WO2007046417A1 - L-アラビノースをα－ケトグルタル酸に変換する方法、この方法に使用する酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え微生物 - Google Patents

L-アラビノースをα－ケトグルタル酸に変換する方法、この方法に使用する酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え微生物 Download PDF

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arabinose
converting
enzyme
dehydrogenase
protein
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PCT/JP2006/320744
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Keisuke Makino
Tsutomu Kodaki
Seiya Watanabe
Hiroo Wada
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Shinwa Chemical Industries, Ltd.
Kyoto University
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for converting L-arabinose into a-ketoglutaric acid, an enzyme used in this method, a gene encoding the enzyme, and a recombinant microorganism containing the gene. It is based on the discovery of a new metabolic pathway of L-arabinose, which accounts for the majority of the pentose together with D-xylose among the plant constituents. More specifically, a novel enzyme involved in a novel metabolic pathway, a gene encoding the same, a vector containing the gene, a microorganism containing the vector, and L-arabinose enzymatically converted to ⁇ -ketoglutarate using the microorganism. It relates to the method of conversion.
  • the main raw materials for ethanol biofermentation include sugar-producing plants such as sugar cane and sugar beet, and corn and rice. These biomass raw materials are mainly composed of hexose sugars (D-glucose, D-galactose, fructose), and any Escherichia coli and yeast that are mainly used as ethanol fermentation species (microorganisms) can be converted to ethanol. Is possible.
  • Woody biomass is composed of lignocellulose, which is cellulose (about 45%). %), Hemicellulose (about 30%), and lignin (about 25%). Of these, cellulose and hemicellulose can be decomposed to monosaccharides by supercritical water, acid hydrolysis or enzymatic degradation.
  • Cellulose is also composed of linear D-glucose force, whereas hemicellulose has a chain structure containing pentose (mainly D-xylose and L-arabinose) in addition to hexose. ing.
  • pentose sugars have lower metabolic efficiency in microorganisms than hexose sugars
  • establishing an efficient conversion method from pentose sugars to ethanol is one of the most important propositions for the use of woody biomass. is there.
  • yeast is the solution to this proposition because of its inherently high ethanol fermentability and ethanol resistance! Although it is a beautiful species, it has a major problem that it cannot metabolize pentose at all, and efforts to put it to practical use have gone beyond colonic bacteria.
  • L-arabinose another pentose sugar
  • D-xylose the metabolic pathway of L-arabinose differs between bacteria and strength.
  • L-arabinose was isomerized by L-arabinose isomerase into L-ribulose, which was then phosphorylated by rib-mouth kinase and converted to L-ribulose 5-phosphate. Later, it is finally converted to D-xylulose 5-phosphate by isomerism with L-ribulose phosphate 4-epimerase, and enters the pentose phosphate circuit like D-xylose (Fig. 1A).
  • L-arabinose metabolic pathway from fungi has been hypothetical for a long time, but all of the pathways from Hypocrea jecorina, a type of Ascomycete, are included in this pathway.
  • the gene was recently isolated (Non-patent Documents 3 to 5).
  • L-arabinose is divided into four acid reductases (aldose reductase, L-arabitol dehydrogenase, L-xyl mouth reductase), L-arabitol, L-xylulose, It is converted to D-xylulose via D-xylitol, and finally phosphorylated to D-xylulose 5-phosphate (Figure 1B).
  • this aldose reductase can also reduce D-xylose and convert it to D-xylitol (L-arabinose / D-xylose reductase), so the fungal D-xylose metabolic pathway and L-arabinose metabolic pathway are compared.
  • the only genes specifically required for the latter are L-arabiditol dehydrogenase and L-xylulose reductase. Therefore, the yeast genes into which xylose reductase and xylitol dehydrogenase were introduced were further incorporated with the genes of both enzymes, and the presence or absence of ethanol fermentation was examined. This recombinant yeast was able to grow on L-arabinose, but its ethanol conversion efficiency was extremely low as in the case of D-xylose (Non-patent Document 6).
  • L-alapino- ⁇ -latatatone is hydrolyzed by L-arabinolactonase to become L-arabonate, and then dehydrated with L-arabonate dehydrase to give L-2-keto-3-deoxylabonate. (L-KDA).
  • L-KDA L-alapino- ⁇ -latatatone
  • L-KDA is aldol cleaved by L-KDA aldolase to produce pyruvic acid and daricolaldehyde (path 2).
  • Non-Patent Documents 7 to 15 any (virtual) gene involved in pathways 1 and 2 has not been isolated.
  • Non-Patent Document 1 Jeffries, TW, and Jin, YS (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 63, 4
  • Non-Patent Document 2 Sedlak, M., and Ho, NW (2001) Enzyme Microb. Technol. 28, 16-24
  • Non-Patent Document 3 Richard, P., Londesborough, J., Putkonen, M., Kalkkinen, N ., and Pentittila, M. (2001) J. Biol. Chem. 276, 40631-40637
  • Non-Patent Document 4 Richard, P., Putkonen, M., Vaananen, R., Londesborough, J., and Penttila, M. (2002) Biochemistry 41, 6432-6437
  • Non-Patent Document 5 Verho, R., Putkonen, M., Londesborough, J., Penttila, M., and Richar d, P. (2004) J. Biol. Chem. 279, 14746-14751
  • Patent Document 6 Richard, P., Verho, R., Putkonen, M., Londesborough, J., and Penttil a, M. (2003) FEMES Yeast Res. 3, 185—189
  • Non-Patent Document 7 Welmberg, R., and Doudoroif, M. (1955) J. Biol. Chem. 217, 607-624
  • Non-Patent Document 8 Welmberg, R. (1961) J. Biol. Chem. 236, 629 -635
  • Non-patent document 9 Dagley, S., and Trudgill, PW (1965) Biochem. J. 95, 48-58
  • Non-patent document 10 Dahms, AS, and Anderson, RL (1969) Biochem. Biophys. Res. .36, 809-814
  • Non-Patent Literature l l Pedrosa, F.O., and Zancan, G.T. (1974) J. Bacteriol. 119, 336-338
  • Non-Patent Literature 12 Duncan, M.J. (1979) J. Gen. Microbiol. 113, 177-179
  • Non-Patent Document 13 Duncan, M.J., and Fraenkel, D.G .. (1979) J. Bacteriol. 137, 415—41
  • Non-patent literature 14 Novick, NJ, and Tyler, ME (1982) J. Bacteriol. 149, 364-367
  • Non-patent literature 15 Mathias, AL, Rigo, LU, Funayama, S "and Pedrosa, FO (1989) J Bacteriol. 171, 5206-5209
  • An object of the present invention is to provide a method for converting L-arabinose into a-ketoglutaric acid.
  • Another object of the present invention is to provide a method for converting L-arabinose to pyruvate.
  • Another object of the present invention is to provide an enzyme used in the above method, a gene encoding the enzyme, It is to provide a vector containing a gene and a recombinant microorganism transformed with the vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for converting L-arabinose into ⁇ -ketodaltaric acid or pyruvic acid using the above recombinant microorganism.
  • the present invention is based on the discovery of a novel metabolic pathway of L-arabinose, which occupies most of the pentose together with D-xylose among plant constituents. More specifically, a novel enzyme involved in the novel metabolic pathway shown below, a gene encoding the same, a vector containing the gene, a microorganism containing the vector, and L-arabinose using the microorganism to convert ⁇ -ketoglutin A method for enzymatic conversion to taric acid or pyruvic acid is provided.
  • a method for converting L-arabinose into ⁇ -ketoglutaric acid comprising the following steps.
  • a method for converting L-arabinose into pyruvic acid comprising the following steps.
  • L-alapinose 1 dehydrogenase that catalyzes the process of converting L-arabinose to L-alapino- ⁇ -latataton.
  • L-arabonate dehydrase that catalyzes the process of converting L-arabonate to L-2 keto-3 deoxylabonate.
  • L-2-keto-3-deoxylabonate dehydrase catalyzing the process of converting L-2-keto-3-deoxylabonate to ⁇ -ketoglutarate semialdehyde.
  • a vector comprising at least one of the genes described in 8 to 12 above.
  • a vector comprising the operon according to 13 above.
  • microorganism according to 18 above, wherein the microorganism is yeast or Escherichia coli.
  • a suitable bacterium having a novel L-arabinose metabolic pathway 1 is Azospirillum brasiliense (hereinafter sometimes referred to as A. brasiliense). Since no information on the five genes contained in this pathway and their amino acid sequences has been known at all, the purification of each enzyme is basically performed using the enzymatic activity as an index from the cell-free extract of the cultured bacterium. Then, a DNA primer is designed based on the partial amino acid sequence of the purified enzyme, PCR is performed using the genomic DNA of this bacterium as a cocoon, and a part of the gene is amplified. Using the amplified DNA fragment as a probe, the entire genome library of this bacterium is You can isolate the length and determine the nucleotide sequence.
  • A. brasiliense Azospirillum brasiliense
  • any bacteria can be used as long as the existence of pathway 1 has been suggested so far.
  • Pseudomonas saccharophila Herbaspirillum seropedicae, Rhi zobium meliloti and the like.
  • the L-arapinose-1 dehydrogenase that catalyzes the process of converting L-arabinose to L-alapino- ⁇ -latataton includes the AraA protein (SEQ ID NO: 8) of the present invention and analogs thereof.
  • AraA protein SEQ ID NO: 8
  • protein analog means an amino acid sequence in which a part of the amino acids constituting the protein is deleted, substituted with Z or another amino acid, and inserted with Z or another amino acid. And a protein having substantially the same enzyme activity as the original protein.
  • L-arapino lactonase which catalyzes the process of converting L-alapino ⁇ -latataton to L-arabonate, includes the AraB protein of the present invention (SEQ ID NO: 12) and analogs thereof.
  • the L-arabonate dehydrase that catalyzes the process of converting L-arabonate to L-2 keto 1-3 deoxylabonate includes the AraC protein of the present invention (SEQ ID NO: 6) and analogs thereof. It is done.
  • AraD protein As an L-2 keto-3 deoxylabonate dehydrase that catalyzes the process of converting L-2 keto-3 deoxylabonate to ⁇ -ketoglutarate semialdehyde, AraD protein (SEQ ID NO: 7), and analogs thereof.
  • Examples of the a-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase that catalyzes the step of converting a-ketoglutarate semialdehyde to ⁇ -ketoglutarate include the AraE protein of the present invention (SEQ ID NO: 14) and analogs thereof.
  • Examples of the gene encoding L-arabinose 1-dehydrogenase of the present invention include the AraA gene of the present invention (3073 to 4002 of SEQ ID NO: 5) and analogs thereof.
  • “gene analog” means that a part of the nucleotides constituting the gene is missing, substituted with Z or other nucleotides, and Z or other nucleotides are inserted.
  • Examples of the gene encoding L-arabinolactonase of the present invention include the AraB gene of the present invention (7777 to 8679 of SEQ ID NO: 5) and analogs thereof.
  • Examples of the gene encoding the L-arabonate dehydrase of the present invention include the AraC gene of the present invention (SEQ ID NO: 5: 252 to 2003) and analogs thereof.
  • Examples of the gene encoding the L-2-keto-3 deoxylabonate dehydrase of the present invention include the AraD gene of the present invention (2107 to 3036 of SEQ ID NO: 5) and analogs thereof. .
  • Examples of the gene encoding the a-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase of the present invention include the AraE gene of the present invention (SEQ ID NO: 13) and analogs thereof.
  • L-arabinose operon of the present invention examples include those having the base sequence (SEQ ID NO: 5) shown in FIG.
  • the present invention provides a vector comprising at least one of the above genes.
  • vectors that can be used in the present invention include plasmids, phages and the like. Specifically, pGEM-T (Promega), pBluescript SK (-) (Stratagene), pQE-80L (Qiagen), yeast Plasmid vectors and the like.
  • the present invention further provides a microorganism transformed with the vector.
  • host microorganisms that can be used in the present invention include Escherichia coli and yeast. Of these, yeast is most preferred.
  • yeast to be used is not particularly limited, but particularly preferred is a yeast of the genus Saccharomyces, which is most preferable for Saccharomyces cerevisiae! / ⁇ .
  • the present invention provides a method for producing the enzyme, wherein the microorganism is cultured.
  • Microorganisms should be cultured under the same conditions as the host microorganisms.
  • the present invention provides a method of finally converting arabinose to ⁇ -ketoglutarate or pyruvate using the above enzyme.
  • the method for converting arabinose to ⁇ -ketoglutarate is preferably performed using an enzyme that catalyzes steps ( ⁇ ) to ( ⁇ ). Is desirable.
  • the method for converting arabinose into pyruvate is preferably performed using an enzyme that catalyzes steps (A) to (C) and (F).
  • Each step of the above reaction may be performed sequentially for each step, or may be performed in a reaction system containing two or more enzymes or a reaction system containing all enzymes.
  • the present invention provides a method for finally converting arabinose into ⁇ -ketoglutarate or pyruvate using a microorganism transformed with the vector.
  • yeast excellent in ethanol resistance is used as the host microorganism, L-arabinose can be converted into ⁇ -ketoglutaric acid or pyruvic acid and then further converted into ethanol.
