preferably at least 2 steps to the temperature higher than the maximum value by 1 ° C or more, cleaning solution temperature Change the cleaning procedure. .
  • the temperature of the cleaning liquid is kept constant and the salt concentration in the cleaning liquid is changed stepwise.
  • the cleaning temperature is arbitrarily selected first (however, a value that can be obtained from the salt concentration within the applicable range of the Tm calculation formula is selected).
  • the probe with the smallest Tm is calculated from the Tm calculation formula, and the minimum Tm value is the same as or better than the specified cleaning solution temperature.
  • the salt concentration of the cleaning solution calculated to be higher than 1 ° C was selected as the first-stage cleaning condition, and then the maximum Tm value of the probe mounted on the microarray was specified.
  • This is a method in which the cleaning operation is performed by changing the salt concentration of the cleaning solution at least in two or more stages until the salt concentration is calculated to be 1 ° C or more lower than the cleaning solution temperature.
  • the preparation operation itself such as the purification operation and the labeling operation, should be judged successful. Can do.
  • the signal is not detected (or if it is detected at a value less than a certain value), it can be determined that the preparation operation of the nucleic acid before hyperpridation was not successful. Possible causes of the failure of the preparation operation include the loss of nucleic acid during the purification operation, or the fact that the labeling operation was not performed as expected.
  • “a value above a certain value” is, for example, the value obtained by adding the signal average value of multiple background spots to the signal standard deviation of the background spot 3 times. .
  • the long-chain nucleic acid to the prepared nucleic acid It can be judged that the preparation operation was successful even though the contamination of the mixture was sufficiently suppressed.
  • long chain spike control port If the signal is detected at a certain level or higher, it can be determined that the preparation operation was not successful.
  • the cause of the failure of the preparation operation may be that a nucleic acid longer than the standard to be fractionated was mixed in the short RNA during the purification operation.
  • the present invention can also be provided as a kit for confirming the success or failure of nucleic acid preparation operations.
  • This kit includes reagents necessary for confirming the success or failure of nucleic acid preparation operations, such as short-chain spike control, long-chain spike control, and complementary to these control tools.
  • reagents necessary for confirming the success or failure of nucleic acid preparation operations such as short-chain spike control, long-chain spike control, and complementary to these control tools.
  • Some or all of microarrays on which probes containing sequences are mounted, reagents for nucleic acid preparation, reagents for microarrays, instructions for use, etc. are included, but are not limited thereto.
  • the kit may include a container necessary for confirming the success or failure of the nucleic acid preparation operation.
  • the nucleic acid to be prepared is a short-chain nucleic acid (for example, 15 to 25 bases), it is difficult to obtain an internal control for comparing the signal intensity between samples after the purification operation.
  • This short spike control can also be used as a control to correct errors in operations such as purification, labeling, and hybridization.
  • one probe was prepared to capture Arg-tRNA.
  • the miRNA detection array was equipped with the nine types of probes described in (2), and a microarray equipped with all 190 probes was used.
  • oligo DNAs were mounted on a miRNA detection microarray as follows.
  • the oligonucleotides that serve as probes were synthesized using an automated DNA synthesizer.
  • aminolink TM manufactured by PE Biosystems
  • oligonucleotide is reacted with the oligonucleotide, followed by deprotection, whereby aminohexyl is added to the end of each oligonucleotide.
  • a 5'-0-aminohexyligonucleotide into which a group was introduced was prepared. .
  • a hollow fiber bundle was manufactured using the array fixing device shown in FIG.
  • X, y, and z are orthogonal three-dimensional axes, and the X axis coincides with the longitudinal direction of the fiber.
  • a porous plate with a thickness of 0.1 mm provided with a total of 144 pieces in each of 1 and 2 rows in a vertical and horizontal direction, with a hole having a diameter of 0.32 mm and a distance between the centers of the holes being 0 and 42 mm.
  • 2 1 Two sheets were prepared. These perforated plates were overlapped, and polycarbonate hollow fibers 3 1 (Mitsubishi Engineering Plastics Co., Ltd., 1 mass% added carbon black) were passed through all the holes one by one.
  • the resin raw material was poured into the container from the upper part of the container.
  • the resin is 2.5 masses based on the total weight of polyurethane resin adhesive (Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd. Nipponran 4276, Coronate 4403). /. Use the one with the power of Bon Black did.
  • the resin was cured by standing at 25 ° C for 1 week. Next, the porous plate and the plate-like material were removed to obtain a hollow fiber bundle.
  • a gel precursor polymerizable solution containing the probe nucleic acid was placed in a desiccator. After reducing the pressure inside the desiccator, one end of the hollow fiber bundle where the fiber bundle was not fixed was immersed in this solution. Nitrogen gas was sealed in the desiccator, and a gel precursor polymerizable solution containing a capillary probe was introduced into the hollow portion of the hollow fiber. Next, the inside of the container was brought to 70 ° C., and a polymerization reaction was carried out over 3 hours.
  • the obtained hollow fiber bundle was sliced in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the fiber using a microtome to obtain 50 thin sheet (DNA microarray) having a thickness of 0: 5 mm.
  • probe contl ATACTACGGTAACGGGCCTGT (SEQ ID NO: 7) probe cont2 GGAAGAAACGTCGACCCAAAG (SEQ ID NO: 8) probe cont4 TACGGAAGGTCCGGCATACAA (SEQ ID NO: 9) probe cont5 TGCTCGACAACGATTGGCAAG (SEQ ID NO: 1 0) probe cont6 TTGCGGTACGACCGATCAGTT (SEQ ID NO: 1 1) probe cont7 TCGCTTTGACACGTAATGCGG (SEQ ID NO: 1 2) DNA was synthesized using an automatic DNA synthesizer. '
  • a 300 base pair PCR product was obtained from the yeast YLR377C gene using the following primer designed based on the yeast YLR377C gene sequence.
  • Reverse primer CTACTGTGACTTGCCAATATGGTCTAAAAA (SEQ ID NO: 1 4)
  • the forward primer uses a primer that is phosphorylated at the 5 'end.
  • the resulting PCR product is treated with strandase TM ⁇ Exonuclease (Novagen) to make a single strand, and spiked.
  • Control The name of this control is ssYLR377C 300b.
  • the sequence of ssYLR377C 300b is SEQ ID NO:
  • the probe was synthesized using an automatic DNA synthesizer.
  • Example 2 miRNA microarray analysis
  • the spike control synthesized in Example 1 was mixed as follows. Contl 5 ⁇ 1
  • RNA was eluted with the labeling buffer 251 attached to ULYSIS Alexa Fluor 647 labeling kit (Invitrogen). The obtained RNA was designated as short RNA.
  • RNA was eluted with 25 ⁇ l of labeling buffer attached to ULYSIS Alexa Fluor 647 labeling kit (Invitrogen). The obtained RNA was designated as long RNA.
  • the long RNA was labeled in the same manner as the labeling of the short RNA of (4).
  • the short RNA and long RNA labeled in (4) and (5) were prepared so that the final concentration was 2xSSC, 0.2% SDS, and the amount of solution was 1501. After the preparation, the mixture was heated at 70 ° C. for 2 minutes, centrifuged at lOOOOrpm for 2 minutes, and subjected to hybridization using the miRNA array prepared in Example 1.
  • Hybridization was carried out at 50 ° C for 16 hours under light-shielded conditions.
  • Washing was performed at 2xSSC, 0.2% SDS, 50 ° C for 40 minutes, and then at 2xSSC, 50 ° C for 10 minutes.
  • each probe spot of the microarray after hybridization was imaged and digitized using a cooled CCD camera type fluorescence detector.
  • Figure 2 shows the microarray image after hybridization.
  • the upper panel in Fig. 2 shows the image obtained when labeling and hybridizing long RNA.
  • the lower panel in Figure 2 is an image obtained when hybridizing short RNA.
  • the white solid box indicates the position of the probe (probe contl, 2, 4-7) to detect the short chain spike control
  • the white dashed box indicates The position of the probe (YLR377C 21b-l to 3) for detecting the long-chain spike control is shown.
  • RNA When long RNA is hybridized, a signal is detected in the probe for the long spike control (white broken part), and no signal is detected in the probe for the short spike control (white solid line part). (Upper panel). On the other hand, when short-stranded RNA is hybridized, a signal is detected in the probe for the short spike control (white solid line portion), and a signal is detected in the probe for the long spike control (white dashed line portion). None (lower panel). Therefore, in this example, it can be determined that the fractionation operation of long RNA and short RNA functioned effectively.
