KR20080066060A - 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 암의 치료를 위한인터페론-알파 및 ｃ-피코시아닌 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 및 암 치료용 약학적 제형을 수득하기 위한 인터페론 알파 및 C-피코시아닌(IFNα/C-피코)의 조합에 관한 것이다. 본 발명에서 증명된 조절 T 세포에 관련된 항-염증, 면역조절체, 항산화, 항-바이러스, 항-증식 및 항-종양 효과는 이러한 질환에서 IFNα/C-피코 조합의 용도에 관한 것이다.

자가면역 질환, 알레르기, 인터페론 알파, C-피코시아닌

Description

자가면역 질환, 알레르기 질환 및 암의 치료를 위한 인터페론-알파 및 Ｃ-피코시아닌{INTERFERON-ALPHA AND C-PHYCOCYANIN FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES, ALLERGIC DISEASES AND CANCER}

본 발명은 생물 과학, 생명공학 및 의학 과학, 특히 신경학, 종양학 및 내과학, 및 일반적으로 자가면역 질환, 알레르기 및 암의 치료에서 천연 산물의 유효성분으로서 존재하는 알려진 면역조절 약물의 조합 치료의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 항-염증성, 면역조절성, 항-산화성, 항-바이러스성, 항-증식성 및 항-종양성 효과 및 특히 처음으로 본 발명에 증명된 조절 T 세포 유도 효과를 갖는 약학적 화합물을 수득하는 것을 기초로 한다. 재발하는 임상형태에서 재발 또는 발생 수를 감소시키거나 단상성의 임상 형태에서 진행을 방해함에 의해 다발성 경화증(MS), 및 류마티스 관절염(RA)와 같은 자가면역 질환(AD) 및 기관지 천식(BA)과 같은 알레르기 질환(ALD)에서 유용한 효과를 가지며, 암(CA)에서는 종양 세포의 성장 및 증식을 중단시켜 종양의 진행을 피하도록 하여 유용한 효과를 갖는다.

역학적 연구는 적어도 30년간 선진국에서 ALD 및 AD의 증가에서 강력한 증거를 제공하였다. 이 두 유형의 질환의 발병률은 증가되었다: ALD 및 MS(Rosati G, et al. Incidence of Multiple sclerosis in the town of Sassari, Sardinia, 1965 to 1985: evidence for increasing occurrence of the disease. (1988) Neurology 38: 384-388; Poser S, et at. Increasing incidence of MS in South Lower Saxony, Germany. (1989) Neuroepidemiology 8: 207-213)를 나타내는 천식(Woolcock AJ, et al. Evidence for the increase in asthma worldwide. (1997) CIBA Found Symp 206: 122-134), 비염(Upton MN, et al. Intergenerational 20 years trends in the prevalence of asthma and hay fever in adults: The Midspan family study surveys of parents and offspring (2000) BMJ 321: 88-92) 및 아토피 피부염Williams HC. Is the prevalence of atopic dermatitis increasing?(1992) Clin Exp Dermatol 17: 385-391), 대표적인 AD로서 특히 어린이에서의(EURODIAB ACE study group. Variation and trends in incidence of childhood diabetes in Europe. (2000) Lancet 355: 873-876) 인슐린-의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)(TID), 및 크론병(Swarbrick ET, et al. A critical review of epidemiological studies in inflammatory bowel disease. (2001) Scand J Gastroenterol 36: 560a).

동시에, 항생제, 백신의 사용 결과로서 또는 좀더 간단하게는 공중위생 및 사회경제적 조건의 발전으로 인해 선진국에서 많은 감염성 질환들의 발병률이 명백히 감소되었다.

AD 및 ALD의 증가에 대한 설명은 기본적으로 이들의 병인에 관련된 유전적 및 환경적 인자에 관한 것이다.

유전적 인자에 대해서는, 예를 들어, 일본에서는 유년기 TID에 대한 민감성 을 증가시키는 대립유전자 DR3 및 DR4-DQB1*0302의 낮은 빈도를 나타낸다. 그러므로 이러한 질병의 발병률은 낮으며 TID의 발병률은 (이웃 지역에 비해) 사르디니아섬 주민뿐만 아니라 대륙의 이탈리아로 이주한 사르디니아섬 주민의 직계 후손에게서도 높다(Muntoni S, et at. Incidence of insulin-dependent diabetes mellitus among Sardinian-heritage children born in Lazio region, Italy. (1997) Lancet 349: 160-2).

환경적 인자는 선진국에서 AD 및 ALD의 빠른 증가로 설명할 수 있다. 한 나라에서 다른 나라로 이주한 인구에서 MS, TID 및 BA의 발병률에 대한 정보가 있는데, 이러한 질환의 발병률은 차이가 있다. 영국으로 이주한 파키스탄 태생의 아동에서의 TID 발생률이 영국 아동(11,7/100 000)에서 나타난 것과 동일하거나 파키스탄에서의 TID 발병률(1/100 000)보다 10배 높다(Bodansky HJ, et al. Evidence for an environmental effect in the aetiology of insulin dependent diabetes in a transmigratory population. (1992) BMJ 304: 1020-2). 이스라엘에서, MS는 유럽으로부터의 이주자에서 일반적이며 아프리카 또는 아시아로부터의 이주자에서는 드물며, 이와는 반대로 유럽, 아시아 또는 아프리카 태생의 이스라엘인에서 MS의 유행은 유럽 이주민만큼 높다(Leibowitz OR, et al. The changing frequency of multiple sclerosis in Israel. (1973) Arch Neurol 29: 107-10). 또한 전신성 홍반성 루푸스(SLE)의 빈도가 미국 흑인에서 보다 동부아프리카인에게서 극적으로 낮으며, 두 집단은 동일 인종 그룹으로부터 유래하였지만 다른 환경에서 노출되었음이 주목할만하다(Symmons DPM. Frequency of lupus in people of African origin (1995) Lupus 4: 176-8).

AD 및 ALD에 민감한 유전적 및 환경적 인자의 영향력은 아직까지 정의되고 있다.

중요한 정보는 일란성 쌍둥이에서 이러한 질환의 발병률로부터 나왔다. 비율은 MS에서 25%(Murnford CJ, et al. The British Isles survey of multiple sclerosis in twins. (1994) Neurology 44: 11-5), TID에서 40%(Bach JF. Insulin-dependent diabetes mellitus as an autoimmune disease. (1994) Endocr Rev 15: 516-42) 및 천식에서 75%(Skadhauge LR, et al. Genetic and environmental influence on asthma: to population-based study of 11,688 Danish twin pairs. (1999). Eur Respir J 13. 8-14)이다. 쌍둥이 둘 다 병에 잘 걸리는 유전자를 가지나 병에 걸리지 않은 쌍둥이의 분석 쌍에 포함되는 것이 불가능한 조건을 갖는 질환의 침투에 직접적으로 관련된 일치인 것으로 추정될 수 있다. 중요한 돌파구는 MS(Oksenberg JR, et al. MS: genomic rewards. (2001) J Neuroimmunol 113: 171-84), TID (Todd JA. Genetics of type I diabetes. (1997) Pathol (Paris) 45: 219-27) and asthma (Cookson WOC. Asthma genetics. (2002) Chest 121: Suppl: 7S-13S)에 대하여 인간의 병에 걸리기 쉬운 유전자를 포함하는 염색체 영역의 확인이 최근에 의해 이루어졌지만, AD에서 HLA 유전자를 제외하고는 질환에 관련된 유전자에서는 매우 적은 정보만이 얻어졌다. 중대한 요소는 환경적 인자로부터 우리를 감싸거나 보호하는 감수성을 유전자/유전자들이 직접적으로 조절함을 확인하기 위한 것이다. 이러한 예는 IL-10 및 TGF-β를 코드하는 유전자에서 다형성만이 발 견되는 아토피성 질환을 갖는 환자에게서 발견되었으며(Hobbs K, et al. Interleukin-10 and transforming growth factor-beta promote polymorphisms in allergy and asthma. (1998) Am J Respir Crit Care Med 158: 1958-62), 상기 두 사이토카인은 알레르기성 질환에서 감염의 보호 효과에 기여할 수 있다.

대부분의 AD의 발생은 Th1 세포에 의해 생성된 IL-2 및 IFN-γ사이토카인에 의존하며, 알레르기성 질환의 발생은 Th2 세포로부터 생성된 IL-4 및 IL-5를 요구한다. The reciprocal feedback of Th1 cells for Th2 사이토카인에 대한 Th1 세포 및 Th1 사이토카인에 대한 Th2 세포의 상호간 피드백은 이러한 사이토카인이 AD 또는 ALD에 대항하는 감염에 의해 매개되는 보호에 관련될 수 있다는 사실을 나타낸다. 초기 보고서 (The EURODIAB Substudy 2 study group. Decreased prevalence of atopic diseases in children with diabetes. (2000) J Pediatr 137: 470-4)와는 반대로, 개별 환자들에서 AD 및 ALD 사이의 상호관계가 있다: 아토피 질환의 빈도는 당뇨병 및 류마티스 관절염을 갖는 환자에게서 증가한다(Kero J, et at. TH1 and TH2 disease coexist? Evaluation of asthma incidence in children with coeliac disease, type I diabetes, or rheumatoid arthritis: to register study. (2001) J Allergy Clin Immunol 108: 781-3; Simson CR, et al. Coincidence of immune-mediated diseases driven by Th1 and Th2 subsets suggest to common aetiology: to population -based study using computerized general practice dates. (2002) Clin Exp Allergy 32: 37-42). 이러한 발견은 자가면역 및 알레르기 사이의 공통 매카니즘의 개념을 뒷받침한다.

중요하게 주목할만한 것은 조절 T 세포(rTc)라고 명명되는 IL-2 수용체(CD25)의 알파 사슬로부터 발현된 CD4+ T 세포인데 이는 건강한 마우스에서의 이러한 세포의 결핍이 다중자가면역 증후군을 유도하기 때문이다(Assano M, et al. Autoimmune disease as a consequence of developmental abnormality of to T cell subpopulation. (1996) J Exp Med 184: 387-96). 이러한 발견은 AD의 생성을 피하기 위해 이러한 세포성 부속조의 수준 및 적절한 기능을 유지하는 것이 중요함을 뒷받침한다.

이러한 보호성 자가면역 세포의 하기에 자세히 설명되는 표현형 특성화는 동물 및 인간 모델에서 자가 내성의 결정적인 매개체로서 T 조절 세포의 존재시에 의심할 필요 없이 제공된다.

조절 성질을 갖는 세포를 2가지 유형으로 분류할 수 있다: 흉선에 의해 생성되는 천연 rTc, Th3', 'Tr1' 또는 '적응성 조절 세포'라고 명명되는 말초에서의 특이 조건하에서 알레르기성 자극에 의해 생성되는 유도 rTc (Bluestone JA, et al. Natural versus adaptive regulatory T cells. (2003) Nat Rev Immunol 3: 253-257).

유도 rTc의 억제 메커니즘은 IL-10 및 TGF-β와 같은 사이토카인의 분비를 통하는 것이 기본적이나(Groux H. Type 1 T-regulatory cells: their role in the control of immune responses. (2003) Transplantation 75: 8S-12S), 천연 rTc은 우선적으로 세포를 세포 접촉에 사용한다.

Sakaguchi 등의 문헌에서 처음으로 rTc 마커로서 CD5 분자를 확인하였으 며(Sakaguchi S, et at. Organ-specific autoimmune diseases induced in mice by elimination of T cell subset: I. Evidence for the active participation of T cells in natural self-tolerance; deficit of to T cell subset as to possible causes of autoimmune disease. (1985) J Exp Med 161: 72-87), CD45RB은 다른 rTc 마커로서 확인되었다(Powrie F, et at. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induces or Project from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. (1993) Int Immunol 5. 1461-1471).

현재 사용되는 주요 표면 마커는 CD25이다(Sakaguchi S, et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receiving alpha chains (CD25). Breakdown of to it sails mechanism of self-tolerance you cause various autoimmune diseases. (1995) J Immunol 155: 1151-1164). 마우스에서, 약 5-10%의 CD4+ 세포 및 1%의 CD8+ 세포는 CD5^high 및 CD45RB^low를 발현하며(Itoh M, et al. Thymus and autoimmunity: production of CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells as to key function of the thymus in maintaining immunologic self-tolerance. (1999) J Immunol 162: 5317-5326), 인간에서는 rTc가 6-10%의 CD4+ 세포이다 (Ng WF, et al. Human CD4+CD25+ cells: to naturally occurring population of regulatory T cells (2001) Blood 98: 2736-2744). rTc는 명백한 알레르기성 자극이 없을 때에 고수준의 CD11a (LFA-1), CD44, CD54 (ICAM-1) 및 CD103를 나타낸다(McHugh RS, et at. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals the functional role of the glucocorticoid-induced TNF receptor. (2002) Immunity 16: 311-323). 추가적으로 rTc는 세포 작용 후에 단독으로 발현되는 분자인 CD152 (CTLA-4)를 발현한다(Takahashi T,et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+ regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 (2000) J Exp Med 192: 303-310).

rTc는 인간에게서 고수준의 CCR5케모카인(chemokine) 수용체 및 이들의 상대물(CCR4 및 CCR8)을 발현한다(Bystry RS, et al. B cells and professional APCs recruit regulatory T cells via CCL4. (2001) Nat Immunol 2: 1126-1132). 케모카인 수용체 발현의 이러한 특유의 패턴은 rTc가 염증 부위로 재빨리 공급될 수 있으며 면역 반응을 효과적으로 조절할 수 있음을 제시한다. 많은 그룹이 CD4+CD25+ 세포에서 글루코코르티코이드 유도 종양 괴사 인자 수용체(GITR)의 발현을 보고하였다(McHugh RS, et al. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals to functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. (2002) Immunity 16: 311-323).

rTr 마커가 또한 활성화 세포에서도 발견된다는 사실은 이들ㄹ의 분리 및 억제 세포의 마커로서 CD25의 확인을 방해한다(Shevach EM. CD4+CD25+ suppressor T cells: More questions than answers. (2002) Nat Rev Immunol 2: 389-400).

최근 연구는 rTc가 IL-2 수용체의 고농도의 알파 사슬을 발현하는 CD4+T 세 포에 속하는 CD25^high 에서 풍부함을 보여준다. CD4+CD25^high T 세포는 CD4+ T 세포의 증식 및 사이토카인 분비를 완전히 저해한다. CD4+CD25^high T 세포는 CD45RO 및 HLA-DR의 발현 수준에서 CD4+CD25+ T 세포와는 다르다(Baecher-Allan C, et at. CD4+CD25^high regulatory cells in human peripheral blood. (2001) J Immunol 167: 1245-1253).

마우스 및 인간의 흉선으로부터 유래된 rTc가 기술되었다. 마우스에서, rTc의 부재는 기관-특이 자가면역을 생성한다. 최근에, 번역 인자인 Foxp3가 마우스에서 rTc의 작용에 중요함이 증명되었다. Foxp3의 발현은 CD4+CD25+ T 세포의 전형적인 일이며 이러한 세포들의 억제 활성에 관련이 있음이 보여졌다. 이는 rTc 생성에서의 실패가 AD에 기여할 수 있음을 제안하며 또한 Foxp3가 이러한 질환의 치료에서 치료학적 역할을 함을 제안한다(Walker MR, et al. Induction of Foxp3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25+ T cells. (2003) J Clin Invest 112: 1437-1443).

스커핀(Scurfin) 단백질을 코드하는 Foxp3 번역 인자는 rTc의 약간 더 폐쇄적인 마커일 수 있는 것으로 보여지지만(Brunkow ME, et at. Disruption of to new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. (2001) Nat Genet 27: 68-73), 발현 가능성에도 불구하고 다른 활성 조건 및 다른 세포 집단에서 배재되지 않는다(Morgan ME, et at. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4(+)CD25(+) T regulatory cells in humans. (2005) Hum Immunol. 1:13-20).

유도 rTc의 작용 메커니즘은 TGF-β를 포함한다(Nakamura K, et at. Cell contact-dependent immuno-suppression by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor beta. (2001) J Exp Med 194: 629-44). NK 및 T 세포 특성을 갖는 NK 세포는 이러한 면역조절에 기여할 수 있다(Bendelac A, et al. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function (1997) Annu Rev Imunol 15: 535-62).

IL-10, 유도 rTc에 의해 생성된 Th2 사이토카인, 단핵구 및 마크로파지는 실험 모델에서 AD 및 ALD의 진행을 천천히 저해시킨다(Moore KW, et at. Interleukin-10 and the receptor interleukin-10. (2001) Annu Rev Immunol 19: 683-765). IL-10은 또한 활성화된 에오시노필(eosinophyl)의 생존을 감소시킴에 의해 ALD에서 중요한 역할을 수행한다(Takanashi S, et at. Interleukin-10 inhibits lypopolisaccharide induced survival and cytokine production by human peripheral blood eosinophils (1994) J Exp Med 180: 711-5). 두 그룹의 연구원이 건강한 대조군의 폐에서보다 천식 환자의 폐에서 IL-10의 양이 주목할만큼 낮음을 발견하였다(Lim S, et al. Haplotype associated with low interleukin-10 production in patients with severe asthma. (1998) Lancet 352: 113; Takan ashi S, et al. Interleukin-10 level in sputurn is reduced in bronchial asthma, COPD and in smokers. (1999) Eur Resp J 14: 309-14).

rTc에 의해 생성된 IL-10 및 TGF-β의 두 반응(Th1 및 Th2) 모두를 저해할 수 있어, 이러한 조절의 매개체에 속함을 제안한다.

rTc는 면역 반응의 조절에서 중요한 역할을 하는데, 예를 들어 미생물 또는 항-종양 면역 반응을 제한할 수 있다. rTc의 전략적 조작은 필요할 때 면역 반응을 증가시키거나 감소시기기 위해 실행될 수 있다 (Fehervari Z, et at. To paragon of self-tolerance: CD25+CD4+ regulatory T cells and the control of immune responses (2004) Arthritis Head Ther 6: 19-25).

본 발명에서 증명된 IFN-α/피코시아닌 조합의 rTc의 유도 효과는 rTc의 수 및/또는 기능의 감소를 수반하는 주효 세포 및 rTc가 있는 AD 및 ALD에서의 이의 사용을 정당화한다.

