WO2007006488A2 - ENTWICKLUNG EINER ORTSSPEZIFISCHEN, CHEMOSELEKTIVEN UND GERICHTETEN PHOTOCHEMISCHEN MIKROSTRUKTURIERUNGSTECHNIK FÜR BIO- UND MATERIALWISSENSCHAFTLICHE ANWENDUNGEN (z.B. ZUR HERSTELLUNG VON MIKROARRAYS) - Google Patents

ENTWICKLUNG EINER ORTSSPEZIFISCHEN, CHEMOSELEKTIVEN UND GERICHTETEN PHOTOCHEMISCHEN MIKROSTRUKTURIERUNGSTECHNIK FÜR BIO- UND MATERIALWISSENSCHAFTLICHE ANWENDUNGEN (z.B. ZUR HERSTELLUNG VON MIKROARRAYS) Download PDF

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WO2007006488A2
WO2007006488A2 PCT/EP2006/006622 EP2006006622W WO2007006488A2 WO 2007006488 A2 WO2007006488 A2 WO 2007006488A2 EP 2006006622 W EP2006006622 W EP 2006006622W WO 2007006488 A2 WO2007006488 A2 WO 2007006488A2
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Herbert Waldmann
Maja KÖHN
Rolf-Peter Breinbauer
Dirk NÜSSE
Edgar Voges
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Chimera Biotec Gmbh
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Publication date
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Publication of WO2007006488A3 publication Critical patent/WO2007006488A3/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J7/00—Chemical treatment or coating of shaped articles made of macromolecular substances
    • C08J7/12—Chemical modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2383/00—Characterised by the use of macromolecular compounds obtained by reactions forming in the main chain of the macromolecule a linkage containing silicon with or without sulfur, nitrogen, oxygen, or carbon only; Derivatives of such polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method for coating surfaces.
  • the coating is carried out by a chemoselective reaction between unsaturated hydrocarbon groups and thiol groups.
  • the surfaces can be functionalized as desired and e.g. be patterned using masks and / or lasers.
  • the process is characterized by short reaction times as well as simple substance application and washing processes. The selectivity and mildness of the process allows many uses of the structuring technique according to the invention.
  • Structured or microstructured surfaces are surfaces that have differently coated or functionalized regions with reactants.
  • microstructured surfaces are widely used, such as high throughput screening.
  • protein-structured surfaces were developed to integrate biological molecules into miniaturized biological-electronic devices. They are also used in the development of biosensors, which can be used, for example, to determine the selectivity and sensitivity of antibodies.
  • biosensors which can be used, for example, to determine the selectivity and sensitivity of antibodies.
  • they are used for the mediation of structured cell growth, with which, for example, cell microarrays can be produced. With their help, artificial tissue and organ transplants are generated.
  • microstructured surfaces play an important role, in particular in the production of LEDs (light emitting diodes), LCDs (liquid crystal displays) and OLEDs (organic high-frequency diodes).
  • LEDs light emitting diodes
  • LCDs liquid crystal displays
  • OLEDs organic high-frequency diodes
  • OLEDs prepared by photolithography using photoacid spirobifluorene-co-fluorene polymers are used (Müller et al., 2003).
  • Structured surfaces can be prepared by photoresist techniques, photochemical techniques and SAMs.
  • the patterns can be created by UV lamps in combination with masks or focusing.
  • surfaces can be patterned by lithographic techniques that manage without exposure.
  • lithography in which rigid inorganic materials are treated, for example, by laser ablation or induced deposition
  • soft lithography in which the structures in self-assembled layers are transferred to substrates by stamping or casting of elastomer and flexible organic molecules and materials are used.
  • photolithography is much more commonly used by default.
  • Photochemical substance microstructuring techniques utilize chemically labile functional groups which can be activated by UV exposure to bind target molecules.
  • shortwave UV radiation can be used to deactivate chemical species, e.g. in the conversion of thiols to sulfonates.
  • SAMs Self-assembled monolayers
  • Gold surfaces is known. Regions were left unexposed and a photolabile protecting group and a photolabile linker were used.
  • Mrksich et al. used SAMs together with photolabile protecting groups to chemoselectively immobilize ligands through a Diels-Alder reaction.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method which provides a possibility for the chemoselective coating of surfaces under mild conditions.
  • this object is achieved by a reaction between an unsaturated hydrocarbon group of a first molecule and a thiol group of a second molecule, wherein one of the two molecules is immobilized on the surface.
  • any thiol group-containing molecules or molecules having an unsaturated hydrocarbon group can be prepared by all methods known to those skilled in the art for introducing a thiol group or an unsaturated hydrocarbon group, preferably a double bond, into molecules.
  • the introduction of the desired group can be carried out before the immobilization of the molecule with the first reactant on the surface but also after its immobilization on the surface.
  • the first and second molecules with an unsaturated Hydrocarbon bond or a thiol group are also referred to below as the first or second reactant.
  • saturated hydrocarbon group preferably comprises C 2 to C 100, in particular C 3 to C 20, hydrocarbons which are at least monounsaturated
  • the hydrocarbon group may be straight-chain or branched, substituted or unsubstituted, and is preferably a terminal unsaturated hydrocarbon group.
  • the molecule having an unsaturated hydrocarbon group may basically be an unsaturated hydrocarbon or a substituted unsaturated hydrocarbon, but also a molecule in which the unsaturated hydrocarbon group itself is a substituent.
  • the unsaturated hydrocarbons may be substituted with functional groups such as OH, COOH, COOR, NO 2 , RSO 2 , wherein R is a straight or branched chain, substituted or unsubstituted hydrocarbon preferably having 1 to 10 carbon atoms, or substituted with functional molecules.
  • functional groups such as OH, COOH, COOR, NO 2 , RSO 2 , wherein R is a straight or branched chain, substituted or unsubstituted hydrocarbon preferably having 1 to 10 carbon atoms, or substituted with functional molecules.
  • mercaptan used according to the invention comprises all compounds or molecules known to the person skilled in the art which have at least one thiol group, i.e. -SH group.
  • Examples of preferred molecules which may be substituted with an unsaturated hydrocarbon group or a thiol group or include such a group include natural products such as sugars and carbohydrates, amino acids, peptides, phosphopeptides, proteins, enzymes, antibodies, lipids, nucleotides, nucleosides and nucleic acids. Further preferred examples include dyes, radioactively labeled molecules, isotopically labeled molecules, monomers for polymerization reactions or polymers, luminescent molecules, in particular fluorescent molecules, electroluminescent molecules or polymers, nanoparticles, vesicles and inorganic catalysts.
  • These molecules are, in order to be used as a reactant in the process according to the invention, provided with one or more unsaturated hydrocarbon groups or thiol groups. If these moieties are already contained in the molecule, these existing moieties can be used to carry out the reaction. It is also possible to introduce additional additional hydrocarbon or thiol groups into the molecules.
  • the unsaturated hydrocarbon group or thiol group-containing molecules most preferably comprise electroluminescent, e.g. red, green and / or blue electroluminescent molecules or polymers.
  • electroluminescent molecules include PoSy (1,4-phenylenevinylenes) (PPV) and derivatives derived therefrom, especially PPV copolymers and CN-PPVs, poly (3-alkylthiophenes) and derivatives derived therefrom, poly (para-phenylenes) ( PPP) and derivatives derived therefrom, in particular ladder poly (para-phenylenes) (LPPP), and mixtures of such compounds which are derivatized for the invention with an unsaturated hydrocarbon group or a mercaptan group.
  • PPV PoSy (1,4-phenylenevinylenes)
  • LPPP ladder poly (para-phenylenes)
  • Nanoparticles include quantum dots, in particular semiconductor materials such as CdS, CdSe, CdTe, ZnS, TiO 2 or similar transition metal chalcogenides, and metal particles, in particular of Au, Ag, Pt, Pd and Cu.
  • the Nanopartikei can eg surface-functionalized and / or they may be in organically encapsulated form.
  • An organic shell is preferably formed from branched hydrocarbons which may be substituted or unsubstituted.
  • the immobilization of the immobilized molecule to a surface can take place via any interactions that lead to a bond between the surface and the molecule to be immobilized with unsaturated hydrocarbon group or thiol group. These interactions can be e.g. covalent, ionic, hydrogen bonds or van der Waals forces.
  • the binding of the immobilized molecule to the surface does not take place via the thiol group or via the unsaturated hydrocarbon group, which react with one another according to claim 1, so that these groups are available for the reaction with the second reactant or molecule.
  • the first molecule deshlab to be bonded to the surface preferably has at least one further functional group which allows binding to the surface. Particularly preferred are hydroxyl, thiol or amino groups.
  • the binding of the immobilized molecule takes place via an SH-Gurppe to a gold surface.
  • the immobilization of the first molecule is carried out by self-assembly to form a self-assembled monolayer.
  • the immobilization of the first reactant or molecule on the surface can take place uniformly over the entire surface, but the immobilization can also take place only at fixed sections on the surface, so that the surface can already undergo structuring by the immobilization of the first reactant. Excess and / or loose first reactant is removed from the surface after its immobilization.
  • dendrimers and / or silanes derivatized with a mercaptan group or an unsaturated hydrocarbon group are used as the first reactant and immobilized on the surface.
  • the dendrimers, for example PAMAM dendrimers, or the silanes have at least one functional group which can be converted into a mercaptan or an unsaturated hydrocarbon group.
  • a molecule containing a mercaptan group (thiol) is the first reactant on the
  • the thiol group of the mercaptan can be both in the immobilized on the surface already in the
  • Molecule may be present, preferably in a protected form, so that it can not interact with the surface during immobilization, or it may be produced only after immobilization on the surface by chemical reaction of another functional group.
  • surface encompasses all surfaces on which one of the two reactants, preferably the mercaptan, can be immobilized
  • the surfaces used at least partially prevent the reflection or propagation of light in the surface carrier Generation of structures can be achieved.
  • the surface preferably consists of Si, SiOx with 0 ⁇ x ⁇ 5, with SiO 2 being particularly preferred, polysiloxanes, Ge, Ge oxides, with GeO 2 being particularly preferred, metals, such as Au, Ag, Cu, Pd, Pt and particularly preferably Al, metal oxides, where Al oxides, such as A! 2 O3, ZrO 2 , and In-Sn-oxides (ITO), such as In 2 O 3 ZSnO 2 , particularly preferred are GaAs, InP, any mixtures of metals and oxides and / or semiconductor materials, in particular mixtures of Ge, Al and / or their oxides, alloys of Ge and / or Al and other semiconductor materials.
  • the surface is preferably 0.1-10 mm thick. Particularly preferred is a thickness of 5 ⁇ 1 mm, more preferably 2 ⁇ 1 mm and even more preferably 0.5 ⁇ 0.4 mm.
  • the surface preferably has functional groups, such as amino, hydroxy or thiol groups, by which the immobilization of the first reactant on the support surface is possible. If there is an SiO x surface, hydroxyl groups are preferred.
  • the surface is preferably a carrier surface, with preference being given to using polymers, glass, quartz and silicon wafers, as well as combined Si / SiO x elements with 0 ⁇ x ⁇ 5 as support on which the surface is applied. Furthermore, all materials which form the surface as described above can also form the carrier itself.
  • the carriers and thus also the surfaces can be planar or non-planar, eg concave or convex. The use of silicon, silica and combined silicon / silica supports is particularly preferred.
  • the reaction between the thiol group of the mercaptan and unsaturated hydrocarbon is preferably photo-induced or radical-induced.
  • the mercaptan used Upon induction, the mercaptan used decomposes into a hydrogen- and a sulfur-linked radical prior to the addition reaction with the unsaturated hydrocarbon group.
  • the sulfur radical then adds selectively to a double bond, preferably to a terminal one Double bond.
  • the addition reaction preferably proceeds to form an anti-Markovnikov product.
  • the method of the invention is chemoselective, i. the functional groups involved in the reaction go largely no others
  • reactions with other functional groups may be present in the reactants themselves and in other substances present in the reaction solution but not directly participating in the reaction.
  • the reaction is particularly compatible with functional groups such as carboxylic acids, esters, amides,
  • Halogens may also be present as functional groups in the reaction mixture.
  • the chemoselective reaction thus enables the targeted planning and production of coated surfaces.
  • the large number of functional groups compatible with the process according to the invention makes it possible to largely dispense with the use of protective group chemistry during the reaction.
