WO2007055100A1 - 酵素電極 - Google Patents

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WO2007055100A1
WO2007055100A1 PCT/JP2006/321291 JP2006321291W WO2007055100A1 WO 2007055100 A1 WO2007055100 A1 WO 2007055100A1 JP 2006321291 W JP2006321291 W JP 2006321291W WO 2007055100 A1 WO2007055100 A1 WO 2007055100A1
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WO
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electrode
enzyme
fadgdh
glucose
ptc
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Yuka Inose
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Ultizyme International Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose

Definitions

  • the present invention is advantageous as an enzyme electrode including carbon powder carrying nano-level platinum particles and glucose dehydrogenase (FADGDH) using flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme, particularly as a glucose sensor. It relates to the enzyme electrode used in the above.
  • FDGDH glucose dehydrogenase
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • the enzyme electrode generally refers to an electrode in which an enzyme is immobilized on an electrode surface such as a gold electrode, a platinum electrode, or a carbon electrode.
  • Enzyme electrodes are widely used as biosensors that specifically detect various physiologically active substances by utilizing the reaction specificity of enzymes. In particular, it can be used as a glucose sensor for measuring blood glucose concentration as an important marker for diabetes.
  • GOD glucose oxidase
  • Examples of other oxidoreductases include dehydrogenases represented by glucose dehydrogenase (GDH).
  • GDH glucose dehydrogenase
  • GDH-based systems are not easily affected by dissolved oxygen in the measurement sample. Therefore, measurement is performed in an environment with a low oxygen partial pressure, or a high concentration sample that requires a large amount of enzyme is measured. Even in this case, there is an advantage that glucose can be measured with high accuracy.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • the electron mediator refers to an acid-reducing substance such as a non-protein metal complex or an organic compound capable of mediating electron transfer from an oxidoreductase to an electrode.
  • an acid-reducing substance such as a non-protein metal complex or an organic compound capable of mediating electron transfer from an oxidoreductase to an electrode.
  • ferricyanite potassium, phenazine And methosulphate, fucose and their derivatives for example, ferricyanite potassium, phenazine And methosulphate, fusedose and their derivatives.
  • An electron transfer protein refers to a protein that can be reduced by receiving an electron from an electron donor in an acid reduction system of a living body and then passing the electron to an electron acceptor.
  • Examples of the electron transfer protein include cytochrome b, cytochrome C, preferably cytochrome b562.
  • glucose concentration using these enzyme electrodes is performed by placing a buffer solution in a thermostatic cell, adding coenzyme, CaCl 2 and an electron mediator and maintaining the temperature constant, and then using the enzyme electrode as the working electrode. And a counter electrode (for example, platinum electrode) and a reference electrode (for example, Ag ZAgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in current is measured.
  • a counter electrode for example, platinum electrode
  • a reference electrode for example, Ag ZAgCl electrode
  • the electron mediator is contained in the electrode or fixed on the electrode surface, or must be stored as an aqueous solution in the constant temperature cell.
  • An electronic mediator must be prepared separately from the enzyme, which complicates the process and is difficult to mass produce.
  • the platinized carbon powder containing platinum is highly responsive by the electrode containing glucose oxidase enzyme (GOD).
  • GOD glucose oxidase enzyme
  • the present invention provides a high response current value and a wide dynamic range, particularly when used as a glucose sensor, which is inferior in comparison with the use of an electron mediator without using an electron mediator, Moreover, it is an object of the present invention to provide a highly practical enzyme electrode that can obtain highly accurate measurement values with little influence of dissolved oxygen and without being affected by the measurement environment.
  • the enzyme electrode of the present invention does not require an electron mediator to move electrons with the electrode. Therefore, a fuel cell type wireless glucose sensor can be constructed by using the enzyme electrode of the present invention as an anode catalyst and combining it with an enzyme fuel cell having no partition wall, particularly a wireless system.
  • the enzyme electrode of the present invention also has the advantage of not being affected by dissolved oxygen in the measurement sample. Therefore, even when measuring in an environment where the oxygen partial pressure is low or when measuring a high-concentration sample that requires a large amount of oxygen, it is possible to measure accurately without affecting the measurement results. Have advantages.
  • An enzyme electrode comprising nano-level platinum particles !, carbon powder and glucose dehydrogenase (FADGDH) catalytic subunit using flavin adenyl nucleotide (FAD) as a coenzyme.
  • FIG. 1 shows a current glucose concentration curve using a FADGDH catalyst subunit (PtC) electrode as a working electrode and a current value of a dalcose concentration of OmM as a reference.
  • PtC FADGDH catalyst subunit
  • Fig. 2 shows the current value of glucose concentration OmM using FADGDH complex (PtC) electrode (in air and Ar atmosphere), FADGDH complex (CP) electrode or PtC electrode as working electrode. The current dull course concentration curve is shown.
  • PtC FADGDH complex
  • CP FADGDH complex
  • FIG. 3 shows a resistance power curve obtained by constructing an enzyme fuel cell using a FADGDH composite (PtC) electrode or a FADGDH composite (CP) electrode as an anode.
  • PtC FADGDH composite
  • CP FADGDH composite
  • FIG. 4 shows a current glucose concentration curve obtained by constructing an enzyme fuel cell using a FADGDH complex (PtC) electrode or FADGDH complex (CP) as a node.
  • PtC FADGDH complex
  • CP FADGDH complex
  • FIG. 5 shows a current glucose concentration curve using a GOD (PtC) electrode or a GOD (CP) electrode as a working electrode and a current value of glucose concentration OmM as a reference.
  • PtC GOD
  • CP GOD
  • FIG. 6 shows a current glucose concentration curve using a PQQGDH catalyst subunit (PtC) electrode as a working electrode, with reference to the current value of the dalcose concentration OmM.
  • PtC PQQGDH catalyst subunit
  • the nano-level platinum particles used in the present invention mean platinum particles having an average particle size of lOnm or less, preferably an average particle size of 2 to 5 nm.
