WO2007007777A1 - 蛍光性蛋白質の非蛍光性変異体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 - Google Patents

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WO2007007777A1
WO2007007777A1 PCT/JP2006/313826 JP2006313826W WO2007007777A1 WO 2007007777 A1 WO2007007777 A1 WO 2007007777A1 JP 2006313826 W JP2006313826 W JP 2006313826W WO 2007007777 A1 WO2007007777 A1 WO 2007007777A1
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WO
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amino acid
acid sequence
protein
seq
fluorescent
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PCT/JP2006/313826
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Makoto Taketo
Masahiro Sonoshita
Takanori Nakane
Original Assignee
Kyoto University
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • the present invention relates to a non-fluorescent mutant of a fluorescent protein and a transgenic non-human mammal expressing the mutant (for example, a non-fluorescent GFP mutant and a transgenic non-expressing GFP mutant).
  • a non-fluorescent GFP mutant and a transgenic non-expressing GFP mutant Human mammals
  • luciferase mutants having no luciferase activity and transgene non-human mammals expressing the mutants.
  • Green Fluorescent Protein is a natural protein derived from the jellyfish Aequorea victoria, and its fluorescence is cyclic fluorescent coloration that also includes tripeptide (Ser65-Tyr66-G1 y67) force in the amino acid sequence. It is derived from the ⁇ -barrel structure surrounding the group. Numerous reports have been made on fluorescent GFP mutants that maintain or improve fluorescence (US Pat. No. 5625048, International Publication WO96 / 23810, US Pat. No. 5804387, Special Table 2000-509987) , US Pat. No. 6054321, International Publication No.
  • WO03 / 029286 among which a mutant containing a substitution of serine at position 65 with threonine is EGFP (enhanced) in which fluorescence is amplified by artificial amino acid substitution.
  • GFP is widely used in biological and medical research (Non-patent Document 1: Nature Reviews Genetics 4: 613-625, 2003).
  • EGFP EGFP labeling of cultured cancer cells.
  • mouse Colon26 cells when mouse Colon26 cells are transplanted into the rectal submucosa, they interact with the tissue matrix to form early cancers and spread to other tissues such as silkworms, lymph nodes, liver, and lungs. Although metastasis occurs, this metastasis can be traced by using mouse Colon26 cells expressing EGFP.
  • transplanting cancer cells expressing EGFP into experimental animals and monitoring the fluorescent cells in vivo it is possible to elucidate the control of the metastasis process and to develop and develop therapeutic drugs.
  • Patent Document 1 US Patent 5625048 Specification
  • Patent Document 2 International Publication WO96 / 23810
  • Patent Document 3 US Patent No. 5804387 Specification
  • Patent Document 4 Japanese Translation of Special Publication 2000-509987
  • Patent Document 5 US Patent 6054321 Specification
  • Patent Document 6 International Publication No. WO03 / 029286
  • Non-Patent Document 1 Nature Reviews Genetics 4: 613-625, 2003
  • Non-Patent Document 2 Gene Therapy 6, 1305-1312, 1999
  • Non-Patent Document 3 Clin. & Exp. Metastasis 20, 135-141, 2003
  • An object of the present invention is to provide an experimental animal that avoids an immune reaction against cells expressing a fluorescent GFP variant, and further avoids an immune reaction against cultured cancer cells labeled with a fluorescent protein luciferase. To provide experimental animals.
  • the present invention relates to an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence of the fluorescent protein, At least one amino acid residue comprising an amino acid residue of the fluorescent protein presented by the major histocompatibility complex (MHC) on the surface of the expressing cell and forming a fluorescent chromophore of the fluorescent protein
  • MHC major histocompatibility complex
  • a substantially non-fluorescent protein having an amino acid sequence having a deletion, substitution and Z or addition.
  • the present invention relates to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 5 in the sequence listing or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 5 in the sequence listing wherein one or several amino acids are deleted, substituted and Provided is a protein which exhibits the same antigenicity as a fluorescent protein having an amino acid sequence which may be Z or carotened and which is substantially non-fluorescent.
  • one or several amino acids are deleted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 5 in the sequence listing or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 5 in the sequence listing.
  • the fluorescent protein having an amino acid sequence after substitution and Z or addition the following (1) to (3):
  • any one of the above proteins wherein position 67 is alanine or glycine, a protein having the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing A protein is provided.
  • a gene encoding any one of the above proteins a gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing; and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing
  • Transgenic non-human mammals such as transgenic mice that express the above-mentioned! /, Any of the above genes; transgenic mice that express the above-mentioned! /, Any of the proteins are provided.
  • Still another aspect of the present invention provides a biochemical experimental method including a step of transplanting cells expressing the corresponding fluorescent protein into the above-described transgenic non-human mammal. Is done.
  • the present invention also provides an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence of the active luciferase, and the active luciferase is expressed.
  • the amino acid residue of the active luciferase presented by the major histocompatibility complex (MHC) on the surface of the cell and deleted in at least one of the amino acid residues forming the active site of the active luciferase;
  • MHC major histocompatibility complex
  • Provided is a protein having substantially no luciferase activity, having an amino acid sequence with substitution and Z or addition
  • the present invention relates to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 of the sequence listing or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 of the sequence listing wherein one or several amino acids are deleted, substituted and Z
  • the present invention provides a protein that exhibits the same antigenicity as an activated luciferase having an amino acid sequence and that has substantially no luciferase activity.
  • one or several amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of active luciferase having an amino acid sequence the following (7) to (9):
  • position 245 and position 529 amino acid substitution at one or more selected positions
  • a protein having an amino acid sequence in which any one or more mutations selected from the above are present and having substantially no luciferase activity is provided.
  • a gene encoding any one of the above proteins a gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing; a vector including any one of the above genes; Transgenes such as transgenic mice expressing any of the above proteins A non-human mammal is provided.
  • any one of the above transgenic non-human mammals is compared with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • a biochemical experimental method comprising the step of transplanting a cell expressing an activated luciferase having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted and Z or added.
  • FIG. 1 shows the results of computer analysis of antigenic epitopes in EGFP.
  • the enclosed letters indicate amino acids that are not presented by Kd and Dd, respectively.
  • FIG. 2 Western blotting showing expression of EGFP and MGFP in 293T and Colon26 cells.
  • FIG. 3 Fluorescence micrograph and flow cytometry of Colon26 cells expressing EGFP or MGFP.
  • FIG. 4 Fluorescence micrograph and flow cytometry of 293T cells expressing EGFP or MGFP.
  • FIG. 5 Western plotting to detect antibodies produced in mouse serum by cell transplantation.
  • FIG. 6 is a graph comparing the primary foci volume of EGFP-expressing cells in normal Balb / c mice and the transgenic mice of the present invention.
  • FIG. 7 Western blotting showing expression of DsRed monomer and Mred in 293T cells.
  • FIG. 8 shows a comparison of fluorescence micrographs of 293T cells expressing DsRed monomer or Mred and 293T cells expressing EGFP and DsRed monomer or EGFP and Mred.
  • FIG. 9 Flow cytometry of 293T cells expressing DsRed monomer or Mred.
  • FIG. 10 Western blot showing the expression of luciferase and Mluc in 293T cells.
  • the protein of the present invention is a mutant that exhibits the same antigenicity as a fluorescent protein but is substantially non-fluorescent, or has the same antigenicity as luciferase but has substantially luciferase activity. It is characterized by being a mutant.
  • substantially non-fluorescent means that it emits fluorescence having an intensity of 1% or less compared to the fluorescence intensity of the corresponding fluorescent protein, and is substantially reduced by fluorescence microscopy and flow cytometry. This means that no fluorescence is observed.
  • substantially has no luciferase activity means that the value indicating the activity obtained by the activity measurement method known to those skilled in the art is 5% or less compared to the value of active luciferase. .
  • fluorescent protein examples include GFP, DsRed (Discosoma striata red fluorescent protein), and the like.
  • Luciferase means an acid enzyme that catalyzes bioluminescence, such as firefly luciferase.
  • the “fluorescent GFP variant” means “one or several amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the amino acid of the above is deleted, substituted and Z or added, and it may be a “fluorescent protein having an amino acid sequence”, and wild-type GFP (having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) It means to include protein.
  • Examples of other fluorescent GFP variants include EGFP (a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing).
  • a mutant that exhibits the same antigenicity as a fluorescent GFP mutant but is substantially non-fluorescent may be referred to as a GFP mutant or MGFP.
  • fluorescent DsRed monomer means “one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing”. It means “a fluorescent protein having an amino acid sequence that may have amino acids deleted, substituted and Z or added”.
  • a mutant that exhibits the same antigenicity as a fluorescent DsRed monomer but is substantially non-fluorescent may be referred to as a DsRed monomer mutant or Mred.
  • active luciferase refers to an oxidase activity that catalyzes bioluminescence. It means a protein with sex.
