WO2007009404A1 - Formulaciones nasales de eporh con bajo contenido de ácido siálico para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central. - Google Patents

Formulaciones nasales de eporh con bajo contenido de ácido siálico para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central. Download PDF

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epo
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nasal
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Adriana Muñoz Cernada
Julio César GARCÍA RODRÍGUEZ
Yanier NUÑEZ FIGUEREDO
Zenia Pardo Ruiz
Jorge Daniel GARCÍA SELMAN
Iliana SOSA TESTÉ
David CURBELO RODRÍGUEZ
Janette Cruz Rodríguez
Nelvys SUBIROS MARTÍNEZ
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Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM)
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Definitions

  • the present invention relates to the Biopharmaceutical Industry and in particular to the production of a medicament for nasal administration of EPOrh with low content of sialic acid (basic) from Chinese hamster ovary cells by genetic engineering for the treatment of cerebrovascular, neurodegenerative and psychiatric diseases.
  • Erythropoietin is a glycoprotein hormone whose molecular weight ranges around 34kDa; The protein fraction consists of approximately 166 amino acids; It occurs in the kidney, liver and cells of the central nervous system and is involved in the proliferation, differentiation and maturation of erythrocytes and other hematopoietic cells.
  • the neuroprotective effects of EPOrh may be due to different factors within which they are: antagonism of glutamate-induced cytotoxicity, increase in the expression of antioxidant enzymes, decrease in the formation of free radical-mediated nitric oxide (NO), normalization of cerebral blood flow, influence on the release of neurotransmitters, promotion of neoangiogenesis, inhibition of apoptosis induced by excitotoxins and NO, increase in the expression of antiapoptotic genes, neurotropic effect, decrease in neuronal excitability, cerebral anti-inflammatory effect, inhibition of The apoptosis induced by kainate and the production of proinflammatory atokines, angiogenic and neurogenic effect and contributes to ischemic preconditioning and as a whole can justify the use of EPOrh in the treatment of cerebrovascular, neurodegenerative and psychiatric diseases.
  • antagonism of glutamate-induced cytotoxicity increase in the expression of antioxidant enzymes
  • EPOrh can prevent or reverse the neuronal death characteristic of many diseases of the central nervous system, such as ischemia, neurotrauma, and neurodegenerative and neuroinflammatory diseases.
  • neurodegenerative processes contribute to the triggering of the pathophysiology of schizophrenia, which is why neuroprotective drugs can be an effective therapeutic alternative for the treatment of this disease.
  • the CIPO-2074820 patent uses the nasal route for the administration of the protein, in this case cyclodextrin is used as a component of the formulation and also pursues a systemic absorption of EPO, so the protein also has to be acidic.
  • the CIPO-2353553 patent justifies the exogenous administration of the EPO for the treatment of cerebral ischemia, but as in the previous cases it is pursued that the protein passes directly or indirectly to the bloodstream to be effective, so that we are also in presence of EPO with high sialic acid content.
  • the CIPO-2408685 patent protects different EPO formulations, but its use is intended for the treatment of anemia, which is why it is acidic EPO, since the basic EPO does not promote the proliferation, differentiation and maturation of erythrocytes.
  • the CIPO-2437333 patent specifies that the protected formulations are from epoetin alfa, that is to say acid EPO.
  • This formulation can be used for the treatment and / or prevention of diseases of the central nervous system including cerebrovascular, neurodegenerative and psychiatric disorders, on an outpatient basis at the level of primary health care.
  • the advantages of the proposed solution include the use of EPOrh with low sialic acid content for therapeutic purposes allowing a greater protective effect with lower doses.
  • a rapid arrival at the site of action is achieved, which is critical when it comes to achieving a therapeutic effect against cerebral hypoxia.
  • the therapeutic window period In the specific case of cerebrovascular diseases, in the acute phase it is necessary to start the therapeutic intervention before certain processes of the ischemic cascade have occurred, which is called the therapeutic window period.
  • the nasal route of administration of basic EPOrh eliminates the risk of inducing erythropoiesis.
  • An increase in the concentration of erythrocytes increases the viscosity of the blood and compromises reperfusion after an occlusive or hemorrhagic episode, decreases cerebral blood flow and therefore hinders the arrival of oxygen and nutrients to the tissue.
  • the nasal route has greater advantages than other forms of administration, allowing rapid access to the brain, it is less invasive than the intravenous or intracerebroventricular one and a percentage of the EPOrh can reach the cerebrospinal fluid without having to pass the bloodstream before avoiding the hepatic first-pass metabolism and consequently its inactivation.
  • the nasal application route is not traumatic and eliminates surgical risks or other possible implications given by traumatic routes. It constitutes an alternative route of access to the brain without damaging the blood brain barrier.
  • the use of an alternative route to the vascular route ensures the arrival of the molecule to poor or non-irrigated areas of the central nervous system, by diffusion through the interstitial fluid.
  • bioadhesive polymers that increase the residence time of the EPOrh in Ia is followed as a strategy in this invention.
  • Nasal Cavity During the development of the formulation, other auxiliary substances or excipients are also incorporated, such as preservative substances, surfactants, pH regulators, isotonic agents and protein stabilizers; to obtain a stable physicochemical and microbiological formulation that maintains its therapeutic properties over time.
  • An EPOrh was used that contained in its molecule less than 40% sialic acid (basic) at a concentration from 0.5 to 2 mg / mL.
  • the formulations presented are liquid, colorless, transparent and free of mechanical impurities preparations with an apparent viscosity that ranges from 10 to 250 mPas using hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) as bioadhesive polymers in concentrations from 0.4 to 0.9%, hydroxypropylcellulose , (HPC) 0.2 to 0.8% and methylcellulose (MC) from 0.25 to 0.5%.
  • HPMC hydroxypropylmethylcellulose
  • the pH was adjusted in a range from 6.0 to 7.5 using mainly phosphate buffers and citrates in concentrations of 20 to 100 mM / L.
  • Osmotic pressure can be regulated with different isotonizers among which are: sodium chloride, mannitol, sorbitol, glucose, among others, in a range of 0.05 to 10 g / L
  • the preservative agents were: benzalkonium chloride of 0.01 to 0.02% in combination with disodium EDTA in concentrations of 0.01%, chlorobutanol of 0.3 to 0.5%, methylparaben of 0.02 to 0.035% and propylparaben of 0.01 to 0.02%.
  • nonionic surface active substances such as polyethylene sorbitan laurate (tween 20 to 80), cremofor RH 40, sorbitan trioleate (spam 35 to 80) were used, in a range of concentrations between 0.01 and 1 g / L.
  • Different amino acids were used as protein stabilizers, among which are: L-tryptophan, L-leucine, L-arginine hydrochloride and L- hydrochloride histidine in a concentration range between 0.1 and 10 mg / mL
  • the solvent used in all cases was water for injection.
  • a nasal buffer solution of NaH 2 PO 4 and Na 2 HPO 4 was used at a pH of 6.0 and a conductivity of 3.25 ms / cm.
  • the pH was controlled using a Sartorius pH meter and an Omega conductimeter.
  • the process performance is in a range between 75 - 95%. Table 1 shows the results obtained in the process:
  • EPOrh nasal formulation with low sialic acid content that uses HPMC bioadhesive polymer, histidine hydrochloride as a stabilizer, Tween 80 as a surface active substance and benzalkonium chloride as a preservative.
  • the preparation of the solution it is based on a volume of water for injection that represents 30% of the total volume of the formulation, it preserves the buffer, the buffers and the isotonizing agent. Moreover in a container of suitable capacity 15% of the total volume of the formulation of water for injection they are incorporated and heated 85-95 0 C, pulverizing the polymer with stirring strong and constant. Once the polymer has been wetted, the previously prepared solution is incorporated thereto with vigorous stirring until total homogenization. The agitation is reduced for the incorporation of the corresponding volume of basic EPOrh, the superficially active substance and the protein stabilizer, finally it is flush with water for injection to a final volume that represents 100% of the formulation. The formulation is filtered through a 0.2 ⁇ m cellulose acetate membrane and it is verified that the pH is maintained in the established range.
  • the composition of the finished form is as follows:
  • composition of the finished form is as follows:
  • EPOrh nasal formulation with low sialic acid content similar to example 2 but with Tween 20 as a superficially active substance.
