WO2007048357A1 - Interferon alfa y c-ficocianina para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, alérgicas y cáncer - Google Patents

Interferon alfa y c-ficocianina para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, alérgicas y cáncer Download PDF

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Majel Cervantes Llanos
Eduardo PENTÓN ARIAS
Diana GARCÍA DEL BARCO HERRERA
Carmen María VALENZUELA SILVA
Pedro Antonio LÓPEZ SAURA
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
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Definitions

  • the present invention relates to the biological sciences, biotechnology and medical sciences, especially with Neurology, Oncology, Internal Medicine and, in general, with the use of the combination therapy of immunomodulatory drugs known as active ingredients of natural products, for the treatment of autoimmune, allergic diseases and cancer.
  • the invention is based on obtaining a pharmaceutical compound that due to its anti-inflammatory, immunomodulatory, antioxidant, antiviral, antiproliferative, antitumoral and, in particular, as we demonstrated for the first time in the present invention, regulator T cell inducer, has a beneficial effect in autoimmune diseases (AD) such as Multiple Sclerosis (MS) and Rheumatoid Arthritis (RA), in allergic diseases (EAL) such as brochial asthma (AB), by reducing the number of relapses or seizures in their recurrent clinical forms or stopping Ia progression of the monophasic clinical forms and in cancer (CA) through the arrest of the growth and proliferation of tumor cells, thus preventing the progression of the tumor.
  • AD autoimmune diseases
  • MS Multiple Sclerosis
  • RA Rheumatoid Arthritis
  • EAL allergic diseases
  • AB brochial asthma
  • AD Alzheimer's disease
  • MS is common in immigrants from Europe and rare in immigrants from Africa or Asia, on the contrary, in the natives of Israel of European, Asian or African origin, the prevalence of MS is as high as in European immigrants (Leibowitz U, et al. The changing frequency of multiple sclerosis in Israel. (1973 ) Arch Neurol 29: 107-10). It is also notable that the frequency of systemic Lupus erythematosus (SLE) is dramatically lower in East Africans than in American blacks, two populations derived from the same ethnic group but exposed to different environments (Symmons DPM. Frequency of lupus in peopie of African origin (1995) Lupus 4: 176-8).
  • SLE systemic Lupus erythematosus
  • Cells with regulatory properties can be divided into 2 types: the natural ones; those generated by the thymus as cTr and those induced, those generated by antigenic stimulation under special peripheral conditions, called Th3 ', 1 TrV or' adaptive regulatory cells' (Bluestone JA, et al. Natural versus adaptive regulatory T cells. (2003) Nat Rev Immunol 3: 253-257).
  • the suppression mechanisms for induced cTr are fundamentally through the secretion of cytokines such as IL-10 and TGF- ⁇ (Groux H. Type 1 T-regulatory cells: their role in the control of immune responses. (2003) Transplantation 75: 8S-12S), however, for the natural cell-cell contact is preferentially raised.
  • Sakaguchi et al were the first to identify the CD5 molecule as a marker of cTr (Sakaguchi S, et al. Organ-specific autoimmune diseases induced in mice by elimination of T cell subset: I. Evidence for the active participation of T cells! n natural self-tolerance; deficit of a T cell subset as a possible cause of autoimmune disease. (1985) J Exp Med 161: 72-87), in addition CD45RB was identified as another marker of cTr (Powrie F, et al. Phenotypically distinct subsets of CD4 + T cells induce or Project from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. (1993) Int Immunol 5. 1461-1471).
  • CD25 the main surface marker used is CD25, (Sakaguchi S, at. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. (1995) J Immunol 155: 1151-1164). In mice, about 5-10% of CD4 + cells and 1% of CD8 + cells express CD5 high and CD45RB low , (Itoh M, et al. Thymus and autoimmunity: production of CD25 + CD4 + naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self-tolerance.
  • the cTr express high levels of those of CCR5 chemokine receptors and their counterpart in humans (CCR4 and CCR8) (Bystry RS, et al. B cells and professional APCs recruit regulatory T cells via CCL4. (2001) Nat Immunol 2: 1126 1132), this distinctive pattern of chemokine receptor expression suggests that they can be rapidly recruited to the sites of inflammation and therefore efficiently exercise control of the immune response.
  • Many groups have reported expression of glucocorticoid-induced tumor necrosis factor (GITR) in CD4 + CD25 + cells (McHugh RS, et al. CD4 + CD25 + immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveal a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor .
  • GITR glucocorticoid-induced tumor necrosis factor
  • cTr markers are also found in activated cells makes it difficult to isolate and identify CD25 as a suppressor cell marker (Shevach EM. CD4 + CD25 + suppressor T cells: More questions than answers. (2002) Nat Rev Immunol 2: 389 -400) Recent studies have shown that cTr are enriched in CD25 hl9h cells within CD4 + T cells, which express high levels of the alpha chain of the IL-2 receptor. CD4 + CD25 hi9h T cells completely inhibit the proliferation and secretion of cytokines by CD4 + T cells.
  • CD4 + CD25 high T cells differ from CD4 + CD25 + T cells in the expression levels of CD45RO and HLA-DR (Baecher-Allan C, et al. CD4 + CD25 h ⁇ gh regulatory cells in human peripheral blood. (2001) J Immunol 167: 1245-1253).
  • cTr Natural cTr derived from thymus have been described in mice and humans. In mice, the absence of cTr causes organ-specific autoimmunity. Recently, it has been shown that the transcriptional factor Foxp3 is important for the function of cTr in mice. It has been shown that Foxp3 expression is typical of CD4 + CD25 + cells and correlates with the suppressive activity of these cells. These data suggest that the failure in the generation of cTr may contribute to AD and suggest a therapeutic role for Foxp3 in the treatment of such diseases (Walker MR, et al. Induction of Foxp3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4 + CD25- T cells. (2003) J Clin lnvest 112: 1437-1443).
  • the Foxp3 transcriptional factor encoding the Scurfin protein appears to be a somewhat more exclusive marker of Tr (Brunkow ME, et al. Disruption of a new forkhead / winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. (2001) Nat Genet 27: 68-73), although the possibility of its expression in other activation conditions and other cell populations is not excluded (Morgan ME, et al. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4 (+ ) CD25 (+) T regulatory cells in humans. (2005) Hum Immunol. 1: 13-20).
  • induced cTr involves TGF- ⁇ (Nakamura K, et al. CeII contact-dependent immuno-suppression by CD4 (+) CD25 (+) regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor beta (20019 J Exp Med 194: 629-44) NK cells that have properties of NK cells and T cells can contribute to this immunoreaction (Bendelac A, et al. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. (1997) Annu Rev Imunol 15: 535-62).
  • IL-10 Th2 cytokine, produced by induced cTr, monocytes and macrophages, slows the progression of AD and EAL in experimental models (Moore KW, et al. Lnterleukin-10 and the interleukin-10 receptor. (2001) Annu Rev Immunol 19: 683-765).
  • IL-10 can also play a role in EALs by decreasing the survival of activated eosinophils (Takanashi S, et al. Lnterleukin-10 inhibits lipopolysaccharide -induced survival and cytokine production by human peripheral blood eosinophils (1994) J Exp Med 180: 711-5).
  • IL-10 and TGF- ⁇ produced by cTr can inhibit both responses (Th 1 and Th2) being the mediators of this regulation.
  • the cTr cells play an important role in the control of the immune response, for example the cTr could limit the immune response to microorganisms or anti-tumor.
  • a strategic manipulation of cTr could be performed to increase or decrease the immune response when required.
  • Autoimmune diseases are disorders of the immune system (Sl) where the cells responsible for the identification and destruction of harmful invading microorganisms mistakenly identify as foreign tissues of the body itself and attack them.
  • Some researchers offer alternative explanations, viral or bacterial causes such as: Human herpes virus 6, Epstein-Barr virus and Clamydia pneumonia bacteria.
  • Infectious agents can induce AD in different experimental conditions, some of which have their clinical counterpart.
  • a variety of mechanisms have been evoked to explain these observations, including molecular mimicry and an increase in the immunogenicity of autoantigens caused by inflammation in the white organ (Olson JK, et al. Virus-induced autoimmunity: potential role of viruses in initiation, perpetuation, and progression of T-cell mediated autoimmune disease. (2001) Viral Immunol 14: 227-250).
  • infectious agents can also suppress allergic and autoimmune disorders.
  • EAE Experimental autoimmune encephalomyelitis
  • CNS central nervous system
  • TNF- ⁇ Tumor Necrosis Factor- ⁇
  • the levels of oxidative stress were determined through the analysis of immunoreactivity for inducible nitric oxide (NO) synthase, nitrotyrosine and malonyldealdehyde, as well as through the expression of tissue protective antioxidant factors: metallothionein l + ll (MT-l + ll). Also, they determined the number of cells that develop apoptosis through the use of the TUNNEL technique.
  • the levels of oxidative stress, MT-l + ll and apoptotic cell death by EAE were significantly increased in all mice (IFN-gamma R (- / -) and wild strain), but even higher in IFN-gamma R mice ( - ⁇ -). These data support the hypothesis that IFN- ⁇ plays a protective role against EAE.
  • MS is a demyelinating disease of an autoimmune nature that primarily affects young adults.
  • MS is a CNS disease that compromises the brain and spinal cord. It has 2 fundamental characteristics that are: demyelination and axonal loss. The symptoms, severity and clinical course vary widely depending on the location sites of the plaques and the extent of demyelination, in this way it can be classified into 2 main categories: relapse-remission and chronic progressive forms.
  • MS is referred to as an EA. Theoretically, this condition develops when the immune system is damaged by genetic or environmental factors or both, causing the attack on their own tissues, in the case of MS, the tissue is myelin.
  • the body also exerts corrective actions to "turn off" the effects of the destruction of myelin-producing cells (oligodendrocytes), for example, researchers have observed an increase in the density of sodium channels that carry electrical charges, which increase their number so that nerve cells can continue to communicate despite the loss of myelin, on the other hand, the nerves retain some remyelination capacity.
  • Multiple infectious organisms have been proposed as causative agents or co-factors in the development of MS (Johnson RT. Possible viral cause of multiple sclerosis (1998) In: Viral infections of nervous system 2 nd ed. Philadelphia: Lippincott- Raven 248- 258), HIV-1 infections (Blanche P, al. Devic's optic neuromyelitis and HIV-1 infection (2000) J Neuro!
  • CD4 + T cells polarized to Th2 must be regulatory or anti-inflammatory in the lesion of MS.
  • the CD4-Th1 model must explain the variability observed in the clinical and pathological characteristics of MS.
  • the process must be clearly autoimmune, that is, it must give evidence that the host's CNS was healthy before the autoimmune attack by CD4-TM mediated mechanisms.
  • IL-4 cytokine T-secretory cells
  • TGF- ⁇ Th3
  • TM IL-10
  • the blood-brain barrier provides an effective separation between blood cells and myelin in such a way that it is irrelevant if some white cells were programmed incorrectly, therefore, a malfunction of the BHE during attacks is postulated. in the MS.
  • MMPs Metalloproteinases
  • the MS plate contains a large number of macrophages which seem to destroy myelin by digesting its proteins and lipids. Inhibitors of these enzymes responsible for this digestion can reduce the destruction of myelin or interfere with the movement of macrophages to tissues.
  • the principle of drugs used in this disease to treat acute exacerbations are based on their anti - inflammatory properties (WA Sibley and the Therapeutic Claims Committee of the International Federation of Multiple Sclerosis Societies, Therapeutic Claims in Multiple Sclerosis, 3rd Edition, 1992).
  • immunosuppressive drugs such as Mitoxantrone and Cyclosphosamide
  • Beta interferons and peptide binding peptides Main Histocompatibility Complex (MHC) that attach to the T-cell receptor (TCR), Glatiramer Acetate (GA).
  • MHC Main Histocompatibility Complex
  • Interferon Beta-1 b (Betaseron) in 1993
  • Interferon Beta-1a (Avonex) in 1996
  • Copaxone (GA or copolymer 1) in 1996 and are highly expensive.
  • IFN- ⁇ has had a great impact in the treatment of relapse-remission MS, although it is not known whether it can prevent the transition to progressive secondary MS.
  • the mechanism of action of IFN- ⁇ is unclear, probably involving alterations of a number of different mechanisms that include induction of IL-10 and inhibition of T-cell traffic by blocking metalloproteinases (Stuve, O., et al. Interferon beta-1b decreases the migration of T lymphocytes in vitro: effects on matrix metalloproteinase-9 (1996) Ann. Neurol. 40: 853-863).
  • Clinical trials are beginning that block the common p40 chain of IL-12 and IL-23 and blockade of co-stimulatory signals through B7-CD28 interactions with CTLA-4 Ig.
  • the survival of GA-reactive T cells exhibits a high degree of degeneration, measured by their ability to cross react with a wide variety of peptides.
  • RA is another autoimmune inflammatory disease that causes a high degree of disability. It is estimated that 50 to 90% of patients affected by RA have a severe disability 10 years after the diagnosis. (Markenson JA. (1991).
  • RA is a symmetric polyarticular inflammation that primarily affects the small joints of the hands and feet.
  • the tissue mass called pannus invades and destroys local joint structures.
  • CD4 + T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages infiltrate the synovium and are sometimes organized into discrete lymphoid aggregates with germinal centers.
  • the hyperplasia of the intimate layer is the result of a marked increase in synovial fibroblast type and macrophage type.
  • Degenerative enzymes expressed locally, including metalloproteinases, serum proteases and aggreganases digest the extracellular matrix and destroy the joint structure. (Firestein GS. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. (2003) Nature 423: 356-61).
  • the "epitope sharing" could function as a binding site for arthritogenic peptides or perhaps for autoantigens that mimic an exogenous antigen (molecular mimicry).
  • Some infectious agents are proposed as possible triggers of RA (Feldmann M, et al. Role of cytokines ⁇ n RA. (1996) Annu Rev Immunol 14: 397-440), particularly Parvovirus B 19 of which capacity has been demonstrated on the part of the virus inducing invasive properties in normal human synovial fibroblasts by changing the physiological phenotype (Ray NB, et al. Induction of an invasive phenotype by human parvovirus B19 in normal human synovial fibroblasts.
  • innate immunity plays an important role.
  • Mast cells are the main mediators of allergic reactions and their activation is a sufficient and necessary condition for the rapid development of microvasculature permeation and tissue edema in sensitized individuals exposed to allergens.
  • Mast cells are the main source of mediators of allergic inflammation, which include: histamine, neutral proteinases, proteoglycans, prostaglandin D 2 , leukotriene C 4 and some cytokines (Parikh SA, et al. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic nhinitis. (2003) Curr Asthma Rep 3: 266-272).
  • Bronchial asthma is a manifestation of chronic inflammation of the respiratory tract, possibly secondary to allergen hypersensitivity, therefore one of the pathways for the management of this disease is the control to minimize the inflammatory response related to allergen stimulation and the administration of anti-inflammatory therapy to resolve inflammation and prevent disease progression (Craig ML. Diversity of asthma: evolving concepts of pathophysiology and lessons from genetics. (2005) J Allergy Clin Immunol 115: S526-31)
  • Bronchial hyperreactivity is the pathophysiological framework of asthma but also occurs in individuals without asthma and can be found in 10-15% of the general population.
  • Asthma is currently conceived as a disease of genetic-environmental interaction with a complex immunobiology. It begins early in life by the release of allergens to the airways. The first stage in the immune recognition of asthma is the entry of the antigen into the immune cells. APCs, including dendritic cells, incorporate foreign proteins that can serve as antigens, hydrolyze them to small polypeptides and these can be expressed on their surface in the context of MHC class II.
  • This presentation is accompanied by expression of accessory molecules on the surface of the APC, a process that can occur near the surface of the airways and is followed by the migration of these cells, which carry the CCR7, to the iinfoide tissue, under the influence of the ligands of CCR7, EBI-1 and tissue chemokines of secondary lymphoid tissue, which also attract memory and "naive" T lymphocytes that carry CCR7.
  • the activation of the T cells by the antigen loaded in the APC occurs.
  • the local expression of cytokines can have a profound effect on the response of T lymphocytes to the antigen presentation, a process referred to as immune deviation.
  • these cells In the presence of IL-12 these cells have a Th1 phenotype that expresses IFN- ⁇ . Under the influence of IL-10, these cells can develop a regulatory phenotype, which may be important in limiting the progression of asthma.
  • the influence of IL-4 and IL-13 allows the development of a Th2 phenotype that is required for the appearance of asthma.
  • the combined action of IL-4, IL-13, CD40 and an enzyme called activation-induced citidine deaminase produces a change Deletion in the recombination of B lymphocytes and the production of allergen-specific IgE, whose levels are increased in atopic asthma. It is this ability of the IgE to specifically bind allergens and receptors on the effector cells of the allergic response, including mast cells, basophils and eosinophils, which allows the release of mediators that cause asthma symptoms.
  • the effector molecules in asthma include histamine, platelet activating factor, proteases and metabolites of arachidonic acid (AA).
  • Prostaglandins (PG) and leukotrienes (LT) which are metabolites of AA that are produced enzymatically during allergic and asthmatic reactions and are present in restricted sites within the microenvironment of the respiratory tract and influence the cells resident in the lungs and act on specific receptors (Drazen JM. Leokotrienes in asthma. (2003) Adv Exp Med Biol 525: 1-5).
  • Inflammatory effector cells in asthma produce leukotrienes, and structural lung cells produce prostaglandins (Holgate ST, et al. Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation.
  • PG and LT can also be formed as a result of oxidative stress.
  • the activation of granulocytes of the respiratory tract containing peroxidase is associated with the generation of oxidants at that level.
  • peroxidation of lipid membranes can occur. This process results in the formation of isoprostanes, oxidative stress markers.
  • the availability of polymorphic markers and phenotypically well characterized families with several members suffering from asthma, has allowed the identification of genetic variants associated with the disease.
  • asthma A model of airway narrowing in asthma and in chronic obstructive pulmonary disease . (1992) Am Rev Resp Dis 145: 1251-8). From this episodic release of procontractable mediators of the eosinophils and mast cells of the respiratory tract, asthma symptoms result.
  • the emerging concept is asthma, a disease of infectious agents, allergens and environmental toxins that, over time, leads to changes in the cellular composition and structure of the airways.
  • different subtypes of regulatory or suppressive cells have been described that can prevent the activation of effector cells "in vitro" and "in vivo" in animal models.
  • Epigenetic re-programming results in: hypermethylation of tumor suppressor genes involved in the beginning of cell cycle arrest, DNA repair and apoptosis, hypomethylation of proto-oncogenes associated with persistent proliferative activity, global genome demethylation and activation of repeated sequences of DNA.
  • the sustained proliferation and signaling in an SSE environment that can be produced by the continuous production of cytokines in a tissue subject to permanent aggression, for example, the result of exposure to a carcinogen.
  • a signaling associated with similar stress can be induced by other physiological and environmental factors including cancer inducers well known as inflammation, hormones and viral infections. The involvement of hormones in the origin and development of cancer is well documented.
  • the lymphocytotoxic response by CD8 + T cells is considered against antigens presented in the MHC class I context as the main effector branch of adaptive immunity in the antitumor immune response, in this way, the main trends of antitumor immunotherapy are aimed at increasing this CTL response.
  • IFN- ⁇ ⁇ nterferon- ⁇
  • Type I IFNs have a potent antiviral effect, they are induced after the cells are infected by viruses and give rise to the synthesis of a large number of enzymes such as 2.5'oligoadenylate synthetase that interferes with virus replication.
  • RNA or DNA This early (non-specific antigen) response is critical to limit the spread of the viral spectrum before the antigen-specific response can completely control the infection.
  • IFN- ⁇ and ⁇ can affect all phases of the cell cycle: M, G1 and G2.
  • fibroblasts are stimulated by serum, epidermal growth factor (EGF) or insulin
  • EGF epidermal growth factor
  • the IFNs cause a prolongation of the G1 phase, a reduction in the speed of entry to the S phase and a slowdown of the S and G2 phases
  • Balkwill F et al.
  • Interferon affects both G1 and S + G2 in cells stimulated from quiescence to growth. (1978) Nature 274: 798-800; Gewert DRMG, et al. Inhibition of cell proliferation by ⁇ nterferons 1.
  • IFN-regulated proto-oncogenes include c-myc (Raveh T, et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase mediates c-Myc suppression induced by type I interferons. (1996) J Biol Chem 271: 25479-25484), bcl-2 (Koshiji M, et al. Apoptosis of colorectal adenocarcinoma (COLO201) by tumor necrosis factor-alpha and / or interferon-gamma resulting from down-regulation of Bcl-2 expression.
  • Interferon ⁇ induces the expression of retinoblastoma gene product in human Burkitt lymphoma Daud ⁇ cells: role in growth regulation. (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89: 6599-6603; Resnitzky D, et al. Interferons and interleukin 6 suppress phosphorylation of the retinoblastoma protein in growth-sensitive hematopoietic cells. (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89: 402-406). The effect of IFN- ⁇ results in a reduction in one of the E2F, E2F-1 proteins.
  • Fas One of the pathways for the induction of apoptosis involves the binding of Fas to FasL, which results in the recruitment of the protein that contains the death domain, FADD and the consequent activation of caspases, such as caspase -8.
  • IFNs positively regulate Fas expression and therefore can function through the Fas-mediated apoptotic pathway (Weller M, et al. Anti-Fas / APO-1 antibody-mediated apoptosis of cultured human glioma cells. Induction and modulation of sensitivity by cytokines. (1994) J Clin Invest 94: 954-964). Fas can be positively regulated by IFN- ⁇ , (Gordon M, et al.
  • CFU-GM granulocyte-mecrophage progenitors
  • a dominant negative mutant of 2- 5A-dependent RNase suppresses antiproliferative and antiviral effects of interferon (1993) EMBO J 12: 3297-3304) .
  • the latent ribonuclease is activated by 2-5A, the induction of these enzymes can inhibit the synthesis of RNA and proteins:
  • the expression in enzymatically inactive ribonuclease (RNase-L) cells inhibits the antiproliferative and antiviral effects of IFNs
  • Apoptosis is suppressed in nu! L-RNase-L mice treated with different apoptotic agents (Zhou A, et al.
  • PKR levels are inversely correlated with the proliferative activity in different human tumors and tumor cell lines, and a PKR minin activity was found in invasive breast carcinoma (Haines GKCR, et al. Expression of the double-stranded RNA-dependent protein Kinase (p68) in human breast tissue (1996) Tumor Biol 17: 5-12; Savinova OJB, et al. Abnormal levéis and minimal activity of the ds RNA-activated protein kinase,
  • PKR expression can be controlled by an IFN-induced transcriptional factor, IRF-1 because IRF-1 rapidly increases in cells under arrest during growth, which may influence the expression of genes involved in negative growth control. cellular and can mediate the antiproliferative effect of IFNs.
  • IFNs also negatively regulate the multi-drug resistance (mdr1) gene in human colon carcinoma cells (Stein U, et al. Modulation of mdr1 expression by cytokines in human colon carcinoma cells: an approach for reversal of multidrug resistance. (1996) Br J Cancer 74: 1384-1391).
  • Array arrays have shown that the bcr gene (breakpoint cluster region) can also be negatively regulated by IFN ⁇ (Der SD 1 et al. Identification of genes differentially regulated by interferon ⁇ , ⁇ , or and using oligonucleotide arrays ( 1998) Proc Nati Acad Sci USA 95: 15623-15628).
  • Immunomodulatory effect The proportion of IFN- ⁇ producing cells (Th 1 type cells) increased in T lymphocytes cultured in the presence of IFN- ⁇ and cloned (Parronchi P, et al. IL-4 and IFN alpha and IFN gamma exert opposite regulatory effects on the development of cytolytic potential by Th 1 or Th2 human T cell clones. (1992) J Immunol 149: 2977-2983) or stimulated directly (Brinkmann V, et al. Interferon alpha ⁇ ncreases the frequency of IFN gamma-producing CD4 + T cells. (1993) J Exp Med 178: 1655-1663) via the TCR / CD3 complex. Other reports show that IFN- ⁇ induces IFN- ⁇ .
  • IFN- ⁇ knockout mice In IFN- ⁇ knockout mice, an increase in inflammation and demyelination has been observed (Tran EH, et al. IFN-gamma shapes immune invasion of the central nervous system via regulation of chemokines. (2000) J Immunol 164 : 2759-2768) which suggests the protective role of IFN- ⁇ in autoimmune demyelinating diseases such as MS and therefore its beneficial role in diseases that occur with an increase in IFN- ⁇ contrary to the pathogenic proinflammatory role that was frequently assigned the same.
  • IFNs increase the effectiveness of all cell types of immune effectors. These include cytotoxic T cells, natural killer cells (NK). Antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC) can also be increased by IFNs. In addition to the increased expression of human leukocyte antigen (HLA) molecules, IFNs directly increase the functions of T cells relevant to the cytotoxicity of tumor cells (Kayagaki N, et al. Type I interferons regulate tumor necrosis factor-related apoptosis -inducing ligand (TRAIL) expression on human T cells: a novel mechanism for the antitumoral effects of type I Interferons (1999) J Exp Med 189: 1451-1460).
