WO2007015456A1

WO2007015456A1 - 分析方法、及び該分析方法に用いる装置

Info

Publication number: WO2007015456A1
Application number: PCT/JP2006/315140
Authority: WO
Inventors: Masaru Kato; Toshimasa Toyooka; Kumiko Kato
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2005-08-03
Filing date: 2006-07-31
Publication date: 2007-02-08
Also published as: JP2007040816A; JP4139829B2

Abstract

【課題】キャピラリー電気泳動、及び検出装置を組み合わせて、陽イオン性、陰イオン性及び非イオン性物質を一括して分離、検出できる分析方法を提供する。　　【解決手段】キャピラリー電気泳動装置、及び検出装置を用いる分析方法であって：該キャピラリー電気泳動装置に、充填剤の充填領域、及び非充填領域を有する分離用キャピラリーを装着する工程；該分離用キャピラリーにおいて、該充填領域と該非充填領域との境界面に、分析試料を配置する工程；該分離用キャピラリーに電圧を印加する工程；該分離用キャピラリー内に該分析試料中の被分離物質を移動させるのに必要な圧力を加える工程；及び前記工程で得られた各分画を検出装置で分析する工程を有する、該分析方法。　　

Description

明細書

分析方法、及び該分析方法に用いる装置

技術分野

[0001] キヤビラリ一電気泳動装置、及び検出装置を組み合わせて用いる分析方法に関する。さらに詳細に述べると、分離用キヤビラリ一の改良することにより、陽イオン性、陰イオン性及び非イオン性物質を一括して分離検出することを可能にした分析方法、及び該分析方法に用いる装置に関するものである。

背景技術

[0002] 従来、食品工業、製薬業、化学工業等における研究、開発及び品質管理において、陽イオン性、陰イオン性及び非イオン性物質が様々な方法で分離、検出を行ってきた。

しかし、これらの検出はそれぞれの物質の性質に応じて、個別に行われてきた。例えば、陰イオン性物質を分離、検出する場合、イオンクロマトグラフィー (IC)、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、キヤピラリー電気泳動 (CE)などの方法がある。そして、高感度で高選択性を有するキヤビラリ一電気泳動 Z質量分析装置 (CE/MS)を用いたイオン性物質の分析法も開発されているが (特許文献 1)、やはり陽イオン性、及び非イオン性物質は個別に分離、検出する必要があった。

[0003] また、同様に各種アミノ酸を分離、分析する場合、やはり従来力様々な方法が使用されており、短時間で一括してアミノ酸を分析することができるキヤピラリー電気泳動 Z質量分析装置 (CE/MS)を用いた分析方法も開発されて!ヽるが (特許文献 2)、該方法は、陽イオン性物質、及び陰イオン性物質を個別に測定する必要があり、さらに非イオン性物質に適用することはできな力つた。

また、無機陰イオン、有機酸、アミノ酸、糖類を一括して分析するため、キヤビラリ一電気泳動を用いて、 pH 11.0以上の泳動バッファを使用し、塩基性条件下で、間接吸光度法により、分析する方法が開発されている（特許文献 3)。しかし、この方法は、陰イオン性物質を分離、分析する方法であって、陽イオン性物質、及び非イオン性物質は別途分析する必要があった。 [0004] さらに、キヤピラリー電気泳動と電圧補助マイクロ液体クロマトグラフィーを組み合わせて、酸性、中性、及び塩基性物質を一括して分析する方法 (非特許文献 1)も開発されている。しかし、該方法は各物質に対する分解能が十分でなぐかつ質量分析計に接続することができないなどの問題があった。

なお、近年、生体内で産生される代謝物質全体を網羅的に解析するメタボロームの研究が進展し、従来のゲノム、プロテオーム等に用いられていた解析技術だけでなく、物質の網羅的研究分野に対応した網羅的な分析技術が特に必要とされて!/、る (非特許文献 2)。

特許文献 1：特開 2003-035698号公報

特許文献 2 :特開 2001-083119号公報

特許文献 3：特開平 11-337524号公報

非特許文献 1 : I.S. Lurieらの論文， Analytical Chemistry, Vol.70, p.p. 4563-4569, 19 98

非特許文献 2：「LC/イオントラップ MSによる大腸菌メタボローム解析システムの解析」、ぶんせき、第 11卷、第 658頁〜第 660頁、 2004年

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] キヤピラリー電気泳動装置、及び検出装置を組み合わせて、陽イオン性、陰イオン性及び非イオン性物質を一括して分離、検出できる分析方法、及び該分析方法に用いる装置を提供する。

