CN102100913B - 脑损伤治疗的靶点和药物 - Google Patents

Abstract

本申请涉及脑损伤治疗的靶点和药物。具体而言，本申请涉及用于维持神经细胞的TRPC6水平以预防或者治疗缺血性脑损伤或脑神经退行性病变的物质，及其在制备预防或者治疗缺血性脑损伤或神经退行性病变的药物或者药物组合中的用途。本发明也涉及一种筛选可用于治疗或预防由缺血引起的损伤用的物质的方法。

Description

脑损伤治疗的靶点和药物

技术领域

本申请涉及脑损伤治疗的靶点和药物。具体而言，本申请涉及治疗脑损伤的TRPC6靶点，以及通过该靶点治疗脑损伤的方法和药物。

背景技术

神经退行性疾病是大脑和脊髓的细胞神经元丧失的疾病状态。大脑和脊髓由神经元组成，神经元有不同的功能，如控制运动，处理感觉信息，并作出决策。大脑和脊髓的细胞一般是不会再生的，所以过度的损害可能是毁灭性的，不可逆转的。神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化，导致功能障碍。神经退行性疾病按表型分为两组：一类影响运动，如小脑性共济失调；一类影响记忆以及相关的痴呆症。神经退行性疾病通常包括：阿尔茨海默氏病、肌肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨廷顿氏病、小脑萎缩症、多发性硬化症、帕金森氏病、原发性侧索硬化、和脊髓性肌萎缩症。因此，如何保护神经元免受各种伤害而丧失对于预防和治疗神经退行性疾病是非常重要的。

脑缺血，俗称中风，是一种由于瞬间脑部血液供应不足而引起脑细胞死亡或者损伤的病理过程。脑缺血可以分为局灶性脑缺血和全脑缺血，前者是由于脑中部分血管栓塞或者破裂造成的这部分血管相应的供血区域发生了缺血，多见于脑梗塞或脑溢血等情况中；而后者多见于溺水或者心肌梗死等情况下的整个脑部血液供应不足。

在局灶性脑缺血中，由栓塞血管直接供血的区域，其血流量可以降低到15％以下甚至更低，这部分组织将发生不可逆的病变和细胞死亡，称为中心梗塞区；而其间接供血的区域，由于还有其他侧支循环供血，所以血流量下降幅度小于中心区，一般降低到60-80％以下，这部分组织多发生非功能性的损伤或延迟性细胞死亡，如果及时恢复血流供应或及时治疗，是可以挽救该区域的细胞死亡及组织损伤的；这样的区域一般称为半影区。由于半影区细胞死亡的延迟性及可逆性，科学研究多集中在这个领域，以减少半影区细胞死亡和最终脑梗塞面积为目的。二十世纪八十年代后期，局灶性脑缺血的动物模型的建立为缺血性神经元死亡机制的研究提供了良好的平台。

脑缺血过程中，神经元是最敏感且耐受性最低的一类细胞。怎样保护神经元不受损伤、不死亡就成了脑缺血研究领域中的一个重要问题。近几十年来，关于缺血性神经元死亡机制的研究数不胜数，主要概述为以下几个方面：谷氨酸兴奋毒作用，细胞凋亡，炎症反应以及离子浓度失衡引起的细胞损伤等。针对以上这些神经元死亡机制，研究人员开发了很多药物，以干扰这些破坏型通路的启动或者进行。然而，在脑缺血的临床治疗、应用方面，这些策略的效果却不尽如人意。

经典型瞬时受体电势通道(Transient Receptor Potential channel，简称TRPC通道)是一类近年来发现的通道蛋白家族，从1995年首次发现至今，人们已经发现TRPC通道在神经系统、免疫系统、血液循环系统、肾脏、肺脏、脾脏、卵巢和平滑肌等多个系统和组织器官中均有表达〔“TRPC6与肾脏疾病”，国际病理科学与临床杂志，2008年10月，第28卷，第5期〕。TRPC的家族成员(亚基)包括：TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7。根据其序列相似性，又可以把TRPC1，TRPC2，TRPC4、TRPC5和TRPC3、TRPC6、TRPC7分别归为一组。功能型的TRPC通道分别由这些亚基组成同四聚体或异四聚体，它是一类可以通透钙离子的非选择性阳离子通道。许多细胞的细胞膜上都有TRPC通道的分布，包括神经元上。近年来的研究表明，TRPC通道参与了很多重要的生理或病理过程，比如：神经轴突生长导向，神经元突触的发育，肌肉细胞增殖，肾脏疾病，以及小脑颗粒细胞的存活等。TRPC通道的激活有两条途径，其一是膜上G蛋白耦联受体的激活引起的下游PLC(磷脂酶C)的激活所介导的；其二是膜上酪氨酸激酶受体所引起的PLC的激活介导的。可见，PLC的活化是TRPC通道开放所必需的。PLC活化后水解膜上的PIP2(磷脂酰肌醇4，5-二磷酸)产生IP3(肌醇三磷酸)和DAG(二酰甘油)，前者引起内钙释放从而激活膜上的某些TRPC通道；后者则可以直接作用于膜上的某些TRPC通道进而开放通道。

目前可用于临床治疗缺血性脑中风(局灶性脑缺血)的药物仅一种：tPA(组织血纤维蛋白溶酶原活化剂)，该药物也仅能用于一小部分病例，并且伴有脑出血的风险。因此，急需新的药物和理解新的发病机制，发现新的靶点和开发新的药物。

发明内容

本申请人发现，TRPC6的蛋白水平在缺血后的皮层半影区神经元中特异地下调，这一过程是由NMDA受体激活引发的钙蛋白酶(calpain)的蛋白水解作用介导的。阻止TRPC6的下调，或者上调TRPC6的蛋白水平对于缺血损伤有保护神经元的作用。这些结果提示，在局部脑缺血过程中，TRPC6对于神经元存活起到关键作用；钙蛋白酶介导的TRPC6的下调促进了神经元的死亡，加重了缺血造成的脑损伤。

因此，本申请涉及一种分离的多肽，选自：

(i)SEQ ID NO：1或其包含SLKAAP的片段；或

(ii)在(i)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性的由(i)衍生的多肽。

在一个实施例中，所述多肽选自：

(a)GGSLKAAPGA；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性的由(a)衍生的多肽。

在一个实施例中，所述(b)项多肽选自：在该(a)项多肽的SLKAAP的左右两侧独立延伸0、1、或2个(a)所示的对应位置上的氨基酸残基的多肽；和在SEQID NO：1的基础上，在其中的GGSLKAAPGA的左右两侧独立延伸0、1、2、3、4、5或6个氨基酸残基所得到的多肽。

在一个实施例中，所述多肽选自：

(1)RRGGSLKAAPGAGTRR；或

(2)在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性的由(1)衍生的多肽。

本申请的多肽包括RRGGSLKAAPGAGTRR或其包含SLKAAP的片段。

在一个实施例中，所述包含SLKAAP的片段为GGSLKAAPGA。

本申请提供一种分离的多肽，所述多肽含有穿膜因子和本申请所述的多肽。

在本申请中，穿膜因子可选自RKKRRQRRR、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL、RQIKIWFQNRRMKWKK、RRRRRRR、RRRRRRRRR、RRRRRRRRRRR、GRKKRRQRRRC。在一个实施例中，穿膜因子为GRKKRRQRRRC。

在一个实施例中，本申请的多肽如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。

本申请提供一种药物组合物，所述组合物含有本申请的多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本申请的药物组合物中，本申请的多肽可以是RRGGSLKAAPGAGTRR或其包含SLKAAP的片段，该多肽可连接于穿膜因子。

在一个实施方式中，本申请的药物组合物含有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10。

本申请还提供含有NMDA受体拈抗剂、TRPC6表达载体和/或TRPC6表达增强剂的药物组合物。

本申请提供本申请的多肽在制备提高对象TRPC6表达量用的药物中的用途。所述多肽包括与或未与穿膜因子连接的多肽。穿膜因子(穿膜肽)是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽。

本申请包括TRPC6表达载体、钙蛋白酶的抑制剂、TRPC6增强剂或NMDA受体拈抗剂在制备保护神经元用的药物中的用途。

在一个实施方式中，所述增强剂选自OAG、或其类似物。

本申请包括TRPC6表达载体、钙蛋白酶的抑制剂、TRPC6增强剂或NMDA受体拈抗剂在制备治疗或预防神经退行性疾病中的用途。

在本申请中，神经退行性疾病通常包括：阿尔茨海默氏病、肌肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨廷顿氏病、小脑萎缩症、多发性硬化症、帕金森氏病、原发性侧索硬化、和脊髓性肌萎缩症。

本申请包括TRPC6表达载体、钙蛋白酶的抑制剂、TRPC6增强剂或NMDA受体拈抗剂在制备治疗或预防缺血引起的损伤用的药物中的用途。

本申请中，损伤包括缺血引起的脑损伤。

本申请中，钙蛋白酶的抑制剂包括与或未与穿膜因子连接的本申请多肽。在具体实施方式中，所述多肽为RRGGSLKAAPGAGTRR或其包含SLKAAP的片段，或者如SEQ ID NO：4和9所示。