  • Azospirillum Brassiens ATCC29145 was purchased from RIKEN BioResource Center. Synthetic medium with 37 mM L-arabinose as the sole carbon source (4 g KH PO, 6 g K HPO, 0.2 g MgSO ⁇ ⁇ 0, O.lg NaCl, 0.026 g CaSO -2H O per liter of medium)
  • the bacterium was cultured at 30 ° C for 24 hours. Cells collected by centrifugation are suspended in buffer A (20 mM potassium phosphate buffer, pH 7.0 containing 2 mM Mg CI, lOmM 2-mercaptoethanol).
  • L-arabinose 1-dehydrogenase The activity of L-arabinose 1-dehydrogenase was measured by monitoring the increase in specific 340 nm absorbance of NAD (P) H produced by the reaction at 30 ° C. An appropriate amount of L-arabinose 1-dehydrogenase was added to lOOmM Tris-HCl buffer (pH 9.0) containing 10 mM L-arabinose and ImM NAD (P) +. The enzymatic reaction was started by counting NAD (P) +. One unit of this enzyme is required to produce l / z mol of NAD (P) H in one minute. Defined as quantity. Km and kcat were calculated from Lineweaver-Burk plots using various concentrations of substrates and coenzymes. The protein concentration was determined by the Lawry method using ushi serum albumin as a standard substance.
  • Protein was recovered by centrifugation. The fractionated protein was dissolved in a small amount of buffer A, and then dialyzed overnight at 4 ° C against buffer A containing 1.3M (NH) SO. After dialysis, distant
  • Fraction 2 The insoluble material was removed in mind and the supernatant was used for the next step (Fraction 2).
  • Fraction 3 The protein was eluted. Fractions containing high L-arabinose 1-dehydrogenase activity were collected and dialyzed against Buffer A overnight at 4 ° C (Fraction 3).
  • Fraction 3 was loaded onto a HiPrep 16/10 Q FF column (Amersham Biosciences) equilibrated with buffer A and washed with the same buffer. The protein was then eluted with a 0-1M NaCl gradient in buffer A. Fractions containing high L-arabinose 1-dehydrogenase activity were collected and dialyzed against buffer B (5 mM potassium phosphate buffer, PH 7.0 containing 10 mM 2-mercaptoethanol) at 4 ° C (fractionation). Four).
  • Fractions containing enzyme activity were collected and ultrafiltered using Centriplus YM-30 (Millipore) at 18,000 Xg for about 2 hours (Fraction 5). • Gel filtration chromatography
  • Fraction 5 is loaded onto a HiLoad 16/60 Superdex 200 pg column (Amersham Biosciences) equilibrated with buffer A and only fractions containing high L-arabinose 1-dehydrogenase activity are collected (fraction 6 ), Concentrated by ultrafiltration, and added to the same column. Fractions containing high L-arapinose 1-dehydrogenase activity were analyzed by SDS-PAGE, and fractions containing only a single enzyme were collected and concentrated to give a purified enzyme (Fraction 7).
  • L-arabinorataton was obtained by boiling L-arabonate K + salt in 0.2M HC1 for 5 minutes.
  • L-arabonate K + salt was synthesized from L-arabinose according to the method of Moore, S., and Link, K.P. (1940) J. Biol. Chem. 133, 293-311.
  • the purified enzyme was separated by SDS-PAGE and electroblotted onto a PVDF membrane. After staining, the band was excised and the N-terminal amino acid sequence for 25 residues was determined by protein 'Sequencer 1'. To determine the internal sequence, the purified enzyme 100 / z g was cleaved chemically in 70% (v / v) formic acid containing 0.1% (w / v) cyanobium bromine (BrCN). The lyophilized sample was separated by SDS-PAGE and blotted on a PVDF membrane, and the amino acid sequence of 25 residues of two bands (Fragment I and II in Fig. 2B) excluding the uncut sample was determined.
  • pBluescript KS (-) containing a genomic fragment containing the L-arabinose 1-dehydrogenase gene was isolated by colony hybridization (pBSl), and the entire nucleotide sequence of this gene and its nucleotide sequence (1805 bp) ) (SEQ ID NO: 1) was determined (Fig. 4).
  • the Fragment I sequence was the same as the N-terminal sequence.
  • the sequence of Fragment II was completely different from that, and it was found that this corresponds to the internal sequence.
  • primers upstream (U1-U8) and downstream (D1, D2) of the gene were designed, and genomic PCR was performed to obtain a single amplified fragment.
  • the deduced amino acid sequence showed homology with some of several known sugar dehydrogenases, so this fragment was presumed to be part of the L-arabinose 1-dehydrogenase gene. .
  • 5′-gcttggctgcagTCAGCGGCCGAACGCGTCG-3 ′ (31-mer) (SEQ ID NO: 26) was prepared, and PCR was performed using the pBSl plasmid.
  • the lower case part of the primer indicates the added base sequence
  • the underlined part indicates the cleavage site of Bglll and Pstl, respectively.
  • the amplified DNA fragment was cleaved with Bglll and Pstl and then introduced into plasmid pQE80-L (Qiagen) treated with BamHI and Pstl.
  • This plasmid can express a protein with a 6 histidine tag at the amino acid end.
  • E. coli DH5 a introduced with a plasmid containing L-arabinose 1-dehydrogenase gene, Super broth containing 50 mg / l ampicillin (12 g peptone per liter, 24 g yeast extract, 5 ml glycerol, 3.81 g KH PO, 12.5 g K ⁇ , ⁇ ⁇ 7.0), 37
  • the suspension was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) containing ethanol and lOmM imidazole. After disruption by sonication, the mixture was centrifuged, and the supernatant was added to an N-to-NTA spin column (Qiagen) equilibrated with buffer C. After washing 3 times with buffer D (buffer C containing 10% (v / v) glycerol and 50 mM imidazole instead of 10 mM imidazole), the enzyme is buffer E (250 mM imidazole instead of 50 mM imidazole). And eluted with buffer D).
  • buffer D buffer C containing 10% (v / v) glycerol and 50 mM imidazole instead of 10 mM imidazole
  • the purified recombinant enzyme was fractionated by SDS-PAGE and electroblotted to a trocellulose membrane.
  • Western 'blotting consists of ECL TM Western Blotting Analysis System (Amersham Biosciences) and RGS' His HRP antibody (monoclonal to Arg-Gly-Ser- (His) 6 sequence attached to the N-terminus of the recombinant enzyme) Antibody, Qiagen) was used.
  • This recombinant enzyme shows higher activity against NADP +, like natural purified enzyme, and also has a specific activity against L-arabinose (32 units / mg protein), Km (0.26 mM), and kcat (98 9 min—). These results indicated that the isolated gene definitely codes for L-arabinose 1-dehydrogenase, which was named AraA.
  • Example 2- The nucleotide sequence of the Notl-Notl fragment of the l, 805 bp A. brasiliense genomic DNA isolated in (3) was subjected to homology search against the nucleotide sequence registered in Gene's bank. I got it. As a result, it showed high homology (91%) with a part of the genomic DNA sequence of Burkholderia cepacia strain R18149. This fungus has already completed its genome project, and the function of the putative gene has been identified. Therefore, looking at the vicinity of the AraA gene in the genomic DNA of B. cep acia, it was found that there were a total of 8 gene clusters including the homologue of the AraA gene (Fig. 5).
  • nucleotide sequences of the L-arabinose 'operon of A. brasiliense and B. cepacia are expected to be very similar, in order to determine the upstream and downstream nucleotide sequences of the Notl-Notl fragment of A. brasiliense genomic DNA
  • primers were designed based on the sequence of B. cepacia. Using UP-S and UP-AS for upstream, DOWN-S and DOWN-AS as primers for downstream, and PCR using A. brasiliense genomic DNA as a saddle, amplification products of about 3.5kbp and 4.3kbp, respectively. Got. Each was incorporated into a pGEM-T vector and named pGEM2 and pGEM3 (FIG. 5).
  • the introduced DNA fragment was sequenced and combined with the sequence of the Notl-Notl fragment introduced into pBSl in Example 2- (3) to obtain a nearly full-length nucleotide sequence of L. arabinose 'operon of A. brasiliense ( 8679 bp, Fig. 5 and Fig. 7) (SEQ ID NO: 5).
  • the base sequence of the primer used in this experiment is shown below.
  • the deduced amino acid sequence is weakly homologous to dalconolactonase from Zymomonas mobilis (25%). Dalconolactonase catalyzes the hydrocyclization reaction of D-Dalconolataton ⁇ D-Dalconate This is a reaction that is homologous to L-arabinolactonase. Therefore, we estimated that the AraB gene functions as L-arabinolactonase.
  • 6-Phosphodarconate dehydration enzyme is the ability to catalyze the dehydration reaction of 6-phosphodarconate ⁇ 2-dehydro-3-deoxy-6-phospho-D-dalconate in the Entner-00 (101 "0113 ⁇ 4 way) Is a homologous reaction with L-arabonate dehydration enzyme, so it was assumed that the AraC gene functions as L-arabonate dehydrase.
  • the deduced amino acid sequence suggested that the enzyme belongs to the DHDPS / NAL protein 'family.
  • a characteristic of the reactions of enzymes in this family is the ability to generate pyruvate and aldehydes by aldol cleavage.
  • This reaction is homologous to the L-KDA aldolase contained in the novel L-arabinose pathway 2 ( Figure 1C). This suggests that although this gene is the first candidate for LKDA dehydrase, its amino acid sequence suggests that it may be an L-KDA aldolase. It was.
  • brasiliense cells were obtained in the same manner as in Example (1).
  • the cells recovered by centrifugation are Fur A ′ (1 mM EDTA, 20 mM potassium phosphate buffer containing 7.5 mM 2-mercaptoethanol, PH 7.5) was suspended. After disruption by sonication, cell-free extract was obtained by centrifugation at 105000 Xg for 20 minutes at 4 ° C (Fraction 1).
  • KGSA dehydrogenase activity was measured using a 66.7 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2) containing 10 mM 2_mercaptoethanol, ImM EDTA, and 1.5 mM NAD (P) + as a reaction solution at 25 ° C. Except for what was performed, the procedure was in accordance with Example 1- (2). As the substrate, 10 mM glutaraldehyde and finally 100 ⁇ ⁇ a KGSA were used in the purification process.
  • Fraction 2 All chromatography performed below was performed at 4 ° C using the AKTA purifier system. Fraction 1 was applied to a HiPrep 16/10 Q FF column equilibrated with buffer A 'and washed with the same buffer. The protein was then eluted with a 0-1M NaCl gradient in buffer A. Fractions containing high a KGSA dehydrogenase activity were dialyzed overnight at 4 ° C against buffer B '(5 mM potassium phosphate buffer, PH7.5 containing 10 mM 2-mercaptoethanol and ImM EDTA) ( Fraction 2).
  • Fraction 2 was loaded onto a CHT Ceramic hydroxyapatite Type I force ram equilibrated with buffer B 'and washed with the same buffer. Then 0.005-0.2M in buffer B '
  • Fraction 3 is loaded onto a HiLoad 16/60 Superdex 200 pg column equilibrated with buffer A 'and the fractions containing high a KGSA dehydrogenase activity are collected and contain 1.3M (NH) SO
  • PCR was performed using A. brasiliense genomic DNA as a saddle, and an amplified product of about 1450 bp was obtained (Fig. 5). This was introduced into plasmid pGEM-T and named pGEM4. The base sequence of the primer used for this experiment is shown below.
  • Table 2 shows the results of purification of a KGSA dehydrogenase from A. brasiliense.
  • the enzyme corresponding to this activity was purified to a specific activity of 7.24 units / mg protein by four chromatographies (fraction 5 in Table 2). However, a few proteins coexisted in this (fraction 5 in Fig. 6), and when an enzyme with dehydrogenation activity was searched by in-gel staining, the main 50 kDa of fraction 4 was found. Enzyme having a molecular weight of 2 was able to hit this (Band in Figure 5, fraction 5).
  • N-terminal amino acid sequence of this enzyme is (M) ANVTYTDTQLLIDGEWVDAASXKXI (X is unidentified) (SEQ ID NO: 33), and B. cepacia aldehyde dehydrogenase among proteins registered in Gene 'Bank It completely matched the N-terminal amino acid sequence of (Registration No. ZP_00215432).
  • the four types of internal amino acid sequences determined are as follows.
  • Fragment I (Met)-Ala- Asn- VaL- Thr- Tyr (same as N-terminal sequence) (SEQ ID NO: 34)
  • Fragment II (Met)-Thr- Gin- Glu- Gin- Gly (SEQ ID NO: 35)
  • Fragment III (Met)-Glu- Leu- Gly-Gly-His (SEQ ID NO: 36)
  • Fragment IV (Met)-Ala- Ser- VaL-Ile- Asp (SEQ ID NO: 37)
  • B. cepacia aldehyde dehydrogenase contained an internal sequence very similar to Fragment II, III, and IV. These facts strongly suggested that the ⁇ KGSA dehydrogenase of A. brasiliense has a very homologous sequence. So B. cepacia Aldehi A primer was designed from the 5'- and 3'-end nucleotide sequences of the dehydrogenase gene, and genomic PCR was performed using the A. brassiliense genomic DNA as a cage. Amplification of a single DNA fragment with approximately the same length was observed.
  • AraR has a typical DNA-binding motif (helix-turn-helix) and shows homology with LysR-type transcription factors. Considering that this gene is upstream of the L-arabinose 'operon, Ara R is likely to be a transcriptional regulator of the operon!
  • AraX, AraY, and AraZ are highly homologous to known ABC-type sugar transporter proteins, particularly the L-arabinose 'transporter.