자가면역 질환은 해로운 침투한 미생물을 확인하고 파괴하는 역할을 하는 세포가 자기자신의 조직을 외부물질로서 인식하고 공격하는 면역계(IS)의 기능이상이다. 연구원은 바이러스 또는 박테리아 원인과 같은 대안적인 설명을 제공한다: 인간 헤르페스 바이러스 6, 엡스타인-바 바이러스 및 클라미디아 폐렴 박테리아.

감염성 제제는 일부는 임상학적 대상물을 갖는 상이한 실험적 조건 하에서 AD를 유도할 수 있다. 많은 메커니즘이 표적 기관에서의 염증에 의해 발생하는 분자 유사성 및 자가-항원 면역원성을 포함하는 이러한 발견을 설명하기 위해 고려되었다(Olson JK, et at. Virus-induced autoimmunity: potential role of viruses in initiation, perpetuation, and progression of T-cell mediated autoimmune disease. (2001) viral Immunol 14: 227-250). 역설적으로, 감염성 제제는 또한 자가면역 및 알레르기성 기능이상을 억제할 수 있다.

실험적 자가면역원성 뇌척수염(Experimental autoimmune encephalomyelitis; EAE)은 중추신경계(CNS) 염증이며 다발성 경화증의 동물 모델을 고려할 수 있는 임상학적 및 병리학적 특성을 보이는 탈수초(demyelinating) 질환이다. 많은 증거들이 EAE가 인터페론 감마(IFN-γ) 또는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)와 같은 친염증성 사이토카인의 분비를 수반하는 Th1 질환임을 보여주며 이는 사이토카인에 의해 유도된 산화 스트레스가 EAE 신경병리학에서 중요한 역할을 할 수 있음을 제안한다. 그러나, 질환에서의 발병기전에서 이러한 사이토카인 및 그외의 사이토카인의 각각의 효과는 여전히 알려지지 않았다. 이러한 보고서에서, Mirror C 등의 문헌(Mirror C, et al. Interferon-gamma regulates oxidative stress during experimental autoimmune encephalomyelitis. (2002) Exp Neurol 177:21-31)은 IFN -γ 녹아웃 마우스의 수용체(IFN-감마 R (- / -))를 사용하여 EAE 동안에 IFN-γ의 역할을 분석하였다. 마우스를 랫 미엘린 희소돌기아교세포성(oligodendrocitic) 당단백질(MOG)의 40-55개 펩티드로 면역화시켰다. 산화 스트레스의 수준은 유도성 신타제(syntase) 산화질소(NO), 니트로티로신(nitrotirosine) 및 말론일디알데히드(malonyldealdehyde)에 대한 면역반응성 뿐만 아니라 보호성 조직 항산화 인자의 발현을 통한 분석으로 결정하였다: 메탈레이션(metallotion) I+II (MT-I+II). 이들은 또한 TUNNEL 기술을 사용하여 아폽토시스를 발생하는 여러 세포를 결정한다. 산화 스트레스, MT-I+II 및 EAE에 의한 아폽토시스 세포 죽음의 수준이 모든 마우스(IFN-감마 R (- / -) 및 야생형)에서 상당히 증가하였으나, IFN-감마 R (- / -) 마우스에서 좀더 많이 증가하였다. 이는 IFN-γ가 EAE에 대항하는 보호 역할을 한 다는 가설을 뒷받침한다.

EM은 기본적으로 청소년에게서 나타나는 자가면역 탈수초 질환이다. 쿠바에서 MS 발병률의 대부분의 보존성 수치는 10 / 100 000 주민이다(Hernandez-Valero E, et al. Clinical features of multiple sclerosis in Western Cuba. A comparison with two other regions in the country. (2004) Rev Neurol. May 1-15;38(9):818-23).

이는 질환의 시작에 따라 다양한 비율로 여성에게서 많이 나타난다 (Wingerchuk DM, et al. The clinical course of optic neuromyelitis (Devic's syndrome) (1999) Neurology 53: 1107 - 14). 인종에 있어서는, 백인종에서 좀더 많이 나타난다.

MS는 뇌 및 척수에 발생하는 CNS 질환이다. 이는 다음과 같은 2가지의 기본 특성을 갖는다: 탈수초 및 축삭 손실.

증상, 중증도 및 임상 과정은 플라크의 위치 및 탈수초 범위에 매우 의존적이다. 그러므로 2개의 주요 카테고리에 의해 분류될 수 있다: 재발-완화 및 진행적 만성 형태.

MS는 AD라고 불린다. 이론상으로, 이러한 증상은 자체 조직으로의 공격을 유발하는 유전 또는 환경인자 또는 둘 다에 의해 면역계가 손상되었을 때 발생한다. MS의 겨우, 조직은 수초이다.

유기체는 또한 수초 생성 세포(희소돌기아교세포)의 파괴의 효과를 "없어지게" 하기 위한 조정 사건을 수행한다. 예를 들어, 수초의 손실에도 불구하고 전달 이 계속될 수 있는 신경세포의 수를 증가시키는 전기 하중을 갖는 나트륨 채널의 밀도를 증가가 나타남이 발견되었다: 반대로, 신경은 약간의 수초재생 능력을 유지한다.

다중 감염성 생물이 MS(Johnson RT. Viral Possible causes of multiple sclerosis (1998) In: Viral infections of nervous system 2nd ed. Philadelphia: Lippincott - Raven 248 - 258), HIV-1에 대한 감염(Blanche P, et al. Devic's neuromyelitis optic and HIV-1 infection (2000) J Neurol Neurosurg Psychiatry 68: 795 - 796) 의 발병시 원인성 제제 또는 공-인자로서 제안되었으며, 이들은 이 연구에서 자소성 집단에서의 MS에 관련이 있다. 내재성 레트로바이러스(ERV)는 MS 발병기전에 관련되며 다른 그룹은 MS와 관련된 특정 ERVs를 확인하였다 (Perron H, et al. Molecular identification of to beginner retrovirus repeatedly isolated from patients with multiple sclerosis. (1997) The Collaborative Research Group multiple on Sclerosis. Proc Natl. Acad Sci USA 94: 7583-7588; Christensen T, et al. Reverse transcriptase activity and particle production in B lymphoblastoid cell lines established from lymphocytes of patients with multiple sclerosis. (1999) AIDS Head Hum Retroviruses 15: 285 - 291). 이는 이러한 질환에서 항바이러스 특성을 갖는 약물의 사용을 뒷받침한다.

MS의 원인은 알려지지 않았으나 IFN-γ, IL-2 TNF-α 및 림프독소, 바꾸어 말하면 Th1 세포에 생성에 대해 분열된 한정된 MHC II CD4+ T 세포에 의해 시작되는 AD라는 것이 널리 받아들여지고 있다. 증거는 MS가 Th1 세포(CD4-Th1 모델)에 의해 매개된 AD임을 보여준다(Lassmann H, et al. The CD4-Th1 model for multiple sclerosis: to crucial re-appraisal. (2004) Trend in Immunology 25: 3, 132-137). 이러한 모델에 대하여 실행되는 예언은 다음과 같다: a) CD4+ T 세포는 MS 병변의 림프구 집단에서 우세할 것이다. 다른 집단의 림프구는 보조적 소수 집단일 수 있다. b) Th1 및 TNF-α 및 IFN-γ와 같은 이의 주요 작동체 사이토카인에 의해 분열된 CD4+ T 세포는 MS 병변에서의 발병기전일 것이다. c) Th2에 의해 분열된 CD4+ T 세포는 MS 병변에서 조정성 또는 항-염증성일 것이다. CD4-Th1 모델은 MS의 임상 및 병리학적 특성에서 발견되는 다양성을 설명할 수 있다. d) 과정은 명백하게 자가면역일 것이며 이는 숙주의 CNS가 CD4-Th1-매개 매카니즘에 의한 자가면역 공격 전에 손상되지 않았다는 증거일 것임을 의미한다.

MS의 발병기전에 관하여, 유전적으로 감염되기 쉬운 숙주에서 자체 수초 항원과 교차 반응하는 서열을 포함하는 일반 병원체가 톨-유사 수용체(Toll-like receptors; TLR)를 통한 통해 항원 제시 세포(APC)를 활성화시키고 이는 CNS 자가면역 염증 질환의 유도를 최소한으로 요구한다는 것을 주장하였다. MS 환자의 혈류에서 조절 T 세포의 감소와 같은 근원적인 면역-조절 결함은 자동-반응성 T 세포의 병리학적 활성을 이끈다. 활성화된 수초 반응성 T 세포는 CNS로 이동하여 국소 APC인소신경교세포에 의해 제시되는 항원을 인식한다. Th1 사이토카인이 분비되고 염증 캐스캐이드가 시작된다. 자연적으로 발생하는 메커니즘은 T 세포에 의해 분비되는 Th2 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-13), Th3 (TGF-β) 또는 Tr1 (IL-10)의 유도를 포함하는 자가면역 반응을 조절할 수 있으며, 이들은 CNS로 이동하여 Th1 염증성 자동-반응 T 세포를 음성적으로 조절한다(Hafler DA. Multiple sclerosis (2004) J Clin Inv 113: 788-94).

일반 조건 하에서 혈뇌장벽(BBB)은 혈액 세포 사이의 효과적인 분리를 제공하므로 부정확하게 프로그래밍된 백혈구가 존재할 경우 수초가 혈뇌장벽을 무관하게 만드므로, MS 공격 동안에 BBB의 부적절한 기능이 요구된다.

IS의 일부 세포는 세포외 매트릭스를 용해하는 효소를 생성한다. 대부준의 생물에서 이는 감염 부위로 더 많은 백혈구가 접근하도록 한다; 그러나, 이러한 세포가 CNS 내 모세관에서 화학 물질을 방출할 때, 적어도 특정 개체에서 병변을 생성하는 BBB의 파괴가 존재한다. 백혈구에 의해 방출될 수 있는 화학 물질 중 하나는 세포 "접합체" 사이를 약하게 메탈로프로테나아제 (MMPs)이다. 이들은 방출되었을 때 활성 형태가 아니지만 다른 효소에 의해 활성화된다(Maeda A, et al. Matrix Metalloproteinases in the normal human central nervous system, microglial nodules, Multiple and Sclerosis lesions (1996) J Neuropathol Exp Neurol. 55 (3): 300-309). 그러므로, 이러한 질환에 대한 잠재적 치료의 다른 특성은 MMPs의 저해 및/또는 이들의 저해제의 자극이다.

BBB의 보전에 영향을 미치는 다른 잠재적 메카니즘이 있다. 그러므로, 백혈구가 침입성 미생물을 파괴할 때, 이들은 극단적으로 활성화된 과산화물 및 자유 라디칼을 방출하며 이들의 많은 표적을 파괴할 수 있으나, 이 과정이 BBB에서 일어날 때, BBB의 보전에 대한 하나 또는 그 이상의 공격을 생성할 수 있는 병변을 생성하기 시작한다(Jean Claude Monboisse, et at. Non - enzymatic degradation of acid-soluble calf-skin collagen by superoxide ion: protective effects of flavonoids. (1983) Biochem Pharmacol. 32 (1): 53-58). 그러므로 본 발명에서 증명된 IFN-α/C-피코시아닌 조합의 항산화 특성은 이러한 질환에서의 사용에 관련된 것이다.

MS 플라크는 단백질 및 지질을 절단하여 수초를 파괴하는 것으로 보이는 마크로파지를 다량 포함한다. 이러한 효소들의 저해제는 수초의 파괴를 감소시키거나 조직을 향한 마크로파아지의 이동을 저해할 수 있다. 급성 증상을 치료하기 위해 이러한 질환에서 사용되는 약물의 성분은 항-염증 특성을 기초로 한다 (W. A. Sibley and the Therapeutic Claims Committee of the International Federation Multiple of Sclerosis Societies, Therapeutic Claims in Multiple Sclerosis, 3rd Edition, 1992).

MS의 치료법은 MS의 초기 단계에서 효과가 있는 3가지 유형의 면역조절 치료의 유효성이 증명되어 지난 20년간 알려졌다: 미톡산트론(Mitoxantrone) 및 시클로스포스파미드(Ciclosfosfamide)와 같은 면역억제 약물; 인터페론 베타 및 T 세포 수용체(TCR), 글라티라머 아세테이트(Glatiramer Acetate; GA)에 결합되는 주요 조직적합 복합체(Major Histocompatibility Complex; MHC)에 대한 결합 펩티드.

현재에는, 이러한 질환들에 대하여 FDA 허용 약물은 1993년에 인터페론 베타-1b(베타세론), 1996년에 인터페론 베타-1a(아보넥스) 및 1996년에 코팍손(GA 또는 코폴리머 1)이며 이들은 매우 비싸다.

IFN-β는 재발-완화 MS에서 우수한 효과를 가지나, 진행적 이차 MS로의 전이 를 예방할 수 있는지는 알지 못한다. IFN-β의 작용 메커니즘은 분명하지 않다. 이는 아마도 메탈로프로테나제를 차단함에 의한 IL-10의 유도 및 T 세포의 이동 저해를 포함하는 많은 다른 메커니즘의 교체를 포함한다(Stuve, O., et al. Interferon beta-1b decreases the migration of T lymphocytes in vitro: effects on matrix metalloproteinase-9 (1996) Ann. Neurol. 40:853-863). IL-12 및 IL-23의 공통 p40 사슬을 차단함을 기초로 하는 임상 시도가 현재 시작되었다. 이러한 임상 시도는 또한 Ig CTLA-4과 B7-CD28의 상호작용을 통한 공-자극 시그널의 차단을 포함한다.

GA에 관하여, 대부분의 환자에서 GA의 매일 주입은 Th2 반응에 대한 변화를 나타내는 CD4+ T 세포에 대한 IL-5 and IL-13의 분비를 생성한다(Duda PW, et at. Human and murine CD4 T cell reactivity to complex antigen: recognition of the synthetic random polypeptide glatiramer acetate. (2000) J Immunol165: 7300 7307; Qin, Y, et al. Characterization of T cell lines derived from glatiramer-acetate-treated multiple sclerosis patients. (2000) J Neuroimmunol 108: 201 206; Dabbert, D., et al. Glatiramer acetate (copolymer-1)-specific, human T cell lines: cytokine profile and suppression of T cell lines reactive against myelin basic protein. (2000) Neurosci. Lett 289: 205-208). 게다가, GA에 반응하는 T 세포의 생존은 펩티드의 큰 변화를 갖는 교차-반응에 대한 이의 능력에 의해 측정된, 높은 단계의 변성을 보인다.

현재에는, 이들은 클로날 선별 및 조절 T 세포의 존재에 의해 제시되는 이의 대안적인 우세한 내성의 범례와 대립되는 증거의 설명을 제한하는 통상 지침들을 능가하므로 면역학에서 현재 논의되는 원조 컨셉이 있다.

본 발명에 의해 제공되는 치료학적 옵션은 다른 것 중에서도 세포 집단을 증가시키는 능력을 통해 자가면역에서 중요하다고 여겨지는 작동체/조절체 균형을 복귀시키는 것에 초점을: 천연 rTc CD4+ CD25^high, Foxp3+ 또는 IL-10 또는 TGF-β의 유도된 rTc 생산자.

RA는 큰 장애를 생성하는 다른 자가면역 염증 질환이다. RA에 걸린 환자의 50 내지 90%가 첫 번째 증상 후 10년간 심각한 장애를 갖는 것이 고려된다 (Markenson JA. (1991). Wordwide trends in the socioeconomic impact and long-term prognosis or rheumatoid arthritis. Semin Arthritis Rheum: 21(2), 4-12). 미국에서 RA에 의한 장애 및 치료에 드는 비용은 매해 6.5조 달러 이상이다(Fanci A, et at (Ed) (1998). Harrison's principals of Internal Medicine. (14th ed.) (Chapter 376 p. 2412). New Cork: McGraw Hill; Yelin E. (1996). The cost of rheumatoid arthritis: absolute, incremental, and marginal estimates. J Rheumatol: (suppl 44)23, 47-51).

RA는 세계 성인 인구의 0.5-1% 내에서 가장 일반적인 염증성 관절염이며 장애의 주 요인이다.

RA는 손 및 발의 소관절에 주로 영향을 미치는 다중-관절 대칭성 염증이다. 판누스라고 명명되는 조직성 종괴인 시노븀(sinovium)의 염증에도 불구하고, 이는 국소 관절 구조에 침범하고 파괴한다. RA에서, CD4+ T 세포, B 림프구 및 마크로파지는 시노븀을 침범하며 때때로 배아중심을 갖는 신중한 림프구양 집합체로서 구성된다. 내막층의 이상증식은 섬유아세포 및 마크로파지 유형 활막세포에서의 상당한 증가에 의한 것이다. 국소적으로 발현되는 퇴화된 효소는 메탈로프로테나제, 세린 프로테아제(seric proteases) 및 아그레가나제(aggreganases)를 포함하며 아-세포성 매트릭스를 절단하고 관절구조를 (Firestein GS. Evolving concepts of rheumatoid arthritis (2003) Nature 423:356-61).

RA의 발병기전은 아직 일반적으로 알려지지 않았다; 특히, 관절 구조의 특이 항원에 대한 자가면역성의 역할에 대한 논의가 있다. 질환에서 요구되는 면역성의 항원-특이 활성화의 보급을 이끌어내는 유전성, 감염성 및 신경내분비 인자를 포함하는 다인성 메커니즘에 찬성하는 실험 증거가 있다. HLA-DR4/Dw4의 존재는 감염된 백인 환자의 약 70%에서 증명되었다(Stastny P. Association of the B-cell alloantigen DRw4 with RA. (1978) N Engl J Med 298: 869-71).

발병 메커니즘에 관하여, "에피토프 분배(epitope sharing)"는 관절염유발(arthritogenic) 펩티드 또는 아마도 엑소젠(exogen) 항원을 모방한(분자성 의태) 자가항원에 대한 결합 부위로서 작용할 수 있다. 특정 감염성 제제는 RA를 일으키는 가능한 성분을 가지며 (Feldmann M, et at. Role of cytokines in RA. (1996) Annu Rev Immunol 14: 397-440), 특히 바이러스의 능력으로 생리학적 표현형을 변화시켜 일반 인간 활액 섬유야세포에서 침입 특성을 유도하는 파르보바이러스(Parvovirus) B 19가 증명되었다(Ray NB, et. al. Induction of an invasive phenotype by human parvovirus B19 in normal human synovial fibroblasts. (2001) Arthritis Rheum 44: 1582-6).