  • Such carbon particles carrying nano-level white gold particles are obtained by, for example, diluting platinum-containing dinitrodiamine platinum nitrate solution with pure water to form an aqueous solution, and then adding powdered carbon such as acetylene black. It has been proposed to add powder to mix and disperse, and to produce this by adding reagent grade ethanol to the mixture and reflux heating (see JP-A-9-47659). It has also been proposed to obtain a platinum-supported carbon electrode by a sputtering method by disposing a platinum target on the carbon target as a target (see Japanese Patent Laid-Open No. 2003-121407).
  • Such carbon-supported platinum include, but are not limited to, for example, the catalyst specific surface area 100 ⁇ 1000m 2 Zg, it is desirable that preferably 200 meters 2 Zg above.
  • the white metal content is 20 to 70% of the total mass, preferably 40 to 60%.
  • the carbon powder as the carrier desirably has a carbon powder diameter of lOOnm or less, preferably 50 nm or less.
  • Examples of such platinum-supported carbon powder include Ishifuku Metal Industry Co., Ltd. (trade names IFP C40-II, IFPC series such as IFPC20), or Tanaka Kikinzoku Kogyo Co., Ltd. (trade names TEC10V30E—Pt, TEC10V40E—Pt, TEC10V50E). — Pt etc.).
  • FAD flavin adenyl dinucleotide
  • FAD flavin adenyl dinucleotide
  • It means an enzyme that catalyzes the dehydrogenation reaction of glucose in the presence of an external electron acceptor.
  • Examples of such enzymes include FADG DH derived from Asparagillus oryzae (Tchan-gi Bak, Biochim. Biophys. Acta 139, 277-293 (1967)), FADGDH derived from Asparagillus.
  • FADGDH derived from Burkholderia's Sephacia described later
  • FAD FAD as a coenzyme
  • its subunit alone has glucose dehydrogenase activity. It consists of a catalytic subunit and an electron transfer subunit Enzymes are known.
  • FADGDH itself as an oxidoreductase or FADGDH derived from Burkholderia cepacia! / May be used only with the FADGDH catalyst subunit, or the catalytic subunit. And a complex of electron transfer subunits.
  • the catalytic subunit plays a role of taking out glucose force electrons in the sample and donating the electrons to the electron transfer subunit, and is a flavin adenyl dinucleotide (
  • FADGDH catalytic subunit which is a FAD) coenzyme, is used. Therefore, electrons are donated from the catalytic subunit to the electron transfer subunit via the reduced FAD.
  • the content of the catalyst subunit is, for example, an amount equivalent to 5 to LOOU in terms of activity.
  • 1 unit of enzyme (1U) is known for each enzyme.
  • DCIP 2, 6— under standard assay conditions (pH 6.0, 37 ° C).
  • the absorption wavelength of DCIP the amount of 1 ⁇ glucose oxidized per minute (molar extinction coefficient is 4. 76 X 1000 ⁇ M / cm).
  • FADGDH is not particularly limited as long as it is a catalytic subunit having glucose dehydrogenation activity or a FADGDH complex in which an electron transfer subunit is bound to the catalytic subunit, and among them, Burgolderia's Sephacia, especially Burkholderia • Sephacia KS 1 strain (referred to as “KS 1 strain” in this specification! Is preferred! /.
  • KS 1 strain is a novel strain with isolated soil strength near hot springs, but it was identified as Burkholderia 's Sepia by its bacteriological properties. It is deposited as the microbial deposit number FERM BP-7306 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan).
  • the KS 1 strain has the ⁇ subunit (molecular weight of about 60 kDa), which is a force catalytic subunit disclosed in International Publication WO02Z36779, and the ⁇ subunit corresponding to cytochrome C, which is an electron transfer subunit ( GDH containing about 43 kDa a) and ⁇ subunit (about 14 kDa molecular weight) can be produced.
  • cytochrome C which is an electron transfer subunit ( GDH containing about 43 kDa a) and ⁇ subunit (about 14 kDa molecular weight
  • the oxidoreductase or a complex thereof is mixed well with the platinum-supported carbon powder and attached to the electrode.
  • a crosslinking treatment is performed with a bicrosslinking reagent such as dartalaldehyde.
  • a solid polymer electrolyte The most commonly used solid polymer electrolyte is Nafion.
  • Enzyme immobilization can be achieved by dissolving a solid polymer electrolyte such as naphthion in a solvent such as isopropanol and dropping it onto an enzyme membrane that has been adsorbed or coated and dried, or by mixing and drying a naphthion solution together with the enzyme. Capsule can be created.
  • the enzyme electrode of the present invention does not exclude this force that operates without an electron mediator.
  • an electronic mediator it is not particularly limited.
  • ferricyan potassium, phenazine methosulfate, or the like can be used.
  • the enzyme electrode of the present invention is used as a glucose sensor
  • the enzyme electrode described above is used as a working electrode.
  • a platinum electrode can be used as the counter electrode
  • an Ag ZAgCl electrode can be used as the reference electrode.
  • a buffer solution is put in a thermostatic cell, these electrodes are installed, a constant voltage is applied to the working electrode, and after the current becomes steady, a sample containing dalcose is added to the thermostatic cell to increase the current. taking measurement.
  • the glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve created with a standard concentration glucose solution.
  • the glucose concentration can be continuously measured and several glucose measurements can be continuously performed.
  • the glucose sensor further includes a collecting element for collecting blood or interstitial fluid as well as subcutaneous tissue force, and is configured so that the blood or interstitial fluid collected by the collecting element can be brought into contact with the electrode. Is done.
  • the glucose sensor may be configured to be used so that at least a part of an electrode is embedded in a subcutaneous tissue.
  • the electrode is formed on the insulating substrate.
  • the enzyme electrode of the present invention can be used as an anode of an enzyme fuel cell.
  • Substances according to the substrate specificity of the enzyme can be used as fuel.
  • a platinum-supported carbon electrode, a platinum electrode, or the like can be used, and an enzyme fuel cell without a partition wall can be constructed.
  • a general buffer solution such as a phosphate buffer solution can be used, but it can also be used in a body fluid.
