WO2007048378A1

WO2007048378A1 - Messsensor

Info

Publication number: WO2007048378A1
Application number: PCT/DE2006/001805
Authority: WO
Inventors: Thuro Arnold; Kay Grossmann; Evelyn KRAWCZYK-BÄRSCH
Original assignee: Forschungszentrum Rossendorf E.V.
Priority date: 2005-10-27
Filing date: 2006-10-13
Publication date: 2007-05-03
Also published as: DE102005051405B4; DE102005051405A1

Abstract

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Messsensoren, welche sich innerhalb einer durchstrahlbaren Probe befinden, mikroskopisch zu visualisieren. Der Messsensor dient zur Bestimmung von stoffwechselspezifischen und chemischen Parametern und ist dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen im vorgegebenen Abstand von der Spitze markiert ist.

Description

Messsensor

Die Erfindung betrifft einen Messsensor zur Aufnahme von geochemischen (z.B. pH, Eh, 02) und stoffwechselspezifischen Parametern (z.B. H₂S, H₂, S^2', Nitrit) in aquatischen, mikrobiellen und lebenswissenschaftlichen Proben im mikroskopischen Strahlengang.

Es ist bekannt, dass durch das Einbringen von Messsensoren in aquatische, mikrobielle und lebenswissenschaftliche Proben deren pH, Eh, O₂ - Werte gemessen werden können (Yu, T. and Bishop, P. L. (1998) Stratification of microbial metabolic processes and redox potential change in an aerobic biofilm studied using microelectrodes. Wat. Sei. Tech. 37 (4-5), 195-198;). Um die Zerstörung der Probe durch das Eindringen der Nadelsensoren zu minimieren und um bei der Messung lokale Unterschiede festzustellen, werden sehr feine Nadeln im Durchmesserbereich von ca. 3 bis 30 μm verwendet (Yu, T. and Bishop, P. L. (2001) Stratification and Oxidation-Reduction Potential Change in an Aerobic and Sulfate-Reducing Biofilm Studied Using Microelectrodes. Water Environment Research Vol. 73 (3), 368-373). Bei Untersuchungen von Proben mit Hilfe einer nadelsensorischen Anordnung ist es besonders wichtig, die ermittelten Messwerte genau ihrem Herkunftsort in der Probe zuordnen zu können. Die Nadeln werden dabei durch Präzisionsantriebe so genannte Mikromanipulatoren in der Probe positioniert. Die Visualisierung des Sensors innerhalb der Probe zur angenäherten Standortbestimmung erfolgt zumeist mit Hilfe von Lichtmikroskopen (Beyenal.H., Sani.R.K., Peyton,B.M., Dohnalkova.A.C, Amonette,J.E., Lewandowski.Z. (2004) Uranium Immobilization by Sulfate-Reducing Biofilms. Environ. Sei. Technol. 38, 2067-2074). Dabei wird mit dem Mikroskop auf die Spitze des Messsensors fokussiert. Diese Fokussierung der Spitze ist im Allgemeinen nur bei Durchlichtmikroskopen durchführbar. Da die Sensorspitze jedoch aus Glas besteht, ist sie sowohl im defokusierten, als auch im fokusierten Zustand schlecht erkennbar. Eine weitere Schwierigkeit ergibt sich aus der Miniaturisierung der Messsensoren, die ein Wiederauffinden und Erkennen der Sensorspitze erschwert.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Messsensoren, welche sich innerhalb einer durchstrahlbaren Probe befinden, mikroskopisch zu visualisieren. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit den in den Patentansprüchen dargelegten Merkmalen gelöst.

Eine gezielte Anfärbung der Spitze des Sensors mit Fluoreszenzfarbstoffen in Kombination mit fluoreszenzmikroskopischen Techniken führt zu einer wesentlich verbesserten Wiederauffindbarkeit.

Bei der Markierung der Messsensoren mit Fluoreszenzfarbstoffen ist besonders auf die Wahl der eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe zu achten. Um eine bessere Wiederauffindbarkeit in der Probe zu gewährleisten, werden Farbstoffe eingesetzt, die sich in ihrem Fluoreszenzsignal nicht mit bereits in der Probe befindlichen Fluoreszenzfarbstoffen überschneiden.

Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. In der zugehörigen Zeichnung zeigen

Fig. 1 die Messanordnung und

Fig. 2 mögliche Markierungen der Sensorspitze.