  • this type of transporter is composed of periplasmic substrate-binding protein, ATP-degrading enzyme (ATPase), and transmembrane protein (permease).
  • ATPase ATP-degrading enzyme
  • permease transmembrane protein
  • Primers were designed to introduce BamHI-PstI, BamHI-KpnU BglII-PstI, and BamHI-Pstl restriction enzyme sites at the 5 'and 3' ends of the AraB, AraC, AraD, and AraE genes, respectively. It was. The lower case site indicates the added nucleotide sequence, and the underlined portion indicates the restriction enzyme cleavage site.
  • AraB-UP 5'— caccatggatccCAACAGATTCATCCGGCCGGGCAGGCGACGCTGC TGGC-3 '(SEQ ID NO: 38)
  • AraB-DO leakage 5 gcttggctgcagTCAGCCGCGCGGCGTCCCCGCAAACCGCGCCG TCGCC-3 '(SEQ ID NO: 39)
  • AraE-UP2 5'-caccatggatccGCTAACGTGACTTATACGGATACGCAACTGCTGA TCGACGG-3 '(SEQ ID NO: 44)
  • the culture of transformed E. coli and the expression and purification of the recombinant enzyme were basically in accordance with Example 3- (2). However, the buffer pH and additives used for purification vary slightly depending on the protein.
  • AraB, AraC, AraD, and AraE proteins were expressed in E. coli in the form of a histidine'-tagged N-terminus and purified by electrophoresis (FIG. 9A).
  • the molecular weight of each subunit almost agreed with the calculated theoretical value of amino acid sequence power (AraB: 41300Da / 33555.0Da, AraC: 610000Da / 62228.53Da, AraD: 370000Da / 35022.47Da, AraE: 520000Da / 52097.7Da) ( The former is the molecular weight calculated from the SDS-PAGE molecular weight marker, the latter is the theoretical value).
  • Example 1- Recombinant AraA protein (0.3 ⁇ ) purified in (2) was incubated in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2) containing ImM MgC12, 10 mM L-arabinose, 10 mM NADP + at 1.5 ° C for 1.5 hours. Even so, almost no L-arabonate formation can be observed (Figure 10A). On the other hand, when AraB protein (0.3 M) was allowed to coexist under the same conditions, significant L-arabonate formation was observed (FIG. 10B). This indicates that the AraB protein is an L-arabinolactonase that catalyzes the hydrolytic ring-opening reaction of L-arabinoratatone ⁇ L-arabonate.
  • the starting material L-arabonate was chemically synthesized as a potassium salt by the method of Example 1- (4).
  • AraC protein (1.3 ⁇ ), 50 mM containing 10 mM L-arabonate, 10 mM MgCl
  • the activity of L-arabonate dehydrase was detected spectrophotometrically at 30 ° C with the ⁇ -keto acid produced at a wavelength of 190 nm.
  • the reaction solution contains 10 mM L-arabonate, 10 mM MgCl 50
  • the activity of L-KDA dehydrase was determined by spectroscopically monitoring the increase in the specific 340 nm absorbance of NAD (P) H associated with acidification by a KGSA dehydrogenase. went.
  • the ⁇ KGSA dehydrogenase used here is an AraE protein purified from A. brasiliense as glutaraldehyde dehydrogenase. This enzyme proved to be a KGSA dehydrogenase as shown in Example 10 below. .
  • reaction solution 66.7 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2) containing 10 mM 2-mercaptoethanol, ImM EDTA, 100 ⁇ ML-KDA, 1.5 mM NAD +, and 0.0083 units of purified recombinant AraE protein was used.
  • the reaction temperature was 25 ° C, and the enzyme reaction was started by adding L-KDA.
  • ⁇ KGSA could be obtained from chemically synthesized L-arabonate by enzymatic conversion using AraC and AraD. Therefore, this was used to dehydrogenate recombinant AraE protein using purified a KGS A (100 M) as a substrate instead of dartalaldehyde used in Example 5-(2) Enzyme activity measurement section. Enzyme activity was measured. The specific activity for ⁇ KGSA was 42.5 units / mg protein, which was more than 3 times stronger than glutaraldehyde. Next, the metabolic efficiency (kcat / Km) for each substrate was measured. a The KGSA kcat / Km was 4660 s—mM— 1 , which was 6 times higher than glutaraldehyde (755 s — i 'mM—).
  • the present invention provides a novel metabolic pathway of L-arabinose, which accounts for the majority of the pentose with D-xylose among the plant constituents.
  • This metabolic pathway allows L-alapinose to be enzymatically converted to a-ketoglutarate or pyruvate, and the resulting a-ketoglutarate enters the citrate cycle and is converted to ethanol via pyruvate.
  • the D-xylose power can also convert ethanol enzymatically.
  • yeast can convert hexose, which is a constituent component of cellulose, into ethanol with high efficiency and is excellent in ethanol resistance
  • the recombinant yeast introduced with the gene of the present invention in yeast is L-arabinose. It will also have the ability to convert pentose sugars such as these into ethanol with high efficiency, and the utilization rate of woody biomass will be greatly improved.
  • FIG. 1A shows the L-arabinose metabolic pathway by known bacteria.
  • FIG. 1B shows the L-arabinose metabolic pathway by known molds.
  • FIG. 1C shows the L-arabinose metabolic pathway by novel bacteria.
  • FIG. 2A shows an SDS-PAGE of L-arabinose 1-dehydrogenase purification. Fractions 1 and 2 were run on 50 / ⁇ , and fractions 3-7 were run on 10 g of protein using a 12% gel. M is a molecular weight marker.
  • FIG. 2B shows SDS-PAGE of L-arabinose 1-dehydrogenase cleaved with BrCN. 5 g of protein was run using an 18% gel. M is a molecular weight marker. The N-terminal amino acid sequences of Fragment I and I I were determined.
  • FIG. 2C SDS-PAGE and Western blotting of a recombinant of L-arabinose 1-dehydrogenase with L-arabinose 1-dehydrogenase and histidine 'tag added to the N-terminus.
  • SDS-PAGE 5 ⁇ g of protein was run on a 12% gel and 1 ⁇ g of protein was run on Western blotting.
  • M is a molecular weight marker.
  • FIG. 3 shows the result of HPLC analysis of the reaction product of L_arabinose 1-dehydrogenase. Each peak number indicates the elution time.
  • FIG. 4 shows the base sequence of a 1805 bp A. brasiliense genomic DNA fragment containing the L-arabinose 1-dehydrogenase gene.
  • the underlined portion is the Notl restriction enzyme cleavage site, and the deduced amino acid sequence of L-arabinose 1-dehydrogenase is shown below the base sequence.
  • the underlined portion is the amino acid sequence determined directly from the purified enzyme.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the L-arabinose operon of A. brasiliense, B. cepacia R18149 (upper) and B. thiailandensis (lower). Genes with the same sign are homologous to each other.
  • FIG. 6 a SDS-PAGE of KGSA dehydrogenase purification. Fraction 1 was subjected to 50 ⁇ g, and fractions 2 to 5 were subjected to electrophoresis of 10 g of protein using a 10% gel. M is a molecular weight marker. Peptide 'band with ⁇ corresponds to a KGSA dehydrogenase.