  • HLA human leukocyte antigen
  • IFNs to increase the activity of NK cells and monocyte function has been demonstrated in vitro and in vivo.
  • Effect on angiogenesis Another component of the anti-tumor effects mediated by IFN is the inhibition of angiogenesis.
  • the systemic administration of IFN- ⁇ reduces the growth of tumor cells in IFN-sensitive cells, by direct regulation of the expression of angiogenic protein, bFGF (Dinney CP, et al Inhibition of Basic fibroblast growth factor expression, angiogenesis, and growth of human bladder carcinoma in mice (1998) Cancer Res 58: 808-814).
  • Antitumor effects of IFNs are the result of either the direct effect on the functional capacity or antigenic composition of the tumor cell or an indirect effect on the modulation of immune cell populations that interact with the tumor cell .
  • a certain number of genes induced by type I IFNs are involved in apoptosis and include PKR, PML, RAP46 / Bag-1, phospholipid scramblase and Factor 1 -a If a hypoxia-inducible. (Der SD, et al. Identification of genes differentially regulated by interferon ⁇ , ⁇ , or Y using oligonucleotide arrays. Proc Nati Acad Sci USA (1998); 95: 15623-15628). It would be important to determine whether the effects of IFNs in vivo could be increased by combination with apoptosis inducing agents.
  • IFNs have played an important role in clinical practice.
  • the clinically beneficial therapeutic activity of IFN- a 2 as a simple agent has been demonstrated in many malignant diseases. These findings have allowed us to talk about IFNs as the first human proteins that have increased the survival of cancer patients. Combinations of IFNs with other drugs have shown favorable results and new and more effective clinical applications.
  • IFNs When they have been combined with other therapies in animal models and cells, IFNs have increased the effectiveness of treatment in malignant diseases of diverse histology. The reduction in the number of cells or the size of the tumor and the prolongation of survival has in most cases had an additive or synergistic effect.
  • CML chronic myeloid leukemia
  • the application of IFN- ⁇ resulted in an important therapeutic response (more than 75%) in the majority of patients diagnosed de novo (Kantarjian HM, et al. Chronic myelogenous leukemia: a concise update ( 1993) Blood 82: 691-703; Talpaz M. Use of interferon in the treatment of chronic myelogenous leukemia. (1994) Semin Oncol 21: 3-7).
  • the best results in CML have demonstrated a significant clinical and cytogenetic response with IFN-Ct 2 (Talpaz M. Use of interferon in the treatment of chronic myelogenous leukemia. (1994) Semin Oncol 21: 3-7).
  • Thrombocytosis associated with myeloproliferative disorders positive or negative to the Ph chromosome, can be effectively controlled with IFN- ⁇ 2 (Ludwig H, et al. Treatment with recombinant IFN- ⁇ -2c: multiple myeloma and thrombocythaemia in myeloproliferative diseases. (1985) Oncology 42 (Suppl 1): 19-25; Talpaz M, et al. Recombinant IFN- ⁇ therapy of chromosome-negative myeloproliferative disorders with thrombocytosis. (1989) Am J Med 86: 554-558).
  • IFN- ⁇ has had a therapeutic role in lymphomas of varied histology and phenotypes of T and B cells, (Borden EC.
  • IFN- ⁇ 2 showed activity in 45% of patients with advanced cutaneous T-cell lymphoma, with responses of 3 to 25 months (Borden EC.
  • a response frequency greater than 45% occurred after treatment with IFN-Ci 2 (Foon KA, et al.
  • IFN- ⁇ In the treatment of some metastatic solid tumors, IFN- ⁇ resulted in an equivalent response to the best chemotherapeutic agents.
  • the melanoma response to IFN- ⁇ ranged from 2 to 29% (Creagan E, et al. Phase Il study of recombinant leukocyte interferon (rIFN-alpha-A) in disseminated malignant melanoma. (1984) Cancer 54: 2844 -2849; Robinson W, et al. Treatment of metastatic melanoma with recombinant interferon alpha 2. (1986) Immunobiology 172: 275-282).
  • This approach is based on the use of bioregulatory products and procedures aimed at promoting, triggering or stimulating the individual's abilities to achieve the restoration of the homeostatic functional balance altered in the disease.
  • the rational use of these active principles and procedures modifying the biological response aims to help the patient to gradually and gradually restore the normality of altered functions, by physiological mechanisms and pathways.
  • C-Fico C-Fico is a pigment attached to a protein found in a green-blue algae.
  • C-Fico monomers are linked to 2 different protein subunits called ⁇ and ⁇ , which contain at least 3 covalently bound biline chromophores and open tetrapyrrole chains without metal complexes (Duerring M, et al. Isolation, crystallization, crystal structure analysis and refinement of constitutive c-phycocyanin from the chromatically adapting Cyanobacterium fremyella diplosiplon at 1.66 A resolution (1991). J Mol Biol; 217: 577-92).
  • This prosthetic group is about 4% of the mass of the algae, indicating the presence of approximately 16 chromophoric groups per unit of molecular weight (Oh Eocha C. Phycobilins. In: Lewin RA, editor.
  • ERO reactive oxygen species
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Trolox 0.038 ⁇ g / ml of Trolox
  • Ia C-Fico Spirulina platensis Ia is a selective inhibitor of cyclooxygenase-2 (COX-2) with a very low ratio IC 50 COX-2 / IC 50 COX-I (0.04).
  • C-Fico inhibits luminol-amplified chemiluminescence (LCL) in a dose-dependent manner, probably through its ability to eliminate free radicals (OH “, H 2 O 2 , RO-) and increased peroxides during the respiratory start of phagocytic cells.
  • C-Fico could decrease the LCL signals by other routes, for example, by affectation of the enzymes involved in the production of reactive oxygen species by activated phagocytes, NADPH oxidase and myeloperoxidase or by interference either with the binding of the stimulant or the metabolic pathway of arachidonic acid.
  • C-Fico inhibition of the release of leukotriene B 4 (LTB 4 ) in an animal model of inflammation was recently evidenced. The peroxide-induced inflammatory response has been evaluated in a model "in vivo" in order to identify potential agents "scavenging" or scrubber 2 and OH- H2O.
  • glucose oxidase effects (GO) injected in the mouse leg it reacts with the endogenous glucose and generates H 2 O 2 with the consequent production of OH radicals, both are responsible for tissue damage and the accompanying inflammatory changes (Spillert CR, et al. A peroxide-induced ⁇ nflammation model for drug testing (1987) 21: 297-8).
  • C-Fico reduced the edema produced by glucose oxidase in the mouse leg. This anti-inflammatory effect may be due, at least in part, to the elimination of hydroxyl radicals.
  • C-Fico is a phycobilin found in Spirulina algae (Sp).
  • C-Fico can also be used in diseases with an important inflammatory component because there are reports related to its anti-inflammatory activity (González R, et al. Anti-inflammatory activity of Phycocyanin extract in acetic acid-induced colitis in rats. (1999) Pharm Res 39; 1: 55-59). González et al evaluated the effect of a C-Fico extract on acetic acid-induced colitis, an animal model that mimics some of the acute inflammatory responses observed in ulcerative colitis (Frettland DJ, et al.
  • C-Fico anti-inflammatory activity has also been found in the same dose range in carrageenan-induced edema in the leg of the rat and in granuloma due to cotton spots in rats (Romay Ch, et al. Further studies on anti- inflammatory activity of phycocyanin in some animal models of inflammation (1998) Inflamm Res 47 (8): 334-8). In these models Experimental inflammation as well as in experimental colitis, arachidonic acid metabolites play an important role. C-Fico significantly and dose-dependently reduced edema of the ear induced by arachidonic acid in mice, as well as carrageenan-induced edema in the leg of the rat.
  • C-Fico also showed anti-inflammatory activity in the test of subchronic granuloma by cotton spots in which sterile cotton spots are implanted in the armpits of rats. Oral administration of C-Fico resulted in significant anti-inflammatory activity in all models tested. The anti-inflammatory activity observed was attributed to the oxygen-eliminating and antioxidant activity of C-Fico and perhaps due to its inhibitory effect on the metabolism of arachidonic acid.
  • Vadiraja BB Hepatoprotective effect of C-Phycocyanin: Protection for carbon tetrachloride and R - (+) - pulegone-mediated hepatotoxicity in rats (1998) Biochem and Biophys Res Com 249: 428-431).
  • Vadiraja et al studied the effect of C-Fico on hepatotoxicity induced by R - (+) - pulegone and CCI 4 in rats.
  • C-Fico can act as an efficient radical scavenger.
  • Bhat et al Bhat VB, et al. C-phycocyanin: a potent peroxyl radical scavenger in vivo and in vitro (2000) Biochem Biophys Common Res 1: 20-25
  • C-Fico is a potent peroxyl radical scavenger with a constant velocity ratio of 1.54, compared with 3.5 for uric acid (a known peroxyl radical scavenger). It is postulated that the decrease in antioxidant defense mechanisms and the increase in reactive oxygen and nitrogen species are causal factors of the decline in functions related to age and neurodegenerative diseases (Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. (1956) J Gerontol 11: 289-300; Leibovitz BE, et al. Aspects of free radical reactions in biological systems: aging (1980) J Gerontol 35: 45-56; Ames BN, et al.
  • CNS central nervous system
  • Antioxidants increase some parameters of immune function when they are added to isolated immune cells "in vitro” or when they are given as supplements to animals and humans "in vivo" (lan SN, et al. Antioxidant, cytokines, and influenza infection ⁇ n aged mice and elderly humans (2000) J Infect Dis 182: S74-S80).
  • a potential mechanism is the effect of antioxidants on the production of immunoregulatory molecules such as cytokines.
  • Cytokines are induced in response to brain damage and can mediate and inhibit cell damage favoring repair.
  • Many clinical studies report the increased expression of cytokines in the cerebrospinal fluid (CSF) or in the post-morten brain tissue of patients who have suffered a heart attack or brain damage.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • pro-inflammatory cytokines such as IL-1 and TNF increase with age (Lynch MA. Age-related impairment in long-term potentiation in hippocampus. A role for the cytokine, interleukin-1 ⁇ ? (1998) Prog Neurobiol 56: 571-589; Knoblach SM, et al. Early neuronal expression of tumor necrosis factor- ⁇ after experimental brain injury contributes to neurological impairment.
  • C-Fico is among all the compounds that form the Sp, which has the highest antioxidant activity, evaluated against the oxidation of methyl linolate in a hydrophobic system (Hirata T, et al. Antioxidant activities of phycocyanobilin prepared fron Spirulina platensis (2000) J Appl Phycoi 12: 435-439). In one study (Gemma C, et al. Diets enriched in foods with high antioxidant activity reverse age-induced decreases in cerebellar ⁇ -adenergic function and increases in proinflammatory cytokines.
  • Anti-allergic effects In addition to the anti-inflammatory properties of C-Fico mediated by its antioxidant properties to which we have referred widely. It has been reported that C-Fico has anti-inflammatory effects in the induced allergic inflammatory response and on the release of histamine from isolated rat mast cells (Rem ⁇ rez D 1 et al. Role of histamine in the inhibitory effects of phycocyanin in experimental models of allergic inflammatory response (2002) Mediators of Inflammation, 11: 81-85). In "in vivo" experiments, C-Fico was administered 1 hour before the challenge with Ovalbumin (Ova) in the ear of mice previously sensitized with Ova. An hour later, the MPO activity and edema in the ear was evaluated. C-Fico, significantly reduced both parameters as well as inhibited the release of histamine from isolated rat peritoneal mast cells. The effect of C-Fico was dose dependent.
  • Ovalbumin Ovalbumin
  • the increased vascular permeability to plasma proteins is one of the characteristics of the allergic inflammatory response where mast cells play an important role because they can release preformed vasoactive mediators mainly histamine and in the case of rats and mice Ia serotonin (Halpern BN, et al. On the nature of the chemical mediators involved in anaphylactic reaction in mice. (1963) Br J Pharmacol 20: 389-398; Ohuchi K, et al.
  • mast cells also contain pre-formed cytokines, such as TNF- ⁇ and Vascular permeability factor / vascular endothelial cell growth factor, among others, that can be released in dependent reactions - IgE and can give the mast cells effector and immunoregulatory potentials in the response to allergic inflammatory.
  • cytokines such as TNF- ⁇ and Vascular permeability factor / vascular endothelial cell growth factor, among others, that can be released in dependent reactions - IgE and can give the mast cells effector and immunoregulatory potentials in the response to allergic inflammatory.
  • lipid mediators synthesized de novo by mast cells such as prostaglandin D 2 , leukotrienes (LTC 4 , LTD 4 , LTE 4 , LTB 4 ) and platelet activating factor (PAF), as well as reactive oxygen species (ROS)
  • ROS reactive oxygen species
  • C-Fico reduces the levels of prostaglandin D 2 and LTB 4 in the inflammation test induced by arachidonic acid, in the mouse ear (Romay C, et al. Effects of phycocyanin extract on prostaglandin E 2 levéis in Mouse eras inflammation test (2000) Arzneim Forsch / Drug Res ' 50: 1106-1109; Romay C, et al. Phycocyanin extract reduces leukotrienes B 4 levéis ⁇ n arachidonic acid-induced mouse ear inflammation test (1999) J Phar Pharmacol 51: 641-642).
  • the inhibitory effect of C-Fico on the release of histamine from isolated rat mast cells supports the participation of this event in the action mode of C-Fico as an anti-inflammatory agent.
  • ROS such as: the superoxide anion, hydrogen peroxide, hydroxyl and peroxyl radicals
  • C-Fico is capable of eliminating peroxides, hydroxyl and alkoxy radicals (Lissi EA, et al. Kinetics of phycocyanin bilin groups destruction by peroxyl root.
  • C-Fico from Spirulina platensis inhibited the growth of Ia K562 human leukemia cell line.
  • the effect of C-Fico was initially studied following the growth of K562 cells in semi-solid agar culture at concentrations of 20, 40, 80 and 169 mg-1. The results showed that C-Fico inhibited the growth of K562 leukemia cells in a dose-dependent manner with statistically significant inhibition observed at 80 and 160 mg-1.
  • the effect of C-Fico was also studied using cell viability in the XTT reduction test.
  • C-Fico again inhibited cell viability in a dose-dependent manner.
  • the IC 50 value of C-Fico was 72.5 mg "1.
  • flow cytometry experiments based on the analysis of the DNA content, revealed that the accumulation of K562 cells occurred in the G-1 phase when the cells were incubated with C-Fico for 6 days.The highest percentages of cells in G-1 phase were found at the concentrations of 40 and 80 mg-1 of C-Fico.
  • the analysis of DNA fragmentation did not show the pattern of Staging typically observed in apoptosis, which indicates that a different mechanism may be involved in this inhibition
  • the selective inhibition of COX-2 by C-Fico Reddy CM, et al.
  • AK-5 cells unlike the results of the previous study where apoptosis did not mediate the antitumor effect of C-Fico, are induced to an apoptotic death program when treated with C-Fico, this program involves the activation of Caspase-3.
  • the apoptotic death mediated by C-Fico is induced through the generation of ROS.
  • Bcl-2 an inhibitor of apoptosis, showed regular generation of ROS.
  • the AK-5 cells transfected with the Bcl-2 gene were resistant to death induced by C-Fico.
  • Genomic DNA electrophoresis of C-Fico treated cells showed the typical fragmentation pattern of apoptotic cells.
  • Flow cytometry analysis of apoptotic cells treated with 25 and 50 ⁇ M of C-Fico for 48 hours showed 14.11 and 20.93% of cells in sub G0 / G1 phase respectively.
  • C-Fico treatment of K562 cells also resulted in the release of cytochrome C in the cytosol and rupture of polymerase ribose poly (ADP) (PARP).
  • PARP polymerase ribose poly
  • This study also showed a decrease in anti-apoptotic Bcl-2 but without any change in pro-apoptotic Bax, therefore the Bcl-2 / Bax ratio favors apoptosis.
  • C-Fico The effects of C-Fico appear to be mediated by the entry of C-Fico into the cytosol by an unknown mechanism.
  • the present study also demonstrates that C-Fico induces apoptosis in K562 by release of cytochrome C from the mitochondria to the cytosol, rupture of PARP and decrease of Bcl-2.
  • DIC Document Inippon Ink & Chemicals, Inc.
  • Anti-tumor agents containing phycobillin (1983) Japanese Patent No. 58-65216
  • Activity Lymphocytic treatment group was significantly higher than the control group, suggesting some degree of immune system stimulation.
  • the present invention describes the use of a bioregulatory pharmaceutical compound aimed at promoting, triggering or recovering the affected capacities in the individual to achieve the restoration of the homeostatic functional balance altered in the disease.
  • said compound is novel since its formulation since it is constituted by a protein of the family of interferons together with a product of natural origin, demonstrating in our invention its effectiveness in the treatment of autoimmune, allergic diseases and cancer.
  • the compound referred to in this invention is composed of IFN- ⁇ , specifically recombinant IFN- ⁇ 2b and C-Ficocianina, products that can be used as part of a pharmaceutical combination of parenteral or oral administration with an appropriate excipient.
  • the said pharmaceutical combination can be used as a method of treatment by applying its active components separately in the same individual as a single treatment.
  • the components of the combination were administered by different routes, the IFN- ⁇ intraperitoneally and the C-Phycocyanin orally as part of the same treatment and no significant differences were found at the same doses between
  • the administration of the independent components by different routes and the administration of the components being part of a compound pharmaceutical by a single route, so that the route of administration does not influence the effect, so that said compound can also be administered intramuscularly, intravenously, subcutaneously, orally, nasally and intrathecally.
  • the novelty of the invention consists in demonstrating the inductive effect of natural and adaptive regulatory T cells for both the IFN- ⁇ / C-Fico pharmaceutical compound and its independent active ingredients.
  • This important property of the immune system had already been suggested for IFN- ⁇ , but our invention, in addition to proving it for IFN- ⁇ , constitutes the first report of inducing effect of regulatory T cells for C-Phycocyanin, as well as demonstrating synergistic effect of both components of the pharmaceutical compound IFN- ⁇ / C-Fico, making its use rational in diseases that occur with a decrease in the number or functionality of cTr, such as allergic and autoimmune diseases, with which development is prevented of crisis especially in the relapsing forms of these diseases.
  • a synergistic effect of the pharmaceutical compound IFN- ⁇ / C-Fico is evidenced with respect to the activity of its independent components in terms of its antiproliferative, antioxidant, anti-inflammatory and tumor cell apoptosis inducing properties.
  • the novelty of the invention consists in this case, in which the pharmaceutical compound showed to have statistically significant anticancer effects superior to its independent components, by means of its antiproliferative and apoptosis inducing properties of tumor cells evidenced by the positive regulation that it produced on the proteins p53 and later p21 necessary to maintain the arrest of the cell cycle in G2 / M phase and apoptosis followed by DNA damage.
  • C-Fico also inhibited hepatic microsomal lipid peroxidation (Halliwell B. How to characterize a biological antioxidant. (1990) Free rad Res Comm; 9: 1-32).
  • the anti-inflammatory, immunomodulatory, antiproliferative and apoptosis inducing effect of tumor cells of the C-Fico is considered to be largely mediated by its potent antioxidant activity, so that the anti-cancer effect of the C-Fico could be explained , since most neoplastic processes have a chronic inflammatory component and elements that speak in favor of a marked oxidative stress.
  • Interferon affects both G1 and S + G2 in cells stimulated from quiescence to growth. (1978) Nature 274: 798-800)
  • the cumulative effect of the prolongation of the cell cycle by IFN- ⁇ , both in normal cells and tumor cells gives rise to cytostasis, increm Ento of cell volume and apoptosis (Otsuki T, et al. Human myeloma cell apoptosis induced by interferon- ⁇ . (1998) Br J Haematol 103: 518-529).
  • Tumor cells develop alterations in one or more proteins that control the progression of the cell cycle, including IFN-regulated proto-oncogenes such as bcl2 (Koshiji M, et al.
  • a synergistic effect and dose-dependent negative regulation of bcl2 were demonstrated in tumor cells stimulated by the IFN- ⁇ / C-Fico combination.
  • One of the pathways for the induction of apoptosis involves the binding of Fas to FasL, which results in the recruitment of the protein that contains the FADD death domain and the consequent activation of caspases, such as caspase -8.
  • IFN- ⁇ positively regulates Fas expression and therefore can function through Fas-mediated apoptotic pathway as demonstrated in another particular embodiment of our invention where it was also shown that the IFN- ⁇ / C-Fico pharmaceutical compound positively modulated Fas expression in tumor cells.
  • COX-2 is a known anti-apoptotic molecule and it has been reported that C-Fico is a selective COX-2 inhibitor, thus favoring programmed cell death of tumor cells (Reddy CM, et al. Selective inhibition of cyclooxygenase- 2 by C-phycocyanin, a biliprotein from Spirulina platensis (2000) Biochem Biophys Res Commun 3: 599-603).
  • the IFN- ⁇ / C-Fico compound significantly decreased and dose-dependent levels of COX-2 expression, this being one of the mechanisms that explain the apoptosis inducing effect of tumor cells by The combination described.
  • Figure 1 Effect of independent treatments and of the IFN- ⁇ / C-Fico combination on the expression of natural (A and B) and adaptive (C and D) regulatory T cell marker genes by RT-PCR in patients with sclerosis Multiple.
  • Figure 2 Effect of the IFN- ⁇ / C-Fico combination on the ratio of CD25 / Foxp3 in patients with Multiple Sclerosis.
  • Figure 3 A) Flow Cytometry of the CD4 + CD25 + expression in peripheral blood mononuclear cells treated with the independent active principles and with the combination IFN- ⁇ / C-Fico B) Inductive effect of CD4 + C.D25 + cells and CD4 + CD25 high of the independent active ingredients and of the IFN- ⁇ / C-Fico combination.
  • Figure 4 Effect of independent treatments and of the IFN- ⁇ / C-Fico combination on the expression of natural regulatory (A and B) and adaptive (C and D) regulatory T cell marker genes by RT-PCR in patients with arthritis Rheumatoid
  • Figure 5 Effect of independent treatments and of the IFN- ⁇ / C-Fico combination on the expression of regulatory T cell marker genes natural (A and B) and adaptive (C and P) by RT-PCR in patients with bronchial asthma.
  • Figure 6 Dose-response effect of the IFN- ⁇ / C-Fico combination on the inhibition of proliferation in the HeLa cell line.
  • Figure 7 A) Effect of the IFN- ⁇ / C-Fico combination and of the independent active principles on the expression of the COX-2 and Bcl-2 genes in the K562 cell line.
  • Figure 8 Effect of the IFN- ⁇ / C-Fico combination and of the independent active principles on the expression of the Fas gene in the K562 cell line.
  • Figure 9 Effect of the independent active ingredients and of the IFN- ⁇ / C-Fico combination on the expression of the cytochrome-c protein.
  • Figure 10 Effect of the combination IFN- ⁇ / C-Fico and the independent active principles on the levels of p53 (A) and p21 (B) proteins quantified by ELISA in HepG2 cells.
  • Figure 11 Kinetics of the IFN- ⁇ / C-Fico combination on the levels of the p53 (A) and p21 (B) proteins quantified by ELISA in the HepG2 cell line.
  • Example 1 Therapeutic effect of the IFN- ⁇ / C-Fico combination and its independent active ingredients in an EAE model.
  • the IFN- ⁇ / C-Fico combination was tested in an EAE biomodel. to evaluate its therapeutic effect:
  • mice of 13Og average body weight were immunized, subcutaneously with 5 mg of spinal cord homogenate in PBS (50%) and Freund's complete adjuvant (50%), days 0 and 6.
  • the therapeutic scheme was initiated intraperitoneally with the combination IFN- ⁇ / C-Fico (200 ng / kg / day - 740 ng / kg / day), the independent active principles IFN- ⁇ (200 ng / kg / day) and C-Fico (200 ng / kg / day) and placebo (PBS).
  • the therapeutic scheme was followed by space of 10 days by means of the evaluation of the clinical evolution of the disease according to the following clinical index: 0; no alterations, 1; complete paralysis of the tail, 2; paralysis of one of the lower limbs, 3; complete paralysis of the posterior train, 4; complete paralysis of the posterior train and paralysis of the anterior train, 5; death.
  • Weight loss and bladder or rectal sphincter incontinence which are also clinical signs of the disease in the animal were assessed by adding 0.5 to the clinical index mentioned above.
  • the animals were anesthetized and sacrificed, the brain and spinal cord of each animal was processed (10% formalin fixation, staining with H&E and Luxol Blue) for histopathological analysis.
  • the histopathological criteria considered were, the number and size of the perivascular inflammatory infiltrate, demyelinating lesions, apoptosis of neurons or glands, and astrocyte reactivity. All observations were made blindly.
  • the IFN- ⁇ / C-Fico combination protects experimentally induced animals to develop EAE, since only 50% of these animals develop the mildest form of the disease and the rest do not get sick. This is not the case in the rest of the groups where the incidence of the disease is 100% (groups treated with the independent active ingredients and placebo).
