WO2007041965A1

WO2007041965A1 - L'application de trpc dans le criblage de médicaments antitumoraux et l'utilisation pharmaceutique de son inhibiteur

Info

Publication number: WO2007041965A1
Application number: PCT/CN2006/002690
Authority: WO
Inventors: Yizheng Wang; Yichang Jia
Original assignee: Shanghai Institutes For Biological Sciences, Chinese Academy Of Sciences
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2006-10-13
Publication date: 2007-04-19
Also published as: CN1948502A

Description

TRPC在抗肿瘤药物筛选中的应用及其抑制剂的药物用途

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种细胞离子通道，更具体的，本发明涉及 TRPC离子通道对于抗肿瘤药物筛选方面的应用以及 TRPC拮抗剂在制备治疗肿瘤药物方面的用途。背景技术

细胞内钙稳态对于细胞正常生理活动至关重要，胞外钙离子进入胞内，以及胞内钙离子浓度上升会促进细胞的增殖和影响细胞周期 [Kahl CR, Means AR.

Endocr Rev. 2003 Dec;24(6):719-36.]。

TRP (transient receptor potential, 瞬时受体电位通道；）离子通道是最近发现的一大类离子通道家族。 Montell等根据 T P离子通道家族中各个成员的序列同源性将这一家族分成了三类： TRPC、TRPM以及 TRJPV[Montell, C等，（2002b). Mol. Cell. 9, 229 231.]。有研究报道 TRPM8和 TRPV6在前列腺癌中高表达 [Fixemer T 等， Oncogene. 2003 Oct 30;22(49):7858-61； Tsavaler L等， Cancer Res. 2001 May l;61(9):3760-9.]o T PC根据序列的同源性以及功能的相似性分成 TRPC1、 TRPC4、 TRPC 5、 TRPC3、 TRPC 6、 TRPC 7以及 TRPC2。

最新报道证实， TRPC可以被生长因子，如表皮细胞因子 (EGF)，脑源神经营养因子 (BDNF)所激活 [Li, H.S.等， (1999). Neuron 24, 261-273； Bezzerides VJ等， Nat Cell Biol. 2004 Aug;6(8):709-20; Hisatsune C等， J Biol Chem. 2004 Apr 30;279(18): 18887-94.] , 而此两种生长因子均与肿瘤细胞的增殖和肿瘤形成有关 [Yarden Y等， Annual Reviews in Biochemistry 57 443—478.1988 ; Ullrich A等， Nature 309 418-425. 1984]。

此外，有报导证实， TRPC1与 bFGF介导的神经干细胞胞内钙升高和的增殖有关，同时 TRPC6在原发性肺动脉高血压病人 (idiopathic pulmonary arterial hypertension)的肺动脉平滑肌细胞 (pulmonary artery smooth muscle cell)高表达，并与此类细胞的增殖相关 [Antoniotti S等， FEBS Lett. 2002 Jan 16;510(3):189-95； Yu Y等， Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Sep 21 ;101(38): 13861-6]。

目前，肿瘤的生长和增殖仍然是一个复杂而没有完整答案的问题，因此本领

1

确认本域迫切需要研究与肿瘤的生长和增殖有关的离子通道和相关途径，并开发针对相关途径或靶点从而抑制肿瘤细胞增殖的化合物。发明内容

本发明的目的就是提供一种与肿瘤的生长和增殖有关的 TRPC通道，并提供了通过该相关途径筛选抑制肿瘤细胞增殖的化合物等用途。在本发明的第一方面，提供了一种筛选通过 TRPC离子通道抑制肿瘤细胞增殖的化合物的方法，包括以下步骤-

(a)在测试组中，向表达 TRPC离子通道的肿瘤细胞培养物中添加待筛选的候选物，并检测肿瘤细胞的增殖情况；

(b)将步骤 (a)测试组中肿瘤细胞的增殖情况与对照组中肿瘤细胞的增殖情况进行比较，其中所述的对照组包括：未添加候选物且表达 TRPC离子通道的肿瘤细胞培养物和 /或添加候选物且不表达 TRPC离子通道的肿瘤细胞培养物；

