WO2007037473A1

WO2007037473A1 - 細胞遊走阻害方法および細胞遊走阻害剤

Info

Publication number: WO2007037473A1
Application number: PCT/JP2006/319681
Authority: WO
Inventors: Hiromasa Hamada; Hiroto Nakajima; Hirofumi Doi; Hirokazu Matsuki
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-10-02
Publication date: 2007-04-05

Abstract

【課題】ＭＡＳＴ２０５と相互作用する蛋白質を見出し、ＭＡＳＴ２０５の作用調節手段・ＭＡＳＴ２０５の異常に起因する疾患の防止や治療に有用な手段を提供する。【解決手段】ＭＡＳＴ２０５が、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３／４／６／７、ｐ３８　ＭＡＰＫと結合すること、ＤＣＴＮ１をリン酸化すること、ＭＫＫ３／４／６、ｐ３８　ＭＡＰＫ、ＪＮＫのリン酸化に関与すること、細胞の遊走や浸潤に関与することを見出し、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法・阻害剤、癌転移の抑制方法・抑制剤、血管新生の抑制方法・抑制剤、細胞遊走抑制活性を有する化合物・ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３／４／６／７、またはｐ３８　ＭＡＰＫとの結合を阻害する化合物・ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法、試薬キットを提供。

Description

明細書

細胞遊走阻害方法および細胞遊走阻害剤

技術分野

[0001] 本発明は細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤、該遊走阻害方法または該遊走阻害剤を用いる癌の転移抑制方法、該遊走阻害剤を含む癌の転移抑制剤、並びに血管新生抑制方法および血管新生抑制剤に関する。

[0002] より詳しくは、本発明は MAST205 (microtubule associated testis specific

ST protein kinase— 205kDa)の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤、並びに血管新生抑制方法および血管新生抑制剤に関する。さらに、本発明は、該遊走阻害方法または該遊走阻害剤を用いる癌の転移抑制方法、並びに該遊走阻害剤を含む癌の転移抑制剤に関する

[0003] 本発明はまた、前記方法および前記阻害剤に用いる化合物の同定方法、並びに試薬キットに関する。

背景技術

[0004] MAST205は、キナーゼドメインおよび PDZドメインを保持するセリンスレオ-ンキナーゼである。 MAST205には、スプライシングバリアントと考えられる数種の変異体が知られている。具体的には、 NCBIデータベースにァクセッションナンバー AAH6 5499 (1797アミノ酸残基）、 CAH73244 ( 1798アミノ酸残基）、および BAB40778 (1734アミノ酸残基）として開示されている各蛋白質力 MAST205として知られている。 CAH73244 ( 1798アミノ酸残基）は、 AAH65499 (1797アミノ酸残基）のアミノ酸配列と比較して、第 1224番目と第 1225番目のアミノ酸残基の間にセリン残基が挿入されて、ることを除、て同一のアミノ酸配列を有する。 BAB40778 ( 1734ァミノ酸残基）は、 CAH73244 ( 1798アミノ酸残基）のアミノ酸配列と比較して、第 388番目、第 659番目および第 1550番目のアミノ酸残基がそれぞれグルタミン酸残基、メチォニン残基およびグリシン残基に置換し、かつ第 1688番目以降の領域がフレームシフトして!/、ることを除!、て同一のアミノ酸配列を有する。 [0005] MAST205は 1993年、ワルデン（Walden)らによって、微小管結合蛋白質（micr otubule- associated proteins)と複合体を形成するリン酸化酵素として最初にクローニングされ、精巣に分布することが報告された (非特許文献 1)。また、 MAST20 5の発現がほとんどすべての正常組織で普遍的に認められるという報告がある（非特許文献 2)。一方で、 MAST205の発現は、精子で、それも発達分ィ匕中の精子で最も高!ヽと！ヽぅ報告 (非特許文献 3)や、心臓で高ヽ発現が認められるとヽぅ報告 (非特許文献 2)がある。

[0006] MAST205と相互作用する蛋白質が現在までにいくつか報告されている。例えば、神経筋接合部では MAST205は PDZドメインを介して |8 2 シントロフィンと結合することが知られて!/、る（非特許文献 2)。このような PDZドメインを介した MAST205 と他の蛋白質との結合は他にも知られており、プロトカドヘリン LKCや PTEN (phos phatase and tensm homologue deleted on chromosome ten)力 MAS T205と結合すると報告されてヽる（それぞれ非特許文献 4並びに非特許文献 5および 6)。 PTENは腫瘍抑制ホスファターゼとして知られており、細胞増殖やアポトーシスに関連すると考えられている。 PTENについては、 MAST205によるリン酸化も報告されており、 MAST205による機能的制御の可能性も示唆される（非特許文献 6) 。また、腎臓の Ila型ナトリウム Zリンコトランスポーター（type Ila Na/Pi cotra nsporter)と MAST205の結合が報告されており（非特許文献 7)、このトランスポーターも PDZドメインを保持してヽることから、該結合は PDZドメインを介した結合であると考免られる。

[0007] MAST205の機能については、 MAST205の不活性体をトランスフエクシヨンした細胞でリポポリサッカライド (lipopolysaccharide：以下、 LPSと略称する）刺激に対するインターロイキン 12 (以下、 IL— 12と略称する）産生が抑制されていることが報告 (非特許文献 8)されている。また、 MAST205は、マクロファージをペプチドダリカンによる TLR - 2 (toll - like receptor - 2)刺激や LPSによる TLR - 4刺激により活性ィ匕したときの IL 12産生にお、て必須の蛋白質であること (非特許文献 8)、マク口ファージにおける Fc y受容体 IIA(Fc y R ΠΑ)刺激によってュビキチンィ匕を受けプロテアソーム媒介型の分解を受けることが報告されている（非特許文献 8)。さら〖こ、 MAST205は、ュビキチンリガーゼとして機能する TRAF2 (tumor necrosis fact or receptor -associated factor 2)や TRAF6と結合すること等も報告されている (非特許文献 9)。

[0008] さらに、 MAST205に対する siRNA (small interfering RNA)を用いて MAST 205の発現をノックダウンすることにより癌細胞の増殖が阻害されたことが開示されている（特許文献 1)。

[0009] 特許文献 1：国際公報第 2004Z058153号パンフレット。

非特許文献 1 :ワルデン (Walden P. D. )ら、「モレキュラーアンドセルラーバイォロジ一（Molecular and Cellular Biology)」、 1993年、第 13卷、第 12号、 p. 7625— 7635。

非特許文献 2 :ルーメング（Lumeng C. )ら、「ネイチヤーニューロサイエンス（Nat ure Neuroscience)」、 1999年、第 2卷、第 7号、 p. 611— 617。

非特許文献 3 :ワルデン (Walden P. D. )ら、「バイオロジーォブリプロダクション (Biology of Reproduction)」、 1996年、第 55卷、第 5卷、 p. 1039— 1044。非特許文献 4 :オカザキ（Okazaki N. )ら、「カルシノジヱネシス（Carcinogenesis) 」、 2002年、第 23卷、第 7号、 p. 1139— 1148。

非特許文献 5 :アディ（Adey N. B. )ら、「キャンサーリサーチ（Cancer Research )」、 2000年、第 60卷、第 1号、 p. 35— 37。

非特許文献 6 :ヴアリエンテ（Valiente M. )ら、「ザジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry)」、 2005年、第 280卷、第 32号、 p. 28936— 28943。

非特許文献 7 :ギスラー（Gisler S. M. )ら、「ザジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry)」、 2001年、第 276卷、第 12号、 p. 9206— 9213。

非特許文献 8 :ゾゥ（Zhou H. )ら、「ザジャーナルォブィムノロジー（The Jour nal of Immunology)」、 2004年、第 172卷、第 4号、 p. 2559— 2568。

非特許文献 9 :シヨン（Xiong H. )ら、「ザジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry)」、 2004年、第 279卷、第 42号、 p. 43675—43683。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] MAST205はセリンスレオニンキナーゼであり、様々な蛋白質と結合すること、また、刺激を受けたマクロファージにおける IL— 12産生や癌細胞の増殖に関与することが知られている。 MAST205と結合する新たな蛋白質を見出し、 MAST205の機能を明らかにすることにより、 MAST205の発現や機能の異常に起因する疾患を防止および Zまたは治療できる。

[0011] 本発明の課題は、 MAST205と相互作用してその作用を調節する蛋白質を見出して提供することである。また、本発明の課題には、 MAST205の作用を調節する手段を提供することが含まれる。さら〖こ、本発明の課題には、 MAST205の異常に起因する疾患の防止および Zまたは治療に有用な手段を提供することが含まれる。

課題を解決するための手段

[0012] 上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、 MAST205力 DCTN1 (dyna ctin 1)および TIAM1 (T— cell lymphoma invasion and metastasis 1)それぞれと結合すること、さらに DCTN1をリン酸ィ匕することを見出した。また、 MAST2 05に対する siRNAをトランスフエクシヨンした細胞で、 p38 MAPK (p38 mitogen -activated protein kinase)、 MKK6 (MAPK kinase 6) /MKK3 (MAPK kinase 3)、および JNK(c—Jun N— terminal kinase)のリン酸化が阻害されることを見出した。

[0013] さらに本発明者らは、 MAST205力 MLK3 (mixed liniage kinase 3)、MK K3、MKK4 (MAPK kinase 4)、 MKK6、 MKK7 (MAPK kinase 7)、および p38 MAPKそれぞれと結合することを見出した。また、 MAST205に対する siR NAをトランスフエクシヨンした細胞で、 MKK4のリン酸化が阻害されることを見出した

[0014] DCTN1および TIAM1は、 p38 MAPKあるいはその上流の MKK6ZMKK3を介した情報伝達経路への関与が示唆されている。

[0015] p38 MAPKは、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に関与していることが知られている。また、 p38 MAPKは、 MAPキナーゼ（以下、 MAPKと略称することがある）ファミリーに属し、 MAPキナーゼキナーゼキナーゼ（以下、 MAPKKKまたは MAP3Kと略称することがある）や MAPキナーゼキナーゼ（以下、 MAPKKまたは MAP2Kと略称することがある）を介したキナーゼカスケードにより活性ィ匕される。 p 38 MAPKの活性化には、 MKK3、 MKK4および MKK6が関与することが知られている。また、 p38 MAPKの活性化を、 MLK3が MKK3を介して促進することが知られている。

[0016] JNKは、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られており、 MKK7/MKK4によりリン酸ィ匕されることによりその機能が調節されている。

[0017] これらから発明者らは、 MAST205は、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 M KK4、および MKK6等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、 p38 MAPKのリン酸化を促進し、その結果、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に促進的に関与していると考えている。また MAST 205は、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK4、および MKK7等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、 JNKのリン酸ィ匕にも関与し、その結果、癌の転移、血管新生、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与すると発明者らは考えている。

[0018] 本発明においてはさらに、 MAST205の発現を阻害することにより、細胞の遊走および浸潤が顕著に抑制されることを見出した。細胞の遊走および浸潤は癌の転移能の指標であることから、 MAST205は癌の転移に関与すると発明者らは考えている。

[0019] 上記のように MAST205が、細胞の遊走および浸潤、癌の転移、血管新生、細胞増殖や細胞死、並びに免疫炎症応答に関与すると考えられることから、 MAST205 の発現および Zまたは機能を阻害することにより癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答を抑制できると発明者らは考えている。

[0020] 本発明は、これら知見により完成した。

[0021] すなわち本発明は、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法に関する。

[0022] また本発明は、 MAST205の機能力下記の群から選択される 1つ以上の機能である前記細胞遊走阻害方法に関する：

(D MAST205と DCTN1の結合、

(2) MAST205と TIAM1の結合、

(3) MAST205と MLK3の結合、

(4) MAST205と MKK3の結合、

(5) MAST205と MKK4の結合、

(6) MAST205と MKK6の結合、

(7) MAST205と MKK7の結合、

(8) MAST205と p38 MAPKの結合、

および

(9) MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性。

[0023] さらに本発明は、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性力 DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記細胞遊走阻害方法に関する。

[0024] さらにまた本発明は、細胞が癌細胞である前記細胞遊走阻害方法に関する。

[0025] また本発明は、細胞が内皮細胞である前記細胞遊走阻害方法に関する。

[0026] さらに本発明は、 MAST205に対する RNA干渉により MAST205の発現および

Zまたは機能を阻害する前記細胞遊走阻害方法に関する。

[0027] さらにまた本発明は、 MAST205に対する RNA干渉が MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行う RNA干渉である前記細胞遊走阻害方法に関する。

[0028] また本発明は、 MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害方法に関する。

[0029] さらに本発明は、 MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害方法に関する。

[0030] さらにまた本発明は、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害剤に関する。

[0031] また本発明は、 MAST205の機能力下記の群から選択される 1つ以上の機能である前記細胞遊走阻害剤に関する：

(D MAST205と DCTN1の結合、

(2) MAST205と TIAM1の結合、

(3) MAST205と MLK3の結合、

(4) MAST205と MKK3の結合、

(5) MAST205と MKK4の結合、

(6) MAST205と MKK6の結合、

(7) MAST205と MKK7の結合、

(8) MAST205と p38 MAPKの結合、

および

(9) MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性。

[0032] さらに本発明は、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性力 DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記細胞遊走阻害剤に関する。

[0033] さらに本発明は、細胞が癌細胞である前記細胞遊走阻害剤に関する。

[0034] さらにまた本発明は、細胞が内皮細胞である前記細胞遊走阻害剤に関する。

[0035] また本発明は、 MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む前記細胞遊走阻害剤に関する。

[0036] さらにまた本発明は、 MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害剤に関する。

[0037] また本発明は、 MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害剤に関する。

[0038] さらに本発明は、前記いずれかの細胞遊走阻害方法を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法に関する。

[0039] さらにまた本発明は、前記いずれかの細胞遊走阻害剤を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法に関する。

[0040] また本発明は、前記、ずれかの細胞の遊走阻害剤を含んでなる癌の転移抑制剤に関する。

[0041] さらに本発明は、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制方法に関する。

[0042] さらにまた本発明は、 MAST205の機能力下記の群力も選択される 1つ以上の機能である前記血管新生の抑制方法に関する：

(D MAST205と DCTN1の結合、

(2) MAST205と TIAM1の結合、

(3) MAST205と MLK3の結合、

(4) MAST205と MKK3の結合、

(5) MAST205と MKK4の結合、

(6) MAST205と MKK6の結合、

(7) MAST205と MKK7の結合、

(8) MAST205と p38 MAPKの結合、

および

(9) MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性。

[0043] また本発明は、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性力 DCTN1および Z または TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記血管新生の抑制方法に関する。

[0044] さらに本発明は、 MAST205に対する RNA干渉により MAST205の発現および

Zまたは機能を阻害する前記血管新生の抑制方法に関する。

[0045] さらにまた本発明は、 MAST205に対する RNA干渉が MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行う RNA干渉である前記血管新生の抑制方法に関する。

[0046] また本発明は、 MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制方法に関する。

[0047] さらに本発明は、 MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制方法に関する。

[0048] さらにまた本発明は、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制剤に関する。

[0049] また本発明は、 MAST205の機能力下記の群から選択される 1つ以上の機能である前記血管新生の抑制剤に関する：

(D MAST205と DCTN1の結合、

(2) MAST205と TIAM1の結合、

(3) MAST205と MLK3の結合、

(4) MAST205と MKK3の結合、

(5) MAST205と MKK4の結合、

(6) MAST205と MKK6の結合、

(7) MAST205と MKK7の結合、

(8) MAST205と p38 MAPKの結合、

および

(9) MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性。

[0050] さらに本発明は、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性力 DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記血管新生の抑制剤に関する。

[0051] さらにまた本発明は、 MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む前記血管新生の抑制剤に関する。

[0052] また本発明は、 MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制剤に関する。

[0053] さらに本発明は、 MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制剤に関する。

[0054] さらにまた本発明は、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であつて、 MAST205および Zまたは下記の群力選択される 1つ以上の蛋白質とある化合物（以下、被検化合物と称する）とを接触させ、 MAST205と該蛋白質との結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と該蛋白質との結合を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する：

(i) DCTN1、

(ii) TIAMl、

(iii) MLK3、

(iv) MKK3、

(v) MKK4、

(vi) MKK6、

(vii) MKK7、

および

(viii) p38 MAPKo

[0055] また本発明は、 MAST205と DCTN1の結合を阻害する化合物の同定方法であつて、 MAST205および Zまたは DCTN1と被検化合物とを接触させ、 MAST205と DCTN 1の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と DCTN 1の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0056] さらに本発明は、 MAST205と TIAM1の結合を阻害する化合物の同定方法であつて、 MAST205および/または TIAM1と被検化合物とを接触させ、 MAST205と TIAM 1の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と TIAM1の結合を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0057] さらにまた本発明は、 MAST205と MLK3の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および/または MLK3と被検化合物とを接触させ、 MAST205 と MLK3の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と MLK3の結合を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0058] また本発明は、 MAST205と MKK3の結合を阻害する化合物の同定方法であつて、 MAST205および/または MKK3と被検化合物とを接触させ、 MAST205と M KK3の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と MKK3の結合を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0059] さらに本発明は、 MAST205と MKK4の結合を阻害する化合物の同定方法であつて、 MAST205および/または MKK4と被検化合物とを接触させ、 MAST205と MKK4の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と MKK4の結合を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0060] さらにまた本発明は、 MAST205と MKK6の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および/または MKK6と被検化合物とを接触させ、 MAST2 05と MKK6の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用 V、、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と MKK6の結合を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0061] また本発明は、 MAST205と MKK7の結合を阻害する化合物の同定方法であつて、 MAST205および/または MKK7と被検化合物とを接触させ、 MAST205と M KK7の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と MKK7の結合を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0062] さらに本発明は、 MAST205と p38 MAPKの結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは p38 MAPKと被検化合物とを接触させ、 M AST205と p38 MAPKの結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と p38 MAPKの結合を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0063] さらにまた本発明は、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であつて、 MAST205と被検化合物とを接触させ、 MAST205のリン酸ィ匕活性を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が M AST205のリン酸ィ匕活性を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する

[0064] また本発明は、 MAST205による DCTN1のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは DCTN1と被検化合物とを接触させ、 MAS T205による DCTNlのリン酸ィ匕を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205による DCTN1のリン酸ィ匕を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0065] さらに本発明は、 MAST205による TIAM1のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは TIAM1と被検化合物とを接触させ、 MAS T205による TIAMlのリン酸ィ匕を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205による TIAM1のリン酸ィ匕を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する。

[0066] さらにまた本発明は、下記 A群から選択される 1つ以上の成分と、下記 B群力選択される 1つ以上の成分とを有してなる試薬キットに関する：

ここで、 A群は、

(a) MAST205、

(b) MAST205をコードするポリヌクレオチド、

(c)上記 (b)のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および

(d)上記 (c)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなり、

B群は、

(e) DCTN 1および TIAM 1から選ばれるいずれ力 1の蛋白質、

(f)上記 (e)の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、

(g)上記 (f)のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および

(h)上記 (g)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなる。

[0067] また本発明は、下記 A群から選択される 1つ以上の成分と、下記 B群から選択される 1つ以上の成分とを有してなる試薬キットに関する：

ここで、 A群は、

(a) MAST205、

(b) MAST205をコードするポリヌクレオチド、

(d)上記 (c)の組み換えベクターを含有する形質転換体、からなり、

B群は、

(i) MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6および p38 MAPKから選ばれるいずれか 1 の蛋白質、

(j)上記 (i)の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、

(k)上記 (j)のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および

(1)上記 (k)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなる。

[0068] さらに本発明は、下記 A群から選択される 1つ以上の成分と、下記 B群から選択される 1つ以上の成分とを有してなる試薬キットに関する：

ここで、 A群は、

(a) MAST205、

(b) MAST205をコードするポリヌクレオチド、

(d)上記 (c)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなり、

B群は、

(m) MLK3、 MKK4、 MKK7および JNKから選ばれるいずれか 1の蛋白質、

(n)上記 (m)の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、

(o)上記 (n)のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および

(p)上記 (o)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなる。

発明の効果

[0069] 本発明により、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。具体的には本発明により、 MAST205の発現、 MAST205と DCTN1の結合、 MAST205と TIAM1の結合、 MAST205と MLK 3の結合、 MAST205と MKK3の結合、 MAST205と MKK4の結合、 MAST205 と MKK6の結合、 MAST205と MKK7の結合、 MAST205と p38 MAPKの結合、および MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性から選ばれる少なくとも 1を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。

[0070] MAST205は、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、および p 38 MAPK等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、 p38 MAPKのリン酸化を促進し、その結果、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に促進的に関与していると発明者らは考えている。また MAS T205は、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK4、および MKK7等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、 JNKのリン酸化にも関与し、その結果、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与すると発明者らは考えている。

[0071] 実際に、 MAST205の発現を阻害することにより、細胞の遊走および浸潤が顕著に抑制されることを本発明において見出した。したがって、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することにより、癌の転移や免疫炎症応答を抑制できると発明者らは考えている。

[0072] このように本発明により、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する癌の転移抑制方法および転移抑制剤を提供できる。

[0073] MAST205力 38 MAPKのリン酸化の促進に関与することを本発明において見出し、また、 p38 MAPKが血管新生に関与することが知られていることから、本発明により MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する血管新生抑制方法および血管新生抑制剤を提供できる。

[0074] さらに本発明により、前記阻害方法、前記阻害剤、前記抑制方法および前記抑制剤に用いる化合物の同定方法を提供できる。具体的には例えば、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法を提供できる。また、 MAST205の発現、 M AST205と DCTN1の結合、 MAST205と TIAM1の結合、 MAST205と MLK3の結合、 MAST205と MKK3の結合、 MAST205と MKK4の結合、 MAST205と M KK6の結合、 MAST205と MKK7の結合、 MAST205と p38 MAPKの結合、 M AST205による DCTN1のリン酸化、および MAST205による TIAM1のリン酸化から選ばれる少なくとも 1を阻害する化合物の同定方法を提供できる。 [0075] また本発明により、（A) MAST205、 MAST205をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれるいずれか 1つの成分と、（B) DCTN1、 TIAM1 、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p38 MAPK,および JNKから選ばれるいずれか 1つの蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体力なる群力選ばれるいずれか 1つの成分とを有してなる試薬キットを提供できる。図面の簡単な説明