  • the signal from the probe for miRNA detection when hybridizing short RNA was sufficiently strong compared to the result of hybridization of long RNA (lower panel in Fig. 2). Compared to the probe signal corresponding to trawl, it was sufficiently strong. Therefore, it is considered that the miRNA detection probe is functioning sufficiently.
  • the miRNA probe spot in which a signal was detected in long-chain RNA (Fig. 2, upper panel) is considered to detect a pre-stressed miRNA.
  • SEQ ID Nos: 1 to 18 synthetic DNA

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Abstract

本発明は、核酸の調製操作の成否を確認する方法であって、以下の工程：(a) 調製目的となる核酸の長さと同等の長さを有する対照核酸を含む試料から、核酸を調製する工程、及び(b) 調製後の核酸をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせ、前記対照核酸に相補的な配列を含むプローブとハイブリダイズした、前記対照核酸のシグナルを検出する工程を含む、前記方法に関する。

Description

核酸の調製確認方法
技術分野 '
本発明は、 核酸、 好ましくは miRNAの調製操作の成否を確認するだめの方法 に関する。
背景技術 明 ,
miRNA (マイクロ RNA) は 15〜25.塩基の短い 1本鎖 RNAで、 この miRNA 書
が mRNAの 3末端の UTR領域に結合することで、様々な翻訳制御を行っている ことが、 近年報告されている。 miRNA概念の発見は 1993年に初めて報告されて いるが （Cell 75(3)., 843-854, 1993)、 miRNAが上記のように翻訳制御機構にお いて大きな役割をなしていることが発見されたのは、 2001 年以降である （Cell 107(7).， 823-826, 2001、 Cell 116(2)., 89·92, 2004)。 当初、 miRNAは線虫、 酵 母などから発見されてきたが、 現在はヒ 卜で 2 5 5個、 マウスで 1 8 4個発見さ れている。 これらの配列は公知であり、 公共の DBにアクセスすることにより、 酉己 歹 IJ 情 報 等 を 取 得 す る こ と 力 S で き る ( URL:http：〃 www.biocenter.helsinki.fi/bi/rnd/biocomp/DB l.HTM#RNADB、 URL:http：〃 www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna一 list. html)。 レヽく つかの miRNAは、 機能 （翻訳抑制機能） が解明されているが、 多くの miRNA の機能は不明である。
これまでに、 miRNA の発現レベルは、 ノーザンプロッ ト解析や、 クローニン グなどの手法によって検索されてきたが、 よりハイスループッ 卜な手法として、 miRNA検出用のマイクロアレイが開発されてきている。
マイクロアレイを用いて miRNAを検出するためには、 標識効率を向上させる 目的で、 余分な鎖長の RNA分画を排除する必要がある。 また、 ク ロスハイプリ ダイゼーシヨンを抑制する目的で、予め Total RNAから miRNAを含む 200塩基 以下程度の短鎖の RNA分画のみを分取し、 それ 標識してハイブリダィゼ一シ ヨンに供する必要がある。
短鎖 RNAを分画するためのキッ トゃプロ トコールは、 Ambion、 Invitrogenな どの複数の会社から提供されている。短鎖 RNAを分画するための手法と しては、 ゲルを用いて電気泳動した後、 核酸の移動度に従って、 短鎖 RNA をゲルから切 り出す分画方法、 シリカゲルメンブレン等を用いた手法、 アク リルアミ'ドゲルの 通過にかかる時間差によって、 短鎖 RNAのみを抽出する方法が知られている。
しかしながら、 上記のような方法を使用する場合は、. 分画操作の操作再現性を 得ることが困難である場合が多い。 例えば、 市販のカラム精製キッ トを用いる場 合は、 分画される範囲は、 塩溶液の濃度、 EtOHの含有比率、 温度、 時間等によ つて変化する場合があることが知られている。
そこで、 短鎖 RNA を分画後、 分画操作の成否を判断する必要がある。 分画操 作の成否の判断方法には、 高濃度のアク リルアミ ドゲルを用いて電気泳動し、 バ ン,ドの確認をする方法が考えられる。
しかし、 200塩基以下程度の短鎖 RNAに分画した場合でも、 それらを電気泳 動した後のゲルにおいてインタ一カレ一タ等で染色されるバンドは、 rRNA や tRNAが主である。 Total RNA中に含まれる 20塩基程度の miRN Aの量は非常に 少ないため、 多量のサンプルを使用しなければその存在がバンドとして確認でき ないことが多い。
一方、短鎖 RNA分画操作において、本来取り除かれるべき長鎖 RNAが短鎖分 画に混入する可能性も否定できない。長鎖 RNAが短鎖 RNA分画に混入すること により、 短鎖 RNA に含まれる鎖長のプロファイルが大きく変わると、 標識効率 に大きな影響を与えることが考えられるため、 望ましいことではない。
以上のように、 現状の実験手法では、 分画操作によって total RNA から短鎖 RNA、特に miRNAが取得されていることを確認する手段が無いに等しレ、。また、 それらの核酸に対する標識操作の成否を確認することも困難である。したがって、 miRNA の存在の有無、 標識操作の成否等が確認されていないサンプルを、 マイ クロアレイに対してハイブリダイゼーションし、 シグナルがほとんど得られない 場合、 もともとのサンプル中に miRNAが存在し 'いの力、、 あるいは、 分画及び 標識等の調製操作に問題があつたのかが、 マイクロァ.レイのデータからだけでは 判別することはできなかった。
発明の開示
本発明は、 試料から核酸、 例えば miRNAを調製する操作の成否を確認するた めの方法を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するために、 鋭意研究を行った。 本発明者は、 miRNAとほぼ同一長の対照核酸の存在下で、 total RNAなどの試料から、 miRNA を含む短鎖核酸を調製した。 得られた核酸を、 対照核酸の相補配列を含むプロ一 ブを 載したマイクロアレイで解析すると、対照核酸のシグナルの有無によって、 核酸調製操作の成否を判断することが可能となることを見出し、 本発明を完成し た。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 核酸の調製操作の成否を確認する方法であって、 以下の工程 ：
(a) 調製目的となる核酸の長さと同等の長さを有する対照核酸を含む試料から、 核酸を調製する工程、 及び
(b) 調製後の核酸をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダィズさせ、 前記対 照核酸に相補的な配列を含むプローブとハイブリダィズした、 前記対照核酸のシ グナルを検出する工程
を含む、 前記方法。
( 2 ) 核酸の調製操作の成否を確認する方法であって、 以下の工程 ：
(a) 調製目的となる核酸の長さと同等の長さを有する対照核酸及び調製目的とな る核酸の長さの 1 0〜 1 0 0倍の長さを有する対照核酸を含む試料から、 核酸を 調製する工程、 及び
(b) 調製後の核酸をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダィズさせ、 前記対 照核酸に相補的な配列を含むプローブとハイプリダイズした、 前記対照核酸のシ グナルを検出する工程 を含む、 前記方法。 '，
上記 （ 1 ) 及び （2 ) において、 調製目的となる核酸は、 例えば、 miRNA を 挙げることができる。
また、 核酸を調製する工程には、 例えば、 核酸を精製すること及び核酸を標識 することが含まれる。 '
本発明により、 試料から調製目的の核酸を調製する際に当該核酸と同等の長さ を有する対照核酸を試料中に存在させることによって、 当該調製操作の成否を確 認することが可能となった。
また、 本発明により、 miRNAのマイクロアレイ解析において、 miRNAと同等 の長さを有する対照核酸を使用することにより、 マイクロア レイの結果から miRNAの精製操作、 標識操作の成否を確認することが可能となった。 図面の簡^な説明
、 図 1は、 中空繊維束を製造するための配列固定器具を示す図である。
図 2は、 実施例 2のハイブリダィゼ一シヨン後のマイクロアレイの画像を示 す図である。 囲み画像は左力、ら順に、 probe contl、 probe cont2、 probe cont4、 probe coht5、 probe cont6、 probe cont7、 YLR377C 21W及び YLR377C 21b'2 (上段）、 並びに YLR377C 21b-3 (下段） の位置を示す （上パネル、 下パネル）。 符号の説明