  • FIG. 7 shows the base sequence of L. arabinose operon of A. brasiliense. This sequence was determined by linking the base sequences of pGEM2, pBSl (FIG. 4) and pGEM3 in FIG. The deduced amino acid sequence of each gene is shown below the base sequence. The underlined portion shows the following amino acid sequence. Solid line: AraR, short wave line: AraC, dash-dot line: AraD, long wave line: AraA, long dash-dot line: Ara X, dotted line: AraY, long dash-dot line: AraZ, dash-dot line: AraB
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence of a KGSA dehydrogenase gene.
  • the underlined portion is the amino acid sequence determined directly from the purified enzyme.
  • FIG. 9 shows SDS-PAGE (A) and Western 'blotting (B) of recombinant (AraA), AraB, AraC, AraD, and Ara E proteins with a histidine' tag attached to the N-terminus. 5 g for SDS-PAGE and 1 ⁇ g for Western 'blotting were run on a 10% gel. M is a molecular weight marker.
  • FIG. 10A shows the HPLC analysis result of the enzyme reaction product of AraA protein, that is, the elution curve of the conversion reaction product of L-arabinose ⁇ L-arabinolaton by AraA protein.
  • FIG. 10C shows the HPLC analysis result of the enzyme reaction product of AraC protein, that is, the elution curve of the conversion reaction product of L-arabonate ⁇ L-KDA by AraC protein.
  • FIG. 10D shows the HPLC analysis result of the enzyme reaction product of AraD protein, that is, the elution curve of the conversion reaction product of L_KDA ⁇ a KGSA by AraD protein.
  • FIG. 10E HPLC analysis result of enzyme reaction product of AraE protein, that is, the upper part shows the elution power of the conversion reaction product of a KGSA ⁇ a-ketoglutarate by Ar aE protein, and the lower part shows the ⁇ -ketoglutarate An elution curve is shown.

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Abstract

　L-アラビノースをα－ケトグルタル酸に変換する方法、使用する酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子により形質転換した組換え微生物を提供する。 　以下の工程を含むL-アラビノースをα－ケトグルタル酸に変換する方法。 （Ａ）L-アラビノースをL-アラビノ－γ－ラクトンに変換し、（Ｂ）これをL-アラボネートに変換し、（Ｃ）これをL-２－ケト－３－デオキシアラボネートに変換し、（Ｄ）これをα－ケトグルタル酸セミアルデヒドに変換し、及び（Ｅ）これをα－ケトグルタル酸に変換する工程；L-アラビノース－１－脱水素酵素、L-アラビノラクトナーゼ、L-アラボネート脱水酵素、L-２－ケト－３－デオキシアラボネート脱水酵素、及びα－ケトグルタル酸セミアルデヒド脱水素酵素；上記酵素コードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターにより形質転換された酵母。

Description

明 細 書
L-ァラビノースをひ _ケトグルタル酸に変換する方法、この方法に使用す る酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え微生物
技術分野
[0001] 本発明は、 L-ァラビノースを aーケトグルタル酸に変換する方法、この方法に使用 する酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え微生物に関する。植 物構成成分のうち D-キシロースとともに五炭糖の大部分を占める L-ァラビノースの新 規代謝経路の発見に基づくものである。さらに詳細には、新規代謝経路に関与する 新規酵素、これをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む微 生物、該微生物を用いて L-ァラビノースを α—ケトグルタル酸に酵素的に変換させる 方法に関するものである。
背景技術
[0002] 1998年の資料によると、全世界で生産されたエタノールの総量は 3.12 X 109リットル におよぶ。このうち、合成エタノールの占める割合はわず力 7%であり、残りは生物発 酵によって作られたものである。また、全体の 2/3は燃料エタノールとして使われてい る。エタノール生物発酵の原料として主要なものとしては、サトウキビ、テンサイなどの 製糖植物あるいはトウモロコシ、コメなどである。こうしたバイオマス原料は、主に六炭 糖 (D-グルコース、 D-ガラクトース、フルクトース)によって構成されており、エタノール 発酵の生物種 (微生物)として主に用いられる大腸菌や酵母はいずれもエタノールま で変換することが可能である。しかし、我が国の耕地面積、食糧生産の観点から見る とこうした作物を単にエタノール生産の原料のためだけに作ることは極めて難しい。 我が国が生物発酵によるエタノール生産を促進しなければならないことは間違いな V、が、その原料としてこれら食用作物以外に注目する必要がある。
[0003] 地球上のバイオマスの大部分を占めるのはこうした食用作物ではなく木質系バイオ マスである。特に、我が国においては豊富な森林資源やその維持に伴って生じる間 伐材などによって木質系バイオマスの供給は極めて容易かつ豊富である。木質系バ ィォマスは、リグノセルロースから構成されており、リグノセルロースはセルロース (約 45 %)とへミセルロース (約 30%)、リグニン (約 25%)に分類される。このうち、セルロースや へミセルロースは超臨界水や酸加水分解あるいは酵素分解によって単糖まで分解す ることが出来る。セルロースは直鎖状 D-グルコース力も構成されているのに対して、 へミセルロースは六炭糖に加えて五炭糖 (主に D-キシロース、 L-ァラビノース)も含ん だ鎖状構造を取っている。微生物において五炭糖は六炭糖と比較して代謝効率が 低!、ため、五炭糖からエタノールへの効率的変換法の確立は木質系バイオマスの利 用において極めて重要な命題の 1つである。特に、酵母は本来の高いエタノール発 酵能とエタノール耐性能から本命題解決にお！ヽて魅力的な生物種であるが、五炭糖 を全く代謝できないという大きな問題があり実用化に向けた取り組みにおいては大腸 菌などに先を越されてきた。
[0004] 酵母による D-キシロースからのエタノール変換は 1990年代初期には既にその基本 的戦略が確立しており、具体的には異なる 2つの経路 (細菌由来ある ヽはカビ由来)の 酵素遺伝子 (群)を酵母に導入した組換え酵母を用いる。前者では D-キシロースはキ シロース異性ィ匕酵素によって一段階でキシルロースに変換される力 S、後者ではキシロ ース還元酵素とキシリトール脱水素酵素によって D-キシリトールを介してキシルロー スになる。キシルロースはキシル口キナーゼによって D-キシルロース 5リン酸に変換さ れペントース 'リン酸回路を介して代謝される。どちらの経路を酵母に導入した場合も 変換効率は極めて悪いもののエタノール発酵が確認でき、さらに実用化に向けた改 良がなされている (非特許文献 1)。
[0005] 一方、もう 1つの五炭糖である L-ァラビノースについてはこれまでほとんどこうした試 みはなされてこな力つた。 D-キシロース同様、 L-ァラビノースの代謝経路は細菌と力 ビで異なっている。細菌由来の経路では、 L-ァラビノースは L-ァラビノースイソメラー ゼによって異性ィ匕され L-リブロースとなり、続いてリブ口キナーゼによってリン酸ィ匕さ れ L-リブロース 5リン酸に変換された後、最終的に L-リブロースリン酸 4-ェピメラーゼ による異性ィ匕によって D-キシルロース 5リン酸に変換され、 D-キシロース同様ペントー ス 'リン酸回路に入る (図 1A)。大腸菌ではこれら 3つの酵素をコードする遺伝子はタン デムに並んだオペロンをなしており (AraBCDオペロン)、最近大腸菌由来のそれぞれ の遺伝子を真核生物のためのプロモーター、ターミネータ一につないで野生型サッ カロミセス酵母に導入した組換え酵母が作出された。し力しながら、この酵母は L-ァ ラビノースを炭素源として生育できたもののエタノール発酵は全く確認できな力つた（ 非特許文献 2)。
[0006] カビ由来の L-ァラビノース代謝経路は長い間仮想的であつたが、子嚢菌 (しのうきん )の一種であるハイポクレアジェコリナ（Hypocrea jecorina)からこの経路に含まれる全 ての遺伝子が最近単離された (非特許文献 3〜5)。これによると、 L-ァラビノースは 4 つの酸ィ匕還元酵素 (アルドース還元酵素、 L-ァラビ-トール脱水素酵素、 L-キシル口 ース還元酵素)によって、 L-ァラビ-トール、 L-キシルロース、 D-キシリトールを介して D-キシルロースに変換され、最終的にはリン酸ィ匕され D-キシルロース 5リン酸となる（ 図 1B)。実は、このアルドース還元酵素は D-キシロースも還元して D-キシリトールに変 換できるため (L-ァラビノース/ D-キシロース還元酵素)、カビの D-キシロース代謝経 路と L-ァラビノース代謝経路を比較すると後者に特異的に必要な遺伝子は L-ァラビ 二トール脱水素酵素と L-キシルロース還元酵素だけである。そこで、キシロース還元 酵素とキシリトール脱水素酵素を導入した酵母にさらに両酵素遺伝子を組み込みェ タノール発酵の有無が検討された。この組換え酵母は L-ァラビノースで生育できたが そのエタノール変換効率は D-キシロースの場合と同様極めて低力つた (非特許文献 6)。
[0007] 細菌の L-ァラビノース代謝経路の研究の中で、主に植物根粒菌の中のいくつかの 細菌において大腸菌などの既知の経路とは全く異なる L-ァラビノース代謝がなされ ている可能性が古くから指摘されてきた (図 1C)。これらの細菌の細胞抽出液中には L -ァラビノースイソメラーゼ、リブ口キナーゼ、 L-リブロースリン酸ェピメラーゼ活性が見 られない。それに替わって見出された酵素活性をもとに構築された仮想的経路による と、 L-ァラビノースはまず NAD(P)+依存的に L-ァラビノース 1-脱水素酵素によって酸 化され L-ァラピノ- γ -ラタトンになる。 L-ァラピノ- γ -ラタトンは L-ァラビノラクトナーゼ によって加水開環され L-ァラボネートとなり、さらに L-ァラボネート脱水酵素による脱 水反応によって L- 2-ケト- 3-デォキシァラボネート (L-KDA)となる。 L- KDAのその後 の代謝様式は細菌によって異なる。
[0008] まず、シユードモナスサッカロフイラ（Pseudomonas saccharophila)、ァゾスピリルムブ ラシリエンス (Azospirillum brasiliense)、へノレノ スピリノレムセロぺディカェ (Herbaspirill um seropedicae)、リゾビゥムメリロチ（Rhizobium meliloti)などでは、 L- KDA脱水酵素 による脱水反応によって α—ケトグルタル酸セミアルデヒド（a KGSA)になり、さらに α KGSA脱水素酵素の NAD(P)+依存的酸ィ匕によって最終的に α—ケトグルタル酸に変 換される (経路 1)。
一方、リゾビゥムジャポニカム（Rhizobium japonicum)ゃシユードモナス株 (Pseudom onas strain) MSU- 1では L- KDAは L- KDAアルドラーゼによってアルドール開裂され ピルビン酸とダリコールアルデヒドが生じる (経路 2)。
これまで、経路 1および 2に関与するどの (仮想的)遺伝子も単離されていな力つた（ 非特許文献 7〜 15)。
[0009] 木質などのバイオマス資源のうち、 30%以上を占めるへミセルロースを加水分解す ることによって容易に得ることが出来る単糖を、高効率でエタノールへと変換し、エネ ルギ一問題を解決するための 1つの手段を提供することは重要な課題である。そのた めには、セルロースなどの構成成分である六炭糖を高効率でエタノールへと変換で き、エタノール耐性に優れた酵母に、 L-ァラビノースなどの五炭糖を原料として高効 率でエタノールへと変換できる能力を与えるのが最も理想的である。
[0010] 最近報告された細菌由来、カビ由来の L-ァラビノース代謝経路を用いたこの命題 への試みは失敗に終わっている。この明確な理由については不明であるが、 1つの 特徴として (これは D-キシロース代謝経路についても言えることであるが) L-ァラビノー スの最終代謝産物が 、ずれの経路にお!、てもペントース ·リン酸回路の中間産物で あるキシルロース 5リン酸であることが挙げられる。そこで、例えば、 L-ァラビノースを 別の形で変換して異なる代謝系に送り込むことは 1つの突破口になりうる。この意味に おいて、上に示した細菌由来の仮想的 L-ァラビノース代謝経路は極めて魅力的であ る。経路 1で生じる α—ケトグルタル酸はクェン酸サイクルに入りピルビン酸を介して エタノールに変換されるし、経路 2ではピルビン酸が最終産物の 1つとして直接生成さ れる。
[0011] 非特許文献 1： Jeffries, T.W., and Jin, Y.S. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 63, 4 非特許文献 2 : Sedlak, M., and Ho, N.W. (2001) Enzyme Microb. Technol. 28, 16-24 非特許文献 3 : Richard, P., Londesborough, J., Putkonen, M., Kalkkinen, N., and Pe nttila, M. (2001) J. Biol. Chem. 276, 40631-40637