[0076] [図 1]MAST205と DCTN1との細胞内での結合を、 Myc— MAST205および FLA G— DCTN1を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左パネルは、細胞溶解液（図中、 lysateと示す)を用いたゥエスタンブロッテイングの結果を示す。中パネルは抗 c Myc抗体による免疫沈降サンプル（図中、 IP : Mycと示す）について、抗 FLAG抗体および抗 c Myc抗体を用いてィムノブロットを行った結果を示す。右パネルは、抗 FLAG抗体による免疫沈降サンプル（図中、 IP :FLAGと示す）について、抗 FLAG抗体および抗 c Myc抗体を用いてィムノブロットを行った結果を示す。各パネルともレーン 1は Myc— MAST2 05および FLAG - DCTN 1を共発現させた細胞、レーン 2は Mycと FLAG - DCT N1を共発現させた細胞、レーン 3は Myc— MAST205と FLAGを共発現させた細胞、レーン 4は Mycと FLAGを共発現させた細胞を用いた結果を示す。 Myc— MA ST205と 1^^ 001?^1を共発現させた細胞（レーン1)から、マウス抗 c— Myc モノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルおよびマウス抗 FLAGモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプルにおいてのみ、 Myc— MAST205と FL AG— DCTN1の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例 1)

[図 2]MAST205と TIAM1との細胞内での結合を、 Myc— MAST205ぉょびFLA G—TIAM1を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左パネルは、細胞溶解液（図中、 Cell lysateと示す)を用いたウェスタンブロッテイングの結果を示す。中パネルは抗 c Myc抗体による免疫沈降サンプル（図中、 IP : Mycと示す）について、抗 FLAG抗体および抗 c Myc抗体を用いてィムノブロットを行った結果を示す。右パネルは、抗 FLAG抗体による免疫沈降サンプル（図中、 IP :FLAGと示す）について、抗 FLAG抗体および抗 c Myc 抗体を用いてィムノブロットを行った結果を示す。各パネルともレーン 1は Myc— MA ST205および FLAG—TIAM1を共発現させた細胞、レーン 2は Mycと FLAG—TI AMIを共発現させた細胞、レーン 3は Myc— MAST205と FLAGを共発現させた細胞、レーン 4は Mycと FLAGを共発現させた細胞を用いた結果を示す。 Myc— M AST205と FLAG— TIAM1を共発現させた細胞（レーン 1)から、マウス抗 c— Myc モノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルおよびマウス抗 FLAGモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプルにおいてのみ、 Myc— MAST205と FL AG— TIAM1の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例 1)

[図 3]MAST205による DCTN1のリン酸ィ匕を各蛋白質を用いて解析した結果を示す図である。レーン 1は Myc— MAST205と FLAG— DCTN1、レーン 2は Mycと F LAG— DCTN1、レーン 3は Myc— MAST205と FLAG、レーン 4は Mycと FLAG を反応させた結果を示す。 Myc - MASTと FLAG - DCTN1を反応させたときのみ、 DCTN1のリン酸ィ匕を示すバンドが検出された（レーン 1)。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例 2)

[図 4]ソルビトール（Sorbitol)刺激により活性ィ匕される MAPKKおよびその下流に位置する蛋白質のリン酸化を、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞と、コントロール siRNA (Control siRNA)をトランスフエクシヨンした細胞を用いて比較検討した結果を示す図である。右パネルは、各リン酸化蛋白質を検出した結果を示す。左パネルは、各蛋白質をウェスタンブロッテイングにより検出した結果を示す。コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、ソルビトール刺激をしな!、ときには、 p38 MAPK, MKK3、 MKK6、および JNKのリン酸化は検出されず、ソルビトール刺激により、これら蛋白質のリン酸化が検出された。一方、 MAST205 siRN Aをトランスフエクシヨンした細胞では、ソルビトール刺激によっても、 p38 MAPK, MKK3、 MKK6および JNKのリン酸化は検出されないか、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞と比較してその程度が低力つた。 ERK1Z2のリン酸ィ匕は、ソルビトール刺激の有無に関わらず、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞および MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞の!/ヽずれにおヽても検出された。（実施例 3)

[図 5]細胞の遊走への MAST205の影響を、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞と、コントロール siRNA (Control siRN A)をトランスフエクシヨンした細胞を用いて比較検討した結果を示す図である。細胞の遊走は、フルォロブロックセルカルチャーインサートを用いて実施した。遊走した細胞は蛍光染色し、蛍光強度（ Fluorescence (Ex485ZEm530) )により細胞の遊走を判定した。蛍光強度の低下は、細胞の遊走の低減を反映する。 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。（実施例 4)

[図 6- A]細胞の浸潤への MAST205の影響を、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞と、コントロール siRNA (Control siRNA)をトランスフエクシヨンした細胞を用いて比較検討した結果を示す図である。細胞の浸潤は、マトリゲルを被覆したフルォロブロックセルカルチャーインサートを用いて実施した。マトリゲルに浸潤した細胞は蛍光染色し、蛍光強度（Fluorescence (Ex485ZEm530) )により細胞の浸潤を判定した。蛍光強度の低下は、細胞の浸潤の低減を反映する。 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロール siRN Aをトランスフエクシヨンした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。（実施例 5)

[図 6-B]細胞の浸潤の検討に用いた、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞とコントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞における MAST205の発現量をウェスタンブロッテイングにより測定した結果を示す図である。 MAST205 siR NAをトランスフエクシヨンした細胞（レーン 2)では、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞（レーン 1)と比較して、 MAST205の発現が著しく低減していた。一方、 β チューブリン（j8—tubulin)の発現量はいずれの細胞でも同程度であった。図中の矢印は各蛋白質を示す。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例 5)

[図 7]MAST205と p38 MAPK、 MLK3または MKK6との細胞内での結合を、 M yc MAST205と H A— p 38、 HA— MLK3または H A— MKK6とを一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左上パネルおよび左下パネルは、細胞溶解液（図中、 lysateと示す）について、それぞれマウス抗 HAモノクローナル抗体およびマウス抗 c Mycモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行った結果を示す。右上パネルおよび左下パネルは、ゥサギ抗 c— Mycポリクローナル抗体による免疫沈降サンプル（図中、 IP： Mycと示す）について、それぞれマウス抗 HAモノクローナル抗体およびマウス抗 c Mycモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行った結果を示す。各パネルともレーン 1は Mycと HAを共発現させた細胞、レーン 2は Myc— MAST205と HAを共発現させた細胞、レーン 3は Mycと HA—p38を共発現させた細胞、レーン 4は Myc— M AST205と HA—p38を共発現させた細胞、レーン 5は Mycと HA—MLK3を共発現させた細胞、レーン 6は Myc— MAST205と HA— MLK3を共発現させた細胞、レーン 7は Mycと HA—MKK6を共発現させた細胞、およびレーン 8は Myc— MAS T205と HA— MKK6を共発現させた細胞を用いた結果を示す。 Myc— MAST20 5と HA— p38、HA— MLK3または H A - MKK6とを共発現させた細胞（レーン 4、 6および 8)から、ゥサギ抗 c— Mycポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルにおいてのみ、 Myc— MAST205と HA— p38、 HA— MLK3または HA— MKK6との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例 6)

[図 8]MAST205と MKK3の細胞内での結合を、 Myc— MAST205とHA—MKK 3を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左上パネルおよび左下パネルは、細胞溶解液（図中、 lysateと示す）について、それぞれマウス抗 HAモノクローナル抗体およびマウス抗 c Mycモノクロ一ナル抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行った結果を示す。右上パネルおよび右下パネルは、ゥサギ抗 c— Mycポリクローナル抗体による免疫沈降サンプル（図中、 IP : Mycと示す）について、それぞれマウス抗 HAモノクローナル抗体およびマウス抗 c— Mycモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行った結果を示す。各パネルともレーン 1は Mycと HAを共発現させた細胞、レーン 2は Myc— MAST 205と HAを共発現させた細胞、レーン 3は Mycと HA—MKK3を共発現させた細胞、およびレーン 4は Myc— MAST205と HA—MKK3を共発現させた細胞を用いた結果を示す。 Myc MAST205と HA— MKK3を共発現させた細胞（レーン 4)から、ゥサギ抗 c— Mycポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルにおいてのみ、 Myc— MAST205とHA—MKK3の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例 6)

[図 9]MAST205と MKK4の細胞内での結合を、 Myc— MAST205とHA—MKK 4を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左上パネルおよび左下パネルは、細胞溶解液（図中、 lysateと示す）について、それぞれマウス抗 HAモノクローナル抗体およびマウス抗 c Mycモノクロ一ナル抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行った結果を示す。右上パネルおよび右下パネルは、ゥサギ抗 c— Mycポリクローナル抗体による免疫沈降サンプル（図中、 IP : Mycと示す）について、それぞれマウス抗 HAモノクローナル抗体およびマウス抗 c— Mycモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行った結果を示す。各パネルともレーン 1は Mycと HAを共発現させた細胞、レーン 2は Mycと HA—M KK4を共発現させた細胞、およびレーン 3は Myc— MAST205と HA— MKK4を共発現させた細胞を用いた結果を示す。 Myc— MAST205と HA— MKK4を共発現させた細胞（レーン 3)から、ゥサギ抗 c - Mycポリクローナル抗体を用、て調製した免疫沈降サンプルにおいてのみ、 Myc— MAST205とHA— MKK4の共沈（図中、矢印で示す)が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例 6 )

[図 10]MAST2O5と MKK7の細胞内での結合を、 Myc— MAST205とHA—MK K7を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左上パネルおよび左下パネルは、細胞溶解液（図中、 lysateと示す）について、それぞれマウス抗 HAモノクローナル抗体およびマウス抗 c Mycモノクロ一ナル抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行った結果を示す。右上パネルおよび右下パネルは、ゥサギ抗 c— Mycポリクローナル抗体による免疫沈降サンプル（図中、 IP : Mycと示す）について、それぞれマウス抗 HAモノクローナル抗体およびマウス抗 c— Mycモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行った結果を示す。各パネルともレーン 1は Mycと HAを共発現させた細胞、レーン 2は Myc— MAST 205と HAを共発現させた細胞、レーン 3は Mycと HA— MKK7を共発現させた細胞、およびレーン 4は Myc— MAST205と HA—MKK7を共発現させた細胞を用いた結果を示す。 Myc MAST205と HA— MKK7を共発現させた細胞（レーン 4)から、ゥサギ抗 c— Mycポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルにおいてのみ、 Myc— MAST205とHA—MKK7の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例 6)

[図 11]ソルビトール（図中、 Sorbと示す)刺激または IL 1 (図中、 IL1と示す)刺激により活性化される MKK4のリン酸化を、 MAST205 siRN Aをトランスフエクシヨンした細胞と、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞を用いて比較検討した結果を示す図である。左パネルは、 MAST205を検出した結果を示す。左から 2番目のパネルは、リン酸ィ匕 MKK4 (図中、 P— MKK4と示す）を検出した結果を示す。左から 3番目のパネルは、 MKK4を検出した結果を示す。右パネルは β チューブリン（ι8— tublin)を検出した結果を示す。各蛋白質の検出は、各蛋白質に対する抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより行った。図中の矢印は、各蛋白質を示す。図中の矢頭と数値は分子量を示す。コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、ソルビトール刺激または IL—1刺激をしないときには、 MKK4のリン酸ィ匕は検出されず、ソルビトール刺激または IL—1刺激により、 MKK4のリン酸ィ匕が検出された。一方、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、ソルビトール刺激または IL—1刺激によっても、 MKK4のリン酸ィ匕は検出されな力つた。（実施例 7)

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。

本明細書にぉヽては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」 t 、う用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している 2個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、 1文字または 3文字にて表記することがある。

[0078] (細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤、癌の転移抑制方法および転移抑制剤、並びに血管新生の抑制方法および抑制剤）

本発明の一態様は、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤に関する。

[0079] 本発明の一態様はまた、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする癌の転移抑制方法および転移抑制剤に関する。

[0080] 本発明の一態様はまた、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制方法および抑制剤に関する。

[0081] 「MAST205」は、セリンスレオニンキナーゼであり、ほとんどすべての正常糸且織において普遍的に発現が認められている（非特許文献 2)。一方、精子に、それも発達分ィ匕中の精子にぉ、て最も発現が高、と、う報告 (非特許文献 3)や、心臓にぉ、て高、発現が認められると、う報告 (非特許文献 2)がある。

[0082] MAST205として、配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質を好ましく例示できる。配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質は、本発明において汎用の遺伝子工学的手法により取得した遺伝子によりコードされる 1797アミノ酸残基力もなる蛋白質であり、キナーゼドメインおよび PDZドメインを保持する。本蛋白質は、 NCBIデータベースにァクセッションナンバー AAH65499 ( 1797アミノ酸残基）として開示されている MAST205のアミノ酸配列と比較して、第 3 88番目のアミノ酸残基がグルタミン酸残基に置換して！/、ることを除！、て同一のァミノ酸配列を有する。本蛋白質が、公知 MAST205と著しく高い相同性を有し、公知 M AST205が有するキナーゼドメインおよび PDZドメインと同一のアミノ酸配列からなるキナーゼドメインおよび PDZドメインを保持することから、本蛋白質は、 MAST205であると考えることができる。後述するように、配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質が、 DCTN1をリン酸ィ匕したこと (実施例 2参照)から、機能の観点からも、本蛋白質はセリンスレオニンキナーゼである MAST205であると考えることができる。

[0083] MAST205は、配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質に制限されず、該蛋白質と配列相同性を有し、かつ該蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質も包含される。また、 MAST205をコードする遺伝子は、配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチドに制限されず、該ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつ該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の構造的特徴や生物学的機能を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにお、て、ずれのポリヌクレオチドも包含される。

[0084] 配列相同性は、通常、アミノ酸配列または塩基配列の全体で 50%以上、好ましくは少なくとも 70%であることが適当である。より好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 8 0%以上、さらにより好ましくは 90%以上、またさらにより好ましくは 95%以上であることが適当である。

[0085] 配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有する蛋白質には、該アミノ酸配列において、 1個以上、例えば 1〜： LOO個、好ましくは 1〜30個、より好ましくは 1〜20個、さらに好ましくは 1〜： LO個、特に好ましくは 1〜数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異が存するアミノ酸配列で表される蛋白質が含まれる。また、配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチドと配列相同性を有するポリヌクレオチドには、該ポリヌクレオチドの塩基配列において、 1個以上、例えば 1〜300個、好ましくは 1〜90個、より好ましくは 1 〜60個、さらに好ましくは 1〜30個、特に好ましくは 1〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入と、つた変異が存する塩基配列で表されるポリヌクレオチドが含まれる。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質あるいは該変異を有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が、配列番号 1に記載のァミノ酸配列で表される蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。変異を有する蛋白質およびポリヌクレオチドは天然に存在するものであってよぐまた人工的に変異を導入したものであってもよい。 [0086] 配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の構造的特徴は、酵素活性に関与するキナーゼドメイン、および同種または別種の蛋白質との結合に関与する PD Zドメインを例示できる。配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質は、そのアミノ酸配列の第 512番目から 785番目のアミノ酸領域にキナーゼドメインを、第 110 5番目から 1186番目のアミノ酸領域に PDZドメインを保持する。配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同様の構造的特徴とは、該蛋白質に存在する上記ドメインと配列相同性を有しかつ同様の機能を有するドメインを意味する。ドメインの配列相同性は、好ましくは少なくとも 70%、より好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらにより好ましくは 90%以上、またさらにより好ましくは 95%以上であることが適当である。

[0087] 配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の生物学的機能として、セリンスレオニンキナーゼ活性を例示できる。「セリンスレオニンキナーゼ活性」とは、本蛋白質が、基質となる他の蛋白質 (以下、基質蛋白質と称することがある）と結合し、該基質蛋白質のあるセリン残基および Zまたはスレオニン残基のヒドロキシル基にアデノシン三リン酸 (ATP)の γ —リン酸基を転移させる反応を触媒することにより、該基質蛋白質をリン酸化する機能を意味する。「基質」とは、酵素によって触媒作用を受ける化合物または分子を意味する。本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性によりリン酸化される基質蛋白質として、 DCTN1、 TIAM1、および PTENを好ましく例示できる。本蛋白質の基質蛋白質は、これら例示した蛋白質に限定されず、本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性によりリン酸ィ匕される蛋白質である限りにお、て、ずれの蛋白質でもあり得る。

[0088] 本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性の測定は、基質蛋白質のリン酸化を指標にして実施できる。本蛋白質による基質蛋白質のリン酸ィ匕は、自体公知の蛋白質リン酸化測定方法を用いて、本蛋白質と基質蛋白質とを共存させてリン酸化反応を行つた後にリン酸ィ匕基質蛋白質を測定することにより実施できる。このような方法として、本蛋白質と基質蛋白質とを調製して両蛋白質を共存させる方法、および本蛋白質と基質蛋白質とを細胞で発現させて両蛋白質を細胞内で共存させる方法のいずれも利用できる。リン酸化された基質蛋白質の検出は、例えば、リン酸化基質蛋白質に対する抗体を用いてウェスタンブロッテイングにより実施できる。また、リン酸化された基質蛋白質の検出は、リン酸ィ匕反応に放射性同位体標識した ATP、例えば [ γ — ³²P] ATPを用いて、リン酸ィ匕反応により基質蛋白質に転移された [ γ—³²P]の放射活性を測定することにより実施できる。具体的には、本実施例 2を参照して本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性の測定を実施できる。

[0089] 配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の生物学的機能としてまた、他の蛋白質との結合を例示できる。本蛋白質と結合する蛋白質として、 DCTN1、 TIA Ml、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p38 MAPK、 PTEN、 TRAF 2、TRAF6、 j8 2—シントロフィン、プロトカドヘリン LKC、および腎臓の Ila型ナトリゥム Zリンコトランスポーターを例示できる。本蛋白質と結合する蛋白質は、これら例示した蛋白質に限定されず、本蛋白質と結合する蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質でもあり得る。「本蛋白質と他の蛋白質の結合」とは、本蛋白質と他の蛋白質とが、複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味する。ここでの結合とは、本蛋白質と他の蛋白質がその一部分において結合すれば足りる。例えば、本蛋白質または他の蛋白質を構成するアミノ酸の中に、両蛋白質の結合に関与しな、アミノ酸が含まれてヽてもよい。また、本蛋白質と他の蛋白質により形成される複合体には、これら蛋白質とは別種の蛋白質が含まれて、てもよ、。本蛋白質と他の蛋白質との結合の測定は、ウェスタンブロッテイング、免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより実施できる。

[0090] 配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有する蛋白質として、 NCBIデータベースにァクセッションナンバー AAH65499、 CAH73244, B AB40778、および BAA34527として開示されている各蛋白質を例示できる。これら蛋白質は配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と比較して、 PDZドメインのアミノ酸配列が同一であること、さらに、キナーゼドメインのアミノ酸配列が同一または 1塩基置換の他は同一であることから、いずれも本蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有すると考えることができる。 [0091] 「MAST205の発現」とは、 MAST205をコードする DNAの遺伝子情報が mRNA に転写されること、または、 mRNAに転写され、かつ蛋白質（MAST205)のアミノ酸配列として翻訳されることを、う。

[0092] 「MAST205の発現を阻害する」とは、 MAST205をコードする DNAの遺伝子情報が mRNAに転写される過程、または、 mRNAに転写され、かつ蛋白質（MAST2 05)のアミノ酸配列として翻訳される過程で生じる様々な反応の少なくとも 1つを妨げることにより、 MAST205遺伝子の転写'翻訳による MAST205の生成を妨げることを意味する。

[0093] MAST205の発現の阻害は、 MAST205の発現を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、好ましくは MAST205の発現を特異的に阻害する化合物、より好ましくは MAST205の発現を特異的に阻害する低分子量ィ匕合物を挙げることができる。 MAST205の発現を特異的に阻害するとは、当該発現を強く阻害するが、他の蛋白質の発現は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。低分子量化合物とは、ペプチド、ペプチド様物質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機化合物、および無機化合物が含まれ、その分子量が好ましくは 10000以下、より好ましくは 5 000以下、さらに好ましくは 1000以下、さらにより好ましくは 500以下の化合物を意味する。 MAST205の発現を阻害する化合物は、後述する化合物の同定方法を用いて取得できる。

[0094] MAST205の発現を阻害する化合物として、 MAST205の発現を RNA干渉の手法により低下または消失させ得る siRNA (small interfering RNA)を例示できる（エルバシ（Elbashir S. M. )ら、「ネイチヤー（Nature)」、 2001年、第 411卷、 p. 4 94— 498 ;およびパディソン（Paddison P. J. )ら、「ジーンズアンドディべロプメント（Genes and Development)」、 2002年、第 16卷、 p. 948— 958)。

[0095] MAST205に対する siRNAは、 MAST205 mRNAの部分配列からなる RNA ( センス RNA)と該 RNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなる RNA (アンチセンス RNA)とを、 MAST205 mRNAの配列に基づいて設計し、自体公知の化学合成法により合成し、得られた両 RNAをノヽイブリダィゼーシヨンさせることにより製造できる。 siRNAを構成するセンス RNAおよびアンチセンス RNAは、それぞれ数個ないし 1 0数個程度のヌクレオチドからなることが好ましい。また、それぞれ、その 3'末端に、オーバーハング配列と呼ばれる 1個ないし数個の塩基配列力なるヌクレオチドを結合させることが好ましい。オーバーハング配列は、 RNAをヌクレアーゼ力保護する作用を有する。オーバーハング配列は、該 RN Aの RN A干渉効果を阻害しない限りにおいて特に制限されず、好ましくは 1個ないし 10個、より好ましくは 1個ないし 4個、さらに好ましくは 2個のヌクレオチドからなるものをいずれも用いることができる。具体的には、デォキシチミジル酸力なる配列（例えば TT)、ゥリジル酸力なる配列（例えば UU)、デォキシチミジル酸に続いて任意のヌクレオチドが結合した配列（例えば TN)といった配列を例示できる。合成を安価に行えることおよびヌクレアーゼ耐性がより強いことから、より好ましくは、 2つのデォキシチミジル酸力なる配列をオーバーハング配列として用いる。オーバーハング配列は、センス RNAおよびアンチセンス R NAのそれぞれの^末端のリボース^水酸基部位にジエステル結合により結合させる。