  • composition of the finished form is as follows:
  • composition of the finished form is as follows:
  • composition of the finished form is as follows:
  • the preparation of the solution it is based on a volume of water for injection that represents 30% of the total volume of the formulation, in it the buffers are solubilized and the agent toner. Moreover in a container of suitable capacity 15% of the total volume of the formulation of water for injection are incorporated and heated between 90-95 0 C, the parabens are dissolved and the polymer incorporated by stirring strong and constant. Once the polymer has been wetted, the previously prepared solution is added thereto with vigorous stirring until total homogenization. The agitation is reduced for the incorporation of the corresponding volume of basic EPOrh, the superficially active substance and histidine hydrochloride and finally it is flush with water for injection to a final volume that represents 100% of the formulation. Subsequently, the formulation is filtered through a 0.2 ⁇ m cellulose acetate membrane and it is verified that the pH is maintained in the established range.
  • composition of the finished form is as follows:
  • EPOrh nasal formulation with low sialic acid content similar to the previous example but with methylcellulose as bioadhesive polymer.
  • composition of the finished form is as follows:
  • composition of the finished form is as follows:
  • composition of the finished form is as follows:
  • Example 12 Nasal formulation of EPOrh with low sialic acid content similar to example 7 but with chlorobutanol as an antimicrobial preservative.
  • composition of the finished form is as follows:
  • composition of the finished form is as follows:
  • EPOrh nasal formulation with low sialic acid content similar to example 12 but with Tween 20 as a superficially active substance.
  • composition of the finished form is as follows:
  • composition of the finished form is as follows:
  • Example 16 "In vitro" evaluation of the stimulatory action on cells of nervous origin of the nasal formulation of recombinant human erythropoietin with a low content of sialic acid
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • PC12 cells The cells were maintained undifferentiated in DMEM medium supplemented with 2 mM L-Glutamine, 100 Units / ml penicillin G, 100 micrograms / ml streptomycin (GIBCO), 10% (v / v) containing 1OmM Hepes Buffer. In the culture 10% total horse serum was used.
  • the homogenate thus obtained was kept in an ice bath and was used for the determination of the specific activity of the GST according to the Habig method. (Habig, WH, Pabst, JJ, and Jakoby, WB 1974; Biol. Chem. 249 (22): 7130-7139). Protein determination was performed by the Bradford method (Bradford MM. Anal. Biochem, 72, (176) 158). As a main result, it was obtained that the cells of nervous origin responded to the presence of the EPO by modifying the activity of the GST enzyme.
  • the plotted values (Fig. 1) represent the average value of three independent crops.
  • This graph shows the action of acid and basic erythropoietin on the enzymatic activity of GST in PC12 cell culture. In this graph we can observe how the cells of nervous origin respond to the presence of the EPO by modifying the activity of the GST enzyme. The response with recombinant human Erythropoietin with low sialic acid and acid content was similar.
  • Mongolian gerbils of both sexes were used, with a body weight between 60 and 70 grams, with water and ad limitum feeding, which were maintained in a 12-hour alternating cycle of light-dark throughout the experimental period.
  • the unilateral permanent occlusion (ULP) of the right carotid of the animals was performed, under deep anesthesia, for which the intraperitoneal route was used, as a diazepan pre-anesthetic (5.0 mg / Kg.); as a ketamine anesthetic (47 mg / kg) and 0.02 mg / kg of Atropine.
  • the right carotid was exposed under stereoscope, doubly linked and sectioned.
  • the falsely injured animals were obtained with the same manipulations but without binding or cutting the carotid.
  • the treatment consisted of the application in the nasal cavity of 10 ⁇ l of EPOrh or its vehicle every 8 h daily, from 1 hour after the operation until the 4th. day after the operation.
  • the spontaneous exploratory activity was also used, where the steepness on the hind legs that the rodents make when exploring a new vessel were counted.
  • a vertical cylindrical box 30 cm in diameter and 25 cm high was used as a container. Each gerbil was placed in the center of that box and the steepings were counted in an interval of 3 minutes.
  • the animals were perfused through the left ventricle with 4% formaldehyde in phosphate buffer solution (PBS) at pH 7.0. Brains were extracted and maintained in this solution for a few days. They were subsequently included in paraffin, sectioned at 4 ⁇ m and stained with hematoxylin and eosin. The sections were evaluated at 10x and 4Ox, without prior knowledge of their identity.
  • PBS phosphate buffer solution
  • FIG. 3 we can see the motor behavior of the gerbil of Mongolia in the cylinder. Significant functional damage appears in injured animals without treatment. Exploratory-motor activity appears depressed in untreated ischemic animals while in those treated with EPOrh, it remains similar to that of controls.
  • Figure 4 shows the neurological state of the animals 24 hours after the injury. The effect of the lesion and treatment with EPOrh by nasal route in the model of permanent unilateral ischemia on the body weight of the animals after 5 weeks is shown in Figure 5. The group of injured animals compared with the injured and treated groups or falsely injured showed a different weight curve behavior. Similar curves were obtained in the control and injured group treated, contrasting with the weight loss of the injured and untreated animals. This group could not exceed the average weight with which the experiment began.
  • Figure 8 shows M icrofotog raffias of the Gerbil hippocampus treated with EPOrh by nasal route.
  • the integrity of the CA1 sector in the treated animals can be noted.
  • pichnosis was observed throughout the right hemisphere as well as hemorrhages in the fimbria of the right hippocampus and in the parietal cortex of the right hemisphere, areas of edema, dense and diffuse chromatin in the right hemisphere. Pycnotic neurons in the hippocampus.
  • Example 18 Example 18:
  • the animals were sacrificed by cervical dislocation and decapitation, the brain was quickly removed from the cranial cavity and the tissue was immediately frozen at -70 degrees celcius.
  • the hippocampus, cerebral cortex and cerebellum regions of each animal were dissected with the help of a stereotactic atlas (Paxinos, G., and Watson, C. (1986). Academic Press, New York, pp 230-259).
  • a pool of each of these regions was formed and a homogenate of each region was prepared containing 1: 8 parts of tissue by 0.1 M phosphate buffer pH 7.0.
  • the cell-free liquid was obtained by centrifugation at 4 degrees celcius at 10,000 g for 30 minutes.
  • the presence of the labeled molecule in regions of the cerebellum indicates the passage of the BHE, on the other hand, the detection of the molecule at the level of regions not related to the olfactory pathway (cerebellum) indicates that not only the olfactory pathway is compromised in the passage of molecules to the brain, but a more general and rapid mechanism is participating, which can be diffusion through the mucus and subsequent permeation through discontinuities that occur in regions of the olfactory epithelium, particularly in the area of the cribriform sheet , which allows the arrival of recombinant human erythropoietin with low content of sialic acid to regions far from the olfactory pathway.
  • Figure 11 represents the passage through the nasal route of the recombinant human erythropoietin with low sialic acid content to olfactory bulb and cerebellum.
  • the figure represents in each bar the average value of six animals. It shows how recombinant human erythropoietin with low sialic acid content reaches regions of the brain in at least 5 minutes and over time it gradually decreases from the frontal region at caudal. After 60 minutes of application, there is still EPO in the olfactory bulb and cerebellum regions. Between 80 and 85% of the EPO that reaches the brain was detected in the olfactory bulbs, while about 20% was detected in the cerebellum after 5 minutes of application. After 30 minutes these concentrations almost equalize and after 60 minutes the cerebellum has 30% and only 10% of the radioactivity of the olfactory bulb.
  • the test was carried out in male New Zealand rabbits with a weight between 3-4 Kg that were anesthetized with intramuscular ketamine 40 mg / kg, subsequently 5 ml of blood were extracted from the central artery of the ear that were percutaneously injected into the magna cistern , the animals were monitored for 72 h.
  • the rabbits were divided into 3 experimental groups with 8 animals each: Group I: Non-injured animals Group II: Injured animals
  • Group III Injured animals + basic EPOrh 20 ⁇ g (example 5) The administrations of basic EPOrh were performed, 5 minutes after inducing the suranoid hemorrhage and repeated every 8 hours for 72 hours.
  • the degree of neurological damage was classified as: 1: There are no indications of damage. 2: Minimal damage.
  • the right carotid under anesthesia was linked to 36 glands in Mongolia and treated with 40 ul daily of EPOrh by nasal route (examples 10 and 11) for 7 days, beginning within 1 hour after surgery. Another 24 animals received similar processing and an equivalent amount of vehicle was administered. To 9 gérbiles the carotid was isolated without ligating it and constituted the control group.
  • the results show a smaller slope (closer to 0) in animals undergoing ischemia, one week after ischemia and in comparison with those treated with EPOrh and controls.