課題を解決するための手段

[0006] 前記課題を解決するために研究を行った結果、本件発明者は、充填剤が充填された充填領域、及び非充填領域を有する分離用キヤピラリーを用いて、分析試料をキャピラリー電気泳動することにより、陽イオン性、陰イオン性及び非イオン性物質を一括して、効率よぐかつ高分離能で分離できるという知見を得た。本発明は、かかる知見に基づ、てなされたものである。

[0007] したがって、本発明は、キヤビラリ一電気泳動装置、及び検出装置を用いる分析方法であって：該キヤビラリ一電気泳動装置に、充填剤の充填領域、及び非充填領域を有する分離用キヤピラリーを装着する工程；

該分離用キヤビラリ一において、該充填領域と該非充填領域との境界面に、分析試料を配置する工程；

該分離用キヤビラリ一に電圧を印加する工程；

該分離用キヤビラリ一内に該分析試料中の被分離物質を移動させるのに必要な圧力を加える工程;及び

前記工程で得られた各分画を検出装置で分析する工程を有する、該分析方法を提供する。

なお、本発明の分析方法では、前記分離用キヤビラリ一内に該分析試料中の被分離物質を移動させるのに必要な圧力を加える工程において、該分離用キヤビラリ一内で該分析試料中の被分離物質が、充填領域末端と連結した検出装置に移動するよう圧力を加えるのが好ましい。

[0008] さらに本発明は、キヤビラリ一電気泳動装置、及び検出装置を含む分析装置であつて、該分離用キヤビラリ一が、充填剤の充填領域、及び非充填領域を有するキヤビラリーである、分析装置を提供する。

なお、本発明の分析装置は、さらに、分析試料中の被分離物質を、充填領域末端と連結した検出装置に移動するよう圧力を加える手段を有するのが好ましい。

発明の効果

[0009] 本発明の分析方法、及び装置を使用することにより、陽イオン性、陰イオン性及び非イオン性物質を効率的に分離し、かつ高い分離能を得ることができ、また、該分離装置を、必要に応じて質量分析計を含む各種検出装置に直接接続することができる発明を実施するための最良の形態

[0010] まず、本発明で用いる、キヤピラリー電気泳動装置について説明する。図 1に示されているように、該電気泳動装置は、分離用キヤピラリー 2と、陽極 3、陰極 4、泳動緩衝液 5を収納する容器、電源 7、ネブライザ一ガス導入口 8、シース液導入口 9、及びエアポンプ 10を備えている。該陽極は白金電極が好ましい。また、本電気泳動装置では、電源 7により、陽極 3と陰極 4との間に、試料成分の分離に必要な電圧、通常、 0.05〜45 kV、好ましくは 1〜35 kV、特に好ましくは 4〜30 kVの電圧を印加する。また、該キヤビラリ一に加える圧力は、特に制限する必要はないが、通常、 0.005〜100 ba r、好ましくは 0.005〜20 bar,特に好ましくは 0.005〜12 barである。

[0011] また、前記電圧を印加する時間は、前記キヤビラリ一の長さ、内径、試料の性質などで異なるが、通常、 0.5〜360分間、好ましくは 1〜90分間、特に好ましくは 5〜60分間である。

前記キヤビラリ一は、図 1の泳動緩衝液を入れた容器を密閉し、エアポンプ 10などにより加圧される。なお、該電気泳動装置の末端は、検出すべき成分に応じた検出装置に接続されている。該検出装置は、特に制限されないが、電気化学検出器、蛍光検出器、及び質量分析計 (MS)などがあり、特に質量分析計が好ましい。

[0012] 本発明で用いる分離用キヤビラリ一は、充填剤で満たされている充填領域と、非充填領域を有する。該キヤビラリ一の内径は、分離する試料によって異なるが、通常 2 m〜4.6 mm、好ましくは 10〜250 μ m、特に好ましくは 20〜100 μ mである。また、該キャピラリーの長さは、分離する試料によって異なる力通常 0.5〜500 cm,好ましくは 1 〜200 cm、特に好ましくは 5〜100 cmである。また、キヤピラリーの該充填領域の長さは、特に制限されるものではないが、全長に対し、通常 0.1〜95%、好ましくは 0.1〜8 0%、特に好ましくは 0.1〜50%である。