MAST205に対する siRNAとして、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを例示できる。配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして、例えば、該塩基配列力なるオリゴヌクレオチドの^末端に、オーバーハング配列と呼ばれる 1個ないし数個の塩基配列力なるヌクレオチドが結合されたオリゴヌクレオチドを挙げられる。配列表の配列番号 2に記載の塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして、例えば、該相補的塩基配列の^末端に、オーバーハング配列と呼ばれる 1個ないし数個の塩基配列からなるヌクレオチドが結合されたオリゴヌクレオチドを挙げられる。配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むォリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドとして、具体的には、配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが例示できる。配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2 に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (TT)力もなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (ΤΤ)力なるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。 MAST205に対する siRNAは上記例示したものに制限されず、 MAST2 05の発現を RNA干渉の手法により低下または消失させ得るものであればいずれを用いることもできる。例えば、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いることができる。このような短鎖二重鎖オリゴヌタレォチドはオーバーハング配列を有さない。し力し、オーバーハング配列は、 RNAをヌクレアーゼから保護する目的で RNAに結合させる配列であり、短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドの RNA干渉作用を高める効果を有する力該 RNA干渉作用には直接的に影響するものではない。したがって、オーバーハング配列を有さないこのような短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドであっても、 MAST205に対する siRNAとして有用である蛋白質の発現を RNA干渉の手法により低下または消失させ得る siRNAとしてまた、shRNA (short hairpin RNA)を例示できる。 shRNAは、ヘアピン構造を有する短鎖二重鎖 RNAであり、 siRNAと同様、 RNA干渉により遺伝子の発現を抑制する（パディソン（Paddison P. J. )ら、「ジーンズアンドディべ口プメント（Genes a nd Development)」、 2002年、第 16卷、 p. 948— 958)。 shRNAは、センス RN Aとアンチセンス RNAとが例えばオリゴヌクレオチド等により連結され、センス RNA由来部分とアンチセンス RNA由来部分が二重鎖を形成するため、ヘアピン様構造を呈する。 shRNAは、センス RNAとアンチセンス RNAに加え、これら 2つの RNAを連結しかつループ構造を形成するようなオリゴヌクレオチドを含む RNAを、 MAST205 mRNAの塩基配列に基づいて設計して、自体公知の方法により製造できる。好ましくは、センス RNAの^末端とループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの^末端とが結合し、さらにループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの ^末端とアンチセンス R NAの^末端とが結合したオリゴヌクレオチドであることが望ま、。ループ構造を形成するオリゴヌクレオチドとは、センス RNAとアンチセンス RNAの間に存在して両 R NAを連結でき、それ自体がループ構造を形成するものを意味する。このようなオリゴヌクレオチドの設計は、文献 (パディソン (Paddison P. J. )ら、「ジーンズアンドディべロプメント（Genes and Development)」、 2002年、第 16卷、 p. 948— 95 8)の記載を参考にして実施できる。好ましくは 4個ないし 23個、より好ましくは 4個な V、し 8個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが適当である。ループ構造を形成するオリゴヌクレオチドとして、 TTCAAGAGA (Ambion社製または Oligoengine社製）、 AACGTT、 TTAA、 CAAGCTTC等の配列を例示できる。ヘアピン構造を有する二重鎖の形成は、センス RNA由来部分とアンチセンス RNA由来部分とを慣用の方法でアニーリングすることにより実施できる。

[0098] また、 MAST205の発現を阻害する化合物として、 MAST205遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドを例示できる。

[0099] MAST205の発現を阻害する機能を有する siRNA、 shRNA、およびアンチセンスポリヌクレオチドの選択は、適当な細胞に MAST205遺伝子と siRNA、 shRNA、およびアンチセンスポリヌクレオチドのいずれ力 1つとをコトランスフエクシヨン（共遺伝子導入）し、 MAST205の発現をウェスタンブロッテイング等の自体公知の方法により検出し、 MAST205の発現が阻害される力否かを確認することにより実施できる。

[0100] 内在性の MAST205の発現の阻害は、 MAST205の発現を阻害する機能を有する siRNA、 shRNA、およびアンチセンスポリヌクレオチドを、適当な遺伝子工学的手法、例えばリポフエクシヨンにより細胞内に導入することにより達成できる。

[0101] ここでは、阻害効果を有する化合物 (例えば競合阻害効果を有する低分子化合物等)を阻害剤と称する。

[0102] 「MAST205の機能」とは、 MAST205力 S備えてヽる働きを意味する。 MAST205 の機能として、上述したように、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性、および MAST205と他の蛋白質との結合を例示できる。 MAST205が結合する蛋白質として、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p38 MAP K、 PTEN、 TRAF2、 TRAF6、 β 2—シントロフィン、プロトカドヘリン LKC、および腎臓の Ila型ナトリウム Zリンコトランスポーターを好ましく例示できる。 [0103] MAST205の機能としてより具体的には、 MAST205と DCTN1の結合、 MAST 205と TIAM1の結合、 MAST205と MLK3の結合、 MAST205と MKK3の結合、 MAST205と MKK4の結合、 MAST205と MKK6の結合、 MAST205と MKK7 の結合、 MAST205と p38 MAPKの結合、 MAST205の DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を例示できる。 MAST205の DC TNIおよび/または TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性とは、 MAST2 05が DCTN1および Zまたは TIAM1のセリン残基および Zまたはスレオニン残基をリン酸化する活性を意味する。

[0104] 「MAST205の機能を阻害する」とは、 MAST205が備えて、る働きを低減させるまたは消失させることを意味する。 MAST205の機能を阻害することとして、 MAST 205のセリンスレオニンキナーゼ活性、および MAST205と他の蛋白質との結合のうちの少なくとも 1を阻害することを例示できる。より具体的には、 MAST205の機能を阻害することとして、 MAST205と DCTN1の結合、 MAST205と TIAM1の結合、 MAST205と MLK3の結合、 MAST205と MKK3の結合、 MAST205と MKK4 の結合、 MAST205と MKK6の結合、 MAST205と MKK7の結合、 MAST205と p38 MAPKの結合、 MAST205の DCTN1および/または TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも 1を阻害することを例示できる。

[0105] MAST205の機能の阻害は、 MAST205の機能を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、好ましくは MAST205の機能を特異的に阻害する化合物、より好ましくは MAST205の機能を特異的に阻害する低分子量ィ匕合物を挙げることができる。 MAST205の機能を特異的に阻害するとは、当該機能を強く阻害するが、他の蛋白質の機能は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。 MAST2 05の機能を阻害する化合物は、後述する化合物の同定方法を用いて取得できる。

[0106] MAST205の機能の阻害は、具体的には、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性、および MAST205と他の蛋白質との結合のうちの少なくとも 1を阻害する化合物により実施できる。より具体的には、 MAST205の機能の阻害は、 MAST205と DCTN1の結合、 MAST205と TIAM1の結合、 MAST205と MLK3の結合、 MA ST205と MKK3の結合、 MAST205と MKK4の結合、 MAST205と MKK6の結合、 MAST205と MKK7の結合、 MAST205と p38 MAPKの結合、 MAST205 の DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも 1を阻害する化合物を用いて実施できる。

[0107] MAST205と他の蛋白質との結合を阻害する化合物のうち、 MAST205と基質蛋白質の結合を阻害する化合物は、該結合を阻害する結果、 MAST205の該基質蛋白質への作用を阻害するため、例えば、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性による該基質蛋白質のリン酸化を阻害する。具体的には、 MAST205と DCTN1 の結合を阻害する化合物は、 MAST205の DCTN1への作用を阻害するため、 MA ST205のセリンスレオニンキナーゼ活性による DCTN1のリン酸化を阻害する。また、 MAST205と TIAM1の結合を阻害する化合物は、 MAST205の TIAM1への作用を阻害するため、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性による TIAM1のリン酸化を阻害する。

[0108] MAST205と他の蛋白質との結合を阻害する化合物として、 MAST205の不活性変異体（以下、不活性型 MAST205と称することがある）を例示できる。「MAST205 の不活性変異体」とは、 MAST205の変異体であって、セリンスレオニンキナーゼ活性が MAST205と比較して減弱したまたは消失した MAST205変異体を意味する。好ましい不活性型 MAST205として、 MAST205にアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異が導入された MAST205変異体であって、 MAST205が結合する他の蛋白質との結合能を有する力セリンスレオニンキナーゼ活性を有さない MAS T205変異体を例示できる。このような不活性型 MAST205は、野生型の MAST20 5と拮抗して他の蛋白質と結合することにより、該蛋白質に対する MAST205の作用を阻害できる。不活性型 MAST205は、天然に存在するものであってもよぐ人工的に変異を導入したものであってもよヽ。不活性型 MAST205における変異部位として、 MAST205のアミノ酸配列において MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性に必要な部位、例えばキナーゼドメインを例示できる。不活性型 MAST205は、 MAST205のアミノ酸配列に基づ、て所望の蛋白質を設計して公知の方法で製造し、取得した蛋白質の中から MAST205と他の蛋白質との結合を阻害するものを、後述する化合物の同定方法に記載の方法を用いて選別することにより取得できる。 [0109] MAST205と他の蛋白質の結合を阻害する化合物としてまた、 MAST205と他の蛋白質とが結合する部位のアミノ酸配列力もなるポリペプチドを例示できる。このようなポリペプチドは、蛋白質間の結合を競合的に阻害できる。このようなポリペプチドは、 MAST205または MAST205と結合する蛋白質のアミノ酸配列力設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、 MAST205と該他の蛋白質の結合を阻害するものを選択することにより取得できる。このように特定されたポリペプチドに、 1〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、 MAST205と該他の蛋白質の結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよぐまた人工的に変異を導入したものであってもよい。これらポリペプチドは、後述する一般的な製造方法により取得できる。

[0110] MAST205と他の蛋白質の結合を阻害する化合物としてまた、 MAST205または MAST205と結合する蛋白質を認識する抗体であって、 MAST205と該他の蛋白質の結合を阻害する抗体およびそのフラグメントを例示できる。かかる抗体は、 MAS T205または MAST205と結合する蛋白質自体、またはこれらの断片、好ましくは M AST205と該他の蛋白質が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。

[0111] MAST205と他の蛋白質の結合を阻害する化合物としてさらにまた、 MAST205 または MAST205と結合する蛋白質を特異的に認識するァプタマ一であって、 MA ST205と該他の蛋白質の結合を阻害するァプタマ一を例示できる。ァプタマ一は、核酸ァプタマ一またはペプチドァプタマ一の、ずれであってもよ、。力かるァプタマ一は、公知の方法（例えば、ハーマン（Hermann T. )ら、「サイエンス（Science)」、 2000年、第 287卷、第 5454号、 p. 820— 825 ;ノーグスタラー（Burgstaller P. )ら、「カレントオピニオンインドラッグディスカバリーアンドディべ口プメント（ Current upinion in Drug Discovery and Development)」、 2002年、第 5卷、第 5号、 p. 690— 700 ;およびホップ—セイラー（Hoppe— Seyler F.；)ら、 20 02年、「カレントモレキュラーメデイシン（Current Molecular Medicine)」、 20 04年、第 4卷、第 5号、 p. 529- 538)に記載された方法)を用いて取得できる。 [0112] MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物は、 MAST205力、基質蛋白質と結合し、該基質蛋白質のあるセリン残基および Zまたはスレオニン残基のヒドロキシル基にアデノシン三リン酸 (ATP)の γ —リン酸基を転移させる反応を触媒することにより、該基質蛋白質をリン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか 1を阻害する化合物であり得る。例えば、 MAST205 の DCTN1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物は、 MAST20 5力 DCTN1と結合し、 DCTN1をリン酸ィ匕する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか 1を阻害する化合物であり得る。また、 MAST205の Τ IAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物は、 MAST205力 S 、 TIAM1と結合し、 TIAM1をリン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか 1を阻害する化合物であり得る。

[0113] MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物として、 MAST20 5に特異的に結合しそのセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する抗体またはそのフラグメントを例示できる。また、 MAST205に特異的に結合しそのセリンスレオ-ンキナーゼ活性を阻害する活性を有するアブタマ一を例示できる。抗体あるいはアブタマ一は上述の方法で取得でき、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性に対するこれらの阻害活性を後述する化合物の同定方法に記載の方法で測定することにより、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する活性を有する抗体あるヽはァプタマ一を取得できる。

[0114] 本発明においては、 MAST205として配列番号 1に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質を用い、該蛋白質が、 DCTN1および TIAM1それぞれと結合すること、さらに DCTN1をリン酸ィ匕することを見出した (実施例 1および 2参照)。また、該蛋白質に対する siRNAをトランスフエクシヨンした細胞で、 p38 MAPK、 MKK6/ MKK3、および JNKのリン酸ィ匕が阻害されることを見出した (実施例 3参照)。

[0115] さらに本発明において、 MAST205力 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MK K7、および p38 MAPKそれぞれと結合することを見出した (実施例 6参照)。また、 MAST205に対する siRNAをトランスフエクシヨンした細胞で、 MKK4のリン酸化が阻害されることを見出した (実施例 7参照)。 [0116] DCTN1は、 10〜： L I個のサブユニット（それぞれ 22〜150kDのサイズ）からなる巨大分子であるダイナクチンの最大サブユニットであり、 1278アミノ酸残基力もなる。本蛋白質は、ストレス刺激、例えばソルビトール刺激による p38 MAPKのリン酸化〖こ MKK3ある!/、は MKK6の活性化を介して関与して!/、る (チェゥン (Cheung P. )ら、「ザジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biologic al Chemistry)」、 2004年、第 279卷、第 44号、 p. 45308—45311)。

[0117] TIAM1は、 1591アミノ酸残基力もなる蛋白質であり、 PDZドメインを有し、グァ- ンニリン酸—グァニン三リン酸 (GDP— GTP)交換因子活性を示す。本蛋白質は、 T 細胞腫の浸潤、転移に関与することが知られている。その他、本蛋白質は神経細胞分ィ匕にも関与することが知られている。本蛋白質は急性骨髄性白血病を発症したダゥン症の子供の骨髄で過剰発現している。本蛋白質は MKK3を介して p38 MAP Kのリン酸化に関与している（バックスバウム（Buchsbaum R. J. )ら、「モレキュラーアンドセルラーノィォロジ一（Molecuar and Cellular Biology)」、 2002年、第 22卷、第 12号、 p. 4073—4085)。

[0118] DCTN1および TIAM1は、 p38 MAPKあるいはその上流の MKK6ZMKK3を介した情報伝達経路への関与が示唆されている。

[0119] p38 MAPKおよび JNKは、 MAPKファミリーに属するセリンスレオ-ンキナーゼである。

[0120] MAPKは細胞内情報伝達系にお、て重要な役割を果たすプロテインキナーゼの一つであり、関連する一連のプロテインキナーゼとともに連鎖的に活性ィヒすることによって、細胞膜表面のシグナルを核内に伝達する働きをしている。 MAPKが関与する細胞内情報伝達経路（以下、 MAPキナーゼ経路と称することがある）には、キナーゼカスケードが存在し、該キナーゼカスケードにおいて、 MAPKKKにより MAPKK 力 Sリン酸化されて活性化され、次、で MAPKKにより MAPKがリン酸化されて活性化する。 MAPキナーゼカスケードにおいて活性ィ匕された MAPKは数々の転写因子をリン酸化し、その結果、該転写因子により様々な遺伝子の転写が開始される。この MAPキナーゼカスケードは、細胞増殖刺激やストレス刺激等の様々な刺激によって発生する様々な細胞内シグナル伝達系で働ヽて、る。 [0121] MAP3K、 MAP2K、および MAPKには多くのファミリー蛋白質が知られている。例えば、 MAP3Kファミリー蛋白質として、 MLK、 MEKK (ΜΑΡΚ/ERK kinase kinase)、および ASK1 (Apoptosis signal― regulating kinase 1)等の蛋白質が知られている。また、 MAP2Kファミリー蛋白質として、 MKK3、 MKK4、 MKK 6、および MKK7等の蛋白質が知られている。 MAPKファミリー蛋白質として、 p38 MAPK ( α / β / y / δ ) , JNK (JNK1、 JNK2、および JNK3等）、および ERK (E xtracellular signal -regulated kinase : ERK2、 ERK3等）等が知られている。

[0122] MLK3は、 MAPキナーゼキナーゼキナーゼ 11とも呼称され、 MAP3Kファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼである。 MLK3は、 847アミノ酸残基からなる蛋白質であり、分子内に SH3ドメインやロイシンジッパーモチーフを有する。活性ループ内のセリン 'スレオニン残基、特にアミノ酸配列中第 277番目のスレオニン残基 (Thr 277)は自己リン酸ィ匕する。また、アミノ酸配列中第 555番目および第 556番目のセリン残基（Ser555および Ser556)のリン酸化は CDC42により誘導される。 MLK3は MAPK8ZJNK1を活性ィ匕し、 JNKシグナル伝達経路の促進的調節因子として機能することや、 MKK3を介して p38の活性ィ匕を促進することなどが知られている。また MLK3は、 I κ Bキナーゼ aと 13を直接リン酸化することができ、 Rhoファミリー GTP ァーゼや CDC42を介した NF— κ Bの活性への関与も示唆されている。

[0123] MKK3は、 MAP2Kファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、 347ァミノ酸残基からなる。 MKK3はサイト力インや環境ストレスにより活性ィ匕され、 p38 MAP Kのスレオニン残基ゃチロシン残基をリン酸化することが知られている。

[0124] ΜΚΚ4は、 SEK1とも称され、 ΜΑΡ2Κファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、 399アミノ酸残基力もなる。 ΜΚΚ4はサイト力インや環境ストレスにより活性ィ匕される。また、 MAPキナーゼ経路において JNK1/MAPK8、 JNK2/MAPK9 および p38 MAPKを活性化するが、 ERK2/MAPK1や ERK3/MAPK3は活性ィ匕しな、ことが知られて！/、る。

[0125] MKK6は、 MAP2Kファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、 334ァミノ酸残基からなる。 MKK6は、サイト力インや環境ストレスにより活性ィ匕され、 p38 MA PKのスレオニン残基ゃチロシン残基をリン酸化することが知られている。また、 ΜΚΚ 6は、ストレスにより誘発される細胞周期停止、転写の活性ィ匕およびアポトーシスに関与している。

[0126] MKK7は、 MAP2Kファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、 419ァミノ酸残基からなる。 MKK7はサイト力インや環境ストレスにより活性ィ匕され、 JNK1や JN K2を活性化することが知られている。また、 MKK7は、 MAP3K1/MEKK1, MA P3K2/MEKK2, MAP3K3/MEKK5等の MAP3Kや、 MAP4K2/GCKによりリン酸化され活性ィ匕する。

[0127] p38 MAPKは、 MAPKファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、 360 アミノ酸残基カゝらなる。 p38 MAPKは、細胞内でのシグナル伝達経路で重要な働きをしており、環境ストレス、炎症性サイト力インおよび LPSにより活性ィ匕され、インターロイキン 6 (IL— 6)等のサイト力イン産生や細胞増殖、分化、転写調節等に関与し、ストレス応答やアポトーシスといった様々な細胞の応答を制御している。 p38 MAPK は、 MAP3Kファミリーや MAP2Kファミリーに属するキナーゼを介したキナーゼカスケードによって活性化される。 p38 MAPKは、基質として ELK1や ATF2のような多くの転写因子をリン酸化して転写を促進する。また、 MAPキナーゼ経路において下流に位置する MAPKAPK2や MAPKAPK5のようなキナーゼのリン酸化を介してシクロォキシゲナーゼ 2 (COX- 2)やサイト力インの mRNAを安定化させてプロスタグランジン産生やサイト力インを介した炎症反応を誘導したり、サイクリン D1をリン酸化して分解を促進し、細胞周期を停止させる等、転写因子以外の経路を制御する例も報告されている。

[0128] p38 MAPKは、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に関与していることが知られている（ラフェリェール（Laferriere J. )ら、「アナルズォブザニューヨークアカデミーォブサイェンシズ (Annals of the New York Academy of Sciences)」、 2002年、第 973卷、 p. 562— 572 ;ドン（Dong C.；)ら、「ァ-ユアルレビューォブィムノロジー (Annual Review of Immunology)」、 2002年、第 20卷、 p. 55— 72)。また、 p38 MAPK力血管内皮増殖因子（以下、 VEGFと略称する）により誘導される内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生において重要な役割を果たしていることが報告されている（ルソー（Rousseau S. )ら、「トレンズィンカノレディオノくスキユラ一メデイシン (Trends in Cardiovascular Medicine) 」、 2000年、第 10卷、第 8号、 p. 321— 327)。

[0129] JNKは、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られており、

MKK7/MKK4によりリン酸ィ匕されることによりその機能が調節されている（ドン (Do ng C. )ら、「ァ -ュアルレビューォブィムノロジー（Annual Review of Im munology)」、 2002年、第 20卷、 p. 55— 72)。

[0130] MAST205が結合する蛋白質のうち DCTN1および TIAM1は、 MAST205の基質蛋白質であり、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性によりリン酸化される。 PTENについても、 MAST205によりリン酸化されると報告されている。 DCTN1および TIAM1は、 p38 MAPKあるいはその上流の MKK6/MKK3を介した情報伝達経路への関与が示唆されて、る。

[0131] これらから、 MAST205は、直接的および Zまたは間接的に DCTN1および Zまたは TIAM1と結合してリン酸化し、その結果、 p38 MAPKあるいはその上流の MK K6ZMKK3を介した情報伝達経路に促進的に作用すると考えることができる。

[0132] p38 MAPKが癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に関与していることから、 MAST205は DCTN1および/または TIAM1と結合することにより MKK6/M KK3を介して p38 MAPKをリン酸ィ匕し、その結果、癌の転移および免疫炎症応答に促進的に関与していると発明者らは考えている。また、 p38 MAPKが VEGFにより誘導される内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生に重要な役割を果たすことから

、 MAST205は DCTN 1および Zまたは TIAM 1と結合することにより MKK6ZMK K3を介した p38 MAPKをリン酸ィ匕し、その結果、内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生を促進すると考えることができる。

[0133] また MAST205は、 JNKのリン酸化にも関与し、その結果、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与すると発明者らは考えている。 MAST205が DCTN1および Zまたは TIAM1と結合したこと、 MAST205の発現阻害により JNKのリン酸化が阻害されたこと、並びに JNKの機能は MKK7ZMKK4によるリン酸ィ匕により調節されていること（ドン（Dong C. )ら、「ァ-ユアノレレビューォブィムノロジー（Annual Review of Immunology)」、 2002年、第 20卷、 p. 55— 72)力も、 MAST205 は、 DCTN1および Zまたは TIAM1との結合により MKK7ZMKK4を介して JNK のリン酸化に関与して、ると発明者らは考えて、る。

[0134] MAST205が結合する蛋白質のうち MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7 および p38 MAPKは MAPキナーゼカスケードを構成する蛋白質である。また、 M AST205の発現阻害により、ストレス刺激による MKK3、 MKK4、 MKK6、 p38MA PK、および JNKのリン酸ィ匕が阻害された (実施例 3および 7参照)。したがって、 MA ST205はこれら蛋白質と結合することにより、該蛋白質のリン酸ィ匕に関与し、ひいては該蛋白質が関与する情報伝達を促進すると考えることができる。

[0135] MAPキナーゼ経路の機構として、足場蛋白質（scaffold protein)による MAPK 、 MAP2K、 MAP3Kの集積が示唆されている（モリソン（Morrison D. K. )ら、「ァニュアルレビューォブセルアンドディべロプメンタルバイオロジー（Annual