  • a mutant that exhibits the same antigenicity as an active luciferase but is substantially non-fluorescent is referred to as a luciferase mutant or
  • a protein that maintains an amino acid residue presented by a major histocompatibility complex (MHC) on the cell surface of a cell expressing the selected protein a protein that maintains an amino acid residue presented by a major histocompatibility complex (MHC) on the cell surface of a cell expressing the selected protein.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Amino acid residues presented by the major histocompatibility complex (MHC) on the cell surface can be predicted experimentally by a method such as sequence analysis of the presented amino acid fragments or predicted by a program .
  • HLA peptide Binding Predictions http://bimas.dcrt.nih.gov:80/molbio/hla_bind Parker, 1994
  • amino acid residues at positions 244, 245, and 246, which constitute part of the active site of firefly luciferase, as well as the three amino acids (positions 66-68) that constitute the fluorescent chromophore of the DsRed monomer described below was not displayed by MHC on the cell surface of Balb / c mice.
  • a fluorescent protein mutant having no fluorescence can be formed by, for example, a mutant having a modification that inhibits the formation of a fluorescent chromophore of the fluorescent protein.
  • a mutant of luciferase that has substantially no luciferase activity can be formed by changing the structure of the active site, for example, binding to a luciferase substrate (luciferin).
  • the amino acid residues involved in or near the amino acid residues are missing, substituting, or are variants with amino acid additions in the vicinity. Can be formed.
  • GFP variant for example, MGFP having a modification that inhibits the formation of a fluorescent chromophore composed of a tripeptide consisting of positions 66, 67, and 68 of EGFP.
  • GFP variants include EGFP or fluorescent proteins having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence of EGFP.
  • Proteins in which any one or more mutations selected from insertion of one or more amino acids between amino acids 66 and 67 and between amino acids 67 and 68 are included.
  • a fluorescent protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence of EGFP the sequence number is shifted due to deletion or addition of amino acids, etc.
  • Positions 66, 67, and 68 in the protein indicate positions corresponding to positions 66, 67, and 68 (Thr66-Tyr67-Gly68) in the amino acid sequence of EGFP.
  • Such a peptide is also a protein showing the same antigenicity as a fluorescent GFP mutant. Of these, proteins having amino acid substitution at one or more positions selected at positions 66, 67, and 68 are preferred.
  • “several” means 2 or more and 10 or less, preferably 2 or more and 6 or less.
  • the protein of the present invention does not contain these fluorescent GFP mutants.
  • a fluorescent GFP variant in wild-type GFP (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), substitution of serine at position 65 with glycine, alanine, norin, leucine, isoleucine, cysteine, or threonine is possible. And mutants having the substitution of tyrosine 66 at the position of histidine, tryptophan, or ferroalanine.
  • positions 65, 66, and Due to the presence of substitution at two or more positions at position 67, mutants that include the substitutions at serine 65 and tyrosine described above but are non-fluorescent are included within the scope of the present invention.
  • position 66 is preferably glycine or alanine. Most preferably, position 66 is alanine.
  • the serine at position 65 is preferably threonine.
  • MGFP is preferably a protein having a substitution to glycine or alanine at position 67, more preferably a protein having a substitution to alanine at position 67. Most preferred is a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • non-fluorescent DsRed monomer variants include, for example, a fluorescence having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and Z or added to the amino acid sequence of the DsRed monomer.
  • fluorescence having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and Z or added to the amino acid sequence of the DsRed monomer.
  • such a protein is also a protein exhibiting the same antigenicity as the DsRed monomer.
  • proteins with amino acid substitution at one or more positions selected at positions 66, 67, and 68 are preferred. Proteins with amino acid substitution at position 66 are more preferred. More preferred is a protein that is alanine, and most preferred is a protein that is alanine at position 66.
  • Examples of the luciferase mutant having no luciferase activity include, for example, one or several amino acid sequences of firefly luciferase shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing or amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • amino acid sequence of an active luciferase having an amino acid sequence wherein the amino acid is deleted, substituted and Z or added, below (7)-(9):
  • position 245 and position 529 amino acid substitution at one or more selected positions
  • Insertion force of one or more amino acids between amino acids 244 and 245, amino acids 245 and 246, amino acids 528 and 529, and amino acids 529 and 530 examples include proteins having one or more mutations.
  • the active luciferase having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of firefly luciferase, amino acid deletion or addition, etc. May cause a deviation in the SEQ ID NO: 244, 245, 246, 528, 529, and 530 in the protein are 245 in the amino acid sequence of firefly luciferase described in SEQ ID NO: 8, The positions corresponding to 245th, 246th, 528th, 529th, and 530th are shown.
  • such a protein is also a protein having the same antigenicity as the firefly luciferase described in SEQ ID NO: 8.
  • a protein having an amino acid substitution at one or more positions at which positions 245 and 529 are also selected is preferable, and a protein having arginine at position 245 and glutamine at position 529 is more preferable. More preferably, the protein is arginine.
  • a method for producing a gene encoding the protein of the present invention such as MGFP, Mred or Mluc described above
  • methods known to those skilled in the art such as chemical synthesis, genetic engineering methods, and methods using mutagenesis can be used. Any of them may be used.
  • a drug that acts as a mutagen is contacted with DNA encoding a pre-mutation protein (fluorescent GFP mutant, fluorescent DsRed monomer, active luciferase), UV irradiation, PCR method, etc.
  • the gene encoding MGFP can be obtained by using the genetic engineering method.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention is preferably used for embryogenesis in the development of non-human mammals with respect to unfertilized eggs, fertilized eggs, sperm and germ cells containing the primordial cells thereof.
  • the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofussion method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc. can be produced by introducing a transgene containing a gene encoding any of the proteins of the invention.
  • a transgene containing a gene encoding any of the proteins of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • a transgene non-human mammal can be produced by fusing these cells with the above-described embryo cells by a known cell mixing method.
  • the transgene used for production of the transgenic non-human mammal is a gene construct in which a gene encoding any of the above-described proteins of the present invention is linked downstream of an appropriate mammalian promoter. Is preferred.
  • an expression vector in which a transgene including a gene encoding any of the above-described proteins of the present invention is linked downstream of various promoters may be used. You can use gene constructs that have been cut and purified!
  • Expression vectors include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, butteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moro-one leukemia virus, vaccinia viruses or baculoviruses. Animal viruses and the like are used and can be produced according to a known method or a method analogous thereto.
  • the type of mammalian promoter used in the gene construct is not particularly limited as long as it can operate in a non-human mammal.
  • a virus eg, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus.
  • Gene promoters, various mammals eg, humans, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • Promoters derived from each mammal include, for example, anolebumin, endothelin, metamouthonein, smooth muscle ⁇ -actin, polypeptide chain elongation factor la (EF-1 «), ⁇ -actin, ⁇ and j8 myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2. Promoters such as myelin basic protein, serum amyloid P component, and renin can be used.
  • Preferred promoters include the j8 actin promoter and the CMV (cytomegalovirus) promoter. These promoters are generally used in combination with CMV enhancers. Such combinations include, for example, pCA S; chic en beta-actin promoter and cytomegalovirus enhancer. Beta-actin int ana bovine globin poly-adenylation signal (see Gene, 108, 193, 1991), etc. It is.
  • the gene construct may contain an enhancer sequence upstream of the promoter sequence.
  • enhancer sequences that can be used include the CMV enhancer described above.
  • a poly A signal may be linked downstream of the gene encoding the protein of the present invention.
  • Specific examples of the poly A addition signal sequence include, but are not limited to, SV40 poly A addition signal.
  • a part of the intron of the eukaryotic gene may be linked 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or 3 ′ downstream of the translation region.
  • a transgenic non-human mammal introduces a gene encoding the protein of the present invention or a gene construct containing the gene into a fertilized egg of the non-human mammal, and the fertilized egg is pseudopregnant female non-human. It can be produced by transplanting to a mammal and delivering the non-human mammal introduced with the gene encoding the protein of the present invention from the non-human mammal.
  • the gene When the gene is introduced at the fertilized egg cell stage, it is preferably present in all germ cells and body cells of the subject mammal.
  • the presence of the transgene in the embryonic cell of the transgenic animal after transgene means that all of the offspring of the transgenic animal have the transgene in all of its germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this kind of animal has the gene encoding the protein of the present invention in all its germ cells and somatic cells.
  • Have the gene encoding the protein of the present invention in both homologous chromosomes By obtaining a homozygous animal and mating the male and female animals, it is confirmed that all offspring stably hold the gene, and that it has an excess of the gene. can do.
  • a fertilized egg used for transferring a transgene to a fertilized egg of a target non-human mammal or its ancestor is obtained by mating a male mammal and a female mammal of the same species.
  • fertilized eggs can be obtained by natural mating, a method of mating with a male mammal after artificially adjusting the sexual cycle of the female mammal is preferred.
  • Methods for artificially regulating the sexual cycle in female mammals include, for example, follicle stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin (PMSG)), then luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin (hCG). )) Is preferably administered, for example, by intraperitoneal injection.
  • PMSG horse serum gonadotropin
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • the gene encoding the protein of the present invention is artificially transplanted and implanted in a female mammal after introducing the gene encoding the protein of the present invention into the resulting fertilized egg by the method described above.