本申请提供一种筛选治疗或预防缺血引起的损伤用的药物的方法，所述方法包括：

(1)将待测物质加入含有TRPC6的体系中；

(2)向步骤(1)所述的体系中加入钙蛋白酶，和

(3)测定所述待测物质是否能抑制钙蛋白酶降解TRPC6，

其中，将能够抑制钙蛋白酶降解TRPC6的物质作为治疗或预防缺血引起的损伤用的候选药物。

本申请还提供一种筛选TRPC6表达增强剂的方法，该方法包括：

(1)将待测物质加入表达TRPC6的体系中；和

(2)测定该体系中TRPC6的表达量，其中，与未加入待测物质的实验相比，能使TRPC6的表达量提高的待测物质确定为TRPC6表达增强剂。

另一方面，本申请包括用于维持神经细胞的TRPC6水平以预防或者治疗缺血性脑损伤或脑神经退行性病变的物质。

所述物质可选自钙蛋白酶抑制剂，或TRPC6表达增强剂，或NMDA受体拈抗剂。

所述钙蛋白酶的抑制剂可选自钙蛋白酶特异性的小干扰RNA，或calpeptin，或包含SLKAAP序列的多肽。

所述多肽的序列可选自SEQ ID NO：1或其片段。

本申请中，所述多肽可与跨膜因子相连接。

在一些实施方式中，所述多肽的序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10所示。

本申请中，所述钙蛋白酶特异性的小干扰RNA可选自SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6。

本申请中，TRPC6表达增强剂可选自TRPC6表达载体、OAG或者OAG的类似物。

本申请中，NMDA受体拈抗剂可选自金刚烷胺、地佐环平、SEQ ID NO：7或SEQID NO：8。

本申请也包括前述物质的用途，所述用途包括预防或者治疗缺血性脑损伤或脑神经退行性病变。

本申请也包括前述物质的用途，所述用途包括制备预防或者治疗缺血性脑损伤或神经退行性病变的药物或者药物组合。

附图说明

图1显示TRPC6抗体的特异性。(a)显示使用抗TRPC6的抗体进行的转染了GFP或WT-TRPC6构建物的HEK293细胞中TRPC6的蛋白免疫印迹。(b)显示使用抗myc表位的抗体进行的转染了GFP或TRPC6-myc构建物的HEK293细胞中TRPC6的蛋白免疫印迹。(c)显示与或不与抗原性肽共培育情况下，使用抗TRPC6的抗体进行的大鼠脑裂解物中的TRPC6的蛋白免疫印迹。(d)显示用抗TRPC6的抗体和抗NeuN的抗体在或不在抗原性肽存在下双染色的大鼠脑切片的代表性图。刻度为50μm。(e)显示转染了TRPC1-HA、TRPC3-Myc、TRPC4、TRPC5-Flag或TRPC6构建物的HEK293细胞的提取物的免疫印迹分析。TRPC6的抗体能特异性地识别过表达的TRPC6蛋白，但不能识别过表达的TRPC1、3、4和5蛋白。

图2显示脑缺血后神经元中的TRPC6特异性下调。(a)显示使用所示抗体，对照侧(C)或缺血侧(I)皮层(Sham假手术组：左侧皮层(L)或右侧皮层(R))提取物的免疫印迹。微管蛋白(Tubulin)作为蛋白上样量的对照。(a)的半图显示归一化TRPC6蛋白水平的定量分析(每个时间点，n＝5-8只大鼠，与Sham相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。(b)显示脑缺血后，所示时间点TRPC6、3和4蛋白水平的定量分析。在每个时间点，n＝3-5只大鼠，与Sham相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。(c)显示缺血复灌24小时后(R24)TRPC和GluR1的免疫印迹。右图显示蛋白水平定量分析，n＝5只大鼠，与对照侧相比，^**p＜0.01。(d)显示采用qRT-PCR测定的TRPC6mRNA水平，n＝3-5只大鼠。(e)显示缺血复灌24小时(R24)后，用所示抗体双染色得到的所示皮层的代表图。刻度为50μm。右图显示定量分析(n＝5只大鼠)；与对照侧皮层中的荧光强度相比，^**p＜0.01。

图3显示脑缺血后胶质细胞中TRPC6未下调。图中显示，缺血复灌24小时(R24)后，用抗TRPC6和GFAP的抗体双染色所得的对照侧和缺血侧皮层的代表图。右图是从所示区域得到的放大图。斜向上的两个箭头显示GFAP阳性胶质细胞；水平的两个箭头显示邻近的神经元。该图表明，缺血后神经元中的TRPC6蛋白特异性下调，而胶质细胞中的TRPC6蛋白水平没有变化。

图4显示TRPC6的下调先于缺血性神经元死亡。(a)显示用TRPC6抗体和TUNEL标记双染色，缺血复灌24小时(R24)或48小时(R48)后所示皮层的代表图。Hoechst标记细胞核。刻度为50μm。(b)显示在指定时间缺血侧皮层或假手术(Sham)中TRPC6蛋白的定量水平和TUNEL标记的阳性细胞数量；每种情况下，n＝3只大鼠。与Sham相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

图5显示在模拟缺血实验中神经元中TRPC6的下调。(a)显示OGD后用所示抗体进行的培养的皮层神经元提取物的免疫印迹。条带下的数值为归一化的蛋白水平(n＝3)。(b)显示OGD后在指定时间点神经元中TRPC1、3和6的实时RT-PCR定量mRNA水平。

图6显示培养的皮层神经元被OAG刺激后产生的电流(IOAG)。(a)培养的皮层神经元的全细胞记录(第一条轨迹)和转染了TRPC6 RNAi的皮层神经元的记录(第二条轨迹)。右图为电流密度的定量分析结果(每组10个细胞)。右图插图显示分别转染对照质粒、随机RNAi序列TRPC6RNAi的皮层神经元中TRPC6的蛋白水平。OAG(1-油酰基-2-油酰基-sn-甘油)100μM；SKF96365，10μM；NMDG：N-甲基-D-葡糖胺的无Ca²⁺溶液。单星号表示相对对照组而言p＜0.05。(b)用斜升电压钳记录的代表性电流轨迹，电流轨迹下面的图表示这种记录给电压的方式，如图应用了四次从-100V～+80V的斜升电压。100μM的OAG是在第一个斜升电压之后给药的。(c)未转染的皮层神经元(对照组)及转染了TRPC6 RNAi的神经元，OAG刺激电流的I-V曲线。

图7显示OAG刺激对培养的皮层神经元的胞内钙信号的影响。(a)ΔR/R描述的由F340/F380定义的胞内钙升高及其标准化的基线。图中直线代表给药时间。SS即HPSS缓冲液作为对照，零钙胞外液的成分为：SS+2mM EGTA。OAG 100μM，SKF10μM。右图为曲线下面积定量分析，每组15-25个细胞的数据。双星号表示相对于SS组或OAG组p＜0.01。(b)显性抑制型TRPC6对OAG引起的胞内钙升高的影响。用100μM OAG刺激转染了对照质粒或显性抑制型TRPC6质粒的皮层神经元，检测其钙升高。图中直线代表OAG给药时间。右图为每组曲线下面积定量分析，每组20个细胞的数据。双星号表示相对对照组p＜0.01。

图8显示氧糖剥夺特异地抑制神经元中OAG刺激的电流。左图为相应刺激的电流密度定量分析结果，右图为在对照或氧糖剥夺的处理下OAG刺激的反转电位统计结果。单星号表示相对对照组而言p＜0.05。

图9显示下调TRPC6会加剧氧糖剥夺导致的神经元死亡。转染了相应质粒的培养皮层神经元，经氧糖剥夺处理后复灌24小时，定量统计细胞死亡。(3次试验)。单星号表示相对GFP组或对照RNAi组而言p＜0.05，双星号表示p＜0.01。

图10显示药理学方法影响TRPC6对缺血损伤的作用。(a)PI染色显示的对照组，OAG(100μM)处理组及SKF96365(10μM)处理组，对氧糖剥夺处理引起的细胞死亡的影响。统计数据代表三次独立的实验，单星号表示相对对照组而言p＜0.05，双星号表示p＜0.01。(b，c)大鼠脑缺血复灌24小时后，脑片的TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色区域(照片)，及量化的脑梗塞体积(柱状图)：(b)R24或假手术：对照(veh，DMSO 5μM/5μl)或OAG 100mM/5μl，每组8-11只大鼠的数据。双星号表示p＜0.01。(c)R24或假手术：对照(veh，DMSO 5μM/5μl)或SKF9636520mM/5μl，每组8-11只大鼠的数据。双星号表示p＜0.01。

图11显示过表达TRPC6特异地保护氧糖剥夺处理的神经元。(a)转染了野生型TRPC6的培养皮层神经元的代表图及转染效率的定量分析。用TRPC6的抗体对转染GFP或野生型TRPC6的神经元裂解物进行免疫杂交印记的结果。(b)TRPC6而非TRPC3对氧糖剥夺处理的神经元有保护作用。用氧糖剥夺处理转染了相应质粒的神经元之后，用PI(碘化丙啶)染色显示神经元死亡。插图为过表达TRPC3的免疫杂交印记图。统计分析的数据由三次不同的实验得来。双星号表示相对于GFP p＜0.01。

图12显示环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)是TRPC6的下游信号分子。(a)用图示相应的抗体对转染GFP或野生型TRPC6的神经元进行免疫杂交印记分析。(b)氧糖剥夺处理转染了相应质粒的神经元后，PI染色统计的细胞死亡情况的结果。其中KCREB为显性抑制型CREB，每组统计是三次独立的实验数据，双星号表示相对于GFP p＜0.01。

图13显示TRPC6被钙离子依赖的蛋白酶降解。(a)将大鼠脑裂解物与钙离子及如图相应的抑制剂共孵育后，用相应抗体做免疫杂交印记。Calpeptin：20μM；亮抑蛋白酶：100μM；PMSF：100μM；EGTA：5mM。右图为三次独立实验的TRPC6蛋白水平的统计结果。双星号表示相对于对照p＜0.01。(b)左图为大鼠脑裂解物与1mM钙离子37摄氏度下共孵育的TRPC6蛋白降解的时间曲线，右图为30分钟内大鼠脑裂解物与相应浓度钙离子37摄氏度下共孵育的TRPC6蛋白降解的剂量曲线。(c)将大鼠脑裂解物与钙离子及如图相应的抑制剂或对照组共孵育后，用TRPC6或α-spectrin抗体做免疫杂交印记的结果。Calpeptin：20μM；亮抑蛋白酶：100μM；MDL28170(钙蛋白酶抑制剂3)：60μM；cpm-VAD-CHO：20μM；Lactacystin(蛋白酶体抑制剂)：10μM；和EGTA：5mM。

图14显示TRPC6蛋白的K16及A17氨基酸之间被钙蛋白酶切割。(a)在HEK293细胞中过表达N-flag-second loop-HA-C-myc蛋白(如示意图所示)后将细胞裂解物与相应浓度的μ-钙蛋白酶共孵育，用相应的标签抗体进行免疫杂交印记分析。(b)纯化后的NUS标签的TRPC6前203个氨基酸的产物用钙蛋白酶消化后，跑SDS-PAGE胶分离后的考马斯亮蓝染色图。箭头所示为钙蛋白酶切割下来的22kD小片段，右图显示为用Edman N端测序法，对此片段测序得到的钙蛋白酶在TRPC6上的切割位点。其下为依据此位点合成的带有TAT穿膜序列，且包含此位点的肽段TAT-C6序列，再下为大鼠脑裂解物在30分钟内与1mM钙离子及相应浓度的TAT-C6共孵育后，用相应抗体做免疫杂交印记分析。