Review of Cell and Developmental Biology)」、 2003年、第 19卷、 p. 91 — 118 ;ホイットマーシュ（Whitmarsh A. J. )ら、「トレンズインバイオケミカルサイェンシズ（Trends in Biochemical Sciences)」、 1998年、第 23卷、 p. 481 —485)。

[0136] 「足場蛋白質」とは、特定の同一の情報伝達経路に寄与する複数の特定分子を結合して会合させる機能を有する蛋白質を意味する。より詳しくは、足場蛋白質は情報伝達経路に寄与する複数の特定分子と結合することにより複合体を形成し、該分子間の選択的な反応を促進する機能を有する蛋白質を意味する。足場蛋白質との複合体形成により、情報伝達経路に寄与する特定の分子間の反応が促進されるため、該情報伝達経路が関与する特定の情報伝達が促進される。

[0137] MAPキナーゼ経路において、足場蛋白質に MAPK、 MAP2Kおよび MAP3Kが集積することにより、 MAP3Kによる MAP2Kのリン酸ィ匕および活性化、リン酸化 MA P2Kによる MAPKのリン酸ィ匕および活性ィ匕が促進され、その結果、 MAPキナーゼが関与する情報伝達が促進される。 MAPキナーゼ経路に関与する足場蛋白質として、いくつかの蛋白質が報告されている（モリソン（Morrison D. K. )ら、「ァ-ユアルレビューォブセルアンドディべロプメンタルバイオロジー（Annual Revi ew of Cell and Developmental Biology)」、 2003年、第 19卷、 p. 91— 11 8)。足場蛋白質の種類により結合する蛋白質が異なることから、足場蛋白質の種類と MAPK、 MAP2Kおよび MAP3Kそれぞれのファミリーに属する蛋白質の種類との間に、適切な組み合わせが存在すると考えられる。 MAPキナーゼ経路は、 MAP K、 ΜΑΡ2Κおよび ΜΑΡ3Κそれぞれのファミリーに属する蛋白質や足場蛋白質の多様性、およびそれらの組み合わせにより、細胞増殖刺激やストレス刺激等の様々な刺激によって発生する様々な細胞内シグナル伝達を担って、ると考えられる。

[0138] 一方、 ΜΚΚ3、 ΜΚΚ4および ΜΚΚ6により、 ρ38 ΜΑΡΚが活性化されること、および ΜΚΚ4および ΜΚΚ7により JNKが活性化することが報告されている（モリソン（ Morrison D. K. )ら、「ァ -ュアルレビューォブセルアンドディべロプメンタノレノヽィォロン一 (Annual Review of Cell and Developmental Biology 」、 2003年、第 19卷、 p. 91— 118)。

[0139] また、 MLK3が MKK4をリン酸化すること（デイビス (Davis R. J. )、「セル（Cell) 」、 2000年、第 103卷、 p. 239— 252 ;ティブルス（Tibbies L. A.；)ら、「ザェンボジャーナル (The EMBO Journal)」、 1996年、第 15卷、第 24卷 p. 7026— 70 35)、および MLK3が MKK7をリン酸化すること（メリット（Merritt S. E. )ら、「ザジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Ch emistry)」、 1999年、第 274卷、第 15号、 p. 10195— 10202)力 ^報告されて!ヽる。

[0140] さらに、 MLK3と MKK3の共発現が MKK3のリン酸化を誘導すること、および ML K3と MKK6が共沈降することが実証され、それにより、哺乳動物や酵母における M APキナーゼ経路の機構の一部として、 MLK3による MKK3ZMKK6の活性化とそれに続く p38 MAPKの活性化（MLK3→MKK3ZMKK6→p38 MAPK)という機構が提唱されている（ティブルス (Tibbies L. A. )ら、「ザェンボジャーナル (T he EMBO Journal)」、 1996年、第 15卷、第 24卷 p. 7026— 7035)。

[0141] 本発明における実証データおよび上記知見力も本発明者らは、 _P38 MAPKが関与する情報伝達経路には MLK3による MKK3ZMKK4ZMKK6の活性化とそれに続く p38 MAPKの活性化（MLK3→MKK3ZMKK4ZMKK6→p38 MAP K)という機構が存在し、 MAST205は本機構に足場蛋白質として作用していると考えている。すなわち、 MAST205は、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、および p3 8 MAPKと結合することにより複合体を形成して蛋白質間相互作用を促進し、その結果、 p38 MAPKが関与する情報伝達経路を促進すると考えることができる。

[0142] さらに本発明者らは、 JNKが関与する情報伝達経路には MLK3による MKK4Z MKK7の活性化とそれに続く JNKの活性化（MLK3→MKK4ZMKK7→JNK)という機構が存在し、 MAST205は本機構に足場蛋白質として作用していると考えている。すなわち、 MAST205は、 MLK3、 MKK4、 MKK7、および JNKと結合することにより複合体を形成して蛋白質間相互作用を促進し、その結果、 JNKが関与する情報伝達経路を促進すると考えることができる。

[0143] MAST205は MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、および p38 MAPKと結合して足場を提供することにより p38 MAPKが関与する情報伝達経路を促進し、その結果、 p38 MAPKが関与する細胞や生体の機能や応答、例えば癌の転移および免疫炎症応答、並びに VEGFにより誘導される内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生（フワン（Huang C. )ら、「ジャーナルォブセルサイエンス (Journal of C ell Science)」、 2004年、第 117卷、 p. 4619— 4628)に促進的に関与すると発明者らは考えている。

[0144] JNKは MKK7ZMKK4によりリン酸ィ匕されることによりその機能が調節されていることが知られており、さらに、 JNK活性ィ匕は、細胞や生体の機能や応答、例えば癌の転移、血管新生との関連が示唆されている。具体的には、 JNKの作用を阻害し得る化合物が、血管新生抑制を誘導することが報告されている。

[0145] このことから、 MAST205は MLK3、 MKK4、および MKK7と結合して足場を提供することにより、 MLK3による MKK4ZMKK7のリン酸ィ匕および活性ィ匕を促進し、さらに ίお NKが関与する情報伝達経路を促進し、その結果、 JNKが関与する細胞や生体の機能や応答、例えば癌の転移および免疫応答、内皮細胞の遊走や増殖、並びに血管新生に促進的に関与すると発明者らは考えている。

[0146] MAST205が、このように、細胞の遊走および浸潤、血管新生、癌の転移、細胞増殖や細胞死、並びに免疫炎症応答に関与すると考えられることから、 MAST205の発現および Ζまたは機能を阻害することにより、細胞の遊走および Ζまたは浸潤を阻害でき、その結果、癌の転移、細胞増殖や細胞死、血管新生および免疫炎症応答を抑制できると発明者らは考えている。例えば、 MAST205の発現、 MAST205と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合、および MAST205のセリンスレオ-ンキナーゼ活性のうちの少なくとも 1を阻害することにより、細胞の遊走および Zまたは浸潤を阻害でき、その結果、癌の転移、細胞増殖や細胞死、血管新生および免疫炎症応答を抑制できると考えることができる。より具体的には、 MAST205の発現、 MAST2 05と DCTN1の結合、 MAST205と TIAM1の結合、 MAST205と MLK3の結合、 MAST205と MKK3の結合、 MAST205と MKK4の結合、 MAST205と MKK6 の結合、 MAST205と MKK7の結合、 MAST205と p38 MAPKの結合、並びに MAST205の DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも 1を阻害することにより、細胞の遊走および Zまたは浸潤を阻害でき、その結果、癌の転移、細胞増殖や細胞死、血管新生および免疫炎症応答を抑制できると考えることができる。

[0147] 実際、本発明において、 MAST205の発現を阻害することにより、細胞の遊走および浸潤が顕著に抑制されることを見出した (実施例 4および 5参照)。

[0148] 「細胞の遊走」とは、細胞がその運動能により元の位置力別の位置へと動くことを意味する。一般的に細胞の遊走は、遊走因子に対し濃度依存的な方向性を示す。細胞の方向性を持った遊走は、炎症性細胞の炎症部位への移動、癌細胞の浸潤および転移、血管新生のみならず、個体発生や器官の形成にも必須で重要な生理現象である。

[0149] 「細胞の遊走阻害」とは、細胞の元の位置力別の位置への移動を低減すること、または移動させないことを意味する。具体的には、移動する細胞の数および Zまたは細胞の移動距離を低減させることを意味する。

[0150] 「細胞の浸潤」とは、細胞が細胞外マトリックス（以下、 ECMと略称することがある）を破壊し、 ECMが形成するノリア一を通過して、 ECM自体や周囲の組織に侵入することを意味する。例えば、癌細胞の浸潤とは、癌細胞が基底膜を破壊し、上皮下組織や周囲の他臓器に侵入することを意味する。「細胞外マトリックス (ECM)」とは、動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物である。 ECMは細胞により合成され、細胞外に分泌'蓄積された生体高分子の複雑な会合体であり、細胞膜成分は含まない。その主要な構成成分は、繊維状蛋白質 (コラーゲン、エラスチン、フイブリリン等）、ムコ多糖類 (プロテオダリカン、グリコサミノダリカン等）、および糖蛋白質 (フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等)である。 ECMは、細胞接着、細胞移動、細胞の分化'増殖、細胞骨格の配向、細胞形態形成、および細胞代謝等に重要な役割を果たしている。

[0151] 「癌の転移」とは、癌が原発巣から分離して、別の組織や臓器に移行し、そこで増殖することを意味する。

[0152] 「癌の転移抑制」とは、癌の原発巣からの分離、別の組織や臓器への移行、移行先における増殖を低減させることを意味する。

[0153] 「細胞増殖」とは、分裂により細胞の数が増すことを意味し、炎症性刺激に対する反応としての細胞増殖並びに腫瘍性増殖等を含む。

[0154] 「細胞死」とは、インビボ（in vivo)およびインビトロ（in vitro)における細胞の死を意味する。

[0155] 「血管新生」とは、新たな血管の形成を意味する。癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチのような疾患には過剰に血管が形成されるという特徴がある。癌においては、癌細胞が産生する血管新生誘導物質により活性化された血管内皮細胞が誘導物質に向かって遊走し、かつ組織内に浸潤して増殖し、新たな血管を形成する。新生血管は癌細胞の増殖を促進し、さらに新しい転移巣の形成に関与する。

[0156] 「血管新生の抑制」とは、新たな血管の形成を低減させることを意味する。

[0157] 「免疫炎症応答」とは、生体組織の傷害において、生体組織に対して何らかの有害な刺激を起こす物質 (起炎物質)が作用したときに生体が示す局所の反応を意味する。組織傷害の原因として、細菌感染、外傷、熱 '放射線'電気等の物理的刺激、および化学物質を例示できる。炎症部位では血管内皮細胞表面の接着分子の発現、血管内皮へのリンパ球 '好中球'単球の接着と血管外への遊走、血管透過性の亢進が認められる。炎症のメディエーターとして、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジン、ロイコトリェンや、各種サイト力イン等の生理活性物質が関与している。免疫炎症応答に関与するサイト力インとして、単球やマクロファージ等力産生されるインターロイキン 1 (以下、 IL 1と略称する）、細胞性免疫に関与するヘルパー T1細胞の分ィ匕ゃ活性ィ匕に関与する IL— 12·インターフェロン γ '腫瘍壊死因子 a (TNF— « )、また、液性免疫に関与するヘルパー Τ2細胞の分化や活性化に関与する IL -4-IL- 5 - IL 10を例示できる。

[0158] 細胞の遊走および浸潤の検出は、例えば、市販の細胞遊走測定システムまたは細胞浸潤測定システムを用いて実施できる。

[0159] 細胞遊走測定システムとして、具体的には、セルカルチャーインサートとコンパ-ォンプレートから構成される細胞遊走測定チャンバ一 (BD Falcon社製)を例示できる。セルカルチャーインサートは、細孔を有する PETメンブレン（polyethylene phth alate membrane)をその底に保持する。セルカルチャーインサートはコンパ-オンプレートの上部にセットして用いる。セルカルチャーインサートに添加された遊走性細胞は、 PETメンブレンに存在する細孔を通過してメンブレンの裏面（コンパニオンプレート側）に移動する。しかし、非遊走性細胞は、 PETメンブレンの表面（セルカルチヤ一インサート側）に残る。したがって、メンブレンの裏面に存在する細胞を測定することにより、細胞遊走を検出できる。移動した細胞および移動しない細胞の定量は、簡便には、それぞれの細胞を計数することにより実施できる。細胞の計数は、細胞を回収して、その数を実際に計数することにより実施できる。または、上記のようなシステムを用いたときには、移動しない細胞を除去した後に、メンブレンの裏面の細胞を適当な細胞染色剤で染色し、数箇所の領域の顕微鏡写真を撮影して細胞数を算定できる。また、予め細胞を蛍光標識して用い、移動した細胞のみを回収してその蛍光を測定することにより細胞の定量を実施できる。細胞染色剤として蛍光色素を用いる場合、また、予め細胞を蛍光標識して用いる場合は、セルカルチャーインサートとして、フノレォロブロックセノレ力ノレチヤ一インサート (Fluoroblock cell culture insert, B D Falcon社製)を用いることにより、より簡便にメンブレンの裏面に移動した細胞の定量を実施できる。

[0160] 細胞浸潤測定システムとして、具体的には、上記セルカルチャーインサートに ECM を塗布したものとコンパ-オンプレートから構成される細胞浸潤測定チャンバ一を例示できる。 ECMとして、マトリゲル（GROWTH FACTOR REDUCED BD M ATRIGEL MATRIX, BD Biosciences社製）を例示できる。また、細胞浸潤測定システムとして、 BD Falcon社製のバイオコート ^TMマトリゲル ^TM (BioCoat^TMmatri gel™) インべ一ジョンチャンバ一を例示できる。ノィォコート™マトリゲル™ インべ一ジョンチャンバ一は細胞の浸潤特性試験用インビトロシステムであり、再構成した E CMが予め塗布された細孔を有する PETメンブレンを保持するセルカルチャーインサートとコンパ-オンプレートから構成されて、る。 ECMが塗布されたセルカルチヤ一インサートはコンパ-オンプレートの上部にセットして用いる。該セルカルチャーィンサートに添加された浸潤性細胞は、 ECMが塗布された PETメンブレンに存在する細孔を通過してメンブレンの裏面（コンパ-オンプレート側）に移動する。しかし、非浸潤性細胞は ECMが形成するバリアーを通過できな、ため、メンブレンの表面（セルカルチャーインサート側）に残る。したがって、メンブレンの裏面に存在する細胞を測定することにより、細胞浸潤を検出できる。移動した細胞および移動しない細胞の定量は、上記した方法と同じ方法により実施できる。

[0161] 本発明に係る細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤により遊走が阻害される細胞として、 MAST205の発現が亢進しており、 MAST205による遊走や浸潤が認められる細胞を挙げることができる。具体的には、癌細胞や内皮細胞を例示できる。

[0162] MAST205の発現は、ほとんどすべての正常組織において普遍的に認められるという報告がある (非特許文献 2)。一方、精子に、それも発達分化中の精子において最も発現が高、と、う報告 (非特許文献 3)や、心臓にぉ、て高、発現が認められると、う報告 (非特許文献 2)がある。

[0163] MAST205の発現は、癌組織において正常組織と比較して亢進が認められる。例えば、月巿平滑筋肉腫 (lung leiomyosarcoma)や小細胞月巿癌 (lung small cell carcinomaノ、月 ¾髄腫、 medulloblastoma)、および'冃'肉 ft (osteosarcoma)等の癌組織において、 MAST205の発現亢進が認められる。これらの腫瘍はいずれも転移能が高、ことが知られて、る。これらの腫瘍では MAST205の発現が亢進しているため、腫瘍細胞の遊走や浸潤が促進され、その結果、転移能が高くなると考えられる。

[0164] 本発明に係る細胞の遊走阻害剤および血管新生抑制剤は、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する化合物を有効成分として含む。例えば、 MAST205の発現、 MAST205と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合、および MAST205 のセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも 1を阻害する化合物を有効成分として含む。より具体的には、 MAST205の発現、 MAST205と DCTN1の結合、 M AST205と TIAM1の結合、 MAST205と MLK3の結合、 MAST205と MKK3の結合、 MAST205と MKK4の結合、 MAST205と MKK6の結合、 MAST205と M KK7の結合、 MAST205と p38 MAPKの結合、並びに MAST205の DCTN1および Zまたは TIAM 1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも 1を阻害する化合物を有効成分として含む。

[0165] MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する化合物を有効成分として、具体的には、 MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを例示できる。 MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌタレォチドは、 MAST205の発現を阻害することにより、 MAST205の発現量を減少させるまたは消失させることができるため、 MAST205と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合を低減または消失させることができ、その結果、 MAST205の該蛋白質への作用、例えばセリンスレオニンキナーゼ活性を低減または消失させることができる。

[0166] MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして、例えば、該塩基配列力なるオリゴヌクレオチドの 3'末端に、オーバーハング配列と呼ばれる 1個ないし数個の塩基配列力なるヌクレオチドが結合されたオリゴヌクレオチドを挙げられる。配列表の配列番号 2に記載の塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして、例えば、該相補的塩基配列の^末端に、オーバーハング配列と呼ばれる 1個ないし数個の塩基配列力なるヌクレオチドが結合されたオリゴヌクレオチドを挙げられる。配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドとして、具体的には、配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが例示できる。配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (TT)力もなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの ^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (TT)からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。 MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドは上記例示したものに制限されず、 MAST205の発現を RNA干渉の手法により低下または消失させ得るものであればいずれを用いることもできる。例えば、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌタレォチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いることができる。このような短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドはオーバーハング配列を有さない。しかし、オーバーハング配列は、 RNAをヌクレア一ゼカも保護する目的で RNAに結合させる配列であり、短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドの RNA干渉作用を高める効果を有する力該 RNA干渉作用には直接的に影響するものではない。したがって、オーバーハング配列を有さないこのような短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドであっても、 MAST205に対する siRN Aとして有用である。

[0167] 本発明に係る細胞の遊走阻害剤は、細胞の遊走阻害方法の実施に用いることができる。

[0168] 細胞の遊走および浸潤は癌の転移能の指標であることから、細胞の遊走および浸潤を阻害することにより、癌の転移を抑制できると考えることができる。したがって、本発明に係る細胞の遊走阻害剤および遊走阻害方法を用いることにより、癌の転移抑制方法を実施できる。また、本発明に係る細胞の遊走阻害剤を含む癌の転移抑制剤を提供できる。

[0169] 本発明に係る血管新生阻害剤は、血管新生の阻害方法の実施に用いることができる。 [0170] 本発明に係る細胞の遊走阻害剤、癌の転移抑制剤、および血管新生の抑制剤は、医薬組成物として調製できる。この場合、通常、有効成分に加えて 1種または 2種以上の医薬用担体を含む医薬組成物として製造することが好ましい。

[0171] 本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約 0. 00001〜70重量％、好ましくは 0. 0001〜5重量％程度の範囲とするのが適当である。

[0172] 医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。

[0173] より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビ-ルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、ァラビァゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マン-トール、ソルビトール、ラタトースを例示できる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組合わせて使用される。

[0174] 所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、および pH調整剤等を適宜使用することちでさる。

[0175] 安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常の L アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合わせて使用できる。特にこの組合わせによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。 L—アミノ酸は、特に限定はなぐ例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなぐ例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン-トール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等の、ずれでもよ、。セルロース誘導体も特に限定はなぐメチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシェチルセル口ース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、カノレボキシメチルセルロースナトリウム等の!/、ずれでもよ!/、。

[0176] 界面活性剤も特に限定はなぐイオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノァシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。

[0177] 緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クェン酸、 ε アミノカプロン酸、グルタミン酸および Ζまたはそれらに対応する塩 (例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を例示できる。

[0178] 等張化剤は、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、糖類、グリセリンを例示できる。

[0179] キレート剤は、ェデト酸ナトリウム、クェン酸を例示できる。

[0180] 本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥ィ匕し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。

[0181] 医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質 (体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重 lkgあたり約 0. 01 μ g〜100mg程度、好ましくは約 0.： g〜lmg程度の範囲であることが好ましい。し力しながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は 1日 1回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよい。

[0182] 本発明の医薬組成物を投与するときは、該医薬組成物を単独で使用してもよぐあるいは目的の疾患の防止および Zまたは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他の抗腫瘍用医薬ゃ抗炎症用医薬の有効成分等を配合してちょい。

[0183] 投与経路は、全身投与または局所投与の!/ヽずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口経路で投与することもできる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することができる。

[0184] 投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リボソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製できる。

[0185] (化合物の同定方法）

本発明の一態様は、細胞の遊走を阻害する活性を有する化合物の同定方法、および MAST205の機能を阻害する化合物の同定方法に関する。

[0186] 本発明にお!/、ては、細胞の遊走および Zまたは浸潤の阻害を、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することにより達成できることを見出した (実施例 4および 5参照)。例えば、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する化合物を用いること〖こより、細胞の遊走および Zまたは浸潤の阻害を達成できる。すなわち、 MA ST205の発現および Zまたは機能を阻害する化合物は、細胞の遊走および Zまたは浸潤を阻害する活性を有する化合物であるということができる。したがって、細胞の遊走および Zまたは浸潤を阻害する活性を有する化合物を、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する活性を指標にして同定できる。

[0187] MAST205の機能として、上述したように、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性、および MAST205と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合を例示できる。より具体的には、 MAST205の機能として、 MAST205と DCTN1の結合、 MAS T205と TIAM1の結合、 MAST205と MLK3の結合、 MAST205と MKK3の結合、 MAST205と MKK4の結合、 MAST205と MKK6の結合、 MAST205と MKK7 の結合、 MAST205と p38 MAPKの結合、 MAST205の DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を例示できる。 MAST205の DC TNIに対するセリンスレオニンキナーゼ活性により DCTN1がリン酸化され、 MAST 205の TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性により、 TIAM1がリン酸化される。ただし、 MAST205の機能であるセリンスレオニンキナーゼ活性力 DCTN1 および TIAM1に対するリン酸ィ匕活性に留まらないことはいうまでもない。例えば、当該同定方法を実施する場合、セリンスレオニンキナーゼの一般的な基質として当業者に知られている適当な基質を用いたり、市販のキットを使用したりして実施できる。

[0188] この知見に基づき、本発明にお、て、細胞の遊走および Zまたは浸潤を阻害する活性を有する化合物の同定方法、並びに MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する化合物の同定方法を提供できる。より具体的には、細胞の遊走を阻害する活性を有する化合物の同定方法、 MAST205と DCTN1の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と TIAM1の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST2 05と MLK3の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と MKK3の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と MKK4の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と MKK6の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と M KK7の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と p38 MAPKの結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205による DCTN1のリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法を阻害する化合物の同定方法、または MAST205による TIAM1のリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法を提供できる。