  • a non-human mammal having a DNA incorporating can be obtained.
  • mating with a male mammal will result in artificial implantation and implantation of a fertilized egg obtained in a pseudopregnant female mammal whose fertility has been induced. Is preferable.
  • LHRH luteinizing hormone-releasing hormone
  • mice early embryos can be used in addition to fertilized eggs as totipotent cells into which genes are introduced.
  • DNA microinjection is preferable in consideration of the yield rate of transgenic non-human mammal individuals and the efficiency of transgene transfer to the next generation. Further, the number of introduced genes to be injected may be, for example, 100 to 3000 molecules per fertilized egg.
  • the fertilized egg into which the gene has been injected is then transplanted into the oviduct of a foster parent, and after raising and born the animal to a foster parent, a part of the body (in the case of a mouse, for example, the tail) DNA can also be extracted and the presence of the transgene can be confirmed by Southern analysis or PCR. If the individual in which the presence of the transgene is confirmed is the founder (Founder), the transgene is transmitted to 50% of the offspring (F1). Furthermore, by crossing this F1 individual with a wild-type animal or another F1 animal, an individual (F2) having a transgene in one (heterozygous) or both (homozygous) of a diploid chromosome can be produced. it can.
  • the transgenic non-human mammal may have a genetic encoding the protein of the present invention. It can also be created by introducing the pup into ES cells.
  • the gene is introduced into an HPRT-negative ES cell (embryonic stem cell) that is derived from a normal mouse blastcyst and lacks a hypoxanthine phosphiribosyltransferase gene.
  • HPRT-negative ES cell embryonic stem cell
  • ES cells in which the gene is integrated on the mouse endogenous gene are selected by the HAT selection method.
  • the selected ES cells are then microinjected into fertilized eggs (blastocysts) that have also acquired normal mouse power.
  • the blastocyst is transplanted into the uterus of another normal mouse as a foster parent.
  • a heterotransgenic mouse can be obtained by crossing the chimeric transgenic mouse with a normal mouse. By crossing the heterotransgenic mice, homotransgenic mice can be obtained.
  • transgenic non-human mammal of the present invention examples include the organelles, cells, tissues and organs of the non-human mammal, as well as the head, fingers, hands, feet, abdomen and tail.
  • Non-human mammals include, for example, mice, rats, mice, mussels, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, horses, rabbits, hidges, pigs, goats, monkeys, etc. It is not a thing.
  • a mouse that is preferably a rodent mammal such as a mouse, a rat, or a guinea pig is particularly preferable.
  • mice include C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains, and B6C3F1 strain, BDF1 strain, B6D2F1 strain, Balb / c strain, ICR strain, etc. as hybrid strains. Balb / c Strain mice are preferred.
  • Transgenic non-human mammals expressing one or more of the proteins of the present invention such as MGFP, Mred or Mluc are transplanted with cells expressing the corresponding fluorescent protein or active luciferase, respectively.
  • Biochemical experiments can be carried out by tracking the movement, proliferation, etc. of the cells using the fluorescence or luminescence generated by the action of the activated luciferase as an index.
  • a transgenic non-human mammal that expresses MGFP can be transplanted with cells that express a fluorescent GFP variant, and biochemical experiments can be performed using the fluorescence as an indicator.
  • EGFP is preferably used as the fluorescent GFP mutant.
  • Cells expressing a fluorescent protein or active luciferase can be transferred to a gene encoding a fluorescent protein or active luciferase in the same manner as in the method of introducing a gene construct such as the above expression vector into a fertilized egg or the like. It can be prepared by introducing and culturing. Examples of cells that express a fluorescent protein or activated luciferase include colon 26 cells, cultured cancer cells such as HCA-7 human colon cancer cells, embryonic cells' fetal cells, organ cells in early differentiation, and the like.
  • biochemical experiments include experiments in which cancer cell metastasis is performed using cultured cancer cells that express a fluorescent protein or active luciferase. It is also possible to test and develop therapeutic drugs using the increase or decrease of fluorescent cells or luminescent cells as an index. Other biochemical experiments include organ stem cell transplant experiments and basic experiments in regenerative medicine.
  • MGFP is a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
  • Mred is a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing
  • Mluc is described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • a protein having the following amino acid sequence was used.
  • ludferase represents firefly luciferase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing.
  • the TAC codon at position 66 of the EGFP cDNA was changed to the GCC codon (alanine), and the pCX-MGFP vector was prepared in the same manner as the pCX-EGFP vector.
  • the insert containing the promoter, MGFP cDNA, and polyaduration signal is pCX-
  • the MGFP vector was cleaved with BamHI and Sail, and the resulting fragment was purified with phenol and chloroform (see FEBS Lett. 407: 313-319, 1997).
  • the purified fragment was inserted into a fertilized egg of a Balb / c mouse by a microinjection method to produce a transgenic mouse strain (transgenic mouse strain was produced at Laboratory Animal Central Laboratory (Kawasaki)).
  • 393 fertilized eggs with DNA inserted were transplanted into pseudopregnant mother mice, and 45 offspring mice were obtained.
  • the presence or absence of the transgene was confirmed by performing Southern blotting using MGFPcDNA as a template for DNA collected from the tail tissue force.
  • pCX-EGFP and pCX-MGFP plasmids were inserted into 293T and Colon26 cells, respectively, using Lipofectamine (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. After 72 hours, a cell lysate was prepared, separated, blotted onto a nylon membrane, and incubated with an anti-EGFP antibody (Molecular Probes). The results of Western blotting are shown in FIG. EGFP or MGFP based on the inserted gene is produced in 293T and Colo n26 cells!
  • the C 0 lon26 and 293T cells were subjected to the same gene transfer and Example 3, after gene introduction 70 hours, monitored by fluorescence microscopy ((Leica), were taken.
  • Figure 3 and 4 top results in each cell, medium For quantification, cells were analyzed using FACS Calibur (Becton Dickinson) V. Fluorescence observed in cells introduced with EGFP gene was not observed in cells introduced with MGFP. This result was also confirmed by flow cytometry ( Figures 3 and 4 bottom).
  • Colon26 cells expressing EGFP were transplanted into the rectal submucosa of female Balb / c mice (CLEA) according to the method already reported (Cancer Lett. 169: 77-85, 2001). The same was done for MGFP transgenic mice. Two weeks later, the transplanted mouse force was collected from each of the sera and used as a primary antiserum for Western blotting. The results are shown in Fig. 5. It can be seen that anti-EGFP antibody and anti-MGFP antibody were produced in the serum of Balb / c mice transplanted with Colon26 cells expressing EGFP. Meanwhile, Transgenic Mouse In serum, the difference between anti-EGFP antibody and anti-MGFP antibody is also produced.
  • Colon26 cells or colon26 cells expressing EGFP (1 ⁇ 10 6 cells) were transplanted into Balb / c mice or MGFP transgenic mice submucosa connective tissue. After 4 weeks, the volume of the primary lesion formed in the rectum was measured and compared in both mice. The result is shown in FIG. Colon26 cells expressing EGFP show slower growth in immunoresponsive Balb / c mice than colon26 cells that do not express EGFP. Growth in MGFP transgenic mice was the same for both.
  • pCX-DsRed monomer and pCX-Mred plasmid were each inserted into 293T cells using Lipofectamine (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. After 72 hours, a cell lysate was prepared, separated, blotted onto a nylon membrane, and incubated with an anti-DsRed antibody (TAKARA Clontech). The result of Western blotting is shown in FIG. It can be seen that DsRed monomer or Mred is produced based on the inserted gene in 293T!
  • the pCX-luciferase and pCX-Mluc plasmids were each inserted into 293T cells using Lipofectamine (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. After 72 hours, a cell lysate was prepared, separated, blotted onto a nylon membrane, and incubated with an anti-luciferase antibody (Chemicon). The results of Western blotting are shown in FIG. Luciferase or Mluc based on the inserted gene in 293T is produced!
  • the present invention provides a transgenic non-human mammal useful for cancer cell transplantation experiments, stem cell transplantation experiments for various organs, and basic experiments for regenerative medicine.