다른 중요한 병원체는 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)이다(Ebringer A, et al. Sequence similarity between HLA-DR1 and DR4 subtypes associated with RA and Proteus/Serratia membrane haemolysins. (1992) Ann Rheum Dis 51: 1245-6).

최근에는 질환의 진행에서 선천적인 면역성의 직접적 역할을 강조한다. The natural course of RA의 자연적 과정은 3 단계로 특징지어진다: 유도, 유지 및 조직 파괴. T 세포의 활성화, 미란(erosion) 메커니즘에서의 T 세포의 역할 및 "귀환(homing)" 및 혈관형성과정에 관련된 케모카인의 연구에 관련된 분자에 대한 인식의 전개는 적응성 면역계의 항원-특이 활성화 이론을 지지한다. 그러므로, RA 동안에, 활막염 및 미란의 발병은 선천적 및 적응성 면역계 둘다의 메커니즘을 포함하므로 관절 손상의 최종 유도를 생성한다 (Valenisi G, Barone F, et at. Advances in immunology and rheumatoid arthritis pathogenesis. (2004) rheumatism 56: 9-20).

최근에는, 막 또는 특이 가용성 매개체에 결합되는 분자에서 사용된 생물학적 제제의 발전은 RA의 치료에서 혁명적이었다. TNF-α 저해제의 성공 및 IL-1의 저해제의 다소 적은 성공은 RA의 임상 관리에서 견고하게 수립된 치료를 제공한다. 임상 실험 및 실생활에서 TNF-α 저해제의 사용의 데이터에도 불구하고, 상당한 비율의 환자는 이러한 제제에 반응하지 않으며 이들에 대한 초기 반응이 나타나지 않 아 새로운 치료법을 찾아야 할 필요성이 있다. 지난해에 모노클로날 항체 리툭시맵(Rituximab)을 사용하는 B 세포 고갈은 질환의 증상 및 징조에서 상당히 개선되었음을 보였다. 동시에, 개선 및 수용가능한 독성이 Ig CTLA-4의 사용을 수반하는 T 세포의 공-자극 시그널의 저해를 통해 발견되었다. RA에서의 선택적 IL-6 저해, 중추 친-염증성 사이토카인은 질환, 특히 RA에 관련된 급성 반응 단계에서 임상적인 개선을 이루었다 (Singh R, et al. Emerging biologic therapies in rheumatoid arthritis: cell targets and cytokines. (2005) Curr Opin Rheumatol 17: 274-79).

알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 음식 알레르기, 약물에 의한 알레르기 및 아토피성 알레르기 습진/피부염 증후군 등을 포함하는 알레르기 질환은 면역글로불린 E에 의해 매개되는 공통 장애 그룹이다. 세계의 어느 나라에서의 모든 연령의 사람들이 이러한 질환에 걸려있다. 알레르기의 유행은 최근에 증가하였다. 세계 인구의 30-40%가 감염되었으며 이는 21세기의 3대 주요 질환 중 하나로 간주된다.

지난 20년간, 염증은 알레르기 반응의 주요 병리생리학적 특성 중 하나이다. 비대세포는 알레르기 반응의 주요 매개체이며 이들의 활성화는 알레르겐에 노출된 민감한 개체에서 미소혈관계 투과성 및 조직 부종의 급격한 발생에 대한 충분하고 필수적인 조건이다. 비대세포는 다음을 포함하는 알레르기성 염증의 주요 원천이다: 히스타민, 천연 프로테나제, 프로테오글리칸, 프로스타글란딘 D2, 류코트리엔 C4 및 특정 사이토카인(Parikh INC, et at. Preformed enzymes in mast cell granulates and their potential role in allergic rhinitis. (2003) Curr Asthma Rep 3: 266-272). 이들 중에서, 히스타민은 천식에 관련된 병리생리학적 변화의 첫 번째 매개체이다.

기관지 천식은 기도의 만성 염증의 발현이며 알레르겐에 대한 과민성이 나타나는 것이 가능하다. 따라서, 이 질환의 치료는 알레르겐 자극에 관련된 염증 반응을 최소화하기 위한 환경 조절뿐만 아니라 염증의 감소 및 질환의 진행을 예방하기 위한 항염증 치료의 사용으로 구성된다(Craig ML. Diversity of asthma: evolving concepts of pathophysiology and lessons from genetics. (2005) J Allergy Clin Immunol 115: S526-31).

천식은 선진국에서 주로 나타나며 아동 4명 중 1명에게 나타난다(Asher MI, Keil OR, et at. International study of asthma and allergies in childhood (ISAAC): rationale and methods. (1995) Eur Resp J 8: 483-91). 기관지 과-반응성이 천식의 생리학적 구성 내에서 관찰되었으나 이는 또한 천식이 없는 개체에서도 발생한다(일반 집단의10-15%).

현재 천식은 복합체 면역생물학을 수반하는 유전-환경 상호작용에 의해 생성되는 질환으로서 생각된다. 기도 내로 알레르겐이 방출됨에 의해 수명의 초기에 발생한다. 천식의 면역 인식의 첫 번째 단계는 항원이 면역 세포로 들어갔을 때 발생한다. 수상돌기 세포를 포함하는 APC는 항원으로서 공급될 수 있는 외부 단백질에 통합된다; 이들은 MHC 클래스 II 배경에서 표면에 발현될 수 있는 작은 폴리펩티드로 가수분해된다. 이러한 제시는 APC의 표면상의 보조 분자의 발현을 수반한다. 과정은 기도의 표면 근처에서 일어나며 이차 림프양 조직의 CCR7 리간드, EBI-1 및 사이토카인의 영향력 하에서 림프양 조직으로 향하는 CCR7을 갖는 이러한 세포의 이동에 의해 지속되고, 또한 기억 T 세포 및 CCR7을 갖는 "천연" 세포를 공격한다. T 세포의 활성화는 APC에 축적되는 항원에 대한 국소 림프양 조직에서 일어난다. 사이토카인의 국부 발현은 면역 편차로서 언급되는 과정인 항원 제시에 대한 T 세포의 반응에서 깊은 효과를 가질 수 있다. IL-12의 존재시에 이러한 세포들은 IFN-γ를 발현하는 Th1 표현형을 갖는다. IL-10의 영향력 하에서, 이러한 세포들은 천식의 진행을 제한하는데 중요할 수 있는 조절체 표현형을 발달시킬 수 있다. IL-4 및 IL-13의 영향력은 천식의 존재시 요구되는 Th2 표현형의 발달을 이끌어낸다. 흥미롭게, 활성화에 의해 유도된 IL-4, IL-13, CD40 및 시티딘(citydin) 디아미나제로 명명된 효소의 조합된 작용은 아토피 천식에서 농도가 증가하는 알레르기에 대한 특이 IgE의 생성 및 B 림프구의 재조합에서의 결실 변화를 생성한다. 이는 천식 증상을 발생시키는 매개체의 방출을 이끌어내는 비대세포, 호염기구 및 호산구를 포함하는 알레르기 반응의 작동체에서 알레르겐 및 수용체에 특이적으로 결합하는 특이 IgE의 능력이다.

천식에서 작동체 분자는 히스타민, 혈소판의 활성화 인자, 프로테아제 및 아리키돈산(AA)의 대사물질을 포함한다. 프로스타글란딘(PG) 및 류코트리엔(LT)은 알레르기 및 천식성 반응 동안 효소적으로 생성되는 AA의 대사물질이며 이들은 특이 수용체에서 작용하는 동안 폐에서 고유 세포에게 영향을 미치는 기도 환경 내의 한정된 부분에 존재한다(Drazen JM. Leukotrienes in asthma. (2003) Adv Exp Med Biol 525: 1-5). 천식에서 작동체 염증 세포는 류코트리엔을 생성하며 폐의 구성 세포는 프로스타글란딘을 (Holgate ST, et al. Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation. (2003) J Allergy Clin Immunol 111 (suppl): S18-36).

PG 및 LT는 또한 산화 스트레스의 결과로서 형성될 수 있다. 퍼옥시다제를 포함하는 호흡기도의 과립구의 활성은 이러한 수준에서 산화제의 발생에 관련되있다. 질소 및 산소 반응종의 형성이 호흡기도의 환경의 수용량을 넘어섰을 때, 지질막의 과산화가 발생할 수 있다. 이 과정은 이소프로스테인(isoprostane) 형성을 이끌어내며; 이들은 산화 스트레스의 마커이다.

천식에 걸린 여러 구성원을 갖는 표현형적으로 특성화된 가족 및 다형 마커의 유효성은 질환에 관련된 유전적 변이체의 확인을 가능하게 한다. 천식에 관련되어 있을 것으로 여겨지는 유전자(IL4, IL13, Tbet and GATA3)의 12가지 연구로부터의 집단의 실험은 이 질환과 상호관계가 없음을 보였다. 천식과 관련있는 유전자는 데신테그린(desintegrin) 및 메탈로프로타나제 33(ADAM33) (Van Eerdewegh P, Little RD, et at. Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness. (2002) Nature 418: 426-30), 디펩티딜 펩티다제(dipeptidil peptidase) 10 (DPP10) 및 PHD 핑거 단백질 11 (PHF11) (Zhang Y, et at. Positional cloning of to quantitative trait locus on chromosome 13q14 that influences immunoglobulin E levels and asthma. (2003) Nat Genet 34: 181-6) 과 같은 널리 알려진 다인자성 유전자를 포함한다. 이러한 유전자의 변이체가 천식의 발병기전에 영향을 미치는 메커니즘은 현재 연구되지 않았다.

천식 발병기전에서의 신생 모델이 있다. 천식에 대한 전통적인 모델은 호흡 기도에서 평활근의 기능 및 염증 방식에 초점을 맞추었다. 현재, 사이토카인 및 케모카인 발현에 영향을 미치는 조절체 시스템의 컨셉에 통합되며 이는 천식에서 DP프로스타노이드 수용체의 역할을 설명하는 기도에서의 고유 세포의 성장 및 증식에서 알레르겐의 효과를 포함한다(Holgate ST, et al. Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation. (2003) J Allergy Clin Immunol 111 (suppl): S18-36). 이러한 모델에서, 독성 또는 알레르겐과 같은 염증을 일으키는 제제로의 노출은 적응성 면역계의 편차 및 기도를 향하는 Th2 림프구, 호산구 및 비대세포의 보충을 불가능하게 하지만, 또한 호흡기도의 평활근의 세포 주위에 비대세포가 위치하는 것에 간접적으로 작용하며(Brightling CE, et at. Mast-cell infiltration of airway smooth muscle in asthma. (2002) N Engl J Med 346: 1699-705) 이의 생존을 촉진하기 위해 프로스타노이드 DP 수용체를 활성화시킨다(Gervais FG, et at. Selective modulation of chemokinesis, degranulation, and apoptosis in eosinophils through the PGD2 receptors CRTH2 and DP. (2001) J Allergy Clin Immunol 108: 982-8). 알레르겐으로의 반복된 노출은 기도의 상피 세포의 활성화 조건을 변화시키고 콜라겐 분비자 근아세포 표현형으로의 아-상피 섬유아세포의 형질전환을 유발하는 인자를 방출한다. 호흡기도의 기저막에서의 콜라겐의 침착은 내강 부위에 영향을 미치는 기도의 평활근의 구성 반응을 변화시킨다(Wiggs BR, et at. A model of airway narrowing in asthma and in chronic obstructive pulmonary disease. (1992) Am Rev Resp Dis 145: 1251-8). 천식 증상은 호흡기도로부터의 호산구 및 비대세포의 친-수축성 매개체의 방출 에피소드를 통해 생성된다. 신생 구상은 천식은 세포성 조성물 및 기도 구조에서의 변화를 유도하는 시간을 갖는 감염성 제제, 알레르겐 및 환경 독성에 의해 생성되는 질환이라는 것이다.

억제성 또는 조절성 T 세포의 다른 서브타입은 동물 모델에서 작동체 세포의"생체외" 및 "생체내" 활성화를 예방할 수 있는 천식에 대하여 기재된 것이다. 최근의 증거는 알레르기성 감작의 발달에서 역할을 수행할 수 있는 CD4(+)CD25(+) 천연 조절 T 세포 및 IL-10 생성 조절 T 세포의 억제 활성에서의 결손을 제안한다. 치료법은 천식에서 조절T 세포 및 작동체 세포 사이의 균형을 유지하는 것을 목표로 한다(Robinson DS. The role of regulatory lymphocytes in asthma pathogenesis. (2005) Curr Allergy Asthma Rep 5: 135-41).

종양형성에 관하여 제안된 모델은 다른 유형의 암의 특징적인 주요 comuneses의 분석을 기초로 한다.

최근의 연구(Karpinets V, et at. Tumorigenesis: the adaptation of mammalian cells to sustained stress environment by epigenetic alterations and succeeding matched mutations. (2005) Carcinogenesis 26: 1323-1334)는 종양형성성 형질전환 동안에 세포가 잘못되고 비정상적인 유사분열을 생성하는 경향을 갖는 폴리머라제의 참가를 수반하는 세포 분열 동안 오류를 나타내는 경향의 결과로서 그들 자체의 돌연변이를 생성할 수 있음을 나타낸다. 이들 메커니즘은 생존 시그널링에 의해 세포에서 활성화될 수 있으며 지속되는 스트레스 환경(sustained stress environment; SSE)에서 증식을 계속할 수 있다: 이러한 시그널링에 대한 장기간 노 출은 특정 세포의 게놈을 후생적으로 재-프로그래밍하며 이들의 노화를 일으킨다. 후생적 재-프로그래밍은 다음과 같은 결과를 나타낸다: 세포 주기 정지의 저해에 관련된 종양 억제 유전자의 과메틸화, DNA 수복 및 아폽토시스, 지속성 증식 활성에 관련된 원종양유전자(proto-oncogene) 과메틸화, 전체적인 게놈 디메틸화 및 DNA 반복 서열의 활성화.

이 모델에 따라, SSE에서의 지속적 증식 및 시그널링은 영구적 침습에 노출되는, 예를 들어 발암물질의 결과로서 조직의 사이토카인의 지속적인 생성을 일으킬 수 있다. 유사한 스트레스에 관련된 시그널링은 염증, 호르몬 및 바이러스 감염과 같은 잘 알려진 암 유발물질을 포함하는 다른 생리적 및 환경적 인자에 의해 유도될 수 있다.

암의 기원 및 발달에 관련된 호르몬은 널리 다루어졌다. 많은 호르몬들이 아폽토시스 저해 뿐만 아니라 이의 증식을 유도하는, 많은 세포에서의 증식 반응 및 생존 시그널링 둘 다를 활성화 시킴이 알려졌다(Moggs JG, et al. Phenotypic anchoring of gene expression changes during estrogen-induced uterine growth. (2004) Environ Health Perspect 112: 1589-1606).

이러한 이슈는 세포 손상이 복구되지 않았을 경우 세포 사망 경로가 프로그래밍된 활성화를 야기할 수 있는 시그널링인, 세포 주기의 조절 및 아폽토시스 메커니즘이 어떻게 신생물의 성장 및 발달에서 중요한지의 이해가 결정적이다(Pietenpol JA, et al. Cell cycle checkpoint signalling: cell cycle arrest versus apoptosis. (2002) Toxicology 181-182: 475-481).

연구는 p53 및 p21이 G2/M 단계에서 세포 주기를 저해하고 DNA 손상이 따르는 아폽토시스를 유지하는 데에 필수적임을 보여준다. G2/M p53-의존 저지 메커니즘은 p21에 대한 B1/Cdc2 사이클린의 활성의 초기 저해 및 B1 및 Cdc2 단백질 사이클린 수준의 뒤이은 감소를 포함한다(Flatt PM, et at. p53 regulation of G(2) checkpoint i retinoblastoma protein dependent. (2000) Mol Cell Biol 20: 4210-23; Innocente INC, et at. p53 regulates to G2 checkpoint through cyclin B1. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 2147-52). B1/Cdc2 사이클린 수준 및 p21 활성의 조절에도 불구하고, p53은 또한 캐스캐이드 하의 추가 표적 유전자의 양성 전사적 조절을 통한 점검(check-up) 반응을 수행한다(Chan TA, et at. 14-3-3 Sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage. (1999) Nature 410: 616-20).

아폽토시스의 유도가 p21과 같은 캐스캐이드 하의 p53 표적 유전자의 양성 조절에 관련되있음이 보고되었다(Kannan K, et al. DNA microarrays identification of primary and secondary target genes regulated by p53. (2001) Oncogene 20: 2225-2234).

세포성 과정에서의 형질전환체 바이러스의 효과는 SSE의 많은 양상과 유사하다. 특정 바이러스에 의해 코드되는 종양단백질은 생존 및 증식 시그널과 같은 방식으로 숙주 세포 프로세스를 변화시킨다.

악성 질환의 대략 1/4이 만성 염증의 단계를 통해 약해진다(Coussens LM, et at. Inflammation and cancer (2002) Nature 420: 860-7). 발암물질에 대해 주어진 SSE와 유사하게, 이 세포성 환경은 시스템의 세포성 방어로서 산소 반응성 종의 생성을 이룬다. 그러므로, 병인학에 관계없이 염증은 또한 세포성 침습, DNA 손상 및 SSE를 유도하는 사이토카인 및 성장 인자가 풍부한 미세-환경을 발생시킨다.

"암 면역-에디션"으로 명명된 좀더 광범위한 프로세스의 부분일 수 있는 종양에 대항하는 면역학적 감시의 천연 메커니즘의 존재를 지속시키는 많은 증거가 있다. 이는 인식 및 종양 제거로부터 종양 탈출까지를 포함하는 종양 발달에서의 천연 및 요구된 면역성의 과정의 완전한 계열을 포함한다(Dunn GP, et al. The Three is of cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escapes. (2004) Annu Rev Immunol 22: 329-360). 놀랍게도, 손상되지 않은 면역계의 부재 하에서 형성된 종양은 면역적격성 숙주에서 형성된 것보다 좀더 면역원성을 나타낸다; 이는 종양 발달에 대항하는 숙주의 보호뿐만 아니라 면역원성에 기초한 종양 변이체의 선별에서의 이의 영향력에서 면역계의 역할을 강화시킨다.

기본적으로 MHC 클래스 I 배경에서 존재하는 항원에 대한 CD8+ T 세포(CTL)의 림프독성 반응은 항-종양성 면역 반응에서 요구되는 면역성의 주요 작동체 분파로 간주되며, 이러한 방식에서, 항-종양성 면역계의 주요 경향은 CTL 반응을 증가시키는 것에 초점을 맞춘다.