  • the mean clinical index of the group treated with the IFN- ⁇ / C-Fico combination is 0.37 ⁇ 0.47, that of the groups treated with the independent active principles is 1.37 ⁇ 1.7 for the IFN- ⁇ and 1.5 ⁇ 1.6 for the C- Fico and that of the placebo group is 1.7 ⁇ 1.4.
  • a total of 8 rats per group was used and the comparisons were made according to the Newman Keuls multiple comparison test for p ⁇ 0.001.
  • Example 2 Therapeutic effect of the IFN- ⁇ / C-Fico combination using different routes of administration.
  • group I combination IFN- ⁇ / C- Fico (200 ng / kg / day - 7400 ⁇ g / kg / day) intraperitoneal
  • group II IFN- ⁇ / C-Fico combination where IFN- ⁇ is administered at (200 ng / kg / day) intraperitoneally and Ia C -Fico at a rate of 7400 ⁇ g / kg / day orally through gastric intubation
  • group III placebo. This therapeutic scheme was followed for 10 days. Clinical measurements were performed as explained in the previous example.
  • the IFN- ⁇ / C-Fico combination either by the intraperitoneal administration route or by the intraperitoneal / oral routes respectively, protects experimentally induced animals to develop EAE. In both cases, only 40% of the animals developed the disease with respect to the placebo group where 100% of the animals became ill.
  • the mean clinical index of the group treated with the intraperitoneal IFN- ⁇ / C-Fico combination is 0.37 ⁇ 0.17, that of the group treated with the oral IFN- ⁇ / C-Fico combination is 0.35 ⁇ 0.11 and that of the group treated with the placebo is 1.7 + 1.4.
  • a total of 8 rats per group were used. The statistical comparison between the groups was p ⁇ 0.001. The Newman Keuls multiple test "test" was used.
  • Example 3 Evaluation of the inductive effect of natural and adaptive regulatory T cells by the combination IFN- ⁇ / C-Fico and its independent active principles in mononuclear cells of patients with Multiple Sclerosis.
  • CD25 Oligo 5 J -Sequence of 20 base pairs (bp) from position 618 to 637. Oligo 3'-Sequence of 20 bp from position 1053 to 1072, amplify a band of 454 bp of the sequence with number of access NM_000417. Foxp3: Oligo 5'-Sequence of 20 bp from position 482 to 501. Oligo 3'- Sequence of 20 bp from position 762 to 781, amplify band of 299 bp of the sequence with access number NM_014009.
  • IL-10 Oligo 5'-Sequence of 20 bp from position 358 to 377. Oligo 3'- Sequence of 22 bp from position 687 to 709, amplify 351 bp band of the sequence with access number NM_000572.
  • TGF- ⁇ Oligo 5'-Sequence of 19 bp from position 1209 to 1227. Oligo 3'- Sequence of 19 bp from position 1564 to 1582, amplify 373 bp band of the sequence with access number NM__000660.
  • GAPDH Oligo 5'-Sequence of 18 bp from position 386 to 403. Oligo 3'- Sequence of 20 bp from position 561 to 580, amplify 164 bp band of the sequence with access number NM_002046.
  • GAPDH was used as a constitutive expression gene against which the relative values obtained by application of the Molecular Analysis software were normalized to the densitometry of the 2% agarose gels where the PCR products were run.
  • results are expressed as the mean or median (according to the distribution of the variable) of the relative values of RNA normalized with the GAPDH, the mean or medium and the 3 cellular variants were compared with treatment with respect to the control of single cells and it was calculated the p value associated with the statistician in patients and controls.
  • results show an inducing effect of CD4 + CD25 + and CD4 + CD25 h ⁇ gh cells , for the independent components and even greater for the IFN- ⁇ / C-Fico combination in both patients and controls (the results presented in our invention they are representative of 3 patients and 3 controls).
  • the inducing effect of the lFN- ⁇ / C-Fico combination reached the maximum biologically possible values (see Figures 3A and 3B).
  • Example 4 Evaluation of the inductive effect of natural and adaptive regulatory T cells of the IFN- ⁇ / C-Fico combination and its independent active principles in mononuclear cells of patients with Rheumatoid Arthritis. For the evaluation of the effect on the cTr marker genes, we proceeded as explained in the previous section only that 6 patients and 6 controls were included.
  • Example 5 Evaluation of the inductive effect of natural and adaptive regulatory T cells of the IFN- ⁇ / C-Fico combination and its independent active principles in mononuclear cells of patients with bronchial asthma.
  • the antitumor activity of the IFN- ⁇ / C-Fico combination was demonstrated through the evaluation of the antiproliferative, cytotoxic and tumor cell apoptosis inducing activity.
  • several human tumor cell lines were analyzed "in vitro": HeLa (Human cervical carcinoma), HepG2 (Human hepatocarcinoma), A375 (Human Melanoma), HL60 (Human Promyelocytic Leukemia), K562 (Human Erythroleukemia), PBMC (Peripheral Mononuclear Blood Cells).
  • Each cell line evaluated was cultured at the total amount of cells referred to above, in the culture medium established for the growth of each line, 100 ⁇ l / well was added and incubated for 24 hours at 37 degrees Celsius 5% CO 2 , at After this time, the culture medium was replaced by means that contained the different treatments in duplicate: A) Single cells, B) Cells + 5 ⁇ M IFN- ⁇ 2b, C) Cells + 20 ⁇ M C-Fico, D) Cells + 5 ⁇ M IFN- ⁇ 2b / 20 ⁇ M C-Fico. The treated cells were incubated for an additional 48 hours under the same conditions. Subsequently, MTT was added and its soluble products were read at 540 nm in a plate reader (Multiscan, Titertek).
  • Figure 6 shows the dose-dependence of the effect of the IFN- ⁇ / C-Fico combination on the inhibition of proliferation in the HeLa cell line.
  • the apoptosis inducing activity of the IFN- ⁇ / C-Fico combination and its independent active principles was also evaluated through its effect on the expression of the genes of COX-2 and Bcl-2 by RT-PCR and Ia expression of the cytochrome-c protein by Western-Blot.
  • RNA / experimental variable extracted from the K562 cell line was started.
  • the RT reaction was performed in a total volume of 20 ⁇ l which were subsequently divided into 2 PCR reactions of 10 ⁇ l each.
  • GAPDH was used as a constitutive expression gene against which the relative values obtained by application of the Molecular Analysis software were normalized to the densitometry of the agarose gels where the PCR products were run.
  • Fas can be positively regulated by IFN- ⁇ , (Gordon M, Marley SB, LewisJL, et al. Treatment with interferon-alpha preferentially reduces the capacity for amplification of granulocyte-mecrophage progenitors (CFU-GM) from patients with chronic myeloid leukaemia but normal spares CFU-GM. (1998) J Clin Invest 102: 710-715) This event promotes Fas-mediated apoptosis (Selleri CMJ, Pane F, Luciano L, et al.
  • Fas-mediated modulation of bcr / abl in chronic myelogenous leukaemia results in differential effects on apoptosis (1998) Blood 92: 981-989), in our invention it was evaluated if the IFN- ⁇ / C-Fico combination had a positive regulatory effect of Fas that IFN- ⁇ alone.
  • Experimental variants were explained, which are explained in the previous example, 10 5 cells / experimental vaptant of the K562 cell line were incubated for 4 hours with the different treatments and the Fas level expression was measured by RT-PCR as explained. in previous headings.
  • Proteasome inhibitors induces apoptosis in glucocorticoid-resistant chronic lymphocytic leukemia lymphocytes . (1998) Blood 92: 4220). 5 ⁇ g of proteins / experimental variable, from K562 cells treated as explained above for an incubation time of 24 hours, were analyzed by PAGE-SDS electrophoresis on a 15% acriiamide gel, then the proteins were transferred to a membrane of nitrocellulose, the specific protein was evidenced with the use of a murine anti-cytochrome-c monoclonal antibody.
  • the proteins p53 and p21 are necessary to maintain the arrest of the cell cycle in the G2 / M phase and the apoptosis followed by DNA damage.
  • an ELISA Roche Molecular Biochemical, Germany
  • an ELISA Calbiochem, Cambridge, MA, USA
  • the cells were treated with the combination 30nglFN- ⁇ 2b / 50 ⁇ MC-Fico or the independent components at the concentrations referred to above for the experiments shown in Figure 7A and for 6, 12, 24 and 48 hours for the experiments shown in Figure 7B.

Abstract

La presente invención consiste en la combinacion de Interferón alfa y C- Ficocianina (IFN-α / C-Fico) en la obtención de una preparación farmacéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, alérgicas y el cáncer. Los efectos antinflamatorios, inmunomoduladores, antioxidantes, antivirales, antiproliferativos, antitumorales, asociados al efecto inductor de células T reguladoras que se demuestra en esta invención, hacen racional el uso de la combinación IFN-α / C-Fico en estas enfermedades.

Description

INTERFERON ALFA Y C-FICOCIANINA PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES, ALÉRGICAS Y CÁNCER.
Campo de Ia técnica
La presente invención se relaciona con las ciencias biológicas, Ia biotecnología y las ciencias médicas, en especial con Ia Neurología, Ia Oncología, Ia Medicina Interna y, en general, con el uso de Ia terapia combinada de fármacos inmunomoduladores conocidos presentes como principios activos de productos naturales, para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, alérgicas y el cáncer. La invención se basa en Ia obtención de un compuesto farmacéutico que por sus efectos antinflamatorios, inmunomoduladores, antioxidantes, antivirales, antiproliferativos, antítumorales y en especial, según demostramos por primera vez en Ia presente invención, inductor de células T reguladoras, tiene un efecto beneficioso en enfermedades autoinmunes (EA) como Ia Esclerosis Múltiple (EM) y Artritis reumatoide (AR), en enfermedades alérgicas (EAL) como el asma broquial (AB), al reducir el número de recaídas o crisis en sus formas clínicas recurrentes o detener Ia progresión de las formas clínicas monofásicas y en el cáncer (CA) a través de Ia detención del crecimiento y proliferación de las células tumorales, evitando de esta forma Ia progresión del tumor.
Estado de Ia técnica anterior
Diferentes estudios epidemiológicos han proporcionado fuertes evidencias del aumento de las EAL y EA en los países desarrollados en las últimas 3 décadas. La incidencia de muchas enfermedades de estos 2 tipos se ha incrementado: asma (Wooicock AJ, et al. Evidence for the increase in asthma worlwide. (1997) CIBA Found Symp 206: 122-134), rinitis (Upton MN, et al. Intergenerational 20 year trends in the prevalence of asthma and hay fever in adults: The Midspan family study surveys of parents and offspring. (2000) BMJ 321 : 88-92) y dermatitis atópica (Williams HC. Is the prevalence of atopic dermatitis increasing? (1992) Clin Exp Dermatol 17: 385-391), representando EAL y Esclerosis Múltiple (Rosati G, et al. Incidence of Múltiple sclerosis in the town of Sassari, Sardinia, 1965 to 1985: evidence for increasing ocurrence of the disease. (1988) Neurology 38: 384-388; Poser S, et al. Increasing incidence of múltiple sclerosis in South Lower Saxony, Germany. (1989) Neuroepidemiology 8: 207-213), diabetes mellitus insulino-dependiente (diabetes tipo I) (DTI) particularmente en jóvenes (EURODIAB ACE study group. Variation and trends ¡n incidence of childhood diabetes in Europe. (2000) Lancet 355: 873-876) y enfermedad de Crohn (Swarbrick ET, el al. A critical review of epidemiological studies in inflammatory bowel disease. (2001) Scand J Gastroenterol 36: 560a), como representantes de EA. Concomitantemente, ha existido una evidente disminución de Ia incidencia de muchas enfermedades infecciosas en los países desarrollados como resultado del uso de antibióticos, vacunación o más simplemente, por las mejores condiciones higiénicas y socioeconómicas.
Existen varias explicaciones para este incremento de las EA y EAL fundamentalmente relacionados con factores genéticos y ambientales que intervienen en su patogénesis.
En cuanto a los factores genéticos, por ejemplo, en Japón, existe una baja frecuencia de los alelos (DR3 y DR4-DQB1*0302) que incrementan Ia susceptibilidad a Ia DTI juvenil y Ia incidencia de esta enfermedad es también baja, por el contrario, Ia incidencia de DTI es alta en los residentes de Cerdeña (cuando se compara con las regiones vecinas), así como en los descendientes de primer grado de los habitantes de Cerdeña que migraron al continente italiano (Muntoni S, et al. Incidence of insulin-dependent diabetes mellitus among Sardinian-heritage children born in Lazio región, Italy. (1997) Lancet 349: 160-2). Los factores ambientales podrían explicar el rápido incremento de las EA y EAL en los países desarrollados. Existen datos sobre Ia incidencia de EM, DTI y AB en poblaciones que migraron de un país a otro los cuales difieren en Ia incidencia de estas enfermedades. La velocidad de desarrollo de Ia DTI en los niños de Pakistaníes que migraron al Reino Unido es Ia misma que Ia velocidad de los nativos en el Reino Unido (11 ,7/100 000) o alrededor de 10 veces más alta que Ia incidencia de DTI en Pakistán (1/100 000) (Bodansky HJ, et al. Evidence for an environmental effect in the aetiology of insulin dependent diabetes ¡n a transmigratory population. (1992) BMJ 304: 1020-2). En Israel, Ia EM es común en los inmigrantes de Europa y rara en los inmigrantes de África o Asia, por el contrario, en los nativos de Israel de origen europeo, asiático o africano, Ia prevalencia de EM es tan alta como en los inmigrantes europeos (Leibowitz U, et al. The changing frequency of múltiple sclerosis in Israel. (1973) Arch Neurol 29: 107-10). Es también notable que Ia frecuencia de Lupus eritematoso sistémico (LES) es dramáticamente más baja en los africanos del este que en los negros americanos, dos poblaciones derivadas del mismo grupo étnico pero expuestas a ambientes diferentes (Symmons DPM. Frequency of lupus in peopie of African origin (1995) Lupus 4: 176-8). El grado de influencia de los factores genéticos y ambientales en Ia susceptibilidad a EA y EAL está aún por definir. Uno de los principales hechos deriva de Ia concordancia de tales enfermedades en gemelos monocigóticos. La proporción es de un 25% para el caso de Ia EM, (Murnford CJ, et al. The British Isles survey of múltiple sclerosis in twins. (1994) Neurology 44: 11-5), 40% para Ia DTI (Bach JF. Insulin-dependent diabetes mellitus as an autoimmune disease. (1994) Endocr Rev 15: 516-42) y 75% para el caso del asma (Skadhauge LR, et al. Genetic and environmental influence on asthma: a population-based study of 11 ,688 Danish twin pairs. (1999). Eur Respir J 13. 8- 14). Se podría asumir que Ia concordancia está directamente relacionada a Ia penetrancia de Ia enfermedad, con Ia condicional de que es imposible incluir en este análisis pares de gemelos en los cuales ambos gemelos tengan todos los genes de predisposición pero estén libres de enfermedad. Recientemente se han realizado mayores progresos con Ia identificación de áreas cromosomales que incluyen genes que predisponen a las personas a EM (Oksenberg JR, et al. Múltiple sclerosis: genomic rewards. (2001) J Neuroimmunol 113: 171-84), DTI (Todd JA. Genetics of type I diabetes. (1997) Pathol (Paris) 45: 219-27) y asma (Cookson WOC. Asthma genetics. (2002) Chest 121 : Suppl: 7S-13S), pero está disponible muy poca información acerca de los genes relacionados con Ia enfermedad, con excepción de los genes del HLA en EA. Un elemento crucial es identificar cual o cuales de estos genes modulan directamente Ia sensibilidad para favorecer o protegerse de factores ambientales. Un ejemplo es Ia observación en pacientes con enfermedades atópicas que el único polimorfismo se encuentra en los genes codificantes para IL-10 y TGF-β (Hobbs K, et al. lnterleukin-10 and transforming growth factor-beta promote polymorphisms in allergics and asthma. (1998) Am J Respir Crit Care Med 158: 1958-62), dos citoquinas que pueden contribuir ai efecto protector de las infecciones sobre las enfermedades alérgicas.
El desarrollo de Ia mayoría de las EA depende de las citoquinas IL-2 e IFN-γ producido por las células TM , mientras que el desarrollo de las enfermedades alérgicas requiere IL-4 e IL-5, ambas producidas por las células Th2. La regulación negativa recíproca de las células Th1 por citoquinas Th2 y de células Th2 por citoquinas Th 1 , ofrece Ia posibilidad que estas citoquinas estén involucradas en Ia protección mediada por Ia infección contra EA o EAL. Contrariamente a reportes iniciales, (The EURODIAB Substudy 2 study group. Decreased prevalence of atopic diseases in children with diabetes. (2000) J Pediatr 137: 470-4) existe una asociación entre EA y EAL en pacientes individuales: Ia frecuencia de enfermedades atópicas se incrementa en pacientes con diabetes y artritis reumatoide (Kero J, et al. TH 1 and TH2 disease coexist? Evaluation of asthma incidence in children with coeliac disease, type I diabetes, or rheumatoid arthritis: a register study. (2001) J Allergy Clin Immunol 108: 781-3; Simson CR, et al. Coincidence of immune- mediated diseases driven by Th 1 and Th2 subsets suggests a common aetiology: a population -based study using computerized general practice data. (2002) Clin Exp Allergy 32: 37-42). Estas observaciones avalan el concepto de un mecanismo común entre autoinmunidad y alergia.
Se ha dedicado considerable atención a las células T CD4+ que expresan Ia cadena α del receptor de IL-2 (CD25), denominadas células T reguladoras (cTr) ya que Ia depleción de estas células en ratones sanos induce un Síndrome poliautoinmune (Assano M1 el al. Autoimmune disease as a consequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation. (1996) J Exp Med 184: 387-96), observación que avala Ia importancia del mantenimiento de los niveles y Ia funcionalidad adecuada de esta subpoblación celular para evitar Ia generación de una EA. La siguiente caracterización fenotípica detallada de tales células preventivas autoinmunes ahora no ofrece dudas de Ia existencia de las células T reguladoras como mediadores cruciales de tolerancia a Io propio en modelos animales y en humanos.
Las células con propiedades reguladoras pueden dividirse en 2 tipos: las naturales; aquéllas generadas por el timo como cTr y las inducidas, aquéllas generadas por estimulación antigénica bajo condiciones especiales en periferia, denominadas Th3', 1TrV o 'células reguladoras adaptativas' (Bluestone JA, et al. Natural versus adaptive regulatory T cells. (2003) Nat Rev Immunol 3: 253- 257). Los mecanismos de supresión para las cTr inducidas son fundamentalmente a través de Ia secreción de citoquinas como IL-10 y TGF-β (Groux H. Type 1 T- regulatory cells: their role in the control of ¡mmune responses. (2003) Transplantation 75: 8S-12S), sin embargo, para las naturales se plantea preferencialmente el contacto célula-célula. Sakaguchi y col fueron los primeros en identificar a Ia molécula CD5 como marcador de cTr (Sakaguchi S, et al. Organ-specific autoimmune diseases induced ¡n mice by elimination of T cell subset: I. Evidence for the active participation of T cells ¡n natural self-tolerance; déficit of a T cell subset as a posible cause of autoimmune disease. (1985) J Exp Med 161 : 72-87), además CD45RB fue identificado como otro marcador de cTr (Powrie F, et al. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or Project from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. (1993) Int Immunol 5. 1461-1471). Más recientemente, el principal marcador de superficie usado es el CD25, (Sakaguchi S, el at. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. (1995) J Immunol 155: 1151-1164). En ratones, alrededor del 5-10% de las células CD4+ y el 1 % de las células CD8+ expresan el CD5high y CD45RBlow, (Itoh M, et al. Thymus and autoimmunity: production of CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self-tolerance. (1999) J Immunol 162: 5317-5326), en humanos las cTr son del 6-10% de las células CD4+ (Ng WF, el at. Human CD4+CD25+ cells: a naturally ocurring population of regulatory T cells. (2001) Blood 98: 2736-2744). Las cTr muestran elevados niveles de CD11a (LFA-1), CD44, CD54 (ICAM-1), CD103 en ausencia de aparente estimulación antigénica (McHugh RS, et al. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveáis a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. (2002) Immunity 16: 311-323), adicionalmente expresan CD152 (CTLA-4), una molécula solamente expresada después de Ia activación celular (Takahashi T, et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+ regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4. (2000) J Exp Med 192: 303-310).
Las cTr expresan elevados niveles de los de receptores de quimiocionas CCR5 y su contraparte en el humano (CCR4 y CCR8) (Bystry RS, et al. B cells and professional APCs recruit regulatory T cells via CCL4. (2001) Nat Immunol 2: 1126-1132), este patrón distintivo de expresión de receptores de quimiocinas sugiere que pueden ser rápidamente reclutadas a los sitios de inflamación y por tanto ejercer eficientemente el control de Ia respuesta inmune. Muchos grupos han reportado expresión del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR) en las células CD4+CD25+ (McHugh RS, et al. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveáis a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. (2002) Immunity 16: 311-323). El hecho de que marcadores de cTr se encuentren también en células activadas dificulta su aislamiento e identificación del CD25 como marcador de células supresoras (Shevach EM. CD4+CD25+ suppressor T cells: More questions than answers. (2002) Nat Rev Immunol 2: 389-400) Recientes estudios han mostrado que las cTr están enriquecidas en células CD25hl9h dentro de las células T CD4+, que expresan elevados niveles de Ia cadena alfa del receptor de IL-2. Las células T CD4+CD25hi9h inhiben completamente Ia proliferación y secreción de citoquinas por las células T CD4+. Las células T CD4+CD25high difieren de las células T CD4+CD25+ en los niveles de expresión de CD45RO y HLA-DR (Baecher-Allan C, et al. CD4+CD25hιgh regulatory cells in human peripheral blood. (2001) J Immunol 167: 1245-1253).
Se han descrito cTr naturales derivadas del timo en ratones y humanos. En ratones, Ia ausencia de cTr provoca autoinmunidad órgano-específica. Recientemente, se ha demostrado que el factor transcripcional Foxp3, es importante para Ia función de las cTr en ratones. Se ha demostrado que Ia expresión de Foxp3 es típica de células CD4+CD25+ y se correlaciona con Ia actividad supresiva de estas células. Estos datos sugieren que el fallo en la generación de cTr pueda contribuir a Ia EA y sugieren un papel terapéutico para Foxp3 en el tratamiento de tales enfermedades (Walker MR, et al. Induction of Foxp3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25- T cells. (2003) J Clin lnvest 112: 1437-1443). El factor transcripcional Foxp3 que codifica para Ia proteína Scurfin parece ser un marcador algo más exclusivo de Tr (Brunkow ME, et al. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. (2001) Nat Genet 27: 68-73), aunque no se excluye Ia posibilidad de expresión del mismo en otras condiciones de activación y otras poblaciones celulares (Morgan ME, et al. Expression of FOXP3 mRNA ¡s not confined to CD4(+)CD25(+) T regulatory cells in humans. (2005) Hum Immunol. 1 :13-20).
El mecanismo de acción de las cTr inducidas involucra al TGF-β (Nakamura K, et al. CeII contact-dependent immuno-suppression by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor beta. (20019 J Exp Med 194: 629-44). Las células NK que tienen propiedades de células NK y células T pueden contribuir a esta inmunoreguiación (Bendelac A, et al. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. (1997) Annu Rev Imunol 15: 535-62).
IL-10, citoquina Th2, producida por cTr inducidas, monocitos y macrófagos, enlentece Ia progresión de las EA y EAL en modelos experimentales (Moore KW, et al. lnterleukin-10 and the interleukin-10 receptor. (2001) Annu Rev Immunol 19: 683-765). La IL-10 puede también jugar un papel en las EAL por disminución de Ia sobrevida de los eosinófilos activados (Takanashi S, et al. lnterleukin-10 inhibits lipopolysaccharide -induced survival and cytokine production by human peripheral blood eosinophils (1994) J Exp Med 180: 711- 5). Dos grupos de investigadores han encontrado que existe considerablemente menos cantidad de IL-10 en los pulmones de pacientes con asma que en los pulmones de sujetos controles (Lim S, et al. Haplotype associated with low interleukin-10 production in patients with severe asthma. (1998) Lancet 352: 113; Takan ashi S, et al. lnterleukin-10 level in sputurn ¡s reduced in bronchial asthma, COPD and ín smokers. (1999) Eur Resp J 14: 309-14).
Estos datos sugieren que Ia IL-10 y TGF-β producidos por las cTr, pueden inhibir ambas respuestas (Th 1 y Th2) siendo los mediadores de esta regulación. Las células cTr juegan un importante papel en el control de Ia respuesta inmune por ejemplo las cTr podrían limitar Ia respuesta inmune a microrganismos o anti-tumoral. Se podría realizar una manipulación estratégica de cTr para aumentar o disminuir Ia respuesta inmune cuando se requiera. (Fehérvari Z, et al. A paragon of self-tolerance: CD25+CD4+ regulatory T cells and the control of immune responses (2004) Arthritis Res Ther 6: 19-25). El efecto inductor de cTr de Ia combinación IFN-α / Fico demostrado en nuestra invención podría justificar su uso en en las EA y EAL donde existe un desequilibrio de las células efectoras y las cTr, con disminución del número y/o funcionalidad de las cTr.