如果测试组中的肿瘤细胞的增殖在统计学上低于 (优选显著低于，更优选的，测试组中的肿瘤细胞的增殖比对照组低 20%，最优选的为低 40%或更低)对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤细胞增殖的化合物。

在本发明的一个优选例中，所述的 TRPC离子通道为 TRPC1、TRPC3或 TRPC6。在本发明的更进一步的优选例中，所述的 TRPC离子通道为 TRPC3或 TRPC6。

在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤细胞选自：乳腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、卵巢透明细胞瘤、卵巢浆叶性腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、或卵巢内膜癌的细胞。在本发明的第二方面，提供了一种 TRPC离子通道抑制剂的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。

在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤可以是乳腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、卵巢透明细胞瘤、卵巢浆叶性腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、或卵巢内膜癌。

在本发明的一个优选例中，所述的 TRPC抑制剂为 TRPC1、 T PC3或 TRPC6 的抑制剂。在本发明的更进一步的优选例中，所述的 TRPC离子通道为 TRPC3或 TRPC6。在本发明的一个优选例中，所述的 TRPC抑制剂是 1-[ β -[3-(4-甲氧基苯基)丙氧基] -4-对甲氧酚] -1-氢 -咪唑盐酸盐 (SK&F96365)。在本发明的第三方面，提供了一种用所述的筛选通过 TRPC离子通道抑制肿瘤细胞增殖的化合物的方法获得的可抑制肿瘤细胞增殖的化合物。 . 附图说明

图 1A，图 IB显示了 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 EB染色的结果。图 1C-F以及图 1J显示了 Western blot检测各 TRPC通道亚型在肿瘤细胞株和肿瘤临床样本的表达情况。

图 2显示了各 TRPC通道亚型相对于 GAPDH的表达水平。

图 3显示了 TRPC通道在肿瘤临床样本中表达情况的免疫组化图。

图 4显示了各种组织样品的 DAB显色强弱。

图 5显示了 BDNF和 EGF在肿瘤细胞 SKOV3中可以诱发 TRPC特性的内向电流。

图 6显示了 TRPC特性的内向电流的 IV曲线分析。

图 7显示了 TRPC通道阻断剂抑制胶质瘤细胞 U251和 C6增殖， ** p<0.01。表 8显示了 SK&F 96365可以将肿瘤细胞阻断在 G2/M期。

图 9显示了 SK&F 96365对肿瘤细胞的 G2/M期阻滞是时间依赖的。

图 10显示了过表达野生型 TRPC3、 TRPC6,过表达突变型的 TRPC3、 TRPC6 对肿瘤细胞增殖的影响。

图 11显示了 TRPC3、 TRPC6突变型抑制肿瘤细胞增殖。

图 12显示了 TRPC6突变型抑制肿瘤细胞增殖。

图 13显示了釆用免疫组化方法比较子宫内膜癌标本与正常子宫内膜标本中 TRPC6的表达水平。

图 14显示了采用免疫组化方法比较胃癌标本与正常胃组织标本中 TRPC6的表达水平。

图 15显示了釆用免疫组化方法比较人的胶质细胞瘤标本与正常脑组织中胶质细胞标本中 TRPC6的表达水平。

图 16显示了子宫内膜癌、胃癌和胶质瘤样品的 DAB显色强弱。其中， " T"表示肿瘤（Tumor) ; "N"表示正常组织（Normal) ; " III或 IV"表示三或四级胶质细胞瘤； " I或 II "表示一或二级胶质细胞瘤。具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次发现了：

1. 胞外 Ca²⁺离子是通过 TRPC离子通道，具体是通过 TRPC3以及 TRPC6 进入肿瘤细胞从而促进其生长和增殖的，证明肿瘤细胞的增殖与 TRPC离子通道相关；