1 1 · · · ·孔
2 1 · · · ·多孔板
3 1 · · · · 中空繊維
4 1 · · · ·板状物 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明するが、 本実施の形態は、 本発 明を説明するための例示であり、 本発明をこの実施の形態のみに限定させるもの ではない。 '， '
なお、 本明細書において引用した文献、 及び公開公報、 特許公報その他の特許 文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 また、 本明細書は、 本願優 先権主張の基礎となる日本国特許出願第 2005-344451号の開示内容を包含する。
· '
1 . 本発明の概要
本発明は、 核酸の調製操作の成否を確認する方法である。 具体的には、 本発明 は、 まず調製目的となる核酸とほぼ同一長の対照核酸 （以下、 「短鎖スパイクコン ドロール」 ともいう） の存在下で、 核酸の調製操作を行う。 次に、 当該スパイク コントロールと相補的な配列を有するキ.ャプチヤ一プローブを搭載したマイク口 アレイを使用して、 調製後の核酸をハイブリダィズさせた後に、 短鎖スパイクコ ン トロールのシグナルが一定以上の値で検出できれば、 核酸の調製操作自体に問 題はないことが確認され、 あるいは、 当該シグナルが検出できなければ、 ハイブ リダイズ以前の調製操作において核酸を損失していることが確認されるというも のである。
また、 本発明の別の態様では、 核酸の調製操作において、 適切な調製操作を行 えば、 調製後のサンプルに混入しないことが経験的に明らかである長さの対照核 酸 （以下、 「長鎖スパイクコン トロール」 ともいう） をさらに存在させてもよレ、。 本態様では、 長鎖スパイクコン トロールのシグナルが検出されなければ、 調製操 作自体に問題はないことが確認され、 あるいは、 長鎖スパイクコン トロールのシ グナルが一定以上の値で検出されれば、 調製操作の際に、 分画される予定の長さ よりも長い核酸が調製後の核酸に混入していることが確認される。
本明細書において、 「調製目的となる核酸」 又は 「調製目的の核酸」 とは、 調製 操作によって出発試料から取得することを目標とする核酸を意味する。本発明は、 調製目的となる核酸が、 実際に調製されたか否かを確認するための手段を提供す るものである。
本発明の方法によって、 上記のスパイクコントロール及びマイクロアレイに搭 載されたプローブを用いたマイクロアレイの検出結果から、 核酸の調製操作の成 否を確認することが可能となる。 例えば、 本発^ .の方法によって、 調製目的の核 酸 （例えば、 miRNA) のマイクロアレイ解析において,シグナルが確認できなかつ た場合に、 もともとの出発試料中に調製目的の核酸が検出できる程度に存在しな かったのか、 又は調製操作において調製目的の核酸が失われたのかを確認するこ とができる。 '
2 . スノ イクコ ン ト ローノレ
本発明において、 スパイタコン ト ロールは出発試料に添加される核酸である。 '本発明のスパイクコントロールは、 DNA及び RNAのいずれでもよいが、 当業 者であれば調製目的の核酸、 調製条件等を考慮して、 核酸の種類を適宜選択する ことができる。 本発明のスパイクコン トロールは、 調製目的の核酸との標識効率 がー致する点では、 当該核酸と同じ種類であることが好ましい。 一方、 安定性の 面においては、 スパイクコントロールは DNAであることが好ましい。
例えば、 調製目的の核酸が miRNA である場合は、 スパイク コ ン ト ロールは RNA又は DNA .のいずれでもよい。 この場合、 RNAは、 調製目的の核酸との標 識効率が一致する点、 また、 シグナル強度が強くなる点で好ましく、 DNA は、 製造の安定性の点や操作の簡便性の点で好ましい。 当業者であれば、 スパイクコ ントロールに用いる核酸の種類を、 DNA及び RNAから適宜選択することができ る。，
本発明のスパイクコンドロールは、 公知の方法で合成することができる。 例え ば、 Applied Biosystems 3400 DNA 合成機などの市販の核酸合成装置を用いる ことによって合成することができる。
また、 本発明のスパイクコントロールは、 スパイクコントロールの配列を含む 核酸を铸型にした PCRを利用して得ることもできる。 PCRに用いるフォヮ一ド プライマ一として、 5'末端がリン酸化されたプライマーを使用すると、 得られた PCR産物を exonuclease処理することによって一本鎖 DNAを得ることができる c 得られた一本鎖 DNAをスパイクコントロールと して使用することができる。 また、 本発明のスパイクコン トロールが RNA である場合は、 転写産物を用い ることも可能である。 . · '
本発明において、 出発試料に添加されるスパイタコントロールは 1種類の核酸 でもよいし、 複数種類の核酸でもよい。 複数種類の核酸を使用するときは、 各コ ントロールは伺一の量を添加してもよいし、 コン トロール毎に異なる量を添加し てもよレ、。 各スパイクコントロールは、 出発試料に別々に添加してもよいし、 予 め混合してから出発試料に混合液を添加してもよい。 .
調製目的となる核酸が調製操作によって消失したか否かを確認するためには、 短鎖スパイクコントロールを出発試料に添加すればよい。 また、 核酸の調製操作 において適切な操作によっては混入しない長さの核酸が混入したか否かを確認す るためには、 長鎖スパイクコントロールを出発試料にさらに添加すればよい。 以 下に、 短鎖スパイクコン トロール及び長鎖スパイクコン トロールについて説明す る。 ，
( 1 ) 短鎖スパイクコン トロール
本発明において、調製目的となる核酸と同等又はほぼ同一長の対照核酸を、 「短 鎖スパイクコン トロール」 ともレ、う。 '
本明細書において、 「同等の長さ」 又は 「ほぼ同一長」 とは、 調製目的となる核 酸の長さと同一の長さ又は当該核酸の長さから ±100〜0塩基、 好ましくは ±10〜0 塩基、 より好ましくは、 ±6〜0塩基、 さらに好ましくは ±1〜0塩基の範囲の長さ を意味する
短鎖スパイクコントロールは、 調製目的の核酸とともに調製され、 マイクロア レイ解析される。 短鎖スパイクコン トロールは、 マイクロアレイ解析される試料 中の調製目的の核酸の有無を判断するために出発試料に添加されるものである。 したがって、 短鎖スパイクコン トロールは、 マイクロアレイ解析において、 ァレ ィに搭載された調製目的の核酸に対応するプローブとクロスハイプリダイゼ一シ ヨ ンしないような配列であることが望ましい。 すなわち、 短鎖スパイクコン ト口 ールは、 調製目的の核酸との相同性を考慮して、 調製目的の核酸と低い相同性と なるように設計することが好ましい。 相同性は、 既存のデータベースから既知の 配列情報を入手して、 公知の相同性検索ソフ トを利用することで求めることがで きる。
調製目的の核酸と相同性の低い短鎖スパイクコント..ロールは、 例えば、 出発試 料の由来する種とは異なる種において特異的に発現する遺伝子の配列を基に設計 い。
さらに、 上記のようなスパイクコン トロールに相補的な塩基配列を含む核酸と ス トリ ンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、 かつ、 調製目的となる'核酸と相 同性の低い核酸も短鎖スパイクコントロールとして用いることができる。
ここで、 ス トリンジヱン卜な条件とは、 ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄時の 条件であって、 塩濃度が 100〜1000mM、 温度が 40〜75°C、 好ましくは塩濃度が 100〜500mM、 温度が 40°C〜60°Cの条件を意味する。 例えば、 2xSSCで 50°C等 の条件を挙げることができる。
調製目的の核酸が miRNAである場合には、 さらに、 以下の条件 (i)及び (ii)の両 方、 又はいずれかをもとにして、 短鎖スパイクコントロールを設計することがで きる。
条件 (i)： Gの数が 5個
. 条件 (ii)： Cの数が 6個
例えば、 A、 T、 G、 Cから構成される 21塩基のランダムな 1000種類の配列か ら、 条件 (i)及び (ii)に当てはまる配列を検索してもよレ、。 このような検索によって 選択される配列に関して、 miRNAのデータベースである miRBaseで相同性検索 を行い、 miRNAと類似性が十分に低いことを確認してもよい。 miRNAを調製す る際に用いる短鎖スパイクコントロールの例として下記の 6種類の配列を挙げる ことができる。
Contl ACAGGCCCGTTACCGTAGTAT (配列番号 1
Cont2 CTTTGGGTCGACGTTTCTTCC (g己列番号 2
Cont4 TTGTATGCCGGACCTTCCGTA (配列番号 3
Cont5 CTTGCCAATCGTTGTCGAGCA (配列番号 4
ContG AACTGATCGGTCGTACCGCAA (配列番号 5
Cont7 CCGCATTACGTGTCAAAGCGA (配列番号 6 ( 2 ) 長鎖スパイクコン トロール