[0013] 前記分離用キヤビラリ一の充填領域の作製は、汎用されている充填剤を充填する方法に加えて、キヤピラリー内にモノリス型の充填剤を形成する方法で行うことができる。該充填剤としては、球形や粉砕型等の形状、その表面の細孔径ゃ細孔容量に特に制限はなぐまたその材質もシリカ、アルミナ、ポリスチレン、デキストラン、ポリアタリルアミドなどの様々な材質で調製された充填剤の使用が可能である。またその表面への化学修飾基に関しても、ォクタデシル基、ォクチル基、ァミノプロピル基、フエ二ル基、光学活性基を始め、様々な化学修飾基を導入することが可能である。またェンドキヤッビング処理を行った充填剤も行ってヽな、充填剤の使用も可能である。キヤピラリー内で充填剤を作製するモノリス型カラムの場合は、シリカに加えて有機化合物や炭素などにより調製したモノリス体表面に、前記化学修飾基の導入やエンドキヤッビング処理を必要に応じて行ったモノリス体を用いることができる。

[0014] しかし、充填剤を充填する手法を用いて長、充填領域を作製した場合、カラムの背圧が高くなることから、充填領域の長さを短くする、もしくは充填剤の粒子径を大きくするなどの工夫が必要であることから、モノリス型の充填剤の方が好ましい。

[0015] 本発明では、泳動液として、検出に ESI-MSを用いる場合、揮発性の溶媒として酢酸、ギ酸、アンモニア、トリエチルァミン、エタノールアミンゃそれらの組み合わせた溶液を使用できる。さらに必要に応じてメタノールゃァセトニトリルなどを添加して調製した溶液の使用も可能である。さらに添加剤としてペンタデカフルォロオクタン酸 (CF (

3

CF ) COOH)等をカ卩えることも可能である。該泳動液の pHについては、泳動液の pH

2 7

が試料の官能基の解離状態を反映するため pHを低くするほど、多くの試料がプラスの電荷を帯びて、る可能性が高、ことから、陽イオン性物質の高速分離に適しており、逆に pHを高くするほど、多くの試料がマイナスの電荷を帯びている可能性が高いことから、陰イオン性物質の高速分離に適している。しかし、本発明の分析法は、試料の電荷状態に依存せず、全ての物質の分離を可能にする手法であることから、全ての pH範囲での使用が可能である。

[0016] さらに検出に ESI-MSではなく MALDI-MS、電気化学検出、可視紫外部吸収、蛍光等を使用した場合には、上記の溶液に加えて、リン酸、ホウ酸、 Tris溶液又は該溶液にメタノールゃァセトニトリルを混合したもの、さらにそれらにトリフルォロ酢酸、 1-ペンタスルホン酸 Na、 1-へキサスルホン酸 Na、 1-ヘプタスルホン酸 Naなどを添カ卩した溶液ち用いることがでさる。

また、本発明で分析する試料は、キヤピラリーで泳動、及び非電気的に移動できるものであれば特に制限されるものではない。例を挙げると、食品、血液、血清などの生体サンプル、汚水などがあり、さらにキヤビラリ一の中で破壊できる細胞そのものや、被覆された物質、例えばリボソームなどを試料として用いることができる。

[0017] 次に本発明の試料の成分分離過程について説明する。図 2に示すように、充填剤の充填領域と非充填領域を有する分離用キヤピラリーを用意する。次いで、該キヤピラリーを泳動緩衝液で満たし、加圧などの手段により、分析試料を非充填領域と充填領域の境界面に移動させる。続いて、適切な電圧を印加して陽イオン性物質、及び陰イオン性物質を移動させる。この際、充填領域、及び非充填領域には、その末端にある電極に向い、それぞれ反対の電荷を有する物質が移動する。続いて、電圧の印加を止め、非充填領域側力加圧することにより、電気的中性物質を充填領域に移動させる。加圧を継続することにより、図 2の e)に示されているように分離された成分が充填領域末端に移動し、該末端部と連結した検出装置により検出される。なお、図 2の c)の電圧の印加と d)非充填領域末端力の加圧を同時に行い、該試料を同時に分離することちできる。

[0018] 次に本発明の試料として細胞を用いる場合の成分分離過程について説明する。図 3に示すように、充填剤の充填領域と非充填領域を有する分離用キヤピラリーを用意する。次いで、該キヤビラリ一を泳動緩衝液で満たし、加圧などの手段により、分析する試料細胞を非充填領域と充填領域の境界面に移動させる。続いて、該細胞を、超音波、電気的刺激、イオン強度変化、及び薬物などで破壊した後、適切な電圧を印加して陽イオン性物質、及び陰イオン性物質を移動させる。この際、充填領域、及び非充填領域には、その末端にある電極に向い、それぞれ反対の電荷を有する物質が移動する。続いて、電圧の印加を止め、非充填領域側から加圧することにより、電気的中性物質を充填領域に移動させる。加圧を継続することにより、図 3の!)に示されて！ヽるように分離された成分が充填領域末端に移動し、該末端部と連結した検出装置により検出されることになる。なお、図 3の e)の電圧の印加と D非充填領域末端からの加圧を同時に行い、該試料を同時に分離することもできる。