종양에 대항하는 면역계 감시의 이론은 의심할여지 없이 면역계가 종양 세포를 인식하고 제거할 수 있음을 증명한다.

종양에 대항하는 면역학적 감시의 메커니즘에서의 가장 적절한 양상 중 하나는 IFN-γ의 역할이다. 면역 세포계에 의해 생성되는 IFN-γ가 이식된 종양의 성장 뿐만 아니라 화학-유도되고 자발적인 종양의 유도에 대항하는 숙주를 보호할 수 있다(Dighe AS, et at. Inhibition of cellular responsiveness to interferon-γ(IFN-γ) induced by overexpression of inactive forms of the IFN-γ receptor (1993) J Biol Chem 268: 10645-53). 이전 진술, 예를 들어 이식된 종양을 갖는 마우스에서의 모노클로날 항체 항- IFN-γ 주입이 LPS에 의해 유도되는 이의 거부를 차단함을 보인다는 것을 뒷받침하는 증거가 있다; 이식된 섬유육종은 비처리 마우스에 비해 모노클로날 항체 항- IFN-γ로 처리한 마우스에서 더 빠르고 효과적으로 성장한다; 녹아웃 마우스(- / -) IFN-γ R 또는 (- / -) STAT1은 대조 마우스에 비해, 메틸콜란트렌(methylcholanthrene; MCA)에 의한 종양 유도에 10-20배 더 민감하며, 종양의 더 특이적인 발달에 의해 대조보다 MCA의 더 낮은 투여량 및 적은 시간을 나타낸다(Qin Z, et al. Inhibition of methylcholanthrene-induced carcinogenesis by an IFN-γ receptor dependent foreign body reaction. (2002) J Exp Med 195: 1479-90).

IFN-γ에 민감하지 않은 종양 세포주는 민감한 종양보다 훨씬 빨리 성장한다. 종양 면역 거부는 녹아웃 마우스에서와 유사하게 저해된다. 종양 세포는 이러한 모델에서의 거부 프로세스에서 IFN-γ의 생리학적 표적이다. IFN-γ는 종양에서 직접적인 영향을 갖는 항-증식성 및 친-아폽토시스 특성을 나타낸다. IFN-γ 의존 MHC I 항원 제시의 증가의 중요성은 종양 유도의 유사한 모델에서 입증되었으며 항-종양성 반응을 생성하는 Th1 반응의 유도의 중요성도 증명되었다.

IFN-α/C-피코 조합의 일부를 형성하는 두 독립적인 유효 성분을 사용하는 비율에 대하여, MS에서 유형 I IFNs (IFN-α또는 IFN-β)의 유효한 효과를 제시하는 증거이다.

항바이러스 효과: 유형 I IFNs은 강력한 항바이러스 효과를 가지며, 이들은 세포가 바이러스에 의해 감염된 후에 유도되며 이들은 RNA 또는 DNA 바이러스 복제를 방해하는 2'5'올리고아데닐레이트 합성과 같은 많은 수의 효소를 촉진한다. 이러한 초기 반응(항원에 대해 비특이적임)은 항원에 대한 특이 반응이 감염을 완전히 제어할 수 있기 전에 바이러스 감염의 연장을 제한하는 것에 결정적이다.

MS 소질에서 감염의 역할에 관하여 모순이 있는데, 예를 들어 Sieve 등의 문헌(Sieve AN, et al. Chronic restraint stress during early Theiler's virus infection exacerbates the subsequent demyelinating disease in SJL mice. (2004) J Neuroimmunol. Oct;155 (1-2):103-18)은 SJL 마우스의 탈수초화 질환의 동물 모델에서 트레일러 바이러스의 감염으로 탈수초화의 증가를 생성한다고 증명하였으며, 반대로, 주혈흡충증(Schistosomiasis)이 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni) 감염에 의한 MS의 시작을 직접적으로 억제함이 발견된, EAE 모델에서 MA의 보호를 제공한다(The Flamme AC, et al. Schistosomiasis protects against multiple sclerosis. (2004) Mem Inst Oswaldo Cruz; 99 (5 Suppl 1):33-6. Epub 2004 Oct 13).

항-증식, 항-아폽토시스 및 세포 분화 효과: IFN-α및 β는 모든 세포 주기 단계에 영향을 줄 수 있다: M, G1 및 G2. 섬유아세포가 혈청에 의해 자극되었을 때, 상피 성장 인자(EGF) 또는 인슐린, IFNs은 G1 단계의 연장, S 단계로의 진입률 감소 및 S 및 G2 단계의 감속을 생성한다 (Balkwill F, et al. Interferon affects both G1 and S+G2 in cells stimulated from quiescence to growth. (1978) Nature 274: 798-800; Gewert DRMG, et al. Inhibition of cell proliferation by interferons 1. Effects on cell division and DNA synthesis in human lymphoblasts (Daudi) cells (1984) Eur J Biochem 139: 619-625). 일반 및 종양 세포에서 IFN에 의한 세포 주기의 연장의 축적된 효과는 세포성색전, 세포 부피 및 아폽토시스의 증가를 나타낸다(Otsuki T, et al. Human myeloma cell apoptosis induced by interferon-α(1998) Br J Haematol 103: 518-529).

종양은 세포 주기의 진행을 제어할 하나 또는 그 이상의 단백질의 변경을 발생시킨다. IFN에 의해 조절되는 세포암유전자는 c-myc(Raveh T, et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase mediates c-Myc suppression induced by type I interferons. (1996) J Biol Chem 271: 25479-25484), bcl-2 (Koshiji M, et at. Apoptosis of colorectal adenocarcinoma (COLO201) by tumor necrosis factor-alpha and/or interferon-gamma resulting from down-regulation of Bcl-2 expression. (1998) Clin Exp Imunol 111: 211-218), c-Ha-ras (Samid D, et at. Biochemical correlates of phenotypic reversion in interferon-treated mouse cells transformed by to human oncogene. (1984) Biochem Biophys Res Comm 119. 21-28) 및 c-src를 포함한다. 많은 종양에서 다른 중요한 돌연변이 단백질은 망막아세포종(retinoblastoma; Rb)이다. E2F 전사 인자와의 결합을 통한 이 단백질의 과-인산화는 세포 주기의 진행을 저해한다; IFN-α로의 처리는 이러한 과-인산화의 저해를 나타낸다(Kumar R, et al. Interferon-α induce the expression of retinoblastoma gene product in human Burkitt lymphoma Daudi cells: role in growth regulation. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 6599-6603; Resnitzky D, et al. Interferons and interleukin 6 suppress phosphorylation of the retinoblastoma protein in growth-sensitive hematopoietic cells. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 402-406). IFN-α 효과는 E2F, E2F-1 단백질에서의 감소를 나타낸다.

아폽토시스 유도에서 사용되는 경로 중 하나는 Fasl로의 Fas의 결합을 포함하며, 이는 사망 도메인, FADD를 포함하는 단백질의 보충 및 그로 인한 카스파제-8과 같은 카스파제의 활성화를 야기한다. IFN은 Fas 발현을 양성적으로 조절하므로 Fas 매개 아폽토시스 경로를 통해 작용할 수 있다(Weller M, et al. Anti-Fas/APO-1 antibody-mediated apoptosis of cultured human glioma cells. Induction and modulation of sensitivity by cytokines (1994) J Clin Invest 94: 954-964). Fas는 IFN-α에 의해 양성적으로 조절될 수 있으며(Gordon M, et at. Treatment with interferon-alpha preferentially reduces the capacity for amplification of granulocyte-mecrophage progenitors (CFU-GM) from patients with chronic myeloid leukaemia but normal spares CFU-GM. (1998) J Clin Invest 102:710-715) 이러한 사건은 Fas에 의해 매개되는 아폽토시스를 촉진한다(Selleri CMJ, et al. Fas-mediated modulation of bcr/abl in chronic myeloid leukaemia results in differential effects on apoptosis (1998) Blood 92: 981-989).

유전자 조절: 효소 2-5 올리고아데닐레이트 합성효소(2-5A 합성효소), 단백질 키나아제(PKR), 및 인돌아민 2,3-디옥시제나제(IDO)가 IFNs에 의해 유도되며, 2-5A 합성효소는IFN 시그널링의 상대적으로 특이적인 마커이다(Hassel BA, et at. A dominant negative mutant of 2-5A-dependent RNase suppresses anti-proliferative and antiviral effects of interferon (1993) EMBO J 12: 3297-3304). 잠복기 리보누클레아제는 2-5A에 의해 활성화된다; 이러한 효소의 유도는 RNS 및 단백질 합성을 저해할 수 있다: 효소적으로 불활성인 리보누클레아제(RNase-L)의 세포 내 발현은 IFNs의 항-바이러스 및 항-증식 효과를 저해한다. 아폽토시스는 다른 아폽토시스 제제로 처리된 마우스null-RNase-L에서 억제된다(Zhou A, et al. Interferon action and apoptosis are defective in mice devoid of 2',5'-oligoadenylate-dependent RNase I (1997) EMBO J 16: 6355-6363).

PKR의 수준은 다른 인간 종양 및 종양 세포주에서 증식 활성에 반비례하며, 적은 PKR 활성이 침습성 유방 암종에서 발견되었다(Haines GKCR, et al. Expression of the double-stranded RNA-dependent protein kinase (p68) in human breast tissues. (1996) Tumor Biol 17: 5-12; Savinova OJB, et al. Abnormal levels and minimal activity of the ds RNA-activated protein kinase, PKR, in breast carcinoma cells (1999) Int Biochem Cell Biol 31: 175-189).

PKR의 발현은 IFN-유도 전사 인자인 IRF-1에 의해 조절될 수 있으며, IRF-1은 성장 동안에 지체 단계에서 세포에서 재빨리 증가하므로, 이는 세포 성장의 음 성 제어 및 IFN-매개 항-증식 효과에 관련된 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있다.

The degradation of tryptophan to quinurenin by IDO에 의한 퀴누레닌(quinurenin)로의 트립토판의 분해는 또한 트립토판 분해의 결과로서 단백질 합성의 저해 및 항-증식 효과에 관련된다 (Byrne G, et al. Induction of tryptophan degradation in vitro and in vivo: to gamma-interferon stimulated activity. (1986) J Interferon Res 6: 389-396).

IFNs은 또한 결장 암종의 인간 세포에서 다중-약물 내성 유전자(mdr1)을 음성적으로 조절한다 (Stein U, et al. Modulation of mdr1 expression by cytokines in human colon carcinoma cells: an approach for reversal of multi-drug resistance. (1996) Br J Cancer 74: 1384-1391). 누클레오티드 배열은 bcr 유전자(브레이크포인트 클러스터 영역) 또한 IFN-α에 의해 음성적으로 조절될 수 있음을 증명한다 (Der SD, et al. Identification of genes differentially regulated by interferon-α, β 또는 γ using oligonucleotide arrays (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 15623-15628).

면역조절 효과: IFN-γ 세포 생산자 (Th1 세포 유형)의 비율은 IFN-α의 존재하에서 T 세포에서 증가되며 TCR/CD3 복합체 경로를 통해 클로닝되거나 (Parronchi P, et al. IL-4 and IFN alpha and IFN gamma exert opposite regulatory effects on the development of cytolytic potential by Th1 or Th2 human T cell clones. (1992) J Immunol 149: 2977 - 2983) 직접적으로 자극된다(Brinkmann V, et al. Interferon alpha increases the frequency of IFN gamma- producing CD4+ T cells (1993) J Exp Med 178: 1655 - 1663). 다른 문헌은 IFN-α가 IFN-γ를 유도함을 증명한다. IFN-γ "녹아웃" 마우스에서, 염증 및 탈수초화의 증가가 관찰되며(Tran EH, al. IFN-gamma shapes immune invasion of the central nervous system via regulation of chemokines. (2000) J Immunol 164: 2759 - 2768) 이는 MS와 같은 탈수초 자가면역 질환에서의 IFN-γ의 보호적 역할 및 이로 인한 빈번한 병인성 친-염증성 역할과는 반대로 IFN-γ에서의 증가를 보이는 순차적인 유용한 역할을 제안한다.

작동체 면역 세포에서의 효과: IFNs은 면역 작동체의 모든 세포 유형의 효과를 증가시킨다. 이들은 세포독성 T 세포 및 자연 킬러 세포(NK)를 포함한다. 항체-의존 세포성 세포독성(Antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC)은 또한 IFNs에 의해 증가될 수 있다. 인간 백혈구 항원(HLA)의 분자의 증가된 발현 외에 또 IFNs가 종양 세포의 세포독성에 대한 적절한 T 세포의 기능을 직접적으로 증가시킨다(Kayagaki N, et al. Type I interferons regulate tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) expression on human T cells: a novel mechanism for the anti-tumoral effects of type I Interferons (1999) J Exp Med 189: 1451-1460). NK 세포 활성 및 이의 단핵구 기능을 증가시키기 위한 IFNs의 능력이 생체외 및 생체내에서 증명되었다.

혈관형성 효과: IFN 매개 항-종양 효과의 다른 성분은 혈관형성의 저해이다. IFN-α의 전신 투여는 혈관형성 단백질 발현, bFGF 의 직접적 조절에 의한 IFN 민감성 세포에서 종양 세포의 성장율을 감소시킨다(Dinney CP, et al Inhibition of Basic fibroblast growth factor expression, angiogenesis, and growth of human bladder carcinoma in mice (1998) Cancer Res 58: 808-814).

임상적으로, IFN-α 처리는 비정상 상피 세포를 포함하는 종양인 혈관종 퇴화의 유도에서 성공적이었다(Ezekowitz RAB, et al. Interferon alpha-2b therapy for life-threatening hemangiomas of infancy (1992) N Engl J Med 326: 1456-1463). 상피 기원의 종양성 질환인 카포시 암종은 또한 IFN-α 치료에 반응한다(Krown SE. Interferon-α:evolving therapy for AIDS-associated Kaposi'sarcoma. (1998) J Interferon Cyto Res18: 209-214).

IFNs의 항-종양 효과: 항-종양 효과가 종양 세포의 항원성 조성이나 기능적 능력에서의 직접적 효과 또는 종양 세포와 상호작용하는 면역 세포 집단의 조절에서의 간접 효과 중 하나의 결과임이 주장되었다.

그러나, 특정 수의 유형 I IFN 유도 유전자는 아폽토시스에 관한 것으로 PKR, PML, RAP46/Bag-1, 인지질 스크램블라제(scramblase) 및 히드록시 유도가능 알파-1 인자를 포함한다(Der SD, et al. Identification of genes differentially regulated by interferon α, β 또는 γ using oligonucleotide arrays. Proc Natl Acad Sci USA (1998); 95: 15623-15628). 이는 생체내 IFNs 효과가 아폽토시스 유도 제제와 결합하는지를 결정하기 위해 중요할 것이다.

최근 연구(Dunn GP, et at. A critical function for type I interferons in cancer immunoediting. (2005) Nature Immunol 6: 722-29)는 종양의 치료에서 IFN 유형 I (IFN α/β)의 사용을 뒷받침한다. 이러한 연구는 암 "면역-에디션" 과정에 서 결정적인 성분으로서 IFN α/β뿐만 아니라 IFN-γ를 확인하였다. 이 그룹은 면역적격성 마우스에서 내재적으로 생성된 IFNs α/β높은 면역원성을 갖는 MCA 암종의 거부를 위해 요구됨을 증명하며, 또한 숙주 조혈 세포가 보호성 항-종양 반응의 발달 동안에 IFN α/β의 중요한 표적이므로 일차 발암물질에 의해 유도되는 종양의 과성장을 예방한다.

인간 항-종양 효과: IFNs은 임상실험에서 중요한 역할을 수행한다. 단일 제제로서 IFN-α2의 임상학적으로 유용한 치료 활성은 많은 질환에서 증명되었다. 이러한 발견은 암 환자의 생존율을 증가시키기 위한 일차 인간 단백질로서 IFNs을 뒷받침한다. 다른 약물과 IFNs의 조합은 결과 및 새롭고 더 효과적인 임상적용을 촉진함을 증명한다. 동물 모델 및 세포에서 다른 치료와 조합되었을 때, IFNs은 다른 조직학의 악성 질환에서의 치료의 효능을 증가시킨다. 종양의 세포수 또는 크기의 감소 및 생존 연장은 대부분의 경우에서 부가 또는 시너지 효과를 갖는다.

악성 혈액학적 질환에서 IFNs의 효과: 모발세포 백혈병(HCL)을 갖는 환자의 삶의 질의 개선 및 활성의 정도는 미국에서 IFN에 대하여 승인된 일차 라이선스를 이끌어 냈다. 환자의 85% 이상이 IFN-α2에 대한 부분적 또는 완전한 혈액학적 반응의 객관적 증거를 갖는다(Quesada J, et al. Treatment of hairy cell leukemia with alpha interferon (1985) Blood 1986: 493-497).

만성 골수성 백혈병에서(CML), the application of IFN-α의 적용은 새로 진단된 환자의 대부분에서 중요한 치료학적 반응(75% 이상)을 생성한다(Kantarjian HM, et al. Chronic myeloid leukemia: a concise update (1993) Blood 82: 691- 703; Talpaz M. Use of interferon in the treatment of chronic myeloid leukemia. (1994) Semin Oncol 21: 3-7). CML에서의 최상의 결과는 의미있는 임상 반응 및 IFN-α2와의 세포형성 반응을 증명한다 (Talpaz M. Use of interferon in the treatment of chronic myeloid leukemia. (1994) Semin Oncol 21: 3-7). 지속적인 치료로, 대락 25%의 환자가 필라델피아(Ph) 염색체의 발현의 손실을 수반하는 완전한 세포형성 반응을 갖는다. 세포형성 반응(완전한 반응이 아닐지라도)의 증거를 보이는 응답자 환자의 평균 생존 기간은 대략 6년이다: 완전한 세포형성 반응을 나타내는 90%의 환자는 10년 이상의 완화를 갖는다. 10년의 평균 생존기간은 화학치료에 비해 IFN-α₂에 대한 상당한 이득을 증명한다(leukemia TICSGoCM. Long-term follow-up of the Italian trial of interferon-alpha versus conventional chemotherapy in chronic myeloid leukemia. (1998) Blood 92: 1541-1548).