图15显示NMDA受体介导细胞缺血模型中钙蛋白酶对TRPC6的降解。(a)左图：在对照(Veh.)，calpeptin(20μM)或MDL28170(MDL，60μM)共孵育下，进行氧糖剥夺处理的皮层神经元裂解物，用TRPC6抗体对其进行免疫杂交印记分析。中图：三次独立实验的TRPC6蛋白水平统计。单星号表示相对对照组而言p＜0.05，双星号表示p＜0.01。右图：以上三种处理的氧糖剥夺导致细胞死亡统计，三次独立实验，双星号表示p＜0.01。(b)对转染了对照无义siRNA及转染两种钙蛋白酶的RNAi(CAPNi_1，CAPN i_2)进行钙蛋白酶蛋白的免疫印记分析。下方图为三次实验的钙蛋白酶蛋白水平统计图。双星号表示p＜0.01。右图：两段钙蛋白酶的RNAi都可以阻断氧糖剥夺导致的TRPC6蛋白降解，下图为TRPC6蛋白水平统计，三次独立实验，双星号表示p＜0.01。(c)在共孵育对照或10uM地佐环平后对培养的皮层神经元进行氧糖剥夺处理。细胞裂解物用TRPC6抗体进行免疫杂交印记分析。(d)对转染了对照无义siRNA及转染两种NMDA受体NR1亚基的RNAi(NR1i_1，NR1i_2)进行NR1蛋白的免疫印记分析。下方图为三次实验的NR1蛋白水平统计图。双星号表示p＜0.01。右图：两段NR1的RNAi都可以阻断氧糖剥夺导致的TRPC6蛋白降解，下图为TRPC6蛋白水平统计，三次独立实验，双星号表示p＜0.01。(e)免疫杂交印记实验显示，钙蛋白酶的抑制剂calpeptin及NMDA受体的抑制剂金刚烷胺都可以阻断缺血导致的TRPC6蛋白降解，下图为TRPC6蛋白水平统计，三次独立实验，双星号表示p＜0.01。

图16显示TRPC6转基因小鼠中TRPC6蛋白水平在前脑中特异地上调。(a)用图示相应的抗体对转基因小鼠(tg)或野生型小鼠(wt)的皮层提取物进行免疫杂交印记分析。下方图为相应小鼠的基因型鉴定，右图为TRPC6蛋白水平定量分析。每种基因型三只小鼠，双星号表示相对于野生型p＜0.01。(b)分别用TRPC6，3，4，5，NR2A，GluR2/3及PSD95的抗体对来自3个独立的转基因建成系的转基因小鼠(tg)或同窝的野生型小鼠(wt)的皮层提取物进行免疫杂交印记分析。右图为相应蛋白水平定量分析。每种基因型三只小鼠，单星号表示相对于野生型p＜0.05。(c)用TRPC6抗体对转基因小鼠(tg)或野生型小鼠(wt)的脑冰冻切片进行免疫组织化学分析。下方图为不同脑区。CTX皮层，HIP海马，CBM小脑。比例尺为200微米。

图17显示提高TRPC6蛋白水平可降低小鼠脑缺血损伤。左图：对相应基因型小鼠进行局灶脑缺血后的TTC染色脑片照片及脑梗塞体积统计(柱状图)，每种基因型14只小鼠，双星号表示相对于野生型p＜0.01。右图：脑缺血后转基因及野生型小鼠的生存率。每种基因型14只小鼠。

图18显示转基因及野生型小鼠的脑血管情况代表组化图。转基因及野生型小鼠脑的冠状切片，用血管内皮细胞特异的蛋白CD31的抗体做组化，Hoechst染细胞核。比例尺为50微米。右图为缺血后转基因及野生型小鼠的脑血流量分析。双星号表示相对于缺血0分钟时p＜0.01。

图19显示TRPC6蛋白量与缺血造成的细胞死亡负相关。左图：用TRPC6抗体及TUNEL染色对缺血侧皮层半影区进行的免疫组化双标代表图。Hoechst染细胞核。比例尺50微米。右图：TRPC6的免疫荧光强度及TUNEL标记的阳性细胞数的统计结果，每组三只小鼠的数据，双星号表示相对于野生型p＜0.01。

图20显示，(a)用TRPC6的抗体对缺血或假手术的小鼠皮层提取物进行免疫杂交印记实验，右图为统计结果，每组6只小鼠，双星号表示相对于假手术(转基因型)p＜0.01。(b，c)缺血或假手术后的野生型或转基因型小鼠的皮层提取物，分别用p-CREB，CREB，p-CaMKII α，CaMKII α及NOS1的抗体进行免疫杂交印记分析。右图为p-CREB/CREB，p-CaMKII α/CaMKII α的蛋白水平比值，及NOS1的相对蛋白水平。单星号表示p＜0.05，双星号表示相对于相应组p＜0.01。

图21显示抑制钙蛋白酶对TRPC6的降解可降低大鼠脑缺血损伤。对侧脑室注射对照肽或TAT-C6的大鼠进行局灶脑缺血或假手术，左图：用TRPC6及spectrin抗体对其脑组织提取物进行免疫杂交印记实验，下方图为TRPC6蛋白水平统计分析，每组三只大鼠，单星号表示相对于对照p＜0.05。右图：TTC染色脑片照片及脑梗塞体积(柱状图)。缺血前大鼠侧脑室注射对照(Veh.)，对照TAT-肽(TAT-ctrl)或TAT-C6肽(TAT-C6)。单星号表示相对于对照p＜0.05。

图22显示TTC染色脑片及损伤体积(柱状图)。侧脑室注射对照TAT-肽(TAT-empty)或TAT-C6-2肽(TAT-C6-2)。单星号表示相对于对照p＜0.05。

图23显示TTC染色脑片照片及损伤体积(柱状图)。侧脑室注射对照TAT-肽(TAT-empty)或TAT-C6-3肽(TAT-C6-3)。单星号表示相对于对照p＜0.05。

图24显示腹腔注射TAT-C6改善老年性痴呆模型老鼠的学习和记忆能力。

附图中，“control”和“ctrl”指对照，“Tubulin”指微管蛋白，“No inh.(No Ca²⁺)”指“无抑制剂(无Ca²⁺)”，“No inh.”指“无抑制剂”，“Veh.”指“载体”(例如蒸馏水)。“TAT-empty”指的是TAT，

指“未经实验的”，“scrambleRNAi”为“对照无义RNAi”。

具体实施方式

如本说明书中和权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”、“该”包括复数参考，除非内容明显说明。因此，“一多肽”的应用包括两个或多个多肽的混合物等。

文中使用了下列氨基酸缩写：

丙氨酸：Ala(A)          精氨酸：Arg(R)

天冬酰胺：Asn(N)        天冬氨酸：Asp(D)

半胱氨酸：Cys(C)         谷氨酰胺：Gln(Q)

谷氨酸：Glu(E)           甘氨酸：Gln(Q)

组氨酸：His(H)           异亮氨酸：Ile(I)

亮氨酸：Leu(L)           赖氨酸：Lys(K)

甲硫氨酸：Met(M)         苯丙氨酸：Phe(F)

脯氨酸：Pro(P)           丝氨酸：Ser(S)

苏氨酸：Thr(T)           色氨酸：Trp(W)

酪氨酸：Tyr(Y)           缬氨酸：Val(V)

术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，并不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在该定义中。全长的蛋白质及其片段包括在该定义中。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，为了本申请的目的，“多肽”指包括天然序列的修饰，例如缺失、添加和取代(通常性质保守)，只要蛋白质维持所需活性。这些修饰可以通过定点诱变设计，或可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主突变，或由于PCR扩增引起的错误。

术语“类似物”指具有天然多肽序列和结构，以及相对于天然分子的一个或多个氨基酸添加、取代(通常性质保守)和/或缺失的化合物，只要修饰不破坏衍生该类似物的原始多肽的活性。制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的，如下进一步所述。

特别优选的类似物包括性质上保守的取代，即这些取代发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。具体而言，氨基酸一般被分成四类：(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷的极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测：单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸，这样的取代将不会对生物活性有重要影响。例如，感兴趣的多肽可包括多达约2-6个保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸取代，或2-10之间任何整数，只要该分子的所需功能仍维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。

可用“相同性”或“同源性”来限定本申请的多肽或核苷酸序列。“相同性”或“同源性”指两条多核苷酸或多肽序列上准确的核苷酸对核苷酸或者氨基酸对氨基酸对应。通过排列两个分子的序列直接比较它们的序列信息，计算两条排列的序列间匹配的准确数量，将其除以最短序列的长度，然后乘以100，从而可得到相同性百分数。

在同源性和相同性分析中可辅助使用易于获得的计算机程序，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff编辑，5Suppl.，3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC)，它适用于Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.，2：482-489，1981)。可从Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版，从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)获得测定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。使用制造者建议的和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可使用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定的核苷酸序列与参比序列的同源性百分数。

本申请建立同源性百分数的另一方法是使用版权属于爱丁堡大学、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在这套程序包中使用，其中，在计分表中使用默认参数(例如，间隔开放罚分＝12，间隔延伸罚分＝1，间隔＝6)。从这批数据产生的“匹配”值反映出“序列同源性”。计算序列间的相同性百分数或相似性百分数的其它合适的程序在本领域中一般都是已知的，例如，另一种排列程序是BLAST，使用默认参数。例如，可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP：基因编码＝标准；过滤＝无；链＝两；截留＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGH SCORE；数据库＝无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。在http://www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST网址上可查到这些程序的详细描述。

或者，在同源区域之间形成稳定的双链的条件下进行多核苷酸杂交，接着用单链特异性核酸酶消化，然后测定消化的片段的大小，从而测出同源性。在如(对具体的体系所定义的)严格条件下进行的Southern杂交试验中，可鉴别基本同源的DNA序列。确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所掌握的知识之内。例如，参见Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。

本申请优选与本申请多肽具有90％以上、95％以上、96％以上、98％以上或者99％以上序列相同性、并保留本文所述治疗或预防活性或者保留抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性的多肽。