  • the electromotive force can be adjusted by changing the resistance applied to the external circuit.
  • Platinum catalyst-supported carbon obtained from Ishifuku Metal Industry Co., Ltd. under the trade name IFPC40-II. Hereinafter, simply “PtC” t was mixed with 1 ⁇ l of mineral oil per mg.
  • FADGDH catalyst subunit 500U was mixed with 20 mg of PtC (platinum catalyst-supported carbon powder), freeze-dried, filled on the surface of the carbon paste electrode filled with platinum powder, polished, and then cross-linked with dartalaldehyde.
  • PtC platinum catalyst-supported carbon powder
  • FADGDH catalytic subunit (PtC) enzyme electrode was prepared.
  • FADGDH catalyst subunit 500U was mixed with 20 mg of carbon paste (CP), and after freezing, the carbon paste electrode was filled to prepare a FADGD H catalyst subunit (CP) electrode.
  • each electrode as a working electrode, a platinum wire as a counter electrode, and AgZAgCl as a reference electrode, an applied potential of +250 mV was applied and the response current value to glucose was measured in a batch format.
  • the solution was measured at 37 ° C. using 10 mM of MOPS (pH 7.0) containing ImM CaCl as a solution.
  • Fig. 1 shows the obtained response current as a current dark-course concentration curve based on the response current value in glucose OmM.
  • the response current value was hardly observed with the FADGDH catalyst subunit (CP) electrode, whereas the response current up to about 35 ⁇ was obtained with the F ADGDH catalyst subunit (PtC) electrode. A value was observed.
  • the response current value to glucose was measured in a batch format with a platinum wire as the counter electrode and Ag / AgCl as the reference electrode and an applied potential of +250 mV.
  • a carbon paste and a FADGDH composite are mixed to carry a white metal, and an electrode in which the FADGDH composite is fixed to a carbon electrode (in this specification, this electrode is referred to as a “FADGDH composite (CP) electrode”).
  • CP carbon electrode
  • the response current value was measured in the same manner. Evaluation was also made on a Pt C electrode filled only with platinum powder (IFPC-II powder) (oil base). All measurements were performed at 37 ° C.
  • Fig. 2 shows a current dulcose concentration curve in which the response current value with respect to the glucose concentration was measured using these electrodes, and the current value of the glucose concentration OmM was used as a reference value.
  • the FADGDH complex (PtC) electrode and the FADGDH complex The response value increased depending on the glucose concentration. It can be seen that the response current value of the FADGDH composite (PtC) electrode is about 10 times higher than that of the FADGDH composite (CP) electrode. Moreover, almost no response current was obtained with the (CP) electrode.
  • the FADGDH complex (PtC) electrode it is considered that the electron transfer efficiency between the enzyme electron transfer subunit and the electrode was improved by using platinum-supported carbon as the electrode material.
  • Table 1 shows the current values obtained for each electrode force at a glucose concentration of OmM.
  • FIG. 2 shows that the FAGDH composite (PtC) electrode does not have a large difference between the value measured in Ar and the value measured in the atmosphere.
  • the FAGDH composite (PtC) electrode was found to have a very low influence of dissolved oxygen and a high V, response current.
  • Fig. 3 shows the obtained resistance power curve. It is considered that the use of platinum powder in the anode and the power sword improved the catalytic efficiency of the oxygen reduction reaction in the power sword in the anode in the electron transfer efficiency between the electrode and the electron transfer subunit. The effect was remarkable in the anode.
  • Fig. 4 shows the results of evaluating the dependence of the open circuit voltage on the glucose concentration for each battery. All batteries were able to obtain a wider dynamic range by using the FADGDH complex (PtC) electrode as the force anode whose open circuit voltage increased depending on the glucose concentration.
  • PtC FADGDH complex
  • A represents an anode
  • C represents a force sword
  • FADGDH complex is omitted in the anode and is simply described as “CP” or “PtC”.
  • the open circuit voltage value was negative for low concentrations of glucose by using the FADGDH complex (PtC) electrode as the anode. This is thought to be due to the oxygen reduction reaction occurring at the anode via the electron transfer unit.
  • the wireless system currently in use cannot measure negative values, but no matter what battery is used, the glucose concentration is about ImM (20 mg / dl), which is equivalent to low blood glucose levels! It is considered possible to construct a sensor in combination with a wireless system.
  • Glucose oxidase (GOD) 25U was mixed with lmg of PtC (platinum-supported carbon powder), freeze-dried, filled on the surface of the carbon paste electrode packed with platinum powder, polished, and then cross-linked with dartalaldehyde. After processing, a GOD (PtC) electrode was produced.
  • glucose oxidase (GOD) 500U was mixed with 1 mg of CP (carbon paste), frozen, and then filled into a CP (carbon paste) electrode to prepare a GOD (CP) electrode.
  • each electrode platinum wire as the counter electrode, AgZAgCl as the reference electrode, the applied current + 250mV was applied, and the response current value to the glucose concentration was measured in batch mode.
  • the solution was measured at 37 ° C. using 10 mM of PPB (pH 7.0) containing lm of CaCl as a solution.
  • Fig. 5 shows the obtained response current as a current dark-course concentration curve based on the response current value in glucose OmM.
  • GOD (CP) electrode As can be seen from Fig. 5, almost no response current was observed for the GOD (CP) electrode, whereas a response current of about 160 A was observed for the GOD (PtC) electrode.
  • GOD (PtC) Ar which is the response current value due to the GOD (PtC) electrode in an argon atmosphere, is an increase in the response current of about 90 ⁇ , which is only about half of the measurement in air. You can see that This is because there is no hydrogen peroxide produced by the reaction of GOD and oxygen in an Ar atmosphere, and the response current is observed based on the electrode reaction due to direct electron transfer with GOD. It is presumed that a large error occurs in the air due to the strong influence of dissolved oxygen.