実施例

[0019] (実施例 1)

(分析装置）

キヤピラリー電気泳動装置には、 Hewlett-Packard ^3DCEを用い、検出装置としてェレクトロスプレイ/イオンィ匕質量分析計 (ESI-MS)として AccuTOF (日本電子）を用いた。また、キヤビラリ一には、全長 90 cm、内径 75 μ mのフューズドシリカキヤピラリーを用いた。そのカラムの一方の端 60 cmに充填剤を充填した。該充填剤は下記の方法で調製した。

[0020] (充填剤とキヤビラリ一の調製）ポリエチレングリコール (分子量 1万、 Merck社) 80 mg、 0.01 M酢酸水溶液 833 μ 1、テトラメトキシシラン (TMOS、東京化成株式会社) 333 1を混合し、 0°Cで 45分間攪拌した。該溶液をキヤビラリ一の充填すべき領域のみ (60 cm)に充填した。該キヤビラリ一の両端に蓋をし、 40°Cで一晩放置した後、カラムの洗浄を行った。

[0021] その後、キヤピラリーを 1 Mアンモニア水で満たし、 90°Cで 1時間反応させた後、再びカラムを洗浄し、 100°Cで 30分間乾燥させた。次に、クロロトリメトキシシラン (東京化成株式会社) 40 μ 1、ジェチルァミン 80 μ 1、及びトルエン 880 μ 1の混合液でキヤビラリ一内を満たし、室温で反応をさせた。その後、カラムを洗浄し、分析に使用した。

[0022] (分離'検出条件）

泳動緩衝液として 1 Μギ酸水溶液を、シース液として 1%酢酸水溶液/メタノール = 1/1(ν/ν)、又は 10 mMアンモニア水/メタノール = l/l(v/v)を用いた。該シース液の流速を 10 /z l/minとした。 ESI-MSを用いる検出時のイオン化モードは、陰イオン測定時には ES卜モードで、また陽イオン測定時には ESI+モードとした。 ESI+モードでは、リング電圧 5 V、オリフィス 1電圧 30 V、オリフィス 2電圧 5 V、及び-一ドル電圧 3000 Vとした。また ESI-モードでは、リング電圧 -20 V、オリフィス 1電圧 -70 V、オリフィス 2電圧 -5V、及び-一ドル電圧 -2000 Vとした。

[0023] 5 barの圧力を 20秒間加えることで、分析試料をキヤビラリ一内に導入した。その後、 30 kVの電位差と 5 barの圧力差をカラムの両端に印加することで分析を行った。分離を行う電圧の印加は、試料を導入したキヤピラリーの端を陽極とし、逆の充填領域の端を陰極とした。

分析試料は、陽イオン性物質として各種アミノ酸、陰イオン性物質として、クェン酸、及び ATP、非イオン性物質として、チォ尿素、及び尿素を含む生体内物質の混合液を使用した。

図 4に、前記分析試料の混合液を分離し、かつ検出した分析結果のエレクト口フエログラムを示した。

[0024] 図 4において、 MTは各物質がキヤビラリ一に導入されて力質量分析計によって検出されるまでの時間を示している。各試料の質量数 Z電荷 (m/z)の数値から ±0.1の範囲にある m/zのイオンのクロマトグラムを示した。例えば Glyは分子量が 75.032であり、 ESI+で検出した場合、プロトンが 1つ付加するため質量数は 76.040となり、その時に電荷は +1であることから m/zは 76.040となる。そこで m/zが 75.940-76.141の範囲にあるイオンを検出したクロマトグラムが図 4の一番上のクロマトグラムであり、そのピークを Glyのピークとして、同様に試料溶液に入っている化合物の m/z±0.1の値で作製したクロマトグラムを並べたのが図 4である。各ピークの溶出時間を左側に、 m/zの値を右側に示した。