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Abstract

 癌細胞の移植実験及び多様な臓器の幹細胞移植実験や再生医療の基礎実験に有用な、蛍光性蛋白質やルシフェラーゼにより標識された培養癌細胞に対する免疫反応を回避した実験動物、例えば、EGFPアミノ酸配列の66位、67位、及び68位から選択される一個以上の位置に置換、欠失、又は挿入があり、かつ実質的に非蛍光性であるGFP変異体（例えば、配列表の配列番号２に記載の蛋白質等）及び該蛋白質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。

Description

蛍光性蛋白質の非蛍光性変異体を発現するトランスジエニック非ヒト哺乳 動物
技術分野
[0001] 本発明は蛍光性蛋白質の非蛍光性変異体及び該変異体を発現するトランスジェニ ック非ヒト哺乳動物 (例えば、非蛍光性 GFP変異体及び該 GFP変異体を発現するトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物）、ならびにルシフェラーゼ活性を有しないルシフェラー ゼ変異体及び該変異体を発現するトランスジエニック非ヒト哺乳動物に関する。
背景技術
[0002] 緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescent Protein:GFP)はクラゲの Aequorea victoria由 来の天然蛋白質であり、その蛍光性はアミノ酸配列中のトリペプチド (Ser65-Tyr66- G1 y67)力もなる環状の蛍光発色団を囲んだ β一バレル構造に由来している。蛍光性を 維持又は改善した蛍光性 GFP変異体について数多くの報告がなされており（米国特 許 5625048号明細書、国際公開 WO96/23810号、米国特許 5804387号明細書、特表 2000-509987号公報、米国特許 6054321号明細書、国際公開 WO03/029286号）、そ の中で、 65位セリンのスレオニンへの置換を含む変異体は、人工的アミノ酸置換によ つて蛍光を増幅させた EGFP (enhanced GFP)として、生物 ·医学研究に広く使用され ている（非特許文献 1 : Nature Reviews Genetics 4: 613-625, 2003)。
[0003] EGFPの有用な用途と 1つとして培養癌細胞の標識が挙げられる。例えば、マウス C olon26細胞は直腸粘膜下組織に移植されると、組織基質と相互作用して初期癌を形 成し、さら〖こ、リンパ節、肝臓、及び肺等の他の組織に広がって転移するが、 EGFPを 発現させたマウス Colon26細胞を用いることによりこの転移が追跡できる。すなわち、 E GFPを発現させた癌細胞を実験動物に移植し、インビボでこの蛍光細胞をモニター することにより、転移工程の制御の解明や、治療薬の試験開発を行うことができる。
[0004] し力し、 EGFPを発現させた Balb/cマウス系統由来の Colon26細胞を同系マウスに移 植すると細胞性 T細胞応答が引き起こされること (非特許文献 2 : Gene Therapy, 6, 13 05-1312, 1999)及び、 EGFPを発現させると Balb/cマウス系統由来の Colon26細胞の 同系マウスの肝臓での転移の効率が落ちること（非特許文献 3 : Clin. & Exp. Metasta sis 20, 135-141, 2003)が報告され、免疫反応により EGFP発現癌細胞のマウス生体 への移植率が低下するという問題点があることがわ力つた。従って、このような免疫反 応を回避した EGFPを有効な指標として使用することのできる実験動物が望まれてい た。
[0005] また、同様に、 EGFP以外の蛍光性蛋白質や生物発光を触媒する酵素により標識さ れた培養癌細胞に対する免疫反応を回避した実験動物が望まれていた。
特許文献 1：米国特許 5625048号明細書
特許文献 2：国際公開 WO96/23810号
特許文献 3：米国特許 5804387号明細書
特許文献 4：特表 2000-509987号公報
特許文献 5：米国特許 6054321号明細書
特許文献 6：国際公開 WO03/029286号
非特許文献 1 : Nature Reviews Genetics 4: 613-625, 2003
非特許文献 2 : Gene Therapy 6, 1305-1312, 1999
非特許文献 3 : Clin. & Exp. Metastasis 20, 135-141, 2003
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の課題は、蛍光性 GFP変異体を発現する細胞に対する免疫反応を回避し た実験動物を提供し、さらに蛍光性蛋白質ゃルシフ ラーゼにより標識された培養癌 細胞に対する免疫反応を回避した実験動物を提供することである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは上記課題の解決のため鋭意検討した結果、 EGFPと同じ抗原性を示 すが非蛍光性である GFP変異体を発見し、この GFP変異体を発現するトランスジェ- ックマウスカ ¾GFPを発現させた Colon26細胞によって抗 EGFP抗体を産生しないこと を見出した。本発明はこれらの知見を基に完成されたものである。
[0008] すなわち本発明は、蛍光性蛋白質のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換及び Z又は付加されているアミノ酸配列であって、該蛍光性蛋白質を 発現する細胞の表面の主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)により提示される該蛍光 性蛋白質のアミノ酸残基を含み、かつ該蛍光性蛋白質の蛍光性発色団を形成する アミノ酸残基の少なくとも 1つに欠失、置換及び Z又は付加があるアミノ酸配列を有 する、実質的に非蛍光性である蛋白質を提供する。より具体的には、本発明は、配 列表の配列番号 1もしくは 5に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号 1もしくは 5 に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付 カロされていてもよいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質と同じ抗原性を示し、かつ実 質的に非蛍光性である蛋白質を提供する。
[0009] 本発明の好ましい態様によれば、配列表の配列番号 1もしくは 5に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 1もしくは 5に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数 個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽてもよ ヽアミノ酸配列を有する蛍 光性蛋白質において、下記（1)〜（3)：
(1) 66位、 67位、及び 68位から選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
(2) 66位、 67位、及び 68位力 選択される一個以上のアミノ酸の欠失;及び
(3) 66位及び 67位アミノ酸間、並びに 67位及び 68位アミノ酸間への 1以上のアミノ酸 の挿入
から選択される何れか 1以上の変異が存在し、かつ実質的に非蛍光性である蛋白質 が提供される。
本発明のさらに好ましい態様によれば、 67位がァラニン又はグリシンである上記い ずれかの蛋白質、配列表の配列番号 2に記載の配列を有する蛋白質、および配列 表の配列番号 6に記載の配列を有する蛋白質が提供される。
[0010] 本発明の別の観点からは、上記のいずれかの蛋白質をコードする遺伝子;配列表の 配列番号 3に記載の塩基配列を有する遺伝子;配列表の配列番号 7に記載の塩基 配列を有する遺伝子；上記の!/、ずれかの遺伝子を含むベクター；上記の!/、ずれかの 蛋白質を発現するトランスジヱニックマウス等のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物が提 供される。
本発明のさらに別の観点力もは、上記のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物に、対応 する蛍光性蛋白質を発現する細胞を移植する工程を含む生物化学的実験法が提供 される。
[0011] また、本発明は、活性型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されているアミノ酸配列であって、該活性型ルシフ エラーゼを発現する細胞の表面の主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)により提示さ れる該活性型ルシフェラーゼのアミノ酸残基を含み、かつ該活性型ルシフェラーゼの 活性部位を形成するアミノ酸残基の少なくとも 1つに欠失、置換及び Z又は付加があ るアミノ酸配列を有する、実質的にルシフェラーゼ活性を有しない蛋白質を提供する
[0012] 本発明は、より具体的には、配列表の配列番号 8に記載のアミノ酸配列又は配列表 の配列番号 8に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換 及び Z又は付加されて ヽてもよ ヽアミノ酸配列を有する活性型ルシフェラーゼと同じ 抗原性を示し、かつ実質的にルシフェラーゼ活性を有しない蛋白質を提供するもの である。本発明の好ましい態様によれば、配列表の配列番号 8に記載のアミノ酸配列 又は配列表の配列番号 8に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、置換及び Z又は付加されて ヽてもよ ヽアミノ酸配列を有する活性型ルシフェラ ーゼのアミノ酸配列において、下記（7)〜（9)：
(7) 245位、及び 529位力 選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
(8) 245位、及び 529位力 選択される一個以上のアミノ酸の欠失;及び
(9) 244位及び 245位アミノ酸間、 245位及び 246位アミノ酸間、 528位及び 529位ァミノ 酸間、並びに 529位及び 530位アミノ酸間への 1以上のアミノ酸の挿入
から選択される何れか 1以上の変異が存在するアミノ酸配列を有し、かつ実質的にル シフェラーゼ活性を有しない蛋白質が提供される。本発明のさらに好ましい態様によ れば、 245位がアルギニンである上記の蛋白質、 529位がグルタミンである上記いず れかの蛋白質、配列表の配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質が提供さ れる。
[0013] 本発明の別の観点からは、上記のいずれかの蛋白質をコードする遺伝子;配列表 の配列番号 10に記載の塩基配列を有する遺伝子；上記 、ずれかの遺伝子を含むベ クタ一；上記いずれかの蛋白質を発現するトランスジエニックマウス等のトランスジェ- ック非ヒト哺乳動物が提供される。
本発明のさらに別の観点からは、上記いずれかのトランスジヱニック非ヒト哺乳動物 に配列表の配列番号 8に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号 8に記載のアミ ノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて 、て もよいアミノ酸配列を有する活性型ルシフェラーゼを発現する細胞を移植する工程を 含む生物化学的実験法が提供される。
図面の簡単な説明
[図 1]EGFPにおける抗原性ェピトープのコンピューター解析の結果である。囲われた 文字は Kd及び Ddそれぞれによって提示されないアミノ酸を示す。