Las enfermedades autoinmunes son trastornos del sistema immune (Sl) donde las células responsables de Ia identificación y destrucción de microorganismos invasores dañinos identifican erróneamente como extraños tejidos del propio organismo y los atacan. Algunos investigadores ofrecen explicaciones alternativas, causas virales o bacterianas tales como: Herpes virus 6 humano, virus de Epstein-Barr y Ia bacteria Clamydia pneumonía. Los agentes infecciosos pueden inducir EA en diferentes condiciones experimentales, algunas de las cuales tienen su contraparte clínica. Una variedad de mecanismos han sido evocados para explicar estas observaciones, incluyendo Ia mímica molecular y un incremento en Ia inmunogenicidad de autoantígenos causados por inflamación en el órgano blanco (Olson JK, et al. Virus-induced autoimmunity: potential role of viruses in initiation, perpetuation, and progression of T-cell mediated autoimmune disease. (2001) Viral Immunol 14: 227-250). Paradójicamente, los agentes infecciosos pueden también suprimir trastornos alérgicos y autoinmunes.
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es una enfermedad desmielinizante, inflamatoria del sistema nervioso central (SNC) que muestra características clínicas y patológicas que permiten considerarla como modelo animal de esclerosis múltiple. Existen gran cantidad de evidencias que apuntan a que Ia EAE es una enfermedad Th1 , con secreción de citoquinas pro- inflamatorias tales como interferón gamma (IFN-γ) o Factor de Necrosis Tumoral-α (TNF-α) y se ha sugerido que el stress oxidativo inducido por citoquinas podría jugar un importante rol en Ia neuropatología de Ia EAE. Sin embargo, los efectos individuales de estas y otras citoquinas en Ia patogénesis de Ia enfermedad son aún desconocidos. En este reporte, Espejo C y col (Espejo C, et al. Interferon-gamma regulates oxidative stress during experimental autoimmune encephalomyelitis. (2002) Exp Neurol 177:21-31) analizaron el papel del IFN-γ durante la EAE, por medio de ratones knockout del receptor de IFN-γ (IFN-gamma R(-/-)), los ratones se inmunizaron con el péptido 40-55 de la glicoproteína ologodendrocítica de Ia mielina (MOG) de rata. Se determinaron los niveles de stress oxidativo a través del análisis de Ia inmunoreactividad para el óxido nítrico (NO) sintasa inducible, nitrotirosina y malonyldealdehído, así como a través de Ia expresión de factores antioxidantes protectivos tisulares: metalotioneína l+ll (MT-l+ll). También, determinaron el número de células que desarrollan apoptosis mediante el uso de Ia técnica de TÚNEL. Los niveles de stress oxidativo, MT-l+ll y muerte celular apoptótica por EAE fueron significativamente aumentados en todos los ratones (IFN-gamma R(-/-) y cepa salvaje), pero aún mayor en los ratones IFN-gamma R(-λ-). Estos datos avalan Ia hipótesis que el IFN-γ juega un papel protector contra Ia EAE. La EM es una enfermedad desmielinizante de naturaleza autoinmune que afecta fundamentalmente a adultos jóvenes.
La cifra más conservadora de prevalencia de EM en Cuba es de 10/ 100 000 habitantes (Hernandez-Valero E, et al. Clinical features of múltiple sclerosis in Western Cuba. A comparison with two other regions in the country. (2004) Rev Neurol. May 1-15;38(9):818-23).
Predomina en el sexo femenino con una proporción que varía en dependencia del comienzo de Ia enfermedad (Wingerchuk DM, el at The clinical course of neuromyelitis óptica (Devic's syndrome) (1999) Neurology 53: 1107- 14). En cuanto a Ia raza es más frecuente en Ia raza blanca.
La EM es una enfermedad del SNC que compromete el cerebro y Ia médula espinal. Tiene 2 características fundamentales que son: desmielinización y pérdida axonal. Los síntomas, severidad y curso clínico varían ampliamente dependiendo de los sitios de ubicación de las placas y Ia extensión de Ia desmielinización, de esta forma puede clasificarse en 2 principales categorías: recaída-remisión y las formas crónicas progresivas.
La EM se refiere como una EA. Teóricamente, esta condición se desarrolla cuando el sistema inmune se daña por factores genéticos o ambientales o ambos, causando el ataque a sus propios tejidos, en el caso de Ia EM, el tejido es Ia mielina.
El organismo también ejerce acciones correctivas para "apagar" los efectos de Ia destrucción de las células productoras de mielina (oligodendrocitos), por ejemplo, los investigadores han observado un incremento en Ia densidad de los canales de sodio que portan cargas eléctricas, que incrementan su número de manera que las células nerviosas puedan continuar comunicándose a pesar de Ia pérdida de Ia mielina, por otra parte, los nervios retienen alguna capacidad de remielinización. Múltiples organismos infecciosos se han propuesto como agentes causantes o co-factores en el desarrollo de Ia EM (Johnson RT. Possible viral cause of múltiple sclerosis (1998) In: Viral infections of nervous system 2nd ed. Philadelphia: Lippincott- Raven 248- 258), infecciones por HIV-1 (Blanche P, el al. Devic's neuromyelitis óptica and HIV-1 infection (2000) J Neuro! Neurosurg Psychiatry 68: 795- 796) fueron asociados con Ia EM en poblaciones autóctonas en este estudio. Se han implicado retrovirus endógenos (ERV) en Ia patogenia de Ia EM y diferentes grupos han identificado ERVs individuales en asociación con Ia EM (Perron H, et al. Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly ¡solated from patients with múltiple sclerosis. (1997) The Collaborative Research Group on múltiple Sclerosis . Proc Nati. Acad Sci USA 94: 7583-7588; Christensen T, el al. Reverse transcriptase activity and particle production in B lymphoblastoid cell lines established from lymphocytes of patients with múltiple sclerosis. (1999) AIDS Res Hum Retroviruses 15: 285- 291). Lo referido anteriormente avala el uso de fármacos con propiedades antivirales en estas enfermedades.
La causa de Ia EM se desconoce pero existe el consenso ampliamente aceptado de que es una enfermedad autoinmune iniciada por linfocitos T CD4+ MHC Il restringidos los cuales son polarizados a la producción de IFN-γ, IL-2 TNF-α y linfotoxina, es decir, son células Th1 , existen evidencias que apoyan el punto de vista de Ia EM como una enfermedad autoinmune mediada por células Th1 (Modelo CD4-Th1) (Lassmann H, et al. The CD4-Th1 model for múltiple sclerosis: a crucial re-appraisal. (2004) Trend in Immunology 25: 3, 132-137). Las predicciones realizadas para este modelo son: a) células T CD4+ deben ser las predominantes en Ia población de linfocitos en Ia lesión de EM. Otras poblaciones de linfocitos deben ser una población accesoria minoritaria, b) células T CD4+ polarizadas a Th 1 y sus principales citoquinas efectoras, TNF-α e IFN-γ, deben ser patogénicas en Ia lesión de EM. c) células T CD4+ polarizadas a Th2 deben ser reguladoras o antinflamatorias en Ia lesión de EM. El modelo CD4-Th1 debe explicar Ia variabilidad observada en las características clínicas y patológicas de Ia EM. d) el proceso deberá ser claramente autoinmune, quiere decir, debe dar evidencias que el SNC del huésped era sano antes del ataque autoinmune por mecanismos mediados CD4-TM .
Respecto a Ia patogenia de Ia EM, se postula que en un hospedero genéticamente susceptible, patógenos comunes que contienen secuencias que cross-reaccionan con los antígenos de Ia mielina propios, activan las células presentadoras de antígenos (APC) a través de los receptores Toll-like (TLR), esto constituye el mínimo requerimiento para Ia inducción de una enfermedad inflamatoria, autoinmune del SNC. Los defectos inmunoregulatorios subyacentes, tales como disminución de las células T reguladoras en Ia circulación de los pacientes con EM, permite una ulterior activación patológica de las células T autorreactivas. Las células T reactivas a Ia mielina activadas migran al SNC y reconocen antígenos presentados por Ia microglia, APCs locales. Se secretan citoquinas Th 1 y se inicia Ia cascada inflamatoria. Mecanismos que ocurren naturalmente pueden existir para regular Ia respuesta autoinmune incluyendo Ia inducción de células T-secretoras de citoquinas Th2 autorreactivas (IL-4, IL-5, IL-13), Th3 (TGF-β) o TM (IL-10), que migran al SNC y regulan negativamente las células T autorreactivas Th 1 inflamatorias (Hafler DA. Múltiple sclerosis (2004) J Clin Inv 113: 788-94)
En condiciones normales Ia barrera hemato-encefálica (BHE) provee una separación efectiva entre las células sanguíneas y Ia mielina de manera tal que es irrelevante si algunas células blancas fueron programadas incorrectamente, por tanto, se postula un mal funcionamiento de Ia BHE durante los ataques en Ia EM.
Algunas células del Sl producen enzimas que disuelven Ia matriz extracelular. En Ia mayor parte del organismo esto permite mayor acceso de las células blancas al área de Ia infección, sin embargo cuando estas células liberan sustancias químicas en los capilares dentro del SNC, se produce una ruptura de Ia BHE, produciéndose una lesión en al menos ciertos individuos. Una de las sustancias químicas que pueden ser liberadas por las células blancas son las Metaloproteinasas (MMPs) que debilitan el "cemento" intercelular. Ellas no son activas en Ia forma que son liberadas sino que son activadas por otras enzimas (Maeda A, et al. Matriz Metalloproteinases in the normal human central nervous system, microglia! nodules, and Múltiple Sclerosis lesions (1996) J Neuropathol Exp Neurol. 55 (3): 300-309), por tanto otra de las características de un tratamiento potencial para estas enfermedades sería la inhibición de las MMPs y/o Ia estimulación de los inhibidores de las mismas.
Existe otro potencial mecanismo que afecta Ia integridad de Ia BHE, cuando las células blancas destruyen los microorganismos invasivos, se liberan superóxidos y radicales libres que son extremadamente activos y pueden destruir muchos de sus tejidos blancos, sin embargo, cuando el proceso tiene lugar en Ia BHE, se produce el inicio de una lesión, esto puede generar uno o más ataques a Ia integridad de Ia BHE (Jean Claude Monboisse, et al. Non- enzymatic degradation of acid-soluble calf-skin collagen by superoxide ion: protective effects of flavonoids. (1983) Biochem Pharmacol. 32 (1): 53-58), por tanto las propiedades antioxidantes de a combinación IFN-α/C-Fico demostradas en nuestra invención hacen racional su uso en esta enfermedad.
La placa de EM contiene gran número de macrófagos los cuales parecen destruir Ia mielina digiriendo sus proteínas y lípidos. Los inhibidores de estas enzimas responsables de esta digestión pueden reducir Ia destrucción de Ia mielina o interferir en el movimiento de los macrófagos a los tejidos. El principio de las drogas usadas en esta enfermedad para tratar las exacerbaciones agudas están basadas en sus propiedades antinflamatorias (W. A. Sibley and the Therapeutic Claims Committee of the International Federation of Múltiple Sclerosis Societies, Therapeutic Claims in Múltiple Sclerosis, 3rd Edition, 1992). Las terapias para Ia EM han emergido en Ia últimas 2 décadas con Ia demostración de Ia eficacia de 3 tipos de terapias inmunomoduladoras que impactan en el curso temprano de Ia EM: fármacos inmunosupresores tales como Mitoxantrone y Ciclosfosfamida; Interferones Beta, y péptidos de unión al Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) que se acoplan al receptor de células T (TCR), Glatiramer Acetato (GA).
Los fármacos aprobados actualmente para esta enfermedad por Ia FDA son el Interferon Beta-1 b (Betaseron) en 1993, Interferon Beta-1a (Avonex) en 1996 y Copaxone (GA o copolímero 1) en 1996 y son altamente costosos.
El IFN-β ha tenido un gran impacto en el tratamiento de Ia EM recaída-remisión, aunque no se conoce si puede prevenir Ia transición a EM secundaria progresiva. El mecanismo de acción del IFN-β no está claro, probablemente involucre alteraciones de un número de mecanismos diferentes que incluyen inducción de IL-10 e inhibición del tráfico de células T por bloqueo de las metaloproteinasas (Stuve, O., et al. Interferon beta-1b decreases the migration of T lymphocytes in vitro: effects on matrix metalloproteinase-9 (1996) Ann. Neurol. 40:853-863). Están comenzando ensayos clínicos que bloquean Ia cadena p40 común de IL-12 e IL-23 y bloqueo de señales co-estimulatorias a través de las interacciones B7-CD28 con Ig CTLA-4.
Respecto al GA, en Ia mayoría de los pacientes la inyección diaria de GA causa secreción de IL-5 e IL-13 por células T CD4+, indicando un cambio hacia una respuesta Th2 (Duda P.W, et al. Human and murine CD4 T cell reactivity to a complex antigen: recognition of the synthetic random polypeptide glatiramer acétate. (2000) J. Immunol. 165: 7300-7307; Qin, Y, et al. Characterization of T cell lines derived from glatiramer-acetate-treated múltiple sclerosis patients. (2000) J.Neuroimmunol. 108: 201-206; Dabbert, D., et al. Glatiramer acétate (copolymer-i)-specific, human T cell lines: cytokine profile and suppression of T cell lines reactive against myelin basic protein. (2000) Neurosci. Lett. 289: 205- 208). Además, Ia sobrevida de las células T reactivas al GA exhibe un alto grado de degeneración, medido por su habilidad de cross reaccionar con una gran variedad de péptidos.
Actualmente, existen bases conceptuales novedosas que se insertan de lleno en el debate contemporáneo de Ia Inmunología al trascender preceptos convencionales que resultan limitados para explicar ciertas evidencias en conflicto con el paradigma de Ia selección clonal y su alternativa: Ia Tolerancia dominante, sustentado por Ia existencia de células T reguladoras. Por tanto Ia opción terapéutica que propone nuestra invención va encaminada, entre otras propiedades, a revertir este desbalance efector/regulador que creemos que juega un papel importante en las enfermedades autoinmunes a través de su capacidad para aumentar esta población celular: Tr naturales CD4+ CD25 high, Foxp3+ o Tr inducidas productoras de IL-10 o TGF-β. La AR es otra enfermedad inflamatoria autoinmune que produce un alto grado de discapacidad. Se estima que del 50 al 90% de los pacientes afectados de AR presenta una discapacidad severa a los 10 años de realizado el diagnóstico. (Markenson JA. (1991). Wordwide trends in the socioeconomic impact and long-term prognosis or rheumatoid artritis. Semin Arthritis Rheum: 21(2), 4-12). El costo del tratamiento y Ia discapacidad provocada por AR en Estados Unidos es de 6.5 billones de dólares cada año (Fanci A, et al (Ed) (1998). Harrison's principáis of Internal Medicine. (14th ed.) (Chapter 376 p. 2412). New Cork: McGraw HiII; Yelin E. (1996). The costs of rheumatoid arthritis: absolute, incremental, and marginal estimates. J Rheumatol: (suppl 44)23, 47-51). AR es Ia artritis inflamatoria más común y Ia principal causa de discapacidad, ocurre entre el 0.5-1% de Ia población adulta mundial.
La AR es una inflamación poliarticular simétrica que afecta primariamente a las articulaciones pequeñas de las manos y los pies. Además de Ia inflamación del sinovium, Ia masa tisular denominada pannus, invade y destruye las estructuras articulares locales. En Ia AR, linfocitos T CD4+, linfocitos B y macrófagos infiltran el sinovium y algunas veces se organizan en agregados linfoides discretos con centros germinales. La hiperplasia de Ia capa íntima es el resultado de un marcado incremento de sinoviocitos tipo fibroblastos y tipo macrófagos. Enzimas degradativas expresadas localmente, incluidas metaloproteinasas, proteasas séricas y agreganasas digieren Ia matriz extracelular y destruyen Ia estructura articular. (Firestein GS. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. (2003) Nature 423:356-61).
La patogénesis de Ia AR es todavía ampliamente desconocida, en particular, existen controversias sobre el papel de Ia autoinmunidad contra antígenos específicos de las estructuras articulares. Existen evidencias experimentales a favor de un mecanismo multifactorial en el cual coinciden factores genéticos, infecciosos y neuroendocrinos que orientan hacia Ia prevalencia de una activación antígeno-específica de la inmunidad adquirida en Ia patogénesis de Ia enfermedad. Se ha demostrado Ia presencia del HLA-DR4/Dw4 en alrededor del 70% de los pacientes de Ia raza blanca afectados (Stastny P. Association of the B-cell alloantigen DRw4 with RA. (1978) N Engl J Med 298: 869-71). Respecto al mecanismo patogénico, Ia "compartición de epítopes" podría funcionar como sitio de unión para péptidos artritogénicos o quizás para autoantígenos que mimetizan un antígeno exógeno (mímica molecular). Algunos agentes infecciosos se proponen como posibles desencadenantes de Ia AR (Feldmann M, et al. Role of cytokines ¡n RA. (1996) Annu Rev Immunol 14: 397-440), particularmente el Parvovirus B 19 del cual se ha demostrado Ia capacidad de parte del virus de inducir propiedades invasivas en fibroblastos sinoviales humanos normales cambiándoles el fenotipo fisiológico (Ray NB, et al. Induction of an invasive phenotype by human parvovirus B19 in normal human synovial fibroblasts. (2001) Arthritis Rheum 44: 1582-6). Otro patógeno que ha adquirido también importancia es el Proteus mirabilis (Ebringer A, et al. Sequence similarity between HLA-DR1 and DR4 subtypes associated with RA and Proteus/Serratia membrane haemolysins. (1992) Ann Rheum Dis 51 : 1245-6).
Recientemente se ha hecho énfasis en el papel directo de Ia inmunidad innata en Ia progresión de Ia enfermedad. En Ia historia natural de Ia AR, caracterizada por 3 fases: inducción, mantenimiento y destrucción tisular, se ha visto que Ia inmunidad innata juega un papel importante. Los avances en el conocimiento acerca de las moléculas involucradas en Ia activación de linfocitos T, el papel de las células T en el mecanismo de erosión y los estudios acerca de las quimiocinas involucradas en los procesos de "homing" y angiogénesis apoyan Ia teoría de una activación antígeno-específica del sistema inmune adaptativo. Por tanto, durante Ia AR, Ia patogénesis de Ia sinovitis y de las erosiones involucra mecanismos tanto del sistema inmune innato como adaptativo, Io que da como resultado Ia inducción final del daño articular (Valenisi G, Barone F, et al. Advances in immunology and rheumatoid arthritis patogénesis. (2004) Reumatismo 56: 9-20). Recientemente, el desarrollo de agentes biológicos dirigidos a moléculas unidas a membranas o mediadores solubles específicos han revolucionado el tratamiento de Ia AR. El éxito de Ia inhibición del TNF-α y en menor medida de la inhibición de Ia IL-1 , han proporcionado terapias firmemente establecidas en el manejo clínico de Ia AR. A pesar de los datos del uso de los inhibidores de TNF-α en los ensayos clínicos y en Ia experiencia de Ia vida real, una proporción sustancial de pacientes no responden a ellos o perdió Ia respuesta inicial a estos agentes por Io que es necesario Ia investigación de nuevas terapias. El año pasado se mostró que Ia depleción de células B con el anticuerpo monoclonal Rituximab provocaba una mejoría significativa en los síntomas y signos de Ia enferrmedad. De igual manera, se logró mejoría y toxicidad aceptable a través de Ia inhibición de Ia señal co-estimulatoria de células T con el uso de Ig CTLA-4. La inhición selectiva de lL-6, una citoquina pro-inflamatoria central en AR ha producido mejoría clínica en el estado de Ia enfermedad, particularmente en Ia respuesta de fase aguda asociada con Ia AR (Singh R, et al. Emerging biologic therapies in rheumatoid arthritis: cell targets and cytokines. (2005) Curr Opin Rheumato! 17: 274-79). Las enfermedades alérgicas, que incluyen el asma alérgica, Ia rinitis alérgica, las alergias alimentarias, Ia alergia a drogas y el eczema atópico alérgico/ síndrome de dermatitis y otras, son un grupo de trastornos comunes los cuales se consideran mediados por inmunoglobulinas E. Personas de todas las edades en cualquier país del mundo sufren de estas enfermedades. La prevalencia de Ia alergia ha mostrado un incremento en los últimos años. Afectan entre el 30-40% de Ia población mundial y es considerada una de las 3 grandes enfermedades del siglo XXI.
Desde las últimas 2 décadas, Ia inflamación ha sido una de las características patofisiológicas principales de las reacciones alérgicas. Los mastocitos son los principales mediadores de las reacciones alérgicas y su activación es condición suficiente y necesaria para el rápido desarrollo de permeación de la microvasculatura y edema tisular en individuos sensibilizados expuestos a alérgenos. Los mastocitos son Ia fuente principal de mediadores de la inflamación alérgica, que incluyen: histamina, proteinasas neutrales, proteoglicanos, prostaglandina D2, leucotrieno C4 y algunas citoquinas (Parikh SA, et al. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic nhinitis. (2003) Curr Asthma Rep 3: 266-272). De ellos, Ia histamina es el primer mediador de los cambios patofisiológicos implicados en el asma. El asma bronquial es una manifestación de inflamación crónica de las vías respiratorias, posiblemente secundaria a hipersensibilidad a alérgenos, por consiguiente una de las vías para el manejo de esta enfermedad es el control ambiental para minimizar Ia respuesta inflamatoria relacionada a Ia estimulación por alérgenos y Ia administración de terapia antinflamatoria para resolver Ia inflamación y prevenir Ia progresión de Ia enfermedad (Craig ML. Diversity of asthma: evolving concepts of pathophysiology and lessons from genetics. (2005) J Allergy Clin Immunol 115: S526-31)
El asma es endémica en países desarrollados y puede afectar 1 de cada 4 niños (Asher Ml, Keil U, et al. International study of asthma and allergies in childhood (ISAAC): rationale and methods. (1995) Eur Resp J 8: 483-91). La hiperreactividad bronquial es el marco fisiopatológico del asma pero también ocurre en individuos sin asma y se puede encontrar en el 10-15% de Ia población general.
Actualmente se concibe el asma como una enfermedad de interacción genético-ambiental con una inmunobiología compleja. Se inicia tempranamente en Ia vida por Ia liberación de alérgenos a las vías aéreas. La primera etapa en el reconocimiento inmune del asma es Ia entrada del antígeno a las células inmunes. Las APC, incluidas las células dendríticas, incorporan proteínas foráneas que pueden servir como antígenos, las hidrolizan a pequeños polipéptidos y estos pueden ser expresados en su superficie en el contexto del MHC clase II. Esta presentación se acompaña de expresión de moléculas accesorias en Ia superficie de las APC, proceso que puede ocurrir cerca de Ia superficie de las vías aéreas y es seguida por Ia migración de estas células, que portan el CCR7, al tejido iinfoide, bajo Ia influencia de los ligandos del CCR7, EBI-1 y quimiocinas tisulares del tejido linfoide secundario, las cuales también atraen linfocitos T de memoria y "naive" que portan el CCR7. En el tejido linfoide regional, se produce Ia activación de las células T por el antígeno cargado en Ia APC. La expresión local de citoquinas puede tener un profundo efecto en sobre Ia respuesta de linfocitos T a Ia presentación antigénica, proceso referido como desviación inmune. En presencia de IL-12 estas células tienen un fenotipo Th1 que expresa IFN-γ. Bajo Ia influencia de IL-10, estas células pueden desarrolar un fenotipo regulador, que puede ser importante en limitar Ia progresión del asma. La influencia de IL-4 e IL-13 permiten el desarrollo de un fenotipo Th2 que se requiere para Ia aparición del asma. Interesantemente, Ia acción combinada de IL-4, IL-13, CD40 y una enzima llamada citidin deaminasa inducida por activación produce un cambio delecional en Ia recombinación de linfocitos B y la producción de IgE específica a alérgenos, cuyos niveles se encuentran aumentados en el asma atópica. Es esta habilidad de Ia IgE de unir específicamente alérgenos y receptores sobre las células efectoras de Ia respuesta alérgica, incluidos los mastocitos, basófilos y eosinófilos, Ia que permite Ia liberación de mediadores que causan los síntomas del asma.