  • a smaller slope demonstrates a persistence of the animal in exploring this environment in the last two thirds, showing a loss of habituation that can be characterized as a cognitive dysfunction induced by ischemia.
  • the treatment with basic EPOrh prevents the onset of this dysfunction.
  • the behavior of the animals revealed a deterioration induced by the ischemia that could be expressed in a loss of the ability to nest, typical in males of this species, in an increase in aggressiveness and in a loss of the grooming behavior during the time they remained in the circular cylinder.
  • the results were compared using the chi-square independence test and were expressed in the table in percent:
  • the behavioral deterioration can be described as a reflection of the neuronal loss and other histopathological findings observed in the untreated group.
  • the treatment with EPOrh prevents at least partially the behavioral deterioration induced by the decrease in cerebral blood flow in the gerbil of Mongolia.
  • the results are relevant in the sense of suggesting a neuroprotective action of EPO rh capable of counteracting the functional deterioration of dementia of vascular origin in man.

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Abstract

La presente invención se relaciona con la Industria Biofarmacéutica y en particular con el desarrollo de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades cerebrovasculares, neurodegenerativas y siquiátricas que contiene como principio activo Eritropoyetina humana recombinante (EPOrh) con bajo contenido de ácido siálico. Durante la producción de EPOrh se obtiene esta glicoproteína con diferente contenido de ácido siálico cuando presenta menos de un 40% de su molécula protegida con ácido siálico (básica), no es biológicamente activa por vía sistémica, es inactivada por enzimas hepáticas. Sorprendentemente hemos encontrado que la EPOrh básica administrada por vía nasal tiene utilidades terapéuticas superiores a la ácida. Las formulaciones nasales de EPOrh básica que se presentan incorporan polímeros bioadhesivos que incrementan el tiempo de residencia en la cavidad nasal potenciando su efecto terapéutico, se incluyen además otras sustancias auxiliares tales como, sustancias preservantes, tenso activos, reguladores de pH, agentes isotonizantes y estabilizadores de proteína.

Description

FORMULACIONES NASALES DE EPOrh CON BAJO CONTENIDO DE ÁCIDO SIÁLICO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL.
Sector Técnico
La presente invención se relaciona con Ia Industria Biofarmacéutica y en particular con Ia producción de un medicamento para administrar por vía nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico (básica) a partir de células de ovario de hámster chino por ingeniería genética para el tratamiento de enfermedades cerebrovasculares, neurodegenerativas y siquiátricas. Técnica Anterior
La eritropoyetina (EPO) es una hormona glicoproteíca cuyo peso molecular oscila alrededor de 34kDa; Ia fracción proteica consta de 166 aminoácidos aproximadamente; se produce en el riñon, hígado y células del sistema nervioso central y está involucrada en Ia proliferación, diferenciación y maduración de los eritrocitos y otras células hematopoyéticas.
En 1998, Sakanaka y colaboradores reportaron las propiedades neuroprotectoras de Ia EPOrh frente al daño isquémico in vivo, después de Ia oclusión de Ia arteria carótida común, un modelo de isquemia global seguido por infusión de EPOrh en los ventrículos laterales de gerbils, los autores observaron una reducción del daño isquémico sobre las neuronas hipocampales CA1.
Los efectos neuroprotectores de Ia EPOrh pueden deberse a diferentes factores dentro de los que se encuentran: antagonismo de Ia citotoxicidad inducida por glutamato, aumento de Ia expresión de enzimas antioxidantes, disminución de Ia formación de oxido nítrico (NO) mediado por radicales libres, normalización del flujo sanguíneo cerebral, influencia sobre Ia liberación de neurotransmisores, promoción de Ia neoangiogenesis, inhibición de Ia apoptosis inducida por excitotoxinas y NO, aumento de Ia expresión de genes antiapoptóticos, efecto neurotrópico, disminución de Ia excitabilidad neuronal, efecto antiinflamatorio cerebral, inhibición de Ia apoptosis inducida por kainato y Ia producción de atocinas proinflamatorias, efecto angiogénico y neurogénicos y contribuye al precondicionamiento isquémico y en su conjunto pueden justificar el empleo de Ia EPOrh en el tratamiento de enfermedades cerebrovasculares, neurodegenerativas y psiquiátricas.
Las propiedades neuroprotectoras de la EPOrh pueden prevenir o revertir Ia muerte neuronal característica de muchas enfermedades del sistema nervioso central, como son isquemia, neurotrauma, y enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias.
También se ha descrito que los procesos neurodegenerativos contribuyen al desencadenamiento de Ia fisiopatología de Ia esquizofrenia, es por ello que los fármacos neuroprotectores pueden ser una alternativa terapéutica eficaz para el tratamiento de esta enfermedad.
Una vez que el organismo es expuesto a diferentes estados patológicos como pueden ser hipoglicemia, fuerte despolarización neuronal o por Ia generación de especies reactivas de oxígeno por parte de las mitocondrias, Ia expresión de Ia EPO aumenta notablemente.
Por otra parte Ia inflamación aumenta Ia lesión cerebral por varios mecanismos, incluso inhibe directamente Ia producción de EPO local. De hecho, aunque Ia EPO es endógenamente producida en el cerebro después de Ia isquemia, su expresión es inhibida notablemente por citocinas inflamatorias. Dicha inhibición disminuye Ia capacidad neuroprotectora de Ia EPO y justifica el por qué Ia administración exógena de EPOrh puede ser especialmente beneficiosa para el tratamiento de trastornos cerebrovasculares, neurodegenerativos y psiquiátricas.
Por otra parte es conocido que en Ia medida que Ia molécula de EPO presenta menos porciento de ácido siálico, mayor es Ia afinidad de esta con su receptor, facilitándose así Ia respuesta fisiológica.
El efecto neuroprotector de Ia EPOrh aplicada por vía intravenosa en modelos murinos de isquemia cerebral [LM Brines y cois, PNAS97 (19):10526-10531 , 2000], reduce el daño por Ia isquemia entre un 50 y 75%, así como su aplicación en humanos (WO 0354475). Sin embargo, los resultados clínicos y experimentales que utilizan Ia EPOrh acida humana recombinante, no han valorado el impacto negativo que puede tener Ia utilización de esta molécula a mediano plazo sobre Ia inducción de Ia eritropoyesis, ya que, dado Ia poca permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica (BHE) y Ia baja afinidad de los receptores de Ia EPO en el SNC son requeridas relativamente grandes cantidades de EPOrh por un tiempo relativamente largo para lograr el efecto farmacológico. Bajo estas condiciones, se corre el riesgo de que Ia viscosidad de Ia sangre se vea incrementada y con ella las posibilidades de que surjan eventos trombolíticos que desencadenen isquemia cerebral. Estas negativas consecuencias de Ia aplicación de EPO acida han sido reportadas como complicaciones en pacientes nefríticos tratados con esta molécula. Se han desarrollado estudios encaminados a Ia obtención de métodos que incrementen Ia permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica, Ia que se considera un paso crítico en Ia incorporación de sustancias al tejido cerebral (US 5260308; WO 8901343; US 4801575; US 5442043; JP 57146710 y JP 01149718). En muchos de estos métodos se involucran los llamados carrier o transportadores (US 5442043) formando un conjugado peptídico, o utilizan péptidos quiméricos (US 48015575) para Ia incorporación al cerebro de las sustancias. La preparación de liposomas que contiene eritropoyetina ha sido reportada (JP 08231417).
La utilización de Ia vía nasal para hacer llegar moléculas al SNC ha sido reportada para gangliosidos (US 4639437), así como, para agentes terapéuticos neuronales que llegan al cerebro a través de Ia absorción por Ia mucosa nasal y su posterior transportación a través de Ia vía olfatoria neural (EP 504263).
Existen varias patentes relacionadas con Ia protección de formulaciones líquidas de EPOrh, a continuación se refieren las más representativas: Preparaciones líquidas donde se emplea como principio activo Ia EPOrh, y Ia proteína en todos los casos es presentada en forma de inyectable (ejemplo: CIPO-2041989; CIPO-2353553), esta vía de administración es indicativa de que Ia EPO empleada es acida, es decir debe tener más de un 40% de Ia molécula cubierta con ácido siálico, pues de Io contrario esta es inactivada por Ia enzimas hepáticas y no sería clínicamente efectiva.