[図 2]EGFP及び MGFPの 293T及び Colon26細胞における発現を示したウェスタンブロ ッティングである。
[図 3]EGFP又は MGFPを発現する Colon26細胞の蛍光顕微鏡撮影写真及びフロー サイトメトリーである。
[図 4]EGFP又は MGFPを発現する 293T細胞の蛍光顕微鏡撮影写真及びフローサイ トメトリーである。
[図 5]細胞移植によりマウス血清中に産出された抗体を検出するウェスタンプロッティ ングである。
[図 6]通常の Balb/cマウスと本発明のトランスジエニックマウスにおける EGFP発現細胞 の原発巣体積を比較したグラフである。
[図 7]DsRedモノマー及び Mredの 293T細胞における発現を示したウェスタンブロッテ イングである。
[図 8]DsRedモノマー又は Mredを発現する 293T細胞と EGFP及び DsRedモノマー又 は EGFP及び Mredを発現する 293T細胞との蛍光顕微鏡撮影写真を比較して示した 図である。
[図 9]DsRedモノマー又は Mredを発現する 293T細胞のフローサイトメトリーである。
[図 10]luciferase及び Mlucの 293T細胞における発現を示したウェスタンブロッテイン グである。
[図 ll]luciferase又は Mlucを発現する 293T細胞及び Colon26細胞のルシフェラーゼ 活性を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明の蛋白質は、蛍光性蛋白質と同じ抗原性を示すが実質的に非蛍光性であ る変異体であること、または、ルシフェラーゼと同じ抗原性を示すが実質的にルシフエ ラーゼ活性を有しな 、変異体であることを特徴とする。本明細書にぉ 、て「実質的に 非蛍光性」とは、対応する蛍光性蛋白質の蛍光強度と比較して 1%以下の強度の蛍 光を発し、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーで実質的に蛍光が観測されないことを いう。また、「実質的にルシフヱラーゼ活性を有しない」とは、当業者に公知の活性測 定方法において得られる活性を示す値が活性型ルシフェラーゼの値と比較して 5% 以下であることを意味する。
蛍光'性蛋白質としては、 GFPのほ力、、 DsRed (Discosoma striata red fluorescent pro tein)などが挙げられる。ルシフェラーゼは生物発光を触媒する酸ィ匕酵素を意味し、例 えばホタルルシフェラーゼなどが挙げられる。
[0016] 本明細書において「蛍光性 GFP変異体」とは、「配列表の配列番号 1に記載のァミノ 酸配列又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽてもよ ヽアミノ酸配列を有する蛍光性蛋 白質」を意味し、野生型 GFP (配列表の配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有する蛋 白質)を含む意味である。その他の蛍光性 GFP変異体の例としては例えば EGFP (配 列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質)などが挙げられる。また、 本明細書においては、蛍光性 GFP変異体と同じ抗原性を示すが実質的に非蛍光性 である変異体を GFP変異体または MGFPということがある。
[0017] 本明細書において「蛍光性 DsRedモノマー」とは「配列表の配列番号 5に記載のアミ ノ酸配列又は配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のァ ミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽてもよ ヽアミノ酸配列を有する蛍光性蛋 白質」を意味する。また、本明細書においては、蛍光性 DsRedモノマーと同じ抗原性 を示すが実質的に非蛍光性である変異体を DsRedモノマー変異体または Mredという ことがある。
[0018] 本明細書にぉ 、て「活性型ルシフェラーゼ」とは生物発光を触媒する酸化酵素活 性を有する蛋白質を意味する。また、本明細書においては、活性型ルシフェラーゼと 同じ抗原性を示すが実質的に非蛍光性である変異体をルシフ ラーゼ変異体または
Mlucということがある。
[0019] 選択された蛋白質と同じ抗原性を示す蛋白質としては、選択された蛋白質を発現 する細胞の細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)により提示されるァミノ 酸残基を維持する蛋白質が挙げられる。細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（ MHC)により提示されるアミノ酸残基については、提示されたアミノ酸断片の配列分 析などの手法により実験的に確認する力、又はプログラムにより予測することができる 。プログラムを用いた予測としては例えば、 HLA peptide Binding Predictions (http:// bimas.dcrt.nih.gov:80/molbio/hla_bindん Parker, 1994)を使用することができる。
[0020] 本発明者らが、 HLA peptide Binding Predictionsを使用して EGFP (蛍光性 GFP変 異体)のアミノ酸配列を基に細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)により 提示されるアミノ酸残基を予測した結果、 EGFPの蛍光発色団を構成する 3アミノ酸 (6 6位- 68位)は、図 1に示すように MHCによって Balb/cマウスの細胞表面に提示されて いないことが分かった。なお、図中、 Kdはマウスゲノム中の H-2K遺伝子座にコードさ れるクラス I MHC分子、 Ddはマウスゲノム中の H-2D遺伝子座にコードされるクラス I M HC分子を示し、囲われた文字に該当するアミノ酸残基が MHC分子により提示されな いことを示す。
同様に後述の DsRedモノマーの蛍光発色団を構成する 3アミノ酸 (66位- 68位)、およ びホタルルシフェラーゼの活性部位の一部を構成する 244位、 245位、および 246位 のアミノ酸残基は、 MHCによって Balb/cマウスの細胞表面に提示されていないことが 分かった。
[0021] 蛍光性のない蛍光性蛋白質の変異体は、例えば、蛍光性蛋白質の蛍光発色団の 形成を阻害するような改変のある変異体とすることにより形成することができる。また、 ルシフェラーゼ活性を実質的に有しな ヽルシフェラーゼの変異体は、活性部位の構 造が変化する変異体とすることにより形成することができ、例えば、ルシフ ラーゼ基 質 (ルシフェリン）との結合に関わるアミノ酸残基、またはその近傍のアミノ酸残基が欠 失、置換している力、または該残基の近傍でアミノ酸付加のある変異体とすることによ り形成することができる。例えば、ホタルルシフェラーゼについては、 245位のヒスチジ ンもしくは 529位のリジンがルシフェラーゼ活性部位の構造維持'電子伝達'基質との 結合等に必要と考えられることが報告されている（Biochemistry 1999, 38:13223-1323 0)。
[0022] 蛍光性のな!、GFP変異体としては、例えば EGFPの 66位、 67位、及び 68位からなる トリペプチドから構成される蛍光発色団の形成を阻害するような改変のある MGFPで あればよぐそのような GFP変異体としては、 EGFP又は EGFPのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽるアミノ酸配列を有す る蛍光性蛋白質において下記（1)〜（3)：
(1) 66位、 67位、及び 68位から選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
(2) 66位、 67位、及び 68位力 選択される一個以上のアミノ酸の欠失;及び
(3) 66位及び 67位アミノ酸間、並びに 67位及び 68位アミノ酸間への 1以上のアミノ酸 の挿入から選択される何れか 1以上の変異が存在する蛋白質が挙げられる。ここで、 EGFPのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加 されているアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質については、アミノ酸の欠失又は付加 等により配列番号にズレが生じる場合がある力 該蛋白質における 66位、 67位、及び 68位は、 EGFPのアミノ酸配列における 66位、 67位、及び 68位（Thr66-Tyr67-Gly68) に該当する位置を示す。上述の本発明者らの予測力 このようなペプチドは蛍光性 G FP変異体と同じ抗原性を示す蛋白質でもある。これらのうちで、 66位、 67位、及び 68 位力 選択される一個以上の位置にアミノ酸置換がある蛋白質が好ましい。
なお、本明細書において、「数個」とは 2個以上 10個以下、好ましくは 2個以上 6個 以下を意味する。
[0023] 蛍光性 GFP変異体については上述のように数多く報告されている力 本発明の蛋 白質はこれらの蛍光性 GFP変異体を含まない。蛍光性 GFP変異体としては、野生型 GFP (配列表の配列番号 4に記載のアミノ酸配列）において、 65位セリンのグリシン、 ァラニン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、システィン、又はスレオニンへの置換を有す る変異体及び 66位チロシンのヒスチジン、トリプトファン、又はフエ-ルァラニンへの置 換を有する変異体が挙げられる。野生型 GFPアミノ酸配列において、 65位、 66位、又 は 67位の 2箇所以上に置換があることにより、上述の 65位セリン及び 66位チロシンの 置換を含むが非蛍光性である変異体は本発明の範囲に含まれる。 MGFPとしては、 野生型 GFPのアミノ酸配列において、 66位がグリシン又はァラニンであることが好ま しぐ 66位がァラニンであることが最も好ましい。このとき 65位セリンはスレオニンであ ることが好ましい。さらに好ましくは、 MGFPは、 EGFPのアミノ酸配列において、好まし くは、 67位のグリシン又はァラニンへの置換を有する蛋白質であり、さらに好ましくは 6 7位のァラニンへの置換を有する蛋白質であり、最も好ましくは配列表の配列番号 2 に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質である。
[0024] 蛍光性のない DsRedモノマー変異体としては、例えば DsRedモノマーのアミノ酸配 列にお!、て 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて 、るアミノ酸 配列を有する蛍光性蛋白質にお!、て下記 (4)〜（6)：
(4) 66位、 67位、及び 68位から選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
(5) 66位、 67位、及び 68位力 選択される一個以上のアミノ酸の欠失;及び
(6) 66位及び 67位アミノ酸間、並びに 67位及び 68位アミノ酸間への 1以上のアミノ酸 の挿入から選択される何れか 1以上の変異が存在する蛋白質が挙げられる。ここで、 DsRedモノマーのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z 又は付加されているアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質については、アミノ酸の欠失 又は付加等により配列番号にズレが生じる場合がある力 該蛋白質における 66位、 6 7位、及び 68位は、 DsRedモノマーのアミノ酸配列における 66位、 67位、及び 68位（G1 n66-Tyr67-Gly68)に該当する位置を示す。後述の実施例で示すように、このような 蛋白質は DsRedモノマーと同じ抗原性を示す蛋白質でもある。これらのうちで、 66位、 67位、及び 68位力 選択される一個以上の位置にアミノ酸置換がある蛋白質が好ま しぐ 66位にアミノ酸置換がある蛋白質がより好ましぐ 66位がグリシン又はァラニンで ある蛋白質がさらに好ましく、 66位がァラニンである蛋白質が最も好ま 、。