  • the inventively functionalized reactants show no nonspecific complex formation and / or nonspecific binding to the surface.
  • the process according to the invention is characterized by regioselectivity, ie the reactants react at a defined point in the molecule determined by the functionalization with -SH or a double bond.
  • the binding to the surface or the first molecule already immobilized then takes place exclusively via the reaction site thus functionalized.
  • the functionalization with -SH or a double bond can occur in any section on the surface of a molecule that is accessible to such a functionalization. For example, if so the protein structure is known, specifically the domains of a protein are selected and then functionalized, via which a binding to the surface is to take place.
  • Chemoselectivity and regioselectivity of the process of the invention allow a directed coating or immobilization of a variety of complex substrates on surfaces, while maintaining their functionality and / or activity.
  • the immobilization of proteins it is advantageous, for example, to choose the reaction or addition sites such that they do not influence active sites of the proteins.
  • the same protein can be immobilized in different experimental approaches over different domains or sections on a surface. By comparing the different immobilization approaches, information on the catalytic structure or the substrate binding behavior of the protein can be obtained.
  • chromophores or luminescent molecules can be selectively immobilized so that the chromophore or luminescence is not impaired.
  • the coating or immobilization process of the invention is further characterized by its high reproducibility.
  • the inventive method also leads to a uniform and dense coverage of the surfaces with active or functional molecules.
  • the reaction can be radical-induced using free radical initiators such as N, N-azobisisobutyronitrile (AlBN) or ammonium persulfate (APS).
  • AlBN N, N-azobisisobutyronitrile
  • APS ammonium persulfate
  • the structuring of the surface to be coated can be achieved, for example, by using masks which are applied to the surface without any spacing. Distance-free here means that there is no space available between the surface and the mask to penetrate or diffuse into the radical initiator in order to induce the addition reaction between the two reactants.
  • the reaction between the thiol group of the mercaptan and the unsaturated hydrocarbon group of the other molecule is a photochemical reaction, which is preferably photoinduced.
  • Photoinduction is achieved by irradiation of the reactants.
  • light having wavelengths in the visible and / or infrared range may be used, but the photochemical reaction is preferably induced by UV light.
  • light of the UV wavelength range of 200-400 nm is preferably used.
  • the photoinduction is carried out in a wavelength range from 350 to 400 nm and even more preferably at 365 ⁇ 5 nm.
  • any suitable lamp having a suitable spectrum can be used.
  • the use of mercury vapor lamps is a preferred embodiment for induction by UV light.
  • the duration of the photoinduction is in the range of 1 second to 30 minutes, preferably in the range of 1 second to 20 minutes, and most preferably in the range of 1 second to 10 minutes.
  • the photochemical reaction is induced by using a laser, wherein the use of a Laser microscope is particularly preferred.
  • a Laser microscope is particularly preferred.
  • Single photon excitation is particularly preferred.
  • Two-photon and three-photon excitation are preferred embodiments of the multiple photon excitation.
  • Two-photon excitation can be by the high localized energy laser pulses. That is, during the duration of a pulse, molecules simultaneously acquire two or three (in the case of three-photon excitation) photons of a longer wavelength, thereby raising an electron to the first singlet excited state.
  • This high energy is localized, ie defined not only in the X and Y plane but also in the Z plane. This allows the two-photon excitation to be used to create three-dimensional images.
  • the focusing of the high-energy peak can be achieved by the use of optical microscope objectives or lenses with high numerical aperture.
  • the use of laser microscopes equipped with a computer-controlled slide stage movable in the X-Y plane can provide a resolution of the functionalized surfaces in the nm.
  • Microscopes are limited by diffraction effects to around half of their radiation wavelength. By focusing the laser beam with the help of lenses to produce a diffraction-limited point, the width of the structures is no longer determined by the diameter of the
  • the optical resolution of such a microscope can be 100 nm, so that one can scan the structures and no longer on the resolution of that used in photolithography
  • the photochemical reaction is induced using Scanning Near-Field Optical Microscope (SNOM) or SNOM used for patterning.
  • SNOM enables the resolution of structures up to 10 nm.
  • SNOM is based on exploiting extremely short-range interactions between a probe and a surface, using the exponentially decaying near-field optical field.
  • the principle of SNOM is to move a submicroscopic radiation source in the form of a near-field probe at a distance of only a few nanometers, and thus within the reach of the near field, in a grid pattern over a surface.
  • the resolution is essentially determined only by the geometry of the probe (ie as a rule by the aperture diameter) and not by the radiation wavelength.
  • the use of probes with defined probe geometry with high radiation emission is preferred.
  • the method is rastering, ie structures are obtained by the point and row-wise assembly of many individual irradiation processes.
  • STM scanning tunneling
  • AFM atomic force microscopy
  • the photochemical reaction for addition of the second reactant takes place only in those areas of the surface which are irradiated.
  • the coating is structured, preferably microstructured or nanostructured. Structuring in the sense of the invention encompasses any external form of the surface coating that is not based on a random coating result. Nano or micro structuring describes structures in the nanometer or
  • Micrometer range preferably between 10 nm and 1000 ⁇ m, more preferably between 10 nm and 100 ⁇ m, and most preferably between 10 nm and 1 ⁇ m.
  • a plurality of spatially separated coating regions may be located on a carrier.
  • the coating areas can optionally be coated differently. Between the inventively coated or structured areas, arbitrarily large distances or unstructured or uncoated areas may be present.
  • the uncoated areas are preferably structures in the nanometer range down to the centimeter range. Preference is given to non-structured, structured regions separating
  • Both structuring by using masks and structuring by using lasers can produce structures in the nanometer range.
  • the nanostructuring by laser described above, in particular by SNOM, is particularly preferred.
  • nanostructuring by laser structures in the range of 10 to 500 nm, more preferably 10 to 100 nm, and most preferably 10 to 50 nm are preferably obtained.
  • the use of a laser enables selective irradiation of the surface.
  • Selective irradiation describes the irradiation of pre-determined, narrowly defined areas on the surface. Only in the areas irradiated by the laser, the reaction according to the invention takes place or structuring of the surface takes place.
  • the selective range can be chosen arbitrarily for each irradiation process. By removing excess second reactant after a first irradiation in a first selective region and applying a further different reactant and a second irradiation in another, second selective region, it is possible to coat or structure a surface selectively in defined regions. The process can be repeated as often as desired (multiple structuring).
  • the multiple structuring enables the design of three-dimensional structures, such as chambers, tubes or channels on the surface.
  • different targets or test substances for screening methods or electroluminescent polymers which emit different colors can also be immobilized on a surface in this way.
  • the edge blur in selective laser irradiation is at most ⁇ 1 ⁇ m, more preferably at most ⁇ 500 nm, even more preferably at most ⁇ 100 nm, and most preferably ⁇ 10 nm.
  • a mask is used to define the areas that are exposed to radiation.
  • the invention further encompasses all techniques used in corresponding photolithographic processes.
  • the shape of the mask corresponds to the area at which no photochemical reaction takes place, i. no reactant is added.
  • the masks may consist of features such as lines, circles, dots, boxes, and the like.
  • the dimensions of the mold elements are preferably in the nanometer to micrometer range, preferably between 350 nm to 100 .mu.m, more preferably between 350 nm to 10 .mu.m, and most preferably between 350 nm to 1 .mu.m.
  • the masks are preferably fixed on the carrier surface such that no
  • Deviation in the addition of the second reactant with respect to the mask pattern is preferably at most ⁇ 2 ⁇ m, and more preferably at most ⁇ 0.5 ⁇ m.
  • a mask material is used which does not reflect and / or transmit incident light. In this way, a higher edge sharpness in the creation of structures is contributed.
  • differently structured masks are used successively. This accordingly enables multiple structuring, as described in detail above for the use of lasers.
  • the surface of the regions which are coated by the process according to the invention can also be functionalized by the process according to the invention. In contrast, however, an inert coating is also possible.
  • An inert coating may be in no way accessible to further reactions or reactions, regardless of the reaction conditions, or an inert coating may not be accessible to further reaction or coating under the conditions prevailing in the reaction solution.
  • a functionalized coating has arbitrary characteristics to be selected depending on the type of functionalization.
  • the functionalization can be used, for example, to carry out chemical reactions section-ionized on the coated surface.
  • reactants resulting in an inert coating are reacted with reactants resulting in a Functionalization, mixed before the induction of the reaction.
  • the functionalization of the surfaces is carried out by microfluidics.
  • Microfluidic systems have a variety of microfluidic structures. In these microfluidic structures (e.g., chambers, channels, etc.), reactants or functional molecules to be applied to a surface are introduced in nanoliter volumes. Since microfluidics and photolithography are compatible with one another, it is then possible to carry out the method according to the invention in the microfluidic system so that the microfluidic surfaces patterned or functionalized according to the invention can be obtained.
  • the embodiment is characterized by the use of low volumes of reactants.
  • microfluidic system By using such a microfluidic system, it is also possible to easily remove a reactant after immobilization and to introduce successively different different reactants in the system as part of a multiple immobilization. It is thus possible in a simple manner to provide differently radioactivated surfaces or microfluidic structures in a confined space.
  • Functionalization is preferably carried out by using functionalized derivatives derivatized with a mercaptan group or an unsaturated hydrocarbon group as the second reactant.
  • Functional molecules preferably include biological molecules such as proteins, peptide fragments, antibody enzymes, nucleic acids, sugars and lipids, dyes, radioactively labeled molecules, isotopically labeled molecules, monomers for polymerization reactions, polymers, luminescent molecules, especially fluorescent molecules, electroluminescent Moieküle or polymers, nanoparticles, Vesikei and inorganic catalysts.
  • Functionalization further comprises that the surface can be subjected to any further chemical reaction according to the patterning process according to the invention.
  • both further molecules can be added as well as groups, e.g. Protective groups, from the
  • Functionalization in the sense of the invention also includes altering and / or adding surface properties such as electrical conductivity, dielectric anisotropy, birefringence, rotational viscosity, elastic constants, photosensitivity, temperature sensitivity, oxidation or reduction properties, acidic and basic properties, hydrophobic and hydrophilic properties Properties etc.
  • the functional molecules described above are added only after the patterning process according to the invention and bound to the surface via interactions with the immobilized second reactant.
  • the second reactant used is a molecule having an unsaturated hydrocarbon group or a molecule having a thiol group, this molecule being functionalized with a first binding partner of a high-affinity binding pair.
  • the first binding partner of the high-affinity binding pair is thus immobilized on a structured surface in accordance with the invention.
  • another reactant or a Reaction solution comprising the second binding partner of the high-affinity binding pair is added, which then interacts with the first immobilized binding partner.
  • the interactions between the binding partners can be covalent, hydrophobic, ionic, hydrogen bonds, or van der Waals forces.
  • preferred high affinity binding pairs include biotin or biotinylated substrates / (strept) avidin, Ni (nitrile acetic acid hyHis tags, antibody / epitope, receptor / ligand,
  • biotin or biotinylated substrates / (strept) avidin is particularly preferred, with biotin or a biotinylated substrate preferably being immobilized directly on a surface by the method according to the invention.
  • the formation of complexes between high affinity binding partners wherein a partner is immobilized on a surface according to the invention can also be used to functionalize a structured surface.
  • the second binding partner immobilized directly on the surface can be functionalized in any way.
  • Preferred functionalizations include all functions already discussed above for direct functionalization of the surface. Preference is given to using complexes for the preparation of binding partners of mediated nanostructuring, for example conductive microstructures.
  • nanostructures include metal particles, preferably Au, Ag, Pt, Pd and Cu, which metals may be derivatized on their surface, in particular with an unsaturated hydrocarbon group or a thiol and quantum dots, in particular semiconductor materials such as CdS, CdSe 1 CdTe , ZnS, TiO 2 or similar transition metal chalcogenides.
  • semiconductor materials such as CdS, CdSe 1 CdTe , ZnS, TiO 2 or similar transition metal chalcogenides.
  • This embodiment is preferably suitable for immobilizing receptors or antibodies, in particular for screening for biological interaction partners.
  • the embodiment just described which uses a high-affinity binding pair, is suitable for producing a universal structured binding surface or a molecular clip, which are not determined after their preparation to a specific functionalization, but only later by appropriate choice of a functionalized second binding partner of the high-affinity binding pair can be functionalized.