[0189] 細胞の遊走および Zまたは浸潤を阻害する活性を有する化合物は、 MAST205 の発現および Zまたは機能を阻害する活性を指標にして同定できることから、該化合物の同定方法は、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する化合物の同定方法により実施できる。

[0190] 細胞の遊走を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、例えば、 MAST205と DCTN 1の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と TIAM 1の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と MLK3の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と MKK3の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と MK K4の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と MKK6の結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205と MKK7の結合を阻害する化合物の同定方法、 M AST205と p38 MAPKの結合を阻害する化合物の同定方法、 MAST205〖こよる DCTN 1のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を阻害する化合物の同定方法、または MAST205による TIAM 1のリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法により実施できる。

[0191] 細胞の遊走を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、具体的には次に示す実験系を用いて実施できる： DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK 6、 MKK7および p38 MAPKからなる群より選択された 1つ以上の蛋白質と MAS T205とを共存させて、 MAST205と該蛋白質を結合させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、ある化合物（以下、被検化合物と称する）と該蛋白質および Zまたは MAST205を接触させ、 MAST205と該蛋白質との結合を検出し得るシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物が MAS T205と該蛋白質との結合を阻害する力否かを決定することにより、細胞の遊走を阻害する活性を有する化合物を同定できる。

[0192] 被検化合物は DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7および p38 MAPKからなる群より選択された 1つ以上の蛋白質と MAST205との結合反応に共存させることもできるし、被検化合物を予め該蛋白質および Zまたは MA ST205と接触させ、その後に MAST205と該蛋白質の結合反応を行うこともできる。 MAST205と該蛋白質の結合により生じるシグナルまたは結合のマーカー力被検化合物を MAST205と接触させたときに、被検化合物を接触させな力つたときと比較して低下あるヽは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物は MAST205と該蛋白質との結合を阻害し、その結果、細胞の遊走を阻害すると判定できる。

[0193] 細胞の遊走を阻害する活性を有する化合物の同定方法はまた、 MAST205と DC TNIおよび Zまたは TIAM 1とを共存させて、 MAST205により DCTN1および Zまたは TIAM 1をリン酸ィ匕させる実験系を用、て実施できる。このような実験系において、被検化合物と MAST205を接触させ、 MAST205による DCTN1および/または TIAM1のリン酸ィ匕を検出し得るシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用 V、て、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物が MAST205による DCTN1および/または TIAMlのリン酸化を阻害するか否かを決定することにより、 MAST205による DCTN1および Zまたは TIAM1のリン酸ィ匕を阻害し、その結果、細胞の遊走を阻害する化合物を同定できる

[0194] 被検化合物は MAST205による DCTN 1および Zまたは TIAM 1のリン酸化反応に共存させることもできるし、被検化合物を予め MAST205と接触させ、その後に M AST205による DCTN1および/または TIAM1のリン酸化反応を行うこともできる。 MAST205による DCTN 1および Zまたは TIAM 1のリン酸化により生じるシグナルまたはリン酸ィ匕のマーカー力被検化合物を MAST205と接触させたときに、被検化合物を接触させな力つたときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物は MAST205による DCTN 1および Zまたは TIAM 1のリン酸化を阻害し、その結果、細胞の遊走を阻害すると判定できる。

[0195] MAST205と DCTN1の結合を阻害する化合物の同定方法は、 MAST205と DC TNIとを共存させて、 MAST205と DCTN1を結合させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、被検化合物と MAST205および/または DCTN1とを接触させ、 MAST205と DCTN1の結合を検出し得るシグナルおよび/またはマ一力一を使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物が MAST205と DCTN1の結合を阻害する力否かを決定することにより、 MAST205と DCTN1の結合を阻害する化合物を同定できる。

[0196] 被検化合物は MAST205と DCTN1の結合反応に共存させることもできるし、被検化合物を予め MAST205および Zまたは DCTN1と接触させ、その後に MAST20 5と DCTN1の結合反応を行うこともできる。 MAST205と DCTN1の結合により生じるシグナルまたは結合のマーカー力被検化合物を MAST205および Zまたは DC TNIと接触させたときに、被検化合物を接触させな力つたときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物は MAST205と DCTN1の結合を阻害すると判定できる。

[0197] このような実験系は、 in vivoおよび in vitroのいずれの条件においても実施できる。好ましくは in vitroの実験系を用いることが適当である。

[0198] in vitroの実験系は、蛋白質の結合阻害剤のスクリーニングにおいて一般的に用いられている同定方法を参考にして実施できる。 in vitroの実験系として、 MAST2 05と DCTN1とを in vitroで反応させて、ウェスタンブロッテイングやプルダウン法により両蛋白質の結合を検出する実験系を例示できる。

[0199] in vitroの実験系として例えば、調製した MAST205と DCTNlとを用いた実験系や、 MAST205と DCTN1とを共に発現して、る真核細胞または培養細胞株を用いた実験系が好ましく例示できる。細胞を用いた実験系においては、 MAST205や DCTN1を発現させた真核細胞または培養細胞株を用いることができる。細胞におけるこれら蛋白質の発現は、 MAST205をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターおよび Zまたは DCTN1をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフエクシヨンすること〖こより達成できる。

[0200] MAST205と DCTN1の結合の検出は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えば免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法、ウェスタンブロッテイングおよび蛍光共鳴エネルギー転移法等の方法またはこれらの方法を組合わせて、 MAST205と D

CTN1により形成される複合体を検出することにより実施できる。 MAST205と DCT N1により形成される複合体の検出を容易にするために、 MAST205および Zまたは DCTN1は、適当な標識物質により標識されたものを用いることが好ましい。標識物質として、 FLAG— tag、 Myc— tagおよび HA— tag等のタグペプチド類が好ましく例示できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を用いて実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ホースラディッシュパーォキシダーゼ（以下、 HRPと略称する）やアルカリホスファターゼ (以下、 ALPと略称する）等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはピオチン等で標識した抗体を用いることにより検出がより容易に実施できる。ある!/ヽは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ピオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。

[0201] 具体的には、 MAST205と DCTN1の結合を阻害する化合物の同定方法は、例えば、 Myc— tagが付カ卩された MAST205をコードする遺伝子を含む適当なベクターおよび FLAG— tagが付加された DCTN 1をコードする遺伝子を含む適当なべクタ一をトランスフエクシヨンした細胞（実施例 1参照）を用いて実施できる。該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解して細胞溶解物を調製し、該細胞溶解物中に含まれる MAST205と DCTN1により形成された複合体を検出する。細胞溶解物中に含まれる該複合体の測定は、一方の蛋白質に付加されたタグペプチドに対する抗体を用いた免疫沈降の後に、もう一方の蛋白質に付カロされたタグペプチドに対する抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行うことにより実施できる。被検化合物で処理したときに検出される MAST205と DCTN1により形成された複合体の量が、細胞を被検化合物で処理しな!、ときに検出される複合体の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物は MAST205と DCTN1の結合を阻害すると判定できる。

[0202] MAST205と DCTN1の結合を阻害する化合物の同定方法はまた、公知のツーハイブリツド（two— hybrid)法を用いて実施できる。例えば、 MAST205と DNA結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、 DCTN1と転写活性ィ匕蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続した lacZ 等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母や真核細胞等の細胞に導入し、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しな!ヽときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しな!、該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物は MAST205と DCTN 1の結合を阻害すると判定できる。

[0203] 上記同定方法により同定される化合物は、 MAST205と DCTN1の結合を阻害する化合物である。

[0204] 上記同定方法において、 DCTN1の代わりに TIAM1を用いることにより、 MAST2 05と TIAM1の結合を阻害する化合物の同定方法を実施できる。該同定方法により同定される化合物は、 MAST205と TIAM1の結合を阻害する化合物である。 DCT N1の代わりに MLK3を用いることにより、 MAST205と MLK3の結合を阻害する化合物の同定方法を実施できる。該同定方法により同定される化合物は、 MAST205 と MLK3の結合を阻害する化合物である。 DCTN1の代わりに MKK3を用いることにより、 MAST205と MKK3の結合を阻害する化合物の同定方法を実施できる。該同定方法により同定される化合物は、 MAST205と MKK3の結合を阻害する化合物である。 DCTN1の代わりに MKK4を用いることにより、 MAST205と MKK4の結合を阻害する化合物の同定方法を実施できる。該同定方法により同定される化合物は、 MAST205と MKK4の結合を阻害する化合物である。 DCTN1の代わりに MK K6を用いることにより、 MAST205と MKK6の結合を阻害する化合物の同定方法を実施できる。該同定方法により同定される化合物は、 MAST205と MKK6の結合を阻害する化合物である。 DCTN1の代わりに MKK7を用いることにより、 MAST205 と MKK7の結合を阻害する化合物の同定方法を実施できる。該同定方法により同定される化合物は、 MAST205と MKK7の結合を阻害する化合物である。 DCTN1の代わりに p38 MAPKを用いることにより、 MAST205と p38 MAPKの結合を阻害する化合物の同定方法を実施できる。該同定方法により同定される化合物は、 MAS T205と p38 MAPKの結合を阻害する化合物である。

[0205] MAST205による DCTN1のリン酸化を阻害する化合物の同定方法は、 MAST2 05と DCTN 1とを共存させて、 MAST205により DCTN 1をリン酸化させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、被検化合物と MAST205および/または DCTN 1とを接触させ、 MAST205による DCTN 1のリン酸化を検出できるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物が MAST205による DCTN 1のリン酸化を阻害するか否かを決定することにより、 MAST205による DC TNIのリン酸ィ匕を阻害する化合物を同定できる。

[0206] 被検化合物は MAST205による DCTN 1のリン酸ィ匕反応に共存させることもできるし、被検化合物を予め MAST205および Zまたは DCTN1と接触させ、その後に M AST205による DCTN1のリン酸化反応を行うこともできる。 MAST205による DCT N1のリン酸ィ匕により生じるシグナルまたはリン酸ィ匕のマーカー力被検化合物を MA ST205および/または DCTN 1と接触させたときに、被検化合物を接触させなかつたときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物は M AST205による DCTN1のリン酸化を阻害すると判定できる。

[0207] このような実験系は、 in vivoおよび in vitroのいずれの条件においても実施できる。好ましくは in vitroの実験系を用いることが適当である。

[0208] リン酸化された蛋白質の検出は、例えば、リン酸化された蛋白質に対する抗体を用いてウェスタンブロッテイングにより実施できる。また、リン酸化された蛋白質の検出は、リン酸ィ匕反応に放射性同位体標識した ATP、例えば [ γ— ³²P]ATPを用いて、リン酸化された蛋白質に転移された [ γ—³²Ρ]の放射活性を測定することにより実施できる（実施例 2を参照)。あるいは、ペプチドアレイを用いた表面プラズモン共鳴ィメージング法により蛋白質のリン酸ィ匕を検出できる。

[0209] 上記同定方法により同定される化合物は、 MAST205による DCTN1のリン酸ィ匕を阻害する化合物である。このような化合物には、 MAST205と DCTN1の結合を阻害する化合物や、 MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物が含まれる。

[0210] 上記同定方法において、 DCTN1の代わりに TIAM1を用いることにより、 MAST2 05による TIAM1のリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法を実施できる。該同定方法により同定される化合物は、 MAST205と TIAM1の結合を阻害する化合物である。このような化合物には、 MAST205と TIAM1の結合を阻害する化合物や、 ΜΑ ST205のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物が含まれる。

[0211] 本発明においてはまた、 MAST205の発現を阻害する化合物の同定方法を実施できる。 MAST205の発現を阻害する化合物の同定方法は、 MAST205の発現を測定できる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、 MAST205をコードする遺伝子と被検化合物とを共存させてその発現を測定し、ついで、被検化合物の非存在下での測定結果との比較における発現の変化、例えば低減または消失を検出することにより、 MAST205の発現を阻害する化合物を同定できる。

[0212] MAST205の発現を測定できる実験系として、具体的には、 MAST205をコードする遺伝子を含む発現ベクターをトランスフエクシヨンした細胞を用いて MAST205 を発現させる実験系を例示できる。このような実験系において、該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解して細胞溶解物を調製し

、該細胞溶解物中に含まれる MAST205を検出する。細胞を被検化合物で処理したときに検出される MAST205の量力細胞を被検化合物で処理しないときに検出される MAST205の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物は MA ST205の発現を阻害すると判定できる。

[0213] MAST205の発現の測定は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えばウェスタンブロッテイング等の方法により、 MAST205を直接的に検出することにより実施できる。また、発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、 MAST205の測定を容易に実施できる。発現の指標となるシグナルとして、例えば、標識物質を例示できる。標識物質で MAST205を標識し、該標識物質を測定することにより、 MAST205の測定を容易に実施できる。標識物質として、 FLAG -tag 、 Myc— tagおよび HA— tag等のタグペプチド類が好ましく例示できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を用いて実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、 HRPや ALP 等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはピオチン等で標識した抗体を用いることにより検出がより容易に実施できる。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ピオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。

[0214] MAST205の発現を測定できる実験系としてまた、 MAST205をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流に、該遺伝子の代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等を用いた実験系を例示できる。このような実験系において、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しな!ヽときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しな、該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物は MAST205の発現を阻害すると判定できる。レポーター遺伝子として、レポーターアツセィで一般的に用いられている遺伝子を使用でき、ルシフェラーゼ、 13 ガラクトシダーゼまたはクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ等の酵素をコードする遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。

[0215] 被検化合物は、例えばィ匕学ライブラリーや天然物由来の化合物、または MAST20 5、 DCTN1および TIAM1の一次構造や立体構造に基づ!/、てドラッグデザインして得られた化合物等を挙げることができる。あるいは、 MAST205と DCTN1の結合部位または MAT205と TIAM1の結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られたィ匕合物等も被検化合物として好適である。

[0216] 本発明に係る細胞遊走を阻害する活性を有する化合物の同定方法は、上記同定方法により MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することが明らかになった被検化合物が、細胞遊走を阻害し得るか否力を測定する工程をさらに含む同定方法であり得る。

[0217] 細胞遊走の阻害を測定できる実験系として、例えば上記細胞遊走測定システムまたは上記細胞浸潤測定システムを使用できる。このようなシステムを用いて、細胞の遊走または浸潤を被検化合物で処理した細胞と被検化合物で処理して!/、な、細胞の間で比較検討し、前者の遊走または浸潤が、後者のものと比較して低下した場合には、被検化合物は細胞遊走を阻害する活性を有すると判定できる。

[0218] (試薬キット）

本発明の一態様は、試薬キットに関する。本試薬キットは、次の成分を有してなる試薬キットであり得る：（A) MAST205、 MAST205をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群力選ばれる 1つ以上の成分；および（B) DCTN1、 DCTN1をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる 1つ以上の成分

、または、 TIAM1、 TIAM1をコードするポリヌクレオチド、 TIAM1をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および TIAM1をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる 1つ以上の成分。

[0219] また、本試薬キットは、次の成分を有してなる試薬キットであり得る：（A) MAST205 、 MAST205をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる 1 つ以上の成分；および（B) MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6および p38 MAPK 力選ばれるいずれか 1の蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドをコードする組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる 1つ以上の成分。

[0220] また、本試薬キットは、次の成分を有してなる試薬キットであり得る：（A) MAST205 、 MAST205をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる 1 つ以上の成分；および（B) MLK3、 MKK4、 MKK7および JNKから選ばれるいずれか 1の蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドをコードする組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体力なる群から選ばれる 1つ以上の成分。

[0221] 本発明に係る試薬キットは、上記同定方法において用いるシグナルおよび Zまたはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および Zまたは防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。

[0222] 本発明に係る試薬キットは、例えば本発明に係る化合物の同定方法に使用できる

[0223] (MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK,および JNKの取得）

MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK,および JNKはヒト由来の蛋白質であることが好ましいが、該ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ゥマ、ヒッジ、ゥシ、ィヌ、サル、ネコ、ラットまたはゥサギ等に由来する蛋白質であることができる。また、 MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3 、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p38 MAPK,および JNKをそれぞれコードする遺伝子は、ヒト由来の遺伝子であることが好ましいが、該ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有しかつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質をコードする遺伝子であれば、例えばマウス、ゥマ、ヒッジ、ゥシ、ィヌ、サル、ネコ、ラットまたはゥサギ等に由来する遺伝子であることができる。 MAST205の性質や機能として、例えば、 DCTN1 、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、および p38 MAPKそれぞれとの結合や、 DCTN1および TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を挙げることができる。 DCTN1の性質や機能として、例えば、ストレス刺激、例えばソルビトール刺激による p38 MAPKのリン酸化への MKK3あるいは MKK6の活性化を介した関与を挙げることができる。 TIAM1の性質や機能として、例えば、 GDP — GTP交換因子活性や、 MKK3を介した p38 MAPKのリン酸化を挙げることができる。 MLK3の性質や機能として、例えば、 I κ Bキナーゼ aと βの直接的なリン酸ィ匕とそれによる活性ィ匕を挙げることができる。 ΜΚΚ3の性質や機能として、例えば、 ρ38 MAPKのスレオ-ン残基ゃチロシン残基のリン酸化を挙げることができる。 MKK4 の性質や機能として、例えば、 JNK1ZMAPK8や JNK2ZMAPK9および p38 M APKの活性化が挙げられる。 MKK6の性質や機能として、例えば、 p38 MAPKのスレオニン残基ゃチロシン残基のリン酸ィ匕を挙げることができる。 MKK7の性質や機能として、例えば、 JNK1や JNK2の活性化を挙げることができる。 p38 MAPKの性質や機能として、例えば、 ELK1や ATF2のような転写因子のリン酸ィ匕を挙げることができる。 JNKの性質や機能として、例えば、 c Junのリン酸ィ匕を挙げることができる

MAST205, DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK,および JNKは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよぐあるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、 MAST205、 DCTN1、 TI AMI , MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p38 MAPK,および JNKのうち少なくとも 1を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。 MA ST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p38 MAPK,および JNKは、その性質や機能に影響がない限りにおいて、 N末端側や C 末端側に別種の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカ一ペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加してもよい。別種の蛋白質やポリべプチドとして、ダルタチオン S トランスフェラーゼ (GST)、 j8—ガラクトシダーゼ、 HRPまたは ALP等の酵素類、 His— tag、 Myc— tag、あるいは HA— tag、 FLAG tagまたは Xpress— tag等のタグペプチド類を例示できる。

[0225] 遺伝子工学的手法として、公知の方法がいずれも使用できる。公知の方法として、成書に記載の方法（サムブルック（Sambrook)ら編、「モレキュラークローユング，ァラボラトリーマニュアル第 2版」、 1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマ-ユアル遺伝子工学」、 1988年、丸善株式会社;ウルマー (U lmer, K. M. ) , 「サイエンス（Science)」、 1983年、第 219卷、 p. 666— 671 ;エールリッヒ（Ehrlich, H. A. )編、「PCRテクノロジー， DNA増幅の原理と応用」、 1989 年、ストックトンプレス等を参照）を例示できる。

[0226] MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK、および JNKをそれぞれコードする遺伝子は、例えば、各遺伝子の発現が認められる適当な起源から、自体公知のクロー-ング方法等を用いて容易に取得できる。これら遺伝子の起源として、該遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞を例示できる。 MAST205遺伝子は様々な組織で普遍的に発現している力高発現が認められる組織として、例えば、ヒトの癌組織、具体的には肺平滑筋肉腫や小細胞肺癌、脳髄芽腫、および骨肉腫を例示できる。 DCTN1遺伝子の起源として、脳組織を例示できる。 TIAM1遺伝子の起源として、小脳組織、ヒト白血病細胞を例示できる。 MLK3遺伝子、 MKK3遺伝子、 MK K4遺伝子、 MKK6遺伝子、 MKK7遺伝子、 p38 MAPK遺伝子、および JNK遺伝子は、様々な組織や細胞で普遍的に発現している。 MLK3遺伝子が発現している組織として脾臓、リンパ節が例示できる。 MKK3遺伝子が発現している組織として、脾臓、前立腺、卵巣、小腸、白血球、骨格筋等が例示できる。 MKK4遺伝子が発現してヽる組織として脳組織が例示できる。 MKK6遺伝子が発現してヽる組織として骨格筋、心臓、肝臓、脾臓が例示できる。 MKK7遺伝子が発現している組織として骨格筋、心臓、脳、精巣が例示できる。 p38 MAPK遺伝子が発現している組織として骨格筋、骨髄、リンパ節が例示できる。 JNK遺伝子が発現している組織として心臓、骨格筋、脳が例示できる。

[0227] 起源からの全 RNAの分離、 mRNAの分離や精製、 cDNAの取得とそのクロー- ング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販されている cDNAライブラリーを用いることもできる。所望のクローンを cDNAライブラリ一力も選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を使用できる。例えば、目的の DNA配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダィゼーシヨン法、コロニーハイブリダィゼーシヨン法等やこれらを組合せた方法を使用できる。ここで用いるプローブとして、 MAST 205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p38 MA PK、および JNKをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列に関する情報に基づ、て化学合成された DNA等が一般的に使用できる。また、該遺伝子の塩基配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。 cDNAライブラリーからの目的クローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、その生物学的機能を指標にして実施できる。

[0228] 遺伝子の取得にはその他、 PCR (ウルマー（Ulmer, K. M. )、「サイエンス（Scien ce)」、 1983年、第 219卷、 p. 666— 671；エールリツヒ（Ehrlich, H. A.；)編、「PC Rテクノロジー， DNA増幅の原理と応用」、 1989年、ストックトンプレス；サイキ（Saiki R. K. )ら、「サイエンス（Science)」、 1985年、第 230卷、 p. 1350— 1354) )による DNAZRNA増幅法が好適に利用できる。 cDNAライブラリーから全長の cDNA が得られ難いような場合には、 RACE法（「実験医学」、 1994年、第 12卷、第 6号、 p . 35—）、特に 5'—RACE法（フローマン（Frohman M. A. )ら、「プロシーディンダスォブザナショナルアカデミーォブサイェンシズォブザユナイテッドステーッォブアメリカ（Proceedings of The National Academy of Sci ences of The United States of America)」、 1988年、第 85卷、第 23号、 p. 8998— 9002)等の採用が好適である。 PCRに使用するプライマーは、 DNAの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させた DNAZRNA断片の単離精製は、常法により実施できる。例えばゲル電気泳動法等により DNAZRNA断片の単離精製を実施できる。 [0229] 遺伝子は、その機能、例えばコードする蛋白質の発現や、発現された蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、 5,末端側や ^末端側に、例えば GST、 β ガラクトシダーゼ、 HRPまたは ALP等の酵素類、 His— tag、 Myc— tag、あるいは HA— t ag、 FLAG— tagまたは Xpress— tag等のタグペプチド類等の遺伝子力 1つまたは 2つ以上付加された DNAであることができる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により実施できる。