  • PQQGDH catalyst subunit 500U was mixed with 20 mg of PtC (platinum-supported carbon powder), freeze-dried, filled on the surface of a carbon paste electrode filled with platinum powder, polished, and then cross-linked with dartalaldehyde. A PQQGDH catalyst (PtC) electrode was prepared. Similarly, PQQGDH catalyst unit 500U was mixed with 20 mg of carbon paste, frozen and filled into a carbon paste electrode to produce a PQQGDH catalyst (CP) electrode.
  • PtC platinum-supported carbon powder
  • a response current value to glucose was measured in a batch format by applying an applied potential of +250 mV.
  • the solution was measured at 37 ° C. using 10 mM of MOPS (pH 7.0) containing ImM CaCl as a solution.
  • Fig. 6 shows the obtained response current as a current dark-course concentration curve based on the response current value in glucose OmM.
  • a response current value of several hundred nA is observed at the PQQGDH catalyst (PtC) electrode.
  • PQQGD H is used as an oxidoreductase, it is different from FADGD H even if it is replaced with a carbon powder carrying nano-level platinum particles instead of a carbon powder. It shows that a response current of 100 nA cannot be obtained.
  • an electrode having a combination force of platinum-supported carbon and FADGDH has a higher response current value and a measured value without the influence of dissolved oxygen, compared to an enzyme electrode of another combination, and is practical. It proved to be extremely superior as an electrode material.

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Abstract

　本発明においては、ナノレベルの白金粒子が担持されているカーボン粉末にフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ）を混合することにより、電子伝達蛋白質及び電子メディエータを使用することなく、高い応答電流値と溶存酸素の影響のない電流値が得られる実用的な酵素電極を提供することができる。

Description

明 細 書
酵素電極
技術分野
[0001] 本発明は、ナノレベルの白金粒子が担持されているカーボン粉末及びフラビンアデ ニンジヌクレオチド (FAD)を補酵素とするグルコース脱水素酵素 (FADGDH)を含 む酵素電極、特に、グルコースセンサとして優位に使用される酵素電極に関するもの である。
背景技術
[0002] 酵素電極とは、通常、金電極、白金電極、カーボン電極等の電極表面上に酵素が 固定ィ匕された電極のことをいう。酵素電極は、酵素の反応特異性を利用して、種々の 生理活性物質を特異的に検出するバイオセンサーとして広く使用されている。特に、 糖尿病に重要なマーカーとして血中のグルコース濃度を測定するためのグルコース センサとして使用することができる。
[0003] 酵素電極に使用される酸化還元酵素としては、例えば、グルコースォキシダーゼ（ GOD)に代表される酸化酵素がある。 GODは、グルコースに対する基質特異性が高 くて熱安定性に優れており、酵素の量産化が可能であるために生産コストが他の酵 素と比べて安価であるという利点があるが、溶存酸素の影響を受けやすぐ測定結果 の誤差が大きくなつてしまうという欠点を有する。
[0004] 他の酸化還元酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)に代表さ れる脱水素酵素がある。 GDHを使用した系は、一般に、測定サンプル中の溶存酸 素の影響を受けにくいため、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酵素量が多 く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、精度よくグルコースを測定 することができる利点を有する。しかしながら、 GDHを酵素電極として使用する際に 高い応答電流が得られ、かつ溶存酸素の影響を受けないためには具体的にどのよう な GDHをどのような電極材料と組み合わせればよいかは不明であった。
[0005] また、コレステロール酸ィ匕酵素、フルクトシアルアミン酸ィ匕酵素等を用いて、それぞ れ血中のコレステロールやフルクトシルァミンの濃度を測定するための酵素電極も研 究されている。
[0006] これらの酸化還元酵素を酵素電極に応用する場合、電極の応答電流値が低いこと が問題であった。そこで、本発明の発明者らは、電極の応答電流値を向上するため に、電子メディエータと共に電子伝達蛋白質を有する酵素電極を提案した。
[0007] 電子メディエータとは、酸化還元酵素から電極への電子伝達を媒介し得る非蛋白 質性の金属錯体、有機化合物などの酸ィ匕還元物質をいい、例えば、フェリシアンィ匕 カリウム、フエナジンメトサルフェート、フエ口センおよびこれらの誘導体が挙げられる。
[0008] 電子伝達蛋白質とは、生体の酸ィ匕還元系において、電子供与体から電子を受け取 つて還元され、次いで電子受容体に電子を渡して酸ィ匕されることのできる蛋白質をい う。電子伝達蛋白質の例としては、チトクローム b、チトクローム C,好ましくはチトク口 ーム b562などが挙げられる。