[0025] ルシフ ラーゼ活性のないルシフ ラーゼ変異体としては、例えば、配列表の配列 番号 8に記載のホタルルシフ ラーゼのアミノ酸配列又は配列表の配列番号 8に記 載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加さ れて 、てもよ 、アミノ酸配列を有する活性型ルシフェラーゼのアミノ酸配列にお 、て、 下記 (7)〜（9) :
(7) 245位、及び 529位力 選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
(8) 245位、及び 529位力 選択される一個以上のアミノ酸の欠失;及び
(9) 244位及び 245位アミノ酸間、 245位及び 246位アミノ酸間、 528位及び 529位ァミノ 酸間、並びに 529位及び 530位アミノ酸間への 1以上のアミノ酸の挿入力 選択される 何れ力 1以上の変異が存在する蛋白質が挙げられる。
[0026] ここで、ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失 、置換及び/又は付加されて ヽるアミノ酸配列を有する活性型ルシフェラーゼにつ いては、アミノ酸の欠失又は付加等により配列番号にズレが生じる場合があるが、該 蛋白質における 244位、 245位、 246位、 528位、 529位、及び 530位は、配列番号 8に 記載のホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における 245位、 245位、 246位、 528位、 5 29位、及び 530位に該当する位置を示す。後述の実施例で示すように、このような蛋 白質は配列番号 8に記載のホタルルシフ ラーゼと同じ抗原性を示す蛋白質でもあ る。これらのうちで、 245位、及び 529位力も選択される一個以上の位置にアミノ酸置 換がある蛋白質が好ましく、 245位がアルギニン及び Z又は 529位がグルタミンである 蛋白質がより好ましぐ 245位がアルギニンである蛋白質がさらに好ましい。
[0027] 上記の MGFP、 Mredまたは Mlucなどの本発明の蛋白質をコードする遺伝子の作製 方法としては、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発を用いた方法等の当 業者に既知の方法のいずれを用いてもよい。例えば、変異前の蛋白質 (蛍光性 GFP 変異体、蛍光性 DsRedモノマー、活性型ルシフェラーゼ）をコードする DNAに対して 変異原となる薬剤を接触作用させたり、紫外線を照射したり、あるいは PCR法などの 遺伝子工学的手法を用いることにより MGFPをコードする遺伝子を得ることができる。 また、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法については、 Molecul ar Cloning: A laboratory Mannual, 2nd ED., し old Spring Harbor Laboratory, し old Spring Harbor, NY. ,1989、及び Current Protocols in Molecular Biology, Supplemen t 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997)を参照することができる。また、市販の変異用 キットを用いることもできる。市販の変異用キットとしては、 QuikChange II Site-Directe d Mutagenesis Kit (Stratagene)等を挙げることができる。 [0028] 本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物は、未受精卵、受精卵、精子及びその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚 発生の段階 (さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に 8細胞 期以前）において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフエクシヨン法、凝集法、 マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、 DEAE—デキストラン法などにより本 発明の蛋白質のいずれかをコードする遺伝子を含む導入遺伝子を導入することによ り作製することができる。また、該遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織 細胞などに本発明の蛋白質のいずれかをコードする遺伝子を含む導入遺伝子を転 移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚 芽細胞と公知の細胞配合法により融合させることによりトランスジヱニック非ヒト哺乳動 物を作製することもできる。
[0029] トランスジエニック非ヒト哺乳動物の作製のために用いる導入遺伝子は、上記の本 発明の蛋白質のいずれかをコードする遺伝子を適当な哺乳動物用プロモーターの 下流に連結した遺伝子構築物とすることが好ましい。例えば、各種プロモーターの下 流に、上記の本発明の蛋白質のいずれかをコードする遺伝子を含む導入遺伝子を 連結した発現ベクターを用いてもよぐまた、発現ベクターとして作製した後、制限酵 素で切断して精製等を行った遺伝子構築物を用いてもよ!ヽ。
[0030] 発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由 来のプラスミド、 λファージなどのバタテリオファージ、モロ-一白血病ウィルスなどの レトロウイルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが 用いられ、公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。
[0031] 遺伝子構築物に用いる哺乳動物用プロモーターの種類は、非ヒト哺乳動物で作動 可能であれば特に限定されないが、例えば、ウィルス（例、サイトメガロウィルス、モロ ニー白血病ウィルス、 JCウィルス、乳癌ウィルスなど）由来遺伝子プロモーター、各種 哺乳動物（例えば、ヒト、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど
)由来のプロモーターなどが用いられる。各哺乳動物由来のプロモーターとしては、 例えば、ァノレブミン、エンドセリン、メタ口チォネイン、平滑筋 αァクチン、ポリペプチド 鎖延長因子 l a (EF— 1 « )、 βァクチン、 α及び j8ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖 1及 び 2、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイド Pコンポーネント、レニンなどのプロモータ 一を用いることができる。
[0032] 好ましいプロモーターとしては、 j8ァクチンプロモーター及び CMV (サイトメガロウイ ルス）プロモーターなどが挙げられる。これらのプロモーターは一般的に CMVェンハ ンサ一との組み合わせとして使用される。このような組み合わせとしては例えば、 pCA S； chic en beta— actin promoter and cytomegalo virus enhancer. Beta— actin intro n ana bovine globin poly— adenylation signal (Gene, 108,1 93, 1991参照)等 »罕げら れる。
[0033] 遺伝子構築物においては、プロモーター配列の上流にェンハンサー配列を含んで いてもよい。使用できるェンハンサー配列としては上記した CMVェンハンサーなど が挙げられる。
また、遺伝子構築物においては、必要に応じて、上記の本発明の蛋白質をコード する遺伝子の下流には、ポリ Aシグナルを連結してもよい。ポリ A付加シグナル配列 の具体例としては、 SV40ポリ A付加シグナルなどが挙げられる力 これに限定されな い。また、必要に応じて真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の 5' 上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3'下流に連結してもよい
[0034] 例えば、トランスジエニック非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物の受精卵に本発明の 蛋白質をコードする遺伝子又は該遺伝子を含む遺伝子構築物を導入し、当該受精 卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物から本発明の蛋白質 をコードする遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより作製すること ができる。
受精卵細胞段階で遺伝子導入する場合は、対象の哺乳動物の胚芽細胞及び体細 胞の全てに存在するようにすることが好ましい。トランスジエニック後の作出動物の胚 芽細胞において導入遺伝子が存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細 胞及び体細胞の全てに導入遺伝子を有することを意味する。遺伝子を受け継 、だこ の種の動物の子孫はその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明の蛋白質をコードす る遺伝子を有する。本発明の蛋白質をコードする遺伝子を相同染色体の両方に持つ ホモザィゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が 該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を過剰に有することを確認して、通常の飼 育環境で繁殖継代することができる。
[0035] 導入遺伝子を対象非ヒト哺乳動物またはその先祖の受精卵に転移する際に用いら れる受精卵は、同種の雄哺乳動物と雌哺乳動物を交配させることによって得られる。 受精卵は自然交配によっても得られるが、雌哺乳動物の性周期を人工的に調節した 後、雄哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌哺乳動物の性周期を人工的に調節 する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン (妊馬血清性性腺刺激ホルモン ( PMSG) )、次 、で黄体形成ホルモン (ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン (hCG) )を例えば 腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。
[0036] 得られた受精卵に前述の方法により本発明の蛋白質をコードする遺伝子等を導入 した後、雌哺乳動物に人工的に移植'着床することにより、本発明の蛋白質をコード する遺伝子を組み込んだ DNAを有する非ヒト哺乳動物が得られる。好ましくは、黄体 形成ホルモン放出ホルモン (LHRH)を投与後、雄哺乳動物と交配させることにより、 受精能を誘起された偽妊娠雌哺乳動物に得られた受精卵を人工的に移植 ·着床さ せる方法が好ましい。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵 のほかに初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、ト ランスジ ニック非ヒト哺乳動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率 を考慮した場合、 DNAのマイクロインジェクションが好ましい。また、注入する導入遺 伝子の数は受精卵 1個当たり、例えば 100〜3000分子であればよい。