[0230] MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK、および JNKをそれぞれコードする遺伝子を含む組み換えベクターを構築し、該組み換えベクターを用いて適当な宿主細胞で該遺伝子を発現させることにより、これら遺伝子のうち少なくとも 1を発現する細胞を取得できる。また、該細胞から、公知の方法で MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MK K6、 MKK7、 p38 MAPK、および JNKを調製できる。

[0231] ベクター DNAは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクター DNAは、天然に存在するものを抽出したものの他、複製に必要な部分以外の DNAの部分が一部欠落して、るものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、ノクテリオファージおよびウイノレス由来のベタター DNAを例示できる。プラスミド DNAとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドを例示できる。ノクテリオファージ DNAとして、 λファージを例示できる。ウィルス由来のベクター DNAとして、レトロウイルス、ヮクシ -ァウィルス、アデノウイルス、パポバウィルス、 SV40、鶏痘ウィルス、および仮性狂犬病ゥイノレス等の動物ウイノレス由来のベクター、あるいはバキュロウイノレス等の昆虫ウィルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクター DNAを例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクター DNA、例えばプラスミドおよびバタテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクター DNA (コスミドゃファージミド等）を例示できる。また、目的により発現ベクターやクローユングベクター等、いずれを用いることもできる。

[0232] ベクター DNAには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネータ一、シグナル配列、ェンハンサ一等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した 1つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクター DNAに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子を例示できる。

[0233] ベクター DNAに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次 V、で同様に処理したベクター DNAと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカ一をライゲーシヨンし、これを目的に適したベクターのマルチクローユングサイトへ挿入することによつても、所望の組み換えベクターが得られる。

[0234] MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK,および JNKをそれぞれコードする遺伝子を含む組み換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体が得られる。ベクター DNAとして発現ベクターを使用すれば、これら遺伝子のうち少なくとも 1を発現する細胞を取得でき、さらに該細胞用いて公知の方法により MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p38 MAPK,および JNKを製造できる。該开質転換体には、 MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK 7、 p38 MAPK,および JNKをそれぞれコードする遺伝子以外の所望の遺伝子を組込んだベクター DNAの 1つまたは 2つ以上をさらに導入することもできる。

[0235] 宿主として、原核生物および真核生物の!/ヽずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) )等のェシエリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シユードモナスプチダ（Pseudomonas putida)等のシユードモナス属、リゾビゥムメリロティ（Rhizobium meliloti)等のリゾビゥム属に属する細菌を例示できる。真核生物として、サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) 、シゾサッカロミセスボンべ（Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、 Sf9や Sf 21等の昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（COS細胞、 Vero細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウス L細胞、ラット GH3細胞、ヒト HEK293T細胞等の動物細胞を例示できる。好ましくは動物細胞を用いる。

[0236] ベクター DNAの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されて、る標準的な方法 (サムブルック（Sambrook)ら編、「モレキュラークロ一-ング，ァラボラトリーマ-ユアル第 2版」、 1989年、コールドスプリングハーバ一ラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法を挙げることができる力簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 DEAE—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、形質導入、スクレープ負荷 (scrape loading)、バリスティック導入 (ballistic introduction)および感染を例示できる。

[0237] MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK、および JNKは、これら蛋白質をそれぞれコードする遺伝子を遺伝子ェ学的手法で発現させた細胞や生体試料力調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよぐあるいはこれら力さらに精製されたものであってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフエクシヨンして得られた形質転換体であり得る。

[0238] MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK、および JNKはさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、 N末端側や C末端側に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカ一ペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識ィ匕したものであってもよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識ィ匕が望ましい。付加する蛋白質等として、 GST、 β—ガラタトシダーゼ、 HRPまたは ALP 等の酵素類、 His -tag, Myc— tag、 HA— tagゝ FLAG— tagまたは Xpress— tag 等のタグペプチド類、フノレ才レセインイソチ才シァネート (fluorescein isothiocyan ate)またはフィコエリスリン（phycoerythrin)等の蛍光色素類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンの Fc断片あるいはピオチンを例示できる力これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することもできる。標識ィ匕に用いる物質は、 1つまたは 2つ以上を組合せて付加できる。これら標識化に用いた物質自体、またはその機能を測定することにより、本蛋白質を容易に検出または精製でき、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との相互作用を検出できる。

[0239] MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK、および JNKは、具体的には例えば、これら蛋白質をそれぞれコードする遺伝子を含むベクター DNAをトランスフエクシヨンした形質転換体を培養し、次ヽで得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することにより製造できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体またはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよぐ培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもょヽ。

[0240] 目的とする蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して目的とする蛋白質を抽出する。また、目的とする蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。

[0241] MAST205, DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK、および JNKはまた、一般的な化学合成法により製造できる。例えば、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、 1975年および「ペプチドシンテシス (Pepti de Synthesis)」、インターサイエンス (Interscience)、ニューヨーク (New York) 、 1996年）に記載の方法により、これら蛋白質を製造できるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。蛋白質の化学合成方法として、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれを用いることもできる。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を 1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させて、く、わゆるステップワイズェロンゲーシヨン法と、アミノ酸数個力もなるフラグメントを予め合成し、次、で各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーシヨン法とを包含し、本蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成において用いられる縮合法も、常法に従うことができ、アジド法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステル法、酸化還元法、 DPPA (ジフヱニルホスホリルアジド）法、 DCC +添カ卩物（1—ヒドロキシベンゾトリァゾール、 N—ヒドロキシサクシンアミド、 N—ヒドロキシ一 5—ノルボルネン一 2, 3—ジカルボキシイミド等）法、ゥッドワード法を例示できる。また、市販のアミノ酸合成装置を用いてペプチドを製造することがでさる。

[0242] MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK、また〖お NKに、変異が導入されたものも本発明において使用できる。蛋白質、ポリペプチドおよびポリペプチドに変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（ウルマー（K. M. Ulmer)、「サイエンス（Science)」、 1983 年、第 219卷、 p. 666— 671)を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該の基本的な性質 (物性、機能または免疫学的活性等)を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成ァミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミドィ匕修飾する等、機能の著しい変更を伴わな!/ヽ程度に改変できる。

[0243] MAST205、 DCTN1、 TIAM1、 MLK3、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 p 38 MAPK、また ίお NKは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により精製および Zまたは分離できる。分離および Zまたは精製は、本蛋白質の機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモ-ゥム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するァフィ-ティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。

[0244] 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

実施例 1

[0245] (MAST205と DCTN1および TIAM1との結合解析）

MAST205と DCTN1および TIAM1との結合を、ヒト培養細胞における一過性共発現系を用いて免疫沈降法により検討した。

[0246] 細胞数 5. 0 X 10⁵Z5ml mediumの HEK293T細胞を 6cm ディッシュに播種し

、 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で 24時間培養後、 MAST205遺伝子

2

を組み込んだ pClZMyc発現ベクターと、 DCTN1遺伝子または TIAM1遺伝子を組み込んだ pCl/FLAG発現ベクターとを、 15 Lのリポフエクトァミン 2000 (Lipofectamine2000、 Invitrogen社製）を用いて細胞にトランスフエクシヨンした。これらベクターにより、それぞれ Myc— tagで標識された MAST205 (以下、 M yc— MAST205と称する）、 FLAG— tagで標識された DCTN1 (以下、 FLAG— D CTN1と称する）、 FLAG— tagで標識された TIAM1 (以下、 FLAG— TIAM1と称する）が細胞内で発現される。コントロールとして、 MAST205遺伝子を組み込んだ p ClZMyc発現ベクターの代わりに MAST205遺伝子を組み込んで!/、な!/ ^pCl/M yc発現ベクター、ある!/、は DCTN1遺伝子または TIAM1遺伝子を組み込んだ pCI ZFLAG発現ベクターの代わりに DCTN1遺伝子または TIAM1遺伝子を組み込んで!ヽな、pClZFLAG発現ベクターを、同様の方法でトランスフエクシヨンした細胞を調製した。トランスフクシヨンして 48時間培養した後、培養上清を除き、細胞を冷たいリン酸緩衝生理食塩水（以下、 PBSと略称する）で 2回洗浄し、 0. 01容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（protease inhibitor cocktail、 Sigma社製）を加えた 1 X細胞溶解バッファー (Cell Signaling社製）を 500 μ L添カ卩した。氷上で 15分間放置した後、 15, OOOrpmにて 4°Cで 30分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液として用いた。細胞溶解液の蛋白質濃度は、クマシ一プラス一 200 プロテインアツセィ試薬 (Coomassie Plus― 200 Protein Assay Reagent、 Pierce社製)を用いて定量した。一部の細胞溶解液は、 2 X SDS サンプルバッファーを加え、熱変性させた (以下、細胞溶解液サンプルと称する）。細胞力抽出した細胞溶解液は、各サンプル間で蛋白質量を同一にし、 0. 1 % ゥシ血清アルブミン（BSA)でブロッキングした 20 Ι^ (50% νΖν)のプロテイン G セファロース 4 ファストフロー（Protein

(j ¾epharose 4 Fast Flow、 Amersham Biosciences社製)を刀 UX_、 4 C (? 1時間回転させて攪拌した。その後、 10, OOOrpmにて 4°Cで 1分間遠心処理し、その上清を回収した。回収した上清に 1 μ gの抗体を加え、 4°Cで一晩回転させて攪拌した。その後、 0. 1 % BSAでブロッキングした 60 L (50% vZv)の Protein G Sepharose 4 Fast Flowをカ卩え、 4°Cで 2時間回転させて攪拌した。次いで、 10 , OOOrpmにて 4°Cで 1分間遠心処理し、その上清を除去した。 500 /z Lの I X細胞溶解バッファーを加え、 10, OOOrpmにて 4°Cで 1分間遠心処理し、その上清を除去した。この洗浄操作を 3回繰り返した後に、 2 X SDS サンプルバッファーをレジンと等量 (30 /z L)加え、吸着した蛋白質を抽出し熱変性させた (以下、免疫沈降サンプルと称する）。細胞溶解液サンプルおよび免疫沈降サンプルを 5— 20% SDS - PA GEにより分離し、 1次抗体および 2次抗体で染色後、 ECL試薬 (Amersham Bios ciences社製）または ECL Plus試薬（Amersham Biosciences社製）を用いて蛋白質の検出を行った。免疫沈降サンプルの調製に用いた抗体および 1次抗体として、マウス抗 FLAGモノクローナル抗体（Sigma社製）およびマウス抗 c Mycモノクローナル抗体（Santa Cruz社製）を、 2次抗体として HRP結合ャギ抗マウス IgGポリクローナル抗体（Cell Signaling社製）を用いた。

図 1に、 MAST205と DCTN1の結合解析の結果を示す。図 1の中パネルおよび右パネルに示すように、 Myc - MAST205と FLAG - DCTN 1を共発現させた細胞 (レーン 1)から、マウス抗 c— Mycモノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、 IP： Mycと示す）およびマウス抗 FLAGモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図中、 IP : FLAGと示す）においてのみ、 Myc— MAST205と F LAG— DCTN1の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、 Myc— MAST2 05非発現細胞（レーン 2)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、 Myc— MAS T205と FLAG— DCTN1の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降は F LAG DCTN 1のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、 Myc— MAST20 5と FLAG— DCTN1の結合を示すものと判定した。また、 FLAG— DCTN1非発現細胞（レーン 3)、並びに Myc— MAST205および FLAG— DCTN1非発現細胞（レーン 4)から同様に調製した免疫沈降サンプルでも Myc— MAST205と FLAG— D CTN1の共沈は検出されなかった。 Myc— MAST205発現細胞から調製したサンプルにおける Myc— MAST205の発現、および FLAG— DCTN 1発現細胞から調製したサンプルにおける FLAG— DCTN1の発現は、いずれも同程度であった（図 1 の左パネル）。

[0248] 具体的には、 Myc— MAST205とFLAG— DCTNlを共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗 c Mycモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図 1の中パネル、レーン 1)において、 FLAG— DCTN1を示すバンド（図中、矢印で示す）および Myc— MAST205を示すバンドが検出された。これに対して、 Mycと FLAG DCTN 1を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 1の中パネル、レーン 2)では、 FLAG— DCTN1および Myc— MAST205を示すバンドはいずれも検出されなかった。また、 Myc— MAST205と FLAGを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 1の中パネル、レーン 3)では Myc— MAST 205を示すバンドのみが検出され、 Mycと FLAGを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 1の中パネル、レーン 4)ではいずれのバンドも検出されなかった。

[0249] また、 Myc— MAST205と FLAG— DCTN1を共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗 FLAGモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図 1の右パネル、レーン 1)において、 Myc— MAST205を示すバンド（図中、矢印で示す）および FL AG— DCTN1を示すバンドが検出された。これに対して、 Mycと FLAG— DCTN 1 を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 1の右パネル、レーン 2)では、 FLAG— DCTN1を示すバンドのみが検出された。また、 Myc— MAST20 5と FLAGを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 1の右パネル、レーン 3)および Mycと FLAGを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 1の右パネル、レーン 4)ではいずれのバンドも検出されなかった。 [0250] 上記結果から、 MAST205と DCTN1が細胞内で結合することが明らかになった。

[0251] 図 2に、 MAST205と TIAM1の結合解析の結果を示す。図 2の中パネルおよび右パネルに示すように、 Myc— MAST205と FLAG—TIAM1を共発現させた細胞（レーン 1)から、マウス抗 c— Mycモノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、 IP： Mycと示す）およびマウス抗 FLAGモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図中、 IP :FLAGと示す）においてのみ、 Myc— MAST205と F LAG— TIAM1の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、 Myc— MAST20 5非発現細胞（レーン 2)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、 Myc— MAST 205と FLAG— TIAM1の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降は FL AG— TIAM1のレジンへの非特異的吸着によるものではなぐ Myc— MAST205と FLAG— TIAM1の結合を示すものと判定した。また、 FLAG— TI AMI非発現細胞 (レーン 3)、並びに Myc— MAST205および FLAG— TIAM1非発現細胞（レーン 4)から同様に調製した免疫沈降サンプルでも Myc— MAST205と FLAG—TIAM 1の共沈は検出されなかった。 Myc— MAST205発現細胞から調製したサンプルにおける Myc - MAST205の発現、および FLAG—TIAM 1発現細胞から調製したサンプルにおける FLAG— TIAM1の発現は、いずれも同程度であった（図 2の左パネル)。

[0252] 具体的には、 Myc— MAST205とFLAG—TIAMlを共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗 c Mycモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図 2の中パネル、レーン 1)において、 FLAG—TIAM1を示すバンド（図中、矢印で示す）および Myc— MAST205を示すバンドが検出された。これに対して、 Mycと FLAG TIAM 1を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 2の中パネル、レーン 2)では、 FLAG— TIAM1および Myc— MAST205を示すバンドはいずれも検出されなかった。また、 Myc— MAST205と FLAGを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 2の中パネル、レーン 3)では Myc— MAST 205を示すバンドのみが検出され、 Mycと FLAGを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 2の中パネル、レーン 4)ではいずれのバンドも検出されなかった。 [0253] また、 Myc— MAST205と FLAG—TIAMlを共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗 FLAGモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図 2の右パネル、レーン 1)において、 Myc— MAST205を示すバンド（図中、矢印で示す）および FL AG— TIAM1を示すバンドが検出された。これに対して、 Mycと FLAG— TIAM1を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 2の右パネル、レーン 2 )では、 FLAG— TIAM1を示すバンドのみが検出された。また、 Myc— MAST205 と FLAGを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 2の右パネル、レーン 3)および Mycと FLAGを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 2の右パネル、レーン 4)ではいずれのバンドも検出されなかった。

[0254] 上記結果から、 MAST205と TIAM1が細胞内で結合することが明らかになった。

実施例 2

[0255] (MAST205による DCTN1のリン酸化解析）

MAST205による DCTN1のリン酸化を in vitroで解析した。

[0256] リン酸化試験に用いた MAST205および DCTN1は以下のようにして調製した。細胞数 10 X 10⁵/10ml mediumの HEK293T細胞を 10cm ディッシュに播種し、 3 7°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で 24時間培養後、 MAST205遺伝子を

2

組み込んだ pClZMyc発現ベクター 4 /z g、または DCTN1遺伝子を組み込んだ p CIZFLAG発現ベクター 4 μ gを、 30 μ Lの Lipofectamine2000 (Invitrogen社製)を用いて細胞にトランスフエクシヨンした。これらベクターにより、それぞれ Myc— MAST205および FLAG— DCTN1が細胞内で発現される。コントロールとして、 M AST205遺伝子を組み込んで!/、な!/、pClZMyc発現ベクター、ある!/、は DCTN1遺伝子を組み込んで、な、pClZFLAG発現ベクターを同様の方法でトランスフエクシヨンした細胞を調製した。各蛋白質はトランスフクシヨンの 48時間後に抽出した。具体的には、上記細胞を PBSで洗浄後、 0. 01容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（Sigma社製）を加えた 1 X細胞溶解バッファー (Cell Signaling社製）を添加し、氷上で 35分間放置した後、 15, OOOrpmにて 4°Cで 30分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液とした。細胞溶解液の蛋白質濃度は、 Coomassie Plus— 200 Prot ein Assay Reagent (Pierce社製）を用いて定量した。細胞溶解液（0. 2mL〜0. 5mL)〖こ 0. 1 % BSAでブロッキングした 20 ;z L (50% vZv)の Protein G Sep harose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences社製)をカ卩え、 4。Cで 1時間回転させて攪拌した。次いで、 10, OOOrpmにて 4°Cで 1分間遠心処理し、その上清を回収した。回収した上清に抗体を 2 g添加し、 4°Cで一晩回転させて攪拌した。抗体は、マウス抗 FLAGモノクローナル抗体（Sigma社製）およびマウス抗 c— Mycモノクローナル抗体（Santa Cruz社製）を用いた。その後、 0. 1 % BSAでブロッキングした 66 Ι^ (50% ν/ν)の Protein G Sepharose 4 Fast Flowをカ卩え、 4。C で 2時間回転させて攪拌した。次いで、 10, OOOrpmにて 4°Cで 1分間遠心処理し、その上清を除去した。 500 Lの I X細胞溶解バッファーをカ卩え、 10, OOOrpmにて 4°Cで 1分間遠心処理し、その上清を除去した。この操作を 3回繰り返した。次に 500 ;z Lのキナーゼバッファー（50mM HEPES, pH7. 5, 20mM MgCl , 2mM ジ

2 チォスレイトール（DTT) )を加え、 10, OOOrpmにて 4°Cで 1分間遠心処理後、上清を除去した。この操作を 3回繰り返した。最後に、 33 Lの割合でキナーゼバッファーを加え、使用時まで— 80°Cで保存した。

[0257] リン酸化試験には上記調製した Myc— MAST205を 6 μ L· (50% v/v)および F LAG DCTN1を 13 μ L· (50% vZv)使用した。これらを混合し、 ATPミクスチヤ一を 6 μ L加えて（ΑΤΡ終濃度 200 μ ΜΛ Ύ ³² P] ATP 2. 5 μ Ci/sample)、 3 0°Cで 15分間反応させた。 5 X SDSサンプルバッファーを 6. 25 μ LZsample加え、熱変性させ、これを 5%あるいは 5— 20%アクリルアミドゲルで電気泳動（10 μ L/la ne)し、ゲルドライヤーでゲルを乾燥後、イメージングプレートに露出、 FLA3000 (富士フィルム社製）にて解析した。

[0258] 図 3に示すように、 Myc— MAST205と FLAG— DCTN1を反応させたときに、 FL AG— DCTN1のリン酸化を示すバンドが検出された（レーン 1)。これに対して、 Myc と FLAG— DCTN1を反応させたときにはこのようなバンドはほとんど検出されなかつた（レーン 2)。また、 FLAG— DCTN1の代わりに FLAGを用いて同様の反応を行つたときには、 FLAG— DCTN1のリン酸化を示すバンドは検出されなかった（レーン 3 および 4)。

[0259] この結果から、 MAST205が DCTN1をリン酸化することが明らかになった。実施例 3

[0260] (MAST205発現阻害による p38 MAPK、 JNK、 MKK6のリン酸化阻害）

MAST205は DCTN1と結合してこれをリン酸化する（実施例 2参照）。 DCTN1は、 p38 MAPKあるいはその上流の MKK6ZMKK3を介した情報伝達経路に関与することが知られている（チェゥン（Cheung P. )ら、「ザジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry)」、 2004年、第 279卷、第 44号、 p. 45308—4531:0。

[0261] そこで、 MAPKKあるいは MAPKが関与する情報伝達経路への MAST205の影響を解析するため、ストレス刺激により活性ィ匕される MAPKKおよびその下流に位置する蛋白質のリン酸化を、 MAST205の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しない細胞とを用いて比較検討した。

[0262] 細胞は、 HeLa細胞 (ヒト子宫頸部癌細胞株）を用いた。細胞における MAST205 の発現阻害は、 MAST205に対する siRNA (以下、 MAST205 siRNAと称する）を用いて行った。ここで用いた MAST205 siRNAは、配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと力もなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド (Dharmacon社へ製造委託)である。配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (TT)力なるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (TT)力なるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。コントロールとして、非特異的コントロールデュープレックス VIII (Dharmacon社製）を用いた。非特異的コントロールデュープレックス VIIIは、配列番号 4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロール siRNAと称することがある）。

[0263] 蛋白質リン酸化の検討は、 p38 MAPK, MKK6、 MKK3、 JNK、および ERK1 Z2について行った。

具体的には、 2 X 10⁵ZlmL mediumの HeLa細胞を 12ゥエルプレートの各ゥェル〖こ播種し、 37°C〖こて 5% CO /95% エアの条件下で 24時間培養した。次いで

2

、 3 ;z Lの Lipofectamine2000 (Invitrogen社製）を用いて、 lOOpmolの MAST2 05 siRNAまたはコントロール siRNA ^O /z M siRNAを 5 L)を細胞にトランスフェクシヨンし、さらに 24時間、 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で培養した

2

。その後、細胞を回収し、 2等分にして 12ゥエルプレートにまきなおし、さらに 24時間、 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で培養した。次いで、細胞を 0. 4M ソ

2

ルビトールで 20分間刺激した。刺激後、培養上清を除去し、冷トリス緩衝生理食塩水 (TBS)にて 2回洗浄後、 0. 01容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル (Sigma社製 )、およびそれぞれ終濃度で 1. 5mM MgCl、 M フッ化ナトリウム、： L M