Ph 염색체를 갖는 양성 또는 음성 혈소판증가증에 관련된 골수증식성 기능부전은 FN-α₂로 조절될 수 있다(Ludwig H, et al. Treatment with recombinant IFNα-2c: multiple myeloma and thrombocythaemia in myeloproliferative diseases. (1985) Oncology 42 (suppl 1): 19-25; talpaz m, et al. Recombinant IFN-α₂ therapy of chromosome-negative myeloproliferative disorders with thrombocytosis. (1989) Am J Med 86: 554-558).

이전에 치료하지 않은 다발성 골수종 환자의 50%가 IFN-α₂ 로의 치료에 반응한다(Quesada JR, et al: Collaborative phase I-II study of recombinant DNA- produced leukocyte interferon (clone A) in metastatic breast cancer, malignant lymphoma, and multiple myeloma (1984) Am J Med 77: 427-432).

IFN-a 는 다른 조직학 및 T 및 B세포 표현형의 림프종에서 치료학적 역할을 한다 (Borden EC. Innovative treatment strategies for non-Hodgkin's lymphoma and multiple myeloma (1994) Sem Oncol 21: 14-22). IFN-α₂ 는 3 내지 25달의 반응을 수반하는 진전된 피부 T 세포 림프종을 갖는 환자의 45%에서 활성을 보인다(Borden EC. Innovative treatment strategies for non-Hodgkin's lymphoma and multiple myeloma (1994) Sem Oncol 21: 14-22). 불완전하게 분화된 B 세포의 림프종에서, 45% 이상의 반응 빈도가 IFN-α₂로의 치료 후에 발견되었다(Foon KA, et al. Treatment of advanced non-Hodgkin's lymphoma with recombinant leukocyte α interferon. (1984) N Engl J Med 311: 1148-1152; O'Connell M, Colgan JP, Oken MM, et al. Clinical trial of recombinant leukocyte A interferon as initial therapy for favorable histology non-Hodgkin's lymphomas and chronic lymphocytic leukaemia. An Eastern Cooperative Oncology Group pilot study. (1986) J Clin Oncol 4: 128-136)

충실성 종양에서 IFNs의 효과: 특정 전이성 충실성 종양의 치료에서, IFN-α 은 최상의 화학치료제와 동일한 반응을 나타낸다. IFN-α에 대한 흑생종의 반응은 2% 및 29% 사이로 다양하다(Creagan AND, et al. Phase II study of recombinant leukocyte interferon (rIFN-alpha-A) in disseminated malignant melanoma. (1984) Cancer 54: 2844-2849; Robinson W, et al. Treatment of metastatic melanoma with recombinant interferon alpha 2. (1986) Immunobiology 172: 275-282). 호르몬과IFNs의 조합에서, 화학치료 및/또는 IL-2는 치료 양상으로서 이의 통합이 이들이 독성에 의해 제한되지만 전이성 흑색종에서의 반응을 증가시키고 생존을 연장시킨다(Legha SSRS, et al. Development and results of bio-chemotherapy in metastatic melanoma: the University of Texas M.D. Anderson Cancer Center experience (1997) Cancer J Sci Am; 3 (suppl 1): S9-S15).

전이성 신장 암종에서, IFN-α, IFN-α + IL-2 조합, IFN-α + IFN-γ 조합 치료가 사용되었으나 메타-분석의 결과는 주로 이들의 독성에 기인한, 조합된 치료로 치료한 환자에서 보다 IFN-α으로 처리한 환자가 더 좋은 반응을 가짐을 제안한다 (Hemberg M, et al. Regimens with or without interferon-alpha as treatment for metastatic melanoma and renal cell carcinoma: an overview of randomized trials (1999) J Immunother 22: 145-154).

자연에서 조절 역할을 수행하는 유기적 기원의 생활성 물질은 개체 자신의 고유의 치료 잠재력의 발달에 기초하는 치료 메커니즘을 갖는 약물로 작용할 수 있는 기초 유효 성분을 구성한다. 이러한 접근은 생-조절성 산물에 기초한 것이며 질환에서 변화되는 기능적 항상성 균형의 회복을 이루기 위해 개체의 능력을 촉진시키거나 방출시키거나 자극하기 위해 사용되었다. 이러한 유효 성분 및 생물학적 반응 조절제의 합리적인 사용은 생리학적 메커니즘 및 경로를 통해, 진행적이고 점진적인 방식으로 변화된 기능을 정상적으로 회복시키기 위해 환자를 치료하는 것을 목적으로 한다.

정황 증거 또는 실험 증거는 천연 또는 추출 기원 또는 식물 유도체의 산물의 잠재적인 치료 특성의 사용을 제안한다. 이러한 생-의약품은 가능한 치료학적 적용의 하나 또는 여러 가지의 알려지거나 언급된 약리학적 활성을 나타내는 일반 특성을 갖는 산업에서의 농축되거나 반-정제된 천연원 또는 분리된 성분의 복합체 혼합물일 수 있으며, 이는 C-피코시아닌(C-피코)의 경우이다.

C-피코는 남조류(green-blue algae )에서 발견되는 단백질에 결합하는 색소이다. C-피코 단위체는 공유적으로 결합된 적어도 3개의 빌린 발색단 및 금속 복합체 없는 개방된 테트라피롤린 사슬을 포함하는 두 개의 다른 α 및 β 단백질 서브유닛에 결합된다(Duerring M, et al. Isolation, crystallization, crystal structure anaisis and refinement of constitutive c-phycocyanin from the chromatically adapting Cyanobacterium fremyella diplosiplon at 1.66 A resolution (1991). J Mol Biol ; 217: 577-92). 이러한 보철 그룹은 분자량 유닛 당 대략 16개의 발색단의 존재를 나타내는, 조류 질량의 약 4%를 차지한다(Oh Eocha C. Phycobilins. In: Lewin RA, editor. Physiology and Biochemistry of Algae: New Cork: Academy Press, 1962: 421-35). 4가지의 다른 구조 형태가 있다: 남조류에서 가장 풍부한 색소인(조류 건조 중량의 20% 이상)(Richmond A. Large scale microalgal culture and applications. In: Round Chapman, editors. Progress in Phycological Research. Vol. 7 Biopres Ltd., 1990:8) 단위체, 삼량체, 육량체 및 십량체(MacColl R, et al. Phycobiliproteins. Boca Raton: CRC Press, 1987: 1-10).

C-피코에서 빌린 발색단의 화학 구조(개방된 테트라이롤린 사슬)는 빌리루빈(bilirrubin)과 매우 유사하다. Stocker 등의 문헌(Stocker R, et al. Bilirrubin is an antioxidant of possible physiological importance (1987) Science; 235: 1043-6)은 전체 빌리루빈 분자로 연장되는 공명 안정화를 갖는 중앙 탄소를 갖는 라디칼을 형성하기 위한 테트라피롤린 분자의 C-10에 결합하는 수소 원자로 이들을 수송하는 과산화 라디칼을 제거할 수 있으므로 생리학적 중요성의 가능한 항산화제이다. 산소 반응성종(ORS)이 다음을 포함하는 의학에서 다른 종류의 중요한 과정에 관련되었음이 널리 알려져 있다: 염증, 죽상동맥경화, 암, 재관류에 의한 손상(Kehrer JP. Free radicals as mediators of tissue injury and disease (1993) Crit Rev Toxicol 23:21-48). 방식 중 하나에서 물질이 유리 라디칼의 항산화 또는 스카빈저로서의 이의 작용을 통하는 이러한 과정을 방해할 수 있다.

항산화 효과: C-피코의 항산화 및 항-염증 특성에 대한 첫 번째 보고는 Romay 등의 문헌이며(Romay C, et al. Antioxidant and anti-inflammatory properties of C-phycocyanin from blue-green algae (1998) Inflamm Res 47 (1):36-41), "생체외" 및 "생체내"에서 항산화 제제로서 C-피코의 잠재성을 평가한다. C-피코는 이러한 라디칼 각각의 특이 스캐빈저인 0.125 mg/ml 의 디메틸술폭시드(DMSO) 및 0.038 ㎍/ml의 트롤록스(Trolox)로의 유사한 활성을 갖는 히드록 시(IC₅₀=0.91mg/ml)(IC₅₀: 과산화 손상의 50% 저해를 유도하는 첨가물의 농도) 및 알콕시 라디칼(IC₅₀=76㎍/ml)을 제거할 수 있다. C-피코는 또한 간 미소체 지질 과산화(IC₅₀=12 mg/ml)를 저해한다(Halliwell B. How to characterize a biological antioxidant. (1990) Free rad Res Comm; 9: 1-32). C-피코의 산소 스캐빈저 활성이 어떻게 과산화물 디스물타제(dysmutase)(SOD)보다 3배 적은지를 강조하는 것에 관심이 있으며, P-피코로의 SOD의 추가는 작용의 다른 메커니즘을 제안하는, 이의 항산화 능력을 바꾸지 않는다. 이의 항산화 작용의 다른 지표는 부위-특이적 방식에서 디옥시리보스의 손상을 저해하는 능력이다. 디옥시리보스 검정에서, C-피코에 대하여 계산된 속도 상수는 인도메타신 및 이부프로펜과 같은 몇몇 비-스테로이드성 항-염증 약물에 대한 동일한 방법으로 수득된 속도 상수와 유사하다(1.8x10¹⁰ M^-1S^-1) (Parij N, et al. Linear and non linear competition plots in the deoxyribose assay for determination of rate constants for reaction of non steroidal anti-inflammatory drugs with hydroxyl radicals (1995). Free Rad Head; 23: 571-9).

이러한 동일한 그룹은 C-피코가 매우 널리 알려진 항산화제인 트롤록스 및 아스코르브산에 유사한 방식으로 2,2'-아조비스 (2미디노프라판) 디히드록시클로라이드(AAPH) 적혈구 용혈반응을 저해함이 최근에 보고되었다(Romay C, et al. Phycocyanin is an antioxidant protective of human erythrocytes against lysis by peroxyl radicals (2000) J Pharm Pharmacol 52: 367-368). IC₅₀ 의 수치에 기초하여, C-피코가 트롤록스보다 16배 더 효과적인 항산화제이며 아스코르브산보다 20배 더 효과적인 항산화제임을 증명하였다. 이러한 발견은 다른 연구에 의해 확인되었으며(Hirata T, et al. Antioxidant activities of Phycocyanobilin prepared from Spirulina platensis (2000) J Appl Phycol 435-439) 이는 피코시아노빌린(C-피코의 성분)의 항산화 활성이 알파 토코페롤보다 더 높은 몰량을 가짐을 증명한다. 피코시아노빌린의 항산화 효과는 소수성 시스템에서의 메틸 리놀레이트의 산화에 대하여 또는 포스파티딜콜린 리포솜으로 계산되었다. 연구는 또한 분무 건조된 스피룰리나로부터의 C-피코가 신선한 스피룰리나로부터의 C-피코에서와 유사한 항산화 활성을 가짐을 보여준다. 이러한 결과는 아포단백질 성분이 건조 과정 중에 변성되므로, C-피코의 항산화 활성이 C-피코의 보철 그룹인 피코시아노빌린에 의한 것임을 제안한다. 건조된 C-피코가 천연 단백질과 유사한 활성을 나타낸다는 사실이 C-피코 제형 및 상업적으로 가능한 사용을 가능하게 한다.

Reddy 등의 문헌(Reddy CM, et al. Selective inhibition of ciclooxygenase-2 by C-phycocyanin, a biliprotein from Spirulina platensis (2000) Biochem Biophys Res Commun 3: 599-603)의 결과에 따라, 스피룰리나 플라텐시스로부터의 C-피코는 매우 낮은 IC₅₀COX-2/IC₅₀COX-1(0.04) 비율을 갖는 선택적인 시클로옥시제나제-2 (COX-2) 제해제이다. 흥미롭게도, 이러한 연구는 COX-2에 대한 C-피코에 의해 이루어지는 저해 수치 IC₅₀가 매우 널리 알려진 COX-2 선별 저 해제인 셀레콕시브(255 NM) 및 로페콕시브(401 NM)보다 매우 적음(180nM)을 보여준다. 피코시아노빌린 및 환원된 C-피코가 불활성이므로, C-피코 아포프로테인 성분은 COX-2 저해에 대해 반응한다. 저자는 유리 라디칼을 효과적으로 제거하고 지질 과산화를 저해하기 위한 이의 능력을 통하여 C-피코의 유사한 효과를 배재하지 않았지만, 문헌에서 보고된 C-피코의 항-관절염 항-염증 및 간보호 특성이 COX-2 선별 저해 특성에 부분적으로 기인함을 제안하였다.

C-피코는 식세포의 호흡기 파열 동안에 증가되는 유리 라디칼(OH., H₂O₂, RO.) 및 과산화물을 제거하는 이의 능력을 통해 투여량-의존 방식에서 루미놀 증폭 화학발광(LCL)을 저해한다. 그러나, 이는 또한 다른 경로, 예를 들어 활성화된 식세포, NADPH 옥시다제 및 미엘로퍼옥시다제에 의한 반응성 산소종의 생성에 관련된 효소에서 강한 영향을 주거나 작동제의 연결 또는 아라키돈산 대사 경로 중 하나를 방해함을 통해 LCL 수준을 감소시킬 수 있다. 최근에는, 염증의 동물 모델에서 C-피코에 의해 방출되는 류코트리엔 B4의 저해를 증명하였다.

과산화물에 의해 유도되는 염증 반응은 H₂O₂ 및 OH의 잠재적 스카빈저 효과로 제제를 확인하기 위해 모델 "생체외"에서 평가되었다. 글루코스 옥시다제(GO)를 내재성 글루코스와 반응하는 마우스의 발에 주입하고 OH 라디칼의 성공적인 생산을 수반하는 H₂O₂ 을 생성한다; 둘 다 조직 손상 및 수반되는 염증성 변화에 반응할 수 있다(Spillert CR, et al. A peroxide-induced inflammation model for drug testing (1987) 21: 297-8). C-피코는 마우스 발에서 부종을 유발하는 글루코스 옥 시다제를 감소시킨다. 이러한 항-염증 효과는 적어도 부분적으로 히드록시 라디칼의 제거에 기인할 수 있다.

H₂O₂ 에 의해 유도되는 많은 생체내 손상은 강한 반응성 산화제, 주로 OH로 형질전환됨에 의한 것이라는 많은 일치가 있다 (Halliwell B. How to characterize a biological antioxidant (1990) Free Rad Res Comm 9: 1-32). 그러므로, P-피코의 OH 스캐빈저 작용은 이의 항-염증 효과에 대하여 아마도 중요하다.

항-염증 효과: C-피코는 스피룰리나(Sp) 조류에서 발견된 피코빌린이다. 이러한 미세해초가 쿠바를 포함한 많은 국가에서 영양 보충물로서 사용됨에 관하여, 이의 항-염증 활성에 관한 보고서가 있으므로(Gonzalez R, et al. Anti-inflammatory activity of Phycocyanin extract in acetic acid-induced colitis in rats. (1999) Pharm Head 39; 1: 55-59) 중요한 염증성 인자를 갖는 질환에서 C-피코가 또한 사용될 수 있음이 생각될 수 있다. Gonzalez 등의 문헌에서 궤장성 대장염에서 발견되는 일부 급성 염증 반응과 유사한 동물 모델에서의 아세트산 유도 결장염에서 C-피코의 추출물의 효과를 평가하였다(Frettland DJ, et al. Eicosanoids and inflammatory bowel disease: regulation and prospects for therapy (1990) Prost Leukotr Ess Fatty Acids; 41: 215-33). 이 연구에서 가장 중요한 발견은 C-피코가 랫의 아세트산 유도 결장염을 감소시키고, C-피코의 항-결장 효과의 최초 보고는 이의 조직학적 특성에 의해서 뿐만 아니라 결장 조직의 구조적 분석을 통하여 평가되며 미엘로퍼옥시다제(MPO) 활성 측정에 의해 확인된다. 이 연구에서, 호산구 침윤 및 C-피코로 처리된 결장염을 갖는 동물의 손상된 결장 점막에서의 MPO 활성에서 상당한 증가가 발견되었으며 이는 이러한 조건에 대한 유용한 효과를 뒷받침한다.

C-피코 항-염증 활성 또한 랫의 발에서 카라진 유도 부종 및 랫에서 코튼 스펙 육아종에서 동일 투여량 범위를 가짐을 발견하였다(Romay Ch, et al. Further studies on anti-inflammatory activity of phycocyanin in some animal models of inflammation (1998) Inflamm Head 47 (8):334-8). 실험적 결장염에서 뿐만 아니라 염증의 이러한 실험 모델에서, 아라키돈산의 대사물질은 중요한 역할을 수행한다. C-피코는 투여량-의존 양상에서 마우스의 귀의 아라키돈산 유도 부종 뿐만 아니라 랫의 발의 카라진 유도 부종을 상당히 감소시킨다. C-피코는 또한 랫의 겨드랑이에 솜의 멸균된 스펙을 이식한 코튼 스펙 아-만성 육아종 검정에서 항-염증 활성을 보인다. C-피코의 경구 투여는 매일 처리한 모델에서 상당한 항-염증 활성을 나타낸다. 관찰된 항-염증 활성은 C-피코의 산소 스캐빈저 및 항산화 활성에 의한 것이며 아라키돈산 대사에서 저해 효과에 의한 것일 수 있다.

다른 보고는 이의 언급된 항산화 및 항-염증 효과로부터 유래한 화학적으로 유도된 간 손상을 예방하는 C-피코의 역할을 평가하였다 (Vadiraja BB, et al. Hepatoprotective effect of C-Phycocyanin: Protection for carbon tetrachloride and R-(+)-pulegone-mediated hepatotoxicity in rats (1998) Biochem and Biophys Res Com 249: 428-431). Vadiraja 등은 랫에서 R-(+)-플레곤 및 CCl4 유도 간독성에서의C-피코의 효과를 연구하였다. 이 연구에서 C-피코의 단일 투여량(200 mg/kg) 을 화학제에 의해 생성되는 간독성을 상당히 감소시키는 R-(+)-플레곤(250mg/kg) 또는 CCl4 (0.6 ml/kg)의 투여 1 내지 3시간 전에 랫에게 복강내 투여하였다. 두 제제가 유리 라디칼의 생성을 통해 간독성을 유발함이 제안되었다.