2.一些抑制 TRPC通道或阻断从磷脂酶 C (PLC)及三磷酸肌醇 (InsP3)通路激活的 TRPC通道的化合物能够抑制肿瘤细胞的增殖。

在此基础上完成了本发明。在众多通道中，本发明人通过研究发现， TRPC通道家族 (尤其是 TRPC1、TRPC3 以及 TRPC6)在肿瘤细胞中是主要表达的（TRPC1、 TRPC3禾卩 TRPC6的基因序列分别参见 GeneBank中 LOCUS NM— 003304; LOCUS NM_003305和 LOCUS NM_004621), 并且通过实验证明，丁1^03和丁10^ 6在乳腺癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、卵巢透明细胞瘤、卵巢浆叶性腺癌病人组织高表达，并在细胞水平证实，阻断 TRPC通道，阻断了生长因子在肿瘤细胞上激活的 TRPC类似的内向电流，并阻断肿瘤细胞的增殖。

基于本发明的新发现， TRPC离子通道有多方面的新用途。这些用途包括 (但不限于)：筛选通过抑制 TRPC离子通道进而抑制肿瘤生长的物质 (如抑制剂或拮抗剂)。

这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够有效抑制 TRPC离子通道从而抑制肿瘤生长的相关药物。

TRPC离子通道的拮抗剂或抑制剂，可以施用于哺乳动物 (包括人和非人哺乳动物)的个体，以抑制肿瘤细胞的增殖。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中 pH通常约为 5-8，较佳地 pH约为 6-8，尽管 pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括 (但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。本发明还提供了一种组合物 (如药物组合物)，它含有安全有效量的 (a) TRPC离子通道的拮抗剂或抑制剂，以及 (b)药学上可接受的载体或赋形剂。这些组合物可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖。

通常，这类载体包括 (但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约 0.1微克 /千克体重-约 10毫克 /千克体重。

在本发明中，所述的 "不表达 TRPC离子通道" 的细胞包括完全不表达 TRPC 离子通道的细胞以及包括低表达 TRPC离子通道 (低于正常表达量的 20%，优选的为低于正常表达量的 10%，更优选为低于正常表达量的 5%)的细胞。所述不表达或低表达 TRPC离子通道的细胞可以通过对正常表达 TRPC离子通道的细胞的相应基因进行 knockout处理来获得，或可以通过细胞筛选来获得。本发明的主要优点在于： '

首次证实了细胞上 TRPC离子通道与肿瘤增殖的相关性，从而提供了通过抑制 TRPC离子通道抑制肿瘤增殖的新途径。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例 1 TRPC3及 TRPC6在几种肿瘤样本中的髙表达

采用常规的 RT-PCR的方法，检测 TRPC通道各亚型在一些肿瘤中的表达水平。使用的肿瘤细胞株为：胶质母细胞瘤 (GBM， glioblastoma)、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌细胞株。具体地，从所述的肿瘤细胞或肿瘤临床样本中抽提 mRNA, 通过 RT-PCR分另 lj扩增 TRPC 1、 TRPC3 , TRPC4、 TRPC5、 TK C6、 TRPC7, 将获得的扩增产物进行琼脂精电泳检测， RT-PCR的引物如表 1所示：正向引物 SEQ ID 反向引物 SEQ ID

NO: NO:

TRPC1 ATGGAACGAATTCAGAATCC 1 GTTCAGGAACTGCTGGCA 2

TRPC3 AGGATCAATGCCTACAAGG 3 CAAGCAGACCCAGGAAGAT 4

TRPC4 AGGCTGGAGGAGAAGACACT 5 TGTCCAGGAGCATTCTTCC 6

T PC5 GAGATCATGGAGCTACTGCTG 7 TGGTCATCTCGATGGTTGA 8

T PC6 ACGAGAGCCAGGACTATCTG 9 CATCTTGCTGGAGTTCAGACT 10

T PC7 TGCAAGTGCAATGAGTGC 11 GTTCGTCCTAGCTTGCTGC 12 检测结果见图 1，人胶质母细胞瘤 U251(购于中国科学院细胞库）， A172 (ATCC No.: CRL-1620)细胞株和大鼠胶质瘤细胞株 C6(ATCC No.: CCL-107),主要表达 TRPC1、TRPC3和 TRPC6通道（图 1A)。乳腺癌细胞株 MCF-7 (ATCC No.: HTB-22)、卵巢癌细胞株 SKOV3(ATCC No.: HTB-77)，和肝癌细胞株 7721(购于中国科学院细胞库)与胶质母细胞瘤细胞株相似主要表达 TRPC1、 TRPC3和 TRPC6通道，子宫内膜癌细胞株 HEC-lA(ATCC No.:HTB-112)主要表达 TRPC1 和 TRPC6通道（图 1B)。