La patente CIPO-2074820 emplea Ia vía nasal para Ia administración de Ia proteína, en este caso se usa ciclodextrina como componente de Ia formulación e igualmente se persigue una absorción sistémica de Ia EPO, por Io que Ia proteína también tiene que ser acida.
Existen publicaciones científicas que se refieren al empleo de biodhesivos para aumentar el tiempo de residencia de proteínas en Ia cavidad nasal [Polireddy D y cois, Internacional Journal of Pharmaceutics (127):115 - 133, 1996], sin embargo, no existen reportes del empleo de los mismos en formulaciones que contienen EPOrh.
La patente CIPO-2353553 justifica Ia administración exógena de Ia EPO para el tratamiento de Ia isquemia cerebral, pero al igual que en los casos anteriores se persigue que Ia proteína pase directa o indirectamente al torrente sanguíneo para ser efectiva, por Io que igualmente estamos en presencia de EPO con alto contenido de ácido siálico.
La patente CIPO-2408685 protege diferentes formulaciones de EPO, pero su empleo está destinado al tratamiento de Ia anemia, por Io que se trata de EPO acida, ya que Ia EPO básica no promueve Ia proliferación, diferenciación y maduración de los eritrocitos.
La patente CIPO-2437333 específica que las formulaciones protegidas son a partir de epoetin alfa, es decir de EPO acida.
En todos los casos expuestos anteriormente y revisados en Ia literatura se hace referencia a Ia EPOrh acida, nuestra patente persigue Ia protección de formulaciones líquidas a partir de EPOrh básica. Divulgación de Ia Inveción
Durante Ia producción de EPOrh se obtiene Ia glicoproteína con diferente contenido de ácido siálico, cuando Ia proteína presenta menos de 40% de su molécula protegida con ácido siálico (básica) se elimina pues no es biológicamente activa por vía sistémica. Esta EPOrh básica o de bajo contenido de ácido siálico representa el 70% de Ia producción total EPOrh. Sorprendentemente hemos encontrado que Ia EPOrh básica administrada por vía nasal puede tener utilidades terapéuticas superiores a Ia acida; los resultados de esta invención permiten aprovechar las isoformas básicas de Ia EPOrh que actualmente no se recuperan y son de fácil adquisición. Esto representa una gran ventaja económica pues permite recuperar Io que actualmente constituye un desecho de Ia producción de EPOrh.
Esta formulación puede ser empleada para el tratamiento y/o Ia prevención de las enfermedades del sistema nervioso central incluyendo desórdenes cerebrovasculares, neurodegenerativos y siquiátricas, de forma ambulatoria a nivel de Ia asistencia primaria de salud. Las ventajas de Ia solución propuesta incluyen el empleo de Ia EPOrh con bajo contenido de ácido siálico con fines terapéuticos permitiendo un efecto protector mayor con menores dosis. Se logra una llegada rápida al sitio de acción Io cual es crítico a Ia hora de lograr un efecto terapéutico frente a Ia hipoxia cerebral. En el caso específico de las enfermedades cerebrovasculares, en Ia fase aguda es preciso comenzar Ia intervención terapéutica antes de que ciertos procesos de Ia cascada isquémica hayan ocurrido, a Io que se llama período de ventana terapéutica.
La vía nasal de administración de EPOrh básica elimina el riesgo de inducir eritropoyesis. Un incremento en Ia concentración de eritrocitos incrementa Ia viscosidad de Ia sangre y compromete Ia reperfusión después de un episodio oclusivo o hemorrágico, disminuye el flujo sanguíneo cerebral y por tanto dificulta Ia llegada de oxígeno y nutrientes al tejido.
La vía nasal posee mayores ventajas que otras formas de administración, permitiendo el rápido acceso al cerebro, es menos invasiva que Ia endovenosa o Ia intracerebroventricular y un porciento de Ia EPOrh puede llegar al líquido cefalorraquídeo sin tener que pasar antes al torrente sanguíneo evitándose así el metabolismo de primer paso hepático y por consiguiente su inactivasión. La vía de aplicación nasal no es traumática y elimina los riesgos quirúrgicos u otras posibles implicaciones dadas por vías traumáticas. Constituye una vía alternativa de acceso al encéfalo sin dañar Ia barrera hematoencefálica. La utilización de una vía alternativa a Ia vía vascular asegura Ia llegada de Ia molécula a zonas pobres o no irrigadas del sistema nervioso central, por difusión a través del fluido intersticial.
Teniendo en cuenta que una de las principales limitaciones del empleo de Ia vía nasal es el rápido aclaramiento mucociliar, se sigue como estrategia en esta invención el uso de polímeros bioadhesivos que incrementan el tiempo de residencia de Ia EPOrh en Ia cavidad nasal. Durante el desarrollo de Ia formulación se incorporan además otras sustancias auxiliares o excipientes tales como, sustancias preservantes, tensoactivos, reguladores de pH, agentes isotonizantes y estabilizadores de proteínas; para Ia obtención de una formulación estable físico-química y microbiológica que mantenga sus propiedades terapéuticas en el tiempo.
Se empleó una EPOrh que contenía en su molécula menos del 40% de ácido siálico (básica) a una concentración desde 0.5 a 2 mg/mL. Las formulaciones que se presentan son preparaciones líquidas, incoloras, transparentes y libres de impurezas mecánicas con una viscosidad aparente que se encuentra en un rango desde 10 a 250 mPas empleándose como polímeros bioadhesivos Ia hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en concentraciones desde 0.4 a 0.9%, hidroxipropilcelulosa, (HPC) 0.2 a 0.8% y metilcelulosa (MC) desde 0.25 a 0.5%.
El pH se ajustó en un rango desde 6.0 a 7.5 empleando principalmente buffer fosfatos y citratos en concentraciones de 20 a 100 mM/L.
La presión osmótica se puede regular con diferentes isotonizantes entre los que se encuentran: cloruro de sodio, manitol, sorbitol, glucosa, entre otros, en un rango de 0.05 a 10 g/L
Se emplearon como agentes preservantes: cloruro de benzalconio de 0.01 a 0.02% en combinación con EDTA disódico en concentraciones de 0.01%, clorobutanol de 0.3 a 0.5%, metilparabeno de 0.02 a 0.035% y propilparabeno de 0.01 a 0.02%.
Para evitar Ia adherencia de Ia proteína a las paredes del material de envase se emplearon sustancias superficialmente activas no iónicas como polietilensorbitan laurato (tween 20 al 80), cremofor RH 40, sorbitan trioleato (spam 35 al 80), en un rango de concentraciones entre 0.01 y 1 g/L.
Como estabilizantes de proteínas se emplearon diferentes aminoácidos, entre los que se encuentran: L-triptófano, L-leucina, clorhidrato de L-arginina y clorhidrato de L- histidina en un rango de concentraciones entre 0.1 y 10 mg/mL El solvente empleado en todos los casos fue agua para inyección.
Se realizaron pruebas de irritabilidad de Ia mucosa nasal en ratas, no encontrándose indicios de irritación a este nivel, Io cual adicionado con Ia magnifica tolerancia del producto, avala desde el punto de vista toxicológico el empleo de Ia EPOrh básica en humanos.
Los estudios de estabilidad mostraron un adecuado comportamiento de las concentraciones de proteína en el tiempo después de empleado el método de lowry (± 10%), el pH se mantuvo en el límite establecido.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN Ejemplo 1 :
Purificación de Ia EPOrh con bajo contenido de ácido siálico:
Para Ia obtención de Ia eritropoyetina básica con contenido de ácido siálico menor que el 40% se llevaron a cabo tres pasos cromatográficos básicamente, a partir de un material de gran complejidad y con una gran cantidad de proteínas contaminantes, ya que el mismo contiene 5 % de suero fetal bovino. Posteriormente se realiza un paso adicional para Ia obtención de las isoformas de interés.