可采用各种方法制备本申请的多肽。例如，可采用常规的化学合成法或者重组表达法制备。

本申请分离的多肽序列以MSQSPRFVTRRGGSLKAAPGAGTRRNESQD(SEQID NO：1，见图14b)为基础，包括此序列及其含有SLKAAP的片段。术语“含有SLKAAP的片段”是指在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的左右两侧独立截短任意数量的氨基酸、但仍保留SLKAAP序列所得的序列。所述片段仍保留抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性。所述任意数量对于左侧而言指1-13间的整数，而对于右侧而言指1-11之间的整数，其中，最短的片段可为SLKAAP。本申请也包括上述多肽及其片段的保守性取代产物，尤其是上述多肽或片段中的一个或几个氨基酸残基被性质上相同的氨基酸残基所取代(见前文所述)，同时保守取代所得的氨基酸序列仍保留了抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性。

本申请分离的多肽可选自：(a)GGSLKAAPGA；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性的由(a)衍生的多肽。

上述(b)项的多肽包括但不限于在上述(a)的SLKAAP的左右两侧独立地延伸0、1或2个(a)所示的对应位置上的氨基酸残基的多肽，和在SEQ ID NO：1的基础上，在其中的GGSLKAAPGA的左右两侧独立延伸0、1、2、3、4、5或6个氨基酸残基所得到的多肽。例如，当在SLKAAP的左右两侧各延伸一个氨基酸残基时，所述序列为GSLKAAPG；当在SLKAAPGAGTR的左右两侧各延伸两个氨基酸残基时，所述序列为GGSLKAAPGAGTRRN；当SLKAAPGAGTR的左侧延伸6个氨基酸残基、右侧延伸4个氨基酸时，所述序列为VTRRGGSLKAAPGAGTRRNES；以此类推。本申请也包括这些氨基酸序列的保守取代产物，尤其是上述多肽中的一个或几个氨基酸残基被性质上相同的氨基酸残基所取代(见前文所述)，同时保守取代所得的氨基酸序列仍保留了抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性。

本申请还提供一种分离的多肽，选自：(c)RRGGSLKAAPGAGTRR；或(d)在(c)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性的由(c)衍生的多肽。

上述(d)项的多肽包括但不限于在上述(c)项序列两侧独立减少0、1、2、3或4个氨基酸残基所得的多肽；和在SEQ ID NO：1的基础上，在其中的RRGGSLKAAPGAGTRR的左右两侧独立延伸0、1、2、3、4、5或6个氨基酸残基所得到的多肽。例如，当仅在(c)项序列左侧延伸一个氨基酸残基时，所述序列为TRRGGSLKAAPGAGTRR；当在(c)项序列两侧各延伸2个氨基酸残基时，所述序列为VTRRGGSLKAAPGAGTRRNE；依次类推。本申请也包括这些氨基酸序列的保守取代产物，尤其是上述多肽中的一个或几个氨基酸残基被性质上相同的氨基酸残基所取代(见前文所述)，同时保守取代所得的氨基酸序列仍保留了抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性。在一个实施方式中，本申请包括分离的CRRGGSLKAAPGAGTRR。如前所述，C和T均属性质上相近似的氨基酸，其替换不会影响到所得多肽抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性。

在一个具体实施方式中，本申请提供一种分离的多肽，所述多肽选自RRGGSLKAAPGAGTRR及其含SLKAAP的片段。在一个具体实施例中，所述含SLKAAP的片段为GGSLKAAPGA。

本申请也提供一种肽序列，该序列包含SLKAAP，并具有抑制钙蛋白酶降解TRPC6的活性。在一个实施例中，该肽序列的氨基酸残基数量为6-30个，例如，可以为6-25个、6-20个、6-16个、6-10个等。在一实施例中，包含SLKAAP的序列为SEQ ID NO：1或其片段。在另一实施例中，包含SLKAAP的序列为RRGGSLKAAPGAGTRR或其片段。在另一实施例中，包含SLKAAP的序列为GGSLKAAPGA或其片段。

前述附图14b所示TRPC6为MSQSPRFVTRRGGSLK

GTRRNESQD，前述可在SLKAAP、(a)项序列、(c)项序列和(e)项序列两侧独立延伸或减少的氨基酸残基及其所处位置与此TRPC6序列一一相对应。所述一一对应意指，例如，当延伸氨基酸残基时，所延伸的氨基酸残基为从基础序列(即SLKAAP、(a)项序列、(c)项序列和(e)项序列)两侧的最后一个氨基酸残基起分别外推至指定数量的氨基酸残基，如当延伸2个氨基酸残基时，则从基础序列两侧的最后一个氨基酸残基起算按顺序外推2个氨基酸残基，所延伸的氨基酸残基与图14b的TRPC6中对应的氨基酸位置的氨基酸残基相同。当减少氨基酸残基时，是指从基础序列的两侧的第一个氨基酸开始减少指定数量的氨基酸残基。

在一具体实施方式中，本申请优选下述氨基酸序列：SLKAAP、SLKAAPGAGTR、GSLKAAPGAGTR、GGSLKAAPGAGTR、RGGSLKAAPGAGTR、RRGGSLKAAPGAGTR、RRGGSLKAAPGAGTRR、TRRGGSLKAAPGAGTR、VTRRGGSLKAAPGAGTR、SLKAAPGAGTRR、SLKAAPGAGTRRN、SLKAAPGAGTRRNE、GSLKAAPGAGTRR、GGSLKAAPGAGTRR、RGGSLKAAPGAGTRR、TRRGGSLKAAPGAGTRR、CRRGGSLKAAPGAGTRR、VCRRGGSLKAAPGAGTRR、FVCRRGGSLKAAPGAGTRRN、GGSLKAAPGA等。

本申请的分离的多肽可与穿膜因子连接，以便于穿过细胞膜。穿膜因子指长度小于约30个氨基酸、能穿过细胞膜并能将其所携带的各种物质带入细胞中的多肽。本领域已知的各种穿膜因子可用于本申请，包括但不限于RKKRRQRRR、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL、RQIKIWFQNRRMKWKK、RRRRRRR、RRRRRRRRR、RRRRRRRRRRR、GRKKRRQRRRC等。本申请分离的多肽可直接与穿膜因子连接。可采用本领域各种已知的方法制备与穿膜因子连接的本申请多肽，例如，采用常规的化学合成法来制备。

本申请提供一种药物组合物，所述组合物含有本申请的分离多肽以及药学上可接受的运载体或赋形剂。在一个实施方式中，所述多肽连接于穿膜因子。

本申请还提供一种药物组合物，该组合物含有TRPC6表达增强剂和药学上可接受的运载体或赋形剂。TRPC6表达增强剂指能提高TRPC6的表达量的物质。表达增强剂包括TRPC6表达载体、OAG或其类似物。

本申请还提供一种药物组合物，该组合物含有NMDA受体的抑制剂和药学上可接受的运载体或赋形剂。本申请中，NMDA受体拈抗剂可选自地佐环平(MK801，Sigma公司)、金刚烷胺(memantine)等。

本申请还提供一种药物组合物，该组合物含有TRPC6表达载体。在一个实施例中，所述表达载体是CaMKIIα启动子驱使的表达载体。可采用各种常规的技术手段给予对象所述表达载体，例如，转染技术等。

本申请还提供一种药物组合物，该组合物含有钙蛋白酶的抑制剂和药学上可接受的运载体或赋形剂。所述抑制剂为本申请的多肽、calpeptin、亮抑蛋白酶、或MDL28170或其任意组合。所述多肽可连接于穿膜因子。

本申请药物组合物中还含有溶于或分散于药学上可接受的运载体或赋形剂中的一种或多种其它制剂。短语“药学上可接受的”是指当用于动物时，例如人，不会产生副作用、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。通过本文所公开的内容，本领域技术人员将会知道含有至少一种多肽、在某些实施方式中还含有一种或多种其它活性成分的药物组合物的制备，例如见《雷明顿药物科学》第18版，Mack PrintingCompany，1990(纳入本文参考文献)。另外，对动物(如人)给药，可以理解的是制品应符合无菌、无致热原，总体安全和纯度标准。

本文使用的“药学上可接受的运载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂，抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、调味剂、染料等物质和它们的组合，这是本领域普通技术人员知道的(见例如，《雷明顿药物科学》第18版，Mack Printing Company，1990，1289-1329页，纳入本文参考文献)。除了与活性成分不相容的常规运载体外，认为均可用于治疗或药物组合物中。

给予患病动物本申请组合物的实际剂量由物理和生理因素，如体重、疾病严重性、待治疗疾病的类型、原有和共同的治疗措施、受试者的特发病和给药途径所决定。负责给药的医生将决定组合物中活性成分的浓度和受试者个体的合适剂量。

某些实施方式中，药物组合物可含有，例如至少约0.001重量％的活性成分。在其它实施方式中，药物组合物可含有例如0.01-99.9重量％、0.01-50重量％、0.01-10重量％等的本申请多肽。在一个具体实施方式中，给予的药物组合物中多肽的浓度可为0.01-5mM，例如0.01-3mM、0.05-1mM。给药的方式是常规的，可由临床医师根据患者的具体情况来确定。例如，可直接注射入侧脑室或蛛网膜下腔。或者，也可以腹腔注射给药。

本申请药物组合物可含有各种抗氧化剂以防止一种或多种组分的氧化。此外可用防腐剂来预防微生物的作用，如各种抗菌和抗真菌剂，包括但不仅限于对羟基苯丙酸酯(如甲基对羟基苯丙酸酯、丙基对羟基苯丙酸酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

治疗性多肽可配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，如与蛋白质组分的游离氨基形成的盐，或与无机酸，如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或有机碱如异丙胺、三甲基胺、组胺或普鲁卡因。

在该组合物是液体形式的实施方式中，运载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于：水、多元醇(如甘油、丙烯二醇、液态聚乙二醇等)、脂质(如甘油三酯、植物油、脂质体)和它们的组合。例如，可通过采用包衣如卵磷酯；通过用运载体如液体多元醇或脂分散维持所需颗粒大小；用表面活性剂如羟丙基纤维素；或这些方法的组合来维持适当的流动性。许多情况下，优选包含等渗剂如糖、氯化钠或其组合。