[0009] 国際公開 02Z73181号パンフレットにおいては、電子伝達蛋白質を酸化還元酵 素とともに電極上に固定ィ匕することにより、酸化還元元素から電極への、あるいは電 子メディエータへの電子伝達を促進することができ、これにより応答電流値の高 ヽ酵 素電極を得ている。
[0010] これらの酵素電極を用いたグルコース濃度の測定は、一般に、恒温セルに緩衝液 を入れ、補酵素、 CaCl 2及び電子メディエータを加えて一定温度に維持した後に、作 用電極として酵素電極を使用し、対極 (例えば白金電極)及び参照電極 (例えば Ag ZAgCl電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になつ た後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。
[0011] このように、これら従来の方法では、電子メディエータを電極内に含有又は電極表 面に固定ィ匕する力、あるいは恒温セルに水溶液としてカ卩えなければならず、酸ィ匕還 元酵素とは別に電子メディエータを準備しなければならず、プロセス複雑ィ匕し、量産 化するにはコスト的に難点があった。
[0012] また、特許文献国際公開 88Z08447号パンフレット及び特開平 2— 99849号公 報においては、白金を含有する白金化炭素粉末にグルコースォキシダーゼ酵素（G OD)を含ませた電極により高 、応答電流値が得られて 、るが、前述したように GOD を用いた電極では、溶存酸素の影響が大きぐ測定環境によって測定値に大きな差 異が生じてしま 、実用的でな!、。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明は、電子メディエータを使用することなぐ電子メディエータを使用した場合 に比べて遜色がなぐ特にグルコースセンサとして使用する際に高い応答電流値が 得られ、かつダイナミックレンジも広く得られ、しかも、溶存酸素の影響が少なく測定 環境に影響されずに高精度の測定値を得ることができる実用性の高い酵素電極を提 供することを目的とするものである。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明においては、ナノレベルの白金粒子が担持されているカーボン粉末とフラビ ンァデニンジヌクレオチド（FAD)を補酵素とするグルコース脱水素酵素（FADGDH )との組み合わせにより、電子伝達蛋白質及び電子メディエータを使用しなくても、電 極上のカーボンと酸化還元酵素間での電子の移動がスムーズになり、高い応答電流 値が得られ、かつ溶存酸素の影響がな!、酵素電極としての機能を果たせることを見 出したものである。
[0015] 本発明の酵素電極は、このように電極との電子の移動に電子メディエータを必要と しない。したがって、本発明の酵素電極をアノード触媒として使用し、隔壁のない酵 素燃料電池、特に、ワイヤレスシステムと組み合わせることで燃料電池型ワイヤレスグ ルコースセンサを構築することができる。
[0016] 本発明の酵素電極は、また、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けないという利 点を有する。したがって、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要 求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、測定結果に誤差を及ぼさずに 正確に測定できると 、う利点を有する。
[0017] 本発明の具体的構成は次のとおりである。
(1)ナノレベルの白金粒子が担持されて!、るカーボン粉末及びフラビンアデ-ンジヌ クレオチド (FAD)を補酵素とするグルコース脱水素酵素 (FADGDH)触媒サブュニ ットを含む酵素電極。
(2)ナノレベルの白金粒子が直径 lOnm以下である上記（1)に記載の酵素電極。 (3)ナノレベルの白金粒子が担持されて 、るカーボン粉末の比表面積が 200m2/g 以上である上記（1)又は（2)に記載の酵素電極。
(4)ナノレベルの白金粒子が担持されて 、るカーボン粉末の白金粒子の含有量が 2 0〜70%である上記（1)〜（3)の!、ずれかに記載の酵素電極。
(5)ナノレベルの白金粒子が担持されて 、るカーボン粉末のカーボン粉末の直径が lOOnm以下である上記（1)〜（4)の!ヽずれかに記載の酵素電極。
(6)グルコースセンサとして使用される上記（1)〜（6)の 、ずれかに記載の酵素電極
(7)燃料電池のアノード電極として使用される上記（1)〜（6)のいずれかに記載の酵 素電極。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]図 1は、 FADGDH触媒サブユニット（PtC)電極を作用極として使用して、ダル コース濃度 OmMの電流値を基準とした電流 グルコース濃度曲線を示す。
[図 2]図 2は、 FADGDH複合体（PtC)電極（空気中及び Ar雰囲気下）、 FADGDH 複合体 (CP)電極あるいは PtC電極を作用極として使用して、グルコース濃度 OmM の電流値を基準とした電流 ダルコース濃度曲線を示す。
[図 3]図 3は、 FADGDH複合体（PtC)電極あるいは FADGDH複合体（CP)電極を アノードとして酵素燃料電池を構築して得られた抵抗 電力曲線を示す。
[図 4]図 4は、 FADGDH複合体（PtC)電極あるいは FADGDH複合体（CP)をァノ ードとして酵素燃料電池を構築して得られた電流 グルコース濃度曲線を示す。
[図 5]図 5は、 GOD (PtC)電極あるいは GOD (CP)電極を作用極として使用して、グ ルコース濃度 OmMの電流値を基準とした電流 グルコース濃度曲線を示す。
[図 6]図 6は、 PQQGDH触媒サブユニット（PtC)電極を作用極として使用して、ダル コース濃度 OmMの電流値を基準とした電流 グルコース濃度曲線を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 引用により本明細書に取り込まれるものとする。また、本出願が有する優先権主張の 基礎となる出願である日本特許出願 2005— 324150号および 2006— 065657号 の明細書に記載の内容は全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。
[0020] 本発明で使用するナノレベルの白金粒子とは、平均粒径が lOnm以下、好ましくは 2〜5nmレベルの平均粒径を有する白金粒子を意味する。このようなナノレベルの白 金粒子が担持された炭素粒子は、例えば、白金を含有するジニトロジァミン白金硝酸 溶液を純水で希釈して水溶液とし、これに粉末状のカーボン、例えば、アセチレンブ ラックの粉末を加えて混合、分散し、この混合液に試薬特級エタノールを加えて、還 流加熱することによって製造することが提案されている（特開平 9— 47659号公報参 照）。また、ターゲットとしてカーボンターゲットの上に白金ターゲットを配置することに よってスパッタ法によって白金担持カーボン電極を得ることも提案されている（特開 2 003— 121407号公報参照）。