Die Anordnung zur Messung mit fluoreszierenden Nadelsensoren 2 in Kombination mit einem aufrechten konfokalen Laserscanning Mikroskop 1 (Fig. 1) wird an folgendem Beispiel kurz erläutert. Die sensorische Messanordnung besteht aus einem spezifischen Nadelsensor 2 mit fluoreszierender Spitze 3. Die Probe 4 befindet sich in einer Probenhalterung 5. Mit Hilfe eines manuell bedienbaren Grob- und Feinantriebes wird die Probe 4 dem Nadelsensor 2 bis zu einer gewünschten Position angenähert. Danach wird das Mikroskop 1 auf die mit einem oder mehreren fluoreszenzmarkierten Abschnitten präparierte Sensorspitze 3 fokussiert. Die fluoreszenzmarkierten Bereiche der Nadelsensoren 2 können mit einem aber bevorzugt auch mit mehreren verschiedenen fluoreszierenden Stoffen oder Elementen markiert werden. Auf diese Weise lässt sich die Messspitze innerhalb der Probe dreidimensional lokalisieren. Für Potenzialmessungen kann eine Bezugselektrode eingebracht werden. Um den aktiven Messraum des Nadelsensors 2 auf eine Fläche zu begrenzen, werden die Seitenflächen der Sensorspitze 3 mit isolierenden Materialien ummantelt. So ist gewährleistet, dass der Nadelsensor 2 nur an den Stellen in der Probe 4 Werte misst, wo sich die Sensorspitze 3 befindet.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten die Nadelsensorspitze gezielt zu markieren (Fig. 2). Die einfachste Methode besteht darin, die Spitze in einem definierten Abstand (δ= ca. 1- 100 μm) von der aktiven Messfläche entfernt punktförmig mit einem ausgewählten Fluoreszenzfarbstoff zu markieren (Fig. 2a). Als Fluoreszenzfarbstoffe kommen beispielsweise DAPI, TRITC und Texas Red in Frage. Über den Abstand δ der Fluoreszenzmarkierung zur aktiven Messfläche lässt sich der Messort in der Probe berechnen. Der Fluoreszenzfarbstoff wird hierbei so gewählt, dass sich sein Emissionssignal nicht mit dem Emissionssignal eines weiteren Fluoreszenzfarbstoffes überschneidet, welcher in der Probe zu deren Charakterisierung eingesetzt wird. Da die meisten Fluoreszenzfarbstoffe spezifisch an Probenbestandteilen binden, wird oft eine Vielzahl der Farbstoffe zur Probencharakterisierung eingesetzt. Mit einer Messsonde, welche nach dieser Methode markiert wurde, ist es somit schwierig, mehrere verschiedene Proben zu messen. Es werden in dieser Methode mehrere Messsensoren benötigt, welche mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind. Um auch mit einem Messsensor Proben mit verschiedenen Farbstoffen messen zu können, kann die Sensorspitze auch mehrfach mit verschiedenen Farbstoffen markiert werden (Fig. 2b). Die Fluoreszenzfarbstoffe können dabei ringförmig um die Sensorspitze herum platziert werden oder auf einer Geraden in verschieden definierten Abständen von der Spitze weg. Überlagern sich die Fluoreszenzen eines Markerfarbstoffes für die Sensorspitze mit den Fluoreszenzen der Farbstoffe, welche zur Probencharakterisierung eingesetzt werden, kann bei dieser Methode sofort einer der weiteren Farbstoffe zur Spitzenmarkierung angeregt werden. Die weiteren Abbildungen (Fig.2c und Fig.2d) zeigen die Möglichkeit, die Sensorspitze mit einem oder mehreren durchgehenden Fluoreszenzringen zu markieren. Das Messprinzip ist hierbei dasselbe wie bei der Punktmarkierung. Der Vorteil der Ringmarkierung liegt in der besseren Identifizierbarkeit. Durch die lineare Struktur der Ringmarkierung ist ein besseres Unterscheidungsmerkmal zu den diffusen Strukturen der Proben gegeben als bei einer Punktmarkierung. Die Intensität der Fluoreszenz ist dabei aufgrund der durchgezogenen Linie höher als bei der Punktmarkierung. Ein Nachteil bei der Ringmarkierung ist der höhere Aufwand.

Claims

MesssensorPatentansprüche

1. Messsensor zur Bestimmung von stoffwechselspezifischen und chemischen Parametern dadurch gekennzeichnet, dass der Messsensor mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen im vorgegebenen Abstand von der Spitze markiert ist.

2. Messsensor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung mit mehreren verschiedenen Farbstoffen vorgenommen ist.

3. Messsensoren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung der Sensorspitze mit organischen Fluoreszenzfarbstoffen ausgeführt ist.

4. Messsensoren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung der Sensorspitze mit fluoreszierenden Schwermetallen (z B. Cm, U) durchgeführt ist.