可采用本领域常规的方法配置本申请的药物组合物。

该组合物在制备和贮存条件下必须稳定，防止微生物如细菌和真菌的污染。需知应将内毒素的污染控制到最低，处在安全水平内，例如低于0.5ng/mg蛋白质。

本申请包括本申请药物组合物在制备提高对象的TRPC6表达量用的药物中的用途。

本申请也包括钙蛋白酶的抑制剂在制备提高对象的TRPC6表达量用的药物中的用途。

本申请中，钙蛋白酶的抑制剂包括本申请的多肽、钙蛋白酶特异性的小干扰RNA、calpeptin、亮抑蛋白酶(leupeptin)、或MDL28170或其任意组合。所述多肽可连接于穿膜因子。钙蛋白酶特异性的小干扰RNA可选自SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6，或其组合。

本申请也包括TRPC6增强剂在制备提高对象的TRPC6表达量用的药物中的用途。增强剂包括OAG、其类似物或其任意组合。本申请包括NMDA受体拈抗剂在制备提高对象的TRPC6表达量用的药物中的用途。NMDA受体拈抗剂包括金刚烷胺(memantine)、地佐环平、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8等。本申请包括TRPC6表达载体在制备提高对象的TRPC6表达量用的药物中的用途。

本申请当然也包括TRPC6表达载体本身。在一个具体实施方式中，所述表达载体是CaMKIIα启动子驱使的表达载体。

本申请涉及本申请多肽在制备治疗或预防缺血引起的损伤用的药物中的用途。所述多肽可与穿膜因子相连。所述损伤包括脑缺血造成的脑损伤。

本申请多肽也可用于制备治疗或预防钙蛋白酶和TRPC6介导的各种疾病用的药物，通过抑制钙蛋白酶降解TRPC6而实现治疗或预防目的。所述疾病包括缺血造成的损伤以及各种神经退行性疾病。

本申请多肽可用于制备保护神经元免受伤害的药物。所述伤害可由各种原因引起，包括由缺血引起的伤害等。

本申请多肽可用于制备治疗或预防各种神经退行性疾病用的药物。

本文中，神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏病、肌肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨廷顿氏病、小脑萎缩症、多发性硬化症、帕金森氏病、原发性侧索硬化、和脊髓性肌萎缩症。

因此，本申请还包括治疗或预防缺血引起的损伤的方法，该方法包括提高有此需要的对象的TRPC6的表达。

本申请还包括治疗或预防神经退行性疾病的方法，该方法包括提高有此需要的对象的TRPC6的表达。

本申请还包括保护神经元免受伤害的方法，所述方法包括提高有此需要的对象的TRPC6的表达。

提高对象中TRPC6表达的方法包括：(1)给予对象钙蛋白酶的抑制剂以抑制该酶对TRPC6表达的降解；(2)提供NMDA受体拈抗剂；(3)提供TRPC6表达载体；和/或(4)提供TRPC6表达增强剂。

给予对象钙蛋白酶的抑制剂包括给予对象本申请的多肽、钙蛋白酶特异性的小干扰RNA、calpeptin、亮抑蛋白酶、或MDL28170或其任意组合。所述多肽可连接于穿膜因子。增强剂包括OAG、其类似物或其任意组合。NMDA受体拈抗剂包括金刚烷胺和地佐环平等。

本申请也包括一种提高患病对象中TRPC6表达的方法。

本申请还包括治疗或预防钙蛋白酶和TRPC6介导的各种疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予本申请的多肽，通过抑制钙蛋白酶降解TRPC6而实现所述治疗或预防目的。

本文中，对象包括各种哺乳动物，尤其是人。

本申请提供一种筛选治疗或预防缺血引起的损伤用的药物的方法，所述方法包括：

(1)将待测物质加入含有TRPC6或表达TRPC6的体系中；

(2)向步骤(1)所述的体系中加入钙蛋白酶；

(3)测定所述待测物质是否能抑制钙蛋白酶降解TRPC6，

其中，将能够抑制钙蛋白酶降解TRPC6的物质作为治疗或预防缺血引起的损伤用的候选药物。

所述方法还包括，测试该候选药物是否影响到钙蛋白酶除降解TRPC6之外的其它活性，其中，没有影响到钙蛋白酶的其它活性的候选药物是优选的药物。

所述方法还包括，进一步将测得的优选的药物进行体内实验。

本申请还涉及一种筛选TRPC6表达增强剂的方法，该方法包括：

(1)将待测物质加入表达TRPC6的体系中；和

(2)测定该体系中TRPC6的表达量，其中，与未加入待测物质的实验相比，能使TRPC6的表达量提高的待测物质确定为TRPC6表达增强剂。

所述的表达TRPC6的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达TRPC6的细胞；或可以是重组表达TRPC6的细胞。所述的表达TRPC6的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。所述含有TRPC6的体系可以是例如含有TRPC6的溶液体系。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。本领域技术人员能够采用常规的方法评估一治疗是否达到所需的治疗目的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的实施除非另外说明，将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，如《基础病毒学》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《实验免疫学手册》(Handbook of ExperimentalImmunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，Blackwell ScientificPublications)；T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins：Structures andMolecular properties)(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)，第二版，1989；《酶学方法》(Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。对于未指明来源的试剂，使用的是通常从市场上购得的常规试剂。

具体实施例

1.实验材料和方法

1.1脑缺血动物模型

大鼠(雄性SD大鼠，体重250-280克)或小鼠(雄性C57BL6品系小鼠，体重25-30克)用10％的水合氯醛麻醉，然后切开颈部皮肤，分离出颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA)，在ECA两端结扎然后剪小口，将栓线由此插入，扎好栓线和血管以后再放开靠近CCA端的结扎线，将栓线推入CCA并且往上推入ICA直至有轻微阻感即可。实验中，大鼠缺血2小时，小鼠缺血3小时以后，将栓线退出，恢复灌流(复灌)。在复灌不同时间后，将老鼠脑取出，间隔2mm(大鼠)或间隔1mm(小鼠)切片，然后将脑切片在2％2，3，5-三苯基四唑氯化物(TTC，在0.9％生理盐水中)中染色以确定梗塞区域的大小。

侧脑室注射药物的时候，利用stoelting公司的立体定位仪固定大鼠，根据脑图谱定位，将药物(5ul)用微量注射泵(microsyringe pump，Stoelting Co.)按0.5μl/min的速度注入侧脑室，注射完毕留针10min，然后再缝合。

1.2蛋白免疫印迹和免疫组织化学

细胞或组织在裂解液(以mM计，10Tris-Cl，pH 7.4，150NaCl，5EDTA，1％Triton-X100，1原钒酸钠，50NaF，1PMSF，1抑酶肽，1亮抑酶肽和5DTT)中进行匀浆裂解，将匀浆液在13000rpm，4度，离心15分钟，分离后取上清液。用分光光度计测定样品蛋白浓度并调整至相同浓度。加入上样缓冲液，混匀后在95度加热5～8分钟，使蛋白变性后，经过蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至硝酸纤维素膜，用5％的脱脂牛奶在室温封闭1个小时，用抗体稀释液(5％BSA+0.05％NaN₃+PBS)稀释一抗到合适浓度(1∶200～1∶2000)，用稀释过的一抗杂交过夜，PBS洗3次后(3*10分钟)，用抗体稀释液稀释HRP连接的羊抗兔(鼠)二抗，室温孵育2小时。PBS洗3次后(3*10分钟)，ECL曝光显影。Western-blot的条带灰度经过胶片扫描后用软件ImageQuant(Amersham)统计分析。

免疫组化实验中，麻醉动物后，先用37摄氏度的PBS通过心脏灌流，然后用4摄氏度的4％PFA(多聚甲醛)灌流固定，最后取出脑组织；组织块用OCT(冰冻切片包埋剂，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋，然后冰冻切片，切片厚度一般为12-16μm；冰冻切片用5％的普通羊血清室温封闭1小时，随即加入用5％普通羊血清稀释好的一抗，4摄氏度过夜，第二天PBS洗3次后，加入对应的荧光二抗在暗处孵育1小时，PBS洗3次后，用封片剂固定后到荧光显微镜下观察。

1.3神经元的培养，质粒转染和氧糖剥夺(OGD)实验

怀孕SD大鼠(E17)，取胚胎小鼠的皮层，胰酶消化后，按4×10⁶个细胞电转质粒4μg，用电转仪the rat neuron Nucleofector Kit(Amaxa，Koeln，德国)将DNA质粒或RNA质粒导入细胞。在氧糖剥夺实验中，先将细胞外液替换为无葡萄糖的Earle′s平衡盐溶液(见1.7实验所用抗体和药品)，然后放入一个密闭的OGD室(FormaScientific，Marietta，OH，USA)中，冲入氮气(5％CO₂和95％N2)10分子，然后将该室放入37℃培养箱中孵育2h；OGD处理结束，换回原来的细胞外液再放入正常的培养箱中孵育即可。细胞死亡采用碘化丙锭(PI)染色的方法来计算。

1.4电生理和钙成像实验

利用计算机控制的700A扩增仪(Axopatch 700A，Molecular Devices，Foster City，CA)，在培养的皮层神经元上采用全细胞膜片钳的方法来记录电信号。电极内液成分如下(以mM计)：CsCl 140，CaCl₂0.3，EGTA 10，MgCl₂1，HEPES 10，pH 7.2。正常细胞外液包含(以mM计)：NaCl 140，KCl 5，MgCl₂1，CaCl₂1，D-葡萄糖10，和HEPES10，pH 7.4。记录过程中，钳制电压为-70mV。

钙成像实验的方法主要是参考Zhu等1996的文章[Zhu，X.等，trp，a novelmammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+entry.Cell，1996.85(5)：p.661-71.]。简言之，皮层神经元和钙离子染料Fura-2AM(溶解在0.0125％的聚醚酸中，并用DMSO稀释)共孵育30min，整个反应在HEPES缓冲盐水(HPSS：(以mM计)120NaCl，5.3KCl，0.8MgSO₄，1.8CaCl₂，11.1葡萄糖和20HEPES，pH7.4)中进行，孵育完毕用HPSS洗2-3次，然后再用HPSS孵育半小时。然后用尼康eclipseTe2000-e显微镜来检测胞内钙离子浓度[Ca²⁺]_i(F340/F380比)的变化情况。