Para Ia diafiltración y concentración de Ia EPOrh básica se empleó un sistema de ultrafiltración a escala de laboratorio (SARTOFLOW SLICE 200), acoplado a una bomba peristáltica (IP55 Watson-Marlow). Se utilizó una membrana Hydrosart de 10 kDa. Se trabajó a un flujo de 1.9 ± 0.25 imL/min, una presión de alimentación (P1) de 2.9 ± 0.25 bar, una presión del retenido (P2) de 0.65 ± 0.1 bar y una presión transmembrana (TM) de 1.8 ± 0.2 bar. Para Ia determinación de Ia concentración de Ia proteína se empleó un Espectrofotómetro (Ultrospec ™ 3100) a una λ= 280nm. Para el proceso de diafiltración se empleó una solución buffer nasal de NaH2PO4 y Na2HPO4 a un pH de 6.0 y una conductividad de 3.25 ms/cm. Se controló el pH utilizando un pHmetro Sartorius y un conductimétro Omega. El rendimiento del proceso está en un rango entre 75 - 95%. En Ia tabla 1 , se muestran los resultados obtenidos en el proceso:
Figure imgf000010_0001
Ejemplo 2:
Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico que emplea como polímero bioadhesivo HPMC, clorhidrato de histidina como estabilizante, Tween 80 como sustancia superficialmente activa y cloruro de benzalconio como preservo.
Método de preparación:
Para Ia elaboración de Ia solución se parte de un volumen de agua para inyección que representa el 30 % del volumen total de Ia formulación, en ella se solubilizan el preservo, los buffer y el agente isotonizante. Por otra parte en un recipiente de capacidad adecuada se incorporan el 15 % del volumen total de Ia formulación de agua para inyección y se calienta entre 85-95 0C, pulverizándose el polímero con agitación fuerte y constante. Una vez humectado el polímero se Ie incorpora al mismo Ia solución preparada con anterioridad agitando vigorosamente hasta homogenización total. Se disminuye Ia agitación para Ia incorporación del volumen correspondiente de EPOrh básica, Ia sustancia superficialmente activa y el estabilizante de proteína, finalmente se enrasa con agua para inyección hasta un volumen final que represente el 100 % de Ia formulación. Se filtra Ia formulación a través de una membrana de acetato de celulosa de 0.2 μm y se comprueba que el pH se mantiene en el rango establecido. La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 0.8 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Clorhidrato de histidina 1.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 80 0.25 mg/mL
Cloruro de sodio 7.4 mg/mL Ácido etilendiamino tetraacético 0.1 mg/mL disódico
Cloruro de benzalconio 0.2 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mi
Ejemplo 3:
Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo anterior pero con metilcelulosa como polímero bioadhesivo Método de preparación (similar al ejemplo 2):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 0.8 mg/mL
Metilcelulosa 3.0 mg/mL
Clorhidrato de histidina 1.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 80 0.25 mg/mL
Cloruro de sodio 7.4 mg/mL Ácido etilendiamino tetraacético 0.1 mg/mL disódico
Cloruro de benzalconio 0.2 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mi Ejemplo 4:
Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo 2 pero con Tween 20 como sustancia superficialmente activa.
Método de preparación (similar al ejemplo 2):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 0.8 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Clorhidrato de histidina 1.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 20 0.20 mg/mL
Cloruro de sodio 7.4 mg/mL Ácido etilendiamino tetraacético 0.1 mg/mL disódico
Cloruro de benzalconio 0.2 mg/mL
Agua para inyección . csp 1 mi
Ejemplo 5:
Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo anterior pero con 1.2 mg/ml de principio activo y sin clorhidrato de histidina como estabilizante de proteína. Método de preparación (similar al ejemplo 2):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 1.2 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 20 0.20 mg/mL
Cloruro de sodio 7.7 mg/mL Ácido etilendiamino tetraacético 0.1 mg/mL disódico
Cloruro de benzalconio 0.2 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mi
Ejemplo 6:
Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo 2 pero con 1.2 mg/ml de principio activo y sin clorhidrato de histidina como estabilizante de proteína.
Método de preparación (similar al ejemplo 2, sin incorporar clorhidrato de histidina):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 1.2 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 80 0.25 mg/mL
Cloruro de sodio 7.7 mg/mL
Ácido etilendiamino tetraacético 0.1 mg/mL disódico
Cloruro de benzalconio 0.2 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mi
Ejemplo 7:
Formulación a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico en forma de administración nasal similar al ejemplo 2 pero con metilparabeno y propilparabeno como preservativos antimicrobianos.
Método de preparación:
Para Ia elaboración de Ia solución se parte de un volumen de agua para inyección que representa el 30 % del volumen total de Ia formulación, en ella se solubilizan los buffer y el agente ¡sotonizante. Por otra parte en un recipiente de capacidad adecuada se incorporan el 15 % del volumen total de Ia formulación de agua para inyección y se calienta entre 90-95 0C, se solubilizan los parabenos y se incorpora el polímero con agitación fuerte y constante. Una vez humectado el polímero se adiciona al mismo Ia solución preparada con anterioridad agitando vigorosamente hasta homogenización total. Se disminuye Ia agitación para Ia incorporación del volumen correspondiente de EPOrh básica, Ia sustancia superficialmente activa y el clorhidrato de histidina y finalmente se enrasa con agua para inyección hasta un volumen final que represente el 100 % de Ia formulación. Posteriormente se filtra Ia formulación a través de una membrana de acetato de celulosa de 0.2μm y se comprueba que el pH se mantiene en el rango establecido.
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 0.8 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Clorhidrato de histidina 1.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 80 0.25 mg/mL
Cloruro de sodio 7.5 mg/mL
Metilparabeno 0.33 mg/mL
Propilparabeno 0.17 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mL
Ejemplo 8:
Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo anterior pero con metilcelulosa como polímero bioadhesivo.
Método de preparación (similar al ejemplo 6): La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 0.8 mg/mL
Metilcelulosa 3.0 mg/mL
Clorhidrato de histidina 1.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 80 0.25 mg/mL
Cloruro de sodio 7.5 mg/mL
Metilparabeno 0.33 mg/mL
Propilparabeno 0.17 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mL
Ejemplo 9:
Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo 7 pero con Tween 20 como sustancia superficialmente activa Método de preparación (similar al ejemplo 7):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 0.8 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Clorhidrato de histidina 1.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 20 0.20 mg/mL
Cloruro de sodio 7.5 mg/mL
Metilparabeno 0.33 mg/mL
Propilparabeno 0.17 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mL Ejemplo 10:
Formulación a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo anterior pero sin clorhidrato de histidina como agente estabilizador y glucosa como isotonizante.
Método de preparación (similar al ejemplo 7):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 1. 2 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 20 0.20 mg/mL
Glucosa 48.0 mg/mL
Metilparabeno 0.33 mg/mL
Propilparabeno 0.17 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mL
Ejemplo 11 :
Formulación a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo anterior pero con Tween 80 como sustancia superficialmente activa.
Método de preparación (similar al ejemplo 7):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 1. 2 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 80 0.25 mg/mL
Glucosa 48.0 mg/mL Metilparabeno 0.33 mg/mL
Propilparabeno 0.17 mg/mL
Agua para inyección csp 1 ml_
Ejemplo 12: Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo 7 pero con clorobutanol como preservativo antimicrobiano.
Método de preparación (similar al ejemplo 2):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 0.8 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Clorhidrato de histidina 1.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 80 0.25 mg/mL
Cloruro de sodio 6.2 mg/mL
Clorobutanol 5.0 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mL
Ejemplo 13:
Formulación a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo anterior pero con metilcelulosa como polímero bioadhesivo.
Método de preparación (similar al ejemplo 2): La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 0.8 mg/mL
Metilcelulosa 3.0 mg/mL
Clorhidrato de histidina 1.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 80 0.25 mg/mL
Cloruro de sodio 6.2 mg/mL
Clorobutanol 5.0 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mL
Ejemplo 14:
Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo 12 pero con Tween 20 como sustancia superficialmente activa.
Método de preparación (similar al ejemplo 2):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 0.8 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5.0 mg/mL
Clorhidrato de histidina 1.0 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 20 0.20 mg/mL
Cloruro de sodio 6.2 mg/mL
Clorobutanol 5.0 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mL Ejemplo 15:
Formulación nasal de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico similar al ejemplo 5 pero con clorobutanol como preservativo antimicrobiano.