本発明において、 適切な調製操作を行えば、 調製後のサンプルに混入しないこ とが経験的に明らかである長ざの対照核酸を、 「長鎖スパイク コン トロール」 とも いう。 適切な調製操作は、 例えば、 調製操作に用いるキッ トに添付の説明書に従 つた操作等をあげることができる。 混入しないことが経験的に明らかである核酸 の長さは、 例えば、 キッ トに添付の説明書に記載された分画範囲外の核酸長をあ げることができる。 長鎖スパイクコントロールは、 具体的には、 調製目的となる 核酸長の 1 0〜 1 0 0倍、 好ましくは 1 0〜 5ひ倍、 より好ましくは 1 0〜 2 0 倍の長さを有する対照核酸である。
長鎖スパイ ク コン トロールは、 調製目的の核酸が調製される工程において、 適 切な調製操作によっては混入しないことが経験的に明らかである長さの核酸が、 実際の操作によって混入したか否かを判断するために試料に添加されるものであ る。 したがって、 長鎖スパイクコン トロールの塩基長は、 調製操作によって分画 される予定の長さよりも十分に長いこと、 又は場合によっては十分に短いことが 必要である。
適切な調製操作によっては混入しない核酸長は、 調製操作の内容によって左右 される。 例えば、 カラムを用いて分取操作を行う場合、 投入エタノール量が予定 よりも少ない場合などは、 より長い RNA鎖が短鎖 RNAに混入する場合がある。 調製操作時の温度や、 調製にかかった時間等も、 分画範囲に影響を与えることが ある。
また、 長鎖スパイ ク コン トロールは、 マイ ク ロアレイ解析において、 アレイに 搭載された調製目的の核酸に対応するプローブとクロスハイプリダイゼーション しないような配列であることが望ましい。 すなわち、 長鎖スパイクコン ト ロール は、 調製目的の核酸との相同性を考慮して、 調製目的の核酸と低い相同性となる ように設計することが好ましい。 相同性は、 上記のように求めることができる。 調製目的の核酸と相同性の低い長鎖スパイクコントロールは、 例えば、 出発試 料の由来する種とは異なる種において特異的に発現する遺伝子の配列を基に設計 い。 さらに、 上記のようなスパイクコントロールに '補的な塩基配列を含む核酸と ス トリンジヱン卜な条件下でハイブリダィズし、 かつ、 調製目的となる核酸と相 同性の低い核酸も長鎖スパイクコントロールとして用いることができる。
ここで、 ス トリンジェン卜な条件とは、 前述のとおりである。
調製目的の核酸が、 例えばマウス由来の miRNAの場合、 酵母 YLR377Cの配 列情報をもとに長鎖スパイタコン トロールを設計することができる。 下記のブラ ィマ一を用いて酵母 YLR377Cのゲノム DNAを PCRで増幅すると、 300塩基対 の PCR産物を得ることができる。 このとき、 5'末端がリン酸化された Forward primer を使用すれば、 得られた PCR 産物を、 strandase™ λ Exonuclease ( Novagen 製） などで処理して一本鎖と し、 長鎖スパイ ク コ ン ト ロール (ssYLR377C 300b) とすることができる。
Forward primer: AAGCCTTTCTCGGCTAGGTATGTTGGATCC (配列番号 1 3 )
Reverse primer: CTACTGTGACTTGCCAATATGGTCTAAAAA (配列番号 1 4 )
3 . 核酸の調製操作
上記のように、 本明細書において 「調製目的となる核酸 （調製目的の核酸）」 と は、 調製操作によって出発試料から取得することを目標とする核酸を意味する。 本発明において、 調製目的となる核酸は、 試料に含まれる核酸全体から、 一定の 核酸長を指標に用いて分画できる限り限定されるものではないが、 短鎖 RNA な どの短鎖核酸をあげることができる。 短鎖核酸は、 例えば、 150〜15塩基、 好ま しくは 50〜15塩基、 より好ましくは 25〜15塩基の核酸を挙げることができる。 また、 本発明において、 調製目的となる核酸は、 例えば miRNAである。
本発明において、 上記のスパイクコン トロールを出発試料に添加し、 スパイク コントロールを含む試料から、 核酸を調製する。
本発明において、 出発試料の由来は、特に限定されず、例えば哺乳動物、植物、 昆虫、 線虫、 その他由来の試料を挙げることができる。 本発明で使用される出発試料は、 上記由来であれば、 組織、 細胞、 細胞抽出液 などであってもよく、 細胞抽出液から得られた total RNAのように、 核酸精製操 作の途中段階の試料であってもよい。 例えば、 マウス由来の total RNAは、 例え はマヮス大月 ¾カ ら AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol chloroform) 法などの公知の方法によって抽出することができる。 ' 、
出発試料に添加するスパイクコン トロールの量は、 当業者であれば、 出発試料 に含まれる調製目的となる核酸の量又は濃度、使用する検出デバイスの検出限界、 ダイナミ ックレンジなどを考慮して適宜設定することができる。 例えば、 短鎖ス パイクコントロールは、 使用する検出デバイスの性能に基づき、 ハイブリダィズ 後に十分検出できる量を添加すればよい。 また、 長鎖コン トロールは、 検出にか かわる標識物質の量が所定の方法で十分に検出可能である量となるように添加す ればよレヽ。 ■ . 添加するスパイクコン トロール量が多すぎると、 非特異的なシグナルが生じる おそれ、 あるいは長鎖スパイクコントロールが短鎖核酸分画に混入するおそれが ある。 ハイブリダィズの結果、 これらの現象が ^められたときには、 添加するス パイクコントロールの量を調整することができる。
調製目的となる核酸が miRNAの場合、 繊維型マイクロアレイで本発明の方法 を実施するには、 短鎖スパイクコントロール、 長鎖スパイクコン トロール共に、 0.1pg~ 10000ng/50 / 1 , 好ましくは lpg〜： l000ng/50 1、 より好ましくは 10pg 〜100ng/50 / l となるように出発試料に添加することができる。 例えば、 出発試 料が 12.5 gの total RNA、 精製スケールが 50 μ 1スタートであれば、 添加する 各短鎖スパイクコン トロールの量は 50pg〜500pg、 各長鎖スパイクコン トロール の量は 5ngで実施可能である （実施例 2 )。 また、 スパイクコン トロールを複数 種類使用する場合は、 各スパイクコントロールの添加濃度を適宜変更することも 可能である。
本発明において、 核酸の調製操作には、 核酸の精製操作及び Z又は核酸の標識 操作が含まれる。 核酸の精製操作と核酸の標識操作の順番は、 特に限定されず、 いずれの操作を先に実施してもよく、 あるいは同時に行ってもよい。 また、 核酸 の調製操作は、 精製操作に続いて標識操作を行い'、 さらに精製操作を行うといつ たように、 精製操作又は標識操作を複数回含んでいてもよい。
本発明において、 精製操作は公知の核酸精製方法を使用することができる。 例 えば、 グァニジン塩酸法又はフエノール抽出法により、 試料から調製目的の核酸 を精製することができる。 また、 市販のキッ トを用いて調製目的の核酸,を精製す ることもできる。 例えば、 ISOGEN、 Trizol、 RNeasyなどの total RNA抽出キ ッ 卜又は RNA精製キッ トを購入して、 本発明の精製操作に使用することができ る。 キッ 卜を用いる場合は、 キッ 卜に添付された指示書にしたがって、 調製目的 の核酸を精製することができる。
本発明において、 調製後の核酸はマイクロアレイに供されるために、 調製後の 核酸は、 マイクロアレイの検出感度を向上させる観点、 また、 サンプル中に含ま れる 己列の種類を少なくすることによってクロスハイプリダイゼーションを抑制 する観点から、分画により調製目的の核酸の長さから少なく とも ±500塩基以内の 範囲の核酸とすることが好ましい。 所望の長さの核酸を得るには、 カラム分画法 又はエタノール沈殿を利用することができる。 核酸は、 ί列えば実施例 2に記載の 方法によって、 短鎖核酸と長鎖核酸に分画することができる。
例えば、 調製目的の核酸が miRNAの場合、 調製後の核酸は低分子の核酸とな るように精製することが好ましい。 精製方法としては、 例えば、 公知のグァニジ ン塩酸法 Xはフエノール抽出法の後、 カラム分画法により 200塩基以下の低分子 の RNAとすればよレヽ。 もしくは mirVana miRNA Isolation kit (Ambion社製） で調製することも可能である。
本発明において、 標識操作は公知の核酸標識方法を使用することができる。 例 えば、 ランダムプライマーにより、 逆転写時にアミノアリル- dUTP を取り込み、 アミノアリルを介して標識物質を取り込む方法、 T4 RNA Ligaseにより核酸を標 識する方法、 ピオチンヒ ドラジドにより末端標識を行う方法などによって核酸試 料を標識することができる。 また、 市販のキッ トを用いて調製目的の核酸を標識 することもできる。例えば、 Invitrogen製の ULYSIS Alexa Fluorや、 KREATECH Biotechnology BV製の PlatinaBright を用いて核酸を直接標識してもよいし、 Ambion社製の mirVana miRNA Labeling Kitなどのキッ トを購入して、 本発明 の標識操作に使用してもよい。 キッ トを用いる場合は、 キッ 卜に 付された指示 書にしたがって、 調製目的の核酸を標識することができる。
本発明において、 核酸は、 放射性同位元素、 蛍光標識、 酵素標識等で標識され る。蛍光標識の場合、例えば、 Cy3、 Cy5、 FAM、 Alexa Flour (登録商標）、 D Y-647、 PacificBlue™での標識が挙げられる。
4 . マイグロァレイ .