1.5体外钙蛋白酶切实验

成年大鼠脑组织用HEPES缓冲液(以mM计：20HEPES，pH7.4，5KCl，1.5MgCl₂，1二硫苏糖醇，1EGTA)来匀浆，其提取物与1mM Ca²⁺在37摄氏度反应；或者在1mM Ca²⁺，37摄氏度条件下与纯化的μ-钙蛋白酶(Biovision，Palo Alto，CA，USAS)孵育。为了确定钙蛋白酶在TRPC6上的切割位点，在HEK293细胞中转染flag-loop-HA-TRPC6-myc质粒(pcDNA3.1TRPC6-myc质粒，在之前插入flag，中间TRPC6第二个loop区插入HA，插入标签用的是美国Stratagene公司的

Site-Directed Mutagenesis Kit)，然后用HEPES缓冲液提取细胞裂解液，再加入u-钙蛋白酶切消化。纯化蛋白NUS-C6_1-203用Ni柱(Qiagen，Hilden，德国)提取，然后加入u-钙蛋白酶切消化，酶切下来的片段用来做质谱分析和Edman测序。

1.6TRPC6转基因小鼠的构建和培养

利用CaMKIIα的启动子来驱动小鼠TRPC6基因在小鼠大脑(特别是前脑)神经元上的表达。在质粒p279(Joe Z Tsian等，Neuron，March 4，2004)上含有大约8.5kb的来源于小鼠基因组的CaMKIIα的启动子区域，在其后接上小鼠TRPC6的cDNA片断，并且后面加上polyA尾巴。将该质粒进行线性化，然后显微注射到C57BL6J和FBN品系小鼠杂交的受精卵中，最后将注射好的受精卵植入代孕的母鼠体内。转基因小鼠的基因型是通过聚合酶链式反应(PCR)的方法来鉴定的。PCR检测所用的引物分别是：

p279F，GTTCTCCGTTTGCACTCAGG(SEQ ID NO：2)；

trpc6-flag R，CGGGATCCCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCTCTGCGG  (SEQID NO：3)

最终得到3个亲代小鼠(F0)。使F0的小鼠与C57BL6J品系的小鼠进行交配产生子代，实验中所用的小鼠都是子3代(F3)以上的小鼠。

1.7实验所用抗体和药品

实验中所用商业化抗体分别来自以下公司：

Alomone Labs的兔抗TRPC 1、3、4、5、6抗体；

Millipore的兔抗TRPC6抗体、小鼠抗NeuN、抗GFAP、抗血影蛋白、抗NR2A和抗CD31抗体；

Upstate的兔抗GluR1、GluR2/3、GREB和磷酸-GREB Ser133抗体，小鼠抗myc和抗PSD95抗体；

Sigma的小鼠抗CaMKIIα、抗α-微管蛋白抗体，和抗TRPC6抗体；

Santa Cruz的羊抗capain 1抗体、小鼠抗磷酸-CaMKIIαThr286抗体和抗NOS1抗体。

除非特别说明，其他药品及试剂均来自Sigma公司。

由吉尔生化(上海)有限公司直接合成本申请的TAT-C6肽(见图14b)。

1.8数据统计

用于数据分析的软件主要有：Clampfit 9.0(Axon公司，美国)、Origin 7.0(Originlabcorporation，美国)和Excel 2003(Microsoft)。实验数据以平均值±标准误(mean±s.e.m)表示。用t检验(student’s t-test，包含配对与非配对检验)比较两组数据之间的差异性；用方差分析(ANOVA)比较多组数据之间的差异性。p表示显著性值，n表示实验例数。当p＜0.05即认为有显著性差异。此外，生存曲线的分析采用的是nonparametric Kaplan-Meier方法。

2.实验结果

2.1脑缺血后神经元中的TRPC6蛋白特异的下调

大鼠局灶脑缺血模型采用的是中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的方法[Longa，E.Z.等，Reversible middle cerebral artery occlusion withoutcraniectomy in rats.Stroke，1989.20(1)：p.84-91]，缺血2小时然后复灌不同时间；缺血损伤情况用TTC染色的方法来检测。首先，在缺血大鼠脑中筛查了与生存相关的分子的蛋白表达变化情况。将缺血大鼠脑中缺血侧的半影区和相对应的正常侧脑区的组织提取蛋白，再用免疫蛋白印迹的方法来检测其中蛋白的变化情况。利用特异的TRPC抗体(图1)(见1.7实验所用抗体和药品)，发现TRPC6蛋白表达量在缺血后复灌的0、6、12和24小时分别降低为对照侧蛋白量的74％、58％、40％和32％(每个时间点，n＝5-8只老鼠，^*p＜0.05，^**p＜0.01，图2a)，而TRPC3和TRPC4蛋白在这些时间点上却没有显著变化(图2b)。尽管TRPC6蛋白量在复灌后24小时有显著的降低，但是TRPC1、C3、C4、C5和GluR1等蛋白的表达量却没有明显降低(图2c)。此外，实时酶链式聚合反应也显示，在缺血复灌后TRPC6在mRNA水平上未有显著变化(图2d)，这就提示，其蛋白量的显著下调是发生在翻译后水平的。综上可以推断TRPC6蛋白在缺血后的半影区发生了特异的下调。

接着，用免疫组织化学的方法研究TRPC6蛋白的下调是否发生在神经元中。实验显示，复灌后24小时在缺血侧的NeuN阳性细胞(神经元)中TRPC6的免疫阳性显著降低(图2e)，然而在GFAP阳性细胞(胶质细胞)中，TRPC6的免疫阳性却没有明显变化(图3)。这提示缺血后神经元中的TRPC6蛋白发生了特异的下调。

2.2TRPC6蛋白的下调先于神经元的死亡

为了研究TRPC6蛋白的下调是否是神经元死亡的一个被动结果，将缺血大鼠的脑切片同时用TRPC6蛋白的抗体(见1.7实验所用抗体和药品)和检测细胞死亡的试剂盒(TUNEL Kit)来做染色标记。实验结果显示，缺血复灌24小时后，半影区的TRPC6蛋白已有明显下调，但是TUNEL检测的阳性细胞却要在复灌48小时后才会明显增多(图4a)。进一步的统计分析表明，缺血后的复灌期间，TRPC6蛋白量和TUNEL阳性细胞数之间有很好的负相关性。如图4b显示，缺血后复灌0小时开始，TRPC6蛋白就明显降低，并且在12、24、48小时其蛋白表达量显著的逐渐降低。而TUNEL标记的阳性细胞在复灌后24小时才开始出现并在48小时显著增加。这就提示，TRPC6蛋白的下调是先于神经元死亡的，并且TRPC6蛋白下调可能在其后的缺血性神经元死亡中扮演一个重要角色。

2.3在细胞模拟缺血实验中TRPC6蛋白发生功能性的下调

为了更好地研究TRPC6蛋白的下调，利用广泛使用的细胞模拟缺血实验，即在培养的神经元细胞上进行氧糖剥夺实验(Oxygen-Glucose Deprivation，简称OGD)[Goldberg，M.P.和D.W.Choi，Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cellculture：calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal iniury.JNeurosci，1993.13(8)：p.3510-24]。结果发现，在OGD处理的培养神经元中，TRPC6蛋白量特异地下调，而TRPC3蛋白量却没有显著变化(图5a)。通过定量RT-PCR的方法分析得出TRPC6在mRNA水平上并未有变化(图5b)，这就与前面在动物中的实验结果相符，表明在模拟缺血刺激的条件下，神经元中的TRPC6蛋白也会发生特异性的下调。

为了研究TRPC6蛋白的下调是否影响膜上TRPC6通道的功能，进行电生理实验。利用全细胞膜片钳的记录方式，在培养的神经元中OAG(DAG(二酰基甘油)的类似物，是TRPC6、TRPC3通道的增强剂)可以引起一个缓慢而微小的内向电流(IOAG)。用SKF96365(广泛的TRPCs通道的抑制剂，Sigma公司购得)或者用0Ca²⁺外液加NMDG(替代Na⁺)都可以完全抑制这一电流。进一步，在神经元中转染针对TRPC6蛋白的特异的RNAi质粒(RNAi_C6，见Zhou J^*等的文献，旨在敲减TRPC6蛋白的表达量)可以抑制OAG引起的这一电流(图6a、b)。同样，在钙成像实验中，发现用OAG刺激可以在培养的皮层神经元中引起一个缓慢而微小的胞内钙离子浓度([Ca²⁺]i)的升高。这一[Ca²⁺]i的升高可以被SKF96365所抑制；如果在0Ca²⁺外液中，OAG则不能引起胞内钙升高；此外，如果神经元中过表达突变型的TRPC6(DN-TRPC6，其通道孔区有三个突变，从而可以抑制TRPC6通道的开放[Hofmann，T.，et al.，Subunit composition of mammalian transient receptor potential channels in livingcells.Proc Natl Acad Sci U S A，2002.99(11)：p.7461-6])，则OAG引起的[Ca2+]i升高也会被明显抑制(图7)。并且，根据电流和电压的关系所显示的该通道的双向整流性质(图6c)，提示I_OAG电流主要是由TRPC6通道蛋白所介导的。在OGD处理的神经元中，发现I_OAG明显被抑制(图8)，作为对照，与已有报道一致的是，由酸离子通道所介导的电流IpH6.0明显增加[Xiong，Z.G.，et al.，Neuroprotection in ischemia：blocking calcium-permeable acid-sensing ion channels.Cell，2004.118(6)：p.687-98]。这就提示，在模拟缺血的实验条件下神经元中的TRPC6通道蛋白特异下调，从而导致膜上TRPC6通道功能的特异性的下调。