Método de preparación (similar al ejemplo 2):
La composición de Ia forma terminada queda como sigue:
Componente Proporción
EPOrh básica 1.2 mg/mL
Hidroxipropilmetilcelulosa 5 mg/mL
Dihidrógeno fosfato de sodio 2 mg/mL
Hidrógeno fosfato disódico 0.7 mg/mL
Tween 20 0.20 mg/mL
Cloruro de sodio 6.5 mg/mL
Clorobutanol 5.0 mg/mL
Agua para inyección csp 1 mL
Ejemplo 16: Evaluación "in vitro" de Ia acción estimuladora sobre células de origen nervioso de Ia formulación nasal de eritropoyetina recombinante humana con un contenido bajo de ácido siálico
Para demostrar el efecto inductor sobre Ia actividad específica de Ia enzima Glutation- S-Transferasa (GST) de Ia EPO en células de origen nervioso, así como para demostrar que Ia Eritropoyetina acida y básica humana recombinantes, tienen un efecto similar sobre las células de origen nervioso, se realizó un estudio in vitro empleando células PC12. Las células fueron mantenidas indiferenciadas en medio DMEM suplementado con 2 mM de L-Glutamina, 100 Unidades/ml penicilina G, 100 microgramos/ml estreptomicina (GIBCO), 10% (v/v) conteniendo 1OmM de Tampón Hepes. En el cultivo se utilizó suero total de caballo al 10%. A las células se Ie añadieron 0,6 y 15 nanomolar de Eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico (ejemplos 5 y 6) y/o eritropoyetina acida. Como controles se añadieron similares cantidades de EPO previamente inactivadas por calor. Los valores de la actividad específica de Ia GST obtenidos en estos cultivos se consideró como un 100%. Para Ia determinación de Ia actividad específica de Ia GST, se empleó el homogenato de las células crecidas con EPO acida o básica, que fue realizado en un sistema de homogeneización todo de vidrio a 4 grados celcius, en Tampón fosfato 0,1 M pH 6,95. El homogenato libre de células se obtuvo por centrifugación a 16 000 X g a 4 grados celcius en una centrífuga refrigerada de alta velocidad. El homogeneizado así obtenido se mantuvo en baño de hielo y fue utilizado para Ia determinación de Ia actividad específica de Ia GST según el método de Habig. (Habig, W. H., Pabst, J.J., and Jakoby, W.B. 1974; Biol. Chem. 249 (22): 7130-7139). La determinación de proteínas se realizó por el método de Bradford (Bradford MM. Anal. Biochem, 72, (176) 158). Como resultado principal se obtuvo que las células de origen nervioso respondieron a Ia presencia de Ia EPO modificando Ia actividad de Ia enzima GST. Los valores graficados (Fig.1) representan el valor medio de tres cultivos independientes. Este gráfico muestra Ia acción de las eritropoyetinas acida y básica sobre Ia actividad enzimática de Ia GST en cultivo de célula PC12. En este gráfico podemos observar cómo las células de origen nervioso responden a Ia presencia de Ia EPO modificando Ia actividad de Ia enzima GST. La respuesta con Ia Eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico y Ia acida fue similar.
Ejemplo 17:
Eficacia terapéutica de Ia EPOrh con bajo contenido de ácido siálico administrada por vía nasal.
Se emplearon gerbils de Mongolia de ambos sexos, con un peso corporal entre 60 y 70 gramos, con agua y alimentación ad limitum, que fueron mantenidos en un ciclo de 12 horas alternas de luz-oscuridad durante todo el período experimental.
Se procedió a Ia oclusión unilateral permanente (ULP) de Ia carótida derecha de los animales, bajo profunda anestesia, para Ia cual se utilizó Ia vía intraperitoneal, como pre-anestésico diazepán (5.0 mg/Kg.); como anestésico ketamina (47 mg/Kg.) y 0,02 mg / Kg. de Atropina. La carótida derecha fue expuesta bajo estereoscopio, doblemente ligada y seccionada. Los animales falsamente lesionados fueron obtenidos con las mismas manipulaciones pero sin ligar ni cortar Ia carótida. Para la evaluación clínica e histopatológica, los grupos experimentales fueron: Grupo Control: carótida aislada, sin otro procedimiento (falsos lesionados). (n=10) Grupo de Animales Lesionados sin tratamiento: Animales lesionados, sin otro procedimiento (n=20).
Grupo de Animales Lesionados con tratamiento: carótida aislada, doblemente ligada y seccionada, con administración de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico por vía nasal (ejemplo 10) (n=20).
El tratamiento consistió en Ia aplicación en Ia cavidad nasal de 10 μl de EPOrh o su vehículo cada 8 h diarias, desde 1 hora después de Ia operación hasta el 4to. día posterior a Ia operación.
A cada animal se Ie determinó el estado neurológico mediante una escala de 2 a 5 que incluyó el tono corporal, Ia fuerza prensil y alteraciones en Ia postura y Ia marcha. Un animal sobreviviente sin signos patológicos tiene un valor de 5 en esta escala.
Para Ia evaluación funcional se utilizó también Ia actividad exploratoria espontánea, donde se contaron los empinamientos sobre las patas traseras que hacen los roedores al explorar un recipiente nuevo. Como recipiente se utilizó una caja cilindrica vertical de 30 cm de diámetro y 25 cm de altura. Cada gerbil fue colocado en el centro de dicha caja y los empinamientos fueron contados en un intervalo de 3 minutos.
A los 7 días posteriores a Ia operación, los animales fueron perfundidos a través del ventrículo izquierdo con formaldehído al 4% en solución buffer fosfato (PBS) a pH 7.0. Los cerebros fueron extraídos y mantenidos en esta solución algunos días. Posteriormente fueron incluidos en parafina, seccionados a 4 μm y teñidos con hematoxilina y eosina. Las secciones fueron evaluadas a 10x y 4Ox, sin conocimiento previo de su identidad.
Para Ia evaluación del edema cerebral, se utilizaron 90 hembras entre 60 y 70 g comprendidas en los 3 grupos experimentales: Falsos lesionados (n = 20) Lesionados sin tratamiento (n = 35) Lesionados con tratamiento (n = 35)
A las 3, 12 y 24 horas de Ia lesión los animales fueron anestesiados y perfundidos con solución salina, el encéfalo se extrajo de Ia cavidad craneana y los hemisferios fueron separados. La determinación del contenido de agua se realizó según el método gravimétrico descrito por Calapai y cois, 2000 según Ia ecuación: %Agua = [(Peso
Húmedo del Hemisferio - Peso seco del Hemisferio) X 100 X Peso Húmedo"1]. Para el análisis de los datos se establecieron diferencias entre grupos y muéstreos para cada variable mediante los test t de Student, ANOVA (una vía) y el test de Dunnett para Ia
Comparación Múltiple.
Para evaluar el peso corporal de los animales se utilizaron machos que fueron ubicados en 3 grupos (de 10 animales cada) siguiendo el mismo esquema de tratamiento empleado en los experimentos anteriores. Los animales fueron pesados en una balanza Sartorius el día de Ia operación (ULP) y por 5 semanas consecutivas (1 vez por semana).
Durante los experimentos descritos donde se administró EPOrh por vía nasal, se encontró una mortalidad menor en los animales tratados durante los días posteriores a Ia cirugía en ambos sexos, evidenciado en el análisis de las proporciones . En Ia figura 2, podemos observar el efecto sobre Ia Mortalidad en ambos sexos en el modelo de isquemia cerebral en el gerbil de Mongolia.
A las 24 h de Ia ligadura unilateral, una parte de los animales mostró afectaciones en el estado neurológico que fueron reveladas mediante el examen descrito y expresadas en el puntaje. En Ia Figura 3 podemos aprecir Ia conducta motora de los gerbil de Mongolia en el cilindro. En los animales lesionados sin tratamiento aparece un daño funcional significativo. La actividad exploratoria-motora aparece deprimida en los animales isquémicos no tratados mientras que en los tratados con EPOrh, se mantiene similar a Ia de los controles. En Ia Figura 4 aparece representado el estado neurológico de los animales a las 24 h de realizada Ia lesión. El efecto de Ia lesión y el tratamiento con EPOrh por vía nasal en el modelo de isquemia unilateral permanente sobre el peso corporal de los animales después de 5 semanas se muestra en Ia Figura 5. El grupo de animales lesionados comparados con los grupos lesionados y tratados o falsamente lesionados mostró un comportamiento en su curva de peso diferente. En el grupo control y lesionado tratado se obtuvieron curvas similares, contrastando con Ia pérdida de peso de los animales lesionados y no tratados. Este grupo no pudo sobrepasar a las semanas el promedio de peso con el cual se comenzó el experimento.
Los resultados obtenidos en Ia disminución del edema cerebral fueron debidos a que Ia aplicación de EPOrh por vía nasal produjo una significativa protección sobre Ia formación de edema cerebral en todos los animales tratados (Fig. 6a y 6b) no encontrándose diferencias en el contenido de agua entre el animal tratado con EPOrh y los controles. Una situación diametralmente opuesta se detectó en el grupo de animales lesionados no tratados donde el contenido de agua en el hemisferio lesionado (derecho) se incrementó en todos los tiempos estudiados (3, 12 y 24 horas), encontrándose una alta significación a las 24 h de Ia lesión (p<0.001 ).