  • a thiol-functionalized support surface-bonded first reactant is used, wherein at least one thiol group of the reactant does not bind to the surface of the support and is therefore available for the process according to the invention.
  • the second reactant to be added is uniformly applied to the support surface.
  • the second reactant to be added is applied evenly to the carrier surface by centrifugation. After exposure and removal of reactants by washing, another reactant can be applied to the surface and immobilized. The procedure can be repeated as often as desired.
  • a detergent is added to the second reactant to be distributed prior to centrifugation.
  • the surface tension of the solution is thus reduced and facilitates the uniform distribution on the support surface.
  • the exposure for inducing the photochemical reaction is preferably carried out as described after the second reactant has dried on the support surface.
  • Unreacted second reactant is removed from the surface after the reaction. All operations are preferred under a protective gas atmosphere (eg nitrogen, argon, etc.) and in a light environment which does not induce the photochemical reaction can contribute (eg yellow light, red light, etc.) performed. After exposure, the second reactant is preferably removed by simple rinsing.
  • the solvent to be used is not limited unless it reacts with the immobilized reactants. Preference is given to the use of DMF and water.
  • the second reactant to be added after the reaction is removed from the surface by a centrifuging step additional to the washing step.
  • the process according to the invention can be carried out both in polar and in non-polar solvents, in protic as well as in aprotic solvents and in solvent mixtures.
  • Exemplary solvents which do not limit the invention are water, alcohols, dimethylformamide (DMF), hexane, chloroform and toluene.
  • the process according to the invention can also be carried out in the gas phase.
  • the process according to the invention is preferably used in high-boiling solvents, preferably DMF, or in higher-boiling mixtures
  • Solvent carried out Is the boiling point of a solvent, preferably> 100 0 C, more preferably> 120 0 C and most preferably> 150 0 C.
  • an agent is added to the solvent or solvent mixture which supports the photochemical energy transfer or acts catalytically and / or acts as a stabilizing agent on free-radical intermediates during the reaction.
  • the process of the invention can be carried out in a temperature range from -20 0 to 150 0 C, but preferably at room temperature (20 0 C +/- 5 ° C).
  • the method according to the invention in the practical implementation thus characterized by short reaction times and simple substance application and washing processes.
  • the selectivity and mildness of the process allows the manifold uses of the structuring technique according to the invention.
  • the method according to the invention is carried out automatically.
  • the method according to the invention is particularly preferably used in an automatable microfluid system in combination with laser or laser mirror technology.
  • Another aspect of the present invention is a coated surface or carrier having such a surface obtainable by the method of the invention.
  • the surfaces or microarrays obtainable by the process according to the invention are distinguished by a high density of the immobilized molecules, a high native activity or functionality of the immobilized molecules and the stability of the coating.
  • the structured or functionalized surfaces show no desorption of immobilized molecules during the reactions in which they are used.
  • the structured surfaces or supports may be planar or non-planar.
  • the coating of a surface obtainable by the process according to the invention can natural substances such as sugars and carbohydrates, amino acid, peptides, phosphopeptides, proteins, enzymes, antibodies, lipids, nucleotides, nucleosides and nucleic acids, moreover dyes, radioactively labeled molecules, isotope-labeled molecules, polymers , Monomers for polymerization reactions, luminescent molecules, in particular fluorescent molecules, Liquid crystals, electroluminescent molecules and / or polymers, nanoparticles, vesicles and / or inorganic catalysts.
  • natural substances such as sugars and carbohydrates, amino acid, peptides, phosphopeptides, proteins, enzymes, antibodies, lipids, nucleotides, nucleosides and nucleic acids, moreover dyes, radioactively labeled molecules, isotope-labeled molecules, polymers , Monomers for polymerization reactions, luminescent molecules, in particular fluorescent molecules, Liquid crystals,
  • coated surfaces can be used for a variety of applications, for example in biosensing and Wirkstroffscreening, z. As for the identification or / and characterization of pharmacological agents used. Furthermore, coated surfaces may be used for analysis of biomolecules selected from proteins, antibodies, antibiotics, nucleic acids, carbohydrates, lipids, hormones, steroids, etc. The coated surfaces may also be used to mimic the outer envelope of a cell, for example, to study biological processes on cells. Use in surgery or transplantation medicine, for example for the replacement or bridging of defective nerves is conceivable.
  • Another aspect of the present invention is the use of producing biochips in particular for high throughput screening for new pharmaceutical agents.
  • microfluidic systems for example by structured immobilization of polymers.
  • the method can be used to construct three-dimensional structures, as required in microfluidic systems, for example in the form of channels or reaction chambers. In addition to the structure of such structures, these can additionally be coated or functionalized according to the invention. Such systems are particularly useful for the analysis and synthesis of multi-stage catalytic reactions.
  • microbeads carrying immobilized enzymes or heterogeneous catalysts are particularly preferred in the field of microfluidics because they have a high surface volume ratio which is required for an efficient heterogeneous reaction.
  • Yet another aspect of the present invention is the use of the inventive method for the production of surfaces which are coated with luminescent molecules, in particular fluorescent molecules, electroluminescent polymers and / or electroluminescent inorganic molecules.
  • the coating with electroluminescent conjugated molecules or polymers is particularly advantageous, since a fine-tuning of their properties (color, quantum yield) by changing the structure is easily possible.
  • the present invention comprises a surface structured according to the invention which is coated with red, green and / or blue electrium-emitting molecules and / or polymers.
  • electroluminescent molecules according to the invention include poly (1,4-phenylenevinylene) (PPV) and derivatives derived therefrom, in particular PPV copolymers and CN-PPVs, poly (3-alkylthiophenes) and derivatives derived therefrom, poly (para) phenylene) (PPP) and derivatives derived therefrom, in particular ladder poly (para-phenylene) (LPPP), and mixtures of such compounds.
  • PPV poly (1,4-phenylenevinylene)
  • LPPP ladder poly (para-phenylene)
  • Another aspect of the present invention is the use of the inventive method for the production of surface structures containing liquid crystals.
  • Particularly preferred is the production of TN cells (twisted nematic, TN) in which orient liquid crystals.
  • TN cells twisted nematic, TN
  • Another particularly preferred aspect is an embodiment in which each picture element (pixel) is driven individually via a transistor.
  • the liquid crystals used are preferably polyfluorinated hydrocarbons.
  • Surface structures obtainable in accordance with the invention are particularly suitable for the construction of LCDs and AM-LCDs (active matrix LCDs).
  • Another aspect of the present invention is therefore the use of the method according to the invention for the production of LEDs, LCDs, AM
  • LCDs and OLEDs are distinguished from displays as they are known from the prior art, in particular by a high resolution.
  • the inventive method is particularly suitable for the production of large-area LED displays, since according to the prior art for their preparation, both inorganic semiconductor materials and organic fluorescent dyes by expensive methods such as sublimation or vapor deposition must be applied consuming.
  • OLEDs prepared by photolithography with photoacid have limited shelf life due to not completely removed photoacid.
  • this disadvantage of the prior art is eliminated, so that OLEDs obtainable according to the invention are distinguished by a high durability or thermal stability.
  • OLEDs obtainable according to the invention are therefore particularly suitable for the production of true-color matrix displays.
  • Another aspect of the present invention is the use of the inventive method for the production of surfaces, which with
  • Nanoparticles in particular Ag, Au, Pd, Pt, Cu, quantum dots, vesicles and / or inorganic catalysts are coated.
  • Such nanoparticles may consist exclusively of an element or a single compound, or they may be encased by organic molecules, preferably hydrocarbons.
  • Conductive microstructures made according to the invention can be used in semiconductor and chip technology.
  • Surfaces coated with inorganic catalysts, as well as vesicle-coated surfaces, which, for example, can release a substance in a controlled manner, can be used, particularly in the context of miniaturized systems such as microfluidic systems. Such miniaturized systems are, for example, able to carry out all the reactions required for a particular synthetic route on a small scale in a narrow space, for example a chip.
  • Another aspect of the present invention is the use of the process according to the invention for the production of surfaces which are coated with polymers and / or monomers for a subsequent polymerization reaction.
  • Surface-immobilized three-dimensional structures can thus be constructed according to the invention, as are used, for example, in microfluidics and display technology. Such three-dimensional structures can both hold fluids, as well as catalyze reactions in incorporated fluids with appropriate functionalization of their surfaces.
  • the FAB mass spectra were measured on a Finnigan MAT MS 70 spectrometer.
  • the matrix used in the FAB measurements was 3-nitrobenzyl alcohol (3-NBA) as standard.
  • Helium was used as the carrier gas for GC-MS studies and the following standard gradient: 1 min 100 0 C, then within 5 min at 280 0 C, which were held for 5 min.
  • the specific rotation values [ ⁇ ] D 20 refer to the Na-D line.
  • Reagent B 2.5 g of molybdatophosphoric acid, 1 g of cerium (IV) sulfate, 6 ml of conc.
  • Reagent C 10% conc. Sulfuric acid in ethanol.
  • the corresponding eluents and Rr values are given for the respective compounds.
  • the column chromatographic separations were carried out on flash silica gel with an overpressure of 0.3-0.8 bar.
  • the preparative high pressure liquid chromatography (HPLC) was carried out with a system from Agilent (1100 Series). The columns used were a CC125 / 21 Nucleosil 120-5 C4 column or CC125 / 21 Nucleodur 120-5 C18 Gravity from Macherey & Nagel at flow rates of 25 ml / min.
  • the analytical HPLC was carried out with an HP 1100 model from Hewlett-Packard with CC125 / 4 Nucleosil 120-5 C4 column or CC125 / 4 Nucleodur 120-5 C18 Gravity from Macherey & Nagel with flow rates of 1 ml / min. The detection was carried out in each case at the wavelengths 210 nm and 280 nm.
  • the mobile phase used was water + 0.1% by volume of TFA (A) and acetonitrile + 0.1% by volume of TFA (B). The following standard gradients were used:
  • the silicon wafers (SSP, thickness: 125 mm, size: 2.5 ⁇ 7.5 cm 2 ) were produced with a coated top side (1 ⁇ m PECVD-SiO 2 ).
  • the differently functionalized dendrimer-modified glass and silicon supports were purchased from Chimera Biotec GmbH, Dortmund.
  • a spin coater from Laurell was used to apply the substances together with a chuck adapter made of Mylar film (to ensure the required vacuum) and the exposure was carried out with the system MA6 (company Suess, wavelength: 365 nm). Power: 20 mW / cm 2 , program: soft contact) with the PKI mask at the Institute for High Frequency Technology.
  • the exposure without photolithographic equipment was carried out with the aid of a mercury vapor lamp ("Pen Ray" lamp from the company UVP 1 California, USA, wavelength maximum 365 nm, power 5.5 W, length 2 1/8 inches.)
  • the fluorescence signals were read with the Microarray Fluorescence Reader 4000B from Axon and evaluated with the program Axon Gene Pix Pro 4.0.
  • Streptavidin-Cy5 was supplied by Chimera Biotec and is from Zyomed.
  • Alexa-fluoro-647-labeled concanavalin A was obtained from the company Molecular Probes, anti-phosphotyrosine biotin from the company BIOTREND Chemicals.
  • MESTBS 20 mM TRIS-CI, 150 mM NaCl, 4.5% milk powder (Oxoid), 5 mM EDTA, 0.2% NaN 3 , 1 mg / ml DNA MB Grade (Roche);
  • the detection of the immobilized substances was carried out by the company Chimera Biotec GmbH, Dortmund.
  • Example 1 Immobilization of haptens by light-induced addition of mercaptans to terminal double bonds
  • the immobilization reaction was evaluated with the aid of biotinallylamide 143 with streptavidin-Cy5 as detection.
  • the required thiol-functionalized glass supports were synthesized as shown in Scheme 2. Dendrimer-coated carboxylic acid-functionalized slides from Chimera Biotec were reacted with DCC and cystamine dihydrochloride, and then disulfide 150 was reduced to the thiol with DTT.
  • Figure 2 shows the result of the dendrimer-coated thiol-functionalized glass slides. The experiment clearly shows that the binding proceeds via the double bond, since the negative control 38 could not be detected. With regard to the solvents, the reaction proceeded best in DMF / toluene (3: 1).
  • Biotinallylamide 143 was immobilized at concentrations of 0.1 mM and 0.01 mM on a thiol-functionalized glass slide. After detection with a 100 nM solution of streptavidin-Cy5 (Figure 3A), the glass slide was washed several times stringently with 0.1% sodium dodecyl sulfate solution at 80 0 C ( Figure 3B and 3C). The mixture was then incubated again with streptavidin-Cy5 (FIG. 3D).