在神经元中过表达以下质粒：GFP(对照蛋白)，TRPC6(功能性通道蛋白)，DN-TRPC6(突变的没有功能的通道)，RNAi_C6(敲减TRPC6蛋白的表达)〔ZhouJ^*，Du WL^*，Zhou KC，Tai YL，Yao HL，Jia YC，Ding YQ，Wang YZ.Critical role ofTRPC6 channels in the formation of excitatory synapses.Nat Neurosci.2008Jul；11(7)：741-3〕，并且对神经元做OGD处理。结果发现，过表达TRPC6蛋白可以降低OGD引起的细胞死亡数，而过表达DN-TRPC6或者过表达RNAi_C6质粒敲减内源的TRPC6蛋白量都会明显增加OGD引起的细胞死亡。这就说明，在模拟的缺血条件下，增加TRPC6蛋白表达量对神经元有保护作用，而降低TRPC6蛋白量则加重细胞损伤(图9)。与此相应，我们用OAG预处理细胞后再做OGD刺激，细胞死亡率明显降低；但是如果用SKF96365预处理细胞后再给OGD刺激，则细胞死亡率明显增加(图10a)。同样，在MCAO大鼠(Sprague-Dawley，250-280g，上海斯莱克实验动物有限公司)中，如果预先侧脑室注入OAG，那么缺血引起的梗塞面积明显减小；相反，如果预先注入SKF96365，则加重缺血损伤(图10b，c)。以上实验结果表明，在模拟缺血刺激的情况下，上调TRPC6有很好的神经元保护作用，而下调TRPC6则加重神经元的损伤。

此外，在培养的神经元中过表达TRPC3蛋白，发现其对于OGD引起的细胞死亡并没有保护作用(图11)。进一步的实验提示，TRPC6蛋白的特异性保护作用是有赖于CREB蛋白的激活，因为，其一，过表达TRPC6蛋白量可以增加p-CREB的表达量，即激活形式的CREB增多(图12a)；其二，如果将KCREB(显性抑制型环磷酸腺苷反应元件结合蛋白，不能与DNA结合，无功能)与TRPC6共表达的话，则完全抑制了TRPC6蛋白的保护作用(图12b)。

2.4TRPC6蛋白被钙蛋白酶降解

缺血复灌中，TRPC6蛋白的快速下调提示，这可能是由一种蛋白酶介导的快速降解过程。接下来的实验筛查是参与TRPC6蛋白的下调的蛋白酶。

在大鼠脑组织提取液中，加入钙离子可以诱导TRPC6蛋白特异的下调，而TRPC3蛋白却没有这种钙离子引起的下调，并且预加EGTA可以阻断这种蛋白降解(图13a)。时程分析表明，加入钙离子5分钟后这一蛋白降解就非常明显了，并且发现当钙离子浓度从100μM开始就有这一降解现象(图13b)。已知这样的钙离子浓度正好可以激活μ型钙蛋白酶，这也是主要分布在神经元中的一类型钙蛋白酶[Goll，D.E.，et al.，Thecalpain system.Physiol Rev，2003.83(3)：p.731-801]。这些结果提示，TRPC6蛋白被一种钙离子激活的蛋白酶水解。为了进一步验证是哪一种蛋白酶参与此过程，使用以下抑制剂：PMSF，丝氨酸蛋白酶抑制剂，cpm-VAD-CHO，caspase蛋白酶抑制剂，以及lactacystin，蛋白降解体抑制剂(见1.7实验所用抗体和药品)，然而，这些抑制剂都不能阻断这一体外系统中钙离子引起的TRPC6蛋白的降解。相反，钙蛋白酶的抑制剂，包括：calpeptin，亮抑蛋白酶和MDL28170(见1.7实验所用抗体和药品)，它们都很好的阻断了钙离子引起的TRPC6蛋白的降解(图13a，c)。这些结果表明，TRPC6蛋白的降解是由于钙蛋白酶的蛋白水解作用。此外，通过免疫蛋白印迹的方法检测了spectrin蛋白的降解情况(可以作为钙蛋白酶激活与否的一个标志[Siman，R.，M.Baudry，and G.Lynch，Brain fodrin：substrate for calpain I，an endogenouscalcium-activated protease.Proc Natl Acad Sci U S A，1984.81(11)：p.3572-6])，证实了在这一体外系统中钙蛋白酶确实是激活的。

接下来验证TRPC6蛋白是否是由钙蛋白酶直接降解的。首先在HEK293细胞系中表达了N-flag-second loop-HA-C-myc(pcDNA3.1TRPC6-myc质粒，在之前插入flag，中间TRPC6第二个loop区插入HA，插入标签用的是Stratagene公司的

Site-Directed Mutagenesis Kit)标记的TRPC6质粒(图14，示意小图)，24小时以后，收取细胞蛋白并做钙蛋白酶体外消化实验。在免疫蛋白印记实验中用HA抗体检测发现，代表全长的TRPC6蛋白的条带随着钙蛋白酶浓度的增加而降低(Fig 3.4.2a)，并且在原来主带下面出现两条条带。用flag抗体检测发现，随着钙蛋白酶浓度的增加全长TRPC6蛋白的条带很快的消失了，而用myc抗体检测的全长条带消失明显晚于flag抗体所识别的条带，并且随着钙蛋白酶浓度的增加，全长的条带下面紧靠着出现一条条带，到最后的全部条带消失。这就提示，TRPC6蛋白的N端比C端更容易被钙蛋白酶降解。因此推测N端是开始降解的地方，随着N端的降解，TRPC6蛋白发生了顺序的降解，直至C端片段也完全降解。

接下来，在原核细胞E.Coli中表达了TRPC6蛋白的N端氨基酸序列(把TRPC6的N端序列从M¹到D²⁰³亚克隆后接到载体NUS_tag(pET-43.1a载体，Novagen，德国)，即NUS_C6_1-203)，分离纯化这段蛋白后，加入钙蛋白酶消化。结果显示，钙蛋白酶浓度依赖性地切割这段蛋白，并且发现了一条被切割下来的片段，把这一片段收集并进行质谱分析和N端测序，显示该片段确实来源于TRPC6，测序结果也证实了钙蛋白酶在TRPC6上的切割位点是在AAPGA序列的N端(图14b)。根据这一位点构建了一段多肽，其序列就是包含了这一切割位点的一段TRPC6的氨基酸序列，并带有TAT序列(为了使其很好的穿过细胞膜[Vives，E.，P.Brodin，和B.Lebleu，Atruncated HIV-1Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasmamembrane and accumulates in the cell nucleus.J BiolChem，1997.272(25)：p.16010-7])。将该多肽命名为TAT-C6，其序列为GRKKRRQRRRCRRGGSLKAAPGAGTRR(SEQ ID NO：4)。接下来的要用这一段多肽去特异的阻断钙蛋白酶对TRPC6的蛋白水解作用而不影响钙蛋白酶的其他功能。实验发现，这段TAT_C6肽段可以有效的抑制Ca离子引起的大鼠脑溶解物(rat brainlysates)中TRPC6蛋白的降解，而并不影响钙蛋白酶的标志性底物spectrin的降解(图14b，右图)。这就提示，这段肽对于抑制钙蛋白酶降解TRPC6的过程是非常特异并且有效的。

2.5在缺血情况下NMDA受体参与TRPC6蛋白的降解

根据已有文献报道，在缺血过程中，钙蛋白酶的激活很可能是由于NMDA受体的过度开放造成的。

为了研究NMDA受体是否参与了缺血条件下钙蛋白酶介导的TRPC6蛋白水解过程，首先在培养的神经元中预加入钙蛋白酶的两种抑制剂：calpeptin和MDL28170(见1.7实验所用抗体和药品)，再将细胞做OGD处理，24小时后检测其中蛋白变化情况和细胞死亡率。实验结果显示，OGD引起的TRPC6蛋白的降解可以被预加钙蛋白酶的抑制剂所阻断。并且，这两个钙蛋白酶的抑制剂都可以有效的降低OGD引起的细胞死亡(图15a)。

预先在培养的皮层神经元中转染特异的针对钙蛋白酶的两段siRNA(CAPN i_1：5’-GCUUCUUGUUGGCCCUCAUTT-3’(SEQ ID NO：5)；CAPN i_2，5’-GAAUCAUUAGCAAACACAATT-3’(SEQ ID NO：6)，上海吉玛公司合成)以敲减钙蛋白酶的表达量，再做OGD刺激然后统计TRPC6蛋白的降解情况。结果发现，这两段siRNA都能很好的阻断OGD引起的TRPC6蛋白降解(图15b)。

这些结果都表明，细胞缺血条件下TRPC6蛋白的下调确实由于钙蛋白酶的水解作用。

此外还发现地佐环平(MK801，Sigma公司购得，NMDA受体的阻断剂)能有效的阻断TRPC6蛋白的降解(图15c)，提示NMDA受体可能参与这一过程。进一步的，预先用转染siRNA(RANi由上海吉玛公司合成，NR li_1：5’-GGCAGUUCACGAACUCCUATT-3’(SEQ ID NO：7)；NR li_2：5’-GACUAAAGAUAGUGACAAUTT-3’(SEQ ID NO：8))的方法去降低NMDA受体一个必需亚基NR1的蛋白表达量，结果，OGD引起的TRPC6蛋白降解被有效的抑制(图15d)。这提示，NMDA受体也确实参与了TRPC6蛋白的降解过程。此外，在大鼠的缺血模型中，如果预先侧脑室注入NMDA受体的阻断剂(memantine)或钙蛋白酶的抑制剂(calpeptin)，都可以有效的抑制缺血引起的TRPC6蛋白的降解(图15e)。无论在缺血的动物模型中或细胞模型中，都证实了NMDA受体和钙蛋白酶都参与了TRPC6蛋白的降解过程。

2.6增加TRPC6蛋白表达量可以有效的降低缺血小鼠脑损伤

为了进一步证明TRPC6蛋白量与脑缺血保护的关系，构建了TRPC6转基因小鼠。利用CaMKIIα启动子驱使的表达载体，可以将外源的TRPC6蛋白比较特异的表达在前脑神经元中，这其中包括皮层和海马神经元，而不包括小脑神经元。

首先鉴定了在转基因小鼠大脑皮层蛋白中，TRPC6蛋白的表达水平较之于野生型小鼠有明显的增加而其他蛋白水平未有改变(图16a，b)。其次，用免疫组化实验观察到在转基因小鼠中TRPC6蛋白在皮层和海马中都有较高表达，而小脑中没有(图16c)。这都说明了转基因小鼠中的TRPC6蛋白特异的在前脑神经元中有较高表达。接下来，用转基因小鼠(Tg)和其同窝的非转基因小鼠(WT)做了缺血实验(这里采用的是双盲实验的方式，即做手术的人员并不知道小鼠的分组，而统计缺血损伤的人员也不知道小鼠的分组情况)。结果发现TRPC6转基因小鼠的脑梗塞面积明显小于非转基因的野生型小鼠，并且转基因小鼠的存活率也高于野生型小鼠(图17)。这就进一步的证实，增加TRPC6蛋白表达量对于缺血小鼠的脑损失有明显的降低作用，并且可以提高脑缺血后的存活率。同时，也用免疫组化的方法，通过标记CD31蛋白(一种血管内皮细胞的marker，常用于显示血管的结构及密度)，来检查转基因小鼠和野生型小鼠脑中的血管结构及密度，结果表明没有显著性差异(图18)。另一方面，用激光多普勒血流仪来检测缺血前后转基因小鼠和野生型小鼠脑中的血流量变化情况，结果显示也没有明显差异(图18，右图)。所以，我们认为，转基因小鼠对于缺血损伤的耐受性可能是由于保持了一定的TRPC6蛋白量，而并非其他原因。