[0021] このような白金担持カーボンは、これに限定されるものではないが、例えば、触媒比 表面積 100〜1000m2Zg、好ましくは 200m2Zg以上であることが望ましい。また白 金含有量は総質量の 20〜70%、好ましくは 40〜60%が望ましい。また、担体である カーボン粉末はカーボン粉末の直径が lOOnm以下、好ましくは 50nm以下であるこ とが望ましい。また、金属比表面積 30〜： L00m2/gを有していることが望ましい。この ような白金担持カーボン粉末としては、例えば、石福金属興業株式会社 (商品名 IFP C40— II、 IFPC20など IFPCシリーズ）、あるいは田中貴金属工業株式会社 (商品 名 TEC10V30E— Pt, TEC10V40E— Pt、 TEC10V50E— Ptなど）などから入手 可能である。
[0022] 本発明で使用されるフラビンアデ-ンジヌクレオチド (FAD)を補酵素とするダルコ ース脱水素酵素 (FADGDH)とは、触媒機能を発揮するための補酵素として FADを 分子内に有しており、外部電子受容体の存在下でグルコースの脱水素化反応を触 媒する酵素を意味する。このような酵素としてはァスパラギルス 'ォリゼ由来の FADG DH (Tchan-gi Bak, Biochim. Biophys. Acta 139, 277- 293(1967)) ,ァスパラギ ラス.テレウス由来 FADGDH(Seiya Tsujimura et al" Biosci. Biotechnol. Bioch em., 70(3) 654-659(2006)),あるいは後述するブルクホルデリア 'セパシァ由来 FA DGDHのように FADを補酵素として有しておりそのサブユニット単独でグルコース脱 水素酵素活性を示す触媒サブユニットと電子伝達サブユニットとから構成されている 酵素が知られている。本発明では、酸化還元酵素として FADGDHそのもの、あるい はブルクホルデリア ·セパシァ由来 FADGDHにお!/、て報告されて 、る FADGDH触 媒サブユニットのみで使用してもよ 、し、触媒サブユニットと電子伝達サブユニットの 複合体を使用してもよい。
[0023] 触媒サブユニットは、試料中のグルコース力 電子を取り出し、この電子を電子伝 達サブユニットに供与する役割を果たすものであり、フラビンアデ-ンジヌクレオチド（
FAD)補酵素とする FADGDH触媒サブユニットが使用される。したがって、電子伝 達サブユニットに対しては、還元型 FADを介して、触媒サブユニットから電子が供与 される。
[0024] 触媒サブユニットの含有量は、例えば、活性に換算して 5〜： LOOUに相当する量と される。ここで、酵素 1単位（1U)は、各酵素ごとにその定義が知られており、例えば GDHの場合は、標準検定条件（pH6. 0、 37°C)の下で DCIP (2, 6—ジクロロフエノ ールインドフエノール）の還元にもとづく退色を、 DCIPの吸収波長である 600nmに おいて経時的に計測したときに、 1分ごとに 1 μ Μグルコースを酸ィ匕する量 (モル吸光 係数は 4. 76 X 1000 μ M/cm)として定義される。
[0025] FADGDHは、グルコース脱水素活性を有する触媒サブユニット又は FADGDH 複合体として前記触媒サブユニットに電子伝達サブユニットが結合したものであれば 特に限定されないが、その中でもブルクホルデリア'セパシァ、特にブルクホルデリア •セパシァ KS 1株（本明細書では「KS 1株」と!、う）を用いるのが好まし!/、。
[0026] KS 1株は、温泉付近の土壌力も分離した新規菌株であるが、その菌学的性質から ブルクホルデリア 'セパシァであると同定されており、平成 12年 9月 25日に独立行政 法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (〒 305 - 8566 日本国茨城県 つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に微生物受託番号第 FERM BP— 7306とし て寄託されている。 KS 1株は、その詳細については、国際公開 WO02Z36779号 公報に開示されている力 触媒サブユニットである αサブユニット（分子量約 60kDa) 、電子伝達サブユニットであるシトクロム Cに相当する βサブユニット（分子量約 43kD a)及び γサブユニット（分子量約 14kDa)を含む GDHを産出することができる。ただ し、分子量は、還元条件下での SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動において測定 したものである。
[0027] 本発明の酵素電極を製造するためには、酸化還元酵素又はその複合体を白金担 持カーボン粉末と共によく混合して電極に装着する。酸化還元酵素又はその複合体 を白金担持カーボン電極に固定ィ匕するためには、上記のように電極に装着後、例え ば、ダルタルアルデヒドなどの二架橋性試薬で架橋処理する。あるいは固体高分子 電解質を用いて固定ィ匕することもできる。固体高分子電解質として最もよく用いられ ているのが Nafion (ナフイオン）である。ナフイオンをはじめとする固体高分子電解質 をイソプロパノールなどの溶媒に溶解し、これを酵素吸着あるいは塗布乾燥させた酵 素膜の上に滴下、あるいは酵素とともにナフイオン溶液を混合し乾燥することで酵素 固定ィ匕膜を作成することができる。
[0028] 本発明の酵素電極は、原則として電子メディエータなしで動作する力 これを排除 するものではない。電子メディエータを使用する場合は、特に限定されないが、例え ばフェリシアンィ匕カリウム、フエナジンメトサルフォートなどを使用することができる。
[0029] 本発明の酵素電極をグルコースセンサとして使用する場合は、上述の酵素電極を 作用極として使用する。対極としては例えば白金電極を、参照電極として例えば Ag ZAgCl電極を用いることができる。恒温セルに緩衝液を入れてこれらの電極を装置 し、作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにダルコ一 スを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作 製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することがで きる。