Las moléculas efectoras en el asma incluyen histamina, factor activador de plaquetas, proteasas y metabolitos del ácido araquidónico (AA). Las prostaglandinas (PG) y leucotrienos (LT), que son metabolitos del AA que se producen enzimáticamente durante las reacciones alérgicas y asmáticas y están presentes en sitios restringidos dentro del microambiente de las vías respiratorias e influencian a las células residentes en los pulmones y actúan sobre receptores específicos (Drazen JM. Leokotrienes in asthma. (2003) Adv Exp Med Biol 525: 1-5). Las células efectoras inflamatorias en el asma producen leucotrienos, además las células estructurales del pulmón producen prostaglandinas (Holgate ST, et al. Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation. (2003) J Allergy Clin Immunol 111 (suppl): S18-36). Las PG y LT pueden ser formados también como resultado de un stress oxidativo. La activación de granulocitos de las vías respiratorias que contienen peroxidasa se asocia con Ia generación de oxidantes a ese nivel. Cuando Ia formación de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno excede Ia capacidad reductora del microambiente de las vías respiratorias, puede ocurrir Ia peroxidación de membranas lipídicas. Este proceso resulta en Ia formación de isoprostanos, marcadores de stress oxidativo. La disponibilidad de marcadores polimórficos y de familias fenotípicamente bien caracterizadas con varios miembros que padecen asma, ha permitido Ia identificación de variantes genéticas asociadas a Ia enfermedad. El examen de poblaciones en 12 estudios sobre los genes que se sospechaban estar relacionados con el asma (IL4, IL13, Tbet y GATA3) no mostraron correlación con Ia enfermedad. Los genes que se han encontrado relacionados con el asma incluyen algunos multifacto ríales conocidos como desintegrina y metaloproteinasa 33 {ADAM33) (Van Eerdewegh P, Little RD, et al. Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness. (2002) Nature 418: 426-30), dipeptidil peptidasa 10 {DPP10) y PHD finger protein 11 (PHF11) (Zhang Y, et al. Positional cloning of a quantitative trait locus on chromosome 13q14 that influences immunoglobulin E levéis and asthma. (2003) Nat Genet 34: 181-6). Se están investigando los mecanismos por los cuales las variantes de estos genes influencian en Ia patogénesis del asma. Existe un modelo emergente en Ia patogénesis del asma. El modelo tradicional de patogénesis del asma se enfocaba hacia la función del músculo liso de las vías respiratorias y las vías inflamatorias. Ahora, se incorpora el concepto de sistema regulador que afecta Ia expresión de citoquinas y quimiocinas e incluye el efecto de alérgenos sobre el crecimiento y proliferación de células residentes en las vías respiratorias (Holgate ST, et al. Roles of cysteinyl leukotrienes ¡n airway ¡nflammation. (2003) J Allergy Clin Immunol 111 (suppl): S18-36), Io cual explica el papel del receptor DP de prostanoide en el asma. En este modelo, Ia exposición a irritantes, toxinas o alérgenos, no solo permite Ia desviación del sistema inmune adaptativo y reclutamiento de linfocitos Th2, eosinófilos y mastocitos a las vías respiratorias, sino también actúa indirectamente en posicionar los mastocitos cerca de las células del músculo liso de las vías respiratorias (Brightling CE, et al. Mast-cell infiltration of airway smooth muscle in asthma. (2002) N Engl J Med 346: 1699-705) y activa el receptor DP de prostanoide para promover su supervivencia (Gervais FG, et al. Selective modulation of chemokinesis, degranulation, and apoptosis in eosinophils through the PGD2 receptors CRTH2 and DP. (2001) J Allergy Clin Immunol 108: 982-8). La exposición repetida a alérgenos permite cambios en el estado de activación de las células epiteliales de las vías respiratorias y Ia liberación de factores que causan Ia transformación de fibroblastos sub-epiteliales a un fenotipo mioblástico secretor de colágeno. La deposición de colágeno sobre Ia membrana basal de las vías respiratorias, altera Ia respuesta de constricción del músculo liso de las vías respiratorias que compromete el área luminal (Wiggs BR, et al. A model of airway narrowing in asthma and in chronic obstructive pulmonary disease. (1992) Am Rev Resp Dis 145: 1251-8). De esta liberación episódica de mediadores procontráctiles de los eosinófilos y mastocitos de las vías respiratorias resultan los síntomas del asma. El concepto emergente es el asma una enfermedad a agentes infecciosos, alérgenos y toxinas ambientales que con el tiempo conduce a cambios en Ia composición celular y estructura de las vías aéreas. En el asma, se han descrito diferentes subtipos de células reguladoras o supresivas que pueden prevenir Ia activación de células efectoras "in vitro" e "¡n vivo" en modelos animales. Recientes evidencias sugieren un déficit en Ia actividad supresiva de las células T reguladoras naturales CD4(+)CD25(+) y las células T reguladoras productoras de IL-10 que puede jugar un papel en el desarrollo de sensibilización alérgica. Las terapias deben ser dirigidas a mantener el equilibrio entre células T reguladoras y células efectoras en el asma (Robinson DS. The role of regulatory lymphocytes in asthma pathogenesis. (2005) Curr Allergy Asthma Rep 5: 135-41). Los modelos propuestos acerca de Ia tumorigénesis están basados en el análisis de las características comunes principales de los diferentes tipos de cáncer.
Recientes estudios (Karpinets V1 et al. Tumorigénesis: the adaptation of mammalian cells to sustained stress environment by epigenetic alterations and succeding matched mutations. (2005) Carcinogenesis 26: 1323-1334) indican que durante las transformaciones tumorigénicas, las células pueden generar mutaciones por sí mismas como resultado de una propensión a error en Ia división celular con participación de polimerasas que propenden al error y mitosis aberrantes. Estos mecanismos pueden ser activados en células por señalización de sobrevida y proliferación continuada en un ambiente de stress sostenido (SSE): a largo plazo Ia exposición a esta señalización, re-programa epigenéticamente el genoma de algunas células y además, permite su senescencia. La re-programación epigenética resulta en: Ia hipermetilación de los genes supresores de tumores involucrados en el comienzo del arresto del ciclo celular, reparación del ADN y apoptosis, hipometilación de proto- oncogenes asociados con actividad proliferativa persistente, demetilación global del genoma y activación de secuencias repetidas de ADN. De acuerdo a este modelo, Ia proliferación sostenida y señalización en un ambiente SSE que puede ser producida por Ia producción continuada de citoquinas en un tejido sujeto a una agresión permanente, por ejemplo, el resultado de Ia exposición a un carcinógeno. Una señalización asociada al stress similar puede ser inducida por otros factores fisiológicos y ambientales incluidos inductores de cáncer bien conocidos como Ia inflamación, las hormonas y las infecciones virales. La implicación de las hormonas en el origen y desarrollo del cáncer está bien documentada. Se conoce que muchas hormonas activan tanto Ia respuesta proliferativa como Ia señalización de sobrevida en muchas células, induciendo su proliferación por una parte y Ia inhibición de apoptosis por Ia otra (Moggs JG, el al. Phenotypic anchoring of gene expression changes during estrogen- induced uterine growth. (2004) Environ Health Perspect 112: 1589-1606). Estos aspectos son cruciales para Ia comprensión de cómo Ia regulación del ciclo celular y Ia maquinaria apoptótica son importantes en el crecimiento y desarrollo de neoplasmas, puntos de señalización que pueden resultar en Ia activación de vías que permitan Ia muerte celular programada si el daño celular no puede ser reparado (Pietenpol JA, et al. CeII cycle checkpoint signaling: cell cycle arrest versus apoptosis. (2002) Toxicology 181-182: 475-481. Diferentes estudios han mostrado que Ia p53 y p21 son necesarias para mantener Ia detención del ciclo celular en fase G2/M y apoptosis que sigue al daño del ADN. El mecanismo de arresto G2/M p53-dependiente involucra una inhibición inicial de Ia actividad de Ia ciclina B1/Cdc2 por p21 y una consiguiente reducción de los niveles proteicos de ciclina B1 y Cdc2 (Flatt PM, et al. p53 regulation of G(2) checkpoint is retinoblastoma protein dependent. (2000) Mol CeII Biol 20: 4210-23; Innocente SA, et al. p53 regulates a G2 checkpoint throught cyclin B1. (1999) Proc Nati Acad Sci USA 96: 2147-52). Además de Ia modulación de los niveles de ciclina B1/Cdc2 y actividad p21 , Ia p53 también ejerce respuestas de chequeo a través de Ia regulación positiva transcripcional de genes blancos adicionales por debajo de Ia cascada (Chan TA, et al. 14-3-3 Sigma ¡s required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage. (1999) Nature 410: 616-20).
Se ha reportado que Ia inducción de apoptosis está asociada con Ia regulación positiva de genes blancos de Ia p53 por debajo de Ia cascada, tales como Ia p21 (Kannan K, et al. DNA microarrays identification of primary and secondary target genes regulated by p53. (2001) Oncogene 20: 2225-2234). El efecto de virus transformantes sobre los procesos celulares mimifican muchos aspectos de Ia SSE. La expresión de oncoproteínas codificadas por algunos virus cambia los procesos celulares en el hospedero de igual forma que una señal proliferativa y de sobrevida. Aproximadamente un cuarto de las enfermedades malignas pasan a través de una fase de inflamación crónica (Coussens LM, et al. Inflammation and cáncer (2002) Nature 420: 860-7). De manera similar a Ia SSE impuesta por carcinógenos, este ambiente celular permite Ia producción de especies reactivas del oxígeno como un importante elemento del sistema de defensa celular. Por tanto, Ia inflamación, independientemente de su etiología, también causa una agresión celular, daño del ADN y crea un micro-ambiente rico en citoquinas y factores de crecimiento que induce SSE. Existen múltiples evidencias que sustentan Ia existencia de un mecanismo natural de vigilancia inmunológica contra tumores que puede ser una fase de un proceso más global denominado "inmuno-edición del cáncer" que comprende el espectro completo de efectos de Ia inmunidad innata y adquirida en el desarrollo tumoral, que incluyen desde el reconocimiento y eliminación tumoral hasta Ia evasión tumoral (Dunn GP, et al. The Three Es of cáncer immunoediting: from ¡mmunosurveillance to tumor escape. (2004) Annu Rev Immunol 22: 329-360). Sorprendentemente, tumores formados en ausencia de un sistema inmune intacto son más inmunogénicos que aquellos surgidos en hospederos inmunocompetentes; Io que documenta el papel del sistema inmune no sólo en Ia protección del huésped al desarrollo de tumores, sino su influencia en Ia selección de variantes tumorales sobre Ia base de su inmunogenicidad.
Básicamente se considera Ia respuesta linfocitotóxica por células T CD8+ (CTL) frente a antígenos presentados en el contexto MHC clase I como Ia rama efectora principal de Ia inmunidad adaptiva en Ia respuesta inmune antitumoral, de esta manera, las principales tendencias de Ia inmunoterapia antitumoral están dirigidas a incrementar esta respuesta CTL.
La teoría de Ia vigilancia inmunológica frente a los tumores demuestra sin lugar a dudas, que el sistema inmune es capaz de reconocer y eliminar a las células tumorales. Uno de los aspectos más relevantes en el mecanismo de vigilancia inmunológica contra los tumores es el papel del IFN-γ. El IFN-γ producido por las células del sistema inmune es capaz de proteger al hospedero contra el crecimiento de tumores transplantados, así como contra la inducción de tumores espontáneos o quimioinducidos (Dighe AS, et al. Inhibition of celular responsiveness to ¡nterferon-γ (IFN-γ) ¡nduced by overexpression of inactive forms of the IFN-γ receptor (1993) J Biol Chem 268: 10645-53). Existe una serie de evidencias que apoya Ia afirmación anterior, por ejemplo, Ia inyección de anticuerpos monoclonales anti- IFN-γ en ratones con tumores transplantados bloquea el rechazo de estos inducido por el LPS, los fibrosarcomas transplantados en ratones tratados con anticuerpos monoclonales anti- IFN-γ, crecen más rápida y eficientemente que en los ratones sin tratar, Ratones Knockout (-/-)IFN-γR o (-/-) STAT1 fueron de 10 a 20 veces más sensibles que los ratones controles a Ia inducción de tumores por metilcolantreno (MCA), específicamente estos ratones desarrollaron más tumores, en menos tiempo y a más bajas dosis de MCA que los controles (Qin Z, et al. Inhibition of methylcholanthrene-induced carcinogenesis by an IFN-γ receptor dependent foreign boby reaction. (2002) J Exp Med 195: 1479-90). Líneas tumorales insensibles al lFN-γ crecen mucho más que las sensibles. El rechazo inmune del tumor es inhibido, de forma muy similar a los ratones Knockout. La célula tumoral es el blanco fisiológico del IFN-γ en el proceso de rechazo en este modelo experimental. El IFN-γ presenta propiedades antiproliferativas y proapoptóticas, las cuales tienen un efecto directo sobre el tumor. Se ha comprobado en modelos similares de inducción de tumores la importancia del aumento de Ia presentación antigénica por MHC I dependiente de IFN-γ, así como Ia importancia de Ia inducción de una respuesta Th 1 en Ia generación de una respuesta antitumoral. Sobre Ia racionalidad del uso de los dos principios activos que forman parte de Ia combinación IFN-α /C-Fico de manera independiente, existen evidencias que sugieren un efecto beneficioso de los IFNs tipo I (IFN-α e IFN-β) en Ia EM. Efecto antiviral: Los IFN tipo I tienen un potente efecto antiviral, se inducen después que las células son infectadas por virus y dan lugar a Ia síntesis de un gran número de enzimas como Ia 2'5'oligoadenilato sintetasa que interfiere en Ia replicación de virus ARN o ADN. Esta respuesta temprana (no específica de antígeno) es crítica para limitar Ia extensión del espectro viral antes que Ia respuesta específica para antígeno pueda controlar completamente Ia infección. Sobre el papel de las infecciones en Ia predisposición a EM existen discrepancias en Ia literatura, por ejemplo, Sieve et al. (Sieve AN, et al. Chronic restraint stress during early Theiler's virus infection exacerbates the subsequent demyelinating disease in SJL mice. (2004) J Neuroimmunol. Oct;155 (1-2):103- 18) en un modelo animal de enfermedad desmielinizante en ratones SJL demostraron que Ia infección con el virus de Theiler producía exacerbaciones de los eventos desmielinizantes, contrariamente, ha sido reportado que Ia esquistosomiasis protege de Ia EM en un modelo de EAE donde se vio supresión directa del comienzo de Ia EM por infección con Schistosoma mansoni (La Flamme AC, et al. Schistosomiasis protects against múltiple sclerosis. (2004) Mem Inst Oswaldo Cruz; 99 (5 Suppl 1):33-6. Epub 2004 Oct 13).
Efectos antiproliferativos, apoptóticos y de diferenciación celular: Los IFN-α y β pueden afectar todas las fases del ciclo celular: M, G1 y G2. Cuando fibroblastos son estimulados por suero, Factor de crecimiento epidérmico (EGF) o insulina, los IFNs causan una prolongación de Ia fase G1 , una reducción en Ia velocidad de entrada a Ia fase S y un enlentecimiento de las fases S y G2 (Balkwill F, et al. Interferon affects both G1 and S+G2 in cells stimulated from quiescence to growth. (1978) Nature 274: 798-800; Gewert DRMG, et al. Inhibition of cell proliferation by ¡nterferons 1. Effects on cell división and DNA synthesis in human lymphoblasts (Daudi) cells. (1984) Eur J Biocehm 139: 619- 625). El efecto acumulativo de Ia prolongación del ciclo celular por IFN, tanto en células normales como células tumorales resulta en citostasis, incremento del volumen celular y apoptosis (Otsuki T, et al. Human myeloma cell apoptosis induced by interferon-α. (1998) Br J Haematol 103: 518-529).
Las células tumorales desarrollan alteraciones en una o más proteínas que controlan Ia progresión del ciclo celular. Los proto-oncogenes regulados por IFN incluyen c-myc (Raveh T, et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase mediates c-Myc suppression induced by type I interferons. (1996) J Biol Chem 271 : 25479-25484), bcl-2 (Koshiji M, et al. Apoptosis of colorectal adenocarcinoma (COLO201) by tumor necrosis factor-alpha and/or ¡nterferon- gamma resulting from down-regulation of Bcl-2 expression. (1998) Clin Exp Imunol 111 : 211-218), c-Ha-ras (Samid D, et al. Biochemical correlates of phenotypic reversión ¡n interferon-treated mouse cells transformed by a human oncogene. (1984) Biochem Biophys Res Comm 119. 21-28) y c-src. Otra importante proteína mutada en muchos tumores es Ia proteína del retinoblastoma (Rb). La hiperfosforilación de esta proteína por unión al factor transcripcional E2F, inhibe Ia progresión del ciclo celular, el tratamiento con IFN-α resulta en una inhibición de esta hiperfosforilación (Kumar R, et al. Interferon α induces the expression of retinoblastoma gene product in human Burkitt lymphoma Daudí cells: role in growth regulation. (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89: 6599-6603; Resnitzky D, et al. Interferons and interleukin 6 suppress phosphorylation of the retinoblastoma protein in growth-sensitive hematopoietic cells. (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89: 402-406). El efecto del IFN-α resulta en una reducción en una de las proteínas E2F, E2F-1. Una de las vías para Ia inducción de apoptosis involucra Ia unión de Fas a FasL, Ia cual resulta en el reclutamiento de Ia proteína que contiene el dominio de muerte, FADD y Ia consiguiente activación de las caspasas, tales como Ia caspasa -8. Los IFNs regulan positivamente Ia expresión de Fas y por tanto pueden funcionar a través de Ia vía apoptótica mediada por Fas (Weller M, et al. Anti-Fas/APO-1 antibody-mediated apoptosis of cultured human glioma cells. Induction and modulation of sensitivity by cytokines. (1994) J Clin Invest 94: 954-964). Fas puede ser regulado positivamente por IFN-α, (Gordon M, et al. Treatment with ¡nterferon-alpha preferentially reduces the capacity for amplification of granulocyte-mecrophage progenitors (CFU-GM) from patients with chronic myeloid leukaemia but spares normal CFU-GM. (1998) J Clin Invest 102:710-715) y este evento promueve Ia apoptosis mediada por Fas (Selleri CMJ, et al. Fas-mediated modulation of bcr/abl in chronic myelogenous leukaemia results in differential effects on apoptosis (1998) Blood 92: 981-989) Modulación génica: Las enzimas 2-5 oligoadenilato sintetasa (2-5A sintetasa), una proteína kinasa (PKR), y Ia indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) son inducidas por IFNs, Ia 2-5a sintetasa es un marcador relativamente específico de Ia señalización por IFN (Hassel BA, et al. A dominant negative mutant of 2- 5A-dependent RNase suppresses antiproliferative and antiviral effects of interferon (1993) EMBO J 12: 3297-3304). La ribonucleasa latente se activa por 2-5A, Ia inducción de estas enzimas puede inhibir Ia síntesis de ARN y proteínas: La expresión en células de una ribonucleasa (RNasa-L) enzimáticamente inactiva inhibe los efectos antiproliferativos y antivirales de los IFNs. La apoptosis está suprimida en ratones nu!l-RNasa-L tratados con diferentes agentes apoptóticos (Zhou A, et al. Interferon action and apoptosis are defective ¡n mice devoid of 2',5'-oligoadenylate-dependent RNase I (1997) EMBO J 16: 6355-6363). Los niveles de PKR se correlacionan inversamente con Ia actividad proliferativa en diferentes tumores humanos y líneas celulares tumorales, y una actividad minina PKR fue encontrada en el carcinoma invasivo de mama (Haines GKCR, et al. Expression of the double-stranded RNA-dependent protein kinase (p68) in human breast tisúes. (1996) Tumor Biol 17: 5-12; Savinova OJB, et al. Abnormal levéis and mínimal activity of the ds RNA-activated protein kinase,
PKR, in breast carcinoma cells (1999) lnt Biochem CeII Biol 31 : 175-189).
La expression de PKR puede ser controlada por un factor transcripcional inducido por IFN, IRF- 1 debido a que IRF- 1 incrementa rápidamente en las células en arresto durante el crecimiento, Io que puede influenciar Ia expresión de genes involucrados en el control negativo del crecimiento celular y puede mediar el efecto antiproliferativo de los IFNs.
También se ha relacionado Ia degradación del triptófano a quinurenina por IDO a Ia inhibición de Ia síntesis de proteínas y el efecto antiproliferativo como un resultado de Ia depleción de triptófano (Byrne G, et al. Induction of tryptophan degradation in vitro and in vivo: a gamma-interferon stimulated activity. (1986) J Interferon Res 6: 389-396).
Los IFNs también regulan negativamente el gen de resistencia a multi-drogas (mdr1) en células humanas de carcinoma de colon (Stein U, et al. Modulation of mdr1 expression by cytokines in human colon carcinoma cells: an approach for reversal of multidrug resistance. (1996) Br J Cáncer 74: 1384-1391). Los arreglos (arrays) de nucleótidos han demostrado que el gen bcr (breakpoint cluster región) puede ser también regulado negativamente por IFN α (Der SD1 et al. Identification of genes differentially regulated by interferon α, β, or y using oligonucleotide arrays (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95: 15623-15628). Efecto inmunomodulador: La proporción de células productoras de IFN-γ (células tipo Th 1) incrementó en linfocitos T cultivados en presencia de IFN-α y clonados (Parronchi P, et al. IL-4 and IFN alfa and IFN gamma exert opposite regulatory effects on the development of cytolytic potential by Th 1 or Th2 human T cell clones. (1992) J Immunol 149: 2977- 2983) o estimulados directamente (Brinkmann V, et al. Interferon alpha ¡ncreases the frequency of IFN gamma-producing CD4+ T cells. (1993) J Exp Med 178: 1655- 1663) por Ia vía del complejo TCR/CD3. Otros informes demuestran que el IFN-α induce IFN-γ. En los ratones "knockout" de IFN-γ se ha observado un incremento de Ia inflamación y Ia desmielinización (Tran EH, et al. IFN-gamma shapes immune invasión of the central nervous system vía regulation of chemokines. (2000) J Immunol 164: 2759- 2768) Io cual sugiere el rol protector del IFN-γ en las enfermedades desmielinizantes autoinmunes como Ia EM y por tanto su papel beneficioso en enfermedades que cursan con aumento de IFN-γ contrariamente al papel proinflamatorio patogénico que con frecuencia se le asignaba al mismo.
Efectos sobre las células inmunes efectoras: Los IFNs aumentan Ia efectividad de todos los tipos celulares de efectores inmunes. Estos incluyen células T citotóxicas, células natural killer (NK). La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) puede también ser aumentada por los IFNs. Además de Ia expresión aumentada de las moléculas de antígenos leucocitarios humanos (HLA) los IFNs aumentan directamente las funciones de las células T relevantes para Ia citotoxicidad de las células tumorales (Kayagaki N, et al. Type I interferons regúlate tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) expression on human T cells: a novel mechanism for the antitumoral effects of type I Interferons (1999) J Exp Med 189: 1451-1460). La habilidad de los IFNs para aumentar Ia actividad de células NK y Ia función monocitaria ha sido demostrada in vitro e in vivo. Efecto sobre Ia angiogénesis: Otro componente de los efectos anti-tumorales mediados por IFN es Ia inhibición de Ia angiogénesis. La administración sistémica de IFN-α reduce el crecimiento de las células tumorales en células sensibles al IFN, mediante Ia regulación directa de Ia expresión de Ia proteína angiogénica, bFGF (Dinney CP, et al Inhibition of Basic fibroblast growth factor expression, angiogénesis, and growth of human bladder carcinoma in mice (1998) Cáncer Res 58: 808-814).
Clínicamente, el tratamiento con IFN-α ha sido exitoso en Ia inducción de Ia regresión de hemangiomas, los cuales son tumores que contienen células endoteliares anormales (Ezekowitz RAB, et al. Interferon alfa-2b therapy for life- threatening hemangiomas of infancy (1992) N Engl J Med 326: 1456-1463). El Sarcoma de Kaposi, una enfermedad neoplásica de origen endotelial, también responde al tratamiento con IFN-α (Krown SE. Interferon-α: evolving therapy for AIDS-associated Kaposi'sarcoma. (1998) J Interferon Cyto Res 18: 209-214). Efectos antitumorales de los IFNs: Se postula que sus efectos antitumorales son el resultado ya sea del efecto directo sobre Ia capacidad funcional o composición antigénica de Ia célula tumoral o de un efecto indirecto sobre Ia modulación de las poblaciones celulares inmunes que interactúan con Ia célula tumoral. Sin embargo, cierto número de genes inducidos por los IFNs tipo I, están involucrados en Ia apoptosis e incluyen el PKR, PML, RAP46/Bag-1 , phospholipid scramblase y el Factor 1 -a If a inducible por Ia hipoxia. (Der SD, et al. Identification of genes differentially regulated by interferon α, β, or Y using oligonucleotide arrays. Proc Nati Acad Sci USA (1998); 95: 15623-15628). Sería importante determinar si los efectos de los IFNs in vivo podrían ser aumentados por combinación con agentes inductores de apoptosis.
Existe un estudio reciente (Dunn GP, et al. A critica! function for type I interferons ¡n cáncer immunoediting. (2005) Nature Immunol 6: 722-29) que avala el uso de los IFN tipo I (IFN α/β) en el tratamiento de los tumores. Este estudio identificó a los IFN α/β al igual que el IFN-γ, como componentes críticos en el proceso de "inmuno-edición" del cáncer, específicamente este grupo demostró que en ratones inmunocompetentes se requieren IFNs α/β producidos endógenamente para el rechazo de sarcomas MCA altamente inmunogénicos y también previenen el sobrecrecimiento de tumores inducidos por carcinógenos primarios ya que las células hematopoyéticas de hospedero son blancos críticos de ios IFN α/β durante el desarrollo de Ia respuesta antitumoral protectiva.