  • biotinallylamide 143 and biotinpropylamide 38 were spotted in a concentration gradient with a handspotter onto two thiol-functional glass slides.
  • One of the glass slides was exposed for 3 h at 365 nm, the other was 3 h after spotting under laboratory light kept in the dark. After intensive washing with DMF and water, the binding was again detected with a 100 nM solution of streptavidin-Cy5 (FIG. 4).
  • FIG. 4A the glass carrier is shown, which has been exposed for 3 h.
  • the signal intensities correspond to the concentration gradient and the detection limit for the biotinallylamide 143 is 1 ⁇ M.
  • the traces of negative control which have been detected are due to the drying of the substance and insufficient washing.
  • the glass slide shown in Figure 4B was spotted under laboratory light and then stored in the dark. Significantly lower signals were detected compared to the exposed carrier. This is illustrated in the histogram shown in FIG. 4C.
  • phosphopeptide 158 was immobilized and detected with anti-pTyr antibody. It was prepared in solution (Scheme 4).
  • phosphopeptide 158 was spotted at a concentration of 1 mM on thiol-functionalized glass pieces, which were then exposed. After every 45 minutes, a glass piece was taken out under the UV lamp and washed with DMF and water. As a negative control (nk) served a spotted piece of glass, which had been kept for 315 minutes in the dark. Subsequently, detection was again carried out with the anti-pTyr antibody conjugate (50 nM) (FIG. 7). It was found that the signal intensity did not increase further even after 135 minutes, i. a saturation had occurred.
  • the signal intensity of the negative control was in the range of those after 45 minutes exposure time, which means that 45 minutes are not sufficient for a visible immobilization by means of the UV lamp used.
  • Example 2 Use of light-induced addition of mercaptans to B ⁇ otinaylamiel 143 for patterning surfaces by photolithography
  • silicon carriers For photolithography, silicon carriers have been used which prevent reflection or propagation of the light in the carrier.
  • silicon plates were produced with an approximately 1 micron thick SiO 2 layer and cut into the shape of slides. Subsequently, these silicon carriers were coated with dendrimers. The thiol functionalization was carried out as described for the glass slides (Scheme 2).
  • the carriers were wetted by spin coating with the Biotinallylamid 143 solution. This was done with a 1 mM and 10 mM Biotinallylamid solution and Exposure times of 10 and 30 min realized. It was then washed by centrifugation and incubated with streptavidin-Cy5 (100 nM) (FIG. 8).
  • Detection of the immobilization of biotin-llylide 143 (10 mM) by a 10-minute exposure time revealed a signal intensity of the exposed sites (Figure 8A) that corresponded to that on detection of immobilization of biotin-allylamide (1 mM) by a 30-minute exposure time ( Figure 8D).
  • the lowest intensity of the exposed sites was obtained in the reaction of the 1 mM solution of compound 143 after 10 minutes (FIG. 8C), the highest in that of the 10 mM solution after 30 minutes (FIG. 8B, different contrast settings in the illustration).
  • the signal-to-background ratio was improved to 9: 1 on the thirty minute exposure of the 10 mM biotin-allylamide solution.
  • Example 3 Use of Light-Induced Addition of Wercaptans to Phosphopept ⁇ d 158 and Pentenoic Acid-Functionalized Streptavidin 161 for Patterning Surfaces by Photolithography
  • phosphopeptide 158 and, on the other hand, pentenoic acid-functionalized streptavidin 161 were used for patterning surfaces (FIG. 10D).
  • streptavidin 162 that the streptavidin actually binds to the surface via the double bond was shown by unfunctionalized streptavidin 162, which was subjected to the same immobilization procedure as streptavidin 161. The result is shown in FIG. 10B. Although is a structuring by streptavidin, but the signal-to-background ratio is much lower at -6: 1 than that achieved by the immobilization of streptavidin 161 (-50: 1). Thus, although a minor side reaction takes place, but the attachment proceeds mainly by the addition of the thiols on the surface to the terminal double bonds, which are located on the streptavidin.
  • Example 5 Biotin-S-amidocaproic acid allylamine (143) A solution of 50 mg (0.14 mmol) of biotin-6-amidocaproic acid in 3 ml of abs. DMF was prepared by heating the suspension obtained by addition with a hot air gun and, after all had dissolved, cooled again to rt. Then 30 mg (0.15 mmol) EDC and 24 mg (0.15 mmol) HOBt were added and stirred for 1 h. Thereafter, 23 .mu.l (0.3 mmol) of allylamine were added and stirred for 18 h. The solvent was i. Vak. removed, the residue was taken up in a little MeOH and the product precipitated with plenty of Et 2 O. This process was repeated once. Grayish solid.
  • Example 6 Ethoxy - [(4V-allyloxycarbonyl) aminoethyl] ether (156) 1.94 ml (19.4 mmol) of 2,2-aminoethoxyethanol and 1.08 g (27.0 mmol) of NaOH were dissolved in 20 ml of dioxane and 10 ml of water. Under ice-cooling and stirring, 2.48 ml (23.3 mmol) of allyl chloroformate in 20 ml of dioxane was added dropwise within 40 min, resulting in a white suspension. The mixture was then stirred for 21 h at rt and then the solvent mixture i. Vak. away.
  • the residue was overlaid with 100 ml of chloroform and 100 ml of water and brought to pH 5 with 1 M HCl solution and the phases were separated after extraction.
  • the organic phase was dried over MgSO 4 and the solvent i. Vak. away. Colorless liquid. Yield: 4.05 g, (about 19.4 mmol), quantitative.
  • the Fmoc group was cleaved as described in Example 9.
  • Example 11 W-Fiymenmethyloxycarbonyl- [tyrosyl-O-0 ( ⁇ V f , ⁇ / --phosphoric acid bis-dimethylamido)] - glycyl- [aspartic acid (O-t-butyl)] allylamide (at 158)
  • the Fmoc group was cleaved as described in Example 9.
  • Example 12 ⁇ f-te ⁇ t-BytyloxycarbonyI-IeucyI- [tyrosyl-O- fW, W "-Phosporsä rebisdimethySamido y)] - gIycyS- [aspartic acid (O-fert- butyl)] a ! y amide (at 158)!
  • Example 16 General Procedure for Photoimmobilization through a Mask or Laser Microscope on Glass Carriers Three 25 ⁇ l (1.0 x 1.0 cm, AB-0576) frames from ABGene, Surrey, UK, were applied to a thiol-modified glass slide.
  • the corresponding solution was filled in the dark in the frame and then the glass substrate was either put into the mask and exposed from above through the closed mask with the UV lamp about 10 cm away or on a laser microscope through a lens from below. Thereafter, the glass slide was immediately rinsed intensively with DMF and H 2 O and dried at HV.
  • Laser power 100% at 728 nm about 150-200 mW (two photon excitation gave theorem 364 nm).
  • Thiol-functionalized silicon wafers were charged with 400 ⁇ l of the appropriate solution. The solution was evenly distributed on the surface by centrifugation. The centrifugation program was:
  • the silicon wafer was allowed to dry for 10 minutes under nitrogen flow in the spin coater. Then was exposed with variable duration. After exposure, washing was carried out with the same centrifugation program:
  • Scheme 1 Synthesis of the required compound for the test reaction 143.
  • Scheme 2 Functionalization of glass supports with thiols.
  • Scheme 3 Synthesis of mannoseallyiamide 155.
  • DCM / diethylamine (4: 1); b: Fmoc-Gly-OH, HOBt, DIPEA, HBTU, DMF / DCM (1: 1), RT, 20 h; c: Fmoc-pTyr [(NMe 2 ) 2 ] -OH, HOBt, DIPEA, PyBOP, DMF, RT, 12 h; d: Boc-Leu-OH, HOBt, DIPEA, HBTU, DMF / DCM (1: 1), RT, 12.5 h; e: 1. TFA / DCM / TES
  • FIG. 1 Reactions for photochemical immobilization according to Blawas et al.1998.
  • Figure 2 Detection of the immobilization of Biotinallyiamid 143 and
  • FIG. 3 Experiment for the regeneration of the surface; A: detection of biotin 143 by binding streptavidin-Cy5; B and C:
  • FIG. 4 Detection of the binding of biotin 143 immobilized in a concentration gradient with STV-Cy5; A: 3 h at 365 nm exposed glass slide; B: 3 h in the dark stored glass slide;
  • FIG. 5 Detection of immobilized mannose 155 with concanavalin A (2 ⁇ M).
  • FIG. 3 Detection of the phosphopeptide 158 with the biotinylated anti-pTyr antibody-streptavidin-Cy5 conjugate and histogram representation of the signal intensities.
  • FIG. 7 Histogram of the signal intensities of the time-dependent immobilization of phosphopeptide 158.
  • FIG. 8 Detection of immobilized biotinallylamide 143 with
  • Streptavidin-Cy5; Biotin 143 was used in concentrations of 1 and 10 mM, and the exposure time was varied at 10 and 30 minutes.
  • FIG. 9 Enlargement of the upper section of FIG. 8A.
  • FIG. 10 A: detection of immobilized streptavidin 161 with biotin
  • FIG. 11 A: Detection of laser-immobilized biotinallylamide 143 with streptavidin-Cy5; B: magnification of A;
  • Literature BT. Houseman, M. Mrksich, Chem. BIoL 2002, 9, 443-454.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen. Die Beschichtung erfolgt durch eine chemoselektive Reaktion zwischen ungesättigten Kohlenwasserstoffengruppen und Thiolgruppen. Durch entsprechende Wahl der Reaktanten können die Oberflächen beliebig funktionalisiert und z.B. unter Verwendung von Masken und/oder Lasern strukturiert werden. Das Verfahren zeichnet sich durch kurze Reaktionszeiten sowie einfache Substanzauftragungs- und Waschprozesse aus. Die Selektivität und Milde des Verfahrens ermöglicht vielfältige Nutzungen der erfindungsgemäßen Strukturierungstechnik.

Description

Entwicklung einer ortsspezifischen, chemoselektlven yndl gerichteten photochemischen Mikrostaikturieryngstechnik für bio- und materialwissenschaftlϊche Anwendungen (z.B. zur Herstellung von
Mikroarrays)
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen. Die Beschichtung erfolgt durch eine chemoselektive Reaktion zwischen ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppen und Thiolgruppen. Durch entsprechende Wahl der Reaktanten können die Oberflächen beliebig funktionalisiert und z.B. unter Verwendung von Masken und/oder Lasern strukturiert werden. Das Verfahren zeichnet sich durch kurze Reaktionszeiten sowie einfache Substanzauftragungs- und Waschprozesse aus. Die Selektivität und Milde des Verfahrens ermöglicht vielfältige Nutzungen der erfindungsgemäßen Strukturierungstechnik.
Strukturierte bzw. mikrostrukturierte Oberflächen sind Oberflächen, die mit Reaktanten unterschiedlich belegte oder funktionalisierte Bereiche aufweisen. Insbesondere mikrostrukturierte Oberflächen finden breite Anwendung wie beispielsweise beim Hochdurchsatz-Screening. Ursprünglich wurden mit Proteinen strukturierte Oberflächen entwickelt, um biologische Moleküle in miniaturisierte biologisch-elektronische Geräte zu integrieren. Sie finden auch Anwendung in der Entwicklung von Biosensoren, welche beispielsweise zur Ermittlung von Selektivität und Sensitivität von Antikörpern herangezogen werden können. Weiterhin werden sie zur Vermittlung von strukturiertem Zellwachstum genutzt, womit beispielsweise Zell-Mikroarrays hergestellt werden können. Mit ihrer Hilfe sollen künstliche Gewebe sowie Organ-Transplantate erzeugt werden.
Weitere Anwendungsgebiete für mikrostrukturierte Oberflächen finden sich in der Computer-Chip-Industrie, der Elektro- und Halbleitertechnik, der Displaytechnologie und der Herstellung mikrofluidischer Systeme. Insbesondere bei der Herstellung von LEDs Qight emitting diodes), LCDs (liquid crystal displays) und OLEDs (organic Hght-emitting diodes) spielen strukturierte Oberflächen eine wichtige Rolle. In OLEDs, die durch Photolitographie mittels Photosäure hergestellt werden, finden beispielsweise Spirobifluoren-co-fluoren Polymere Verwendung (Müller et al., 2003).