간보호 효과: C-피코의 간보호 효과는 반응성 대사물질 생성에 관련된 반응의 저해 및 아마도 이의 라디칼 제거 활성에 의한 것이다. C-피코는 반응성 대사물질의 형성에 관련된 사이토크롬 P450에 의해 매개되는 작용의 일부를 저해한다. 이러한 경우에서 C-피코가 효과적인 라디칼 제거제로서 작용할 수 있음이 또한 가능하다. 최근에, Bhat 등의 문헌(Bhat VB, et al. C-phycocyanin: a potent peroxyl radical scavenger in vivo and in vitro (2000) Biochem Biophys Res Comun 1: 20-25)에서 C-피코가 랫 간 "생체내"에서 CCl₄ 에 의해 유도되는 지질 과산화를 저해하며 이 저해는 11.35μM의 IC₅₀ 를 갖는 농도-의존성임을 보고하였다. 이러한 연구는 C-피코가 요산(널리 알려진 퍼옥시 라디칼 제거제)에 대한 3.5에 비해 1.54의 일정한 속도 비율을 갖는 잠재적 퍼옥시 라디칼임을 명백히 증명하였다.

항산화 방어 메커니즘에서의 감소 및 산소 및 질소 반응성 종의 증가는 연령 및 신경변성 질환에 관련된 기능의 감퇴에서 인과적 인자임이 제안되었다(Harman D. Aging: to theory based on free radical and radiation chemistry. (1956) J Gerontol 11: 289-300; Leibovitz BE, et al. Aspects of free radical reactions in biological systems: aging (1980) J Gerontol 35: 45-56; Ames BN, et al. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 7915-7922). 성장 증거는 염증 과정이 중추신경계(SNC)의 산화 손상에 관련되어 있음을 제시한다. 항산화 효소 과산화물 디스물타제의 주입은 몇몇 동물 모델에서 염증을 감소시킨다. 항산화제는 이들이 "생체외" 분리된 면역 세포에 첨가되었을 때 또는 "생체내" 동물 및 인간에게 보충물로서 주어졌을 때 면역 기능의 특정 파라미터를 증가시킨다(Ian SN, et al. Antioxidant, cytokines, and influenza infection in aged mice and elderly humans (2000) J Infect Dis 182:S74-S80). 잠재적인 메커니즘은 사이토카인과 같은 면역-조절 분자 생성에서의 항산화 효과이다. 사이토카인은 뇌 손상에 대한 반응에서 유도되며 이들은 세포성 손상에 유리한 회복을 매개하고 저해할 수 있다. 많은 임상 실험은 뇌 손상 또는 경색을 갖는 환자의 뇌척수액(CSF) 또는 사후 뇌 조직에서의 증가된 발현을 보고하였다. 증거는 연령에 따른 IL-1 및 TNF과 같은 친-염증성 사이토카인이 증가됨을 나타낸다(Lynch MA. Age-related impairment in long-term potentiation in hippocampus. A role for the cytokine, interleukin-1β?(1998) Prog Neurobiol 56: 571-589; Knoblach SM, et al. Early neuronal expression of tumor necrosis factor -α after experimental brain injury contributes to neurological impairment. (1999) J Neuroimmunol 95: 115-125).

C-피코는 Sp에서 발견된 모든 화합물의 가장 높은 항산화 활성을 가지며, 소수성 시스템에서 메틸 리놀레이트의 산화에 대하여 평가되었다(Hirata T, et al. Antioxidant activities of phycocyanobilin prepared from spirulina platensis (2000) J Appl Phycol 12: 435-439).

한 연구(Gemma C, et al. Diets enriched in foods with high antioxidant activity to be reviewed age-induced decreases in cerebellar β-adenergic function and increases in pro-inflammatory cytokines. (2002) J Neurosci 22; 14: 6114-6122)에서 오직 Sp만을 기초로 한 먹이를 14일간 공급한 344 일된 피셔 랫은 소뇌에서 b-아드레날린 수용체 작용의 개선, 친-염증성 사이토카인의 감소(TNF -α 및 TNF -β의 mRNA의 수준의 감소에 의해 증명됨) 및 산화 손상의 마커인 말로닐디알데하이드 수준(MDA)의 감소를 보인다. 이러한 사건은 오이 및 낮은 수준의 ORAC(산소 반응성 흡수 능력)를 갖는 식품의 동량을 보충한 랫 먹이에서는 나타나지 않았다.

신경보호 효과: 최근의 정교하고 흥미있는 연구는 랫에서의 C-피코의 경구 투여가 랫 해마에서 글리아 반응성 및 카인산에 의해 유도된 행동을 예방하며 이는 뉴런에서의 보호 효과를 제시한다. 연구는 C-피코가 실험적 간질 증상을 감소시킴을 보여주며 이는 간질의 특정 유형에서 가능학 치료학적 적용을 제시한다. 이러한 문헌들에 따라(Rimbau V, et al. Protective effect of C-phycocyanin against kainic acid-induced neuronal damage in rat hippocampus (1999). Neuroscience Letters; 276: 75-78), 카인산은 산소 반응성 종의 생산을 생성하는 세포독성을 야기한다. 그러므로, 이들은 뉴런 손상에서 C-피코의 보호 효과가 자유 라디칼 및 이들의 항산화 특성의 제거에 의한 것임을 주장한다. 이러한 연구에 흥미있는 특성은 C-피코의 경구 투여가 혈뇌 장벽을 가로지르는, 해마에서의 효과를 발휘한다는 발견이다. 이러한 발견 및 C-피코의 독성의 가상 부족은 산화 스트레스에 의해 유도 되는 뉴런 손상을 특징으로 하는 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 신경변성 질환의 치료에 광화학이 사용될 수 있음을 제안한다.

항알레르기 효과: 이미 상세히 언급된 항산화 특성에 의해 매개되는 C-피코의 항-염증 특성에도 불구하고, C-피코가 분리된 랫 비만 세포의 히스타민 방출 및 알레르기성 염증 반응을 유도함이 보고되었다(Remirez D, et al. Role of histamine in the inhibitory effects of phycocyanin in experimental models of allergic inflammatory response (2002) Mediators of Inflammation, 11: 81-85). "생체내" 실험에서, C-피코는 미리 오브알부민(Ova) 감작시킨 마우스의 귀에 Ova로 항원투여하기 1시간 전에 투여하였다. 1시간 후에, MPO 활성 및 부종을 귀에서 평가하였다. C-피코는 두 파라미터를 감소시키고 분리된 랫 복막 비만 세포의 히스타민 방출을 저해한다. C-피코의 효과는 투여량-의존성이다.

혈장 단백질에 대해 증가된 혈관 투과성은 이들이 랫 및 마우스에서 주로 히스타민 및 세로토닌인 형성된 혈관자가용성 매개체를 분비할 수 있으므로 비만 세포가 중요한 역할을 수행한다는 알레르기성 염증 작용의 특성이다(Halpern BN, et al. On the nature of the chemical mediators involved in anaphylactic reaction in mice. (1963) Br J Pharmacol 20: 389-398; Ohuchi K, et al. Pharmacological analysis of the vascular permeability response in the anaphylactic phase of allergic inflammation in rats (1985) Eur J Pharmacol 117: 337-345). 비만 세포가 또한 다른 것 중에서, IgE-의존 작용에서 분비될 수 있고 알레르기성 염증 작용 동안 비만 세포 작동체 및 면역조절 능력을 생성할 수 있는 TNF-α와 같은 미리-형성된 사이토카인, 혈관 투과성 인자/혈관 상피 세포 성장 인자를 포함함이 증명되었다. 이러한 작용에서 프로스타글란딘 D2, 류코트리엔(LTC4, LTD4, LTE4, LTB4) 및 혈소판 활성화 인자(PAF) alc 반응성 산소 종(ROS)와 같은 비만 세포로부터의 새로 합성된 지질 매개체의 참여 또한 중요하다(Williams CM, et al. The diverse potential effector and immunoregulatory roles of mast cells in allergic diseases. (2000) J Allergy Clin Immunol 105: 847-859; Fantozzi R, et al. Mast cell and neutrophil interactions: a role for superoxide anion and histamine. (1985) Agents Actions 16: 260-264). C-피코는 마우스 귀에서의 아라치돈산 유도 염증 검정에서 프로스타글란딘 D2 및 LTB4를 감소시킨다(Romay C, et al. Effects of phycocyanin extract on prostaglandin E2 levels in Mouse ears inflammation test. (2000) Arzneim Forsch/Drug Head 50: 1106-1109; Romay C, et al. Phycocyanin extract reduces leukotrienes B4 levels in arachidonic acid-induced mouse ear inflammation test (1999) J Phar Pharmacol 51: 641-642).

분리된 랫 비만 세포 히스타민 방출에서의 C-피코의 저해 효과는 항-염증 제제로서 P-피코의 작용의 메커니즘에서 이러한 사건에 기여한다는 것을 뒷받침한다.

과산화 음이온, 과산화 수소 및 퍼옥실 히드록시 라디칼과 같은 ROS가 아라키돈산 캐스캐이드, PAF 합성 또는 히스타민 방출을 시작한다는 증거가 있다. ROS가 히스타민, 세포토닌, TNF-α 및 다른 염증 매개체의 방출을 허용하는 비만 세포를 탈과립화시킴이 증명되었다. C-피코는 퍼옥시, 히드록시 및 알코올시 라디칼을 제거할 수 있다(Lissi EA, et al. Kinetics of phycocyanin bilin groups destruction by peroxyl radicals. (2000) Free Radic Biol Med 28: 1051-1055)

C-피코에 대하여 증명된 항산화, 항-염증 및 항-알레르기 특성이외에도, 항종양 특성도 관찰되었다.

항암 효과: Schwartz 등의 문헌(Schwartz J, et al. Regression of experimental hamster cancer by beta carotene and algae extracts. (1987) Oral J Maxillofac Surg; 45: 510-515)에서 DMBA(7, 12-디메틸벤즈-안트라신)에 의해 유도되는 인상 경구 암종에서 250 ㎍의 스피룰리나 추출물의 투여 효과를 연구하였으며, 다른 치료는 베타-카로틴, 칸타크산틴 및 13-시스-레티논산의 주입을 포함한다. 모든 치료는 4주 동안 주 2회 적용하였다. 치료의 마지막에서, 추출물로 처리한 동물의 30%, 베타 카로틴으로 처리한 동물의 20% 및 칸타크산틴으로 처리한 동물의 15%의 암의 완전한 퇴화가 나타난다. 추출물로 처리한 동물의 나머지 70%에서 부분적 종양 퇴화가 나타난다. 이 연구에서 흥미로운 관찰은 베타 카로틴보다 추출물에 더 효과적이라는 것이며 이는 조류의 여러 성분과의 시너지 효과를 제안한다. 동일한 그룹의 다른 연구(Schwartz J, et al. Algae-derived phycocyanin is both cytostatic and cytotoxic to oral squamous cell carcinoma (human or hamster)(1987). J Dent Head 66: 160)에서 이들은 조류로부터 유래된 C-피코가 인상 세포 암종(인간 및 햄스터)에 대항하는 세포증식억제 및 세포독성 능력을 갖는다.

연구(Liu AND, et al. Inhibitory effect of phycocyanin from Spirulina platensis on the growth of human leukemia K562 cells (2000) J Appl Phycol 12: 125-130)에서, 스피룰리나 플라텐시스로부터의 C-피코는 인간 백혈병 K562 세포주의 성장을 저해한다. C-피코의 효과가 of 20, 40, 80 and 169 mg^-1의 농도에서 반-고형 아가 배양물의 K562 세포의 성장에 따라 초기에 연구되었다. 결과는 C-피코가 80 및 160 mg^-1에서 관찰된 통게학적으로 의미있는 저해를 수반하는 투여량-의존 방식으로 K562 백혈병 세포의 성장을 저해함을 보여준다. C-피코의 효과는 또한 환원 염료 XTT 검정에서 세포 생존력을 사용하여 연구되었다. 다시 한번 C-피코가 투여량-의존 방식에서 세포 생존력을 저해한다. C-피코의 IC₅₀ 수치는 72.5 mg-1이다. 유동세포계수법 실험은 세포를 6일간의 80 mg-1의 C-피코와 함께 항온시켰을 때 G-1 기에서 K562 세포의 축적이 발생함을 나타내는 DNA의 분석에 기초한 것이다. G-1기에서 세포의 가장 높은 백분율은 C-피코의40 및 80 mg-1 농도에서 나타난다. DNA 단편화 분석은 전형적 아폽토시스 스텝핑 패턴을 보이며 이는 다른 메카니즘이 이 저해에 포함될 수 있음을 나타낸다.

초기 연구는 C-피코에 의한 COX-2의 선택적 저해를 보고하며(Reddy CM, et al. Selective inhibition of ciclooxygenase-2 by C-phycocyanin, a biliprotein from Spirulina platensis (2000) Biochem Biophys Res Commun 3: 599-603), 이러한 연구에서 및 이러한 특성에 기초하여 그룹(Bobbili V.V, et al. Phycocyanin-mediated apoptosis in AK-5 tumor cells involves down-regulation of Bcl-2 and generation of ROS. (2003) Mol Cancer Therapy 2: 1165-1170)은 조직구성 랫 종양 세포주에서 C-피코의 효과를 연구하였다. 아폽토시스가 항-종양 효과를 매개하지 않는다는 이전 연구의 결과로부터의 다른 의견은 C-피코가 AK-5 세포의 프로그래밍된 아폽토시스 사망을 유도한다는 것이다; 이 프로그램은 카스파제-3 활성화를 포함한다. C-피코에 의해 매개되는 아폽토시스 사망은 ROS의 생성을 통해 유도된다. 아폽토시스 저해제인 Bcl-2는 ROS 생성을 조절한다. Bcl-2로 트랜스펙션된 AK-5 세포는 C-피코에 의해 유도된 사망에 저항성을 갖는다. Bcl-2의 과-발현은 C-피코로 처리된 AK-5 세포에서의 ROS 생성을 저해하며, 이는 AK-5 세포에서 C-피코에 의해 유도된 아폽토시스가 유리 라디칼 생성의 조절을 통한 Bcl-2에 의해 저해됨을 증명한다. COX-2의 다른 저해제 뿐만 아니라 C-피코도 종양 세포에서 이의 아폽토시스 활성에 있어서 가능한 화학치료제로서 사용될 수 있다.

C-피코의 항-암 특성에서 가장 최근의 연구는 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 K562의 성장 및 증가에서 고도로 정제된 C-피코의 효과를 평가하는 Subhashini 등의 문헌에서 보고되었다 (Jagu Subhashini, et al. Molecular mechanisms in C-Phycocyanin induced apoptosis in human chronic myeloid leukemia cell line-K562. (2004) Biochem Pharmac 68: 453-462). 결과는 48시간에서 50 μM의 C-피코로 처리된 K562 세포의 증식에서의 상당한 감소(49%)를 나타낸다. 또한, 전자 현미경 및 형광 연구는 세포성 후퇴, 막 돌출 및 핵 응축을 나타낸다. C-피토로 처리된 세포의 게놈 DNA 전기영동은 아폽토시스 세포의 단편화의 전형적인 패턴을 보인다. 48시간 동안 25 및 50 μM의 C-피코를 수반한 아폽토시스 세포의 유동세포계수법 분석은 각각 서브 G0/G1기에서 14.11 및 20.93%의 세포를 보인다. K562 세포의 C- 피코로의 처리는 또한 사이토솔 및 폴리 (ADP) 리보스 폴리머라제(PARP)의 파열을 야기한다. 이 연구는 또한 친-아폽토시스 Bax에서의 어떠한 변화 없이 항-아폽토시스 Bcl-2의 감소를 보이므로, Bcl-2/Bax 비율은 아폽토시스에 유리하다. C-피코의 효과는 알려지지 않은 메커니즘을 통한 사이토솔 내로 C-피코의 유입에 의해 매개되는 것으로 보여진다. 현재 연구는 또한 C-피코가 미토콘드리아로부터 사이토솔로 방출되는 시토크롬 C, PARP의 파열 및 Bcl-2의 감소를 통한 K562에서의 아폽토시스를 유도함을 증명한다.

일본 특허에 따라(Dainippon Ink & Chemicals, Inc. (DIC). Anti-tumoral agents containing phycobillin. (1983) Japanese Patent Not. 58-65216) C-피코의 경구 투여는 간으로부터 종양 세포를 주사한 마우스의 생존률을 증가시킨다. 처리군에서의 림프구 활성은 대조군에 비해 매우 높으며, 이는 면역계의 자극의 특정 정도를 제안한다.

C-피코의 다른 특성은 다른 연구에서 증명되었다: 마우스 말초 혈액 및 조혈계의 골수에서의 C-피코 및 다당류의 예비 연구에서 C-피코가 높은 에리트로포이에틴(EPO)-유사 활성을 가짐을 증명하는 Cheng-Wu 등의 문헌(Cheng-wu Z, et al. The effects of polysaccharide and phycocyanin from Spirulina platensis on peripheral blood and hematopoietic system of bone marrow in mice. (1994). Book of Abstracts. Second Asia Pacific Conference on Algal Biotechnology; 58).

본 발명은 질환으로 인해 변화되는 항상성 기능 불균형의 회복을 위해 개체의 질환에 걸린 능력의 촉진, 방출 또는 회복을 목적으로 하는 생-조절 약학적 화합물의 용도를 기술한다.

화합물은 본 발명에서 증명된 천연 기원의 산물과 결합된 인터페론과에 속하는 단백질에 의해 형성되므로 이의 제형에서의 원료이며 자가면역 및 알레르기성 질환 및 암에서의 치료에서의 이의 효과에서 독창적이다.

본 발명의 화합물은 적절한 부형제와 함께 비경구 및 경구 투여를 위한 약학적 조합에 포함될 수 있는 알파 인터페론(IFN-α), 특히 재조합 IFNα-2b 및 C-피코사이신으로 구성되어 있다.

상기 언급된 약학적 조합은 단일 치료로 같은 개체에서 유효 성분의 개별 투여를 통한 치료방법으로서 사용할 수 있다.

실험적 자가면역 뇌염(EAE) 모델에서의 특별 연구에서, 조합의 성분은 다른 경로를 통해 투여된다: IFN-α를 복강내로 투여하고 C-피코시아닌을 동일 치료의 부분으로서 경구로 투여하였다. 다른 경로를 통한 성분의 개별 투여 및 동일 투여량을 사용하는 단일 경로를 통한 약학적 제형의 부분으로서의 투여는 많은 차이를 보이지 않는다. 이는 투여 경로가 영향을 미치지 않으며 또한 조합은 근육내, 정맥내, 피하, 경구, 비내 및 척수강내 경로를 통해 투여할 수 있음을 증명한다.