为了进一步证实TRPC6转基因小鼠在脑缺血中的耐受性是由于其神经元中TRPC6蛋白量较高，我们将缺血后的小鼠脑片做免疫组化染色标记TRPC6蛋白的同时用TUNEL试剂盒来检测细胞死亡情况。结果显示，在转基因小鼠中，TRPC6蛋白表达量高的细胞对应的TUNEL阳性数目较少，而在野生型小鼠中TRPC6蛋白表达量低的细胞对应的TUNEL阳性数目显著多于前者(图19)。这就提示，细胞中维持一定的TRPC6蛋白量可以有效的增加其对缺血损伤的耐受性。

如图20a所示，在假手术组中，转基因小鼠脑中的TRPC6蛋白量明显高于野生型小鼠；缺血后，尽管转基因小鼠和野生型小鼠脑中的TRPC6蛋白量都有明显降低，但是转基因小鼠脑中的TRPC6蛋白量仍然高于野生型小鼠。这就提示缺血保护作用可能是依赖于维持一定的TRPC6蛋白量。

2.7TRPC6的缺血保护作用可能是依赖于CREB蛋白的激活

在TRPC6转基因小鼠的皮层蛋白中，检测缺血前后p-CREB以及CREB的蛋白水平，结果显示，假手术组中，转基因小鼠脑中的p-CREB/CREB水平明显的高于野生型小鼠，并且在缺血后，转基因小鼠皮层中的p-CREB/CREB水平也仍高于对照小鼠(图20b)。作为对照，还同时检测了其他受Ca²⁺调控的下游蛋白，比如，p-CaMKIIα/CaMKIIα和NOS1的蛋白量变化情况，结果表明在转基因小鼠和野生型小鼠中，这两个蛋白的表达量在缺血前后都没有明显的差异(图20c)。这就提示，转基因小鼠的缺血损伤小并且存活率长很可能是由于其脑中TRPC6蛋白水平较高，进而下游激活形式的CREB，即p-CREB蛋白水平较高，作为一个促进细胞存活的蛋白，CREB的持续激活对于保护大脑免受缺血损伤有重要作用[Kitagawa，K.，CREB andcAMP response element-mediated gene expression in the ischemic brain.Febs J，2007.274(13)：p.3210-7]。

2.8抑制钙蛋白酶降解TRPC6可以有效的降低大鼠脑缺血损伤

前面的实验表明，TAT_C6这段肽可以有效抑制Ca²⁺引起的脑溶解物中TRPC6蛋白的降解而不影响钙蛋白酶对于其他底物的降解过程。所以，检测TAT_C6肽是否可以抑制脑缺血引起的脑中TRPC6蛋白的降低，进而维持内源性TRPC6蛋白量而保护脑免受缺血损伤。实验结果显示，缺血前侧脑室注入TAT C6肽可以有效的减少缺血引起的TRPC6蛋白的降解而不影响spectrin的降解(图21)，即不影响钙蛋白酶的其他功能，只是特异性的抑制钙蛋白酶降解TRPC6这一过程。此外，将大鼠分为三组，分别给予Veh.(蒸馏水)、TAT_ctrl(GRKKRRQRRRC_PPYGYYPSFRGNENRL由吉尔生化(上海)有限公司直接合成)和TAT_C6肽(缺血前侧脑室注入)，然后缺血2小时复灌24小时以后评估其缺血损伤情况，发现只有第三组，即TAT_C6肽处理组的大鼠其脑损伤最小，相比前两组有明显的差异(图21，右图)。综上，利用针对性的肽段(TAT_C6)抑制钙蛋白酶降解TRPC6蛋白，这一策略可以有效的保护缺血性脑损伤。

3.其它多肽也能抑制钙蛋白酶降解TRPC6

在之前的实验中我们已证明RRGGSLKAAPGAGTRR可以阻止钙蛋白酶切割TRPC6，并且在侧脑室注射此肽段可以保护缺血脑损伤。为了进一步证明钙蛋白酶对TRPC6的切割位点是这一保护作用中的关键，我们合成了包含有此位点的更短肽段TAT-C6-2(grkkrrqrrrcGGSLKAAPGA(SEQ ID NO：9)，grkkrrqrrrc为TAT序列(穿膜因子)，KA为切点两侧的氨基酸)。侧脑室注射(每只大鼠侧脑室注射1mM肽×5μl)后对损伤面积的分析表明，缺血前注射此短肽段对缺血损伤仍有显著的保护作用(^*p＜0.05)(见图22)。

为了进一步证明钙蛋白酶对TRPC6的切割位点是这一保护作用中的关键因素，我们合成了包含有此位点的更短肽段TAT-C6-3(TAT-C6-3：grkkrrqrrrcSLKAAP(SEQID NO：10)，grkkrrqrrrc为TAT序列(穿膜因子)，KA为切点两侧的氨基酸)。每只大鼠侧脑室注射1mM肽×5μl，侧脑室注射后对损伤面积的分析表明，缺血前注射此短肽段对缺血损伤仍有仍有显著的保护作用(^*p＜0.05)(见图23)。

此外，在体外系统中(cell-free)，将钙蛋白酶与纯化的TRPC6蛋白在37℃并且有钙离子存在的条件下孵育，同时加入不同浓度的多肽。然后用免疫印迹的方法检测某多肽是否能浓度依赖性的抑制钙蛋白酶降解TRPC6蛋白。

采用上述方法检测如下多肽：SLKAAPGAGTR、RGGSLKAAPGAGTR、TRRGGSLKAAPGAGTRR、VCRRGGSLKAAPGAGTRR、FVCRRGGSLKAAPGAGTRRN，预期这些多肽能够抑制特异性地竞争性结合到钙蛋白酶解离TRPC6的位点，从而抑制钙蛋白酶降解TRPC6。

4.腹腔注射TAT-C6改善老年性痴呆模型老鼠的学习和记忆能力

选取年龄在11个月左右的野生型(WT)和APP/PS1老年性痴呆模型小鼠(APP/PS1)，按照20mg/kg的剂量分别进行腹腔注射TAT-C6肽和对应量的生理盐水，分成四个组(每组的n＝5)：WT注射TAT-C6肽组(WT+肽)，WT注射生理盐水组(WT)，APP/PS1注射TAT-C6肽组(APP/PS1+肽)，APP/PS1注射生理盐水组(APP/PS1)。每周注射两次，一共持续三个月，然后进行水迷宫实验检测老鼠的学习和记忆能力。

结果显示(图24)，相比WT组，APP/PS1组在训练阶段需要花更多时间才能找到隐藏的平台(图24b)，在测试阶段则更少次地穿越了平台位置(图24d)，提示APP/PS1鼠在14个月时表现出明显的学习记忆能力下降。而与APP/PS1相比，APP/PS1+肽组在训练阶段只需花更少时间即可找到隐藏的平台，在测试阶段则更多次地穿越了平台位置(^*p＜0.05；^**p＜0.01；^***p＜0.001)。这说明TAT-C6肽能够显著改善APP/PS1鼠的学习和记忆能力。

以上以具体实施方式的形式描述了本发明。但是，这些具体实施例仅仅是阐述性而言，而非是对本发明范围的限制。本领域技术人员在不偏离本申请说明书的精神的情况下可对本发明作出各种变动和更改。本申请的保护范围由权利要求书来限定。

Claims (13)

1.一种分离的多肽，选自SEQ ID NO:1或其包含SLKAAP的片段。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自：

（a）GGSLKAAPGA；

（b）该（a）项多肽的SLKAAP的左右两侧独立延伸0、1、或2个（a）所示的对应位置上的氨基酸残基的多肽；或

（c）在SEQ ID NO:1的基础上，在其中的GGSLKAAPGA的左右两侧独立延伸0、1、2、3、4、5或6个氨基酸残基所得到的多肽。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自SLKAAP、SLKAAPGAGTR、GSLKAAPGAGTR、GGSLKAAPGAGTR、RGGSLKAAPGAGTR、RRGGSLKAAPGAGTR、RRGGSLKAAPGAGTRR、TRRGGSLKAAPGAGTR、VTRRGGSLKAAPGAGTR、SLKAAPGAGTRR、SLKAAPGAGTRRN、SLKAAPGAGTRRNE、GSLKAAPGAGTRR、GGSLKAAPGAGTRR、RGGSLKAAPGAGTRR、TRRGGSLKAAPGAGTRR、CRRGGSLKAAPGAGTRR、VCRRGGSLKAAPGAGTRR、FVCRRGGSLKAAPGAGTRRN、和GGSLKAAPGA。

4.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽由穿膜因子和权利要求1－3中任一项所述的多肽组成。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述穿膜因子选自RKKRRQRRR、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL、RQIKIWFQNRRMKWKK、RRRRRRR、RRRRRRRRR、RRRRRRRRRRR、GRKKRRQRRRC。

6.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的多肽。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1－6中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体或赋形剂。

8.权利要求1-6中任一项所述的多肽在制备提高对象TRPC6表达量用的药物中的用途。

9.权利要求1－6中任一项所述的多肽在制备保护神经元用的药物中的用途。

10.权利要求1－6中任一项所述的多肽在制备治疗或预防神经退行性疾病用的药物中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病选自：阿尔茨海默氏病、肌肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨廷顿氏病、小脑萎缩症、多发性硬化症、帕金森氏病、原发性侧索硬化、和脊髓性肌萎缩症。

12.权利要求1－6中任一项所述的多肽在制备治疗或预防缺血引起的损伤用的药物中的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述损伤包括缺血引起的脑损伤。

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