2

パラ-トロフエ-ルホスフェート、 2 μ Μ DTT、 0. 5 M フエ-ルメチルスルホ -ルフルオリド（PMSF)を加えた 1 X細胞溶解バッファー (Cell Signaling社製）を 100 /z LZwell添カ卩し、氷上で 20分間放置した後、 15, OOOrpmにて 4°Cで 30分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液とした。細胞溶解液は Coomassie Plus— 200 Pr otein Assay Reagent (Pierce社製）を用いて定量した。一部の細胞溶解液は、 5 X SDS サンプルバッファーをカ卩え、熱変性させた（以下、細胞溶解サンプルと称する）。これらのサンプルを 5— 20% SDS— PAGEにより分離、 1次抗体および 2次抗体で染色後、 ECL試薬（Amersham Biosciences社製）または ECL Plus試薬（ Amersham Biosciences社製）を用いて検出した。各蛋白質を検出するための 1 次抗体として、ゥサギ抗 p38 MAP Kinaseポリクローナル抗体（Cell Signaling 社製）、ゥサギ抗 MKK3ポリクローナル抗体（Cell Signaling社製）、ゥサギ抗 MK K6ポリクローナル抗体（R&D Systems社製）、ゥサギ抗 SAPKZJNKポリクローナル抗体（Cell Signaling社製）、ゥサギ抗 p44Z42 MAP Kinaseポリクローナル抗体（Cell Signaling社製）、およびゥサギ抗 MAST205ポリクローナル抗体を用いた。リン酸ィ匕蛋白質を検出するための 1次抗体として、ゥサギ抗リン酸化 p38 M AP Kinase (Thrl80ZTyrl82)ポリクローナル抗体（Cell Signaling社製）、ゥサギ抗リン酸化 MKK3ZMKK6 (Serl89Z207)ポリクローナル抗体（Cell Signa ling社製）、ゥサギ抗リン酸化 SAPKZjNK(Thrl83ZTyrl85)ポリクローナル抗体（Cell Signaling社製）、およびゥサギ抗リン酸化 p44Z42 MAP Kinase (Thr 202ZTyr204)ポリクローナル抗体（Cell Signaling社製）を用いた。 2次抗体として、 HRP結合ロバ抗ゥサギ IgGポリクローナル抗体（Amersham Biosciences社製 )を用いた。

[0265] 図 4の左パネルに各蛋白質の検出結果を示す。 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、ソルビトール刺激の有無に関わらず、 MAST205が検出されなかった。コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では MAST205が検出され、該細胞における MAST205の発現量はソルビトール刺激の有無に関わらず同程度であった。 p38 MAPK, MKK6、 MKK3、 JNK、および ERK1Z2の発現量は、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞および MAST siRNAをトランスフエクシヨンした細胞で、ソルビトール刺激の有無に関わらず、ほぼ同程度であった

[0266] この結果から、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンすることにより、 MAST2 05の発現が阻害されることが確認できた。

[0267] 図 4の右パネルにリン酸化蛋白質の検出結果を示す。コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、ソルビトール刺激をしないときには、 p38 MAPK, MK Κ3、 ΜΚΚ6、および JNKのリン酸化は検出されず、ソルビトール刺激により、これら蛋白質のリン酸化が検出された。一方、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、ソルビトール刺激によっても、 p38 MAPK, MKK3、 MKK6および J NKのリン酸化は検出されないか、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞と比較してその程度が低力つた。 ERK1Z2のリン酸ィ匕は、ソルビトール刺激の有無に関わらず、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞および MAST205 s iRNAをトランスフエクシヨンした細胞の!/、ずれにおヽても検出された。

[0268] MAST205の発現阻害により、ソノレビトーノレ刺激による p38 MAPK, MKK3、 M KK6、および JNKのリン酸化が著しく低減したことから、 MAST205力 ¾38 MAPK 、 MKK3、 MKK6および JNKのリン酸化に関与することが明らかになった。一方、 M AST205は、 MAPKKが関与する情報伝達経路のうち MEK1および MEK2の下流に位置する ERK1Z2のリン酸化に関与しなかった。このように、 MAST205は D CTN1と結合することにより、 MKK3および MKK6のリン酸化に関与し、さらにこれらの下流に位置する p38 MAPKのリン酸ィ匕に関与すると発明者らは考えている。 M AST205が関与する JNKのリン酸化過程は明らかではないが、 DCTN1および Zまたは TI AM 1との結合により MKK7ZMKK4を介して JNKのリン酸化に関与している力もしれない。

実施例 4

[0269] (細胞遊走試験）

細胞の遊走への MAST205の影響を、 MAST205の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しな、細胞とを用いて比較検討した。

[0270] 細胞は、 MDA— MB— 231細胞（ヒト乳癌細胞株）を用いた。細胞における MAS T205の発現阻害は MAST205 siRNAを用いて行った。ここで用いた MAST205 siRNAは、配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド (Dharmacon社へ製造委託)である。配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの ^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (TT)からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドコントロールとして、非特異的コントロールデュープレックス VIII (Dharmacon社製）を用いた。非特異的コントロールデュープレツタス VIIIは、配列番号 4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌタレォチドである（以下、コントロール siRNAと称することがある）。

[0271] 細胞遊走試験は、セルカルチャーインサート（上層）をコンパニオンプレート（下層）に載せることにより構成されたチャンバ一（以下、細胞遊走試験用チャンバ一と称することがある）を用いて実施した。セルカルチャーインサート（上層）には 0. 1% BSA を含む培養培地 (medium)に懸濁した細胞溶液を添カ卩し、コンパ-オンプレート（下層）には 10% ゥシ胎仔血清 (FBS)を含む培養培地を添加した。セルカルチャーィンサート（上層）に添加された細胞は、コンパ-オンプレート（下層）に添加された培養培地に含まれる 10% FBSにより遊走が誘導されると、該セルカルチャーインサートのメンブレンの細孔を通過してその裏面に移動する。細胞遊走のバックグラウンドとして、 10% FBS含む培養培地の代わりに 0. 1% BS Aを含む培養培地を用い、同様の方法で細胞遊走試験を実施した。

[0272] 細胞遊走の判定は、セルカルチャーインサートとして、フルォロブロックセルカルチヤ一インサート（BD Falcon社製）を用い、セノレ力ノレチヤ一インサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞を蛍光色素染色し、次、で蛍光強度を測定することにより実施した。蛍光強度は、フルォロブロックセルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞の数を反映する。

[0273] 細胞遊走への MAST205の影響の検討は、具体的には、次のように実施した。まず、細胞数 1 X 10⁶Z5mL mediumの MDA— MB— 231細胞を 6cm ディッシュに播種し、 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で 24時間培養した。培養培地

2

は、 10% FBSを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM)を用いた。次いで、 1 5 μ Lの Lipofectamine2000 (Invitrogen社製）を用いて、 500pmolの MAST2 05 siRNAまたはコントロール siRNA^O /z M siRNAを 25 L)を細胞にトランスフエクシヨンし、さらに 48時間、 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で培養し

2

た。その後、細胞を回収し、 0. 1% BSAZDMEMに再懸濁して細胞数 2 X 10⁵/ mLに調整した。細胞遊走試験用チャンバ一の上層であるフルォロブロックセル力ルチヤーインサートに細胞懸濁液を 250 Lずつ添カ卩し、該チャンバ一の下層である 24ゥエルプレート（BD Falcon社製）に 10% FBSZDMEMあるいは 0. 1% BS AZDMEMを 750 /z L添カ卩した。 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下でさら

2

に 6時間培養した後、フルォロブロックセルカルチャーインサートを 2mM カルセィンーAM (Calcein—AM、 Molecular Probes社製）を含むハンクス緩衝平衡塩溶液（HBSS)で 37°Cにて 1時間染色し、 FlexStation II (Molecular Devices社）を用いて Ex485ZEm530の波長で蛍光を測定した。 siRN Aをトランスフエクシヨンして培養した細胞の一部は、 6cm ディッシュに播種し、 MAST205の発現の測定に用いた。 MAST205の発現の測定は、細胞から蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティングにより実施した。細胞からの蛋白質の抽出およびウェスタンブロッテイングは実施例 1に記載の方法と同様の方法で実施した。

[0274] 図 5に示すように、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では MAST205の高い発現が認められたが、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では MAST205の発現はほとんど認められなかった。

[0275] 蛍光強度は、フルォロブロックセルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に遊走した細胞の数を反映する。すなわち、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞の遊走は、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞と比較して有意に低減していることが判明した。また、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、 MAST205の発現が著しく阻害されていることが分力つた。

[0276] このように、 MAST205を阻害することにより、細胞の遊走が抑制されることが明らカゝになった。

実施例 5

[0277] (細胞浸潤試験）

細胞の浸潤への MAST205の影響を、 MAST205の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しな、細胞とを用いて比較検討した。

[0278] 細胞は、 MDA— MB— 231細胞（ヒト乳癌細胞株）を用いた。細胞における MAS T205の発現阻害は MAST205 siRNAを用いて行った。ここで用いた MAST205 siRNAは、配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド (Dharmacon社へ製造委託)である。配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの ^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (TT)カゝらなるォ一バーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (T T)力もなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。コントロールとして、非特異的コントロールデュープレックス VIII (Dharmacon社製）を用いた。非特異的コントロールデュープレックス VIIIは、配列番号 4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと力なる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロール siRNAと称することがある）。

[0279] 細胞浸潤試験は、マトリゲルが被覆されたセルカルチャーインサート（上層）をコンパ-オンプレート（下層）に載せることにより構成されたチャンバ一（以下、細胞浸潤試験用チャンバ一と称することがある）を用いて実施した。マトリゲルが被覆されたセルカルチャーインサート（上層）には 0. 1% BSAを含む培養培地（medium)に懸濁した細胞溶液を添加し、コンパ-オンプレート（下層）には 10% ゥシ胎仔血清 (F BS)を含む培養培地を添加した。マトリゲルが被覆されたセルカルチャーインサート（上層）に添加された細胞は、コンパ-オンプレート（下層）に添加された培養培地に含まれる 10% FBSにより浸潤が誘導されると、セルカルチャーインサートに被覆されたマトリゲルに浸潤し、セルカルチャーインサートのメンブレンの細孔を通過してその裏面に移動する。細胞浸潤のノックグラウンドとして、 10% FBS含む培養培地の代わりに 0. 1% BSAを含む培養培地を用い、同様の方法で細胞浸潤試験を実施した。

[0280] 細胞浸潤の判定は、セルカルチャーインサートとして、 100 μ gZcm²でマトリゲル（ GROWTH FACTOR REDUCED BD MATRIGEL MATRIX, BD Bios ciences社製）を被覆したフルォロブロックセルカルチャーインサート（BD Falcon 社製)を用い、該セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層力も移動した細胞を蛍光色素染色し、次いで蛍光強度を測定することにより実施した。蛍光強度は、マトリゲルが被覆されたフルォロブロックセルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞の数を反映する。

[0281] 細胞浸潤への MAST205の影響の検討は、具体的には、次のように実施した。まず、細胞数 1 X 10⁶Z5mL mediumの MDA— MB— 231細胞を 6cm ディッシュに播種し、 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で 24時間培養した。培養培地は、 10% FBSを含む DMEMを用いた。次いで、 15 μ L( Lipofectamine2000 (Invitrogen社製）を用いて、 500pmolの MAST205 siRNAまたはコントロール si RNA (20 μ M siRNAを 25 μ L)を細胞にトランスフエクシヨンし、さらに 48時間、 37 °Cにて 5% CO /95% エアの条件下で培養した。その後、細胞を回収し、 0. 1 %

2

BSAZDMEMに再懸濁して細胞数 8 X 10⁵ZmLに調整した。細胞浸潤試験用チャンバ一の上層であるマトリゲルが被覆されたフルォロブロックセルカルチャーィンサートに細胞懸濁液を 250 Lずつ添カ卩し、該チャンバ一の下層である 24ゥエルプレート（BD Falcon社製）に 10% FBSZDMEMあるいは 0. 1 % BSA/DM EMを 750 L添加した。 37°C〖こて 5% CO /95% エアの条件下でさらに 24時

2

間培養した後、フルォロブロックセルカルチャーインサートを 2mM 力ルセイン A M (Calcein— AM、 Molecular Probes社製）を含むハンクス緩衝平衡塩溶液（H BSS)で 37°Cにて 1時間染色し、 FlexStation II (Molecular Devices社）を用いて Ex485ZEm530の波長で蛍光を測定した。 siRN Aをトランスフエクシヨンして培養した細胞の一部は、 6cm ディッシュに播種し、 MAST205の発現の測定に用いた。 MAST205の発現の測定は、細胞から蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッテイングにより実施した。細胞力もの蛋白質の抽出およびウェスタンブロッテイングは実施例 1に記載の方法と同様の方法で実施した。

[0282] 図 6— A〖こ示すよう〖こ、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では MAST205の高い発現が認められた力 MAST205 siRNAをトランスフエクションした細胞では MAST205の発現はほとんど認められなかった（図 6— B)。一方、 β チューブリンの発現量は、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞とコントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞でほぼ同程度であった。

[0283] 蛍光強度は、マトリゲルを被覆したメンブレンの裏面に移動した細胞の数を反映する。すなわち、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞のマトリゲルへの浸潤は、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞と比較して有意に低減していることが判明した。また、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、 MAST205の発現が著しく阻害されていることが分力つた。

[0284] このように、 MAST205を阻害することにより、細胞の浸潤が抑制されることが明らカゝになった。

実施例 6

[0285] (MAST205とキナーゼとの結合解析）

MAST205と 6種類のキナーゼ（p38 MAPK、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MK K7および MLK3)それぞれとの結合を、ヒト培養細胞における一過性共発現系を用いて免疫沈降法により検討した。以下、各キナーゼを候補蛋白質と称することがある

[0286] 細胞数 5. 0 X 10⁵Z5ml mediumの HEK293T細胞を 6cm ディッシュに播種し、 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で 24時間培養した。その後、 MAST2

2

05遺伝子を組み込んだ pClZMyc発現ベクター 4 gと、候補蛋白質遺伝子を組み込んだ pCI— neoZHA (p38 MAPK、 MKK3、 MKK4、 MKK7および MLK3 )または pCMV/HA発現ベクター（MKK6) 0. 5 ~4 μ gとを、 15 Lの FuGENE (Roche社製)を用いて細胞にトランスフエクシヨンした。これらベクターにより、それぞれ Myc— tagで標識された MAST205 (以下、 Myc— MAST205と称する）、 HA— tagで標識された p38 MAPK (以下、 HA— p38と称する）、 HA— tagで標識された MKK3 (以下、 HA— MKK3と称する）、 HA— tagで標識された MKK4 (以下、 HA — MKK4と称する）、 HA—tagで標識された MKK7 (以下、 HA—MKK7と称する）、 HA— tagで標識された MLK3 (以下、 HA— MLK3と称する）および HA— tagで標識された MKK6 (以下、 HA— MKK6と称する）が細胞内で発現される。コント口ールとして、 MAST205遺伝子を組み込んだ pClZMyc発現ベクターの代わりに M AST205遺伝子を組み込んで、な、pCl/Myc発現ベクター、ある、は候補蛋白質遺伝子を組み込んだ PCIZHA発現ベクターまたは pCMVZHA発現ベクターの代わりに、候補蛋白質遺伝子を組み込んで!/ヽな、_PCI/HA発現ベクターまたは pC MV/HA発現ベクターを、同様の方法でトランスフエクシヨンした細胞を調製した。トランスフエクシヨンして 48時間培養した後、培養上清を除き、細胞を冷たい PBSで 2 回洗浄し、 0. 01容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル (Sigma社製)を加えた I X 細胞溶解バッファー (Cell Signaling社製）を 500 μ L添カ卩した。氷上で 15分間放置した後、 15, OOOrpmにて 4°Cで 30分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液として用いた。細胞溶解液の蛋白質濃度は、クマシ一プラス 200 プロテインアツセィ試薬 (Pierce社製)を用いて定量した。細胞カゝら抽出した細胞溶解液は、各サンプル間で蛋白質量を同一にし、 0. 1% BSAでブロッキングした 80 1^ (50% vZv)のプロテイン G セファロース 4 ファストフロー（Amersham Biosciences社製）をカロえ、 4°Cで 1時間回転させて攪拌した。その後、 10, OOOrpmにて 4°Cで 1分間遠心処理し、その上清を回収した。回収した細胞溶解液の一部は、 2 X SDS サンプルバッファーを加え、熱変性させた (以下、細胞溶解液サンプルと称する)。回収した上清に 1 μ gの抗体をカ卩え、 4°Cで一晩回転させて攪拌した。その後、 0. 1% BSAでブロッキングした 80 ;z L (50% vZv)のプロテイン G セファロース 4 ファストフローをカロえ、 4°Cで 2時間回転させて攪拌した。次いで、 10, OOOrpmにて 4°Cで 1分間遠心処理し、その上清を除去した。 500 Lの I X細胞溶解バッファーをカ卩え、 10, OOOr pmにて 4°Cで 1分間遠心処理し、その上清を除去した。この洗浄操作を 3回繰り返した後に、 2 X SDS サンプルバッファーを 50 /z Lカ卩え、吸着した蛋白質を抽出し熱変性させた (以下、免疫沈降サンプルと称する)。細胞溶解液サンプルおよび免疫沈降サンプルを 5— 20% SDS— PAGEにより分離し、 1次抗体および 2次抗体で染色後、 ECL試薬（Amersham Biosciences社製）または ECL Plus試薬（Amersha m Biosciences社製)を用いて蛋白質の検出を行った。免疫沈降サンプルの調製および各種蛋白質の検出には、ゥサギ抗 c— Mycポリクローナル抗体 (A14、 Santa

Cruz Biotechnology社製）、マウス抗 c— Mycモノクローナル抗体（9E10、ゥェスタンプロッテイングに 1： 1000倍希釈して使用、 Santa Cruz社製）マウス抗 HAモノクローナル抗体（12CA5、ウェスタンブロッテイングに 1： 1000倍希釈して使用、 Ro che社製）、および HRP結合ャギ抗マウス IgGポリクローナル抗体（ウェスタンブロッテイングに 1： 2000倍希釈して使用、 Cell Signaling社製)を用いた。

図 7に、 MAST205と p38 MAPK、 MLK3または MKK6との結合解析の結果を示す。図 7の右上パネルに示すように、 Myc— MAST205と HA— p38、 HA -ML K3または HA— MKK6とを共発現させた細胞（レーン 4、 6および 8)から、ゥサギ抗 c — Mycポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、 IP： Mycと示す）において、 Myc— MAST205と HA— p38、 HA— MLK3または HA— MKK6 との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、 Mycと HA— p38、 HA— MLK3 または HA— MKK6とを共発現させた細胞（レーン 3、 5または 7)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、 Myc— MAS205と HA— p38、 HA— MLK3または HA

— MKK6の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降は HA— p38、 HA

— MLK3および HA— MKK6のレジンへの非特異的吸着によるものではなぐ Myc

— MAST205と HA—p38、 HA— MLK3および HA— MKK6それぞれとの結合を示すものと判定した。また、 Myc— MAST205を発現させた力 SHA— p38、 HA— M LK3および HA— MKK6のいずれをも発現させていない細胞（レーン 2)、並びに M yc— MAST205、 HA— p38、 HA— MLK3および HA— MKK6のいずれをも発現させていない細胞（レーン 1)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。 Myc— MAST205発現細胞力調製したサンプルにおける Myc— MAST205の発現は、ウェスタンブロッテイングにより確認できた（図 7 の右下パネルおよび左下パネル：レーン 2、 4、 6および 8)。また、 HA— p38、 HA— MLK3または HA— MKK6を発現させた細胞における各蛋白質の発現も、ゥエスタンブロッテイングにより確認できた（図 7の左上パネル：レーン 3— 8)。

具体的には、 Myc— MAST205とHA—p38、 HA— MLK3または HA— MKK6 とを共発現させた細胞の細胞溶解液をゥサギ抗 c Mycポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図 7の右上パネル：レーン 4、 6および 8)について、マウス抗 HAモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行った結果、 HA— p38、 HA— MLK3またはHA—MKK6を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、 Mycと HA— p38、 HA—MLK3またはHA— MKK6とを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 7の右上パネル：レーン 3、 5および 7)では、 HA— p38、 HA— MLK3または HA— MKK6を示すバンドは検出されなかった。また、 Myc— MAST205とHAを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 7の右上パネル：レーン 2)、および Mycと HAを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 7の右上パネル:レーン 1)では HAを示すバンドし力検出されな力つた。

[0289] 上記結果から、 MAST205と p38 MAPK, MLK3および MKK6それぞれとが細胞内で結合することが明らかになった。

[0290] 図 8に、 MAST205と MKK3との結合解析の結果を示す。図 8の右上パネルに示すように、 Myc— MAST205と HA— MKK3を共発現させた細胞（レーン 4)から、ゥサギ抗 c Mycポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、 IP： Mycと示す）において、 Myc— MAST205と HA—MKK3との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、 Mycと HA— MKK3を共発現させた細胞（レーン 3)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、 Myc— MAST205とHA— MKK3の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降は HA—MKK3のレジンへの非特異的吸着によるものではなぐ Myc— MAST205と HA— MKK3の結合を示すものと判定した。また、 Myc— MAST205を発現させたがHA—MKK3を発現させてぃない細胞（レーン 2)、並びに Myc— MAST205および HA—MKK3をいずれも発現させていない細胞（レーン 1)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。 Myc— MAST205発現細胞力調製したサンプルにおける Myc— MAST205の発現は、ウェスタンブロッテイングにより確認できた（図 8 の右下パネルおよび左下パネル：レーン 2および 4)。また、 HA— MKK3を発現させた細胞における HA—MKK3の発現も、ウェスタンブロッテイングにより確認できた（図 8の左上パネル：レーン 3および 4)。

[0291] 具体的には、 Myc— MAST205と HA— MKK3を共発現させた細胞の細胞溶解液をゥサギ抗 c Mycポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図 8の右上パネル：レーン 4)について、マウス抗 HAモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果、 HA— MKK3を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、 Mycと HA— MKK3を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 8の右上パネル：レーン 3)では、 HA— MKK3を示すバンドは検出されなかった。また、 Myc— MAST205とHAを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 8の右上パネル：レーン 2)、および Mycと HAを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 8の右上パネル:レーン 1)では HAを示すバンドし力検出されな力た。

[0292] 上記結果から、 MAST205と MKK3が細胞内で結合することが明らかになった。

[0293] 図 9に、 MAST205と MKK4との結合解析の結果を示す。図 9の右上パネルに示すように、 Myc— MAST205と HA—MKK4を共発現させた細胞（レーン 3)から、ゥサギ抗 c Mycポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、 IP： Mycと示す）において、 Myc— MAST205と HA—MKK3との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、 Mycと HA— MKK4を共発現させた細胞（レーン 2)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、 Myc— MAST205とHA— MKK3の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降は HA—MKK4のレジンへの非特異的吸着によるものではなぐ Myc— MAST205と HA— MKK4の結合を示すものと判定した。また、 Myc— MAST205および HA— MKK3をいずれも発現させていない細胞（レーン 1)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。 Myc— MAST205発現細胞から調製したサンプルにおける My c MAST205の発現は、ウェスタンブロッテイングにより確認できた（図 9の右下パネルおよび左下パネル：レーン 1および 3)。また、 HA— MKK4を発現させた細胞における HA—MKK4の発現も、ウェスタンブロッテイングにより確認できた（図 9の左上パネル：レーン 2および 3)。