同时，采用 Alomone公司的 TRPC3和 TRPC6的抗体， Western blot结果显示，在 5例乳腺癌 (B.C.或 BC)病人中，与癌旁组织相比， TRPC3和 TRPC 6均高表达，特别是 TRPC6(图 1C)，相对于上样对照看家基因甘油醛 -3-磷酸脱氢酶 (GAPDH, 购于 Sigma)，在有的样品中高出正常约 30-200倍（图 2)。

在 3例胶质母细胞瘤 (GBM)临床样本中，与癌旁组织相比，其中 2例的 TRPC6高表达， 1例的 TRPC3高表达（图 1D)。同时本发明人也发现，与 5例正常卵巢组织相比， 8例卵巢透明细胞瘤（SAC或 S.A.C. , serous adenocarcinoma) 病人组织中有 6例高表达 TRPC3和 TRPC6(图 IE：)，并且，相对于上样对照看家基因甘油醛 -3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)，在有的样品中高出正常约 5-10倍 (图 2)。

在 8例卵巢浆叶性腺癌（CCC或 C.C.C., clear cell carcinoma) 病人组织中有 7 例高表达 TRPC3 , 6例高表达 TRPC6(图 1F：)，并且，相对于上样对照看家基因甘油醛 -3-磷酸脱氢酶 (GAPDH), 在有的样品中 TRPC3高出正常约 10-20倍（图 2)。

与 5例正常子宫内膜组织相比，在 9例子宫内膜瘤 (EC或 E.C., endometrial adenocarcinoma)病人组织中有 6例高表达 TRPC6, 但这 9例子宫内膜瘤病人 TRPC3并未出现高表达 (图 1J)，相对于上样对照看家基因甘油醛 -3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) , 在有的样品中 TRPC6高出正常约 10-60倍（图 2)。

为进一步证实 TRPC通道高表达在肿瘤组织中，本发明人用 TRPC6的抗体，釆用免疫组织化学方法，观察乳腺癌和胶质母细胞瘤病人中 TRPC6表达。如图 3A所示，其中，左列为苏木精 -伊红 (H&E)染色的结果，中列为用 TRPC6的抗体（ci TRPC)进行免疫组化染色的结果，右列为对中列中方框部位的放大显示。结果可见， TRPC6在侵润性乳腺癌 (IDC， invasive ductal carcinoma)和原位乳腺癌 (DCIS， in ductal carcinoma in situ)中均有高表达，而在正常的乳腺小叶中表达很弱。如图 3B所示，其中，左列为苏木精 -伊红 (H&E)染色的结果，中列为用 TRPC6的抗体进行免疫组化染色的结果，右列为对中列中方框部位的放大显示。结果可见，在 GBM的样品中， TRPC6高表达于血管周边。根据 DAB显色强弱，本发明人把样品分为强，中，阴性 DAB显色，如图 4所示， 4例 (n = 4)正常乳腺组织均为阴性， 9例 (n= 9)乳腺癌病人中有 5例强阳性， 2例中度呈色； 3例 (n= 3)正常脑组织中 TRPC6着色均为阴性， 9例 (n= 9)GBM病人中有 6例强阳性， 1例中度呈色。

综上所述，在 TRPC通道中，肿瘤细胞主要表达 TRPC1、TRPC3和 TRPC 6。在胶质母细胞瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌病人组织中 TRPC3和 TRPC6 有高表达。实施例 2 生长因子 BDNF和 EGF在肿瘤细胞 SKOV3中可以诱发 TRPC特性的内向电流