[0030] また、グルコースセンサとして使用する場合、例えば、グルコース濃度を連続的に測 定し数回のグルコース測定を継続的に行うことができるように構成することもできる。こ の場合、グルコースセンサは、皮下組織力も血液または間質液を採取するための採 取要素をさらに備え、採取要素によって採取した血液または間質液を、電極に接触 させることができるように構成される。
[0031] 上記グルコースセンサは、電極の少なくとも一部を、皮下組織に埋め込んで使用す るよう〖こ構成することもできる。この場合、電極は絶縁基板上に形成される。
[0032] 本発明の酵素電極は酵素燃料電池のアノードとして使用することができる。この際、 酵素の基質特異性に従った物質を燃料とすることができる。力ソードには、白金担持 カーボン電極、白金電極などを使用することができ、隔壁のない酵素燃料電池を構 築することができる。反応溶液としては、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液を用いる こともできるが、さらには体液中においても使用できる。外部回路にかける抵抗値を 変えることで起電力を調整することができる。
[0033] 以下、実施例と比較例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施 例に限定されるものではない。
実施例 1
[0034] 白金触媒担持カーボン (商品名 IFPC40-IIとして石福金属興業より入手。以下、 単に「PtC」 t 、う）粉末を lmgあたりミネラルオイル 1 μ 1と混合した。
FADGDH触媒サブユニット 500Uを PtC (白金触媒担持カーボン粉末） 20mgと 混合し凍結乾燥後、白金粉末を詰めたカーボンペースト電極表面に充填し、表面を 研磨した後ダルタルアルデヒドによる架橋処理を行 、、 FADGDH触媒サブユニット（ PtC)酵素電極を作製した。同様に、 FADGDH触媒サブユニット 500Uをカーボン ペースト（以下 CP) 20mgと混合し凍結後カーボンペースト電極に充填し、 FADGD H触媒サブユニット (CP)電極を作製した。
[0035] それぞれの電極を作用極、白金線を対極とし、 AgZAgClを参照電極として印加 電位 + 250mVをかけてバッチ形式でグルコースに対する応答電流値を測定した。 溶液として CaClを ImM含む MOPS (pH7. 0) 10mMを用いて、 37°Cで測定した。
2
[0036] 得られた応答電流を、グルコース OmMでの応答電流値を基準として、電流 ダル コース濃度曲線として示したものが図 1である。図 1からわ力るように、 FADGDH触 媒サブユニット (CP)電極では応答電流値がほとんど観測されな力つたのに対し、 F ADGDH触媒サブユニット（PtC)電極では 35 μ Α程度までの応答電流値が観測さ れた。
[0037] 以上の結果から、白金担持カーボンに FADGDH触媒サブユニットを含む電極が アノード電極材料として有用であることがわかった。
実施例 2
[0038] 500U FADGDH複合体を IFPC— II粉末（オイルベース） 20mgとともに凍結乾 燥した。これを乳鉢を用いてよく混合し、 PtC粉末 (オイルベース）を詰めたカーボン ペースト電極（Φ 3mm)表面に充填した。表面を研磨した後、室温にて 1%ダルタル アルデヒド溶液に 30分間浸漬し架橋処理し、 lOmMTris— HCl (pH7. 0)に 20分 間浸漬することで未反応のダルタルアルデヒドをブロッキングし、リン酸緩衝液 100m M (pH7. 0)中で 1時間平衡化した（本明細書では、この電極を FADGDH複合体（ PtC)電極と!/、う）。 FADGDH複合体（PtC)電極につ 、て白金線を対極とし、 Ag/ AgClを参照電極として印加電位 + 250mVをかけてバッチ形式でグルコースに対す る応答電流値を測定した。次に、カーボンペーストと FADGDH複合体を混合して白 金が担持されて 、な 、カーボン電極に FADGDH複合体を固定化した電極 (本明細 書では、この電極を「FADGDH複合体 (CP)電極」という）を作成し、同様に応答電 流値を測定した。また、白金粉末 (IFPC— II粉末）（オイルベース）のみを充填した Pt C電極にっ ヽても評価を行った。測定は全て 37°Cで行った。
[0039] 図 2には、これらの電極を使用して、グルコース濃度に対する応答電流値を測定し 、グルコース濃度 OmMの電流値を基準値とした電流 ダルコース濃度曲線を示した 。図 2から明らかなように、 FADGDH複合体（PtC)電極および FADGDH複合体（
Figure imgf000011_0001
、てグルコース濃度依存的に応答値の増加が見られた。 FADGDH 複合体 (PtC)電極は、 FADGDH複合体 (CP)電極に比較して応答電流値が 10倍 程度高くなつていることがわかる。また、（CP)電極では応答電流がほとんど得られな かった。 FADGDH複合体（PtC)電極においては、白金担持カーボンを電極材料と して用いたことにより、酵素の電子伝達サブユニットと電極との電子伝達効率が向上 したと考えられる。
[0040] 次に、グルコース濃度 OmMにおいてそれぞれの電極力 得られた電流値を表 1に 示した。
[表 1] アノー ド F A D G D H複合体 F A D G D H複合体 F A D G D H複 P t c
( P t C ) 空気中 ( P t C ) A r中 合体 （C P )
ダルコ一ス濃度 0 mM - 7 7 0 0 1 2 0 0 1 5 一 4 0 における電流 （n A) また、アルゴン雰囲気下における FAGDH複合体 (PtC)電極のグルコース濃度に 対する応答電流曲線を図 2に示した。図 2は、 FAGDH複合体 (PtC)電極は Ar中に ぉ 、て測定した値と大気中で測定した値に大きな差が生じな 、ことを示して 、る。こ のように、 FAGDH複合体 (PtC)電極は、溶存酸素の影響が極めて少なぐかつ高 V、応答電流が得られることがわ力つた。
[0041] 以上の結果から、白金担持カーボンに FADGDH複合体を含む電極がアノード電 極材料として有用であることがわかった。
[0042] 実施例 1と実施例 2を比較すると、 FADGDH触媒サブユニット (PtC)電極の方力 ADGDH複合体 (PtC)電極より、応答電流が大きく観察されていることがわかる。こ れは、これらの実施例においては、酵素量を室温における活性値で揃え電極を作製 したため、 FADGDH触媒サブユニット（PtC)電極中の蛋白質量力 ^ADGDH複合 体（PtC)電極のそれの 3倍程度になって!/、るためと考えられる。
実施例 3
[0043] FADGDH複合体（PtC)電極または FADGDH複合体（CP)電極をアノード、 PtC 電極または白金電極を力ソードとして、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH7. 0)を反応溶液 として酵素燃料電池を構築した。反応溶液に 40mMとなるようグルコースを添加し、 外部回路に掛ける抵抗を段階的に変え、各抵抗値で得られる起電力を測定し、電力 (式 W=V2ZRより）の評価を行った。また、開回路電圧のグルコース濃度依存性の 検討も行った。