Strukturierte Oberflächen können durch Photolackverfahren, Photochemische Techniken und mit Hilfe von SAMs hergestellt werden. Die Muster können durch UV-Lampen in Kombination mit Masken oder Fokussierung erstellt werden. Weiterhin können Oberflächen durch lithografische Techniken strukturiert werden, welche ohne Belichtung auskommen. Man unterscheidet zwischen Lithografie, bei der starre anorganische Materialien beispielsweise durch Laser-Abtragung oder -induzierte Abscheidung behandelt werden, und Softlithografie, bei welcher die Strukturen in selbstorganisierten Schichten durch Stempel oder Gussformen aus Elastomer auf Substrate übertragen und flexible organische Moleküle und Materialien verwendet werden. Im Allgemeinen, von der Halbleiterindustrie bis zur biologischen Oberflächenstrukturierung, wird Photolithographie aber weitaus häufiger standardmäßig angewendet.
Konventionelle Photolackverfahren, die in der Elektronikindustrie zur Herstellung von Mikroschaltkreisen verwendet werden, wurden zur Erzeugung von Protein-Strukturen adaptiert.
Photochemische Substanz-Mikrostrukturierungstechniken nutzen chemisch labile funktionelle Gruppen, welche durch UV-Belichtung aktiviert werden können, um Zielmoleküle zu binden. Umgekehrt kann kurzwellige UV- Strahlung zum Deaktivieren von chemischen Spezies verwendet werden, wie z.B. bei der Umsetzung von Thiolen zu Sulfonaten.
Die am meisten verwendeten Methoden für die photochemische Immobilisierung nutzen Arylazid-, Nitrobenzyl-(Schutzgruppen) und Diazirin- Gruppen (Figur 1). Auch Benzophenone werden verwendet, und kürzlich wurde über die Adaption vom Photobleichen von Fluorophoren berichtet. AHe diese Techniken haben die Gemeinsamkeit, dass es sich um eine C-H- Insertion einer hochreaktiven Spezies in die zu immobilisierende Substanz handelt. Aufgrund der hohen Reaktivität können unerwünschte Nebenreaktionen nicht vermieden werden. So kann beispielsweise der Funktionserhalt bei der Immobilisierung, insbesondere die Aktivität von Proteinen, durch diese Techniken nicht gewährleistet werden. Weitere Probleme der photolithographischen Mikrostrukturierung liegen in der Immobilisierung von vielen verschiedenen Substanzen und dem unspezifischen Binden, insbesondere von Proteinen, auf nicht-aktivierten Regionen der Oberfläche.
Selbstassemblierte Monoschichten (self-assembled monolayers (SAMs)) werden häufig in Kombination mit photochemischen Methoden verwendet.
Die Herstellung ausgerichteter SAMs mit verschiedenen Fuktionalitäten auf
Goldoberflächen ist bekannt. Dazu wurden Regionen unbelichtet belassen und eine photolabile Schutzgruppe sowie ein photolabiler Linker verwendet.
Mrksich et al. nutzten SAMs zusammen mit photolabilen Schutzgruppen, um chemoselektiv durch eine Diels-Alder-Reaktion Liganden zu immobilisieren.
Vor der Diels-Alder-Reaktion werden thiolhaltige Gruppen über ihr
Schwefelatom an die Goldoberfläche gekoppelt. Dies ist neben der
Verwendung von Ligandenpaaren mit hoher Affinität wie Biotin-Streptavidin das einzige Beispiel für eine chemoselektive Mikrostrukturierung, die aber viele chemische Schritte benötigt.
Für die Herstellung von Mikroarrays stehen nur wenige Alternativen an chemoselektiven Reaktionen zur Auswahl, bei denen die eingesetzten funktionellen Gruppen nicht möglicherweise auch für die biologische Aktivität wichtig sind. Eine hohe Chemoselektivität wird beispielsweise bei der Cu1+ vermittelten Cycloaddition eines Acetylens mit einem Azid erreicht. Da aber Kupfer insbesondere mit Sulfiden Komplexe bildet, kann ein Verlust der Aktivität bzw. Funktion von Proteinen durch diese Komplexbildung nicht ausgeschlossen werden.
Zur Mikrostrukturierung von Oberflächen ist derzeit im Stand der Technik keine milde, direkte kovalente Kupplungsmethode beschrieben, bei der nicht unselektiv in eine C-H-Bindung des Substrats insertiert wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb ein Verfahren bereitzustellen, welches eine Möglichkeit zur chemoselektiven Beschichtung von Oberflächen unter milden Bedingungen bereitstellt.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch eine Reaktion zwischen einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe eines ersten Moleküls und einer Thiolgruppe eines zweiten Moleküls gelöst, wobei eines der beiden Moleküle auf der Oberfläche immobilisiert ist.
Zur Durchführung der Reaktion wird
(a) eines der beiden Moleküle, ausgewählt aus einem Molekül mit einer Thiolgruppe und einem Molekül mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe, auf der Oberfläche immobilisiert,
(b) das zweite, an das erste Molekül zu bindende, Molekül zugegeben und
(c) die Reaktion induziert.
Grundsätzlich können erfindungsgemäß beliebige Thiolgruppen-haltige Moleküle bzw. Moleküle mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe eingesetzt werden. Diese können mit allen dem Fachmann bekannten Verfahren zur Einführung einer Thiolgruppe oder einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe, bevorzugt einer Doppelbindung, in Moleküle hergestellt werden. Das Einführen der gewünschten Gruppe kann vor der Immobilisierung des Moleküls mit dem ersten Reaktanten auf der Oberfläche aber auch nach dessen Immobilisierung auf der Oberfläche erfolgen. Die ersten bzw. zweiten Moleküle mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffbindung oder einer Thiolgruppe werden im Folgenden auch als erster bzw. zweiter Reaktant bezeichnet.
Vorteilhafterweise können erfindungsgemäß als Reaktant bzw. Molekül mit ungesättigter Kohlenwasserstoffgruppe beliebige Moleküle eingesetzt werden, solange sie eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, insbesondere eine -C=C- Doppelbindung und besonders bevorzugt eine nicht konjugierte -C=C- Doppelbindung aufweisen.
Die Formulierung „ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe" umfasst bevorzugt C2 bis C100, insbesondere C3 bis C20-Kohlenwasserstoffe, die wenigstens einfach ungesättigt sind. Die Kohlenwasserstoffegruppe kann geradkettig oder verzweigt, substituiert oder unsubstituiert sein. Bevorzugt handelt es sich um eine terminale ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe.
Bei dem Molekül, welches eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe aufweist, kann es sich grundsätzlich um einen ungesättigten Kohlenwasserstoff oder einen substituierten ungesättigten Kohlenwasserstoff handeln, aber auch um ein Molekül, bei welchem die ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe selbst einen Substituenten darstellt.
Die ungesättigten Kohlenwasserstoffe können mit funktionellen Gruppen wie beispielsweise OH, COOH, COOR, NO2, RSO2, wobei R ein geradkettiger oder verzweigter, substituierter oder unsubstituierter Kohlenwasserstoff mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen ist, oder mit funktionellen Molekülen substituiert sein.
Die erfindungsgemäße verwendete Formulierung „Mercaptan" umfasst alle dem Fachmann bekannten Verbindungen bzw. Moleküle, die wenigstens eine Thiolgruppe, d.h. -SH-Gruppe aufweisen.
Beispiele für bevorzugte Moleküle, die mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe oder einer Thiolgruppe substituiert sein können bzw. eine solche Gruppe enthalten, umfassen Naturstoffe wie beispielsweise Zucker und Kohlenhydrate, Aminosäuren, Peptide, Phosphopeptide, Proteine, Enzyme, Antikörper, Lipide, Nukleotide, Nukleoside und Nukleinsäuren. Weitere bevorzugte Beispiele umfassen Farbstoffe, radioaktiv markierte Moleküle, Isotopen markierte Moleküle, Monomere für Polymerisationsreaktionen oder Polymere, lumineszierende Moleküle, insbesondere fluoreszierende Moleküle, elektrolumineszierende Moleküle bzw. Polymere, Nanopartikel, Vesikel und anorganische Katalysatoren.
Diese Moleküle werden, um als Reaktant im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden zu können, mit einer oder mehreren ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppen oder Thiolgruppen versehen. Falls diese Gruppierungen bereits im Molekül enthalten sind, können diese vorhanden Gruppierung zur Durchführung der Reaktion genutzt werden. Es ist auch möglich, noch weitere zusätzliche Kohlenwasserstoff- oder Thiolgruppen in die Moleküle einzubringen.
Die eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe oder eine Thiolgruppe aufweisenden Moleküle umfassen besonders bevorzugt elektrolumineszierende, z.B. rot, grün und/oder blau elektrolumineszierende Moleküle bzw. Polymere. Besonders bevorzugte Beispiele für elektrolumineszierende Moleküle umfassen PoSy(1 , 4- phenylenvinylene) (PPV) und davon abgeleitete Derivate, insbesondere PPV-Copolymere und CN-PPVs, Poly(3-alkylthiophene) und davon abgeleitete Derivate, Poly(para-phenylene) (PPP) und davon abgeleitete Derivate, insbesondere Leiter-Poly(para-phenylene) (LPPP), und Gemische solcher Verbindungen, welche für die Erfindung mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe oder einer Mercaptangruppe derivatisiert werden.
Besonders bevorzugte Beispiele für Nanopartikel umfassen Quantum Dots, insbesondere Halbleitermaterialien wie beispielsweise CdS, CdSe, CdTe, ZnS, TiO2 oder ähnliche Übergangsmetallchalkogenide, und Metallpartikel, insbesondere aus Au, Ag, Pt, Pd und Cu. Die Nanopartikei können z.B. oberflächenfunktionalisiert vorliegen und/oder sie können in organisch ummantelter Form vorliegen. Eine organische Ummantelung wird bevorzugt aus verzweigten Kohlenwasserstoffen gebildet, die substituiert oder unsubstituiert sein können.
Die Immobilisierung des immobilisierten Moleküls an eine Oberfläche kann über beliebige Wechselwirkungen erfolgen, die zu einer Bindung zwischen der Oberfläche und dem zu immobilisierenden Molekül mit ungesättigter Kohlenwasserstoffgruppe oder Thiolgruppe führen. Diese Wechselwirkungen können z.B. kovalent, ionisch, Wasserstoffbrücken oder van-der Waals-Kräfte sein. Die Bindung des immobilisierten Moleküls an die Oberfläche erfolgt nicht über die Thiolgruppe bzw. über die ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, welche gemäß Anspruch 1 miteinander reagieren, so dass diese Gruppen für die Reaktion mit dem zweiten Reaktanten bzw. Molekül zur Verfügung steht. Bevorzugt weist das an die Oberfläche zu bindende erste Molekül deshlab mindestens eine weitere funktionelle Gruppe auf, welche die Bindung an die Oberfläche ermöglicht. Besonders bevorzugt sind Hydroxyl-, Thiol- oder Amino-Gruppen. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung des immobilisierten Moleküls über eine SH-Gurppe an eine Goldoberfläche. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Immobilisierung des ersten Moleküls durch Selbstassemblierung unter Ausbildung einer selbstassemblierten Monoschicht.
Die Immobilisierung des ersten Reaktanten bzw. Moleküls auf der Oberfläche kann gleichmäßig über die gesamte Oberfläche erfolgen, die Immobilisierung kann aber auch nur an festgelegten Abschnitten auf der Oberfläche erfolgen, so dass die Oberfläche bereits durch die Immobilisierung des ersten Reaktanten eine Strukturierung erfahren kann. Überschüssiger und/oder loser erster Reaktant wird nach seiner Immobilisierung von der Oberfläche entfernt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mit einer Mercaptangruppe oder einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe derivatisierte Dendrimere und/oder Silane als erster Reaktant verwendet und auf der Oberfläche immobilisiert. Die Dendrimere, beispielsweise PAMAM- Dendrimere, bzw. die Silane verfügen über wenigstens eine funktionelle Gruppe, die zu einem Mercaptan oder einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe umgesetzt werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein eine Mercaptangruppe (Thiol) enthaltendes Molekül als erster Reaktant auf der
Oberfläche immobilisiert. Insbesondere die Thiolgruppe des Mercaptans kann sowohl vor dessen Immobilisierung auf der Oberfläche bereits im
Molekül vorhanden sein, vorzugsweise in geschützter Form, sodass sie während der Immobilisierung nicht mit der Oberfläche wechselwirken kann, oder sie kann erst nach der Immobilisierung auf der Oberfläche durch chemische Umsetzung einer anderen funktionellen Gruppe erzeugt werden.