[0025] 言い換えると、本分離条件で正電荷を有する Glyは 4.959分に、 Alaは 5.109分に検出された。また非イオン性物質であるチォ尿素 (thiourea),及び負電荷を有するタエン酸は、それぞれ 5.942分と 5.675分に溶出した。したがって、本発明の方法により、キャピラリー電気泳動、及び検出装置を組み合わせて、陽イオン性、陰イオン性及び非イオン性物質を一括して分析できることは明らかである。

[0026] (実施例 2)

分離条件が異なる他は、実施例 1と同じ条件で前記試料の分析を行った。すなわち、前記試料導入後、最初の 2分間は 4 barの圧力を加え、次いで、 30 kVの電位差を 13分間印加し、最後に、 30 kVの電位差と 4 barの圧力差を 45分間、キヤビラリ一の両端に印加することで分析を行った。前記電圧の印加時には、前記試料を導入したキヤピラリーの非充填領域の端を陽極とし、かつ充填領域の端を逆に陰極とした。

[0027] 分析試料の分離、及び検出の結果をエレクト口フエログラムとして図 5に示した。本分離条件では、正電荷を有する Alaは 18.186分で検出され、また中性物質であるチォ尿素は、 19.319分で検出された。この実施例 2の結果からも、本発明の方法により、キャピラリー電気泳動、及び検出装置を組み合わせて、陽イオン性、陰イオン性及び非イオン性物質を一括して分析できることは明らかである。

図面の簡単な説明

[0028] [図 1]図 1は、本発明で用いるキヤピラリー電気泳動装置の概念図である。

[図 2]図 2は、本発明で用いる充填 Z非充填部を有するキヤビラリ一と、その物質の分離過程を示す図である。

[図 3]図 3は、分析試料として、細胞を用いた場合の物質の分離過程を示す図である [図 4]図 4は、実施例 1で行った分析の結果を示す、エレクト口フエログラムである。

[図 5]図 5は、実施例 2で行った分析の結果を示す、エレクト口フエログラムである。符号の説明

1·· .キヤビラリ一電気泳動装置

2" •キヤビラリ一

3·· '陽極

4·· ，陰極

5·· •泳動緩衝液

6·· '分離試料の流れ

7" '電源

8·· 'ネブライザ一ガス導入口

9·· 'シース液導入口

10· ··エアポンマ。

Claims

請求の範囲

[1] キヤビラリ一電気泳動装置、及び検出装置を用いる分析方法であって：

該キヤビラリ一電気泳動装置に、充填剤の充填領域、及び非充填領域を有する分離用キヤピラリーを装着する工程；

該分離用キヤビラリ一に電圧を印加する工程；

前記工程で得られた各分画を検出装置で検出する工程を有する、該分析方法。

[2] 前記分離用キヤビラリ一内に該分析試料中の被分離物質を移動させるのに必要な圧力を加える工程において、該分離用キヤビラリ一内で該分析試料中の被分離物質力充填領域末端と連結した検出装置に移動するよう圧力を加える、請求項 1記載の分析方法。

[3] 前記電圧の印加、及び該分析試料中の被分離物質を移動させるのに必要な圧力を加えることを同時に行う、請求項 1記載の分析方法。

[4] 前記電圧の印加を停止した後、さらに該分離用キヤビラリ一内に該分析試料中の被分離物質を移動させるのに必要な圧力を継続的に加える工程を含む、請求項 1記載の分析方法。

[5] 該充填剤の充填領域の長さが、該分離用キヤビラリ一長さの 5〜90%である、請求項 1記載の分析方法。

[6] 該分離用キヤビラリ一に印加する電圧が、 -50〜50 kVである、請求項 1記載の分析方法。

[7] 該分離用キヤピラリーに該電圧を 0.5〜360分間印加する、請求項 1記載の分析方法。

[8] 該分離用キヤピラリー内に加える圧力が 0.005〜100 barである、請求項 1記載の分析方法。

[9] 前記検出装置が、質量分析計である、請求項 1記載の分析方法。

[10] 前記分析試料が、細胞、又は被覆に内包された物質である、請求項 1記載の方法。

[11] キヤビラリ一電気泳動装置、及び検出装置を含む分析装置であって、該分離用キャピラリーが、充填剤の充填領域、及び非充填領域を有するキヤビラリ一である、分析装置。

[12] さらに、分析試料中の被分離物質を、充填領域末端と連結した検出装置に移動するよう圧力を加える手段を有する、請求項 11記載の分析装置。

[13] 該充填剤の充填領域の長さが、該分離用キヤビラリ一長さの 5〜90%である、請求項 11記載の分析装置。

[14] 前記検出装置が、質量分析計である、請求項 11記載の分析装置。