[0037] 遺伝子注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した 動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例えば、尾部先 端)力も DNAを抽出し、サザン解析や PCR法により導入遺伝子の存在を確認すること ができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代 (Founder)とすれば、導入遺 伝子はその子 (F1)の 50%に伝達される。さらに、この F1個体を野生型動物または 他の F1動物と交配させることにより、 2倍体染色体の片方 (ヘテロ接合)または両方（ ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体 (F2)を作成することができる。
[0038] あるいは、トランスジエニック非ヒト哺乳動物は、本発明の蛋白質をコードする遺伝 子を ES細胞に導入することによって作製することもできる。例えば、正常マウス胚盤 胞（blastcyst)に由来する HPRT陰性（ヒポキサンチングァニン ·フォスフオリボシルトラ ンスフェラーゼ遺伝子を欠いている） ES細胞（embryonic stem cell)に、遺伝子を導 入する。遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされた ES細胞を HATセレ クシヨン法により選別する。次いで、選別した ES細胞を、別の正常マウス力も取得し た受精卵 (胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正 常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウ スが生まれる。該キメラトランスジエニックマウスを正常マウスと交配させることによりへ テロトランスジェニックマウスを得ることができる。該ヘテロトランスジェニックマウス同 士を交配することにより、ホモトランスジエニックマウスが得られる。
[0039] 上記した本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物の子孫、並びに該トランスジェ- ック非ヒト哺乳動物の一部も本発明の範囲内である。トランスジ ニック非ヒト哺乳動 物の一部としては、該非ヒト哺乳動物の細胞内小器官、細胞、組織及び臓器のほか 、頭部、指、手、足、腹部、尾などが挙げられる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ノ、ムスター、モルモット、ゥサギ、ィ ヌ、ネコ、ゥマ、ゥシ、ヒッジ、ブタ、ャギ及びサルなどが挙げられる力 これらに限定さ れるものではない。非ヒト哺乳動物としてはマウス、ラット、モルモットなどの齧歯目の 哺乳動物が好ましぐマウスが特に好ましい。マウスとしては、例えば、純系としては C 57BL/6系統， DBA2系統などが挙げられ、交雑系としては B6C3F1系統， BDF1系統， B6D2F1系統， Balb/c系統， ICR系統などが挙げられる力 Balb/c系統マウスが好ま しい。
[0040] MGFP、 Mredまたは Mlucなどの本発明の蛋白質の!/、ずれかを発現するトランスジェ ニック非ヒト哺乳動物に、対応する蛍光性蛋白質または活性型ルシフェラーゼを発現 する細胞をそれぞれ移植し、その蛍光または該活性型ルシフェラーゼの作用により 生じる発光を指標として該細胞の移動、増殖等を追跡し、生物化学的実験を行うこと ができる。
例えば、 MGFPを発現するトランスジヱニック非ヒト哺乳動物に、蛍光性 GFP変異体 を発現する細胞を移植し、その蛍光を指標として生物化学的実験を行うことができる 。蛍光性 GFP変異体としては例えば EGFPを用いることが好ま 、。
蛍光性蛋白質または活性型ルシフェラーゼを発現する細胞は、上述の発現べクタ 一等の遺伝子構築物を受精卵等に導入する方法と同様に、蛍光性蛋白質または活 性型ルシフェラーゼをコードする遺伝子を細胞に導入し培養すること等により調製す ることができる。蛍光性蛋白質または活性型ルシフェラーゼを発現させる細胞として は、 Colon26細胞、 HCA-7ヒト大腸癌細胞などの培養癌細胞、又は胚細胞'胎児細胞 や分化初期の臓器細胞等が挙げられる。
生物化学的実験としては、例えば、蛍光性蛋白質または活性型ルシフェラーゼを 発現する培養癌細胞を用いて癌細胞転移の等を行う実験等を挙げることができる。 蛍光性細胞または発光性細胞の増減を指標として治療薬の試験開発を行うことも可 能である。その他、生物化学的実験としては、臓器の幹細胞移植実験や再生医療の 基礎実験等が挙げられる。
実施例
[0041] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。なお、 MGFPとしては配列表の配列番号 2に記載のァミノ 酸配列を有する蛋白質、 Mredとしては配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列を 有する蛋白質、 Mlucとしては配列表の配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有する蛋 白質を用いた。また、実施例において、 ludferaseは配列表の配列番号 8に記載のァ ミノ酸配列を有するホタルルシフェラーゼを示す。
(例 1) MGFP発現ベクターの作製
サイトメガロウイノレスェンハンサー、ニヮトリ /3ァクチンプロモーター、 13ァクチンイン トロン、 EGFPの cDNA、及び牛グロビンポリアデ-ル化シグナルを含む pCX- EGFPベ クタ一を既に報告されている方法（FEBS Letters, 407,313,1997)に従って作製した。
QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて EGFPの cDNA の 66位チロシンの TACコドンを GCCコドン（ァラニン）に変えて、 pCX- EGFPベクター と同様に pCX- MGFPベクターを作製した。
[0042] (例 2) MGFPトランスジエニックマウスの作製
プロモーター、 MGFPcDNA、及びポリアデュル化シグナルを含む挿入部分は pCX- MGFPベクターから BamHI and Sailで切断し、得られたフラグメントをフエノール及びク ロロホルムで精製した（FEBS Lett. 407: 313-319, 1997参照）。精製したフラグメントを Balb/cマウス受精卵にマイクロインジェクション法により挿入し、トランスジエニックマウ ス株を産生した (トランスジエニックマウス株の産生は (財)実験動物中央研究所（川 崎)において行った)。 DNA挿入した受精卵を 393個、擬妊娠母親マウスに移植し、 45 の仔マウスを得た。トランス遺伝子の有無は、尾部組織力ゝら採取した DNAを MGFPcD NAをテンプレートとしたサザンブロッテイングを行うことにより確認した。
[0043] (例 3)発現ベクターの 293T及び Colon26細胞への挿入
pCX-EGFP及び pCX- MGFPプラスミドをそれぞれ Lipofectamine (Invitrogen)を用い て製造元のプロトコルに従って、 293T及び Colon26細胞に挿入した。 72時間後、細胞 溶解液を調製、分離してナイロン膜にブロットして抗 EGFP抗体 (Molecular Probes)と インキュベートした。このウェスタンブロッテイングの結果を図 2に示す。 293T及び Colo n26細胞にお!、て挿入された遺伝子に基く EGFP又は MGFPが産生されて!、ることが ゎカゝる。
[0044] (例 4)蛍光細胞の解析
例 3と同様の遺伝子導入を行った C0lon26及び 293T細胞を、遺伝子導入 70時間後 、蛍光顕微鏡 ((Leica)によって観測、撮影した。それぞれの細胞における結果を図 3 及び 4 (上、中）に示す。定量化のため細胞は FACS Calibur (Becton Dickinson)を用 Vヽて解析した。 EGFP遺伝子を導入した細胞で観測されて ヽる蛍光が MGFPを導入し た細胞では観測されていないことがわかる。この結果はフローサイトメトリーによっても 確認した（図 3及び 4下)。
[0045] (例 5)マウス血清中の抗 EGFP抗体の解析
EGFPを発現する Colon26細胞を雌性 Balb/cマウス (CLEA)の直腸粘膜下組織に、 既に報告されている方法（Cancer Lett. 169: 77-85, 2001)に従って移植した。 MGFP トランスジェニックマウスについても同様にした。 2週間後、移植されたマウス力もそれ ぞれ血清を採取し一次抗血清としてウェスタンブロッテイングに用いた。結果を図 5に 示す。 EGFPを発現する Colon26細胞を移植した Balb/cマウスの血清に抗 EGFP抗体 及び抗 MGFP抗体が産出されていることがわかる。一方、トランスジエニックマウスの 血清には、抗 EGFP抗体及び抗 MGFP抗体の 、ずれも産出されて 、な 、ことがわ力る
(例 6)細胞の移植率の解析
Colon26細胞又は EGFPを発現する Colon26細胞（1 X 106個）を、 Balb/cマウス又は MGFPトランスジエニックマウス直腸粘膜下結合組織内に移植した。 4週間後、直腸に 形成された原発巣の体積を測定して、両マウスで比較した。結果を図 6に示す。 EGF Pを発現する Colon26細胞は EGFPを発現しない Colon26細胞と比較して免疫応答性 Balb/cマウス中での増殖が遅いことがわかる。 MGFPトランスジエニックマウス中での 増殖は両者で同じであった。
(例 7) Mred発現ベクターの作製
サイトメガロウイノレスェンハンサー、ニヮトリ /3ァクチンプロモーター、 13ァクチンイン トロン、 DsRedモノマーの cDNA、及び牛グロビンポリアデ-ル化シグナルを含む pCX - DsRedモノマーベクターを既に報告されている方法（FEBS Letters, 407,313,1997) に従って作製した。 Quikし hange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) 用 いて DsRedモノマーの cDNAの 67位チロシンの TACコドンを GCCコドン（ァラニン）に 変えて、 pCX-DsRedモノマーベクターと同様に pCX- Mredベクターを作製した。
[0046] (例 8)発現ベクターの 293T細胞への挿入
pCX-DsRedモノマー及び pCX- Mredプラスミドをそれぞれ Lipofectamine (Invitroge n)を用いて製造元のプロトコルに従って、 293T細胞に挿入した。 72時間後、細胞溶 解液を調製、分離してナイロン膜にブロットして抗 DsRed抗体 (TAKARA Clontech)と インキュベートした。このウェスタンブロッテイングの結果を図 7に示す。 293Tにおいて 挿入された遺伝子に基く DsRedモノマー又は Mredが産生されて!、ることがわかる。
[0047] (例 9)蛍光細胞の解析
293T細胞につ!、て、 pCX- DsRedモノマーまたは pCX- Mredに加えて例 3と同様に 調製した pCX-EGFPを指標として遺伝子導入し、 72時間後、蛍光顕微鏡 (Leica)によ つて観測、撮影した。結果を図 8に示す。なお、定量ィ匕のため細胞は FACS Calibur ( Becton Dickinson)を用いて解析した。 pCX- EGFPを遺伝子導入した細胞では EGFP 由来の緑色蛍光が観察されており、遺伝子導入が成功していることが分かる。この状 況で DsRedモノマー遺伝子を導入した細胞では赤 、蛍光が観測された。一方 Mredを 導入した細胞では観測されていな力つた。この結果はフローサイトメトリーによっても 確認した（図 9)。