[0044] 得られた抵抗 電力曲線を図 3に示す。アノード及び力ソードにおいて白金粉末を 用いることにより、アノードにおいては電極と電子伝達サブユニット間の電子伝達効 率力 力ソードにおいては酸素の還元反応の触媒効率が向上したことによると考えら れる。また、その効果はアノードにおいて顕著であった。 [0045] それぞれの電池についての開回路電圧のグルコース濃度依存性の評価の結果を 図 4に示す。どの電池もグルコース濃度依存的に開回路電圧が上昇した力 アノード として FADGDH複合体 (PtC)電極を用いたことでより広 、ダイナミックレンジを得る ことができた。
[0046] なお、図 3及び図 4において、 Aはアノード、 Cは力ソードを示し、アノードにおいて は FADGDH複合体は省略して、単に「CP」又は「PtC」と記載されて 、る。
また、 FADGDH複合体 (PtC)電極をアノードとしたことで低濃度のグルコースに お!、て開回路電圧値はマイナスを示した。これはアノードにお 、て電子伝達サブュ ニットを介した酸素の還元反応が起きて 、ることによるものと考えられる。現在用いら れているワイヤレスシステムはマイナス値を測定することが出来ないが、どの電池に ぉ ヽても低血糖値に当たるグルコース濃度約 ImM (20mg/dl)にお!/、てプラスの 電圧値が得られていること力 ワイヤレスシステムと組み合わせてセンサを構築するこ とが可能であると考えられる。
[0047] さらに、 FADGDH複合体（PtC)電極をアノード、白金電極を力ソードとした電池に ついて Ar雰囲気下において開回路電圧のグルコース濃度依存性を検討したところ、 グルコース濃度 OmMでの開回路電圧はプラスの値を示し、空気雰囲気下における 結果と比べダイナミックレンジが狭くなつた。これは力ソード側の反応が律速になった ためと考えられる。
比較例 1
[0048] グルコース酸化酵素（GOD) 25Uを PtC (白金担持カーボン粉末） lmgと混合し凍 結乾燥後、白金粉末を詰めたカーボンペースト電極表面に充填し、表面を研磨した 後ダルタルアルデヒドによる架橋処理を行い、 GOD (PtC)電極を作製した。同様に 、グルコース酸化酵素（GOD) 500Uを CP (カーボンペースト） lmgと混合し凍結後 CP (カーボンペースト）電極に充填し、 GOD (CP)電極を作製した。
それぞれの電極を作用極、白金線を対極とし、 AgZAgClを参照電極として、印加 電位 + 250mVをかけてバッチ形式でグルコース濃度に対する応答電流値を測定し た。溶液として CaClを lm含む PPB (pH7. 0) 10mMを用いて、 37°Cで測定した。
2
同様に、アルゴン雰囲気下における GOD (PtC)電極のグルコース濃度に対する応 答電流も測定した。
[0049] 得られた応答電流を、グルコース OmMでの応答電流値を基準として、電流 ダル コース濃度曲線として示したものが図 5である。図 5からわ力るように、 GOD (CP)電 極では応答電流値がほとんど観測されなかったのに対し、 GOD (PtC)電極では 16 0 A程度の応答電流が観測された。し力しながら、アルゴン雰囲気下における GO D (PtC)電極による応答電流値である GOD (PtC) Arは、 90 μ Α程度の応答電流の 増加であり、大気中での測定の約半分にとどまつていることがわかる。これは、 Ar雰 囲気下では GODと酸素が反応して生成する過酸化水素は存在しておらず GODと の直接電子移動による電極反応に基づき応答電流が観測されているのに対して、大 気中のものでは溶存酸素の強い影響を受けた結果大きな誤差が生じているものと推 察される。
[0050] PQQGDH触媒サブユニット 500Uを PtC (白金担持カーボン粉末） 20mgと混合し 凍結乾燥後、白金粉末を詰めたカーボンペースト電極表面に充填し、表面を研磨し た後ダルタルアルデヒドによる架橋処理を行 、、 PQQGDH触媒 (PtC)電極を作製 した。同様に、 PQQGDH触媒ユニット 500Uをカーボンペースト 20mgと混合し凍結 後カーボンペースト電極に充填し、 PQQGDH触媒 (CP)電極を作製した。
[0051] それぞれの電極を作用極、白金線を対極とし、 AgZAgClを参照電極として、印加 電位 + 250mVをかけてバッチ形式でグルコースに対する応答電流値を測定した。 溶液として CaClを ImM含む MOPS (pH7. 0) 10mMを用いて、 37°Cで測定した。
2
[0052] 得られた応答電流を、グルコース OmMでの応答電流値を基準として、電流 ダル コース濃度曲線として示したものが図 6である。図 6からわ力るように、 PQQGDH触 媒 (CP)電極では応答電流値がほとんど観測されな力つた力 PQQGDH触媒 (PtC )電極では数百 nAの応答電流値が観測されていることがわかる。これは、 PQQGD Hを酸化還元酵素として用いた場合、炭素粉末との組み合わせの代わりにナノレべ ルの白金粒子が担持されているカーボン粉末との組み合わせに替えても、 FADGD Hとは異なり、数百 nAの応答電流し力得られな 、ことを示して 、る。
[0053] 以上の実施例は、本発明の例示であって、ここに示した実施例以外の材料、条件 を用いても本発明の特許請求の範囲に包含され限り、同様の効果を奏するものであ り、また、他の様々な変更、改良等が可能であることはいうまでもない。
産業上の利用可能性
以上の結果から、白金担持カーボンと FADGDHをとの組み合わせ力 なる電極が 、他の組み合わせによる酵素電極に比較して、高い応答電流値と溶存酸素の影響が な 、測定値得られ、実用的な電極材料として極めて優位であることがわ力つた。

Claims

請求の範囲
[1] ナノレベルの白金粒子が担持されて 、るカーボン粉末及びフラビンアデニンジヌク レオチド (FAD)を補酵素とするグルコース脱水素酵素 (FADGDH)を含む酵素電 極。
[2] ナノレベルの白金粒子が直径 lOnm以下である請求項 1に記載の酵素電極。
[3] ナノレベルの白金粒子が担持されて 、るカーボン粉末の比表面積が 200m2/g以 上である請求項 1又は 2に記載の酵素電極。
[4] ナノレベルの白金粒子が担持されて 、るカーボン粉末の白金粒子の含有量が 20
〜70%である請求項 1〜3のいずれかに記載の酵素電極。
[5] ナノレベルの白金粒子が担持されているカーボン粉末のカーボン粉末の直径が 10
Onm以下である請求項 1〜4のいずれかに記載の酵素電極。
[6] グルコースセンサとして使用される請求項 1〜6のいずれかに記載の酵素電極。
[7] 燃料電池のアノード電極として使用される請求項 1〜6のいずれかに記載の酵素電 極。
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