生长因子作为一种胞外的刺激，对于肿瘤细胞的增殖至关重要。生长因子是否通过 TRPC通道引起胞外钙进入胞内，升高胞内钙浓度，以达到促进其增殖的目的目前尚不清楚。本发明人在卵巢癌细胞株培液中施加 BDNF (购于 Sigma)、 EGF (购于 Sigma)、阳离子流抑制剂 La3+ (购自 Sigma)或 NMDG (购自 Sigma) , 釆用膜片钳方法检测是否产生内向电流。如图 5所示， BDNF和 EGF均可在 SKOV3上诱发一个缓慢内向电流。通过对其电流的 IV曲线分析，此内向电流类似于 TRPC的双向整流特性 (图 6A， 6B)。并且发现，这种电流可以被阳离子流抑制剂 La3+和 NMDG, 以及 TRPC通道阻断剂 SK&F96365( l-[ β -[3-(4-甲氧基苯基)丙氧基 ]-4-对甲氧酚] - 1-氢-咪唑盐酸盐， C₂₂H₂₆N₂O₃ · HC1，简称 SKF或 SKF96365 , 购于 Calbiochem)所阻断（图 5)。

本实施例的实验结果首次证实，生长因子在肿瘤细胞上能够诱发一个 TRPC 类似的内向电流。实施例 3 TRPC通道阻断剂抑制胶质瘤细胞 U251和 C6增殖

实施例 2证明了 TRPC通道阻断剂 SK&F96365阻断了生长因子在肿瘤细胞上诱发的 TRPC类似的内向电流。本实施例进一步证实 SK&F96365通过阻断 TRP C通道来抑制肿瘤细胞的增殖。

具体的试验方法如下：在培养的胶质母细胞瘤 C6细胞和 U251细胞中分别加入 10 μ M SK&F96365 , 与溶剂对照（Ctrl)相比， SK&F96365可明显抑制两种肿瘤细胞的增殖。磷脂酶 C (PLC)的激活和三磷酸肌醇 (InsP3)作用于其内质网上的受体 (IP3R), 可以激活 TRPC通道 [Montell, C.等， Mol. Cell. 9, 229-231.] 本发明人采用 9 μ M PLC的抑制剂 U73122(l-[6-[((17 3)-3-甲氧雌- 1,3,5[10]-三亚乙基四胺 -17-基)氨基]己基] -1H-吡咯 -2，5-二酮， C₂₉H₄oN₂O₃，购于 Calbiochem), 明显抑制了胶质母细胞瘤 C6细胞和 U251细胞的增殖，同时 IP3R的抑制剂 100 μ Μ 2ΑΡΒ (二苯基硼酸 2-氨基乙酉旨（2-Aminoethyl diphenyl borate,

(C₆H₅)₂BOCH₂CH₂NH₂), 购于 Calbiochem)也可明显抑制肿瘤细胞的增殖（图 7)。

与之相反，本发明人用 MK801(NMDA受体的阻断剂 (5-甲基二氢二苯并环庚烯亚氨马来酸或其盐， C₁₆H₁₅N · C₄H₄O₄，购于 Sigma)、 CNQX(AMPA受体的阻断剂， 6-氰基 -7- 硝基喹喔啉 -2,3-二酮， C₉H₄N₄0₄，购于 Sigma)以及硝苯地平 (Nifedipine, L-型钙通道的阻断剂， 1,4-二氢 -2,6-二甲基 -4-(2-硝基苯 )-3，5-吡啶羟酸二甲基酯， C₁₇H₁₈N₂O₆，购于 Sigma)的混合物对胶质母细胞瘤 C6细胞和 U251 细胞的增殖没有任何影响（图 7)。图中， SKF = SK&F96365 ; MCN = MK801 + CNQX+硝苯地平。

结果提示，阻断 TRPC通道可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖。实施例 4 SK&F 96365 可以将肿瘤细胞阻断在 G2/M期