. ( 1 ) マイクロアレイ
本明細書において、 マイ ク ロアレイは、 複数の区画にオリ ゴヌク レオチド、 cDNA等のキヤプチヤープローブ （以下、 「プローブ」 ともいう） を固定し、 遺伝 子の発現パターンのモニタ リ ング、 新規遺伝子のスク リーニング、 遺伝子変異、 多型の検出等を行うことができるデバイスを意味する。 マイクロアレイの形態は 様々なものが知られている。 例えば、 光リ ソグラフ技術を利用して、 基板上に高 密度でプローブを固定したマイクロアレイ、 ガラス基板等にスポッティングによ りプローブを固定したマイクロアレイ等が知られている。 また、 繊維型マイクロ ァレイも知られている （特許第 3 5 1 0 8 8 2号公報参照）。
マイクロアレイとしては、 基板に複数の貫通孔が存在し、 それら貫通孔にはゲ ルを して.プローブが固定されているマイクロアレイが好適に使用される。 その ようなマイクロアレイとしては、 特開 2 0 0 0 _ 6 0 5 5 4号に記載のマイクロ アレイや、 繊維型マイクロアレイが例示できる。
以下に、 繊維型マイクロアレイについてより詳細に説明する。 繊維型マイクロ アレイは、 例えば、 下記の a ) 〜 d ) の工程を経て作製することができる。 a ) 複数本の中空繊維を、 中空繊維の長手方向が同一方向となるように 3次元に 配列し配列体を製造する工程。
b ) 前記配列体を包埋し、 ブロック体を製造する工程。
c ) 核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を該ブロック体の各中空繊維の中 空部に導入し、 重合反応を行い、 核酸プローブを含むゲル状物を中空部に保持す る工程。 '
d ) 中空繊維の長手方向と交叉する方向で、 切断してブロック体を薄片化するェ 程。
中空繊維材料としては、 例えば、 ナイロン 6、 ナイロン 6 6、 芳香族ポリアミ ド等のポリアミ ド系中空繊維、 ポリエチレンテレフタ レ一 ト、 ポリブチレンテレ フタレー ト、 ポリ乳酸、 ポリグリコール酸、 ポリカーボネート等のポリエステル 系中空繊維、 ポリアク リ ロニ ト リル等のアク リル系中空繊維、 ポリエチレンゃポ リプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、 ポリメタク リル酸メチル等のポリ メタク リ レート系中空繊維、 ポリ ビニルアルコール系中空繊維、 ポリ塩化ビニリ デン系中空繊維、 ポリ塩化ビニル系中空繊維、 ポリ ウレタン系中空繊維、 フエノ —ル ¾中空繊維、 ポリフッ化ビニリデンゃポリテ トラフルォロエチレン等からな るフッ素系,中空繊維、 ポリアルキレンパラォキシベンゾエート系中空繊維等が挙 げられる。
上記中空繊維は、 その長手方向が同一となるように 3次元に配列される。 配列 方法としては、 例えば、 粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の 間隔をもって平行に配置し、 シート状とした後、 このシートを螺旋状に巻き取る 方法 （特開平 1 1 一 1 0 8 9 2 8号公報参照） が挙げられる。 また、 複数の孔が 所定の間隔をもつて設けられた多孔板 2枚を孔部が一致するように重ねあわせ、 それらの孔部に、 中空繊維を通過させ、 2枚の多孔板の間隔を開き、 2枚の多孔 板間の、 中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充满させ硬化させる方法 （特開 2 0 0 1 - 1 3 3 4 5 3号公報参照） が挙げられる。
次に配列体はその配列が乱れないように包埋される。 包埋の方法と しては、 ポ リ ウレタン樹脂、 エポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法、 繊維同士を熱 融着により接着する方法等が挙げられる。
次に包埋された配列体の各中空繊維の中空部に、 核酸プローブを含むゲル前駆 体重合性溶液を導入し、 中空部内で重合反応を行う。 これにより中空部にゲルが 保持され、 ゲルには核酸プローブが固定される。
ゲル前駆体溶液としては、 例えば、 アクリルアミ ド、 N， N—ジメチルアタリ ノレアミ ド、 N—イソプロピルァク リルァミ ド、 N—ァク リ ロイルァミノエ トキシ エタ ノール、 N—ァク リ ロイルアミノブロノ ノール、 N—メチ口一ルァク リノレア ミ ド、 N _ビニルピロ リ ドン、 ヒ ドロキシェチルメタク リ レー ト、 （メタ） ァク リ ル酸、 ァリルデキス トリン等の単量体の一種類以上と、 架橋性モノマーと してメ チレンビス （メ タ） アタ リルァミ ド、 ポリエチレンダリ コールジ （メタ） アタ リ レー ト等を含むものである。 予め核酸プローブの末端を不飽和官能基で修飾して おけば、 核酸プローブの末端を介してゲル前駆体と共重合することにより、 ゲル の構成に核酸プローブが化学結合する（特開 2 0 0 4 - 1 6 3 2 1 1号公報参照）。 次に、 中空繊維の長手方向と交叉する方向で、 切断してブロ ック体を薄片化す る。 ここで作製された薄片は、 マイクロ,アレイとして使用できる。 マイクロアレ ィの厚みは、 0 . 1 m m〜 1 m m程度である。 切断は、 例えばミクロ トーム、 レ 一ザ一等により行うことができる。
上述のマイクロアレイでは、 中空繊維の中空部、 すなわちマイクロアレイの貫 通孔中のゲルにプローブが固定されている。 よって、 プローブは、 3次元構造体 に固定されているため、 プローブはある空間内に固定されていることとなる。 プ ローブの固定されているこの周辺環境は、 空間自由度を有し、 さらには異なる種 類のプローブは物理的な隔壁を隔てて固定されている。 よって、 上記マイクロア レイは、 平面基板上に高密度にプローブが固定されているマイクロアレイと異な り、，そこに.搭載されたプローブはプローブとして十分に機能し、 さらに隣接する 種類の異なるプローブとの非特異的反応はない。 したがって、 プローブは、 リン カー、 スぺ一サ一等のハイプリダイゼーションに関与しない余分な配列を結合す る必要なく設計され、 マイクロアレイに固定することが可能である。
( 2 ) プローブ
本発明において、 マイクロアレイに搭載されるプローブには、 調製目的である 核酸、 例えば miRNAに相補的な配列を含む核酸が含まれる。 本発明において、 調製目的の核酸に相補的な配列を含むプローブを搭載したマイクロアレイを使用 することが好ましく、 調製目的の核酸が miRNAの場合は、 miRNA に相補的な 配列、 特に、 マチュアな miRNAに相補的な配列を含むプローブを搭載したマイ クロアレイを使用することが好ましい。 ' '
既知の核酸の配列情報は、 Genbankから入手することができる。 miRNAの配 列情報は、 例えば、 miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/) にアクセスする ことにより知ることができる。 当業者であれば、 既知の配列情報から、 本発明の マイクロアレイに搭載するプローブを適宜設計し、合成することができる。また、 本発明において、 プローブは、 ランダムな配列を有する核酸を使用することもで きる。 ランダムな配列を有する核酸は、 当業者であれば適宜設計し、 合成するこ とができる。
'また、 本発明において、 マイクロアレイに搭載されるプローブには、 本発明の スパイクコントロールを検出するためのプローブどして、 本発明のスパイクコン 卜ロールに相補的な配列を含む核酸が含まれる。 当該プローブの配列は、 マイク 口ァレイ解析において、 スパイクコントロールと特異的にハイブリダイズする配 列であればよい。 すなわち、 当該プローブは、 ハイブリダィズに用いられる調製 後の核酸試料の中で、 スパイタコントロールのみとハイブリダイズする核酸であ ればよい。
調製目的となる核酸が miRNAである場合の短鎖スパイクコン トロール（Contl， Cont2, Cont4, Cont5, Cont6, Cont7) を検出するためのプローブとして、 それぞ れのスパイクコン トロールに相補的な配列を含む下記の DNAを挙げることがで きる。 ' .