Efectos antitumorales en humanos: Los IFNs han jugado un importante papel en Ia práctica clínica. La actividad terapéutica clínicamente beneficiosa del IFN- a2 como un simple agente ha sido demostrada en muchas enfermedades malignas. Estos descubrimientos han permitido hablar de los IFNs como las primeras proteínas humanas que han incrementado Ia sobrevida de los pacientes con cáncer. Combinaciones de los IFNs con otras drogas, han demostrado resultados favorables y aplicaciones clínicas nuevas y más efectivas. Cuando se han combinado con otras terapias en modelos animales y células, los IFNs han aumentado Ia efectividad del tratamiento en enfermedades malignas de histología diversa. La reducción en el número de células o el tamaño del tumor y Ia prolongación de Ia sobrevida ha tenido en Ia mayoría de los casos un efecto aditivo o sinérgico. Efecto de los IFNs sobre las enfermedades malignas hematológicas: El grado de actividad y Ia mejoría en Ia calidad de vida de pacientes con leucemia de células peludas (LCP) resultó ser Ia primera licencia aprobada para un IFN en Estados Unidos. Más del 85% de los pacientes tenían evidencias objetivas de respuesta hematológica parcial o completa a IFN-Ct2 (Quesada J, et al. Treatment of hairy cell leucemia with alpha interferon (1985) Blood 1986: 493- 497).
En leucemias mieloides crónicas (LMC), Ia aplicación de IFN-α resultó en una respuesta terapéutica importante (más del 75%) en Ia mayoría de los pacientes diagnosticados de novo (Kantarjian HM, et al. Chronic myelogenous leucemia: a concise update (1993) Blood 82: 691-703; Talpaz M. Use of interferon ¡n the treatment of chronic myelogenous leukemia. (1994) Semin Oncol 21 : 3-7). Los mejores resultados en LMC han demostrado respuesta clínica significativa y citogenética con IFN-Ct2 (Talpaz M. Use of interferon in the treatment of chronic myelogenous leukemia. (1994) Semin Oncol 21 : 3-7). Con un tratamiento continuado, aproximadamente el 25% de los pacientes desarrollan respuesta citogenética completa con pérdida de Ia expresión del cromosoma Filadelfia (Ph). La sobrevida media de los pacientes respondedores que mostraron algunas evidencias, aunque no completa, de respuesta citogenética es de aproximadamente 6 años: Más del 90% de los que presentaron respuesta citogenética completa han tenido remisiones de más de 10 años. Los datos de sobrevida media de 10 años demuestran una ventaja significativa para el IFN- α2 comparado con Ia quimioterapia (leucemia TICSGoCM. Long-term follow-up of the Italian trial of interferon-alpha versus conventional chemotherapy in chronic myeioid leukemia. (1998) Blood 92: 1541-1548). La trombocitosis asociada a trastornos mieloproliferativos, positivos o negativos al cromosoma Ph, puede ser controlada efectivamente con IFN-α2 (Ludwig H, et al. Treatment with recombinant IFN-α -2c: múltiple myeloma and thrombocythaemia in myeloproliferative diseases. (1985) Oncology 42 (Suppl 1): 19-25; Talpaz M, et al. Recombinant IFN-α therapy of chromosome-negative myeloproliferative disorders with thrombocytosis. (1989) Am J Med 86: 554- 558).
El 50 % de los pacientes con mieloma múltiple no tratados previamente, han respondido a Ia terapia con IFN-Ct2 (Quesada JR, et al: Collaborative phase l-ll study of recombinant DNA-produced leukocyte ¡nterferon (clone A) in metastatic breast cáncer, malingnant lymphoma, and múltiple myeloma (1984) Am J Med 77; 427-432).
El IFN-α ha tenido un rol terapéutico en linfomas de histología variada y de fenotipos de células T y B, (Borden EC. Innovative treatment strategies for non- Hodkin's lymphoma and múltiple myeloma (1994) Sem Oncol 21 : 14-22). El IFN-α2 mostró actividad en el 45 % de los pacientes con linfoma de células T cutáneo avanzado, con respuestas de 3 a 25 meses (Borden EC. Innovative treatment strategies for non-Hodkin's lymphoma and múltiple myeloma (1994) Sem Oncol 21 : 14-22). En linfomas de células B pobremente diferenciado, una frecuencia de respuesta superior al 45% ocurrió después del tratamiento con IFN-Ci2 (Foon KA, et al. Treatment of advanced non-Hodgkin's lymphoma with recombinant leukocyte α interferon. (1984) N Engl J Med 311 : 1148-1152; O'Connell M, Colgan JP, Oken MM, et al. Clinical trial of recombinant leukocyte A interferon as initial therapy for favorable histology non-Hodgkin's lymphomas and chronic lymphocytic leukaemia. An Eastern Cooperative Oncology Group pilot study. (1986) J Clin Oncol 4: 128-136)
Efecto de los IFNs sobre los tumores sólidos: En el tratamiento de algunos tumores sólidos metastáticos, el IFN-α resultó en una respuesta equivalente a los mejores agentes quimioterapéuticos. La respuesta del melanoma a IFN-α osciló en un rango ente 2 y 29% (Creagan E, et al. Phase Il study of recombinant leukocyte interferon (rIFN-alpha-A) in disseminated malignant melanoma. (1984) Cáncer 54: 2844-2849; Robinson W, et al. Treatment of metastatic melanoma with recombinant interferon alpha 2. (1986) Immunobiology 172: 275-282). Las combinaciones de IFNs con hormonas, quimioterapia y/o IL-2 podría incrementar Ia respuesta y prolongar Ia sobrevida en el melanoma metastático solo que su integración como modalidad de terapia ha sido limitada por sus toxicidades (Legha SSRS, et al. Development and results of biochemotherapy in metastatic melanoma: the University of Texas M. D. Anderson Cáncer Center experience (1997) Cáncer J Sc¡ Am; 3 (suppl 1) : S9-S15).
En el carcinoma renal metastásico se ha utilizado Ia terapia con IFN-α, combinaciones IFN-α + IL-2, combinaciones IFN-α + IFN-γ, pero los resultados de un meta-análisis realizado, sugieren que los pacientes que tienen tratamiento con IFN-α tienen mejores resultados que las terapias combinadas sobretodo por las toxicidades de las mismas (Hemberg M1 et al. Regimens with or without interferon-alpha as treatment for metastatic melanoma and renal cell carcinoma: an overview of randomized triáis (1999) J Immunother 22: 145-154). Las sustancias bioactivas de origen "orgánico" que ejercen en Ia naturaleza funciones reguladoras, constituyen principios activos básicos, que pueden actuar como fármacos cuyo mecanismo terapéutico se fundamenta en el desarrollo de las potencialidades curativas intrínsecas del propio individuo. En este enfoque se basa el empleo de productos y procedimientos biorreguladores dirigidos a promover, desencadenar o estimular las capacidades del individuo para lograr por sí mismo Ia restauración del equilibrio funcional homeostático alterado en Ia enfermedad. El uso racional de estos principios activos y procedimientos modificadores de Ia respuesta biológica, tiene como objetivo ayudar al paciente a restablecer de manera progresiva y gradual Ia normalidad de las funciones alteradas, por mecanismos y vías fisiológicos.
Evidencias de tipo circunstancial o de carácter experimental sugieren el uso de las propiedades potencialmente terapéuticas de un grupo de productos de origen natural, extractivo o derivados de origen vegetal. Estos biofármacos pueden ser mezclas complejas de origen natural, o componentes aislados, concentrados o semi-purificados en Ia industria, que tengan Ia característica común de presentar una o varias actividades farmacológicas conocidas o referidas, de posible aplicación terapéutica tal es el caso de Ia C- Ficocianina (C-Fico) C-Fico es un pigmento unido a una proteína encontrada en un alga verde-azul. Los monómeros de C-Fico están unidos a 2 subunidades proteicas diferentes denominadas α y β, las cuales contienen al menos 3 cromóforos de bilina unidos covalentemente y cadenas tetrapirrólicas abiertas sin complejos de metal (Duerring M, et al. Isolation, crystallization, crystal structure análisis and refinement of constitutive c-phycocyanin from the chromatically adapting Cyanobacterium fremyella diplosiplon at 1.66 A resolution (1991). J Mol Biol ; 217: 577-92). Este grupo prostético es alrededor del 4% de Ia masa del alga, indicando Ia presencia de aproximadamente 16 grupos cromofóricos por unidad de peso molecular (Oh Eocha C. Phycobilins. In: Lewin RA, editor. Physiology and Biochemistry of Algae: New Cork: Academia Press, 1962: 421- 35). Existen 4 formas estructurales diferentes: monomérica, trimérica, hexamérica y decamérica (MacColl R, et al. Phycobiliproteins. Boca Ratón: CRC Press, 1987: 1-10) y es el pigmento más abundante en el alga verde-azul, siendo más del 20% del peso seco del alga (Richmond A. Large scale microalgal culture and applications. In: Round Chapman, editors. Progress in Phycological Research. VoI. 7 Biopres Ltd., 1990:8).
La estructura química de los cromóforos de bilina en la C-Fico, (cadenas tetrapirrólicas abiertas) es muy parecida a Ia bilirrubina. Stocker y col. (Stocker R, et al. Bilirrubin ís an antioxidant of possible physiological importance (1987) Science; 235: 1043-6) informaron que Ia bilirrubina es un posible antioxidante de importancia fisiológica porque podría eliminar radicales peróxidos donándolo a un átomo de hidrógeno unido al C-10 de Ia molécula tetrapirrólica para formar un radical con carbono-central con estabilización de resonancia que se extiende a toda Ia molécula de bilirrubina. Es conocido que las especies reactivas del oxígeno (ERO) están involucradas en una diversidad de procesos importantes en Medicina, que incluyen: inflamación, aterosclerosis, cáncer, daño por reperfusión (Kehrer JP. Free radicáis as mediators of tissue injury and disease (1993) Crit Rev Toxicol 23:21-48). Una de las vías por las cuales una sustancia puede interferir con estos procesos es por su acción como antioxidante o "scavenger" (depuradores) de radicales libres.
Efectos antioxidantes: La primera información de las propiedades antioxidantes y anti-inflamatorias de C-Fico fue referida por Romay y col. (Romay C, et al. Antioxidant and anti-inflammatory properties of C-phycocyanin from blue-green algae (1998) Inflamm Res 47 (1):36-41), que evaluaron las potencialidades de Ia C-Fico como agente antioxidante en ensayos "in vitro" e "in vivo". C-Fico fue capaz de eliminar radicales hidróxilos (IC5O=O.91 mg/ml) (IC5o: concentración del aditivo que provoca el 50% de inhibición del daño peroxidativo) y alcóxilos (IC50=76μg/ml) con actividad igual a 0.125 mg/ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y 0.038μg/ml de Trolox, que son depuradores específicos de estos radicales respectivamente. C-Fico también inhibió Ia peroxidación lipídica microsomal hepática (IC5o=12mg/ml) (Halliwell B. How to characterize a biological antioxidant. (1990) Free rad Res Comm; 9: 1-32). Es interesante destacar como Ia actividad "scavenging" o depuradora de oxígeno de Ia C-Fico fue solo 3 veces menor que Ia de Ia superóxido dismutasa (SOD), Ia adición de SOD a Ia C-Fico no alteró su capacidad antioxidante, Io que sugiere un diferente mecanismo de acción. Otra indicación de su acción antioxidante es su capacidad de inhibir el daño de Ia desoxirribosa de manera sitio-específica. En el ensayo de Ia desoxirribosa, Ia constante de velocidad calculada para C-Fico fue similar a Ia obtenida por el mismo método para algunas drogas antinflamatorias no esteroidales como Ia indometacina y el ibuprofeno (1.8x1010 IvT1S"1) (Parij N, et al. Linear and no linear competition plots in the deoxyribose assay for determination of rate constants for reaction of non steroidal anti- inflammatory drugs with hydroxyl radicáis (1995). Free Rad Res; 23: 571-9).
Este mismo grupo ha informado recientemente que Ia C-Fico inhibe Ia hemolisis de eritrocitos inducida por 2,2'-azobis (2midinoprapane) dihidroxychloride (AAPH) de forma similar a Trolox y al ácido ascórbico, bien conocidos antioxidantes (Romay C, et al. Phycocyanin ¡s an antioxidant protector of human erithrocytes against lysis by peroxyl radicáis (2000) J Pharm Pharmacol 52: 367-368). Basado en los valores de IC50, se demostró que C-Fico era 16 veces más eficiente antioxidante que Trolox y aproximadamente 20 veces más eficiente que el ácido ascórbico. Estos descubrimientos fueron avalados por un estudio más (Hirata T, et al. Antioxidant activities of Phycocyanobilin prepared from Spirulina platensis (2000) J Appl Phycol 435-439) que demostró que Ia actividad antioxidante de Ia Ficocianobilina (un componente de Ia C-Fico) fue mayor en cantidades molares que el alfa Tocoferol. Se evaluó el efecto antioxidante de Ia Ficocianobilina contra Ia oxidación del metil linoleato en un sistema hidrofóbico o con liposomas fosfatidilcolina. El estudio también mostró que Ia C-Fico de Ia Spirulina seca en spray tenía una actividad antioxidante similar a Ia C-Fico de Ia Spirulina fresca. Estos resultados sugieren que Ia actividad antioxidante de Ia C-Fico es atribuible a Ia Ficocianobilina, grupo prostético de Ia C-Fico, ya que el componente apoproteico puede desnaturalizarse en el proceso de secado. El hecho que Ia C-Fico seca muestre similar nivel de actividad que Ia proteína intacta hace comercialmente factible Ia preparación y utilización de Ia C-Fico.
De acuerdo a los resultados de Reddy y col (Reddy CM, et al. Selective inhibition of ciclooxygenase-2 by C-phycocyanin, a biliprotein from Spirulina platensis (2000) Biochem Biophys Res Commun 3: 599-603), Ia C-Fico de Ia Spirulina platensis, es un inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) con una muy baja relación IC50COX-2 / IC50COX-I (0.04). Interesantemente , este estudio mostró que el valor de inhibición ICg0 obtenido para COX-2 por C-Fico fue mucho menor (180 nM) comparado con Celecoxib (255 nM) y Rofecoxib (401 nM), bien conocidos como inhibidores selectivos de COX-2. El componente apoproteico de Ia C-Fico fue responsable de Ia inhibición de COX- 2 ya que Ia Ficocianobilina y Ia C-Fico reducidas fueron inefectivas. Los autores sugieren que las propiedades anti-artríticas, anti-inflamatorias y hepatoprotectivas de Ia C-Fico reportadas en Ia literatura se deben en parte, a su propiedad de inhibición selectiva de Ia COX-2 aunque no excluyen un similar efecto de Ia C-Fico a través de su capacidad de eliminar eficientemente radicales libres e inhibir Ia peroxidación lipídica.
C-Fico inhibe Ia quimioluminiscencia amplificada por luminol (LCL) de manera dosis dependiente, probablemente a través de su capacidad de eliminar radicales libres (OH", H2O2, RO-) y peróxidos aumentados durante el arranque respiratorio de células fagocíticas. Sin embargo, es también posible que Ia C- Fico pudiera disminuir las señales LCL por otras vías, por ejemplo, por afectación de las enzimas involucradas en Ia producción de especies reactivas del oxígeno por fagocitos activados, NADPH oxidasa y mieloperoxidasa o por interferencia ya sea con Ia unión del estimulante o Ia vía metabóiica del ácido araquidónico. Recientemente se evidenció inhibición por C-Fico de Ia liberación de leucotrieno B4 (LTB4) en un modelo animal de inflamación. Se ha evaluado Ia respuesta inflamatoria inducida por peróxido en un modelo "in vivo" con el objetivo de identificar agentes con potenciales efectos "scavenging" o depurador de H2O2 y OH-. La glucosa oxidasa (GO) inyectada en Ia pata del ratón reacciona con Ia glucosa endógena y genera H2O2 con Ia consiguiente producción de radicales OH, ambos son responsables del daño tisular y de los cambios inflamatorios acompañantes (Spillert CR, et al. A peroxide-induced ¡nflammation model for drug testing (1987) 21 : 297-8). C-Fico redujo el edema producido por Ia glucosa oxidasa en Ia pata del ratón. Este efecto anti-inflamatorio puede ser debido, al menos en parte, a Ia eliminación de radicales hidroxilos.
Con frecuencia, existe consenso acerca de que muchos de los daños inducidos por H2O2 in vivo son debidos a su conversión a oxidantes fuertemente reactivos, principalmente OH-. (Halliwell B. How to characterize a biological antioxidant (1990) Free Rad Res Comm 9: 1-32) por tanto, Ia acción depuradora de Ia C- Fico contra OH- es probablemente importante para sus efectos antiinflamatorios. Efectos antinflamatorios: C-Fico es una ficobilina que se encuentra en el alga Spirulina (Sp). Teniendo en cuenta que esta microalga se utiliza como suplemento nutricional en muchos países, incluida Cuba, es concebible que C- Fico pueda ser usada además, en enfermedades con un componente inflamatorio importante por existir informes relacionados con su actividad anti- inflamatoria (González R, et al. Anti-inflammatory activity of Phycocyanin extract in acetic acid-induced colitis in rats. (1999) Pharm Res 39; 1 : 55-59). González y col evaluaron el efecto de un extracto de C-Fico en Ia colitis inducida por ácido acético, un modelo animal que mimifica algunas de las respuestas inflamatorias agudas observadas en Ia colitis ulcerativa (Frettland DJ, et al. Eicosanoids and inflammatory bowel disease: regulation and prospects for therapy (1990) Prost Leukotr Ess Fatty Acids; 41 : 215-33). El más importante descubrimiento de este estudio fue que C-Fico redujo Ia colitis inducida por ácido acético en ratas, siendo el primer reporte de un efecto anti-colítico de Ia C-Fico el cual fue evaluado tanto por sus características histológicas como por análisis estructural del tejido del colon y confirmado por mediciones de Ia actividad de Ia mieloperoxidasa (MPO). En este estudio, se encontró una reducción significativa de Ia infiltración neutrofílica y de Ia actividad MPO en Ia mucosa del colon dañada en animales con colitis tratados con C-Fico, Io que respalda su efecto beneficioso para esta condición. También se ha encontrado actividad antinflamatoria de C-Fico en el mismo rango de dosis en el edema inducido por carragenina en Ia pata de Ia rata y en el granuloma por motas de algodón en ratas (Romay Ch, et al. Further studies on anti-inflammatory activity of phycocyanin in some animal models of inflammation (1998) Inflamm Res 47 (8):334-8). En estos modelos experimentales de inflamación así como en el de colitis experimental, los metabolitos del ácido araquidónico juegan un importante papel. C-Fico redujo significativamente y de manera dosis dependiente el edema de Ia oreja inducido por ácido araquidónico en ratones, así como el edema inducido por carragenina en Ia pata de Ia rata. C-Fico también mostró actividad anti- inflamatoria en Ia prueba del granuloma subcrónico por motas de algodón en el que se implantan motas estériles de algodón en las axilas de ratas. La administración oral de C-Fico dio como resultado una significativa actividad anti-inflamatoria en todos los modelos probados. La actividad anti-inflamatoria observada se atribuyó a Ia actividad eliminadora de oxígeno y antioxidante de Ia C-Fico y quizás debido a su efecto inhibitorio sobre el metabolismo del ácido araquidónico.
Existen otros informes que han evaluado el papel de Ia C-Fico en Ia prevención del daño hepático quimio-inducido a partir de los efectos antioxidantes y anti- inflamatorios referidos. (Vadiraja BB, et al. Hepatoprotective effect of C- Phycocyanin: Protection for carbón tetrachloride and R-(+)-pulegone-mediated hepatotoxicity in rats (1998) Biochem and Biophys Res Com 249: 428-431). Vadiraja y col estudiaron el efecto de C-Fico sobre Ia hepatotoxicidad inducida por R-(+)-pulegone y CCI4 en ratas. En este estudio una dosis simple (200 mg/kg) de C-Fico administrada intraperitonealmente a ratas de 1 a 3 horas previo a Ia administración de R-(+)-pulegone (250mg/kg) o CCI4 (0.6 ml/kg) redujo significativamente Ia hepatotoxicidad causada por estos agentes químicos. Se postula que ambos agentes causen hepatotoxicidad por formación de radicales libres. Efecto hepatoprotector: El efecto hepatoprotectivo de Ia C-Fico fue, por tanto, atribuido a Ia inhibición de reacciones involucradas en Ia formación de metabolitos reactivos y posiblemente a su actividad eliminadora de radicales. C-Fico inhibe algunas de las reacciones mediadas por citocromo P450, involucradas en Ia formación de metabolitos reactivos. En este caso es también posible que C-Fico pueda actuar como un eficiente eliminador de radicales. Recientemente, Bhat y col (Bhat VB, et al. C-phycocyanin: a potent peroxyl radical scavenger in vivo and in vitro (2000) Biochem Biophys Res Común 1 : 20-25) informaron que C-Fico inhibía efectivamente, Ia peroxidación lipídica inducida por CCI4 en el hígado de ratas "in vivo", esta inhibición fue concentración-dependiente con una IC50 de 11.35 μM. Estos estudios han mostrado inequívocamente que C-Fico es un potente eliminador de radicales peróxilos con una relación de velocidad constante de 1.54, comparada con 3.5 para el ácido úrico (un conocido eliminador de radicales peróxilos). Se postula que Ia disminución de los mecanismos de defensa antioxidantes y el incremento de las especies reactivas del oxígeno y nitrógeno son factores causales de Ia declinación de las funciones relacionadas con Ia edad y en las enfermedades neurodegenerativas (Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. (1956) J Gerontol 11 : 289-300; Leibovitz BE, et al. Aspects of free radical reactions in biological systems: aging (1980) J Gerontol 35: 45-56; Ames BN, et al. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90: 7915-7922). Evidencias crecientes sugieren que los procesos inflamatorios están relacionados con el daño oxidativo del sistema nervioso central (SNC). La inyección de Ia enzima antioxidante superóxido dismutasa disminuye Ia inflamación en algunos modelos animales. Los antioxidantes aumentan algunos parámetros de Ia función inmune cuando se adicionan a células inmunes aisladas "in vitro" o cuando se dan como suplementos a animales y humanos "in vivo" (lan SN, et al. Antioxidant, cytokines, and influenza infection ¡n aged mice and elderly humans (2000) J Infect Dis 182:S74-S80). Un mecanismo potencial es el efecto de los antioxidantes sobre Ia producción de moléculas inmunorreguladoras tales como citoquinas. Las citoquinas se inducen en respuesta a un daño cerebral y pueden mediar e inhibir el daño celular favoreciendo Ia reparación. Muchos estudios clínicos informan acerca de Ia expresión incrementada de citoquinas en el líquido cefalorraquídeo (LCR) o en el tejido cerebral post-morten de pacientes que han sufrido infarto o daño cerebral. Existen evidencias que indican que citoquinas pro-inflamatorias tales como IL-1 y TNF incrementan con Ia edad (Lynch MA. Age-related impairment in long-term potentiation in hippocampus. A role for the cytokine, interleukin-1β? (1998) Prog Neurobiol 56: 571-589; Knoblach SM, et al. Early neuronal expression of tumor necrosis factor-α after experimental brain injury contributes to neurological impairment. (1999) J Neuroimmunol 95: 115-125). C-Fico es entre todos los compuestos que forman Ia Sp, el que tiene mayor actividad antioxidante, evaluada contra Ia oxidación de metil linolato en un sistema hidrófobo (Hirata T, et al. Antioxidant activities of phycocyanobilin prepared fron Spirulina platensis (2000) J Appl Phycoi 12: 435-439). En un estudio (Gemma C, et al. Diets enriched in foods with high antioxidant activity reverse age-induced decreases in cerebellar β-adenergic function and increases in proinflammatory cytokines. (2002) J Neurosci 22; 14: 6114-6122) 344 ratas Fischer viejas alimentadas durante 14 días con una dieta que contenía solo Sp, mostraron mejoría de Ia función del receptor β-adrenérgico, disminuyeron las citoquinas proinflamatorias (evidenciado por Ia disminución de los niveles de mRNA de TNF-α y TNF-β) y disminuyeron los niveles de malonyldelaldehído (MDA), marcador de daño oxidativo, en el cerebelo. Estos eventos no ocurrieron en ratas alimentadas con dietas suplementadas con cantidades equivalentes de pepinos o alimentos con bajos niveles de ORAC (capacidad de absorción de radicales de oxígeno). Efecto neuroprotector: Un reciente, elaborado e interesante estudio, muestra que Ia administración oral de C-Fico (100 mg/kg) en ratas previene Ia reactividad glial y el comportamiento inducido por ácido kaínico en el hipocampo de ratas, sugiriendo un efecto protectivo sobre las neuronas. El estudio mostró que C-Fico redujo el status epiléptico experimental, sugiriendo posible intervención terapéutica en el tratamiento de algunas formas de epilepsia. De acuerdo a estos autores (Rimbau V, et al. Protective effect of C- phycocyanin against kainic acid-induced neuronal damage in rat hippocampus (1999). Neuroscience Letters; 276: 75-78), el ácido kaínico provoca excitotoxicidades que generan producción de especies reactivas del oxígeno. Por tanto, postularon que el efecto protectivo de C-Fico en el daño neuronal podría ser debido a Ia eliminación de radicales libres y sus propiedades antioxidantes. Un interesante aspecto en este estudio es el hallazgo de que Ia administración oral de C-Fico ejerce su efecto en el hipocampo, atravesando Ia barrera hematoencefáüca. Estos descubrimientos y Ia virtual ausencia de toxicidad de Ia C-Fico sugieren que este fotoquímico podría ser usado en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como, Ia enfermedad de Alzheimer y Parkinson, las cuales se caracterizan por daño neuronal inducido por stress oxidativo.