非特許文献 4 : Richard, P., Putkonen, M., Vaananen, R., Londesborough, J., and Pe nttila, M. (2002) Biochemistry 41, 6432-6437
非特許文献 5 : Verho, R., Putkonen, M., Londesborough, J., Penttila, M., and Richar d, P. (2004) J. Biol. Chem. 279, 14746-14751
特許文献 6 : Richard, P., Verho, R., Putkonen, M., Londesborough, J., and Penttil a, M. (2003) FEMES Yeast Res. 3, 185—189
非特許文献 7 :Welmberg, R.， and Doudoroif, M. (1955) J. Biol. Chem. 217, 607-624 非特許文献 8 :Welmberg, R. (1961) J. Biol. Chem. 236, 629-635
非特許文献 9 : Dagley, S.， and Trudgill, P.W. (1965) Biochem. J. 95, 48-58 非特許文献 10 : Dahms, A.S., and Anderson, R.L. (1969) Biochem. Biophys. Res. Co mmun. 36, 809 - 814
非特許文献 l l : Pedrosa, F.O., and Zancan, G.T. (1974) J. Bacteriol. 119, 336-338 非特許文献 12 : Duncan, M.J. (1979) J. Gen. Microbiol. 113, 177-179
非特許文献 13 : Duncan, M.J., and Fraenkel, D.G.. (1979) J. Bacteriol. 137, 415—41
9
非特許文献 14 : Novick, N.J., and Tyler, M.E. (1982) J. Bacteriol. 149, 364-367 非特許文献 15 : Mathias, A.L., Rigo, L.U., Funayama, S" and Pedrosa, F.O. (1989) J. Bacteriol. 171, 5206-5209
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明の目的は、 L-ァラビノースを a—ケトグルタル酸に変換する方法を提供する ことである。
本発明の他の目的は、 L-ァラビノースをピルビン酸に変換する方法を提供すること である。
本発明の他の目的は、上記方法に使用する酵素、該酵素をコードする遺伝子、該 遺伝子を含むベクター、該ベクターにより形質転換した組換え微生物を提供すること である。
本発明のさらに他の目的は、上記組換え微生物を用いて L-ァラビノースを α ケト ダルタル酸又はピルビン酸に変換する方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明は、植物構成成分のうち D-キシロースとともに五炭糖の大部分を占める L- ァラビノースの新規代謝経路の発見に基づくものである。さらに詳細には、以下に示 す新規代謝経路に関与する新規酵素、これをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベ クタ一、該ベクターを含む微生物、該微生物を用いて L-ァラビノースを α—ケトグル タル酸又はピルビン酸に酵素的に変換させる方法を提供するものである。
[0014] 1.以下の工程を含む L-ァラビノースを α—ケトグルタル酸に変換する方法。
(A) L-ァラビノースを L-ァラピノ一 γ—ラタトンに変換する工程、
(B) L-ァラビノー γ—ラタトンを L-ァラボネートに変換する工程、
(C) L-ァラボネートを L- 2—ケト 3 デォキシァラボネートに変換する工程、
(D) L- 2 ケト— 3 デォキシァラボネートを α -ケトグルタル酸セミアルデヒドに変 換する工程、及び
(E) aーケトグルタル酸セミアルデヒドを α—ケトグルタル酸に変換する工程。
2.以下の工程を含む L-ァラビノースをピルビン酸に変換する方法。
(A) L-ァラビノースを L-ァラピノ一 γ—ラタトンに変換する工程、
(B) L-ァラビノー γ—ラタトンを L-ァラボネートに変換する工程、
(C) L-ァラボネートを L- 2—ケト 3 デォキシァラボネートに変換する工程、
(F) L- 2 ケト— 3 デォキシァラボネートをピルビン酸に変換する工程。
3. L-ァラビノースを L-ァラピノ一 γ—ラタトンに変換する工程を触媒する、 L-ァラピノ ースー 1 脱水素酵素。
4. L-ァラピノ一 γ—ラタトンを L-ァラボネートに変換する工程を触媒する、 L-ァラピノ ラクトナーゼ。
5. L-ァラボネートを L- 2 ケト— 3 デォキシァラボネートに変換する工程を触媒す る、 L-ァラボネート脱水酵素。 6. L- 2—ケト— 3—デォキシァラボネートを α—ケトグルタル酸セミアルデヒドに変換 する工程を触媒する、L- 2—ケト— 3—デォキシァラボネート脱水酵素。
7. aーケトグルタル酸セミアルデヒドを α—ケトグルタル酸に変換する工程を触媒す る、 α—ケトグルタル酸セミアルデヒド脱水素酵素。
8.上記 3記載の酵素をコードする遺伝子。
9.上記 4記載の酵素をコードする遺伝子。
10.上記 5記載の酵素をコードする遺伝子。
11.上記 6記載の酵素をコードする遺伝子。
12.上記 7記載の酵素をコードする遺伝子。
13.上記 8〜 12記載の遺伝子のすべてを含むオペロン。
14.上記 8〜 12記載の遺伝子の少なくとも 1種を含むベクター。
15.上記 13記載のオペロンを含むベクター。
16.上記 14又は 15記載のベクターにより形質転換された微生物。
17.微生物が酵母又は大腸菌である上記 18記載の微生物。
18.上記 16又は 17記載の微生物を培養することを特徴とする上記 3〜7のいずれか 1項記載の酵素の製造方法。
19.上記 18記載の方法により製造された酵素を使用することを特徴とする上記 1又 は 2記載の方法。
20.上記 15記載のベクターにより形質転換された微生物を使用することを特徴とす る上記 1記載の方法。
発明を実施するための最良の形態
新規 L-ァラビノース代謝経路 1を持つ細菌として好適なものは、ァゾスピリルムブラ シリエンス（Azospirillum brasiliense) (以下、 A. brasilienseと称することもある）である。 この経路に含まれる 5つの遺伝子およびそのアミノ酸配列に関する情報は従来全く知 られていないので、基本的には培養した本菌の無細胞抽出液中から酵素学的活性 を指標にそれぞれの酵素の精製を行い、精製酵素の部分的アミノ酸配列を元に DN Aプライマーを設計し、本菌のゲノム DNAを铸型として PCRを行 ヽ遺伝子の一部を増 幅する。増幅した DNA断片をプローブとして、本菌のゲノムライブラリ一力も遺伝子全 長を単離しヌクレオチド配列を決定すれば良 、。
[0016] 新規 L-ァラビノース代謝経路 1を持つ本発明で使用する細菌としては、ァゾスピリル ムブラシリエンス以外に、これまで経路 1の存在が示唆されているものであれば使用 することができ、例えば、シユードモナスサッカロフイラ（Pseudomonas saccharophila)、 ヘルバスピリルムセロぺディカェ（Herbaspirillum seropedicae)、リゾビゥムメリロチ（Rhi zobium meliloti)等が挙げられる。
[0017] L-ァラビノースを L-ァラピノ一 γ—ラタトンに変換する工程を触媒する、 L-ァラピノ ースー 1 脱水素酵素としては、本発明の AraAタンパク質 (配列番号 8)、及びその類 似体が挙げられる。この明細書において「タンパク質の類似体」とは、当該タンパク質 を構成するアミノ酸の一部が欠失し、及び Z又は他のアミノ酸に置換され、及び Z又 は他のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、元のタンパク 質と実質的に同一の酵素活性を有するタンパク質を意味するものとする。
L-ァラピノ一 γ—ラタトンを L-ァラボネートに変換する工程を触媒する、 L-ァラピノ ラクトナーゼとしては、本発明の AraBタンパク質 (配列番号 12)、及びその類似体が挙 げられる。
L-ァラボネートを L- 2 ケト一 3 デォキシァラボネートに変換する工程を触媒する 、 L-ァラボネート脱水酵素としては、本発明の AraCタンパク質 (配列番号 6)、及びそ の類似体が挙げられる。
[0018] L- 2 ケト— 3 デォキシァラボネートを α ケトグルタル酸セミアルデヒドに変換す る工程を触媒する、 L-2 ケト— 3 デォキシァラボネート脱水酵素としては、本発明 の AraDタンパク質 (配列番号 7)、及びその類似体が挙げられる。
aーケトグルタル酸セミアルデヒドを α—ケトグルタル酸に変換する工程を触媒する 、 aーケトグルタル酸セミアルデヒド脱水素酵素としては、本発明の AraEタンパク質（ 配列番号 14)、及びその類似体が挙げられる。
[0019] 本発明の L-ァラビノース一 1—脱水素酵素をコードする遺伝子としては、本発明の AraA遺伝子（配列番号 5の 3073〜4002)、及びその類似体が挙げられる。この明細 書において「遺伝子の類似体」とは、当該遺伝子を構成するヌクレオチドの一部が欠 失し、及び Z又は他のヌクレオチドに置換され、及び Z又は他のヌクレオチドが挿入 された塩基配列を有する DNAであって、ストリンジェント条件（例えば、 42〜45°C) において元の DNAとハイブリダィズすることができ、実質的に同一の酵素活性を有 するタンパク質をコードする遺伝子を意味するものとする。
本発明の L-ァラビノラクトナーゼをコードする遺伝子としては、本発明の AraB遺伝 子（配列番号 5の 7777〜8679)、及びその類似体が挙げられる。
本発明の L-ァラボネート脱水酵素をコードする遺伝子としては、本発明の AraC遺 伝子（配列番号 5の 252〜2003)、及びその類似体が挙げられる。
[0020] 本発明の L-2—ケト 3 デォキシァラボネート脱水酵素をコードする遺伝子として は、本発明の AraD遺伝子（配列番号 5の 2107〜3036)、及びその類似体が挙げられ る。
本発明の aーケトグルタル酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子として は、本発明の AraE遺伝子 (配列番号 13)、及びその類似体が挙げられる。
本発明の L-ァラビノースォペロンとしては、図 7に示す塩基配列（配列番号 5)を有 するものが挙げられる。
[0021] 本発明は、上記の遺伝子の少なくとも 1種を含むベクターを提供するものである。本 発明に使用できるベクターとしては、プラスミド、ファージ等が挙げられ、具体的には p GEM- T (プロメガ社）、 pBluescript SK (-) (ストラタジーン社）、 pQE- 80L (キアゲン社） 、酵母用プラスミドベクター等が挙げられる。
本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された微生物を提供するものである。 本発明に使用できる宿主微生物としては、大腸菌、酵母等が挙げられる。これらのう ち酵母が最も好ましい。用いる酵母としては特に制限はないが、特に好ましいものは サッカロミセス（Saccharomyces)属酵母であり、サッカロミセスセレビジァ（Saccharomy ces cerevisiae)力最 b好まし!/ヽ。
[0022] 本発明は、上記微生物を培養することを特徴とする上記酵素の製造方法を提供す るものである。微生物の培養は宿主微生物の培養と同様の条件で行えばょ 、。
本発明は、上記酵素を使用してァラビノースを最終的に α—ケトグルタル酸又はピ ルビン酸に変換する方法を提供するものである。ァラビノースを α ケトグルタル酸 に変換する方法は、好ましくは、工程 (Α)〜(Ε)を触媒する酵素を使用して行うこと が望ましい。また、ァラビノースをピルビン酸に変換する方法は、好ましくは、工程 (A )〜 (C)及び (F)を触媒する酵素を使用して行うことが望ま 、。
上記反応の各工程は、工程毎に順次行っても良いし、 2種以上の酵素を含む反応 系、又はすベての酵素を含む反応系で行うこともできる。
[0023] 本発明は、上記ベクターにより形質転換された微生物を使用してァラビノースを最 終的に α—ケトグルタル酸又はピルビン酸に変換する方法を提供するものである。宿 主微生物としてエタノール耐性に優れた酵母を使用すると、 L-ァラビノースを α—ケ トグルタル酸又はピルビン酸に変換した後、これをさらにエタノールに変換することが できる。
実施例
[0024] 次に、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定さ れるものではない。
実施例 1 L-ァラビノース 1-脱水素酵素の精製
(1)ァゾスピリルムブラシリエンスの無細胞抽出液の調整
ァゾスピリルムブラシリエンス ATCC29145は、理化学研究所バイオリソースセンター から購入した。 37mMの L-ァラビノースを唯一の炭素源とする合成培地 (培地 1リットル あたり、 4g KH PO、 6g K HPO , 0.2g MgSO ·Η 0、 O.lg NaCl, 0.026g CaSO -2H O
2 4 2 4 4 2 4 2
, lg NH Cl、 O.Olg FeCl -6H 0、 0.002g NaMoO -2H 0、 O.OOOlgピオチン、 pH 6.8)
4 3 2 4 2
で、本菌を 30°Cで 24時間培養した。遠心で回収した菌体は、バッファー A (2 mM Mg CI、 lOmM 2-メルカプトエタノールを含む 20mMリン酸カリウムバッファー、 pH7.0)に懸
2
濁した。超音波処理により破砕した後、 4°Cで 20分間、 105000 X gで遠心し無細胞抽 出液を得た (分画 1)。
[0025] (2)酵素活性測定
L-ァラビノース 1-脱水素酵素の活性測定は、反応によって生成される NAD(P)Hの 特異的な 340nmの吸収度の増加を 30°Cでモニターすることによって行った。適量の L -ァラビノース 1-脱水素酵素は、 10mM L-ァラビノースと ImM NAD(P)+を含む lOOmM Tris-HClバッファー (pH9.0)に加えられた。酵素反応は、 NAD(P)+をカ卩えることで開 始した。この酵素の 1ユニットは、 l /z molの NAD(P)Hを 1分間に生成するために必要な 量と定義した。 Kmおよび kcatは、種々の濃度の基質、補酵素を用いた Lineweaver-B urkプロットから算出した。タンパク質濃度は、ゥシ血清アルブミンを標準物質として Lo wry法によって決定した。
[0026] (3) L-ァラビノース 1-脱水素酵素の精製
'硫酸アンモニゥム分画
粉末状の (NH ) SOを無細胞抽出液にカ卩えることで、飽和度 50%から 60%で沈殿する
4 2 4
タンパク質を遠心で回収した。分画したタンパク質は、少量のバッファー Aに溶解させ た後で 1.3M (NH ) SOを含むバッファー Aに対して 4°Cで一晩透析した。透析後、遠
4 2 4
心して不溶性物質を除去しその上清を次のステップに用いた (分画 2)。
•疎水性クロマトグラフィー分画