probe contl ATACTACGGTAACGGGCCTGT (配列番号 7 ) probe cont2 GGAAGAAACGTCGACCCAAAG (-配列番号 8 ) probe cont4 TACGGAAGGTCCGGCATACAA (配列番号 9 ) probe cont5 TGCTCGACAACGATTGGCAAG (配列番号 1 0 ) probe cont6 TTGCGGTACGACCGATCAGTT (配列番号 1 1 ) probe cont7 TCGCTTTGACACGTAATGCGG (配列番号 1 2 ) 調製目的となる核酸が miRNA である場合の長鎖スパイク コン ト ロール
(ssYLR377C 300b) を検出するためのプローブとして、 ssYLR377Cに相補的な 配列含む下記の DNAを挙げることができる。 YLR377C 21b- l cggtcaacgatcgcggagaga (配列番号 1 6 )
YLR377C 21b-2 gaatcttggatttggtgccaa (配列番号 1 7 )
YLR377C 21b-3 gtcatatccatgacaaatctt (配列番号 1 8 )
本発明において、 マイクロアレイに搭載されるプローブの鎖長は、 1 0〜1 0 0塩基、 好ましくは 1 0〜4 0塩基である。 , 本発明において、プローブは、例えば DNA、 RNAなどの核酸であればよいが、 好ましくは DNAである。
本発明において、プローブは公知の方法により合成することができる。例えば、 ホスホジエステル法、 ホスホ ト リエステル法、 固相ホスホアミダイ ド法などの方 法により合成することができる。 また、 ，巿販の DNA 自動合成装置を用いること によって合成することもできる。
上記プロ ブは、マイクロアレイの複数の区画に固定されている。プローブは、 各区画に 1種類のみ固定しても、 複数種、 固定しても良い。 固定の方法は、 マイ クロアレイの形態により異なり、 例えば、 フォ トマスクを使用して作製したマイ クロアレイであれば、前述のごとく予めプローブを合成して準備する必要はなく、 基板上で所望のプローブを逐次合成することができる。 また、 スポッティングに より作製されたマイクロアレイであれば、. プローブを予め準備し、 それらプロ一 ブに適当な官能基を付与し、基板にプローブを含む溶液をスポッ トする。この際、 プロ,ーブに導入された官能基と基板 （必要により表面を修飾） とが化学的結合に よりプローブが固定される。 また、 必要に応じて、 miRNA に相補的なプローブ には、 適当な鎖長のリンカ一を結合することも可能である。
上記プローブの他に、 本発明では、 検出データの補正に用いる RNA を検出し 得るキヤプチヤープローブが 1種類以上搭載されていてもよい。 当該 RNA と し ては、例えば、 ribosomal RNA (rRNA)、 transfer RNA (tRNA)、 small nucleolar ribonuleoprotein particle RNA ( snoRNA )、 small nuclear RNA ( Ul〜 Ul8snRNA) などの内在性低分子 RNAが举げられる。 また、 内在性低分子 RNA としては、 5SrRNA、 5.8SrRNA, UlsnRNA, U2snRNA、 U3snRNA、 U4snRNA、 U5snRNA、 U6snRNA、 Arg-tRNAが好適に使用される。 5 . 調製操作の成否の確認
( 1 ) ハイブリダィゼーシヨンとシグナルの検出
調製後の核酸試料を含む溶液を、 上記のマイクロアレイに供し、 核酸試料とプ ローブとのハイブリダィゼ一シヨンを行う。 ハイブリダィゼ一シヨン操作の後、 洗浄などの必要な操作を行い、 マイクロアレイ上の標識された区画、 すなわちプ ローブとハイブリ ッ ドを形成している区画を検出する。 検出の方法は、 標識した 試料に応じて、 そのデバイス、 検出方法が適宜選択される。
'ここで洗浄の際に、 洗浄強度の度合いの弱い条件から強い条件へと段階的に変 えてもよい （段階的洗浄）。 ここで、 洗浄強度は、 核酸試料とプローブとのハイブ リダイゼーションを解離させる作用の強さを意味する。
具体的には、 まず、 マイクロアレイに搭載しているプローブの中で、 ス ト リ ン ジエンシーが最も低いものに洗浄条件を合わせ、 洗浄及び検出を行う。 次に、 当 該プローブの中でス ト リ ンジエンシーの最も高いものの洗浄条件まで、 段階的に 洗浄し、 その都度ハイブリ ッ ドの検出を行う。 このような複数回の洗浄及び検出 を行うことにより、 洗浄条件とハイプリ ッ ドの解離条件とが近接している核酸で も検出可能となる。
洗浄効果は、 洗浄液の塩濃度、 洗浄温度、 洗浄液量、 洗浄時間等に依存し、 特 に、 洗浄効果に対する塩濃度及び温度の影響は、 プローブの核酸組成との関係に よって定まる。
洗浄条件を段階的に変更する方法としては、 例えば、 塩濃度を一定にして、 洗 浄液の温度を段階的に変えていく方法がある。 具体的には、 はじめに塩濃度を任 意に選ぶ （ただし、 Tm (融解温度： melting temperature) 計算式の適用範囲内 の値を選ぶ）。 次いでマイクロアレイ上に搭載されている全てのプローブの内、 Tmが最小となるプローブを Tm計算式から算出する。 その最小の Tm値、 好ま しくは、 最小値よりも c以上低い洗浄液の温度を第一段階の洗浄条件として選 ぶ。 その後、 同じくアレイ上に搭載されているプローブの内の最大 Tm値、 好ま しくは最大値より も 1°C以上高い温度まで、 少なく とも 2段階以上、 洗浄液温度 を変えて洗浄操作を行う。 . '
また、 洗浄液の温度を一定にして、 洗浄液中の塩濃度を段階的に変える方法を 用いることも出来る。 具体的には、 はじめに洗浄温度を任意に選ぶ （ただし、 Tm 計算式の適用範囲内の塩濃度から求められうる値を選ぶ）。次いでマイクロアレイ 上に搭載されている全てのプローブの内、 Tmが最小となるプローブを ' Tm計算 式から算出し、 その最小 Tm値が、 規定された洗浄液温度に比べて、 同じかもし くは、 好ましくは 1°C以上高くなるように計算される洗浄液の塩濃度を第一段階 の洗浄条件として選び、 その後、 同じくマイクロアレイ上に搭載されているプロ ーブの内の最大 Tm値が、 規定された洗浄液温度に比べて好ましくは 1°C以上低 くなるように計算される塩濃度まで、 少,なく とも 2段階以上、 洗浄液の塩濃度を 変えて洗浄操作を行う方法である。
( 2 ) 判断基準 . 調製後の核酸をマイクロアレイ上のプローブにハイプリダイズさせた後に、 調 製目的である核酸の調製操作の成否を確認することができる。
短鎖スパイクコン トロールに相補的な配列を含むプローブとハイブリダイズし た当該コン トロールのシグナルが一定以上の値で検出できれば、 精製操作及び標 識操作などの調製操作自体は成功したと判断することができる。 一方、 当該シグ ナルが検出されなければ（又は一定未満の値で検出されれば）、ハイプリダイズ以 前の核酸の,調製操作は成功しなかったと判断することができる。 調製操作の失敗 の要因には、 精製操作において核酸を消失したこと、 あるいは、 標識操作が想定 どおりに行われなかったことこと等が考えられる。 - ここで、 「一定以上の値」 とは、 例えば、 バックグラウンドとなる複数のスポッ 卜のシグナル平均値に、 バックグラウンドスポッ 卜のシグナル標準偏差を 3倍し たものを足した値が挙げられる。
また、 長鎖のスパイクコントロールに相補的な配列を含むプローブとハイプリ ダイズした当該コントロールのシグナルが検出されなければ （又は一定未満の値 で検出されれば）、調製後の核酸への長鎖核酸の混入は十分に抑えられているとい え、 調製操作は成功したと判断することができる。 一方、 長鎖スパイクコント口 ールのシグナルが一定以上の値で検出される場合は、 調製操作は成功しなかった と判断することができる。 調製操作の失敗の要因には、 精製操作の際に、 分画さ れる基準よりも長い核酸が短鎖 RNA中に混入したことが考えられる。