Eine beispielhafte Funktionalisierung von Glasträgern mit Mercaptanen ist in Schema 2 gezeigt. Die Funktionalisierung immobilisierter Dendrimere oder Silane erfolgt analog, wobei die Dendrimere bzw. Silane nach ihrer Immobilisierung auf der Trägeroberfläche vorzugsweise als selbstassemblierte Monoschichten vorliegen.
Die Formulierung „Oberfläche" umfasst alle Flächen auf welchen einer der beiden Reaktanten, vorzugsweise das Mercaptan immobilisiert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform verhindern die verwendeten Oberflächen zumindest teilweise die Reflexion oder Weiterleitung von Licht im Oberflächenträger. Auf diese Weise kann eine hohe Randschärfe bei der Erzeugung von Strukturen erreicht werden.
Die Oberfläche besteht bevorzugt aus Si, SiOx mit 0<x<5, wobei SiO2 besonders bevorzugt ist, Polysiloxanen, Ge, Ge-Oxiden, wobei GeO2 besonders bevorzugt ist, Metallen, wie beispielsweise Au, Ag, Cu, Pd, Pt und besonders bevorzugt AI, Metalloxiden, wobei AI-Oxide, wie beispielsweise A!2O3, ZrO2, und In-Sn-Oxide (ITO), wie beispielsweise In2O3ZSnO2, besonders bevorzugt sind, GaAs, InP, beliebigen Gemischen von Metallen und Oxiden und/oder Halbleitermaterialien, insbesondere Gemischen von Ge, AI und/oder deren Oxiden, Legierungen von Ge und/oder AI und andere Halbleitermaterialien.
Die Oberfläche ist vorzugsweise 0,1 - 10 mm stark. Besonders bevorzugt ist eine Stärke von 5 ± 1 mm, stärker bevorzugt von 2 ± 1 mm und nochmals stärker bevorzugt von 0,5 ± 0,4 mm.
Die Oberfläche verfügt bevorzugt über funktionelle Gruppen, wie beispielsweise Amino-, Hydroxyi- oder Thiolgruppen, durch welche die Immobilisierung des ersten Reaktanten auf der Trägeroberfläche möglich ist. Liegt eine SiOx-Oberfläche vor, sind Hydroxylgruppen bevorzugt.
Die Oberfläche ist bevorzugt eine Trägeroberfläche, wobei bevorzugt Polymere, Glas, Quartz- und Siliciumwafer, sowie kombinierte Si/SiOx Elemente mit 0<x<5 als Träger auf welchem die Oberfläche aufgebracht ist, Verwendung finden. Des Weiteren können alle Materialien, welche wie oben beschrieben die Oberfläche bilden, auch den Träger selbst bilden. Die Träger und damit auch die Oberflächen können planar oder nicht-planar, z.B. konkav oder konvex, sein. Die Verwendung von Silicium-, Siliciumoxid- und kombinierten Silicium/Siliciumoxidträgem ist besonders bevorzugt.
Die Reaktion zwischen der Thiolgruppe des Mercaptans und ungesättigtem Kohlenwasserstoff ist bevorzugt photoinduziert oder Radikal-induziert.
Durch die Induktion zerfällt das eingesetzte Mercaptan vor der Additions- reaktion mit der ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe in ein Wasserstoff- und ein Schwefel-Iokalisiertes Radikal. Das Schwefelradikal addiert dann selektiv an eine Doppelbindung, bevorzugt an eine terminale Doppelbindung. Die Additionsreaktion läuft bevorzugt unter Bildung eines anti-Markownikow-Produkts ab.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist chemoselektiv, d.h. die an der Reaktion beteiligten funktionellen Gruppen gehen weitgehend keine anderen
Reaktionen mit anderen funktionellen Gruppen ein. Solche „anderen funktionellen Gruppen" können in den Reaktanten selbst und in weiteren in der Reaktionslösung vorhandenen, aber nicht direkt an der Reaktion teilnehmenden, Substanzen, vorliegen. Die Reaktion ist insbesondere kompatibel zu funktionellen Gruppen wie Carbonsäuren, Estern, Amiden,
Nitrilen, Hydroxy, O- und N-Carbonyl, Alkyl, Aryl (Thio)Ethem, Aminen, deren Gegenwart die Reaktion nicht stört. Auch Halogene können als funktionelle Gruppen im Reaktionsgemisch vorliegen. Durch die chemoselektive Reaktion kann das Reaktionsprodukt unter weitgehendem Ausschluss von Nebenprodukten exakt vorhergesagt und erhalten werden.
Die chemoselektive Reaktion ermöglicht somit die zielgerichtete Planung und Herstellung von beschichteten Oberflächen. Die Vielzahl zum erfindungsgemäßen Verfahren kompatibler funktioneller Gruppen ermöglicht den weitgehenden Verzicht auf den Einsatz von Schutzgruppenchemie während der Reaktion. Darüber hinaus zeigen die erfindungsgemäß funktionalisierten Reaktanten keine unspezifische Komplexbildung und/oder unspezifische Bindung an die Oberfläche.
Neben der Chemoselektivität zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch Regioselektivität aus, d.h. die Reaktanten reagieren an einer definierten, durch die Funktionalisierung mit -SH oder einer Doppelbindung festgelegten Stelle im Molekül. Die Bindung an die Oberfläche bzw. das erste bereits immobilisierte Molekül erfolgt dann ausschließlich über die so funktionalisierte Reaktionsstelle. Die Funktionalisierung mit -SH oder einer Doppelbindung kann in jedem beliebigen Abschnitt auf der Oberfläche eines Moleküls erfolgen, der einer solchen Funktionalisierung zugänglich ist. Beispielsweise können so, falls die Proteinstruktur bekannt ist, gezielt die Domänen eines Proteins ausgesucht und anschließend funktionalislert werden, über die eine Bindung an die Oberfläche erfolgen soll.
Chemoselektivität und Regioselektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichen eine gerichtete Beschichtung bzw. Immobilisierung einer Vielzahl komplexer Substrate an Oberflächen, wobei deren Funktionalität und/oder Aktivität erhalten bleibt. Im Gegensatz zu aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, ist es möglich, die Reaktionsstellen in den zu addierenden Molekül so zu wählen, dass sich die zwischen den Reaktanten bildende kovalente Bindung die native Funktionalität oder Aktivität der Reaktanten nicht oder nur unwesentlich beeinflusst. Bei der Immobilisierung von Proteinen ist es beispielsweise vorteilhaft, die Reaktions- bzw. Additionsstellen so zu wählen, dass sie aktive Zentren der Proteine nicht beeinflussen. In einer anderen Ausführungsform ist es möglich, die Reaktionstelle so zu wählen, dass sie gerade im aktiven Zentrum eines Proteins liegt, um so die katalytische Aktivität des Proteins zu hemmen oder vollständig auszuschalten. Auf diese Weise können Aktivitätsstudien durchgeführt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann das gleiche Protein in unterschiedlichen experimentellen Ansätzen über verschiedene Domänen bzw. Abschnitte auf einer Oberfläche immobilisiert werden. Durch Vergleich der unterschiedlichen Immobilisierungsansätze können Hinweise auf die katalytische Struktur oder das Substratbindungsverhalten des Proteins gewonnen werden. Selbstverständlich können beispielsweise aber auch Chromophore oder lumineszierende Moleküle selektiv so immobilisiert werden, dass das Chromophor- bzw. Lumineszenzsystem nicht beeinträchtigt wird.
Aufgrund der hohen Chemoselektivität und Regioselektivität zeichnet sich das erfindungsgemäße Beschichtungs- bzw. Immobilisierungsverfahren ferner durch seine hohe Reproduzierbarkeit aus. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zudem zu einer gleichmäßigen und dichten Belegung der Oberflächen mit aktiven bzw. funktionalen Molekülen. Die Reaktion kann unter Verwendung von Radikalstartern wie beispielsweise N,N-Azobisisobutyronitril (AlBN) oder Arnmoniumpersulfat (APS) Radikal-induziert werden. Bei Radikal-Induktion kann die Strukturierung der zu beschichtenden Oberfläche z.B. durch Verwendung von Masken, die abstandslos auf die Oberfläche aufgebracht werden, erhalten werden. Abstandslos bedeutet dabei, dass zwischen Oberfläche und Maske, kein Raum zur Verfügung steht, in den Radikalstarter eindringen bzw. eindiffundieren können, um dort die Additionsreaktion zwischen den beiden Reaktanten zu induzieren.
in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Reaktion zwischen der Thiolgruppe des Mercaptans und der ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe des anderen Moleküls eine photochemische Reaktion, die vorzugsweise photoinduziert ist. Die Photoinduktion wird durch Bestrahlung der Reaktanten erreicht. Zur Bestrahlung kann Licht mit Wellenlängen aus dem sichtbaren Bereich und/oder dem infrarot Bereich verwendet werden, jedoch wird die photochemische Reaktion vorzugsweise durch UV-Licht induziert. Dabei wird bevorzugt Licht des UV- Wellenlängenbereichs von 200 - 400 nm verwendet. Besonders bevorzugt wird die Photoinduktion in einem Wellenlängenbereich von 350 bis 400 nm und noch stärker bevorzugt bei 365 ± 5 nm durchgeführt. Als Lichtquelle kann dabei jede geeignete Lampe, die über ein geeignetes Spektrum verfügt, verwendet werden. Die Verwendung von Quecksilberdampflampen stellt für die Induktion durch UV-Licht eine bevorzugte Ausführungsform dar.
Die Dauer der Photoinduktion bzw. Belichtung liegt in einem Bereich von 1 Sekunde bis 30 Minuten, bevorzugt in einem Bereich von 1 Sekunde bis 20 Minuten und ganz besonders bevorzugt in einem Bereich von 1 Sekunde bis 10 Minuten.
In einer weiteren Ausführungsform wird die photochemische Reaktion durch Verwendung eines Lasers induziert, wobei die Verwendung eines Lasermikroskops besonders bevorzugt ist. Durch die Verwendung von Laserlicht ist es erfindungsgemäß auch möglich die einer bestimmten Energie entsprechende Wellenlänge durch Einfach- oder Mehrfach- Photonen-Anregung zu erzeugen. Einfach-Photonen-Anregung ist besonders bevorzugt. Zwei-Photonen- und Drei-Photonen-Anregung stellen bevorzugte Ausführungsformen der Mehrfach-Photonen-Anregung dar. Zwei-Photonen-Anregung kann durch die hohe, lokalisiert gebündelte Energie Laser-Pulse erfolgen. Das bedeutet, dass während der Dauer eines Pulses Moleküle gleichzeitig zwei oder drei (bei Drei-Photonen-Anregung) Photonen einer längeren Wellenlänge aufnehmen, wodurch ein Elektron in den ersten Singulett-Anregungszustand angehoben wird. Diese hohe Energie ist lokalisiert, d.h. nicht nur in der X- und Y- Ebene sondern auch in der Z-Ebene definiert. Dadurch kann die zwei-Photonen-Anregung zur Erstellung dreidimensionaler Abbildungen verwendet werden. Die Fokussierung des hochenergetischen Peaks erreicht man durch die Verwendung von optischen Mikroskop-Objektiven bzw. Objektiven mit hoher numerischer Apertur.