본 발명의 독창성은 적응성 및 천연 조절성 T 세포의 유도에서 IFN-α/C-피코 약학적 제형의 효과 및 이의 개별 유효 성분의 증명이다.

면역계의 이러한 중요 특성은 IFN-α에 대하여 이미 제안되었으나, 본 발명에서 IFN-α에 대한 증명 이외에 IFN-α/C-피코 약학적 화합물에서 두 성분의 시너지 효과를 증명하는, C-피코시아닌에 의한 조절성 T 세포의 유도를 처음으로 보고하였다. 이는 특히 질환의 재발 형태에서 질환의 발생을 예방하는 알레르기 및 자가면역 질환과 같은 조절성 T 세포(rTc)의 수 또는 작용의 감소를 나타내는 질환에서의 이의 용도를 뒷받침한다.

따라서, 본 발명을 통해 면역-조절에서의 손실에 기인한 알레르기 질환 및 자가면역 질환에서 분열되는 작동체-조절체 균형을 동시에 회복시킬 수 있으며 IFN-α 및 C-피코시아닌에 대한 문헌에서 기술된 항-염증성 면역조절 및 항산화 특성이 두 유효 성분의 조합에 의해 촉진된다.

다른 한편으로는, 본 발명은 항-증식, 항-산화 및 항-염증 특성 및 종양 세포 아폽토시스의 도입 능력에 관하여, 독립된 성분의 활성에 비교되는 약학적 IFN-α/C-피코 제형의 시너지 효과를 증명한다.

이러한 경우에서, 본 발명의 신규성은 약학적 화합물이 종양 세포에서 항-증식 및 아폽토시스 유도 특성에 관한 독립적인 성분일 때보다 상당히 높은 항-암 효과를 갖는다는 것을 보여준다는 것이다. 이는 G2/M 상에서의 세포성 사이클의 정지 및 DNA 손상에 이은 아폽토시스를 유지하기 위해 요구되는, p53 단백질 및 나중의 p21의 양성 조절에 의해 증명된다.

게다가, IFN-α/C-피코 화합물의 통계학적으로 의미있는 항-증식 및 투여량 의존 시너지 효과는 다른 생물의 종양 계통의 성장 저해를 보여준다.

C-피코의 가장 널리 연구된 효과 중 하나는 생체외 및 생체내 실험에서의 항산화 능력이다(Romay C, et al. Antioxidant and anti-inflammatory properties of C-Phycocyanin from blue-green algae (1998) Inflamm Head 47 (1):36-41). C-피코는 히드록시 및 알콕시 라디칼에 대해 특이적으로 사용되는 기타로서 동일한 스캐빈저 활성으로 히드록시 및 알콕시 라디칼을 제거할 수 있다. C-피코는 또한 간의 마이크로솜 과산화지방질을 저해한다(Halliwell B. How to characterize a biological antioxidant. (1990) Free rad Head Comm; 9: 1-32). C-피코의 종양 세포에서의 항염증, 면역조절 및 항증식 효과 및 아폽토시스 유도 능력은 이의 잠재적인 항산화 활성에 의해 주요 매개될 것으로 여겨진다. 이는 대부분의 신생물 과정이 만성 염증 성분 및 마크된 산화 스트레스를 발현하는 다른 요소를 갖기 때문에 C-피코의 항암 효과를 설명할 수 있다.

이는 세포성 사이클 및 아폽토시스 기작의 조절이 어떻게 신생물의 성장 및 발달에서 중요한지를 이해하기 위한 중요한 양상이다. 이러한 시그널링 포인트는 세포 손상이 회복되지 않을 경우 프로그래밍된 세포 죽음으로 유도되는 경로의 활성화로 바뀐다(Pietenpol JA, Stewart ZA. Cell cycle checkpoint signaling: cell cycle arrest versus apoptosis. (2002) Toxicology 181-182: 475-481).

종양 세포에서 IFN-α의 항-증식 및 아폽토시스 유도 효과는 매우 널리 알려져있다. 이들은 G1상의 연장, S상으로 들어가는 속도의 감소 및 S 및 G2상의 감소를 생성한다(Balkwill F, et al. Interferon affects both G1 and S+G2 in cells stimulated from quiescence to growth. (1978) Nature 274: 798-800). 종양 세포 뿐만 아니라 일반 세포에서 IFN-α의 세포 사이클의 연장의 누적 효과는 세포성색전, 즉 세포 크기 및 아폽토시스의 증가로 유도한다(Otsuki T, et al. Human myeloma cell apoptosis induced by interferon-a. (1998) BR J HAEMATOL 103: 518-529).

종양 세포는 IFN에 의해 조절되는 bcl2와 같은 세포암유전자가 발견될 수 있는 것 중에서 세포 사이클의 진행을 조절하는 하나 또는 그 이상의 단백질에서 변화를 전개한다(Koshiji M, et al. Apoptosis of colorectal adenocarcinoma (COLO201) by tumor necrosis factor-alpha and/or interferon-gamma resulting from down-regulation of Bcl-2 expression. (1998) Clin Exp Immunol 111: 211-218). 본 발명의 특정 실시예에서 시너지 및 투여량 의존 효과는 IFN-α/C-피코 조합에 의해 자극되었을 때 종양 세포 상의 bcl2의 음성 조절에서 증명되었다.

아폽토시스 유도에 대한 경로 중 하나는 FADD 사망 도메인을 포함하는 단백질의 회복 및 카스파제-8과 같은 카스파제의 결과적인 활성화를 나타내는 FasL으로의 Fas의 결합을 포함한다. IFN-α이 Fas의 발현을 양성적으로 조절하므로 IFN-α/C-피코 약학적 화합물이 종양 세포에서 Fas의 발현의 양성 및 상당한 조절을 생성함을 보이는 본 발명의 다른 특별 예에서 증명된 바와 같이 Fas에 의해 매개되는 아폽토시스 경로를 통해 작용될 수 있다.

COX-2는 널리 알려진 항-아폽토시스 분자이며 C-피코가 COX-2의 선택적 저해제이므로 종양 세포의 프로그래밍된 세포 죽음을 장려함이 보고되었다(Reddy CM, et al. Selective inhibition of ciclooxygenase-2 by C-Phycocyanin, to biliprotein from Spirulina platensis (2000) Biochem Biophys Head Commun 3: 599-603). 본 발명에서 또한 IFN-α/C-피코 화합물이 COX-2의 발현 수준을 상당히 감소시키며 투여량 의존 방식에서 이를 기술된 조합에 대한 종양 세포에서 아폽토시스 유도 효과를 설명할 수 있는 가능한 메카니즘으로 만드는 것을 증명할 수 있다.

Subhashini 등의 문헌(Jagu Subhashini, et al. Molecular mechanisms in C-Phycocyanin induced apoptosis in human chronic myeloid leukemia cell line-K562. (2004) Biochem Pharmac 68: 453-462)에 의해 실행된 연구는 C-피코가 미토콘드리아로부터 사이토졸로의 시토크롬-C의 방출 및 bcl-2에서의 감소에 의해 K562 세포주에서 아폽토시스를 유도함을 보여준다. 본 발명에서 상기 언급된 약학적 화합물이 시토크롬-C 발현의 유도 수준에서 이의 개별 성분에 비해 양성의 시너지 효과를 가지며 이로 인해 이러한 화합물에 의해 생성된 종양 세포의 아폽토시스의 유도를 위한 메카니즘으로서 간주됨을 보여준다.

임상 실행에서 호르몬, 화학요범 및/또는 IL-2와 IFN-α의 조합이 많은 유형의 종양으로의 환자의 반응을 증가시키고 생존을 연장시킬 수 있으나 치료 방법에서 이들의 혼입은 이들의 상대적 독성에 의해 제한됨이 증명되었다. 그러므로 본 발명은 이의 항-증식, 세포독성 및 항산화 효과에서 두 성분의 시너지 효과를 생성하는 것 이외에 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하고 이로 인해 임상학적 결과를 조절하는 본원에 기재된 약학적 화합물의 사용을 제안하며 C-피토의 무해함 및 독성 결여의 많은 증거가 존재한다.

도 1은 다발성 경화증(MS)을 갖는 환자에서 RT-PCR에 의해 천연 조절 T 세포(A 및 B) 및 적응성 조절 T 세포(C 및 D)의 마커 유전자의 발현에서 IFN-α/C-피코 조합 및 개별 치료의 효과를 나타낸 것이다.

도 2는 다발성 경화증을 갖는 환자에서 CD25/Foxp3에 관련된 IFN-α/C-피코 조합의 효과를 나타낸 것이다.

도 3a는 개별 유효 성분으로 처리된 말초 혈액 및 IFN-α/C-피코 조합으로 처리된 말초 혈액으로부터의 단핵 세포에서 CD4+ CD25+의 발현의 유동 세포계수법을 나타낸 것이며 도 3b는 개별 유효 성분 및 IFN-α/C-피코 조합의 CD4+ CD25+ 및 CD4+ CD25^high 세포의 유도 효과를 나타낸 것이다.

도 4는 류마티스 관절염을 갖는 환자에서 RT-PCR에 의해 천연 조절 T 세포(A 및 B) 및 적응성 조절 T 세포(C 및 D)의 마커 유전자의 발현에서 IFN-α/C-피코 조합 및 개별 치료의 효과를 나타낸 것이다.

도 5는 기관지 천식을 갖는 환자에서 RT-PCR에 의해 천연 조절 T 세포(A 및 B) 및 적응성 조절 T 세포(C 및 D)의 마커 유전자의 발현에서 IFN-α/C-피코 조합 및 개별 치료의 효과를 나타낸 것이다.

도 6은 HeLa 세포주에서의 증식을 저해하는 IFN-α/C-피코 조합의 투여량-반응 효과를 나타낸 것이다.

도 7의 A는 K562 세포주에서의 COX-2 및 Bcl-2 유전자의 발현에서 IFN-α/C-피코 조합 및 개별 유효 성분의 효과를 나타낸 것이며 도 7의 B는 K562 세포에서의 주COX-2 및 Bcl-2 유전자의 발현에서 IFN-α/C-피코 조합 및 개별 유효 성분의 시간-의존 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 세포주 K562에서의 Fas 유전자의 발현에서 IFN-α/C-피코 조합 및 개별 유효 성분의 효과를 나타낸 것이다.

도 9는 시토크롬-C 단백질의 발현에서 IFN-α/C-피코 조합 및 개별 유효 성분의 효과를 나타낸 것이다.

도 10은 ELISA HepG2 세포에 의해 정량된 단백질 p53(A) 및 P21(B)의 수준에서 IFN-α/C-피코 조합 및 개별 유효 성분의 효과를 나타낸 것이다.

도 11은 HepG2 세포주에서 ELISA에 의해 정량된 단백질 p53(A) 및 P21(B)의 수준에서 IFN-α/C-피코 조합 동역학을 나타낸 것이다.

실시예 1: EAE 의 모델에서 IFN -α/C- 피코 조합 및 이의 개별 유효 성분의 치료 효과.

IFN-α/C-피코 조합은 이의 치료 효과를 측정하기 위해 EAE의 생물모델에서 실험하였다:

130g 중량을 갖는 평균령의 암컷 루이스 랫을 0일 및 6일에 PBS(50%) 및 프라운트 완전 아쥬반트(50%) 내의 기니아피그 척수 균질화액 5mg으로 피하내 면역화시켰다. 치료 스케줄은 복강내 경로를 통해 IFN-α/C-피코 조합(200ng/kg/일-740ng/kg/일), 개별 유효 성분으로 IFN-α(200ng/kg/일)와 C-피코(200ng/kg/일) 및 위약(PBS)을 사용한 첫 면역화 후 10일에 시작하였다. 하기 임상 인덱스에 따라 질 한의 임상 전개의 평가를 통해 10일간 모니터링하였다: 0; 변화 없음, 1; 완전한 꼬리 마비, 2; 뒷다리 중 하나의 마비, 3; 뒷다리와 엉덩이의 완전한 마비, 4; 뒤쪽 1/4 및 앞쪽 1/4의 완전한 마비, 5; 사망. 체중 감소 및 방광이나 직장 괄약근 실금 또한 동물 질환의 임상 징조이며 상기 언급된 임상 인덱스에 0.5를 더하여 계산된다. 첫 면역화 후 40일에 동물을 마취시키고 희생시켜 각 동물의 뇌 및 척수를 조직병리학적 분석을 위해 처리하였다(10 포르말린%에서 고정, H&E 및 룩솔 블루 염색). 고려된 조직병리학적 표본은 혈관주위 염증 침윤, 탈수초 병변, 뉴런 또는 신경교 아폽토시스 및 성상세포 반응성의 수 및 크기이다. 모든 발견은 맹검으로 실행되었다.

표 1에서 보여지는 바와 같이, 이러한 동물들의 50%만이 질환에 취약한 형태이고 나머지는 질환에 걸리지 않았기 때문에, IFN-α/C-피코 조합은 EAE를 발생시키기 위해 유도된 실험 동물을 보호한다. 이는 질환의 발병율이 100%인 군(개별 유효 성분 및 위약으로 처리한 군)의 나머지는 그렇지 않았다. IFN-α/C-피코 조합으로 처리된 군의 임상 인덱스의 평균은 0.37±0.47이며 개별 유효 성분으로 처리된 군의 평균은 IFN-α에서는 1.37±1.7이고 C-피코에서는 1.5±1.6이며 위약으로 처리된 군에서의 평균은 1.7±1.4이다. 군당 8마리 랫을 사용하였으며 비교는 p<0.001을 갖는 뉴만 쿨스(Newman Keuls)의 다중 비교 테스트에 따라 실행하였다.

표 2에서 관찰되는 바와 같이, 다른 군으로부터의 동물의 뇌 및 척수의 병리학적 해부학 연구 결과는 성상세포 반응성이 같더라도 혈관주위 염증 침윤의 수 및 크기가 위약을 투여한 군에서보다는 치료학적 화합물로 처리한 군보다 적다(p=0.028 독립 시료 T 테스트).

이 실험은 IFN-α/C-피코 조합이 좀더 중한 임상 형태에서 질환의 발생으로부터 동물을 보호함을 증명한다.

실시예 2: 다른 투여 경로를 사용한 IFN -α/C- 피코 조합의 치료 효과.

성분에 대하여 다른 투여 경로롤 사용하여 IFN-α/C-피코 조합의 효과를 평가하기 위해, 130g의 평균 체중을 갖는 암컷 루이스 랫을 0일 및 6일에 PBS(50%) 및 프라운트 완전 아쥬반트(50%) 내의 기니아피그 척수 균질화액 5mg으로 피하내 면역화시켰다. 치료 스케줄은 다음과 같은 첫 면역화 후 10일에 시작하였다: I 군:복강내 경로를 통해 IFN-α/C-피코 조합(200ng/kg/일-7400ng/kg/일), II 군: IFN-α(200ng/kg/일)는 복강내로 투여되고 C-피코(7400ng/kg/일)는 위 삽관을 통해 투여되는 IFN-α/C-피코 조합 및 III 군: 위약(PBS). 이 치료 스케줄을 10일간 계속하였다. 임상 평가는 상기 실시예에 설명된 바와 같이 실행하였다.

결과는 표 3에 나타냈다. 둘 다 복강내로 또는 각각 복강내/경구 투여되는 IFN-α/C-피코 조합은 EAE의 발병을 위해 유도된 실험 동물을 보호한다. 두 경우 모두에서 동물의 100%가 발병한 위약 그룹에 비해 동물의 40%만이 질환이 발생하였다. 복강내로 IFN-α/C-피코 조합을 투여한 군의 평균 임상 인덱스는 0.37±0.17이고 경구로 IFN-α/C-피코 조합을 투여한 군의 평균 임상 인덱스는 0.35±0.11이며 위약군은 1.7±1.4이다. 군 당 8마리의 랫이 사용되었다. 군 사이의 비교는 통계학적으로 상당한 p<0.001이다. 뉴만 쿨스의 다중 비교 테스트를 사용하였다.

실시예 3: MS 환자의 단핵 세포에서 IFN -α/C- 피코 조합 및 이의 개별 유효 성분에 대한 천연 및 적응성 rTc 효과의 유도의 평가.

MS 환자에서 IFN-α/C-피코 조합 뿐만 아니라 이의 개별 유효 성분의 rTc 효과의 유도를 평가하기 위해, 20ml의 말초 혈액을 핵자기공명(Nuclear Magnetic Resonance; NMR)에 의해 임상적으로 정의된 재발-완화성 MS(relapsing-remitting MS; RRMS)를 갖는 10명의 환자 및 10명의 대조군(외관상으로 건강한 개체)으로부터 추출하고, 단핵 세포를 피콜 구배(Ficoll gradient, 독일 베를린 소재의 세로텍-바이오켐)를 사용하여 분리하여 이들을 RPMI 1640 배지에서 3x10⁶ 세포/군의 4개의 실험군으로 나누었으며 군들을 다음과 같이 처리하였다: 섭씨 37도 및 5% CO2에서 4시간동안 A) 세포 단독, B) 세포 + 5μM IFN-a2b, C) 세포 + 20μM C-피코, D) 세포 + 5μM IFN-a2b/20μM C-피코. 그 후에, 세포를 세척하고 총 RNA 추출을 트리-리전트 방법으로 수행하였다(Chomczynski P. TO reagent for the sail-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. (1993) BioTechniques, 15, 532-537). 역 전사-폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR)(키트 RT-PCR 코어 퍼킨 엘머)을 1㎍의 총 RNA/실험군을 사용하여 실행하였다. RT-PCR 반응을 20㎕의 총 부피로 실행하였으며 각각 10㎕의 두 PCR 반응으로 나누었다. 반응의 프라이머를 천연 및 적응성 rTc의 마커의 증폭을 위해 사용하였다. 사용된 올리고누클레오티드는 참조로서 생명공학 정보 국립 센터(NCBI)의 데이타베이스의 서열을 사용하여 설계하였다; 이는 하기와 같이 설명된다:

CD25: 위치 618 내지 637의 20 베이스페어(bp)의 올리고 5'-서열. 위치 1053 내지 1072의 20bp의 올리고 3'-서열, 이들은 기탁번호 NM_000417을 갖는 454bp의 서열의 밴드를 증폭시킨다.

Foxp3: 위치 482 내지 501의 20bp의 올리고 5'-서열. 위치 762 내지 781의 20bp의 올리고 3'-서열, 이들은 기탁번호 NM_014009를 갖는 299bp의 서열의 밴드를 증폭시킨다.