本発明は、 上記のプローブ、 スパイクコン トロールを用いることによって、 検 出したアレイの結果から、 核酸の調製操作の成否を確認することが可能となる。 本発明は、 核酸の調製操作の成否を確認するキッ トとしても提供することがで きる。 本キッ トには、 核酸の調製操作の成否を確認するために必要な試薬、 例え ば、 短鎖スパイクコン トロール、 長鎖スパイクコン ト口一ノレ、 これらのコン ト口 ールに相補的な配列を含むプローブが搭載されたマイクロアレイ、 核酸調製用試 薬、 マイクロアレイ用試薬、 使用説明書などの一部又は全部が含まれるが、 これ に限定されるわけではない。 また、 本キッ トには、 核酸の調製操作の成否を確認 するために必要な容器が含まれてもよい。 _ また、 調製目的となる核酸が、 短鎖の核酸 （例えば 15〜25塩基） の場合は、 精製操作の後に、 サンプル間のシグナル強度の比較を行うためのィンターナルコ ントロールを得にくいため、本発明の短鎖スパイクコン トロールを、精製、標識、 ハイブリダイズなどの操作における誤差を補正するためのコントロールとして使 用することも可能である。 以下に 実施例により本発明をより具体例を挙げて説明するが、 本発明は以下 の実施例に限定されるものではない。 実施例 1
( 1 ) miRNAァレイの作製
Sanger Instituteの miRBase (http：〃 microrna.sanger.ac.uk/) より、 実験的 に存在が証明されているマウス miRNAのマチュア配列に対して相補配列である ォリゴ DNAを 180種類作製した。
ィンタ一ナルなポジティブコン卜ロールとして、 Arg-tRNAをキヤプチヤーす るためのプローブを 1種類作製した。 miRNA検出用アレイには、 （2 ) で述べる 9種類のプローブも搭載し、 全 190 プローブを搭載したマイクロアレイを使用した。
これらのオリゴ DNAを、 以下のように miRNA検出用マイクロアレイに搭载 した。
まず、 プローブとなるオリゴヌク レオチ ドを DNA 自動合成装置により合成し た。
合成の際、 最終段階で、 ァミノ リ ンク TM (PEバイオシステムズ社製） を該ォ リゴヌクレオチドに反応させ、 次いで脱保護操作を行うことにより、 各オリゴヌ ク レオチ ドの末端にァミ ノへキシル基が導入された 5'-0-ァミ ノへキシルォリ ゴ ヌク レオチドを調製した。 .
次いで、 それらオリゴヌクレオチドに、 無水メタクリル酸を反応させ、 5'末端 ビュル化オリゴヌク レオチドを調製した。
<中空繊維束薄片の製造〉
図 1に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図 1中の X、 y、 zは直交の 3次元軸であり、 X軸は繊維の長手方向と一致する。
まず、 直径 0 . 3 2 m mの孔 1 1カ 、 孔の中心間距離を 0 , 4 2 m mとして、 縦横各 1 2列で合計 1 4 4個設けられた厚さ 0 . 1 m mの多孔板 2 1 2枚を準備 した。 これらの多孔板を重ね合わせて、 そのすベての孔に、 ポリカーボネート中 空繊維 3 1 (三菱エンジニアリ ングプラスチック社製 カーボンブラ ック 1 質 量％添加） を 1本づつ、 通過させた。
X軸方向に各繊維に 0 . 1 Nの張力をかけた状態で 2枚の多孔板の位置を移動 させて、 中空繊維の一方の端部から 2 0 m mの位置と 1 0 0 m mの位置の 2ケ所 に固定した。 即ち、 2枚の多孔板の間隔を 8 0 m mとした。
次いで、 多孔板間の空間の周囲 3面を板状物 4 1で囲った。 このようにして上 部のみが開口状態にある容器を得た。
次に、 この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。 樹脂としては、 ポ リ ウレタン樹脂接着剤 （日本ポリ ウレタン工業 （株） ニッポラン 4276、 コロネー ト 4403) の総重量に対し、 2.5質量。 /。の力一ボンブラックを添加したものを使用 した。 25°Cで 1週間静置して樹脂を硬化させた。 次いで多孔板と板状物を取り除 き、 中空繊維束を得た。
ゲル充填中空繊維配列体の製造時に、 表 1に示す質量比で混合した単量体及び 開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。
表 1
Figure imgf000023_0001
次に、プローブ核酸を含むゲル前駆体重合性溶液をデシケ一ター内に設置した。 デシケ―タ—内を減圧状態にしたのち、 中空繊維束の繊 it束が固定されていない 一方の端部をこの溶液中に浸漬した。 デシケ一ター内に窒素ガスを封入し、 中空 繊維の中空部にキヤプチヤープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。 次いで、 容器内を 70°Cとし、 3時間かけて重合反応を行った。
このようにしてプローブ核酸がゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持され た中空繊維束を得た。
次に得られた中空繊維束を、 ミクロ トームを用いて繊維の長手方向と直交する 方向でスライスし、 厚さ 0 : 5 m mの薄片シ一ト （DNA マイクロアレイ） を 5 0枚得た。
( 2 ) スパイ ク コン ト 口一ノレプローブ、 及びスパイク コン ト口一ノレの合成 マイクロアレイには、 スパイクコン トロールに対応するプローブも搭載した。 スパイクコントロール用のプローブと して、 短鎖 RNA存在確認用の 6種 （短鎖 スパイクコン トロールに対するプローブ） と、 長鎖 RNA非存在確認用の 3種（長 鎖スパイクコントロールに対するプローブ） の、 合計 9種類のプロ一ブを作製し た。 スパイクコントロール用のプローブ 9種類を、 （1 ) のアレイに搭載した。 スパイクコントロール検体は、短鎖のスパイクコントロールと して、短鎖 RNA 存在確認用の各プローブにそれぞれ相補的な 6種類を作製し、 長鎖のスパイグコ ントロールとして、 長鎖 RNA非存在確認用の 3種類のプローブ配列を全て含む 300塩基の配列を 1種類作製した。 > 以下に、 スパイクコン トロールプローブと、 スパイクコントロールの合成につ いて、 具体的に説明する。
( 2— 1 ) 短鎖
A、 T、 G、 Cから構成される 21塩基のランダムな 1000種類の配列から、 下記 の条件に当てはまる配列をスクリ一二 グしたところ、 6種類存在した。
条件 （i) ： Gの数が 5個
条件 （ii) ： Cの数が 6個
これらの配列に関して、 miRBaseで相同性検索を行い、 miRNAと類似性が十 分に低いことを確認の上、 スパイクコントロールとして使用した。 これらの 6種 類のスパイクコント口ールを、 Contl、 Cont2、 Cont4、 Cont5、 Cont6及び Cont7 とした。
Contl ACAGGCCCGTTACCGTAGTAT (配列番号 1 )
Cont2 CTTTGGGTCGACGTTTCTTCC (配列番号 2 )
Cont4 TTGTATGCCGGACCTTCCGTA (配列番号 3 )
Cont5 CTTGCCAATCGTTGTCGAGCA (配列番号 4 )
Cont6 AACTGATCGGTCGTACCGCAA (配列番号 5 )
Cont7 CCGCATTACGTGTCAAAGCGA (配列番号 6 )
また、 これらのスパイクコントロールを検出するためのキヤプチヤープローブ として、 それぞれのスパイクコントロールに相補的な配列である下記の DNAを 合成し、 （ 1 ) のアレイに搭載した。
probe contl ATACTACGGTAACGGGCCTGT (配列番号 7 ) probe cont2 GGAAGAAACGTCGACCCAAAG (配列番号 8 ) probe cont4 TACGGAAGGTCCGGCATACAA (配列番号 9 ) probe cont5 TGCTCGACAACGATTGGCAAG (配列番号 1 0 ) probe cont6 TTGCGGTACGACCGATCAGTT (配列番号 1 1 ) probe cont7 TCGCTTTGACACGTAATGCGG (配列番号 1 2 ) DNAの合成は、 DNA自動合成装置を用いて行った。 '
( 2 - 2 ) 長鎖
酵母 YLR377Cの遺伝子配列を基に設計した下記のプライマ一を用いて、 酵母 YLR377Cの遺伝子から 300塩基対の PCR産物を得た。
Forward primer: AAGCCTTTCTCGGCTAGGTATGTTGGATCC (配列番号
1 3 )
Reverse primer: CTACTGTGACTTGCCAATATGGTCTAAAAA (配列番号 1 4 )
この PCR産物のうち、 forward primerに関しては、 5'末端がリン酸化された プライマーを使用しており、 得られた PCR産物を、 strandaseTM λ Exonuclease (Novagen製） 処理して一本鎖とし、 スパイクコン トロールとした。 このコン ト ロールの名前を、 ssYLR377C 300b とした。 ssYLR377C 300bの配列を配列番号
1 5に示す。 .