Die Anwendung von Lasermikroskopen, welche über einen computergesteuerten, in der X-Y-Ebene beweglichen Objektträgertisch verfügen, kann eine Auflösung der funktionalisierten Oberflächen im nm-
Bereich ermöglichen und stellt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Die Auflösung konventioneller optischer
Mikroskope ist durch Beugungseffekte auf rund die Hälfte ihrer Strahiungswellenlänge begrenzt. Durch die Fokussierung des Laserstrahls mit Hilfe von Objektiven zur Erzeugung eines beugungsbegrenzten Punktes ist die Breite der Strukturen nicht mehr durch den Durchmesser des
Laserstrahls begrenzt. Die optische Auflösung eines solchen Mikroskops kann 100 nm betragen, so dass man die Strukturen scannen kann und nicht mehr auf die Auflösung des in der Photolithographie verwendeten
Fluoreszenz-Scanners angewiesen ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die photochemische Reaktion unter Verwendung von optischer Raster-Nahfeldmikroskopie (SNOM; scanning near-field optical microscope) induziert bzw. SNOM zur Strukturierung verwendet. SNOM ermöglicht die Auflösung von Strukturen von bis zu 10 nm. SNOM basiert auf der Ausnutzung extrem kurzreichweitiger Wechselwirkungen zwischen einer Sonde und einer Oberfläche, wobei das mit dem Abstand exponentiell abklingende optische Nahfeld herangezogen wird. Das Prinzip der SNOM besteht darin, eine submikroskopische Strahlenquelle in Form einer Nahfeldsonde im Abstand von nur wenigen Nanometern, und somit innerhalb der Reichweite des Nahfelds, rasterförmig über eine Oberfläche zu bewegen. Dabei ist die Auflösung im Wesentlichen nur durch die Geometrie der Sonde (d.h. in der Regel durch den Aperturdurchmesser) und nicht durch die Strahlungswellenlänge bestimmt. Die Verwendung von Sonden mit definierter Sondengeometrie bei hoher Strahlungsemission ist bevorzugt. Das Verfahren ist rasternd, d.h. Strukturen werden durch punkt- und zeilenweises Zusammensetzen vieler Einzelbestrahlungsvorgänge gewonnen. Anstelle von SNOM können auch Rastertunnel (STM)- und Rasterkraftfeldmikroskopie (AFM) eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung findet die photochemische Reaktion zur Addition des zweiten Reaktanten nur in solchen Bereichen der Oberfläche statt, die bestrahlt werden. Dabei ist es bevorzugt, wenn die Beschichtung strukturiert, bevorzugt mikro- oder nanostrukturiert, erfolgt. Strukturierung im erfindungsgemäßen Sinn umfasst dabei jegliche äußere Form der Oberflächenbeschichtung, die nicht auf einem zufälligen Beschichtungsergebnis basiert. Nano- bzw. Mikostrukturierung beschreibt Strukturen im Nanometer- bzw.
Mikrometerbereich, bevorzugt zwischen 10 nm und 1000 μm, stärker bevorzugt zwischen 10 nm und 100 μm und am stärksten bevorzugt zwischen 10 nm und 1 μm. !n einer bevorzugten Ausführungsform können sich auf einem Träger mehrere räumlich voneinander getrennte Beschichtungsbereiche befinden. Die Beschichtungsbereiche können wahlweise unterschiedlich beschichtet sein. Zwischen den erfindungsgemäß beschichteten bzw. strukturierten Bereichen können beliebig große Abstände bzw. nicht strukturierte oder nicht beschichtete Bereiche liegen. Die nicht beschichteten Bereiche sind bevorzugt Strukturen im Nanometerbereich bis hin zum Zentimeterbereich. Bevorzugt sind nicht strukturierte, strukturierte Bereiche trennende
Strukturen im Bereich von 350 nm bis 100 μm, stärker bevorzugt zwischen 350 nm bis 10 μm und am stärksten bevorzugt zwischen 350 nm bis 1 μm.
Sowohl die Strukturierung durch Verwendung von Masken, als auch die Strukturierung durch Verwendung von Laser kann Strukturen im Nanometerbereich erzeugen. Die oben beschriebene Nanostrukturierung durch Laser, insbesondere durch SNOM, ist besonders bevorzugt. Durch Nanostrukturierung mittels Laser werden bevorzugt Strukturen Im Bereich von 10 - 500 nm, stärker bevorzugt von 10 - 100 nm und am stärksten bevorzugt von 10 - 50 nm erhalten.
In einer Ausführungsform ermöglicht die Verwendung eines Lasers die selektive Bestrahlung der Oberfläche. Selektive Bestrahlung beschreibt die Bestrahlung vorbestimmer, eng definierter Bereiche auf der Oberfläche. Nur in den vom Laser bestrahlten Bereichen findet dabei die erfindungsgemäße Reaktion statt bzw. erfolgt eine Strukturierung der Oberfläche. Der selektive Bereich kann für jeden Bestrahlunsvorgang beliebig gewählt werden. Durch Entfernen von überschüssigem zweiten Reaktanten nach einer ersten Bestrahlung in einem ersten selektiven Bereich und Aufbringen eines weiteren unterschiedlichen Reaktanten und einer zweiten Bestrahlung in einem anderen, zweiten selektiven Bereich, ist es möglich eine Oberfläche gezielt in definierten Bereichen unterschiedlich zu beschichten bzw. zu strukturieren. Der Vorgang kann beliebig häufig wiederholt werden (multiple Strukturierung). In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die multiple Strukturierung den Aufbau bzw. die Gestaltung dreidimensionaler Strukturen, wie zum Beispiel Kammern, Röhren oder Kanäle auf der Oberfläche. Aber auch verschiedene Targets oder Testsubstanzen für Screening-Verfahren oder elektrolumineszierende Polymere, die unterschiedliche Farben emittieren, können beispielsweise auf diese Weise auf einer Oberfläche immobilisiert werden.
Die Randunschärfe bei der selektiven Bestrahlung mit Laser, insbesondere bei Verwendung des SNOM-Verfahrens, beträgt höchstens ± 1 μm, stärker bevorzugt höchstens ± 500 nm, noch stärker bevorzugt höchstens ± 100 nm und am stärksten bevorzugt ± 10 nm.
In einer weiteren Ausführungsform wird zur Festlegung der Bereiche, die einer Bestrahlung zugänglich sind, wird eine Maske verwendet. Die Erfindung umfasst weiterhin alle Techniken, die in entsprechenden photolitographischen Verfahren eingesetzt werden.
Die Form der Maske entspricht dem Bereich an welchem keine photochemische Reaktion stattfindet, d.h. kein Reaktant addiert wird. An
Stellen, welche in der Maske ausgespart sind, d.h. die einer Bestrahlung oder Radikalinitiatoren zugänglich sind, findet eine Reaktion statt. An solchen Stellen wird erfindungsgemäß Reaktant addiert. Die Masken können aus Formelementen wie Linien, Kreisen, Punkten, Feldern und dergleichen bestehen. Die Abmessungen der Formelemente liegen bevorzugt im Nano- bis Mikrometerbereich, bevorzugt zwischen 350 nm bis 100 μm, stärker bevorzugt zwischen 350 nm bis 10 μm und am stärksten bevorzugt zwischen 350 nm bis 1 μm. Die Abmessungen der Formelemente werden durch die Wellenlänge des zur Bestrahlung eingesetzten Lichtes in ihrer Minimalgröße begrenzt. Bei der erfindungsgemäß bevorzugten Verwendung von Licht einer Wellenlänge λ = 365 ± 5 nm betragen die minimalen Abmessungen der verwendeten Formelemente somit 365 ± 5 nm. Die Masken werden bevorzugt so auf der Trägeroberfläche fixiert, dass kein
Abstand zwischen Maske und Trägeroberfläche vorhanden ist. Die
Abweichung bei der Addition des zweiten Reaktanten bezüglich der Maskenstruktur beträgt bevorzugt höchstens ± 2 μm und stärker bevorzugt höchstens ± 0,5 μm. Bevorzugt wird ein Maskenmaterial verwendet, welches eingestrahltes Licht nicht reflektiert und/oder weiterleitet. Auf diese Weise wird zu einer höheren Randschärfe bei der Erzeugung von Strukturen beigetragen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden nacheinander unterschiedlich strukturierte Masken verwendet. Dies ermöglicht entsprechend eine multiple Strukturierung, wie sie weiter oben für die Verwendung von Lasern ausführlich beschrieben ist.
Die Oberfläche der Bereiche, die durch das erfindungsgemäße Verfahren beschichtet werden, können durch durch das erfindungsgemäße Verfahren auch funktionalisiert werden. Im Gegensatz hierzu ist jedoch eine inerte Beschichtung ebenfalls möglich.
Eine inerte Beschichtung kann weiteren Reaktionen oder Umsetzungen unabhängig von den Reaktionsbedingungen in keiner Weise zugänglich sein oder eine inerte Beschichtung kannnur unter den in der Reaktionslösung vorliegenden Bedingungen einer weiteren Reaktion bzw. Beschichtung nicht zugänglich sein.
Eine funktionalisierte Beschichtung weist beliebig zu wählende, von der Art der Funktionalisierung abhängige Charakteristika auf. Die Funktionalisierung kann beispielsweise verwendet werden, um chemische Reaktionen Abschnitts-Iokatisiert auf der beschichteten Oberfläche auszuführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Reaktanten, die zu einer inerten Beschichten führen, mit Reaktanten, die zu einer Funktionaiisierung führen, vor der Induktion der Reaktion vermischt. Durch Einstellung unterschiedlicher Mischungsverhältnisse ist es dadurch möglich, die Funktionalisierung in verschiedenen Bereichen der Oberfläche graduell, d.h. je nach Anteil des zu einer inerten Beschichtung führenden Reaktanten, abzustufen.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Funktionalisierung der Oberflächen durch Mikrofluidik. Mikrofluidsysteme weisen eine Vielzahl von Mikrofluidstrukturen auf. In diese Mikrofluidstrukturen (z.B. Kammern, Kanäle etc.) werden Reaktanten bzw. die auf eine Oberfläche aufzubringenden funktionellen Moleküle in Nanolitervolumina eingebracht. Da Mikrofluidik und Photolitographie zueinander kompatibel sind, ist es möglich, anschließend das erfindungsgemäße Verfahren im Mikrofluidsystem durchzuführen, so das erfindungsgemäß strukturierte bzw. funktionalisierte Mikrofluidoberflächen erhalten werden können. Die Ausführungsform zeichnet sich durch den Einsatz geringer Reaktantenvolumina aus. Durch Verwendung eines solchen Mikrofluidsystems ist es darüber hinaus möglich, einen Reaktanten nach erfolgter Immobiliserung leicht zu entfernen und im Rahmen einer multiplen Immobilisierung nacheinander weitere unterschiedliche Reaktanten in das System einzubringen. So ist es möglich auf einfache Weise unterschiedlich funktäonalisierte Oberflächen bzw. Mikrofluidstrukturen auf engstem Raum bereitzustellen.
Eine Funktionalisierung erfolgt bevorzugt durch Verwendung von mit einer Mercaptangruppe oder einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe derivatisierten funktionellen Molekülen als zweiten Reaktanten. Funktionelle Moleküle umfassen bevorzugt biologische Moleküle wie Proteine, Peptidfragmente, Antikörper Enzyme, Nukleinsäuren, Zucker und Lipide, Farbstoffe, radioaktiv markierte Moleküle, Isotopen markierte Moleküle, Monomere für Polymerisationsreaktionen, Polymere, lumineszierende Moleküle, insbesondere fluoreszierende Moleküle, elektrolumineszierende Moieküle bzw. Polymere, Nanopartikel, Vesikei und anorganische Katalysatoren.
Funktionalisierung umfasst ferner, dass die Oberfläche nach dem erfindungsgemäßen Strukturierungsverfahren einer weiteren beliebigen chemischen Umsetzung unterzogen werden kann. Dabei können sowohl weitere Moleküle addiert als auch Gruppen, z.B. Schutzgruppen, von der
Oberfläche abgespalten werden. Ebenso ist die Umwandlung einer immobilisierten funktionellen Gruppe in eine andere funktionelle Gruppe, beispielsweise durch Oxidation oder Reduktion möglich, wobei gegebenenfalls vor der Umsetzung eine Schutzgruppe abgespalten werden kann.
Funktionalisierung im erfindungsgemäßen Sinn umfasst des weiteren das Verändern und/oder Hinzufügen von Eigenschaften der Oberfläche wie elektrische Leitfähigkeit, dielektrische Anisotropie, Doppelbrechung, Rotationsviskosität, Elastizitätskonstanten, Lichtempfindlichkeit, Temperatur- sensivität, Oxidations- bzw. Reduktionseigenschaften, saure und basische Eigenschaften, hydophobe und hydrophile Eigenschaften etc.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die oben beschriebenen funktionellen Moleküle erst nach dem erfindungsgemäßen Strukturierungsverfahren zugegeben und über Wechselwirkungen mit dem immobilisierten zweiten Reaktanten an die Oberfläche gebunden.