IL-10: 위치 358 내지 377의 20bp의 올리고 5'-서열. 위치 687 내지 709의 22bp의 올리고 3'-서열, 이들은 기탁번호 NM_000572를 갖는 351bp의 서열의 밴드를 증폭시킨다.

TGF-β: 위치 1209 내지 1227의 19bp의 올리고 5'-서열. 위치 1564 내지 1582의 19bp의 올리고 3'-서열, 이들은 기탁번호 NM_000660을 갖는 373bp의 서열의 밴드를 증폭시킨다.

GAPDH: 위치 386 내지 403의 18bp의 올리고 5'-서열. 위치 561 내지 580의 20bp의 올리고 3'-서열, 이들은 기탁번호 NM_002046을 갖는 164bp의 서열의 밴드를 증폭시킨다.

GAPDH를 PCR 산물이 이동되는 2% 아가로스 겔의 밀도계측으로부터 분자 분석 소프트웨어로 수득된 상대 수치를 일반화하기 위한 구성적 발현의 유전자로서 사용하였다.

결과는 GAPDH로 일반화된 RNA의 상대 수치의 평균 또는 중앙값으로서 나타내었다; 평균 또는 중앙값은 세포만을 갖는 대조군과 비교되는 3개의 처리된 실험군에 비교되었으며 상응하는 통계 p 수치는 환자 및 대조군에서 계산되었다. 도 1의 A, B, C 및 D에서 보여지는 바와 같이, 세포가 개별 유효 성분 및 조합으로 처리되었을 때 발견되는 이들의 마커의 증가에 의해 발현되는 rTc 유도 효과가 있으며, 이는 IFN-α/C-피코 조합으로 처리한 후에 CD25에서 p=0.023 (쌍비교 t 테스트) (A), Foxp3에서 p=0.037 (쌍비교 t 테스트)(B), IL-10에서 p=0.015(쌍비교 t 테스트)(C) 및 TGFβ에서 p=0.025(윌콜슨)(D)의 수치를 갖는 통계학적으로 상당한 차이를 나타낸다. 이는 환자 및 대조 둘다에서의 rTc 유도에 대하여 IFN-α/C-피코 조합의 시너지 효과가 있음을 보여준다.

CD25 및 Foxp3 유전자에 대하여 통계학적으로 상당한 차이를 보이는 것 이외에 IFN-α/C-피코 조합으로 처리된 세포는 CD25/Foxp3 관계에 대하여 양성의 선형 상호관계를 보이며, 이는 조절 T 세포 및 비활성 T 세포임을 나타내는 p=0.022의 수치로 통계학적으로 의미있다(도 2 참조).

CD4+ CD25+ 세포의 유도는 또한 RRMS 환자 및 대조로부터의 말초 혈액의 단핵 세포에서 유동 세포계수법(FACS)에 의해 증명되었다. 이러한 실험에서, 10⁵ 세;포/웰을 96 웰 세포 배지 플레이트(COSTAR)에서 실험군 당 이중으로 접종하였다. 실험군은 다음을 포함한다: A) 세포 단독, B) 세포 + 5μM IFN-a2b, C) 세포 + 20μM C-피코, D) 세포 + 5μM IFN-a2b / 20μM C-피코. 세포는 섭씨 37도 및 5% CO₂에서 72시간 동안 처리하였다. 그 후에, 세포를 세척하고 항-CD-PE(세로텍) 및 항-CD25-Cy5(세로텍) 항체와 함께 항온한 후 FACS에서 판독하였다.

결과는 개별 성분에 대한 CD4+ CD25+ 및 CD4+ CD25^high 세포의 유도 효과를 보이며 환자 및 대조에서 IFN-α/C-피코 조합에 대하여 더욱 높다(본 발명에서 나타나는 결과는 세 환자 및 세 대조를 나타낸다). IFN-α/C-피코 조합의 유도 효과는 최대 생물학적 수치 가능성에 이른다(도 3A 및 도 3B).

실시예 4: 류마티스 관절염을 갖는 환자의 단핵 세포에서 IFN -α/C- 피코 조합 및 이의 개별 유효 성분의 천연 및 적응성 rTc 의 유도 효과의 평가.

마커 유전자에서 rTc의 효과의 평가에서 과정은 상기에 기재된 바와 동일하며 여섯 환자 및 여섯 대조를 사용한다.

결과는 RT-PCR 섹션에서 설명된 바와 같이 표현되었다. 도 4에 보여진 바와 같이, 세포를 개별 유효 성분 또는 조합 중 하나로 처리했을 때 이의 마커에서의 증가에 의해 발현되는 rTc의 유도 효과가 나타난다. 유도 효과가 모든 경우에서 발견되었으며, 이는 IFN-α/C-피코 조합의 처리에서 CD25는 p = 0.016 (쌍비교 t)(A), Foxp3은 p = 0.029 (쌍비교 t)(B), IL-10은 p = 0.034 (쌍비교 t)(C) 및 TGF-β는 p = 0.028 (윌콕슨)(D)의 수치로 통계학적으로 의미있음을 보여준다. rTc 유도 효과를 보이는 개별 유효 성분으로 세포를 처리했지만, 차이는 평가된 어떠한 유전자에 대하여 통계학적으로 의미가 없으나, IFN-α/C-피코 조합의 시너지 효과는 대조에서와 마찬가지로 환자에서도 항상 발견된다.

실시예 5: 기관지 천식으로 환자의 단핵 세포에서 IFN -α/C- 피코 조합 및 개별 유효 성분의 천연 및 적응성 rTc 유도 효과의 평가.

실험 변화는 RT-PCR 절차 및 데이타 프로세싱과 마찬가지로 상기 설명된 바와 같다. 여섯 환자 및 여섯 대조가 연구되었다.

결과는 환자 및 대조에서 천연 및 유도 rTc 둘 다의 유도 효과를 보이며, CD25에서 p = 0.012 (쌍비교 t 테스트), Foxp3에서 p = 0.009 (쌍비교 t 테스트), IL-10에서 p = 0.037 (쌍비교 t 테스트) 및 TGF-β에서 p = 0.021 (윌콕슨)의 수치를 보이는 IFN-α/C-피코 조합으로 처리된 세포에서 통계학적으로 의미있는 것이다(도 5).

실시예 6: 종양 세포주에서 IFN -α/C- 피코 조합 및 이의 개별 유효 성분의 항-종양 효과의 평가.

IFN-α/C-피코 조합뿐만 아니라 이의 독립적인 성분의 항-종양 활성은 종양 세포에서 항-증식 및 세포독성 활성 및 아폽토시스 유도의 평가를 통해 발현되었다.

IFN-α/C-피코 조합 및 이의 개별 유효 성분의 항-증식 및 세포독성 활성의 평가에서 여러 인간 종양 세포주를 생체외에서 사용하였다: HeLa (인간 경부전근 암종), HepG2 (인간 간암), A375 (인간 흑색종), HL60 (인간 친-골수구 백혈병), K562 (인간 적백혈병), PBMC (말초 혈액으로부터의 단핵 세포). 세포를 96 월 플레이트(코스타)에서 종양 세포주에 대하여 2000 세포/웰 및 BPMC에 대하여 20,000 세포/웰로 배양하였다. 세포 증식의 저해를 Mosmann 등의(Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. (1983) J IMMUNOL METHODS 65: 55-63)에 기재된 바와 같이(변형 있음) 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5 디페닐테트라졸리움 브로마이드 분석(MTT; 미국 미주리 세인트루이스 소재의 시그마 케미칼 컴퍼니)을 통하여 평가하였다. 평가된 모든 세포주를 각 세포주에 대한 적절한 배양 배지에 상기 언급된 세포의 총량에 이르도록 배양하였는데 100㎕/웰을 첨가하고 이들을 섭씨 37도 및 5% CO2에서 24시간 동안 항온하였다. 그런 다음, 배양 배지를 이중으로 다른 치료를 포함하는 다른 배지로 교체하였다: A) 세포 단독, B) 세포 + 5μM IFNa-2b, C) 세포 + 20μM C-피코, D) 세포 + 5μM IFNa-2b/20μM C-피코. 처리된 세포를 동일한 조건 하에서 다시 48시간 동안 항온하였다. 그 후에, MTT를 첨가하고 가용성 산물을 540nM에서 플레이트 판독기(Multiscan, Titertek에서 판독하였다.

결과는 표 4에 나타냈다. 이들은 세포 단독을 갖는 대조에 비해 세포 증식의 저해를 %로 표현하였다. 세포 증식의 저해를 모든 종양 세포주에서 발견하였으며 BPMC에서는 적게 발견되었다. IFN-α/C-피코 조합의 시너지 효과가 개별 유효 성분에 비해 세포 증식의 저해에서 또한 나타난다. 이 효과는 HeLa 세포주 및 A375에서 더 좋다.

도 6은 HeLa 세포주에서 증식의 저해에서 IFN-α/C-피코 조합의 투여량-의존 효과를 보여준다.

IFN-α/C-피코 조합 및 이의 개별 유효 성분에 의한 아폽토시스 활성의 유도 또한 RT-PCR에 의한 COX-2 및 Bcl-2 유전자의 발현 및 웨스턴 블롯에 의해 시토크롬-C 단백질의 발현에서 그들의 효과를 통해 평가하였다.

RT-PCR을 실행하기 위해 퍼킨 엘머 키트를 사용하였다. 각 경우에서 K562 t세포주로부터 추출한 총 RNA/실험적 변수의 1㎍로부터 시작하였다. RT 반응을 각 10㎕의 두 PCR 반응으로 나중에 나누어지는 20㎕의 총 부피에서 실행하였다. PCR 산물이 분리되는 아가로스 겔의 밀도계측으로부터 분자 분석 소프트웨어로 수득되는 상대 수치를 일반화하기 위해 GAPDH구성 발현의 유전자로서 사용하였다.

IFN-α/C-피코 조합의 효과를 COX-2 및 Bcl-2의 유전자의 발현에 의해 평가하는데 105 세포/실험 변수를 하기를 사용하여 8시간 동안 배양하였다: 보충물 없는 RPMI 1640 배지/10% 우태아 혈청에서 A) 세포 단독, B) 세포 + 5μM IFNa-2b, C) 세포 + 20μM C-피코, D) 세포 + 5μM IFNa-2b/20μM C-피코.

결과는 COX-2 유전자의 발현에 있어서 p=0.011(ANOVA. 세포 단독 대 IFN-α/C-피코 조합) 및 Bcl-2 유전자의 발현에 있어서 p=0.009(ANOVA, 세포 단독 대 IFN-α/C-피코 조합)으로통계학적으로 의미있는 IFN-α/C-피코 조합의 시너지 저해 효과뿐만 아니라 개별 유효 성분의 저해 효과를 보이며 널리 알려진 항-아폽토시스 분자이다(도 7A).

게다가, K562 세포주에서의 유전자 COX-2 및 Bcl-2의 저해에서 IFN-α/C-피코 조합의 시간-의존 효과를 증명하였다(도 7B).

아폽토시스의 유도를 위한 경로 중 하나는 Fas의 FasL로의 결합응ㄹ 포함한다. Fas는 INF-α에 의해 양성적으로 조절되며(Gordon M, Marley SB, Lewis JL, et al.) The treatment with interferon-alpha preferentially reduces the capacity for amplification of the granulocyte-macrophage progenitors (CFU-GM) from patients with chronic myeloid leukemia but spares normal CFU-GM. (1998) J Clin Invest 102:710-715), 이 사건은 Fas에 의해 매개되는 아폽토시스를 촉진하고(Selleri CMJ, Pane F, Luciano L, et al. Fas-mediated modulation of bcr/abl in chronic myeloid leukemia results in differential effects on apoptosis (1998) Blood 92: 981-989), 본 발명에서 IFN-α/C-피코 조합이 IFN-α 단독일 경우에 비해 Fas의 양성 조절 효과를 가지는지를 연구하였다. 실험 변형은 상기 실시예에 기재된 바와 같이 실행되었다. K562 세포주의 10⁵/실험 변수를 다른 처리로 4시간 동안 배양하고 Fas의 발현 수준을 상기 섹션에서 설명된 바와 같이 RT-PCR로 측정하였다. 결과는 p=0.042(ANOVA, 세포 단독 대 IFN-α)의 수치를 갖는 Fas 유전자에서 IFN-α에 대하여 통계학적으로 의미있는 자극 효과관찰된 도 8에 나타내었다. C-피코 또한 Fas를 양성적으로 조절하였으나 차이는 통계학적으로 의미없으며 Fas의 시너지 양성 조절이 p=0.009(ANOVA 세포 단독 대 IFN-α/C-피코 조합)의 수치를 갖는 이러한 세포주에서 IFN-α/C-피코 조합에 의하여 관찰되었다.

웨스턴 블롯을 단백질 수준에서 시토크롬-C 발현에서의 IFN-α/C-피코 조합 효과의 평가를 위해 사용하였다(Chandra J, et al. Proteasoma inhibitors induce apoptosis in glucocorticoid-resistant chronic lymphocytic leukemia lymphocytes. (1998) Blood 92: 4220). 상기 설명된 바와 같이 처리된 K562 세포로부터의 5㎍ 단백질/실험 변수를 24시간 동안 배양하고 15% 아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE 전기영동으로 분리하였다. 그런 다음 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고 특정 단백질을 항-시토크롬-C 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였다.

결과를 도 9에 나타냈으며 이는 K562 세포에서 IFN-α/C-피코 조합에 의해 유도되는 아폽토시스 효과의 매개체가 되는 것을 가능하게 하는, 시토크롬-C 발현에서 통계학적으로 의미있는 ANOVA(세포 단독 대 IFN-α/C-피코 조합) p=0.006을 갖는 유도성 시너지 효과를 가짐이 발견되었다.

p53 및 p21 단백질은 G2/M 상에서의 세포 사이클의 저지 및 DNA 손상 후 아폽토시스를 유지하기 위해 필수적인 것이다.

ELISA를 p53 및 p21 단백질의 발현의 검출에 사용하였다(Molecular Roche Biochemical, Germany for p53 and Calbiochem, Cambridge, MA, USES for p21). 30ngI FNa-2b/50μM C-피코 조합 또는 개별 성분을 도 7A에 보여진 실험에서 상기 언급된 농도로 및 도 7B에 보여진 실험에서 6, 12, 24 및 48시에 세포를 처리하였다. 시료를 항-p53 또는 항-p-21 모노클로날 항체로 코팅한 96 웰 플레이트에 특이 바이오틴화 항체를 갖는 단백질의 동일량을 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 항온한 후, 스트렙타비딘-페록시다제 접합체를 첨가하였다. 흡광도를 450nm에서 측정하고 농도를 알려진 농도의 두 단백질의 표준 곡선의 외삽법에 의해 결정하였다.

본 발명에서 독립 성분일 때와 비교한 IFN-α/C-피코 조합의 통계학적으로 의미있는 시너지 효과는 인간 간암의 HepG2 세포주에서 ELISA에 의해 검출된 p53 단백질의 유도에서 p=0.026 및 p21 단백질의 발현의 수준에서 p=0.041(ANOVA 세포 단독 대 IFN-α/C-피코 조합)을 보인다(도 10).

6시간 처리 후 IFN-α/C-피코 조합으로 처리한 세포에서 p53의 수준(도 11A)은 세포 단독일 때보다 4배 높으며 이는 조합으로 12시간 동안 처리한 후 상향-조절을 유지한다. 이러한 결과는 p53 단백질 발현에서의 증가는 HepG2 세포의 아폽토시스에서 중요한 역할을 할 수 있음을 제안한다.

아폽토시스 유도는 p21 단백질에 대해 코드하는 유전자로서 p53을 포함하는 시그널링 캐스캐이드으로부터 다운스트림인 표적 유전자의 음성 조절에 관계된 것이다. 본 발명에서 p21 단백질의 발현의 음성 조절에서 IFN-α/C-피코 조합의 시간 의존 효과를 보인다. 이러한 증가는 IFN-α/C-피코 조합으로 12시간 동안 세포를 처리한 후에 일어난다(도 11B). 12시간 동안 IFN-α/C-피코 조합로 처리한 HepG2 세포는 p21 단백질의 발현을 4배 증가시킨다.

p53의 발현 피크(6시간)는 p21 단백질의 발현 피크(12시간)보다 빠르며, 이는 IFN-α/C-피코 조합으로 세포를 처리함에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 시그날 형질도입 메카니즘에서 p21 이상으로 수행되는 p53의 가능한 역할을 제안한다.

Claims (12)

1. 자가면역, 알레르기 및 암의 치료에 유용한, 인터페론 과(family)의 단백질 및 담즙 색소를 포함함을 특징으로 하는 약학적 화합물.
2. 제1항에 있어서, 재조합 방식에 의해 수득되거나 폴리에틸렌글리콜화 또는 다른 단백질과의 결합에 의해 변형된, 인터페론 성분이 IFNα-2b임을 특징으로 하는 약학적 화합물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 담즙 색소가 C-피코시아닌임을 특징으로 하는 약학적 화합물.
4. 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제형은 비경구 및 경구 투여용임을 특징으로 하는 약학적 화합물.
5. 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유효 성분이 치료 방법 또는 약학적 조성물로서 하나의 개체로 분리되어 투여될 수 있음을 특징으로 하는 약학적 화합물.
6. 제5항에 있어서, 조성물의 두 성분 모두를 동일한 치료 방법의 일부로서 각 개체를 다른 경로로 사용함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, IFNα-2b를 비경구 경로로 투여하고 C-피코시아닌을 경구 경로로 투여함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
8. 근육내, 정맥내, 피하, 경구, 비내 및 경막내로 투여할 수 있는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 약학적 화합물 또는 조성물의 용도.
9. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 질환이 다발성 경화증, 류마티스 관절염 또는 천연 및/또는 적응성 조절 T 세포의 수 또는 기능을 감소시키는 그외 질환인 약학적 화합물의 용도.
10. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환의 재발 형태에서의 재발을 예방하기 위한 약학적 화합물의 용도.
11. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 관지 천식 또는 천연 및/또는 적응성 조절 T 세포의 수 또는 기능을 감소시키는 그외 질환과 같은 알레르기 질환의 치료를 위한 약학적 화합물의 용도.
12. 항증식성, 세포독성 및 종양 세포 아폽토시스에 관한 유효 성분들의 시너지 효과에 의해 다른 기원의 악성 종양에 적용되는, 상기 항 중 어느 한 항의 약학적 화합물의 용도.

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