以下に行う全てのクロマトグラフィーは、 AKTA purifier system (Amersham Pharmaci a Biotech社)を用いて 4°Cで行った。分画 2は、 1.3M (NH ) SOを含むバッファー Aで
4 2 4
平衡化された HiPrep 16/10 Butyl FFカラム (Amersham Biosciences)に添カ卩され、同じ バッファーで洗浄した。その後、バッファー Aの中の 1.3-OM (NH ) SO逆勾配によつ
4 2 4
てタンパク質を溶出した。高い L-ァラビノース 1-脱水素酵素活性を含むフラクション を集め、バッファー Aに対して 4°Cで一晩透析した (分画 3)。
•陽イオン交換クロマトグラフィー分画
分画 3を、バッファー Aで平衡化された HiPrep 16/10 Q FFカラム (Amersham Bioscie nces)に添カ卩し、同じバッファーで洗浄した。その後、バッファー Aの中の 0-1M NaCl 勾配によってタンパク質を溶出した。高い L-ァラビノース 1-脱水素酵素活性を含む フラクションを集め、バッファー B (10mM 2-メルカプトエタノールを含む 5mMリン酸カリ ゥムバッファー、 PH7.0)に対して 4°Cでー晚透析した (分画 4)。
[0027] 'ヒドロキシアパタイト 'クロマトグラフィー
分画 4は、バッファー Bで平衡化された CHT Ceramicヒドロキシアパタイト Type I力 ラム (Bio- Rad)に添カ卩され、同じバッファーで洗浄した。その後、バッファー Bの中の 0. 005-0.5M PO 2勾配によってタンパク質を溶出した。高い L-ァラビノース 1-脱水素
4
酵素活性を含むフラクションを集め、 Centriplus YM-30 (Millipore社)を用いて 18,000 X gで約 2時間限外濾過した (分画 5)。 •ゲル濾過クロマトグラフィー
分画 5をバッファー Aで平衡化された HiLoad 16/60 Superdex 200 pgカラム (Amersha m Biosciences)に添カ卩し、高い L-ァラビノース 1-脱水素酵素活性を含むフラクション のみを集め (分画 6)、限外濾過で濃縮した後同じカラムに添加した。高い L-ァラピノ ース 1-脱水素酵素活性を含むフラクションを SDS-PAGEで解析し単一の酵素のみを 含むフラクションを集め濃縮し精製酵素とした (分画 7)。
[0028] (4)酵素反応生成物の同定
精製酵素 10 gを 10mM L-ァラビノースと 10mM NAD(P)+を含む lOOmM Tris- HC1 バッファー (lml)中で 30°Cで 30分間インキュベートし、そのうち 100 μ 1を Aminex HPX- 8 7H Organic Analysis column (Bio— Rad社)に添カ卩した。バッファ一は 5mM H SOを用
2 4 い、流速 0.6ml/minで行った。生成物の同定は、化学合成した L-ァラビノラタトンに対 して行った。 L-ァラビノラタトンは、 L-ァラボネート K+塩を 0.2M HC1中で 5分間ボイ ルすることで得た。 L-ァラボネート K+塩は、 Moore, S., and Link, K.P. (1940) J. Biol. Chem. 133, 293-311の方法に従い L-ァラビノースから合成した。
[0029] く結果と考察〉
A. brasilienseを L-ァラビノースを炭素源として培養したとき、無細胞抽出液中に L- ァラビノースを NAD(P)+依存的に酸ィ匕する酵素活性が見られた。この活性に相当す る酵素は、硫酸アンモ-ゥム分画と 5回のクロマトグラフィーによって電気泳動的に単 一に精製された (図 2A)。収率は 12%、最終的な比活性は 44ユニット/ mgタンパク質で あった (表 1)。精製の過程で活性における NADP+/NAD+の比はほぼ一定であり、本酵 素以外に主要なアイソザィムはないことが示された。本酵素は、分子量は約 36kDaの 単量体であった。精製酵素を用いた酵素反応の分析の結果、主要反応生成物は L- ァラビノラタトンと同定され (図 3)、本酵素が新規 L-ァラビノース代謝経路の最初の反 応を触媒する L-ァラビノース 1-脱水素酵素と結論付けた。本酵素の NADP+を補酵素 として用いたときの L-ァラビノースに対する比活性は 44.9ユニット /mgタンパク質、力 イネテック'パラメータ一は Km = 0.255mM、 kcat = 2000min— 1であった。
[0030] [表 1] 操作 全タ 全活性 （ュニッ ト） 比活性 収率 濃縮
(ユニット/ (%) 率
NADP+
ク質 励+ NADP+ ragタン 。
/NAD+
(mg) ク質）
無細胞抽出液 100 1. 0
1488 248 373 1. 50 0. 25
(分画 1 )
(NH4) 2S04分画 77 1. 0
1147 171 287 1. 68 0. 25
(分画 2)
Hi Prep 16/ 10 Buty l FF 54 4. 4
186 109 202 1. 85 1. 09
(分画 3)
Hi Prep 16/ 10 Q FF 42 12
53 97 158 1 , 63 2. 98
(分画 4)
CHT Ceram i c Hydroxyapat i t e 33 64
7. 8 70 124 1 , 77 15. 9
(分画 5)
Hi Load 16/60 Superdex 200 pg 24 87
4. 2 51 91 1 , 78 21. 7
(分画 6)
Hi Load 16/60 Superdex 200 pg 12 176
1. 0 25 44 1 , 76 44. 0
(分画 7) 実施例 2 L-ァラビノース 1-脱水素酵素遺伝子の同定
(1) N-末端および内部アミノ酸配列の決定
精製酵素を SDS-PAGEで分離後、 PVDF膜にエレクトロブロットした。染色した後、バ ンドを切り出しプロテイン 'シークェンサ一によつて 25残基分の N-末端アミノ酸配列を 決定した。内部配列を決定するために、精製酵素 100 /z gを 0.1%(w/v)のシアンィ匕臭素 (BrCN)を含む 70%(v/v)の蟻酸中でィ匕学的に切断した。凍結乾燥したサンプルを SDS -PAGEで分離後 PVDF膜にブロッテイングし、未切断のものを除く 2つのバンド (図 2B の Fragment Iと II)の 25残基分のアミノ酸配列を決定した。
(2) L-ァラビノース 1-脱水素酵素遺伝子の部分的 DNA断片の増幅
決定した N-末端アミノ酸配列である (M)SDQVSLGVと内部配列である (M)LEKPPGA Tをもとに、 8種類の U1U8プライマー
5 ' -ATGTCNGAYC ARGTNTCNCTNGGNGT-3 ' (26量体)（配列番号 15)
5 ' -ATGTCNGAYC ARGTNTCNTTRGGNGT-3 ' (26量体)（配列番号 16)
5 ' -ATGTCNGAYC ARGTNAGYCTNGGNGT-3 ' (26量体)（配列番号 17)
5 ' -ATGTCNGAYC ARGTNAGYTTRGGNGT-3 ' (26量体)（配列番号 18)
5 ' -ATGAGYGAYC ARGTNTCNCTNGGNGT-3 ' (26量体)（配列番号 19)
5 ' -ATGAGYGAYC ARGTNTCNTTRGGNGT-3 ' (26量体)（配列番号 20) 5 ' -ATGAGYGAYC ARGTNAGYCTNGGNGT-3 ' (26量体)（配列番号 21) 5 ' -ATGAGYGAYC ARGTNAGYTTRGGNGT-3 ' (26量体)（配列番号 22)
と、 2種類の Dl、 D2プライマー
5 ' -GTNGCNCCNGGNGGYTTYTCNAGC AT-3 ' (26量体)（配列番号 23)
5 ' -GTNGCNCCNGGNGGYTTYTC YAAC AT-3 ' (26量体)（配列番号 24)
を設計した。 PCRは、 EX-taq DNAポリメラーゼ (TaKaRa社)を用いて行われた。 lOpmo
1の各プライマーと lOOngの A. brasilienseゲノム DNAを使い、変性を 98°Cで 10秒間、ァ ニーリングを 50°Cで 30秒間、伸長反応を 72°Cで 30秒間を 30サイクル行った。得られた 約 300bpの DNA断片をプラスミド pGEM- Tに導入し、これを pGEMlと名付けた。
[0032] (3) L-ァラビノース 1-脱水素酵素遺伝子の全長の単離
pGEMlに導入した DNA断片をプローブとして用いたサザンハイブリダィゼーシヨン の結果、 L-ァラビノース 1-脱水素酵素遺伝子は約 2kbpの長さを持つ制限酵素 Notl のゲノム断片上にあることが示された。そこで、 Notlで切断した A. brasilienseゲノム DN Aをァガロース ·ゲルで分離したあと、約 2kbpの断片のみを精製しプラスミド pBluescrip t KS (-)の Notl制限酵素切断部位に導入し大腸菌に形質転換して、部分的なゲノムラ イブラリーを作製した。コロニー 'ハイブリダィゼーシヨンによって L-ァラビノース 1-脱 水素酵素遺伝子を含むゲノム断片の入った pBluescript KS (-)を単離し (pBSl)、シー ケンスによって本遺伝子全長とその近傍のヌクレオチド配列 (1805bp) (配列番号 1)を 決定した (図 4)。
[0033] く結果と考察〉
BrCNで切断して得られた 2つのペプチド断片 (図 2B)のうち、 Fragment Iの配列は N- 末端の配列と同じであった。一方、 Fragment IIの配列はそれとは全く異なっておりこ れが内部配列に相当することが分力つた。これをもとに遺伝子の上流 (U1-U8)と下流 ( Dl、 D2)に対するプライマーを設計し、ゲノミック PCRを行い単一の増幅断片を得た。 シーケンスの結果、推定されるアミノ酸配列は数種類の既知の糖脱水素酵素の一部 と相同性を示したので、本断片は L-ァラビノース 1-脱水素酵素遺伝子の一部であろ うと推定された。サザン 'バイブリダィゼーシヨンは本遺伝子がゲノム上に 1つしか存在 しな 、ことを示唆したので、プラスミドベクターを用いた部分的ゲノムライブラリーの中 から L-ァラビノース 1-脱水素酵素遺伝子の全長を含むゲノム断片を単離し、遺伝子 配列を決定した (図 4) (配列番号 1)。推定されるアミノ酸配列は、精製酵素から決定し た N-末端および内部配列と全く同一の配列を含んでおり (図 4の下線を付したァミノ 酸配列)、本遺伝子が精製酵素をコードしていることが強く示唆された。
実施例 3 大腸菌を用いた組換え酵素の発現
( 1)プラスミドの構築
L-ァラビノース 1-脱水素酵素遺伝子の 5'末端に Bglll切断部位、 3'末端に Pstl切断 部位を導入するために、 2つのプライマー、
5 ' -caccatagatctGATC AGGTTTCGCTGGGTG-3 ' (31量体)（配列番号 25)
5'-gcttggctgcagTCAGCGGCCGAACGCGTCG-3' (31量体)（配列番号 26) を準備し、 pBSlプラスミドを用いて PCRを行った。ここで、上記プライマーの小文字の 部位は付加した塩基配列、下線部はそれぞれ Bglllと Pstlの切断部位を示す。増幅し た DNA断片は、 Bglllと Pstlで切断した後、 BamHIと Pstlで処理したプラスミド pQE80-L (Qiagen)に導入した。このプラスミドは、アミノ酸末端に 6個のヒスチジンタグを付けてタ ンパク質を発現させることができる。
(2)ヒスチジンタグのつ 、た L-ァラビノース 1-脱水素酵素の発現と精製
L-ァラビノース 1-脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドを導入した大腸菌 DH5 aを、 50mg/lのアンピシリンを含む Super broth (1リットル当たり 12gペプトン、 24gイースト' ェクストラタト、 5mlグリセロール、 3.81g KH PO 、 12.5g K ΗΡΟ 、 ρΗ7.0)を用いて、 37
2 4 2 4
°Cで 600nmの吸光度 0.6まで培養した。その後、 L-ァラビノース 1_脱水素酵素を発現 誘導するために、最終濃度 ImMになるようにイソプロピル- β -D-チォガラタトビラノシ ド（IPTG)を添加しさらに 6時間培養を続けた。培養終了後に遠心分離で集菌し、少 量のバッファー C (2mM MgCl、 0.3M NaCl、 ImM L-ァラビノース、 10mM 2-メルカプ
2
トエタノール、 lOmMイミダゾールを含む 50mMリン酸ナトリウムバッファー、 pH8.0)に 懸濁した。超音波処理により破砕したのち遠心し、その上澄みをバッファー Cで平衡 ィ匕した Nト NTA spin column (Qiagen)に添カ卩した。バッファー D (10% (v/v)グリセロー ルを含み、 10mMイミダゾールの代わりに 50mMイミダゾールを含むバッファー C)で 3 回洗浄したのち、酵素はバッファー E (50mMイミダゾールの代わりに 250mMイミダゾ ールを含むバッファー D)で溶出させた。
[0035] (3)ウェスタン.ブロッテイング
精製組換え酵素は、 SDS-PAGEで分画した後-トロセルロース膜にエレクトロブロッ トされた。ウェスタン'ブロッテイングは、 ECL™ Western Blotting Analysis System (A mersham Biosciences)と RGS ' His HRP抗体（組換え酵素の N-末端に付カ卩された Arg -Gly-Ser-(His)6配列に対するモノクローナル抗体、 Qiagen)を用いた。
く結果と考察〉
単離した遺伝子力 実際に L-ァラビノース 1-脱水素酵素が作られるかを確かめる ために、組換え酵素発現用のプラスミドの構築を行った。組換え酵素は、 N-末端に 6 つのヒスチジン ·タグのつ 、た形で大腸菌で発現させ、ニッケル ·ァフィユティーカラム で電気泳動的に単一に精製された (図 2C)。ウェスタン 'ブロッテイングは、実際に L- ァラビノース 1-脱水素酵素の N-末端にヒスチジンタグが付加されて ヽることを示した ( 図 2C)。これによつて、組換え酵素の分子量は天然精製酵素に比べて若干大きくなつ た。この組換え酵素は、天然精製酵素と同様に NADP+に対してより高い活性を示し、 L-ァラビノースに対する比活性 (32ユニット/ mgタンパク質)と Km (0.26mM)、 kcat (98 9min— の値も類似していた。これらの結果は、単離した遺伝子が間違いなく L-ァラビ ノース 1-脱水素酵素をコードしていることを示した。この遺伝子を AraAと名付けた。
[0036] 実施例 4 細菌の L-ァラビノース代謝に関わる新規オペロンの同定
(1) AraA遺伝子周辺のヌクレオチド配列の解析
実施例 2- (3)で単離した l,805bpの A. brasilienseゲノム DNAの Notl-Notl断片のヌク レオチド配列を、ジーン'バンクに登録されて 、る塩基配列に対して相同性検索を行 つた。その結果、ブルクホルデリアセパシァ株（Burkholderia cepacia strain) R18149 のゲノム DNA配列の一部と高!、相同性 (91%)を示した。この菌は既にゲノム ·プロジェ タトが終了しており、推定される遺伝子の機能の同定も行われている。そこで、 B. cep aciaのゲノム DNAにおける AraA遺伝子近傍を見てみると、 AraA遺伝子のホモログを 含め計 8個の遺伝子クラスターが存在することが分力つた (図 5)。本菌の L-ァラビノー ス代謝に関しては報告がないが、おそらく A. brasilienseと同様の新規経路 1(あるいは 2)を持つことが予想される。また、これらの遺伝子は AraA遺伝子同様に L-ァラビノー スの新規経路に含まれる酵素をコードしている可能性が示唆された。