通过以上的实施例，本发明人证明了 SK&F 96365 可以抑制肿瘤细胞的增殖，为分析此药物对于细胞周期的影响，本发明人用 SK&F 96365处理肿瘤细胞 C6， 24小时后测细胞周期。测试结果见图 8，左图为未用 SK&F 96365处理 C6的测 i式结果，采用 SK&F 96365处理 C6后的结果见右图，停留在 S期和 G0/G1 (或称 G0-G1)期的细胞百分比降低，大部分细胞被阻断在了 G2/M (或称 G2-M)期。并且这种 G2/M期阻滞是时间依赖性的，最早发生于 SK&F 96365处理 C6细胞 9小时后 (图 9)。同样的实验也在卵巢内膜癌细胞系 SKOV3 , 乳腺癌细胞系 MCF-7, 子宫内膜癌细胞系 ISKWA (购于中国科学院细胞库)，肝癌细胞株 HCGLM3(中国科学院细胞库），以及胶质瘤细胞系 U251和 U87(ATCC No.: HTB-14)中进行，得到同样的结论，见表 2。

表 2

这表明，通过阻断 TRPC通道，可阻止细胞的 Ca²⁺离子进入，从而将肿瘤细胞阻滞在 G2/M期，进而抑制肿瘤细胞增殖。实施例 5 过表达野生型 TRPC3、 TRPC6促进肿瘤细胞增殖，过表达突变型的 TRPC3、 TRPC6抑制肿瘤细胞克隆的形成

为进一步证实 TRPC通道参与肿瘤细胞的增殖，本发明人首先胶质瘤细胞系 C6上过表达野生型 TRPC3 (方法参见 Vazquez G, Putney JW Jr. 等， J Biol Chem. 2003 ;278(24):21649-54.)，和野生型 TRPC6(方法参见 Hofmann， T.,， Gudermann, T. 等， (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 7461-7466.), 转染后 48小时后，釆用 ³H-胸腺嘧啶核苷掺入法检测肿瘤细胞增殖情况。如图 10所示，与对照组相比，过表达野生型 TRPC3和 TRPC6促进 1H-胸腺嘧啶核苷掺入。图 10中， WTC3 = 野生型 TRPC3, C6 =野生型 TRPC6。

以野生型 TRPC3序列为模板，通过 PCR获得 N端 1-302氨基酸的野生型人 TRPC3的 PCR产物。将 PCR产物插入 pEGFP-Nl质粒 (购自 Clontech)的多克隆位点，得到突变型人 TRPC3(DNC3)。根据 Hofmann, T.， Gudermann, T. 等，（2002). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 7461-7466中所述，可得到突变型 TRPC6(DNC6)。与野生型相反，转染突变型的 TRPC6抑制了 1H-胸腺嘧啶核苷掺入，如图 10所示。

随后，在将带有绿色荧光蛋白（GFP)的两个突变型 TRPC3和 TRPC6(DNC3， DNC6)分别转入 U251细胞系中，用 G418 药物筛选 2 周后，得到的稳定表达带有绿色荧光的 DNC3和 DNC6细胞株，用细胞计数的方法在 35mm 碟中种 1000个细胞， 2周后 DNC3和 DNC6绿色荧光的克隆的大小以及克隆的数目明显低于 GFP对照（图 11)。采用相似的方法，用 DNC6在 SKOV3上得到相似结果 (图 12)。

综上，在细胞水平釆用基因操作结果进一步证实， TRPC3和 TRPC6对于肿瘤细胞的增殖是必需的，因此可知，抑制 TRPC3和 TRPC6通道的药物能够抑制肿瘤细胞的增殖。实施例 6 筛选通过 TRPC离子通道抑制肿瘤细胞增殖的化合物

本实例中，候选物为： MK801， SK&F96365 , U73122, CNQX, 硝苯地平。测试组：添加候选物且表达 TRPC离子通道的肿瘤细胞 (人胶质母细胞瘤 U251)。对照组：未添加候选物且表达 TRPC离子通道的肿瘤细胞 (人胶质母细胞瘤 U251)。