En Ia figura 7 podemos observar el Puntaje histopatológico de las lesiones en CA1 del hipocampo del gerbil. En los hallazgos histopatológicos Ia frecuencia de animales con el cerebro intacto es mayor en los animales controles que en animales sin tratamiento (p=0.002) y es mayor en animales tratados con EPO que en los no tratados (p=0.03).
En Ia figura 8 se pueden apreciar M icrofotog rafias del Hipocampo de gerbil tratado con EPOrh por vía nasal. Se puede notar la integridad del sector CA1 en los animales tratados. En los animales no tratados se observó un edema generalizado, pícnosis en todo el hemisferio derecho así como hemorragias en Ia fimbria del hipocampo derecho y en Ia corteza parietal del hemisferio derecho, áreas de edema, cromatina densa y difusa en hemisferio derecho. Neuronas picnóticas en el hipocampo. Ejemplo 18:
Evaluación "in vitro" de Ia capacidad antioxidante de Ia eritropoyetina con un contenido bajo de ácido siálico humana recombinante básica (ejemplo 10) en homogenado de regiones anatómicas de hipocampo, corteza cerebral y cerebelo de Ia rata.
Para demostrar que Ia EPO acida y básica son capaces de contrarrestar Ia producción de Malondialdehido (MDA) y 4-Hidroxialquenales (4HDA), en homogenado de cerebro de rata, se realizó un experimento in vivo. Para ello se emplearon Ratas Wistar machos (n=15), con un peso corporal entre 180 y 200 gramos. EI agua y Ia alimentación fueron ad libitum, un ciclo de 12 horas alternas de luz oscuridad fue dado a los animales durante todo el período experimental. Para Ia obtención de las regiones anatómicas se siguió Ia siguiente metodología:
Los animales se sacrificaron por dislocación cervical y decapitación, el encéfalo fue rápidamente removido de Ia cavidad craniana y el tejido fue inmediatamente congelado a -70 grados celcius. Las regiones de hipocampo, corteza cerebral y cerebelo de cada animal fueron disecadas con ayuda de un atlas estereotáxico (Paxinos, G., and Watson, C. (1986). Academic Press, New York, pp 230-259). Un pool de cada una de estas regiones se conformó y un homogenado de cada región fue preparado conteniendo 1 :8 partes de tejido por parte de Tampón fosfato 0.1 M pH 7.0. El líquido libre de células fue obtenido por centrifugación a 4 grados celcius a 10 000 g por 30 minutos. Los homogenatos se mantuvieron en baño de hielo hasta Ia determinación de Ia actividad enzimática, para Io cual se utilizó un Espectrofotómetro Digital Spectro UV- VIS RS de Ia Labo Med ,Inc. Como principal resultado se obtuvo que Ia Eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico redujo en un 13 % (0-23 %) Ia producción de MDA + 4 HDA en los homogenatos a las tres regiones estudiadas del cerebro de Ia rata. La disminución fue dependiente de Ia dosis utilizada. Los niveles más altos de protección se detectaron en hipocampo y cerebelo donde se han detectado considerables niveles de receptores a Ia EPO. La respuesta de Ia EPO acida y básica fue similar (Figura.9). Ejemplo 19:
La aplicación de 90 000 Ul de eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico (según formulación ejemplo 6) no induce respuesta eritropoyética significativa.
Para demostrar que Ia eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico utilizada en los ensayos no tiene actividad eritropoyética significativa "//? wVo" se evaluaron sus efectos utilizando una dosis de 90 000 Ul sobre Ia eritropoyesis de los Gerbils de Mongolia en un estudio comparativo con 10 animales (5 administrados y 5 controles), los cuales fueron monitoreados (antes de Ia administración, 7 días post administración y 14 días post administración) para realizar un hemograma completo en sangre total (10 μl_ de EDTA al 10%/mL de sangre) empleando un contador automático Micros ABX para el procesamiento de las muestras y el paquete estadístico sobre Windows SPSS tomando p=0.05 como nivel de confianza para el procesamiento de las variables.
Se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 1).
Tabla 1. Parámetros hematológicos obtenidos en los diferentes grupos.
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
La distribución de las poblaciones para cada parámetro hematológico por muestreo con p=0.05 y n=10 mostraron una distribución normal, en el análisis de homogeneidad de varianza se observó que de modo general las varianzas tuvieron un comportamiento homogéneo, excepto Ia HB y el HTC en el muestreo I, los LEUC. En el muestreo Il y el HCM y los LEUC en el muestreo III. AI comparar las varianzas de las variables hematológicas de los grupos en los diferentes muéstreos se observaron diferencias en Ia HB, los ETO, el HTC y Ia CHCM del muestreo II, donde se evidencian diferencias entre el grupo control y el administrado, al comparar las varianzas entre los muéstreos para cada grupo se observaron diferencias en Ia CHCM del grupo control (muestreo I vs muestreo II) y el grupo tratado presentó diferencias en HB y HTC (muestreo Il vs muéstreos I y III) y Ia CHCM (muestro Il vs muestreo I). Para Ia evaluación de las diferencias de las variables antes mencionadas entre los grupos por muéstreos se tomó el muestreo I como muestreo de referencia para las comparaciones. Teniendo en cuenta que se presentan algunas diferencias estadísticas p=0.05 entre los grupos y entre los muéstreos, se decidió realizar una evaluación más integral de los datos obtenidos; para Io cual se agruparon los valores del muestreo I, momento en que los animales no habían sido aún administrados n=10, y se calculó el rango X+2SD de esta población, graficándose el comportamiento de los valores medios para cada variable (FIG. 10). También se compararon los valores medios de las variables con los reportados por otros autores para esta especie, apreciándose que en todos los grupos y muéstreos se obtuvieron valores similares a los reportados (Tabla 2).
A pesar de que las comparaciones estadísticas reflejan que las variables: HB, ETO, y HTC aumentaron significativamente en el muestreo II, al analizar este comportamiento según el rango normal X±2SD y los valores medios reportados en Ia literatura (Manual sobre el cuidado y uso de los animales de experimentación, Consejo Canadiense de Protección de los Animales. Volumen 1 , 2da edición. 1998), se puede notar que este comportamiento carece de significación biológica, por Io que se puede concluir que Ia eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico no induce respuesta eritropoyética significativa en Ia especie estudiada.
Tabla 2. Valores hematológicos normales para Gerbils.
Figure imgf000027_0001
Ejemplo 20:
Mareaje de Ia eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico con I125.
Para determinar el paso de Ia eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico (ejemplos 3 y 5), a regiones del sistema nervioso central cuando se aplican por vía nasal, Ia EPOrh se marcó con lodo 125, según el método descrito para Ia técnica con YODO-GEN (Pierce. Rockford, Illinois 61105, USA). A partir de este mareaje radiactivo se prepararon formulaciones para aplicación nasal. Se emplearon un total de 18 ratas machos Wistar de peso corporal entre 180 y 20Og que fueron aplicadas por vía nasal con Ia formulación referida utilizando Ia Eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico Yodada con I125. A cada animal se Ie aplicó entre 5 y 100 microlitos de Ia formulación por vía nasal. En intervalos de 5, 30 y 60 minutos fueron sacrificados los animales por decapitación bajo anestesia. El encéfalo fue removido rápidamente (menos de 70 segundos). Las áreas de bulbo olfatorio y cerebelo fueron extraídas. El conteo radiactivo se realizó en un contador Gamma. Se obtuvieron los siguientes resultados: una aplicación de Eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico llega a regiones del cerebro en al menos 5 minutos y con el tiempo ésta va disminuyendo de forma gradual de Ia región frontal a caudal. A los 60 minutos de aplicación aun queda EPO en las regiones del bulbo olfatorio y del cerebelo. Estos resultados indican que aproximadamente entre 1 y 5% de Ia EPO aplicada nasalmente llega al cerebro. Entre un 80 y 85% de Ia EPO que llega al cerebro se detectó en los bulbos olfatorios, mientras que cerca de un 20% fue detectada en cerebelo a los 5 minutos de aplicación. Pasados 30 minutos estas concentraciones casi se igualan y al cabo de 60 minutos el cerebelo tiene un 30% y solo un 10% de Ia radioactividad del bulbo olfatorio. La presencia de Ia molécula marcada en regiones del cerebelo indican el paso de Ia BHE, por otro lado, Ia detección de Ia molécula al nivel de regiones no relacionadas con Ia vía olfativa (cerebelo) indica que no solo está comprometida Ia vía olfatoria en el paso de moléculas al cerebro, sino que un mecanismo más general y rápido está participando, que puede ser Ia difusión a través del mucus y ulterior permeación a través de discontinuidades que se presentan en regiones del epitelio olfatorio en particular en Ia zona de Ia lámina cribiforme, el cual permite Ia llegada de Ia eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico a regiones alejadas de Ia vía olfatoria. La Figura 11 representa el paso a través de Ia vía nasal de Ia eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico a bulbo olfatorio y cerebelo. La figura representa en cada barra el valor promedio de seis animales. La misma muestra cómo Ia eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico llega a regiones del cerebro en al menos 5 minutos y con el tiempo ésta va disminuyendo de forma gradual de Ia región frontal a caudal. A los 60 minutos de aplicación, aun queda EPO en las regiones del bulbo olfatorio y del cerebelo. Entre un 80 y 85% de Ia EPO que llega al cerebro se detectó en los bulbos olfatorios, mientras que cerca de un 20% fue detectada en cerebelo a los 5 minutos de aplicación. Pasados 30 minutos estas concentraciones casi se igualan y al cabo de 60 minutos el cerebelo tiene un 30 % y solo un 10 % de Ia radioactividad del Bulbo olfatorio.