[0037] (2)A. brasilienseの L-ァラビノース'オペロン全長の単離
A. brasilienseと B. cepaciaの L-ァラビノース'オペロンのヌクレオチド配列はよく似て いることが予想されるので、 A. brasilienseゲノム DNAの Notl-Notl断片の上流と下流 の塩基配列を決定するために B. cepaciaの配列を参考に 4つのプライマーを設計した 。上流については UP-Sと UP-AS、下流については DOWN-Sと DOWN-ASをプライマ 一として用い、 A. brasilienseゲノム DNAを铸型として PCRを行いそれぞれ約 3.5kbpと 4 .3kbpの増幅産物を得た。それぞれを pGEM-Tベクターに組み込み、 pGEM2、 pGEM 3と名付けた (図 5)。導入した DNA断片のシーケンスを行い、実施例 2- (3)で pBSlに 導入された Notl-Notl断片の配列と組み合わせて A. brasilienseの L-ァラビノース 'ォ ペロンのほぼ全長のヌクレオチド配列とした (8679bp、図 5と図 7) (配列番号 5)。この中 には B. cepacia同様 8個の遺伝子が含まれており、それぞれの遺伝子をそれぞれ便 宜的に図 5のように名付けた。以下にこの実験に用いたプライマーの塩基配列を示す
-3' (44量体)（配列番号 27) UP- AS: 5'- CGCGCGTGTCCGGATGCAGTTCCGGCA TCGGATGCCGCGGCCGC- 3' (44量体）（配列番号 28) DOWN- S: 5'- CGGATCAC GAACTACGAGCTGCCGACCGCG-3' (30量体)（配列番号 29)
CCGC-3' (45量体)（配列番号 30)
[0038] (3) AraB、 AraC、 AraD遺伝子の機能の推定
•AraB遺伝子（図 5)
推定されるアミノ酸配列は、チモモナスモビリス（Zymomonas mobilis)由来のダルコ ノラクトナーゼと弱い相同性を示す (25%)。ダルコノラクトナーゼは D-ダルコノラタトン→ D-ダルコネートの加水開環反応を触媒する力 これは L-ァラビノラクトナーゼと相同 な反応である。そこで、 AraB遺伝子は L-ァラビノラクトナーゼとして機能すると推定し た。
•AraC遺伝子（図 5) 推定されるアミノ酸配列は、ジヒドロキシ酸脱水酵素と 6-ホスホダルコネート脱水酵 素からなる ILVD/EDD脱水酵素プロテイン 'ファミリーの酵素と相同性がある (例えば、 大腸菌の 6-ホスホダルコネート脱水酵素と 28%の相同性)。 6-ホスホダルコネート脱水 酵素は、 Entner- 00 (101"011¾路の中で 6-ホスホダルコネート→2 -デヒドロ- 3-デォキ シ- 6-ホスホ- D-ダルコネートの脱水反応を触媒する力 これは L-ァラボネート脱水酵 素と相同な反応である。そこで、 AraC遺伝子は L-ァラボネート脱水酵素として機能 すると推定した。
•AraD遺伝子（図 5)
推定されるアミノ酸配列は、本酵素が DHDPS/NALプロテイン 'ファミリーに属するこ とを示唆した。このファミリーに含まれる酵素の反応の特徴はアルドール開裂によって ピルビン酸とアルデヒドが生ずることである力 この反応は新規 L-ァラビノース経路 2 に含まれる L-KDAアルドラーゼと相同である（図 1C)。このこと力 、本遺伝子は L-K DA脱水酵素の第一候補であるにも関わらずアミノ酸配列からはむしろ L-KDAアル ドラーゼである可能性を示唆される、 t 、う興味深 、結果が得られた。
[0039] 実施例 5 A. brasilienseの a KGSA脱水素酵素の同定
(1)初期的な解析
Burkholderia cepacia strain R18149と近縁な関係にあるブルクホルデリアチアイラ デンシス (Burkholderia thiailandensis)のゲノム DNAのドラフト配列が最近公開された 。これによると、この菌も L-ァラビノース'オペロンを持つ力 それを構成する遺伝子の 中に B. cepaciaにはない付カ卩的な遺伝子カ^つ含まれている (図 5)。推定されるァミノ 酸配列はアルデヒド脱水素酵素と相同性を示すので、この遺伝子が a KGSA脱水素 酵素に対応すると考えられる。この遺伝子を AraEと名付けた。 A. brasilienseの L-ァラ ビノース 'ォペロンにもまた AraE遺伝子に相当する遺伝子はないので、本酵素は L- ァラビノース 1-脱水素酵素同様に、独立に精製して遺伝子を単離する必要があった
[0040] (2) a KGSA脱水素酵素の精製
，無細胞抽出液の調整
A. brasilienseの菌体は、実施例ト（1)と同様に得た。遠心で回収した菌体は、バッ ファー A' (1 mM EDTA、 lOmM 2-メルカプトエタノールを含む 20mMリン酸カリウムバ ッファー、 PH7.5)に懸濁した。超音波処理により破砕した後、 4°Cで 20分間、 105000 X gで遠心し無細胞抽出液を得た (分画 1)。
•酵素活性測定
a KGSA脱水素酵素の活性測定は、反応溶液として 10mM 2_メルカプトエタノール と ImM EDTA、 1.5mM NAD(P)+を含む 66.7mMリン酸カリウムバッファー (pH7.2)を用 い、 25°Cで行うこと以外は実施例 1-（2)に準じた。基質としては、精製過程では 10mM グルタルアルデヒド、最終的には 100 μ Μ a KGSAを用いた。
•陽イオン交換クロマトグラフィー
以下に行う全てのクロマトグラフィーは、 AKTA purifier systemを用いて 4°Cで行った 。分画 1は、バッファー A'で平衡化された HiPrep 16/10 Q FFカラムに添加され、同じ バッファーで洗浄した。その後、バッファー Aの中の 0-1M NaCl勾配によってタンパク 質を溶出した。高い a KGSA脱水素酵素活性を含むフラクション^^め、バッファー B' (10mM 2-メルカプトエタノールと ImM EDTAを含む 5mMリン酸カリウムバッファー、 PH7.5)に対して 4°Cで一晩透析した (分画 2)。
'ヒドロキシアパタイト 'クロマトグラフィー
分画 2は、バッファー B'で平衡化された CHT Ceramicヒドロキシアパタイト Type I力 ラムに添カ卩され、同じバッファーで洗浄した。その後、バッファー B'の中の 0.005-0.2M
P0 2—勾配によってタンパク質を溶出した。高い a KGSA脱水素酵素活性を含むフラ
4
クシヨンを集め、 Centriplus YM- 30を用いて 18,000 X gで約 2時間限外濾過した (分 画 3)。
•ゲル濾過クロマトグラフィー
分画 3をバッファー A'で平衡化された HiLoad 16/60 Superdex 200 pgカラムに添カロ し、高い a KGSA脱水素酵素活性を含むフラクションを集め、 1.3M (NH ) SOを含む
4 2 4 ノ ッファー A'に 4°Cで一晩透析した (分画 4)。
•疎水性クロマトグラフィー
分画 4は、 1.3M (NH ) SOを含むバッファー A'で平衡化された HiPrep 16/10 Butyl
4 2 4
FFカラムに添加され、同じバッファーで洗浄した。その後、バッファー A'の中の 1.3-0 M (NH ) SO逆勾配によってタンパク質を溶出した。高い a KGSA脱水素酵素活性を
4 2 4
含むフラクションを集め濃縮し、ノ ッファー A'に 4°Cで一晩透析した (分画 5)。
'ネイティブ- PAGE
分画 5の酵素 100 μ gをネイティブ- PAGEで分離後、 Zymogram染色液（10mM 2-メ ルカプトエタノール、 lmM EDTA、 10mMグルタルアルデヒド、 1.5mM NAD(P)+、 0.25 mMニトロブルーテトラゾリゥム、 0.06mMフエナジンメトスルフェートを含む 66.7mMリ ン酸カリウムバッファー、 PH7.2)に浸し、室温で 15分間放置した。 a KGSA脱水素酵 素活性に相当する染色されたゲルバンドを切り出し、ゲル内からペプチドを精製して 分画 5とし SDS-PAGEで分析した。
[0042] (3) a KGSA脱水素酵素遺伝子の同定
•N-末端および内部アミノ酸配列の決定
分画 5に含まれるペプチドの N-末端および内部アミノ酸配列の決定は、実施例 2- ( 1)に準じて行った。内部配列は、 BrCN切断で生じた主な 4種類のペプチドについて 決定した。
•遺伝子の単離
AraE-UP, AraE- DOWNプライマーを用いて A. brasilienseゲノム DNAを铸型として P CRを行い、約 1450bpの増幅産物を得た (図 5)。これをプラスミド pGEM- Tに導入し pGE M4と名付けた。以下にこの実験に用いたプライマーの塩基配列を示す。
GG-3' (44量体) (配列番号 31)
CGG-3' (42量体)（配列番号 32)
[0043] く結果と考察〉
A. brasilienseからの a KGSA脱水素酵素の精製の結果を表 2に示す。
a KGSAの化学合成法は 、くつか報告されて!、るが、 、ずれの方法も複雑で再現 することは難しい。精製の報告がある a KGSA脱水素酵素はダルタルアルデヒドに対 して中程度の活性を示すことが知られているので、 A. brasilienseからの α KGSA脱水 素酵素の精製にはダルタルアルデヒドを基質として用いた。 A. brasilienseを L-ァラビ ノースを炭素源として培養したとき、無細胞抽出液中にダルタルアルデヒドを NAD(P)+ 依存的に酸ィ匕する酵素活性が見られた。 NAD+依存的活性は NADP+に比べて 3倍程 度高かったので、以下精製には補酵素として NAD+を用いた。この活性に相当する酵 素は、 4回のクロマトグラフィーによって比活性 7.24ユニット /mgタンパク質まで精製さ れた (表 2の分画 5)。しかしこの中にはレ、くつかのタンパク質が共存して 、たので (図 6 の分画 5)、ゲル内染色によって脱水素活性を持つ酵素を探索したところ、分画 4の主 要な 50kDaの分子量を持つ酵素がこれに当たることが分力つた (図 6の分画 5の▲のバ ンド)。
[0044] [表 2]
Figure imgf000022_0001
[0045] 本酵素の N-末端アミノ酸配列は (M)ANVTYTDTQLLIDGEWVDAASXKXI (Xは未 同定)（配列番号 33)であり、ジーン'バンクに登録されているタンパク質のうち B. cepa ciaのアルデヒド脱水素酵素 (登録番号 ZP_00215432)の N-末端アミノ酸配列と完全に 一致した。また、決定した 4種類の内部アミノ酸配列は以下のようである。
Fragment I： (Met)- Ala- Asn- VaL- Thr- Tyr (N-末端配列と同一）（配列番号 34) Fragment II： (Met)- Thr- Gin- Glu- Gin- Gly (配列番号 35)
Fragment III： (Met)- Glu- Leu- Gly-Gly-His (配列番号 36)
Fragment IV： (Met)- Ala- Ser- VaL-Ile- Asp (配列番号 37)
このうち、 Fragment II、 III、 IVと極めてよく似た内部配列を B. cepaciaのアルデヒド脱 水素酵素も含んでいた。これらのことは、 A. brasilienseの α KGSA脱水素酵素はこの 酵素と極めて相同な配列を持つことが強く示唆された。そこで、 B. cepaciaのアルデヒ ド脱水素酵素遺伝子の 5'-および 3'-末端の塩基配列からプライマーを設計し、 A. br asilienseのゲノム DNAを铸型にゲノミック PCRを行ったところ、 B. cepaciaのアルデヒド 脱水素酵素遺伝子とほぼ同じ長さをもつ単一の DNA断片の増幅をみた。シーケンス の結果 (図 8) (配列番号 13、 14)、この DNA断片は単一のオープン 'リーディング'フレ ームをコードしており、推定されるアミノ酸配列（配列番号 14)は B. cepaciaのアルデヒ ド脱水素酵素と極めて高い相同性を示した (97%)。また、精製酵素力も決定した 3つの 内部配列と完全に同一な配列を含んで 、た (図 8の下線部の配列)。この遺伝子を Ara E (配列番号 13)と名付けた。
[0046] (4) AraR, AraX、 AraY、 AraZ遺伝子につ!、て
本発明ではこの 4つの遺伝子に関する実験例は含まないが、それぞれのアミノ酸配 列の解析力も以下のような推測をすることが可能である。まず、 AraRは典型的な DNA 結合モチーフ (ヘリックス ·ターン ·ヘリックス)を持ち、 LysRタイプの転写因子と相同性 を示す。この遺伝子が L-ァラビノース'オペロンの最も上流にあることも考えると、 Ara Rはオペロンの転写制御因子である可能性が高!、。
AraX、 AraY、 AraZは、既知の ABCタイプの糖トランスポータータンパク質、特に L- ァラビノース'トランスポーターと高い相同性がある。一般にこのタイプのトランスポー ターは、細胞質内基質結合タンパク質 (periplasmic substrate-binding protein), ATP 分解酵素 (ATPase)、膜貫通タンパク質 (permease)からなつており、 AraX、 AraY、 AraZ はそれぞれこれら 3つに対応していると思われる。
[0047] 実施例 6 AraB、 AraC、 AraD、 AraE遺伝子の大腸菌内での発現と組換え酵素の精 製
( 1)プラスミドの構築
AraB、 AraC、 AraD、 AraE遺伝子の 5'末端、 3'末端に、それぞれ BamHI-PstI、 BamH I-KpnU BglII-PstI、 BamHI-Pstlの制限酵素部位を導入するために、プライマーの設 計を行った。小文字の部位は付加的した塩基配列、下線部は制限酵素の切断部位 を示す。
AraB-UP: 5'— caccatggatccCAACAGATTCATCCGGCCGGGCAGGCGACGCTGC TGGC-3' (配列番号 38) AraB - DO漏： 5し gcttggctgcagTCAGCCGCGCGGCGTCCCCGCAAACCGCGCCG TCGCC-3' (配列番号 39)
AraC— UP: 5'-caccatggatccTCGGCAACGAAACCCAGGCTGCGCTCTACCCAAT GG-3' (配列番号 40)
AraC— DOWN: 5'— acccggggtacctcaatgcgaatggctcggcacttcagcgccgcgcgtgccg— 3' (酉己歹 [J 番号 41)
AraD— UP: 5し caccatagatctACATCGAGCAGCACGCCGCGCCATCGC— 3' (配列番 号 42)
AraD— DOWN: 5'— gcttggctgcagTCAGTGCGCCCAGCGCAGCACGAGCGG— 3' (配 列番号 43)
AraE-UP2: 5'-caccatggatccGCTAACGTGACTTATACGGATACGCAACTGCTGA TCGACGG-3 ' (配列番号 44)
AraE— DOWN2:5'— gcttggctgcagTCAGACGGCCATCACCGTCACCGACTTCGTGA CGAGGTACGG- 3' (配列番号 45)