Efectos antialérgicos: Además de las propiedades anti-inflamatorias de C-Fico mediadas por sus propiedades antioxidantes a Io cual nos hemos referido ampliamente. Se ha reportado que C-Fico tiene efectos anti-inflamatorios en Ia respuesta inflamatoria alérgica inducida y sobre Ia liberación de histamina de mastocitos de rata aislados (Remírez D1 et al. Role of histamine ¡n the inhibitory effects of phycocyanin in experimental models of allergic inflammatory response (2002) Mediators of Inflammation, 11 : 81-85). En experimentos "in vivo", C-Fico fue administrada 1 hora antes del reto con Ovalbúmina (Ova) en Ia oreja de ratones previamente sensibilizados con Ova. Una hora después, fue evaluada Ia actividad MPO y el edema en Ia oreja. C-Fico, redujo significativamente ambos parámetros así como inhibió Ia liberación de histamina de los mastocitos peritoneales de rata aislados. El efecto de C-Fico fue dosis dependiente.
La permeabilidad vascular incrementada a las proteínas plasmáticas es una de las características de Ia respuesta inflamatoria alérgica donde los mastocitos juegan un papel importante porque ellos pueden liberar mediadores vasoactivos preformados fundamentalmente Ia histamina y en el caso de las ratas y ratones Ia serotonina (Halpern BN, et al. On the nature of the chemical mediators envolved in anaphylactic reaction in mice. (1963) Br J Pharmacol 20: 389-398; Ohuchi K, et al. Pharmacological análisis of the vascular permeability response in the anaphylactic phase of allergic inflammation in rats (1985) Eur J Pharmacol 117: 337-345), se ha demostrado que además los mastocitos contienen citoquinas pre-formadas, tales como el TNF-α y Factor de permeabilidad vascular/factor de crecimiento de células endoteliares vasculares, entre otras, que pueden ser liberadas en reacciones dependientes- IgE y pueden dar a los mastocitos potencialidades efectoras e inmunoreguladoras en Ia respuesta inflamatoria alérgica. En esta respuesta también es importante Ia participación de mediadores lipidíeos sintetizados de novo por los mastocitos , tales como Ia prostaglandina D2, leucotrienos (LTC4, LTD4, LTE4, LTB4) y factor activador de plaquetas (PAF), así como especies reactivas del oxígeno (ROS) (Williams CM, et al. The diverse potencial effector and immunoregulatory roles of mast cells in allergic diseases. (2000) J Allergy Clin Immunol 105: 847-859; Fantozzi R, et al. Mast cell and neutrophil interactions: a role for superoxide anión and histamine. (1985) Agents Actions 16: 260-264). C-Fico reduce los niveles de prostaglandina D2 y LTB4 en el test de inflamación inducido por ácido araquidónico, en Ia oreja del ratón (Romay C, et al. Effects of phycocyanin extract on prostaglandin E2 levéis in Mouse eras inflammation test. (2000) Arzneim Forsch/Drug Res '50: 1106-1109; Romay C, et al. Phycocyanin extract reduces leukotrienes B4 levéis ¡n arachidonic acid- induced mouse ear inflammation test (1999) J Phar Pharmacol 51 : 641-642). El efecto inhibitorio de C-Fico sobre Ia liberación de histamina de los mastocitos aislados de rata apoya Ia participación de este evento en el modo acción de Ia C-Fico como un agente anti-inflamatorio.
Existen evidencias de que ROS, tales como: el anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilos y peroxilos, pueden iniciar Ia cascada del ácido araquidónico, síntesis de PAF o liberación de histamina. Se ha demostrado que ROS degranula los mastocitos permitiendo Ia liberación de histamina, serotonina, TNF-α y otros mediadores de Ia inflamación. C-Fico es capaz de eliminar radicales peróxidos, hidroxilos y alcoxilos (Lissi EA, et al. Kinetics of phycocyanin bilin groups destruction by peroxyl radicáis. (2000) Free Radie Biol Med 28: 1051-1055) Además de las propiedades antioxidantes, anti-inflamatorias, anti-alérgicas demostradas para Ia C-Fico, se ha visto que tiene propiedades antitumorales. Efectos anticancerígenos: Schwartz y col (Schwartz J, et al. Regression of experimental hámster cáncer by beta carotene and algae extraets. (1987) J Oral Maxillofac Surg; 45: 510-515) estudiaron el efecto de Ia administración de 250 μg de un extracto de Spirulina en carcinoma escamoso bucal inducido por DMBA (7,12~dimethylbenz(a)-anthrac¡ne), otros tratamientos incluyeron Ia inyección de beta-carotenos, canthaxanthin y ácido-13 cis-retinoico . Todos los tratamientos se aplicaron 2 veces a Ia semana por 4 semanas. Después de las 4 semanas de tratamiento, se encontró regresión total del tumor en el 30% de los animales tratados con el extracto, 20% en los tratados con beta carotenos y 15% en los tratados con canthaxanthin. Se encontraron regresiones tumorales parciales en el 70% de los animales restantes tratados con el extracto. Un interesante observación en este estudio fue que el extracto del alga fue más efectivo que el beta caroteno solo, sugiriendo un efecto sinérgico entre varios componentes del alga. En otro estudio de este mismo grupo (Schwartz J1 et al. Algae-derived phycocyanin ¡s both cytostatic and cytotoxic to oral squamous cell carcinoma (human or hamster)(1987). J Dent Res 66: 160) se demostró que C-Fico derivada del alga, tenía actividades citostáticas y citotóxicas contra el carcinoma de células escamoso (en humanos y hámster). En un estudio (Liu Y, et al. Inhibitory effect of phycocyanin from Spirulina platensis on the growth of human leucemia K562 cells (2000) J Appl Phycol 12: 125-130), C-Fico procedente de Spirulina platensis inhibió el crecimiento de Ia línea celular de leucemia humana K562. El efecto de C-Fico fue inicialmente estudiado siguiendo el crecimiento de las células K562 en cultivo de agar semi- sólido a concentraciones de 20, 40, 80 y 169 mg-1. Los resultados mostraron que C-Fico inhibió el crecimiento de las células de leucemia K562 de manera dosis-dependiente con inhibición estadísticamente significativa observada a 80 y 160 mg-1. El efecto de C-Fico fue además estudiado usando Ia viabilidad celular en el ensayo de reducción dye XTT. C-Fico, nuevamente inhibió Ia viabilidad celular de manera dosis-dependiente. El valor de IC50 de C-Fico fue de 72.5 mg"1. Además, experimentos de citometría de flujo, basados en el análisis del contenido de ADN revelaron que Ia acumulación de células K562 ocurrió en Ia fase G-1 cuando las células fueron incubadas con C-Fico durante 6 días. Los más altos porcentajes de células en fase G-1 se encontraron a las concentraciones de 40 y 80 mg-1 de C-Fico. El análisis de Ia fragmentación del ADN, no mostró el patrón de escalonamiento típicamente observado en Ia apoptosis, Io que indica que un mecanismo diferente puede estar involucrado en esta inhibición. En estudios anteriores se informa acerca de Ia inhibición selectiva de Ia COX-2 por C-Fico (Reddy CM, et al. Selective inhibition of ciclooxygenase-2 by C- phycocyanin, a biliprotein from Spirulina platensis (2000) Biochem Biophys Res Commun 3: 599-603), en este estudio, este grupo (Bobbili V.V, et al. Phycocyanin-mediated apoptosis in AK-5 tumor cells involves down-regulation of Bcl-2 and generation of ROS. (2003) Mol Cáncer Therapy 2: 1165-1170) y sobre Ia base de esta propiedad, se estudió el efecto de Ia C-Fico sobre una línea tumoral histiocítica de rata. Las células AK-5, a diferencia de los resultados del estudio anterior donde Ia apoptosis no mediaba el efecto antitumoral de Ia C-Fico, son inducidas a un programa de muerte apoptótica cuando son tratadas con C-Fico , este programa involucra Ia activación de Ia caspasa-3. La muerte apoptótica mediada por C-Fico es inducida a través de Ia generación de ROS. Bcl-2, un inhibidor de Ia apoptosis, mostró regular Ia generación de ROS. Las células AK-5 transfectadas con el gen de Bcl-2 fueron resistentes a Ia muerte inducida por C-Fico. La sobre-expresión de Bcl-2, inhibió la producción de ROS en células AK-5 tratadas con C-Fico, Io que demuestra que Ia muerte apoptótica inducida por C-Fico en células AK-5 es inhibida por Bcl-2 a través de Ia regulación de Ia generación de radicales libres. C-Fico, al igual que otros inhibidores de COX-2 podría ser utilizado como un posible agente quimioterapia) a través de su actividad apoptótica contra las células tumorales.
El más reciente estudio sobre las propiedades anti-cancerígenas de C-Fico, fue reportado por Subhashini y col (Jagu Subhashini, et al. Molecular mechanisms in C-Phycocyanin induced apoptosis ¡n human chronic myeloid leucemia cell Iine-K562. (2004) Biochem Pharmac 68: 453-462) que evaluaron el efecto de C- Fico altamente purificada sobre el crecimiento y multiplicación de Ia línea celular leucémica mieloide crónica humana K562. Los resultados indican una significativa disminución (49%) en Ia proliferación de las células K562 tratadas con 50 μM de C-Fico por 48 horas. Además, estudios de microscopía electrónica y fluorescencia revelan características apoptóticas tales como retracción celular, protrusiones de Ia membrana y condensación nuclear. Electroforesis de ADN genómico de células tratadas con C-Fico mostraron el patrón de fragmentación típico de las células apoptóticas. Análisis de citometría de flujo de las células apoptóticas tratadas con 25 y 50 μM de C-Fico durante 48 horas mostraron 14.11 y 20.93% de células en fase sub G0/G1 respectivamente. El tratamiento con C-Fico de las células K562 también resultó en liberación de citocromo C en el citosol y ruptura de polimerasa ribosa poly (ADP) (PARP). Este estudio también mostró disminución de Bcl-2 anti- apoptótico pero sin ningún cambio en pro-apoptótico Bax, por tanto Ia relación Bcl-2/Bax favorece Ia apoptosis. Los efectos de C-Fico parecen ser mediados por Ia entrada de C-Fico al citosol por un mecanismo desconocido. El presente estudio también demuestra que C-Fico induce apoptosis en K562 por liberación de citocromo C de Ia mitocondria al citosol, ruptura de PARP y disminución de Bcl-2. De acuerdo con una patente japonesa (Dainippon Ink & Chemicals, Inc. (DIC). Anti-tumoral agents containing phycobillin. (1983) Japanese Patent No. 58- 65216) Ia administración oral de C-Fico aumentó Ia sobrevida de los ratones que habían sido inyectados con células tumorales hepáticas. La actividad linfocítica del grupo de tratamiento fue significativamente más alta que el grupo control, sugiriendo algún grado de estimulación del sistema inmune. Otras propiedades de Ia C-Fico se han demostrado en diferentes estudios, Cheng-Wu y col (Cheng-wu Z, et al. The effects of polysaccharide and phycocyanin from Spirulina platensis on peripheral blood and hematopoietic system of bone marrow in mice. (1994). Book of Abstracts. Second Asia Pacific Conference on Algal Biotechnology; 58) en un estudio preliminar sobre el efecto de polisacáridos y Ia C-Fico sobre Ia sangre periférica y Ia médula ósea del sistema hematopoyético de ratones demostraron que Ia C-Fico tenía una elevada actividad tipo eritropoyetina (EPO).
Descripción de Ia invención.
La presente invención describe el uso de un compuesto farmacéutico biorregulador dirigido a promover, desencadenar o recuperar las capacidades afectadas en el individuo para lograr Ia restauración del equilibrio funcional homeostático alterado en Ia enfermedad.
De inicio dicho compuesto es novedoso desde su formulación ya que está constituido por una proteína de Ia familia de los interferones conjuntamente con un producto de origen natural, demostrándose en nuestra invención su efectividad en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, alérgicas y el cáncer.
El compuesto referido en esta invención está integrado por IFN-α, específicamente IFN-α2b recombinante y C-Ficocianina, productos que pueden ser usados formando parte de una combinación farmacéutica de administración parenteral u oral con un excipiente apropiado.
La mencionada combinación farmacéutica puede ser empleada como un método de tratamiento aplicándose sus componentes activos por separado en un mismo individuo como un único tratamiento. En una realización particular en el modelo de EAE, los componentes de Ia combinación se administraron por diferentes vías, el IFN-α intraperitonelamente y Ia C-Ficocianina por vía oral como parte del mismo tratamiento y no se comprobaron diferencias significativas a las mismas dosis entre Ia administración de los componentes independientes por diferentes vías y Ia administración de los componentes formando parte de un compuesto farmacéutico por una vía única, de manera que Ia vía de administración no influye en el efecto, por Io que dicho compuesto puede ser administrado además por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea, oral, nasal e intratecal. La novedad de Ia invención consiste en Ia demostración del efecto inductor de células T reguladoras naturales y adaptativas tanto para el compuesto farmacéutico IFN-α/C-Fico como para sus principios activos independientes. Esta importante propiedad del sistema inmune ya había sido sugerida para el IFN-α, pero nuestra invención, además de demostrarlo para el IFN-α, constituye el primer reporte de efecto inductor de células T reguladoras para Ia C- Ficocianina, así como demuestra un efecto sinérgico de ambos componentes del compuesto farmacéutico IFN-α / C-Fico, haciendo racional su uso en enfermedades que cursan con disminución del número o de Ia funcionalidad de las cTr, como son las enfermedades alérgicas y autoinmunes con Io cual se previene el desarrollo de crisis especialmente en las formas recidivantes de estas enfermedades.
De este modo, mediante Ia presente invención se logra de forma simultánea, restaurar el equilibrio efector-regulador que se rompe en las enfermedades alérgicas y autoinmunes por Ia pérdida de Ia inmunorregulación e intervenir en diferentes etapas que participan en Ia patogenia de dichas enfermedades, donde las propiedades anti-inflamatorias, inmunomoduladoras y antioxidantes descritas en Ia literatura para el IFN-α y Ia C- Ficocianina se potencian mediante Ia combinación de ambos principios activos.
Por otra parte, en esta invención se pone en evidencia un efecto sinérgico del compuesto farmacéutico IFN-α / C-Fico respecto a Ia actividad de sus componentes independientes en cuanto a sus propiedades antiproliferativas, antioxidantes, antinflamatorias e inductora de apoptosis de células tumorales. La novedad de Ia invención consiste en este caso, en que el compuesto farmacéutico mostró tener efectos anticancerígenos estadísticamente significativos superiores a sus componentes independientes, por medio de sus propiedades antiproliferativas e inductoras de apoptosis de células tumorales evidenciadas por Ia regulación positiva que produjo sobre las proteínas p53 y más tardíamente p21 necesarias para mantener el arresto del ciclo celular en fase G2/M y Ia apoptosis seguida al daño del ADN. Adicionalmente, un efecto antiproliferativo sinérgico y dosis-dependiente estadísticamente significativo del compuesto lFN-α / C-Fico, fue evidenciado para Ia inhibición del crecimiento de diferentes líneas tumorales de origen variado. Uno de los efectos más estudiados de Ia C-Fico es su capacidad antioxidante en ensayos "in vitro" e "in vivo" (Romay C, et al. Antioxidant and anti- inflammatory properties of C-phycocyanin from blue-green algae (1998) Inflamm Res 47 (1):36-41). C-Fico fue capaz de eliminar radicales hidroxilos e alcoxilos con igual actividad "scavenger" de otros eliminadores específicos de estos radicales. C-Fico también inhibió Ia peroxidación lipídica microsomal hepática (Halliwell B. How to characterize a biological antioxidant. (1990) Free rad Res Comm; 9: 1-32). El efecto anti-inflamatorio, inmunomodulador, antiproliferativo e inductor de apoptosis de células tumorales de Ia C-Fico, se plantea que está mediado en gran medida por su potente actividad antioxidante, de forma tal que pudiera explicarse el efecto anticancerígeno de Ia C-Fico, ya que Ia mayoría de los procesos neoplásicos tienen un componente inflamatorio crónico y elementos que hablan a favor de un marcado stress oxidativo. Estos aspectos son cruciales para Ia comprensión de como Ia regulación del ciclo celular y Ia maquinaria apoptótica son importantes en el crecimiento y desarrollo de neoplasmas, puntos de señalización que pueden dar lugar a Ia activación de vías que permitan Ia muerte celular programada si el daño celular no es reparado (Pietenpol JA, Stewart ZA. CeII cycle checkpoint signaling: cell cycle arrest versus apoptosis. (2002) Toxicology 181-182: 475-481. Son bien conocidos los efectos antiproliferativos e inductor de apoptosis sobre células tumorales del IFN-α, el cual causa una prolongación de Ia fase G1 , una reducción en Ia velocidad de entrada a Ia fase S y un enlentecimiento de las fases S y G2 (Balkwill F, et al. Interferon affects both G1 and S+G2 in cells stimulated from quiescence to growth. (1978) Nature 274: 798-800). El efecto acumulativo de Ia prolongación del ciclo celular por IFN-α, tanto en células normales como células tumorales da lugar a citostasis, incremento del volumen celular y apoptosis (Otsuki T, et al. Human myeloma cell apoptosis induced by interferon-α. (1998) Br J Haematol 103: 518-529). Las células tumorales desarrollan alteraciones en una o más proteínas que controlan Ia progresión del ciclo celular, entre ellas se encuentran los proto- oncogenes regulados por IFN como el bcl2 (Koshiji M, et al. Apoptosis of colorectal adenocarcinoma (COLO201) by tumor necrosis factor-alpha and/or interferon-gamma resulting from down-regulation of Bcl-2 expression. (1998) Clin Exp Imunol 111 : 211-218). En una realización particular de nuestra invención se demostró un efecto sinérgico y dosis dependiente de regulación negativa de bcl2 en células tumorales estimuladas por Ia combinación IFN-α / C-Fico. Una de las vías para Ia inducción de apoptosis involucra Ia unión de Fas a FasL, Ia cual resulta en el reclutamiento de Ia proteína que contiene el dominio de muerte FADD y Ia consiguiente activación de las caspasas, tales como Ia caspasa -8. El IFN-α regula positivamente Ia expresión de Fas y por tanto pueden funcionar a través de Ia vía apoptótica mediada por Fas tal como se demostró en otra realización particular de nuestra invención donde además se evidenció que el compuesto farmacéutico IFN-α / C-Fico modulaba positivamente de manera significativa Ia expresión de Fas en células tumorales. COX-2 es una conocida molécula anti-apoptótica y se ha reportado que C-Fico es un inhibidor selectivo de COX-2 favoreciendo de esta forma Ia muerte celular programada de las células tumorales (Reddy CM, et al. Selective inhibition of ciclooxygenase-2 by C-phycocyanin, a biliprotein from Spirulina platensis (2000) Biochem Biophys Res Commun 3: 599-603). En nuestra invención también se demostró que el compuesto IFN-α / C-Fico disminuía de manera significativa y dosis dependiente los niveles de expresión de COX-2 pudiendo ser este uno de los mecanismos que explican el efecto inductor de apoptosis de las células tumorales por Ia combinación descrita.
En un estudio realizado por Subhashini y col (Jagu Subhashini, el at. Molecular mechanisms in C-Phycocyanin induced apoptosis in human chronic myeloid leucemia cell line-K562. (2004) Biochem Pharmac 68: 453-462) se demuestra que C-Fico induce apoptosis en Ia línea celular K562 por liberación de citocromo C de Ia mitocondria al citosol y disminución de bcl-2. En nuestra invención se evidenció que el compuesto farmacéutico referido en Ia misma tiene un efecto sinérgico positivo respecto a sus componentes aislados referente a Ia inducción de los niveles de expresión de citocromo C, pudiendo ser este un mecanismo de inducción de apoptosis de las células tumorales generado por dicho compuesto.
En Ia práctica clínica se ha demostrado que las combinaciones de IFN-α con hormonas, quimioterapia y/o IL-2 podría incrementar la respuesta y prolongar Ia sobrevida en muchos tipos de tumores, solo que su integración como modalidad de terapia ha sido limitada por sus toxicidades respectivas, de ahí que propongamos el uso del compuesto farmacéutico descrito en nuestra invención que además de tener un efecto sinérgico de ambos componentes respecto a sus propiedades antiproliferativas, citotóxicas, antioxidantes e inductora de apoptosis de células tumorales que justifican su respuesta clínica, existen amplias evidencias de Ia inocuidad y ausencia de toxicidad de Ia C- Fico.
Descripción de las figuras
Figura 1 : Efecto de los tratamientos independientes y de la combinación IFN-α / C-Fico sobre Ia expresión de genes marcadores de células T reguladoras naturales (A y B) y adaptativas (C y D) por RT-PCR en pacientes con Esclerosis Múltiple. Figura 2: Efecto de Ia combinación IFN-α / C-Fico sobre Ia relación de CD25/Foxp3 en pacientes con Esclerosis Múltiple.
Figura 3: A) Citometría de Flujo de Ia expresión CD4+ CD25+ en células mononucleares de sangre periférica tratadas con los principios activos independientes y con la combinación IFN-α / C-Fico B) Efecto inductor de células CD4+ C.D25+ y CD4+ CD25high de los principios activos independientes y de Ia combinación IFN-α / C-Fico.
Figura 4: Efecto de los tratamientos independientes y de Ia combinación IFN-α / C-Fico sobre Ia expresión de genes marcadores de células T reguladoras naturales (A y B) y adaptativas (C y D) por RT-PCR en pacientes con Artritis Reumatoide.
Figura 5: Efecto de los tratamientos independientes y de Ia combinación IFN-α / C-Fico sobre Ia expresión de genes marcadores de células T reguladoras naturales (A y B) y adaptativas (C y P) por RT-PCR en pacientes con Asma Bronquial.
Figura 6: Efecto dosis-respuesta de Ia combinación IFN-α/C-Fico sobre Ia inhibición de Ia proliferación en Ia línea celular HeLa. Figura 7: A) Efecto de Ia combinación IFN-α/C-Fico y de los principios activos independientes sobre Ia expresión de los genes COX-2 y Bcl-2 en Ia línea celular K562. B) Efecto tiempo dependiente de Ia combinación IFN-α/C-Fico sobre Ia expresión de los genes COX-2 y Bcl-2 en Ia línea celular K562.
Figura 8: Efecto de Ia combinación IFN-α/C-Fico y de los principios activos independientes sobre Ia expresión del gen Fas en Ia línea celular K562.
Figura 9: Efecto de los principios activos independientes y de Ia combinación IFN-α/C-Fico sobre Ia expresión de Ia proteína citocromo-c.
Figura 10: Efecto de Ia combinación IFN-α / C-Fico y de los principios activos independientes sobre los niveles de las proteínas p53 (A) y p21 (B) cuantificados por ELISA en células HepG2.
Figura 11 : Cinética de Ia combinación IFN-α / C-Fico sobre los niveles de las proteínas p53 (A) y p21 (B) cuantificados por ELISA en Ia línea celular HepG2.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Efecto terapéutico de Ia combinación IFN-α / C-Fico y sus principios activos independientes en un modelo de EAE.
La combinación IFN-α / C-Fico, se probó en un biomodelo de EAE. para evaluar su efecto terapéutico:
Se inmunizaron ratas Lewis hembras de 13Og de peso corporal promedio, por vía subcutánea con 5 mg de homogenado de médula espinal de curiel en PBS (50%) y adyuvante completo de Freund (50%), los días 0 y 6. Diez días después de Ia primera inmunización se comenzó el esquema terapéutico por vía intraperitoneal con Ia combinación IFN-α / C-Fico (200 ng / kg / día - 740 ng / kg / día), los principios activos independientes IFN-α (200 ng / kg / día) y C- Fico (200 ng / kg / día) y placebo (PBS). El esquema terapéutico se siguió por espacio de 10 días mediante Ia evaluación de Ia evolución clínica de Ia enfermedad según el siguiente índice clínico: 0; no alteraciones, 1 ; parálisis completa de Ia cola, 2; parálisis de uno de los miembros inferiores, 3; parálisis completa del tren posterior, 4; parálisis completa del tren posterior y parálisis del tren anterior, 5; muerte. La pérdida de peso y Ia incontinencia vesical o del esfínter rectal, que también son signos clínicos de Ia enfermedad en el animal se valoraron adicionando 0.5 al índice clínico mencionado anteriormente. A los 40 días posteriores a Ia primera inmunización los animales fueron anestesiados y sacrificados, el encéfalo y Ia médula espinal de cada animal se procesó (fijación en 10% de formalina, tinción con H & E y Luxol Blue) para el análisis histopatológico. Los criterios histopatológicos considerados fueron, el número y tamaño del infiltrado inflamatorio perivascular, lesiones desmielinizant.es, apoptosis de neuronas o glías y reactividad de los astrocitos. Todas las observaciones fueron realizadas a ciegas.