[0294] 具体的には、 Myc— MAST205と HA— MKK4を共発現させた細胞の細胞溶解液をゥサギ抗 c Mycポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図 9の右上パネル：レーン 3)について、マウス抗 HAモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果、 HA—MKK4を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、 Mycと HA— MKK4を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 9の右上パネル：レーン 2)では、 HA— MKK4を示すバンドは検出されなかった。また、 Mycと HAを共発現させた細胞力も同様に調製した免疫沈降サンプル（図 9の右上パネル：レーン 1)では HAを示すバンドしか検出されなかった。

[0295] 上記結果から、 MAST205と MKK4が細胞内で結合することが明らかになった。

[0296] 図 10に、 MAST205と MKK7との結合解析の結果を示す。図 10の右上パネルに示すように、 Mvc— MAST205と HA—MKK7を共発現させた細胞（レーン 4)から、ゥサギ抗 c Mycポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、 I P : Mycと示す）において、 Myc— MAST205と HA—MKK7との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、 Mycと HA— MKK7を共発現させた細胞（レーン 3)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、 Myc - MAST205と H A - MKK7の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降は HA—MKK7のレジンへの非特異的吸着によるものではなぐ Myc— MAST205と HA— MKK7の結合を示すものと判定した。また、 Myc— MAST205を発現させたがHA— MKK7を発現させてぃない細胞（レーン 2)、並びに Myc— MAST205および HA— MKK7をいずれも発現させていない細胞（レーン 1)から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかつた。 Myc— M AST205発現細胞力調製したサンプルにおける Myc— MAST205の発現は、ウェスタンブロッテイングにより確認できた（図 10の右下パネルおよび左下パネル：レーン 2および 4)。また、 HA— MKK7を発現させた細胞における HA—MKK7の発現も、ウェスタンブロッテイングにより確認できた（図 10の左上パネル：レーン 3および 4)。

[0297] 具体的には、 Myc— MAST205と HA— MKK7を共発現させた細胞の細胞溶解液をゥサギ抗 c Mycポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図 10の右上パネル：レーン 4)について、マウス抗 HAモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行った結果、 HA— MKK7を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、 Mycと HA—MKK7を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 10の右上パネル：レーン 3)では、 HA— MKK7を示すバンドは検出されなカゝつた。また、 Myc— MAST205と HAを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 10の右上パネル：レーン 2)、および Mycと HAを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図 10の右上パネル:レーン 1)では HAを示すバンドしか検出されな力つた。

[0298] 上記結果から、 MAST205と MKK7が細胞内で結合することが明らかになった。

実施例 7

[0299] (MAST205発現阻害による MKK4のリン酸化阻害）

MAST205の発現を阻害することにより、 JNKのリン酸ィ匕が阻害された (実施例 3参照)。 JNKは、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られており、 MKK7/MKK4によってリン酸ィ匕されることによりその機能が調節されて、る。

[0300] そこで、 MAST205の発現阻害による JNKのリン酸化阻害が、 MAST205による MKK4の機能阻害に起因するカゝ否かを解析した。 MKK4は、ストレス刺激によりリン酸ィ匕されて活性ィ匕する。ストレス刺激による MKK4のリン酸ィ匕を、 MKK4の機能の指標として測定した。具体的には、ストレス刺激による MKK4のリン酸ィ匕を、 MAST2 05の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しな、細胞とを用いて比較検討した。

[0301] 細胞は、 HeLa細胞を用いた。 HeLa細胞は、 40 m メッシュによりろ過してから用いた。

[0302] 細胞における MAST205の発現阻害は、 MAST205 siRNAを用いて行った。ここで用いた MAST205 siRNAは、配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド (Dharmacon社へ製造委託)である。配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの^末端に、 2個のデォキシチミジル酸（ TT)力もなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号 5 に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号 2に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの^末端に、 2個のデォキシチミジル酸 (TT)力なるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。コントロールとして、非特異的コントロールデュープレックス VIII (Dharmacon社製)を用いた。非特異的コントロールデュープレックス VIIIは、配列番号 4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるォリゴヌクレオチドと力なる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロール _Si

RNAと称することがある）。

[0303] 具体的には、 5 X 10⁵ZlmL mediumの HeLa細胞を 6ゥエルプレートの各ゥエルに播種し、 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で 24時間培養した。次いで、

2

7. 5 μ Lの Lipofectamine2000 (Invitrogen社製）を用いて、 250pmolの MAST 205 siRNAまたはコントロール siRNAを細胞にトランスフエクシヨンした（最終液量は 3mL)。 37°Cにて 5% CO /95% エアの条件下で 24時間培養後、細胞を回

2

収し、 4等分にして 12ゥエルプレートにまきなおし、さらに 24時間、 37°Cにて 5% C O /95% エアの条件下で培養した。次いで、 0. 4M ソルビトールで 20分間、ま

2

たは、 20ngZmLの IL— 1で 15分間、細胞を刺激した。刺激後、培養上清を除去し、冷 TBSにて 2回洗浄後、 0. 01容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル (Sigma社製）、およびそれぞれ終濃度で 1. 5mM MgCl 、 M フッ化ナトリウム、： L M

2

パラ-トロフエ-ルホスフェート、 2 μ Μ DTT、 0. 5 M PMSFをカ卩えた 1 X細胞溶解バッファー (Cell Signaling社製）を 100 μ L/well添カ卩し、氷上で 20分間放置した後、 15, OOOrpmにて 4°Cで 30分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液とて用いた。細胞溶解液は Coomassie Plus— 200 Protein Assay Reagent (Pier ce社製)を用いて定量した。一部の細胞溶解液は、 5 X SDS サンプルバッファーを加え、熱変性させた（以下、細胞溶解サンプルと称する）。これらのサンプルを 5— 20 % SDS— PAGEにより分離し、 1次抗体および 2次抗体で染色後、 ECL試薬 (Am ersham Biosciences社製)ま 7こ ίま ECL Plusgrvi薬 (Amersham Biosciences社製)を用いて検出した。蛋白質を検出するための 1次抗体として、ゥサギ抗 SEK1Z MKK4ポリクローナル抗体（ウェスタンブロッテイングに 1： 500希釈して用いた、 Cell Signaling社製）、ゥサギ抗 MAST205ポリクローナル抗体（ウェスタンブロッテイングに 1： 1000希釈して用いた、スクラム社へ製造委託）、およびゥサギ抗 j8—チューブリンポリクローナル抗体（ウェスタンブロッテイングに 1： 300希釈して用いた、 Santa Cmz社製)を用いた。リン酸ィ匕蛋白質を検出するための 1次抗体として、ゥサギ抗リン酸化 SEK1ZMKK4 (Thr261)ポリクローナル抗体（ウェスタンブロッテイングに 1 ： 500希釈して用いた、 Cell Signaling社製）を用いた。 2次抗体として、 HRP結合ロバ抗ゥサギ IgGポリクローナル抗体（ウェスタンブロッテイングに 1： 2000希釈して用 Vヽ 7こ、 Amersham Biosciences社:^) 用ヽ 7こ。

[0304] 図 11の各パネルにそれぞれ、 MAST205、リン酸化 MKK4 (図中、 P— MKK4と示す） MKK4、および j8—チューブリン（図中、 13 tubulinと示す）をウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す。

[0305] リン酸化 MKK4 (図 11、左から 2番目のパネル中で矢印により示す）は、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンし且つソルビトール刺激または IL 1刺激した細胞で検出された（レーン 2および 3)。それに対し、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、ソルビトール刺激や IL—1刺激を行っても、リン酸ィ匕 MKK4が検出されなかった（レーン 5および 6)。ソルビトール刺激や IL— 1刺激を行わな、場合は、 MAST205 siRNAのトランスフエクシヨンの有無に関らず、リン酸化 MKK4は検出されなかった（レーン 1および 4)。

[0306] MAST205の発現（図 11、左パネル中で矢印により示す）は、コントロール siRNA をトランスフエクシヨンした細胞にぉ、て検出され、その発現量はソルビトール刺激や I L—1刺激の有無に関わらずほぼ同程度であった（レーン 1— 3)。一方、 MAST205 siRNAをトランスフエクシヨンした細胞では、 MAST205の発現はほとんど検出されなかった（レーン 4 6)。 MKK4の発現（図 11、左から 3番目のパネル中で矢印により示す）は、コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした細胞および MAST205 si RNAをトランスフエクシヨンした細胞の!/、ずれにおヽても検出され、その発現量はソルビトール刺激や IL 1刺激の有無に関わらずほぼ同程度であった。また、内因性蛋白質である ι8—チューブリンの発現量力用いたいずれの細胞溶解液においてもほぼ同程度であることから、ウェスタンブロッテイングに用いた細胞溶解液中の蛋白質量は、いずれのレーンにおいてもほぼ同程度であることが明らかである。

[0307] MAST205の発現阻害により、ソルビトール刺激または IL— 1刺激による MKK4のリン酸ィ匕が著しく低減したことから、 MAST205が MKK4のリン酸ィ匕に関与することが明らかになった。一方、 MAST205の発現を阻害することにより、 JNKのリン酸ィ匕が阻害された (実施例 3参照)。また、 MAST205は MKK4と結合した (実施例 6)。したがって、 MAST205は MKK4と結合することにより、 MKK4のリン酸化に関与し、さらにこれらの下流に位置する JNK3のリン酸ィ匕に関与すると発明者らは考えている。

産業上の利用可能性

[0308] 本発明によれば、 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。具体的には本発明により、 MAST205の発現、 MAST205と DCTN1の結合、 MAST205と TIAM1の結合、 MAST205と MLK3の結合、 MAST205と MKK3の結合、 MAST205と MKK4の結合、 MAS T205と MKK6の結合、 MAST205と MKK7の結合、 MAST205と p38 MAPK の結合、および MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性から選ばれる少なくとも 1を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。 MAST205の発現および Zまたは機能を阻害することにより、癌転移、血管新生、および免疫炎症応答の抑制を実施できると発明者らは考えている。

[0309] 本発明は、細胞の遊走および浸潤、癌転移、血管新生、並びに免疫炎症応答に関する基礎的研究直に有用である。さらに、癌転移、血管新生を伴う疾患、炎症性疾患の防止および Zまたは治療に有用である。

配列表フリーテキスト

[0310] 配列番号 1 :MAST205。

配列番号 1 : (512)： (785)キナーゼドメイン。

配列番号 1 : (1105)： ( 1186) PDZドメイン。

配列番号 2： MAST205遺伝子の発現を阻害するために該遺伝子の塩基配列に基づ、て設計された RNA。

配列番号 3：配列番号 2に記載の塩基配列を有し、その^末端に dTdTを有する設計された RNAZDNA。

配列番号 4：非特異的コントロールデュープレックス VIIIを構成するセンス RNA。配列番号 5 :配列番号 2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、その^末端に dTdTを有する設計された RNAZDNA。

Claims

請求の範囲

[1] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

205kDa)の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法。

[2] MAST205の機能力下記の群力も選択される 1つ以上の機能である請求項 1に記載の細胞の遊走阻害方法：

(D MAST205と DCTNl (dynactin 1)の結合、

(2) MAST205と TIAM1 (T— cell lymphoma invasion and metastasis 1) の結合、

(3) MAST205と MLK3 (mixed liniage kinase 3)の結合、

(4) MAST205と MKK3 (mitogen— activated protein kinase kinase 3)の結合、

(5) MAST205と MKK4 (mitogen— activated protein kinase kinase 4)の結合、

(6) MAST205と MKK6 (mitogen— activated protein kinase kinase 6)の結合、

(7) MAST205と MKK7 (mitogen— activated protein kinase kinase 7)の結合、

(8) MAST205と p38 MAPK(p38 mitogen -activated protein kinase)の結合、

および

(9) MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性。

[3] MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性力 DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である請求項 2に記載の細胞の遊走阻害方法

[4] 細胞が癌細胞である請求項 1に記載の細胞の遊走阻害方法。

[5] 細胞が内皮細胞である請求項 1に記載の細胞の遊走阻害方法。

[6] MAST205に対する RNA干渉により MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する請求項 1に記載の細胞の遊走阻害方法。

[7] MAST205に対する RNA干渉が MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行う RNA干渉である請求項 6に記載の細胞の遊走阻害方法。

[8] MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項 7に記載の細胞の遊走阻害方法。

[9] MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項 7に記載の細胞の遊走阻害方法。

[10] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

205kDa)の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害剤。

[11] MAST205の機能力下記の群力も選択される 1つ以上の機能である請求項 10に記載の細胞の遊走阻害剤：

(D MAST205と DCTNl (dynactin 1)の結合、

(3) MAST205と MLK3 (mixed liniage kinase 3)の結合、

(4) MAST205と MKK3 (mitogen— activated protein kinase kinase 3)の結合、

(5) MAST205と MKK4 (mitogen— activated protein kinase kinase 4)の結合、

(6) MAST205と MKK6 (mitogen— activated protein kinase kinase 6)の結合、

(7) MAST205と MKK7 (mitogen— activated protein kinase kinase 7)の結合、 (8) MAST205と p38 MAPK(p38 mitogen -activated protein kinase)の結合、

および

(9) MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性。

[12] MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性力 DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である請求項 11に記載の細胞の遊走阻害剤。

[13] 細胞が癌細胞である請求項 10に記載の細胞の遊走阻害剤。

[14] 細胞が内皮細胞である請求項 10に記載の細胞の遊走阻害剤。

[15] MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む請求項 10に記載の細胞の遊走阻害剤。

[16] MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項 15に記載の細胞の遊走阻害剤。

[17] MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項 15に記載の細胞の遊走阻害剤。

[18] 請求項 1から 9のいずれか 1項に記載の細胞の遊走阻害方法を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法。

[19] 請求項 10から 17のいずれ力 1項に記載の細胞の遊走阻害剤を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法。

[20] 請求項 10から 17のいずれ力 1項に記載の細胞の遊走阻害剤を含んでなる癌の転移抑制剤。

[21] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

205kDa)の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制方法。

[22] MAST205の機能力下記の群力も選択される 1つ以上の機能である請求項 21に記載の血管新生の抑制方法：

(D MAST205と DCTNl (dynactin 1)の結合、

(3) MAST205と MLK3 (mixed liniage kinase 3)の結合、

(4) MAST205と MKK3 (mitogen— activated protein kinase kinase 3)の結合、

(5) MAST205と MKK4 (mitogen— activated protein kinase kinase 4)の結合、

(6) MAST205と MKK6 (mitogen— activated protein kinase kinase 6)の結合、

(7) MAST205と MKK7 (mitogen— activated protein kinase kinase 7)の結合、

(8) MAST205と p38 MAPK(p38 mitogen -activated protein kinase)の結合、

および

(9) MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性。

[23] MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性力 DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である請求項 22に記載の血管新生の抑制方法。

[24] MAST205に対する RNA干渉により MAST205の発現および Zまたは機能を阻害する請求項 21に記載の血管新生の抑制方法。

[25] MAST205に対する RNA干渉が MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行う RNA干渉である請求項 24に記載の血管新生の抑制方法。

[26] MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項 25に記載の血管新生の抑制方法。

[27] MAST205に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項 25 に記載の血管新生の抑制方法。

[28] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

205kDa)の発現および Zまたは機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制剤。

[29] MAST205の機能力下記の群力も選択される 1つ以上の機能である請求項 28に記載の血管新生の抑制剤：

(D MAST205と DCTNl (dynactin 1)の結合、

(3) MAST205と MLK3 (mixed liniage kinase 3)の結合、

(4) MAST205と MKK3 (mitogen— activated protein kinase kinase 3)の結合、

(5) MAST205と MKK4 (mitogen— activated protein kinase kinase 4)の結合、

(6) MAST205と MKK6 (mitogen— activated protein kinase kinase 6)の結合、

(7) MAST205と MKK7 (mitogen— activated protein kinase kinase 7)の結合、

(8) MAST205と p38 MAPK(p38 mitogen -activated protein kinase)の結合、

および

(9) MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性。

[30] MAST205のセリンスレオニンキナーゼ活性力 DCTN1および Zまたは TIAM1に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である請求項 29に記載の血管新生の抑制剤。

[31] MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む請求項 28に記載の血管新生の抑制剤。

[32] MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項 31に記載の血管新生の抑制剤。

[33] MAST205に対する RNA干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド力配列表の配列番号 3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項 31に記載の血管新生の抑制剤。

[34] 細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であって、 MAST205 (mic rotuoule associated testis specific ¾T protein kinase— 205kDa)および Zまたは下記の群力選択される 1つ以上の蛋白質とある化合物 (被検化合物）とを接触させ、 MAST205と該蛋白質との結合を検出するシグナルおよび Zまたはマ一力一を使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と該蛋白質との結合を阻害する力否かを決定することを含む同定方法：

(i) DCTNl (dynactin 1)、

Ui TIAMl (T— cell lymphoma invasion ana metastasis 1J、

Uii) MLK3 (mixed liniage kinase 3)、

(iv) MKK3 (mitogen— activated protein kinase kinase 3)、

ι,ν MKK4 mitogen— activated protein Kinase kinase 4)、

(vi) MKK6 (mitogen— activated protein kinase kinase 6)、

(vii) MKK7 (mitogen— activated protein kinase kinase 7)、

および

(vni p38 MAPK(p38 mitogen― activated protein kinase)。

[35] MAST205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

- 205kDa)と DCTN1 (dynactin 1)の結合を阻害する化合物の同定方法であつて、 MAST205および Zまたは DCTN1とある化合物（被検化合物）とを接触させ、 MAST205と DCTN1の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と DCTN1の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。

[36] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase — 205kDa)と TIAM1 (T— cell lymphoma invasion and metastasis 1)の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは TIAM1とある化合物 (被検化合物）とを接触させ、 MAST205と TIAM1の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAS T205と TIAM1の結合を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法。

[37] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase — 205kDa)と MLK3 (mixed liniage kinase 3)の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは MLK3とある化合物（被検化合物）とを接触させ、 MAST205と MLK3の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205と MLK3の結合を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法。

[38] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase — 205kDa)と MKK3 (mitogen— activated protein kinase kinase 3)の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは MKK3とある化合物 (被検化合物）とを接触させ、 MAST205と MKK3の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマ一力一の存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST 205と MKK3の結合を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法。

[39] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase — 205kDa)と MKK4 (mitogen— activated protein kinase kinase 4)の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは MKK4とある化合物 (被検化合物）とを接触させ、 MAST205と MKK4の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマ一力一の存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST 205と MKK4の結合を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法。

[40] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

— 205kDa)と MKK6 (mitogen— activated protein kinase kinase 6)の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは MKK6とある化合物 (被検化合物）とを接触させ、 MAST205と MKK6の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマ一力一の存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST 205と MKK6の結合を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法。

[41] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

— 205kDa)と MKK7 (mitogen— activated protein kinase kinase 7)の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは MKK7とある化合物 (被検化合物）とを接触させ、 MAST205と MKK7の結合を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマ一力一の存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST 205と MKK7の結合を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法。

[42] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

— 205kDa)と p38 MAPK (p38 mitogen - activated protein kinase)の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは P38 MAP Kとある化合物（被検化合物）とを接触させ、 MAST205と ρ38 ΜΑΡΚの結合を検出するシグナルおよび Ζまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Ζまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物力 MAST205と ρ38 ΜΑΡΚの結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。

[43] 細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であって、 MAST205 (mic rotuoule associated testis specific ¾T protein kinase— 205kDa)とあ化合物 (被検化合物）とを接触させ、 MAST205のリン酸ィ匕活性を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカ一の存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205 のリン酸ィ匕活性を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法。

[44] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

- 205kDa)による DCTN 1 (dynactin 1)のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは DCTN 1とある化合物（被検化合物）とを接触させ、 MAST205による DCTN 1のリン酸化を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205による DCTN 1 のリン酸ィ匕を阻害するカゝ否かを決定することを含む同定方法。

[45] MAS Γ205 (microtubule associated testis specific ST protein Kinase

— 205kDa)による TIAM 1 (T— cell lymphoma invasion and metastasis 1 )のリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法であって、 MAST205および Zまたは TI AM Iとある化合物（被検化合物）とを接触させ、 MAST205による TIAM 1のリン酸化を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物が MAST205による TIAM 1のリン酸化を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。

[46] 下記 A群から選択される 1つ以上の成分と、下記 B群力選択される 1つ以上の成分とを有してなる試薬キット：

ここで、 A群は、

a) ΜΑ¾ Γ205 (.microtubule associated testis specific S Γ protein kma se - 205kDa) ,

(b) MAST205をコードするポリヌクレオチド、

(d)上記 (c)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなり、 B群は、

(e) DCTNl (dynactin 1)および TIAM1 (T—cell lymphoma invasion and metastasis 1)から選ばれるいずれか 1の蛋白質、

(f)上記 (e)の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、

(h)上記 (g)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなる。

[47] 下記 A群から選択される 1つ以上の成分と、下記 B群力選択される 1つ以上の成分とを有してなる試薬キット：

ここで、 A群は、

(b) MAST205をコードするポリヌクレオチド、

(d)上記 (c)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなり、

B群は、

u) MLKd (mixed liniage kinase 3)、 MKK3 (mitogen— activated protein kinase kinase 3)、 MKK4 (mitogen— activated protein kinase Kinase 4)、 MKK6 (mitogen— activated protein kinase kinase 6)および p38 M APK (p38 mitogen - activated protein kinase)から選ばれるいずれ力 1の蛋白質、

(j)上記 (i)の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、

(1)上記 (k)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなる。

[48] 下記 A群から選択される 1つ以上の成分と、下記 B群力選択される 1つ以上の成分とを有してなる試薬キット：ここで、 A群は、

(a) MAST205 (microtubule associated testis specific ST protein Kina se- 205kDa) ,

(b) MAST205をコードするポリヌクレオチド、

(d)上記 (c)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなり、

B群は、

、m) MLK 5 (mixed liniage kinase 3)、 MKK4 (mitogen— activated protei n kinase kinase 4)、 MKK7 (mitogen— activated protein kinase kinase 7)および JNK(c— Jun N- terminal kinase)から選ばれるいずれか 1の蛋白質

(n)上記 (m)の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、

(p)上記 (o)の組み換えベクターを含有する形質転換体、

からなる。