包括以下步骤：

在测试组中，向表达 TRPC离子通道的肿瘤细胞培养物中添加待筛选的候选物： MK801 , SK&F96365 , U73122, CNQX,硝苯地平，并检测肿瘤细胞的增殖情况。

将前述测试组中肿瘤细胞的增殖情况与对照组中肿瘤细胞的增殖情况进行比较，如果测试组中的肿瘤细胞的增殖在统计学上显著低于对照组 (<70%)，就表明该候选物是抑制肿瘤细胞增殖的化合物。

各组的肿瘤细胞抑制情况见表 3。表 3

* " + "表示肿瘤细胞的增殖显著受到抑制； "-"表示肿瘤细胞的增殖没有受到抑制。结果表明， MK801， CNQX , DNQX , 硝苯地平不能抑制肿瘤细胞的增殖，而 SK&F96365 , U73122能够抑制肿瘤细胞的增殖。实施例 7 癌变组织与正常组织的 TRPC6表达水平比较

采用常规的苏木精-伊红（H&E)染色方法或采用 TRPC6 的抗体 TRPC6)进行免疫组化染色，本发明人以 20例人的子宫内膜癌标本来测定 TRPC6表达水平。在 20例（n = 20)人的子宫内膜癌标本中，癌变腺体的 TRPC6表达水平普遍高于 10 例（n= 10)正常子宫内膜标本，见图 13和图 16。其中图 13显示了部分子宫内膜癌标本与正常子宫内膜标本的 TRPC6表达水平比较，其中，左列为苏木精 -伊红 (H&E)染色的结果，中列为用 TRPC6的抗体进行免疫组化染色的结果，右列为对中列中方框部位的放大显示。同样的现象也发现于人的胃癌标本（25 例， n=25)和正常胃组织标本（4例， n=4) , 见图 14和图 16。其中图 14显示了部分胃癌标本与正常组织标本的 TRPC6 表达水平比较，其中，左列为苏木精 -伊红（H&E)染色的结果，中列为用 TRPC6 的抗体进行免疫组化染色的结果，右列为对中列中方框部位的放大显示；其中箭头所示为肿瘤和非肿瘤组织在同一个视野。在人的胶质细胞瘤标本中， TRPC6 的表达水平在等级高的胶质母细胞瘤和间变型少突胶质细胞瘤（19例， n=19)有显著升高，而在等级较低的星形胶质细胞瘤 (14例， n=14)中表达水平则较低，正常脑组织中胶质细胞的表达水平也较低，见图 15和图 16。 0 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1.一种筛选通过 TRPC离子通道抑制肿瘤细胞增殖的化合物的方法，其特征在于，包括步骤：

如果测试组中的肿瘤细胞的增殖在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤细胞增殖的化合物。

2.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述的 TRPC离子通道为 TRPC1、 T PC3或 TRPC6。

3. 如权利要求 2所述的方法，其特征在于，所述的 TRPC离子通道为 TRPC3或 TRPC6。

4. 如权利要求 1所述的的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞选自：乳腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、卵巢透明细胞瘤、卵巢浆叶性腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、或卵巢内膜癌的细胞。

5.一种用权利要求 1所述的方法获得的通过 TRPC离子通道抑制肿瘤细胞增殖的化合物。

6. 一种 TRPC离子通道抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。

7. 如权利要求 6所述的 TRPC抑制剂的用途，其特征在于，所述的肿瘤为乳腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、卵巢透明细胞瘤、卵巢浆叶性腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、或卵巢内膜癌。

8. 如权利要求 6所述的用途，其特征在于，所述的 TRPC抑制剂为 TRPC1、 TRPC3或 TRPC6的抑制剂。

9. 如权利要求 8所述的用途，其特征在于，所述的 TRPC抑制剂为 TRPC3或 TRPC6的抑制剂。

10. 如权利要求 6所述的用途，其特征在于，所述的 TRPC抑制剂是 1-[ β -[3-(4- 甲氧基苯基)丙氧基 ]-4-对甲氧酚] -1-氢-咪唑盐酸盐。