Como se muestra en Ia Tabla 1 Ia combinación IFN-α / C-Fico protege a los animales experimentalmente inducidos a desarrollar EAE, dado que sólo el 50% de estos animales desarrolla Ia forma más leve de Ia enfermedad y el resto no se enferma. No ocurre así en el resto de los grupos donde Ia incidencia de Ia enfermedad es del 100% (grupos tratados con los principios activos independientes y placebo). El índice clínico medio del grupo tratado con Ia combinación IFN-α / C-Fico es de 0.37 ± 0.47, el de los grupos tratados con los principios activos independientes es 1.37 ± 1.7 para el IFN-α y 1.5 ± 1.6 para Ia C-Fico y el del grupo tratado con el placebo es 1.7 ± 1.4. Se utilizó un total de 8 ratas por grupo y las comparaciones se realizaron según Ia prueba de comparación múltiple de Newman Keuls para p < 0.001.
Tabla 1. Efecto clínico-terapéutico de Ia combinación IFN-α / C-Fico y sus principios activos independientes en ratas inducidas a desarrollar EAE.
Figure imgf000051_0001
Como puede apreciarse en Ia Tabla 2, los resultados del estudio por anatomía patológica de los encéfalos y médulas de los animales de los diferentes grupos demuestra que aún existiendo Ia misma situación en términos de astrocitos reactivos, el número y tamaño de los infiltrados inflamatorios perivasculares es menor en el grupo tratado terapéuticamente con Ia compuesto farmacéutico que en el que recibe placebo (p = 0.028 T test no pareado)
Tabla 2. Efecto de Ia combinación IFN-α / C-Fico y sus principios activos independientes sobre los infiltrados inflamatorios perivasculares en el cerebro y médula de ratas inducidas a desarrollar EAE.
Figure imgf000051_0002
Este experimento demuestra que Ia combinación IFN-α / C-Fico protege a los animales de desarrollar Ia enfermedad en su forma clínica más severa. Ejemplo 2: Efecto terapéutico de Ia combinación IFN-α / C-Fico utilizando diferentes vías de administración.
Para evaluar el efecto de la combinación IFN-α / C-Fico utilizando diferentes vías de administración de los componentes de Ia combinación, ratas Lewis femeninas, 13Og de peso corporal promedio, fueron inmunizadas por vía subcutánea con 5mg de homogenado de médula espinal de curiel en PBS (50%) y adyuvante completo de Freund (50%), en los días 0 y 6. Diez días posteriores a Ia primera inmunización se comenzó el esquema terapéutico de Ia siguiente forma: grupo I: combinación IFN-α / C-Fico (200 ng / kg/ día - 7400 μg / kg / día) intraperitoneal, grupo II: combinación IFN-α / C-Fico donde el IFN- α se administra a (200 ng/kg/día) ¡ntraperitonealmente y Ia C-Fico a razón de 7400 μg /kg/día por vía oral a través de intubación gástrica y grupo III: placebo. Este esquema terapéutico se siguió por espacio de 10 días. Las mediciones clínicas se realizaron como se explica en el ejemplo anterior.
Los resultados se reflejan en Ia Tabla 3, Ia combinación IFN-α / C-Fico ya sea por Ia vía de administración intraperitoneal o por las vías intraperitoneal/oral respectivamente, protege a los animales experimentalmente inducidos a desarrollar EAE. En ambos casos sólo el 40% de los animales desarrolló Ia enfermedad respecto al grupo placebo donde se enfermó el 100% de los animales. El índice clínico medio del grupo tratado con Ia combinación IFN-α / C-Fico intraperitoneal es de 0.37 ± 0.17, el del grupo tratado con Ia combinación IFN-α / C-Fico via oral es 0.35 ± 0.11 y el del grupo tratado con el placebo es 1.7 + 1.4. Se usaron un total de 8 ratas por grupo. La comparación estadística entre los grupos fue p<0.001. Se usó el "test" de comparación múltiple de Newman Keuls.
Tabla 3. Efecto clínico-terapéutico de Ia combinación IFN-α / C-Fico por las diferentes vías de administración en ratas inducidas a desarrollar EAE. SZ
Figure imgf000053_0001
Ejemplo 3: Evaluación del efecto inductor de células T reguladoras naturales y adaptativas por Ia combinación IFN-α / C-Fico y sus principios activos independientes en células mononucleares de pacientes con Esclerosis Múltiple.
Para evaluar el efecto inductor de cTr de Ia combinación IFN-α / C-Fico, así como de sus principios activos independientes en pacientes con EM, se extrajo 20 mi de sangre periférica a 10 pacientes con EM definida clínicamente como de recaída-remisión (EMRR) así como por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) y 10 controles (individuos aparentemente sanos), se aislaron las células mononucleares por gradiente de Ficoll (Serotec-Biochem, Berlín, Germany) y se dividieron en 4 grupos experimentales de 3x106 células/grupo en medio RPMI 1640, los grupos fueron tratados como se describe a continuación: A) Células solas, B) Células + 5 μM IFN-α2b, C) Células + 20 μM C-Fico, D) Células + 5 μM IFN-α2b / 20 μM C-Fico durante 4 horas a 37 grados centígrados y 5% CO2. Al cabo de ese tiempo, se lavaron las células y se procedió a Ia extracción de ARN total mediante el método del Tri-reagent (Chomczynski P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. (1993) BioTechniques, 15, 532- 537). Posteriormente se procedió a Ia realización de Ia Reverso Transcripción- Reacción en cadena de Ia polimerasa (RT-PCR) (Kit RT-PCR core Perkin Elmer) partiendo de 1 μg de ARN total/variable experimental. La reacción de RT se realizó en un volumen total de 20 μl que fueron posteriormente divididos en 2 reacciones de PCR de 10 μl cada una. Se utilizaron oligonucleótidos como cebadores para Ia amplificación de marcadores de cTr naturales y cTr adaptativas. Los oligonucleótidos utilizados fueron diseñados usando como referencia las secuencias de Ia Base de Datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI), los mismos se exponen a continuación:
CD25: Oligo 5J-Secuencia de 20 pares de bases (pb) de Ia posición 618 a Ia 637. Oligo 3'-Secuencia de 20 pb de Ia posición 1053 a Ia 1072, amplifican una banda de 454pb de Ia secuencia con número de acceso NM_000417. Foxp3: Oligo 5'-Secuencia de 20 pb de Ia posición 482 a Ia 501. Oligo 3'- Secuencia de 20 pb de Ia posición 762 a Ia 781 , amplifican banda de 299 pb de Ia secuencia con número de acceso NM_014009.
IL-10: Oligo 5'-Secuencia de 20 pb de Ia posición 358 a Ia 377. Oligo 3'- Secuencia de 22 pb de Ia posición 687 a Ia 709, amplifican banda de 351 pb de Ia secuencia con número de acceso NM_000572. TGF-β: Oligo 5'-Secuencia de 19 pb de Ia posición 1209 a Ia 1227. Oligo 3'- Secuencia de 19 pb de Ia posición 1564 a Ia 1582, amplifican banda de 373 pb de Ia secuencia con número de acceso NM__000660.
GAPDH: Oligo 5'-Secuencia de 18 pb de Ia posición 386 a Ia 403. Oligo 3'- Secuencia de 20 pb de Ia posición 561 a Ia 580, amplifican banda de 164 pb de Ia secuencia con número de acceso NM_002046.
Se usó el GAPDH como gen de expresión constitutiva contra el cual se normalizaron los valores relativos obtenidos por aplicación del software Molecular Analysis a Ia densitometría de los geles de agarosa 2% donde se corrieron los productos de PCR.
Los resultados están expresados como Ia media o mediana (según Ia distribución de Ia variable) de los valores relativos de ARN normalizados con el GAPDH, se compararon las medias o medianas y las 3 variantes celulares con tratamiento respecto al control de células solas y se calculó el valor de p asociado al estadígrafo en los pacientes y controles. Como se muestra en Ia figura 1A, B, C y D, existe un efecto inductor de cTr que se manifiesta por el aumento de sus marcadores cuando las células son tratadas tanto con los principios activos de forma independiente como con Ia combinación, demostrándose una diferencia estadísticamente significativa con un valor de p=0.023 (t pareada) para CD25 (A), p=0.Q37 (t pareada) para Foxp3 (B), p=0.015 (t pareada) para IL-10 (C) y p=0.025 (Wilcoxon) para TGF-β (D) en el tratamiento con Ia combinación IFN-α / C-Fico, Io que pone en evidencia un efecto sinérgico de Ia combinación IFN-α / C-Fico en cuanto a Ia inducción de cTr tanto para los pacientes como para los controles.
E! tratamiento de las células con Ia combinación IFN-α / C-F¡co además de resultar en un aumento estadísticamente significativo de los genes CD25 y Foxp3, mostró una correlación lineal positiva estadísticamente significativa con un valor de p = 0.022 para Ia relación CD25 / Foxp3, Io que indica que son células T reguladoras y no células T activadas (ver figura 2).
La inducción de células CD4+ CD25+ también se demostró por Citometría de Flujo (FACS) en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con EM-RR y controles. Para Ia realización de estos experimentos se incubaron 105 células/pozo por duplicado por variante experimental en placas de cultivo de 96 pozos (Costar). Las variantes experimentales incluían: A) Células solas, B) Células + 5 μM IFN-α2b, C) Células + 20 μM C-Fico, D) Células + 5 μM IFN- α2b / 20 μM C-Fico, el tratamiento en cada variante experimental tuvo una duración de 72 horas a 37 grados centígrados y 5 % CO2. Al cabo de ese tiempo se lavaron las células y se incubaron con los anticuerpos antiCD4PE (Serotec) y ant¡CD25Cy5 (Serotec) y posteriormente se realizaron las lecturas al FACS.
Los resultados muestran un efecto inductor de células CD4+ CD25+ y CD4+ CD25hιgh, por los componentes independientes y aún mayor por Ia combinación IFN-α / C-Fico tanto en los pacientes como en los controles (los resultados presentados en nuestra invención son representativos de 3 pacientes y 3 controles). El efecto inductor de Ia combinación lFN-α / C-Fico alcanzó los valores máximos biológicamente posibles, (ver figuras 3A y 3B).
Ejemplo 4: Evaluación del efecto inductor de células T reguladoras naturales y adaptativas de Ia combinación IFN-α / C-Fico y sus principios activos independientes en células mononucleares de pacientes con Artritis Reumatoide. Para ia evaluación del efecto sobre los genes marcadores de cTr se procedió como explicamos en el epígrafe anterior solo que se incluyeron 6 pacientes y 6 controles.
Los resultados se expresan como ya se explicó en el epígrafe RT-PCR. Como se muestra en Ia figura 4, existe un efecto inductor de cTr manifestado por el aumento de sus marcadores cuando las células con tratadas tanto con los principios activos de forma independiente como con Ia combinación, demostrándose en todos los casos un efecto inductor, que siempre fue estadísticamente significativo con un valor de p = 0.016 (t pareada) para CD25 (A), p = 0.029 (t pareada) para Foxp3 (B), p = 0.034 (t pareada) para IL-10 (C) y p = 0.028 (Wilcoxon) para TGF-β (D) en el tratamiento con Ia combinación IFN- α / C-Fico. Aunque en las células tratadas con los principios activos independientes también se evidenció un efecto inductor de cTr, Ia diferencia no fue estadísticamente significativa para ninguno de los genes evaluados, sin embargo, un efecto sinérgico de Ia combinación IFN-α / C-Fico siempre fue demostrado tanto para los pacientes como para los controles.
Ejemplo 5: Evaluación del efecto inductor de células T reguladoras naturales y adaptativas de Ia combinación IFN-α / C-Fico y sus principios activos independientes en células mononucleares de pacientes con Asma bronquial.
Las variantes experimentales evaluadas fueron las explicadas anteriormente al igual que el procedimiento de Ia técnica del RT-PCR y el procesamiento de los datos. Se incluyeron también 6 pacientes y 6 controles.
Los resultados muestran igualmente un efecto inductor de cTr naturales e inducidas para los pacientes y los controles que es estadísticamente significativo para el tratamiento de las células con Ia combinación IFN-α / C- Fico con un valor de p = 0.012 (t pareada) para CD25, p = 0.009 (t pareada) para Foxp3, p = 0.037 (t pareada) para IL-10 y p = 0.021 (Wilcoxon) para TGF- β (ver figura 5). Ejemplo 6: Evaluación del efecto antitumoral de Ia combinación IFN-α / C- Fico y sus principios activos independientes en líneas celulares tumorales.
La actividad antitumoral de Ia combinación IFN-α / C-Fico, así como de sus componentes de manera independiente se demostró a través de Ia evaluación de Ia actividad antiproliferativa, citotóxica e inductora de apoptosis de células tumorales. Para Ia evaluación de Ia actividad antiproliferativa y citotóxica de Ia combinación lFN-α / C-Fico y de sus principios activos independientes se analizaron "in vitro" varias líneas celulares tumorales humanas: HeLa (Carcinoma cervical humano), HepG2 (Hepatocarcinoma humano), A375 (Melanoma humano), HL60 (Leucemia promielocítica humana), K562 (Eritroleucemia humana), PBMC (Células mononucleares de sangre periférica). Las células se cultivaron en placas de 96 pozos (Costar), un total de 2000 células/pozo para las líneas celulares tumorales y 20 000 células/pozo para las PBMC. La inhibición de Ia proliferación celular fue evaluada por el ensayo de 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) como fue descrito por Mosmann y colaboradores (Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth. and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. (1983) J Immunol Methods 65: 55-63), con algunas modificaciones. Cada línea celular evaluada fue cultivada a Ia cantidad total de células referida anteriormente, en el medio de cultivo establecido para el crecimiento de cada línea, se añadieron 100μl/pozo y se incubaron por 24 horas a 37 grados centígrados 5% de CO2, al cabo de este tiempo, el medio de cultivo fue remplazado por medio que contenía los diferentes tratamientos por duplicado: A) Células solas, B) Células + 5 μM IFN-α2b, C) Células + 20 μM C-Fico, D) Células + 5 μM IFN-α2b / 20 μM C-Fico. Las células tratadas se incubaron por 48 horas adicionales en las mismas condiciones. Posteriormente, se adicionó MTT y sus productos solubles se leyeron a 540nm en un lector de placas (Multiscan, Titertek).
Los resultados se muestran en Ia Tabla 4, fueron expresados como % inhibición de Ia proliferación celular, respecto al control de células solas. Se observó inhibición de Ia proliferación celular para todas las líneas celulares tumorales y en menor medida para las PBMC. Además, se detectó un efecto sinérgico de Ia combinación IFN-α / C-Fico en Ia inhibición de Ia proliferación celular respecto a los principios activos independientes. Este efecto fue mayor para las líneas celulares HeLa y A375.
En Ia figura 6 se muestra Ia dosis-dependencia del efecto de Ia combinación IFN-α / C-Fico sobre Ia inhibición de Ia proliferación en Ia línea de células HeLa.
Tabla 4. Evaluación de Ia actividad antiprolϊferativa de Ia combinación IFN- α / C-Fico y sus principios activos independientes en líneas celulares tumorales.
Figure imgf000058_0001
La actividad inductora de apoptosis de Ia combinación IFN-α / C-Fico y sus principios activos independientes también se evaluó a través de su efecto sobre Ia expresión de los genes de Ia COX-2 y Bcl-2 por RT-PCR y de Ia expresión de Ia proteína citocromo-c por Western-Blot.
Para Ia realización del RT-PCR se utilizó un Kit Perkin Elmer, en todos los casos se comenzó con 1 μg de ARN total/variable experimental extraído de Ia línea celular K562. La reacción de RT se realizó en un volumen total de 20 μl que fueron posteriormente divididos en 2 reacciones de PCR de 10 μl cada una. En todos los casos se usó el GAPDH como gen de expresión constitutiva contra el cual se normalizaron los valores relativos obtenidos por aplicación del software Molecular Analysis a Ia densitometría de los geles de agarosa donde se corrieron los productos de PCR.
Se evaluó el efecto de Ia combinación IFN-α/C-Fico sobre Ia expresión de los genes de COX-2 y Bcl-2, para Io cual fueron incubadas 105células/variable experimental A) Células solas, B) Células + 5 μM IFN-α2b, C) Células + 20 μM C-Fico, D) Células + 5 μM IFN-α2b / 20 μM C-Fico en medio RPMI 1640/10% de suero fetal bovino descomplementado durante 8 horas. Los resultados muestran un efecto inhibitorio de los principios activos independientes así como un efecto sinérgico inhibitorio de Ia combinación IFN-α / C-Fico estadísticamente significativo con un valor de p = 0.011 (ANOVA Células solas vs Combinación IFN-α / C-Fico) sobre Ia expresión del gen COX- 2 y p = 0.009 (ANOVA Células solas vs Combinación IFN-α / C-Fico) para el gen Bcl-2, conocidas moléculas anti-apoptóticas. (ver figura 7A). Además, se demostró un efecto tiempo-dependiente de Ia combinación IFN- α/C-Fico sobre Ia inhibición de los genes COX-2 y Bcl-2 en Ia línea celular K562. (ver figura 7B).
Una de las vías para Ia inducción de apoptosis involucra Ia unión de Fas a FasL. Fas puede ser regulado positivamente por IFN-α, (Gordon M, Marley SB, LewisJL, et al. Treatment with interferon-alpha preferentially reduces the capacity for amplification of granulocyte-mecrophage progenitors (CFU-GM) from patients with chronic myeloid leukaemia but spares normal CFU-GM. (1998) J Clin Invest 102:710-715) este evento promueve Ia apoptosis mediada por Fas (Selleri CMJ, Pane F, Luciano L, et al. Fas-mediated modulation of bcr/abl in chronic myelogenous leukaemia results in differential effects on apoptosis (1998) Blood 92: 981-989), en nuestra invención se evaluó si Ia combinación IFN-α / C-Fico tenía un efecto regulador positivo de Fas que el IFN-α solo. Se realizaron las variantes experimentales que se explican en el ejemplo anterior, 105células/vaπante experimental de Ia línea celular K562 se incubaron durante 4 horas con los diferentes tratamientos y se midió Ia expresión a nivel de Fas por RT-PCR como se ha explicado en epígrafes anteriores. Los resultados se muestran en Ia figura 8 donde se observa un efecto estimulador por IFN-α estadísticamente significativo del gen Fas con un valor de p=0.042 (ANOVA Células solas vs IFN-α). C-Fico también reguló positivamente Fas, solo que Ia diferencia no tuvo significación estadística y se observó un efecto sinérgico regulador positivo de Fas por Ia combinación IFN-α / C-Fico en esta línea celular con un valor de p=0.009 (ANOVA Células solas vs combinación IFN-α/C-Fico). Para Ia evaluación del efecto de Ia combinación IFN-α / C-Fico sobre Ia expresión de citocromo-c a nivel de proteína se realizó un Western blot (Chandra J, et al. Proteasoma inhibitors induce apoptosis in glucocorticoid- resistant chronic iymphocytic leucemia lymphocytes. (1998) Blood 92: 4220). 5 μg de proteínas/variable experimental, provenientes de células K562 tratadas como se explicó anteriormente por un tiempo de incubación de 24 horas, fueron analizadas por electroforesis PAGE-SDS en un gel de 15% de acriiamida, después las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa, Ia proteína específica se evidenció con el uso de un anticuerpo monoclonal murino anti-citocromo-c.
Los resultados se muestran en Ia figura 9 donde se observa que Ia combinación IFN-α/C-Fico tuvo un efecto inductor sinérgico estadísticamente , significativo ANOVA (Células solas vs Combinación IFN-α/C-Fico) p=0.006 sobre Ia expresión de citocromo-c, pudiendo ser este un mediador del efecto apoptótico inducido por Ia combinación IFN-α/C-Fico en las células K562.
Las proteínas p53 y p21 son necesarias para mantener el arresto del ciclo celular en fase G2/M y Ia apoptosis seguida al daño del ADN. Para detectar Ia expresión de las proteínas p53 y p21 , se usó un ELISA (Roche Molecular Biochemical, Germany) para p53 y un ELISA (Calbiochem, Cambridge, MA, USA) para p21. Se trataron las células con Ia combinación 30nglFN-α2b/50μMC-Fico o los componentes independientes a las concentraciones referidas anteriormente para los experimentos que se muestran en Ia figura 7A y durante 6, 12, 24 y 48 horas para los experimentos que se muestran en Ia figura 7B. Se añadieron muestras con Ia misma cantidad de proteína conjuntamente al anticuerpo específico biotinilado en placas de 96 pozos las cuales estaban recubiertas con anticuerpos monoclonales anti-p53 o anti-p21. Se incubaron 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente se añadió el conjugado estreptavidina-peroxidasa. Se midió Ia absorbancia a 450nm y las concentraciones se determinaron por extrapolación a curvas standard de concentraciones conocidas de ambas proteínas.
En nuestra invención se muestra un efecto sinérgico de Ia combinación IFN-α / C-Fico respecto a sus componentes independientes estadísticamente significativo p=0.026 para Ia inducción de Ia proteína p53 y p=0.041 (ANOVA Células solas vs Combinación IFN-α/C-Fico) para los niveles de expresión de Ia proteína p21 detectadas por ELISA en Ia línea de hepatocarcinoma humano HepG2 (ver figura 10).
Los niveles de Ia proteína p53 en las células tratadas con Ia combinación IFN-α
/ C-Fico (figura 11A) fueron 4 veces superior a las 6 horas de tratamiento respecto a las células sin tratar y se mantuvieron elevados hasta las 12 horas de tratamiento con Ia combinación. Estos resultados pueden sugerir que Ia elevación de Ia expresión de Ia proteína p53 puede jugar un papel importante en Ia apoptosis de las células HepG2.
La inducción de apoptosis ha sido asociada con Ia regulación negativa de genes blancos que se encuentran por debajo en Ia cascada de señalización que involucra p53 como es el caso del gen que codifica para Ia proteína p21. En nuestra invención se demostró un efecto dependiente del tiempo de Ia combinación IFN-α / C-Fico sobre Ia regulación positiva de Ia expresión de Ia proteína p21 , dicho incremento se produjo a las 12 horas de tratamiento de las células con Ia combinación IFN-α / C-Fico (ver figura 11 B). Las células HepG2 tratadas con Ia combinación por 12 horas incrementaron 4 veces Ia expresión de Ia proteína p21.
El pico de incremento de Ia expresión de p53 (6 horas) ocurrió más tempranamente qu el pico de expresión de Ia proteína p21 (12 horas), Io que sugiere un posible papel de Ia p53 actuando por encima de p21 en el mecanismo de transducción de Ia señal de apoptosis inducida por el tratamiento de las células con Ia combinación IFN-α / C-Fico.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto farmacéutico caracterizado porque contiene una proteína de Ia familia de los interferones conjuntamente con un bilipigmento natural, útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, alérgicas y el cáncer.
2. Compuesto farmacéutico de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizado porque el interferón es IFN-α2b obtenido de forma recombinante o modificado por pegilación o fusión a otras proteínas.
3. Compuesto farmacéutico de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el bilipigmento natural es Ia C-Ficocianina.
4. Compuesto farmacéutico de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 3 caracterizado porque es un preparado para ser utilizado por via parenteral u oral.
5. Compuesto farmacéutico de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 3, caracterizado porque sus componentes activos se pueden aplicar por separado en un mismo individuo como un método de tratamiento o como una combinación farmacéutica.
6. Combinación farmacéutica de acuerdo con Ia reivindicación 5 caracterizado porque ambos componentes de Ia formulación se usan por diferentes vías en un mismo individuo como parte de un mismo método de tratamiento.
7. Combinación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque el IFN-α2b se usa por vía parenteral y Ia C- Ficocianina por vía oral.
8. Uso del compuesto o combinación farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 7, donde estos pueden administrarse por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea, oral, nasal e intratecal.
9. Uso del compuesto farmacéutico de acuerdo a las reivindicaciones precedentes, donde Ia enfermedad autoinmune es Ia esclerosis múltiple, Ia artritis reumatoide u otra de este tipo que curse con disminución del número o funcionalidad de células T reguladoras naturales y/o adaptativas.
10. Uso del compuesto farmacéutico de acuerdo a las reivindicaciones precedentes, para Ia prevención de las crisis en las formas recidivantes de estas enfermedades.
11. Uso del compuesto farmacéutico de acuerdo a las reivindicaciones precedentes, donde Ia enfermedad alérgica es asma bronquial u otra de este tipo que curse con disminución del número o funcionalidad de células T reguladoras naturales y/o adaptativas.
12. Uso del compuesto farmacéutico de acuerdo a las reivindicaciones precedentes, donde por el efecto sinérgico de sus componentes activos en cuanto a las propiedades antiproliferativas, citotóxicas y apoptóticas de células tumorales, es racional su uso en neoplasias de diverso origen.
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