全ての遺伝子は A. brasilienseのゲノム DNAを铸型にゲノミック PCRで増幅、制限酵 素処理されたあとで、 PQE80-Lの適切な制限酵素部位 (AraB、 AraD, AraEは BamHI- Pstl部位、 AraCは BamH卜 Kpnl部位)に導入された。
(2)ヒスチジンタグのっレ、た AraB、 AraC, AraD, AraEの発現と精製
形質転換した大腸菌の培養および組換え酵素の発現、精製は、基本的には実施 例 3- (2)に従った。ただし、精製の際に用いるバッファーの pHと添加物は各タンパク 質によって多少、異なって 、る。
く結果と考察〉
AraB, AraC, AraD, AraEタンパク質は、 AraAと同様に N-末端にヒスチジン'タグの 付いた形で大腸菌で発現させ電気泳動的に単一に精製された (図 9A)。それぞれの サブユニットの分子量は、アミノ酸配列力 計算された理論値とほぼ一致した (AraB: 41300Da/33555.0Da、 AraC: 610000Da/62228.53Da、 AraD: 370000Da/35022.47Da 、 AraE: 520000Da/52097.7Da) (前者は SDS-PAGEの分子量マーカーから計算した 分子量、後者は理論値)。実施例 3- (3)と同じウェスタン 'ブロッテイングの結果、各タ ンパク質にヒスチジン ·タグが付加されて 、ることが確認された (図 9B)。
[0049] 実施例 7 L-ァラビノラクトナーゼとしての AraBタンパク質の同定
以下、全ての酵素反応生成物の分析は、実施例 1- (4)に準じた HPLCによって行つ た。
実施例 1- (2)で精製した組換え AraAタンパク質 (0.3 μ Μ)を ImM MgC12、 10mM L- ァラビノース、 10mM NADP+を含む 20mMリン酸カリウムバッファー (pH7.2)で 30oC、 1. 5時間インキュベートしても L-ァラボネート形成はほとんど観察できない (図 10A)。一方 、同じ条件で AraBタンパク質 (0.3 M)を共存させると、有意な L-ァラボネート形成が 見られた (図 10B)。このことは、 AraBタンパク質が L-ァラビノラタトン→L-ァラボネート の加水開環反応を触媒する L-ァラビノラクトナーゼであることを示している。
[0050] 実施例 8 L-ァラボネート脱水酵素としての AraCタンパク質の同定
出発物質である L-ァラボネートは、カリウム塩として実施例 1- (4)の方法で化学合 成した。 AraCタンパク質 (1.3 μ Μ)を、 10mM L-ァラボネート、 10mM MgClを含む 50m
2
M HEPESバッファー (pH7.2)の中で 30°Cでインキュベートすると、反応時間の経過に 従って酵素反応生成物に対応すると思われる新たなピークが現れた (図 10C)。便宜 的にこの生成物を Product Iとする力 以降に示す実験結果力 見てこれが L-KDAで あることはほぼ間違!/、な!/、。
L-ァラボネート脱水酵素の活性は、生成される α -ケト酸を 190nmの波長で 30°Cで 分光学的に検出した。反応溶液として 10mM L-ァラボネート、 10mM MgClを含む 50
2 mM HEPESバッファー (pH7.2)を用いた。 AraCタンパク質は、 L-ァラボネートに対して 比活性 126ユニット/ mgタンパク質、 Km = 34.5mM、 kcat = 213 s— 1の値を示した。
[0051] 実施例 9 L-KDA脱水酵素としての AraDタンパク質の同定
実施例 4- (3)で示したように、 AraDタンパク質のアミノ酸配列からは本酵素が L-KD A脱水酵素よりむしろ L-KDAアルドラーゼではないかと推測された。もし前者であれ ば酵素反応によって ( KGSAのみができるし、後者であればピルビン酸とダリコール アルデヒドの 2つが生じる。そこで、実施例 8で完全に反応が終了した溶液に対して Ar aDタンパク質 (3.2 M)をカ卩え、さらに 30°Cでインキュベートした。その結果、時間経過 に伴って溶出時間約 10分の位置に単一の生成物に由来すると思われる新たなピー クが生じた (図 10D)。一方、ピルビン酸とダリコールアルデヒドの溶出時間はそれぞれ 10.2分と 12.4分であり、このことは AraDタンパク質が少なくとも L-KDAアルドラーゼ活 性は持たないことを示す。酵素反応生成物を便宜的に Product IIとするが、以降に示 す実験結果から見てこれが a KGSAであることはほぼ間違!/ヽな!、。
L-KDA脱水酵素の活性は、生成された a KGSAを a KGSA脱水素酵素による酸 ィ匕に伴う NAD(P)Hの特異的な 340nmの吸収度の増加を分光学的にモニターすること によって行った。ここで用いる α KGSA脱水素酵素は A. brasilienseからグルタルアル デヒド脱水素酵素として精製した AraEタンパク質である力 次の実施例 10で示すよう にこの酵素は a KGSA脱水素酵素であることが証明された。反応溶液として 10mM 2 -メルカプトエタノール、 ImM EDTA、 100 ^ M L-KDA, 1.5mM NAD+、 0.0083ユニット の精製した組換え AraEタンパク質を含む 66.7mMリン酸カリウムバッファー (pH7.2)を 用いた。反応温度は 25°C、酵素反応は L-KDAをカ卩えることで開始した。 AraDタンパ ク質は、し-1 0 に対して比活性33.3ユニット/ mgタンパク質、 Km = 54.7 μ M、 kcat = 22.1 s— 1の値を示した。
実施例 10 α KGSA脱水素酵素としての AraEタンパク質の同定
実施例 8、 9で示したように、化学合成された L-ァラボネートから AraC、 AraDを用い た酵素学的変換によって α KGSAを得ることが出来た。そこで、これを用いて実施例 5 - (2)の酵素活性測定の項で用いたダルタルアルデヒドの替わりに、精製した a KGS A (100 M)を基質として用いて組換え AraEタンパク質の脱水素酵素活性を測定した 。 α KGSAに対する比活性は 42.5ユニット/ mgタンパク質であり、これはグルタルアル デヒドに比べて 3倍以上高力つた。次に、それぞれの基質に対する代謝効率 (kcat/K m)を測定した。 a KGSAの kcat/Kmは 4660 s— mM— 1であり、グルタルアルデヒド (755 s — i ' mM— に比べて 6倍高力つた。
さらに、 AraEタンパク質 (0.2 μ Μ)を 10mM 2-メルカプトエタノール、 ImM EDTA、 10m M a KGSA, lOmM NAD+を含む 66.7mMリン酸カリウムバッファー (pH7.2)中で 30°Cで インキュベートすると、酵素反応生成物に由来する新たなピークが HPLC分析で見ら れた (図 10Eの上段)。この物質の溶出様式は α—ケトグルタル酸と一致した (図 10Eの 下段)。これらの結果は、 AraEタンパク質が a KGSAを NAD+依存的に酸ィ匕して α—ケ トグルタル酸を生成する a KGSA脱水素酵素であることを示している。
産業上の利用可能性
[0053] 本発明は、植物構成成分のうち D-キシロースとともに五炭糖の大部分を占める L- ァラビノースの新規代謝経路を提供するものである。この代謝経路により、 L-ァラピノ ースを aーケトグルタル酸又はピルビン酸に酵素的に変換させることが可能となり、 生じた aーケトグルタル酸はクェン酸サイクルに入りピルビン酸を介してエタノールに 変換されるため、 D-キシロース力もエタノールを酵素的に変換することが可能となる。 酵母は、セルロースなどの構成成分である六炭糖を高効率でエタノールへと変換で き、エタノール耐性に優れているため、本発明の遺伝子を酵母に導入した組換え酵 母は、 L-ァラビノースなどの五炭糖を原料として高効率でエタノールへと変換できる 能力をも有することとなり、木質系ノ^オマスの利用率を格段に向上させることができ る。
図面の簡単な説明
[0054] [図 1A]既知の細菌による L-ァラビノース代謝経路を示す。
[図 1B]既知のカビによる L-ァラビノース代謝経路を示す。
[図 1C]新規な細菌による L-ァラビノース代謝経路を示す。
[図 2A]L-ァラビノース 1-脱水素酵素精製の SDS-PAGEを示す。分画 1、 2は 50 /^、 分画 3〜7は 10 gのタンパク質を 12%ゲルを用いて泳動した。 Mは分子量マーカーで ある。
[図 2B]BrCNで切断した L-ァラビノース 1-脱水素酵素の SDS-PAGEを示す。 5 gの タンパク質を、 18%ゲルを用いて泳動した。 Mは分子量マーカーである。 Fragment I、 I Iの N-末端アミノ酸配列を決定した。
[図 2C]L-ァラビノース 1-脱水素酵素及びヒスチジン'タグが N-末端に付加された L- ァラビノース 1-脱水素酵素の組換え体の SDS-PAGEとウェスタン ·ブロッテイングを示 す。 SDS-PAGEでは 5 μ g、ウェスタン'ブロッテイングでは 1 μ gのタンパク質を 12%ゲル で泳動した。 Mは分子量マーカーである。
[図 3]L_ァラビノース 1-脱水素酵素の反応生成物の HPLCによる分析結果を示す。 各ピークの数字は溶出時間を示す。 A. lOmM L-ァラビノース (100 1)の溶出カーブ 。 B. lOmM L-ァラビノラタトン (100 μ 1)の溶出カーブ。 C. 10mM L-ァラボネート（100 1)の溶出カーブ。 D. L-ァラビノース 1-脱水素酵素による反応後の溶液 (100 1)の 溶出カーブ。
[図 4]L-ァラビノース 1-脱水素酵素遺伝子を含む 1805bpの A. brasilienseゲノム DNA 断片の塩基配列を示す。下線部は Notl制限酵素切断部位、推定される L-ァラビノー ス 1-脱水素酵素のアミノ酸配列は塩基配列の下に示した。下線を付した部分は、精 製酵素から直接決定したアミノ酸配列である。
[図 5]A. brasiliense, B. cepacia R18149 (上段)と B. thiailandensis (下段)の L-ァラビノ ース.オペロンの模式図である。同じ符号の遺伝子は互いに相同である。
[図 6] a KGSA脱水素酵素精製の SDS- PAGEを示す。分画 1は 50 μ g、分画 2〜5は 10 gのタンパク質を 10%ゲルを用いて泳動した。 Mは分子量マーカーである。▲のつい たペプチド 'バンドが a KGSA脱水素酵素に相当する。
[図 7]A. brasilienseの L-ァラビノースォペロンの塩基配列を示す。この配列は、図 5の pGEM2、 pBSl (図 4)、 pGEM3の塩基配列を連結して決定した。各遺伝子の推定され るアミノ酸配列は塩基配列の下に示した。下線を付した部分は以下のアミノ酸配列を 示す。実線: AraR、短波線: AraC、一点鎖線: AraD、長波線: AraA、長二点鎖線: Ara X、点線: AraY、長一点鎖線: AraZ、二点鎖線: AraB
[図 8] a KGSA脱水素酵素遺伝子の塩基配列を示す。下線を付した部分は、精製酵 素から直接決定したアミノ酸配列である。
[図 9]ヒスチジン 'タグが N-末端に付カ卩された組換え (AraA)、 AraB, AraC、 AraD、 Ara Eタンパク質の SDS-PAGE(A)とウェスタン'ブロッテイング (B)を示す。 SDS-PAGEでは 5 g、ウェスタン'ブロッテイングでは 1 μ gのタンパク質を 10%ゲルで泳動した。 Mは分 子量マーカーである。
[図 10A]AraAタンパク質の酵素反応生成物の HPLC分析結果、すなわち、 AraAタン パク質による L-ァラビノース→L-ァラビノラタトンの変換反応生成物の溶出カーブを 示す。
[図 10B]AraBタンパク質の酵素反応生成物の HPLC分析結果、すなわち、 AraBタン パク質による L-ァラビノラタトン→L_ァラボネートの変換反応生成物の溶出カーブを 示す。
[図 10C]AraCタンパク質の酵素反応生成物の HPLC分析結果、すなわち、 AraCタン パク質による L-ァラボネート→L-KDAの変換反応生成物の溶出カーブを示す。
[図 10D]AraDタンパク質の酵素反応生成物の HPLC分析結果、すなわち、 AraDタン パク質による L_KDA→ a KGSAの変換反応生成物の溶出カーブを示す。
[図 10E]AraEタンパク質の酵素反応生成物の HPLC分析結果、すなわち、上段は、 Ar aEタンパク質による a KGSA→ aーケトグルタル酸への変換反応生成物の溶出力一 ブ、下段は α—ケトグルタル酸の溶出カーブを示す。

Claims

請求の範囲
[I] 以下の工程を含む L-ァラビノースをひ一ケトグルタル酸に変換する方法。
(A) L-ァラビノースを L-ァラピノ一 γ—ラタトンに変換する工程、
(B) L-ァラビノー γ—ラタトンを L-ァラボネートに変換する工程、
(C) L-ァラボネートを L- 2—ケト 3 デォキシァラボネートに変換する工程、
(D) L- 2 ケト— 3 デォキシァラボネートを α -ケトグルタル酸セミアルデヒドに変 換する工程、及び
(E) aーケトグルタル酸セミアルデヒドを α—ケトグルタル酸に変換する工程。
[2] 以下の工程を含む L-ァラビノースをグリコールアルデヒドに変換する方法。
(A) L-ァラビノースを L-ァラピノ一 γ—ラタトンに変換する工程、
(B) L-ァラビノー γ—ラタトンを L-ァラボネートに変換する工程、
(C) L-ァラボネートを L- 2—ケト 3 デォキシァラボネートに変換する工程、
(F) L- 2 ケト— 3 デォキシァラボネートをピルビン酸に変換する工程。
[3] L-ァラビノースを L-ァラピノ一 γ—ラタトンに変換する工程を触媒する、 L-ァラピノ ースー 1 脱水素酵素。
[4] L-ァラピノ一 γ—ラタトンを L-ァラボネートに変換する工程を触媒する、 L-ァラピノ ラクトナーゼ。
[5] L-ァラボネートを L- 2 ケト— 3 デォキシァラボネートに変換する工程を触媒する
、 L-ァラボネート脱水酵素。
[6] L- 2 ケト— 3 デォキシァラボネートを α ケトグルタル酸セミアルデヒドに変換す る工程を触媒する、L- 2 ケト— 3 デォキシァラボネート脱水酵素。
[7] a -ケトグルタル酸セミアルデヒドを a -ケトグルタル酸に変換する工程を触媒する
、 aーケトグルタル酸セミアルデヒド脱水素酵素。
[8] 請求項 3記載の酵素をコードする遺伝子。
[9] 請求項 4記載の酵素をコードする遺伝子。
[10] 請求項 5記載の酵素をコードする遺伝子。
[I I] 請求項 6記載の酵素をコードする遺伝子。
[12] 請求項 7記載の酵素をコードする遺伝子。
[13] 請求項 8〜 12記載の遺伝子のすべてを含むオペロン。
[14] 請求項 8〜 12記載の遺伝子の少なくとも 1種を含むベクター。
[15] 請求項 13記載のオペロンを含むベクター。
[16] 請求項 14又は 15記載のベクターにより形質転換された微生物。
[17] 微生物が酵母又は大腸菌である請求項 18記載の微生物。
[18] 請求項 16又は 17記載の微生物を培養することを特徴とする請求項 3〜7のいずれ 力 1項記載の酵素の製造方法。
[19] 請求項 18記載の方法により製造された酵素を使用することを特徴とする請求項 1又 は 2記載の方法。
[20] 請求項 15記載のベクターにより形質転換された微生物を使用することを特徴とする 請求項 1記載の方法。
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