このスパイクコン トロール （ssYLR377C 300b) に対応するプローブと して、 下記の 3種類の配列を合成し、 （ 1 ) のアレイに搭載した。
YLR377C 21b- l cggtcaacgatcgcggagaga (酉己歹リ番号 1 6 )
YLR377C 21b-2 gaatcttggatttggtgccaa (酉己歹リ番号 1 7 )
YLR377C 21b-3 gtcatatccatgacaaatctt (配列番号 1 8 )
プローブは、 DNA自動合成装置を用いて合成した。 実施例 2 miRNAのマイクロアレイ解析
( 1 ) スパイクコン トロールミ ックスの作製
実施例 1で合成したスパイクコン トロールを、 下記の通り混合した。 Contl 5μ1
Cont2 5^1
Cont4 5μ1
Con 5/ 1
Cont6 (lng/^1) 5μ1
Cont7 5^1
o
O o
o
ssYLR377C 300b 50 1
Nuclease Free Water 920 u 1
Total
(2) TotalRNAの精製
AGPC法により、 マウス大脳およそ 70mgから、 100 μ gの Total RNAを抽出 した。 o
o
o
(3) 短鎖 RNA及び長鎖 RNAの分画
上記 （2) で得られた Total RNA を用い、 下記の手順で短鎖 RNA及び長鎖 RNAの分画を行った。
(i) ( 1 )のスパイクコントロールミ ックス 10 1を、マウス大脳由来の Total RNA 12.5 g/40 1に対して添加し、 総量 50 μ 1のサンプル溶液を作製した。
(ϋ) ,サンプル溶液に対し、 RNeasy mini elute kit (QIAGEN) 添付の Buffer RLT を 250 1添加し、 よく攪拌した。 100% エタノールを 240 1加え、 1 0回ピぺ ッティング操作を行い、 その後、 氷上に 20分間放置した。
(iii) RNeasy mini elute kit添付のカラムに、 （ii)で得られたサンプルを入れ、 卓 上遠心機を用いて lOOOOrpmで 1分間処理した。
(iv) カラム通過液に対して 760 1 のエタノールを新たに添加し、 1 0回ピぺッ ティング操作を行い、 その後、 氷上に 20分間放置した。
(V) 未使用のカラムに、 （iv)で得られた溶液 650 1 を添加し、 卓上遠心機を用い て lOOOOrpmで 1分間処理した。 通過液を廃棄した後、 （iv)で得られた残りの溶 液に対して同じ操作を再度繰り返し、 （iv)で得られた全ての液をカラムに通過さ せた。 ' '
(vi) (v)のカラムをキッ ト所定の方法で洗浄し、 ULYSIS Alexa Fluor 647ラベリ ングキッ ト（Invitrogen)添付のラベリングバッファ一 25 1で RNAを溶出した。 得られた RNAを短鎖 RNAとした。
(vii) (iii)で処理後のカラムをキッ ト所定の方法で洗浄し、 ULYSIS Alexa Fluor 647ラベリングキッ ト （Invitrogen) 添付のラベリングバッファ一25 μ 1で RNA を溶出した。 得られた RNAを長鎖 RNAとした。
( 4 ) 短鎖 RNAの標識 ―
. ( 3 ) で得られた短鎖 RNAから、 20 lを新しいチューブに分取し、 70°Cで 2 分間熱した後、 即座に氷上で急冷した。 その後、 ULYSIS Alexa Fluro 647を 5 1添加し、 よく攪拌した。 次に、 85°Cで 15分間熱した後、 即座に氷上で急冷し た。
MicroSpincolumn G25 (Amersham社) を用レ、、残存の標識物質を取り除いた。
( 5 ) 長鎖 RNAの標識
長鎖 RNAは、 .（4 ) の短鎖 RNAの標識と同じ方法で標識した。
( 6 ) ノヽイブリダイゼーシヨン
( 4 ) 及び （5 ) で標識した短鎖 RNA及び長鎖 RNAを、 最終濃度が 2xSSC, 0.2% SDS、 溶液量が 150 1となるように調製した。 調製後、 70°Cで 2分間熱し た後に、 lOOOOrpmで 2分間遠心処理を行い、 実施例 1で作製した miRNAァレ ィを用いてハイブリダイゼ一ションに供した。
ハイブリダイゼーションは、 50°C、 遮光条件下で 16時間行った。
洗浄は、 2xSSC, 0.2% SDS、 50°Cで 40分間洗浄後、 2xSSC、 50°Cで 10分間 洗浄した。
検出は、 冷却 CCD カメラ方式の蛍光検出装置を用いて、 ハイブリダィゼーシ ョン後のマイクロアレイの各プローブスポッ トを画像化及び数値化した。
ハイブリダイゼーショ ン後のマイクロアレイの画像を図 2に示す。 図 2の上の パネルは、 長鎖 RNA を標識し、 ハイブリダィズした際に得られた画像である。 図 2の下のパネルは、短鎖 RNAをハイブリダイズした際に得られた画像である。 ハイブリダィゼーシヨンしたマイクロアレイの'うち、 白色実線の囲みが、 短鎖 のスパイクコントロールを検出するためのプローブ （probe contl, 2， 4〜7) の位 置を示し、 白色破線の囲みが、 長鎖のスパイクコン トロールを検出するためのプ ローブ （YLR377C 21b- l〜3) の位置を示す。
長鎖 RNA をハイブリダィズした場合は、 長鎖スパイクコン トロールに対する プローブ （白色破^部分） にシグナルが検出され、 短鎖スパイクコン ト.ロールに 対するプローブ （白色実線部分） にはシグナルは検出されなかった （上パネル）。 一方、 短鎖 RNA をハイプリダイズした場合は、 短鎖スパイクコン トロールに対 するプローブ （白色実線部分） にシグナルが検出され、 長鎖スパイクコントロー ルに対するプローブ （白色破線部分） にはシグナルは検出されなかった （下パネ ル）。 よって、 本実施例において、 長鎖 RNAと短鎖 RNAの分画操作が有効に機 能したと判断することができる。
なお、 本実施例においては、 長鎖 RNA のハイブリダィゼ一シヨン結果に比較 して、 短鎖 RNAをハイブリダイゼーションした際の miRNA検出用のプローブ のシグナルが十分に強く （図 2下パネル）、 スパイクコン トロールに対応するプロ ーブのシグナルと比較しても十分に強いものであった。 したがって miRNA検出 用のプローブが十分に機能していると考えられる。
また、 長鎖 RNAにおいてシグナルが検出された miRNAのプロ一ブスポッ ト は ， (図 2上パネル）、 miRNAのプレ力一サーを検出しているものと考えられる。 配列表フリーテキス ト
配列番号 1 〜 1 8 ：合成 DNA

Claims

1. 核酸の調製操作の成否を確認する方法であって、 以下の工程：
(a) 調製目的となる核酸の長さと同等の長さを有する対照核酸を含む試料から、 5 核酸を調製する工程、 及び
(b) 調製後の核酸をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダィズさせ、 前記 対照核酸に相補的な配列を含むプローブとハイブリダイズした、 前記対照核酸 のシグナルを検出する工程
言主 E
を含む、 前記方法。
2. 核酸の調製操作の成否を確認する方の.法であって、 以下の工程：
' (a) 調製目的となる核酸の長さと同等の長さを有する対照核酸及び調製目的と 囲
なる核酸 長さの 1 0 〜 1 0 0倍の長さを有する対照核酸を含む試料から、 核 酸を調製する工程、 及び
(b) 調製後の核酸をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダィズさせ、 前記 対照核酸に相補的な配列を含むプローブとハイブリダイズした、 前記対照核酸 のシグナルを検出する工程
を含む、 前記方法。
3. 調製目的となる核酸が miRNAである、 請求項 1又は 2記載の方法。
4. ,核酸を調製する工程に、 核酸を精製すること及び核酸を標識することが含ま れる、 請求項 1 〜 3のいずれか 1項に記載の方法。
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