[0048] (例 10) Mluc発現ベクターの作製
サイトメガロウイノレスェンハンサー、ニヮトリ /3ァクチンプロモーター、 13ァクチンイン トロン、 EGFPの cDNA、及び牛グロビンポリアデ-ル化シグナルを含む pCX-luciferas e (ホタルルシフェラーゼ）ベクターを既に報告されている方法（FEBS Letters, 407,31 3,1997)に従つて作製した。 QuikCnange II Site-Directed Mutagenesis Kit (btratagen e)を用いてホタルルシフェラーゼの cDNAの 245位ヒスチジンの CACコドンを CGCコド ン（アルギニン）に変えて、 pCX- luciferaseベクターと同様に pCX- Mlucベクターを作 製した。
[0049] (例 11)発現ベクターの 293T細胞への挿入
pCX- luciferase及び pCX- Mlucプラスミドをそれぞれ Lipofectamine (Invitrogen)を用 いて製造元のプロトコルに従って、 293T細胞に挿入した。 72時間後、細胞溶解液を 調製、分離してナイロン膜にブロットして抗 luciferase抗体（Chemicon)とインキュベー トした。このウェスタンブロッテイングの結果を図 10に示す。 293Tにおいて挿入された 遺伝子に基く luciferase又は Mlucが産生されて!、ることがわ力る。
[0050] (例 12)ルシフェラーゼアツセィ
例 11の方法と同様に作製した pCX-luciferase及び pCX- Mlucをそれぞれ導入した 29 3T細胞、ならびに Colon26細胞をそれぞれ 24時間後に集め、ルシフヱリン基質をカロ ぇルシフェラーゼ活性を Dual Luciferase Assay Kit (Promega)で測定した。結果を図 1 1に示す。いずれの細胞においても、 pCX-luciferaseを導入した細胞に比較して pCX - Mlucを導入した細胞において、ルシフェラーゼ活性が大きく減少した。
産業上の利用可能性
[0051] 本発明により癌細胞の移植実験及び多様な臓器の幹細胞移植実験や再生医療の 基礎実験に有用なトランスジ ニック非ヒト哺乳動物が提供される。

Claims

請求の範囲 [I] 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号 1に記載のァミノ 酸配列にぉ ヽて 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽても よいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質と同じ抗原性を示し、かつ実質的に非蛍光 性である蛋白質。 [2] 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号 1に記載のァミノ 酸配列にぉ ヽて 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽても よいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質のアミノ酸配列において、下記（1)〜（3)：
(1) 66位、 67位、及び 68位から選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
(2) 66位、 67位、及び 68位力 選択される一個以上のアミノ酸の欠失;及び
(3) 66位及び 67位アミノ酸間、又は 67位及び 68位アミノ酸間への 1以上のアミノ酸の 挿入から選択される何れか 1以上の変異が存在するアミノ酸配列を有し、かつ実質的 に非蛍光性である蛋白質。
[3] 67位がァラニン又はグリシンである請求項 1に記載の蛋白質。
[4] 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
[5] 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
[6] 配列表の配列番号 3に記載の塩基配列を有する遺伝子。
[7] 請求項 5又は 6に記載の遺伝子を含むベクター。
[8] 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の蛋白質を発現するトランスジヱニック非ヒト哺 乳動物。
[9] 非ヒト哺乳動物がマウスである請求項 8に記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物。
[10] 請求項 8又は 9に記載のトランスジ ニック非ヒト哺乳動物に蛍光性 GFP変異体を発 現する細胞を移植する工程を含む生物化学的実験法。
[II] 配列表の配列番号 5に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号 5に記載のァミノ 酸配列にぉ ヽて 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽても よいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質と同じ抗原性を示し、かつ実質的に非蛍光 性である蛋白質。
[12] 配列表の配列番号 5に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号 5に記載のァミノ 酸配列にぉ ヽて 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽても よいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質のアミノ酸配列において、下記 (4)〜（6)：
(4) 66位、 67位、及び 68位から選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
(5) 66位、 67位、及び 68位力 選択される一個以上のアミノ酸の欠失;及び
(6) 66位及び 67位アミノ酸間、並びに 67位及び 68位アミノ酸間への 1以上のアミノ酸 の挿入から選択される何れか 1以上の変異が存在するアミノ酸配列を有し、かつ実質 的に非蛍光性である蛋白質。
[13] 67位がァラニン又はグリシンである請求項 12に記載の蛋白質。
[14] 配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
[15] 請求項 11〜14のいずれか一項に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
[16] 配列表の配列番号 7に記載の塩基配列を有する遺伝子。
[17] 請求項 15又は 16に記載の遺伝子を含むベクター。
[18] 請求項 11〜14のいずれか一項に記載の蛋白質を発現するトランスジエニック非ヒト 哺乳動物。
[19] 非ヒト哺乳動物がマウスである請求項 18に記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物。
[20] 請求項 18又は 19に記載のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物に蛍光性 DsRedモノマー を発現する細胞を移植する工程を含む生物化学的実験法。
[21] 蛍光性蛋白質のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z 又は付加されているアミノ酸配列であって、該蛍光性蛋白質を発現する細胞の表面 の主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)により提示される該蛍光性蛋白質のアミノ酸 残基を含み、かつ該蛍光性蛋白質の蛍光性発色団を形成するアミノ酸残基の少なく とも 1つに欠失、置換及び Z又は付加があるアミノ酸配列を有する、実質的に非蛍光 性である蛋白質。
[22] 配列表の配列番号 8に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号 8に記載のァミノ 酸配列にぉ ヽて 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽても ょ 、アミノ酸配列を有する活性型ルシフェラーゼと同じ抗原性を示し、かつ実質的に ルシフェラーゼ活性を有しな 、蛋白質。
[23] 配列表の配列番号 8に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号 8に記載のァミノ 酸配列にぉ ヽて 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽても ょ 、アミノ酸配列を有する活性型ルシフェラーゼのアミノ酸配列にぉ 、て、下記（7) 〜（9)：
(7) 245位、及び 529位力 選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
(8) 245位、及び 529位力 選択される一個以上のアミノ酸の欠失;及び
(9) 244位及び 245位アミノ酸間、 245位及び 246位アミノ酸間、 528位及び 529位ァミノ 酸間、並びに 529位及び 530位アミノ酸間への 1以上のアミノ酸の挿入力 選択される 何れか 1以上の変異が存在するアミノ酸配列を有し、かつ実質的にルシフェラーゼ活 性を有しない蛋白質。
[24] 245位がアルギニンである請求項 23に記載の蛋白質。
[25] 529位がグルタミンである請求項 23又は 24に記載の蛋白質。
[26] 配列表の配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
[27] 請求項 22〜26のいずれか一項に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
[28] 配列表の配列番号 10に記載の塩基配列を有する遺伝子。
[29] 請求項 27又は 28に記載の遺伝子を含むベクター。
[30] 請求項 22〜26のいずれか一項に記載の蛋白質を発現するトランスジエニック非ヒト 哺乳動物。
[31] 非ヒト哺乳動物がマウスである請求項 29に記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物。
[32] 請求項 30又は 31に記載のトランスジ ニック非ヒト哺乳動物に配列表の配列番号 8 に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号 8に記載のアミノ酸配列において 1もし くは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されて ヽてもよ ヽアミノ酸配列を有 する活性型ルシフ ラーゼを発現する細胞を移植する工程を含む生物化学的実験 法。
[33] 活性型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換 及び Z又は付加されて 、るアミノ酸配列であって、該活性型ルシフェラーゼを発現す る細胞の表面の主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)により提示される該活性型ルシ フェラーゼのアミノ酸残基を含み、かつ該活性型ルシフェラーゼの活性部位を形成 するアミノ酸残基の少なくとも 1つに欠失、置換及び Z又は付加があるアミノ酸配列を 有する、実質的にルシフェラーゼ活性を有しない蛋白質。
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