Ejemplo 21 : Efecto de Ia EPOrh básica sobre Ia hemorragia subaranoidea en conejos
El ensayo se realizó en conejos Nueva Zelanda machos con un peso entre 3-4 Kg que fueron anestesiados con ketamina 40 mg/Kg intramuscular, posteriormente se extrajeron de Ia arteria central de Ia oreja 5 mi de sangre que fueron inyectados percutaneamente en Ia cisterna magna, los animales fueron monitoreados por 72 h. Los conejos fueron divididos en 3 grupos experimentales con 8 animales cada uno: Grupo I: Animales no lesionados Grupo II: Animales lesionados
Grupo III: Animales lesionados + EPOrh básica 20μg (ejemplo 5) Las administraciones de EPOrh básica se realizaron, 5 minutos después de inducir Ia hemorragia subaranoidea y se repitió cada 8 h durante 72h.
Para Ia evaluación neurológica se siguió el comportamiento motor de los animales según Grasso G, 2002 durante el periodo de ensayo
Los resultados se muestran en Ia tabla I, observándose un mejor comportamiento de Ia conducta motora en los animales controles (sin lesionar) y los tratados con EPOrh básica que los animales lesionados sin tratamiento.
Figure imgf000030_0001
El grado de daño neurológico fue clasificado como: 1 : No existen indicios de daños. 2: Daños mínimos.
3: Daños moderados sin movimientos anormales. 4: Daños severos con presencia de movimientos anormales
*: difiere con respecto a los animales lesionados tratados con EPOrh básica y los no lesionados para P < 0.05
Ejemplo 22: Efecto de Ia EPOrh básica para el tratamiento de Ia demencia
A 36 gérbiles de Mongolia se les ligó Ia carótida derecha bajo anestesia y fueron tratados con 40 Ul diarias de EPOrh por vía nasal (ejemplos 10 y 11) durante 7 días, comenzando en el espacio de 1 hora posterior a Ia cirugía. Otros 24 animales recibieron un procesamiento similar y les fue administrada una cantidad equivalente de vehículo. A 9 gérbiles les fue aislada Ia carótida sin ligarla y constituyeron el grupo control.
A los 8 días de Ia operación habían sobrevivido 27 y 13 animales de los grupos sometidos a isquemia unilateral y tratados con EPOrh y vehículo respectivamente. No hubo mortalidad para el grupo control. Los animales fueron sometidos a una prueba de habituación un día antes y una semana después de Ia ligadura unilateral de Ia carótida. Esta prueba se basa en el conteo de empinamientos en un recipiente cilindrico durante 9 minutos, divididos en tres tercios. Las proporciones de empinamientos en cada tercio determinan una recta de mejor ajuste entre los tres puntos. Su pendiente fue utilizada para establecer las comparaciones entre grupos mediante Ia prueba U de Mann y Whitney. Las comparaciones antes-después fueron realizadas mediante Ia prueba de comparación por rangos de Wilcoxon de los animales sobrevivientes. Los resultados fueron los siguientes:
Figure imgf000031_0001
a - diferente de control; b - diferente de EPOrh; p < 0.05.
Los resultados muestran una pendiente menor (más próxima a 0) en los animales sometidos a isquemia, una semana después de Ia isquemia y en comparación con los tratados con EPOrh y los controles. Una menor pendiente demuestra una persistencia del animal en explorar este ambiente en los dos últimos tercios, poniendo de manifiesto una pérdida de Ia habituación que puede caracterizarse como una disfunción cognitiva inducida por Ia isquemia. El tratamiento con EPOrh básica previene Ia aparición de esta disfunción. La conducta de los animales reveló un deterioro inducido por Ia isquemia que se pudo expresar en una pérdida de Ia capacidad de anidar, típica en los machos de esta especie, en un incremento de Ia agresividad y en una pérdida de Ia conducta de acicalamiento durante el tiempo en que permanecieron en el cilindro circular. Los resultados fueron comparados mediante Ia prueba de independencia de chi cuadrado y fueron expresados en Ia tabla en porciento:
Figure imgf000031_0002
a - diferente de control; b - diferente de EPOrh; p < 0.05 Los animales fueron sacrificados por perfusión bajo anestesia con formalina neutra tamponada al 10%. Los cerebros fueron extraídos y procesados para Ia obtención de secciones coronales de 8 μm teñidas con hematoxilina y eosina. Las secciones fueron examinadas al microscopio de campo claro para Ia detección de signos histopatológicos. Las comparaciones fueron realizadas mediante Ia prueba de independencia de chi cuadrado. Los resultados de Ia tabla están expresados en porciento:
Figure imgf000032_0001
a - diferente de control; b - diferente de EPOrh; p < 0.05
Resulta notable que el tratamiento previene totalmente el edema y reduce a Ia mitad Ia incidencia de picnosis, gliosis y pérdida neuronal.
El deterioro conductual puede calificarse como un reflejo de Ia pérdida neuronal y otros hallazgos histopatológicos observados en el grupo no tratado. El tratamiento con EPOrh previene al menos parcialmente el deterioro conductual inducido por Ia disminución del flujo sanguíneo cerebral en el gerbil de Mongolia. Los resultados son relevantes en el sentido de sugerir una acción neuroprotectora de Ia EPO rh capaz de contrarrestar el deterioro funcional de Ia demencia de origen vascular en el hombre.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Formulaciones a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico caracterizada porque Ia forma terminada es administrada por vía nasal.
2. Formulaciones a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico de acuerdo con Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia forma terminada son gotas nasales.
3. Formulaciones a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico de acuerdo con Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia forma terminada es spray nasal.
4. Formulaciones a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico de acuerdo con Ia reivindicación 1-3 caracterizado por Ia utilización de polímeros bioadhesivos como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC) y metilcelulosa (MC).
5. Formulaciones a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico de acuerdo con Ia reivindicación 1-3 caracterizado por Ia utilización de preservativos antimicrobianos como cloruro de benzalconio, clorobutanol, metilparabeno y propilparabeno.
6. Formulaciones nasales a partir de EPOrh con bajo contenido de ácido siálico de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 caracterizado por Ia utilización de estabilizantes de proteínas como L-triptófano, L-leucina, clorhidrato de L-arginina y/o clorhidrato de L-histidina y/o sus sales.
7. Formulaciones de acuerdo con Ia reivindicación 1 , para ser empleadas en el tratamiento de enfermedades cerebrovasculares, psiquiátricas, neurodegenerativas agudas y crónicas, hipoxia del recién nacido, hipoxia por causa cardiovascular, accidentes, traumas e intoxicación, demencia, pérdida de
Ia memoria, disminución de Ia capacidad mental, deterioro mental, manifestaciones neurológicas como resultado de enfermedades, daño o alteraciones del sistema fisiológico, manifestaciones siquiátricas como resultado de enfermedades, daño o alteraciones del sistema fisiológico, manifestaciones neurológicas producidas por enfermedades periféricas, manifestaciones siquiátricas producidas por enfermedades periféricas, manifestaciones neurológicas producidas por estados epilépticos.
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