In einer hierzu besonders bevorzugten weiteren Ausführungsform wird als zweiter Reaktant ein Molekül mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe oder ein Molekül mit einer Thiolgruppe eingesetzt, wobei dieses Molekül mit einem ersten Bindepartner eines hochaffinen Bindepaares funktionaiisiert ist. Der erste Bindepartner des hochaffinen Bindepaares wird so erfindungsgemäß auf einer strukturierten Oberfläche immobilisiert. Anschließend wird ein weiterer Reaktant oder eine Reaktionsiösung umfassend den zweiten Bindepartner des hochaffinen Bindepaares zugegeben, der dann mit dem ersten immobilisierten Bindepartner in Wechselwirkung tritt. Die Wechselwirkungen zwischen den Bindepartnem können kovalent, hydophob, ionisch, Wasserstoffbrücken oder Van der Waals-Kräfte sein. Beispiele für bevorzugte hochaffine Bindepaare umfassen Biotin bzw. biothinylierte Substrate/ (Strept-)Avidin, Ni (NitrilessigsäureyHis-Tags, Antikörper/Epitop, Rezeptor/Ligand,
Dien/Dienophil und komplementäre Nukleinsäuren. Erfindungsgemäß ist die Verwendung von Biotin bzw. biothinylierten Substraten/(Strept-)Avidin besonders bevorzugt, wobei bevorzugt Biotin oder ein biothinyliertes Substrat durch das erfindungsgemäße Verfahren direkt auf einer Oberfläche immobilisiert ist.
Die Ausbildung von Komplexen zwischen hochaffinen Bindepartnem, wobei ein Partner erfindungsgemäß an einer Oberfläche immobilisiert ist, kann ebenfalls zu einer Funktionalisierung einer strukturierten Oberfläche verwendet werden. Der zweite nicht direkt an die Oberfläche immobilisierte Bindepartner kann in jeder beliebigen Weise funktionalisiert sein. Bevorzugte Funktionalisierungen umfassen alle Funktionen wie sie weiter oben für eine direkte Funktionalisierung der Oberfläche bereits diskutiert wurden. Bevorzugt werden Komplexe zur Herstellung Bindepartner vermittelter Nanostrukturierungen, wie z.B. leitender Mikrostrukturen, verwendet. Beispiele für derartige Nanostrukturierungen umfassen Metallpartikel, bevorzugt Au, Ag, Pt, Pd und Cu, wobei die Metalle auf ihrer Oberfläche derivatisiert sein können, insbesondere mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe oder einem Thiol und Quantum-Dots, insbesondere Halbleitermaterialien wie beispielsweise CdS, CdSe1 CdTe, ZnS, TiO2 oder ähnliche Übergangsmetallchalkogenide. Die Ausbildung Biotin-Streptavidin vermittelter Goldstrukturierungen ist besonders bevorzugt. Femer eignet sich diese Ausführungsform bevorzugt zur Immobilisierung von Rezeptoren oder Antikörpern insbesondere zum Screening nach biologischen Interaktionspartnern. Insbesondere die eben beschriebene Ausführungsform, welche ein hochaffines Bindepaar verwendet, eignet sich zur Herstellung einer universellen strukturierten Bindeoberfläche oder eines molekularen Clips, die nach ihrer Herstellung nicht auf eine bestimmte Funktionalisierung festgelegt sind, sondern erst später durch entsprechende Wahl eines funktionalisierten zweiten Bindepartners des hochaffinen Bindepaares funktionalisiert werden können.
Zur bevorzugten Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird wie bereits erläutert ein Thiol-funktionalisierter, Trägeroberflächen-gebundener erster Reaktant verwendet, wobei mindestens eine Thiolgruppe des Reaktanten nicht an die Oberfläche des Trägers bindet und somit für das erfindungsgemäße Verfahren zur Verfügung steht. Der zu addierende zweite Reaktant wird gleichmäßig auf die Trägeroberfläche aufgebracht. Bevorzugt wird der zu addierende zweite Reaktant durch Zentrifugation gleichmäßig auf die Trägeroberfläche aufgebracht. Nach Belichtung und Entfernen Reaktanten durch Waschen kann ein weiterer Reaktant auf die Oberfläche aufgebracht und immobilisiert werden. Das Verfahren kann beliebig oft wiederholt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird dem zu verteilenden zweiten Reaktanten vor der Zentrifugation ein Detergenz zugegeben. Die Oberflächenspannung der Lösung wird so herabgesetzt und die gleichmäßige Verteilung auf der Trägeroberfläche erleichtert.
Die Belichtung zur Induktion der photochemischen Reaktion wird wie beschrieben bevorzugt durchgeführt nachdem der zweite Reaktant auf der Trägeroberfläche angetrocknet ist.
Nicht umgesetzter zweiter Reaktant wird nach der Reaktion von der Oberfläche entfernt. Alle Arbeitsschritte werden bevorzugt unter Schutzgasatmosphäre (z.B. Stickstoff, Argon, etc.) und in einer Lichtumgebung, welche nicht zur Induktion der photochemischen Reaktion beitragen kann (z.B. Gelblicht, Rotlicht etc.) durchgeführt. Nach der Belichtung wird der zweite Reaktant vorzugsweise durch einfaches Spülen entfernt. Das zu verwendete Lösungamittel unterliegt keinen Beschränkungen solange es nicht mit den immobilisierten Reaktanten reagiert. Bevorzugt ist die Verwendung von DMF und Wasser.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der zu addierende zweite Reaktant nach der Reaktion durch einen zum Waschschritt zusätzlichen Zentrifugationsschritt von der Oberfläche entfernt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl in polaren als auch in unpolaren Lösungsmitteln, in protischen als auch in aprotischen Lösungsmitteln sowie in Lösungsmittelgemischen durchgeführt werden. Beispielhafte Lösungsmitte!, die nicht beschränkend auf die Erfindung wirken, sind Wasser, Alkohle, Dimethylformamid (DMF), Hexan, Chloroform sowie Toluol. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in der Gasphase durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt in hochsiedenden Lösungsmitteln, bevorzugt DMF, oder in Gemischen hochsiedender
Lösungsmittel durchgeführt. Der Siedepunkt eines Lösungsmittels ist dabei bevorzugt > 100 0C, stärker bevorzugt > 120 0C und am stärksten bevorzugt > 150 0C. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein DMF/Toluol-Gemisch im Verhältnis DMF : Toiuol von 10:1 bis 2:1 und bevorzugt im Verhältnis 3:1 eingesetzt..
In einer weiteren Ausführungsform wird dem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch ein Mittel zugegeben, welches die photochemische Energieübertragung unterstützt bzw. katalytisch wirkt oder/und während der Reaktion stabilisierend auf radikalische Zwischenstufen wirkt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einem Temperaturbereich von -20 0 bis 150 0C ausgeführt werden, vorzugsweise jedoch bei Raumtemperatur (20 0C +/- 5°C).
Zusammenfassend zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren in der praktischen Durchführung somit durch kurze Reaktionszeiten sowie einfache Substanzauftragungs- und Wasch prozesse aus. Die Selektivität und Milde des Verfahrens ermöglicht die vielfältigen Nutzungen der erfindungsgemäßen Strukturierungstechnik.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren automatisiert durchgeführt. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem automatisierbaren Mikrofluidsystem in Kombination mit Laser- oder Laser-Spiegel-Technologie eingesetzt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine beschichtete Oberfläche bzw. ein Träger der über eine solche Oberfläche verfügt, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Oberflächen bzw. Microarrays zeichnen sich durch eine hohe Dichte der immobilisierten Moleküle, eine hohe native Aktivität bzw. Funktionalität der immobilisierten Moleküle und die Stabilität der Beschichtung aus. Die strukturierten bzw. funktionalisierten Oberflächen zeigen während der Reaktionen in welchen sie verwendet werden keine Desorption immobilisierter Moleküle. Die strukturierten Oberflächen oder Träger können planar oder nicht-planar sein.
Die Beschichtung einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Oberfläche kann Naturstoffe wie beispielsweise Zucker und Kohlenhydrate, Aminosäure, Peptide, Phosphopeptide, Proteine, Enzyme, Antikörper, Lipide, Nukleotide, Nukleoside und Nukleinsäuren, darüber hinaus Farbstoffe, radioaktiv markierte Moleküle, Isotopen markierte Moleküle, Polymere, Monomere für Polymerisationsreaktionen,, lumineszierende Moleküle, insbesondere fluoreszierende Moleküle, Flüssigkristalle, elektrolumineszierende Moleküle und/oder Polymere, Nanopartikel, Vesikel und/oder anorganische Katalysatoren umfassen.
Derart beschichtete Oberflächen können für eine Vielzahl von Anwendungen, beispielsweise in der Biosensorik und im Wirkstroffscreening, z. B. zur Identifizierung oder/und Charakterisierung pharmakologischer Wirkstoffe, eingesetzt werden. Weiterhin können beschichteten Oberflächen zu Analyse von Biomolekülen, ausgewählt aus Proteinen, Antikörpern, Antibiotika, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, Hormonen, Steroiden etc., dienen. Die beschichteten Oberflächen können femer zur Nachahmen der äußeren Hülle einer Zelle verwendet werden, um beispielsweise biologische Vorgänge an Zellen zu untersuchen. Eine Verwendung in der Chirurgie oder Transplantationsmedizin beispielsweise zum Ersatz bzw. zur Überbrückung defekter Nerven ist denkbar.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung Herstellung von Biochips insbesondere für das Hochdurchsatz-Screening nach neuen pharmazeutischen Wirkstoffen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung mikrofluidischer Systeme, z.B. durch strukturierte Immobilisierung von Polymeren. Das Verfahren kann verwendet werden, um dreidimensionale Strukturen aufzubauen, wie sie in Mikrofluidensystemen z.B. in Form von Kanälen bzw. Reaktionskammern benötigt werden. Neben dem Aufbau solcher Strukturen können diese erfindungsgemäß zusätzlich beschichtet bzw. funktionalisiert werden. Solche Systeme eignen sich insbesondere zur Analyse und Synthese mehrstufiger katalytischer Reaktionen. Ein weiterer Aspekt ist die Herstellung von Mikroperlen, die immobilisierte Enzyme oder heterogene Katalysatoren tragen. Solche Mikroperlen sind im Rahmen der Mikrofluidik besonders bevorzugt, da sie ein hohes Oberflächen-Volumenverhältnis aufweisen, welches für eine effiziente heterogene Reaktion erforderlich ist. Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Oberflächen, welche mit lumineszierenden Molekülen, insbesondere fluoreszierenden Molekülen, elektrolumineszierenden Polymeren und/oder elektrolumines- zierenden anorganischen Molekülen beschichtet sind. Insbesondere die Beschichtung mit elektrolumineszierenden konjugierten Molekülen bzw. Polymeren ist besonders vorteilhaft, da eine Feinabstimmung ihrer Eigenschaften (Farbe, Quantenausbeute) durch Änderung der Struktur leicht möglich ist. Die vorliegende Erfindung umfasst eine erfindungsgemäß strukturierte Oberfläche, die mit rot, grün und/oder blau elektroiumineszierenden Molekülen und/oder Polymeren beschichtet ist. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Beispiele für elektro- lumineszierende Moleküle umfassen PoIy(1 , 4-phenylenvinyIene) (PPV) und davon abgeleitete Derivate, insbesondere PPV-Copolymere und CN-PPVs, Poly(3-alkylthiophene) und davon abgeleitete Derivate, Poly(para- phenylene) (PPP) und davon abgeleitete Derivate, insbesondere Leiter-Poly (para-phenylene) (LPPP), und Gemische solcher Verbindungen. So beschichtete Oberflächen eignen sich insbesondere zum Aufbau von LEDs.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Oberflächenstrukturen, welche Flüssigkristalle enthalten. Besonders bevorzugt ist dabei die Herstellung von TN-Zellen (twisted nematic, TN), in welchen sich Flüssigkristalle orientieren. Ein weiterer besonders bevorzugter Aspekt ist dabei eine Ausführungsform, bei der jedes Bildelement (Pixel) einzeln über einen Transistor angesteuert wird. Als Flüssigkristalle werden bevorzugt mehrfach fluorierte Kohlenwasserstoffe eingesetzt. Erfindungsgemäß so erhältliche Oberflächenstrukturen eignen sich insbesondere zum Aufbau von LCDs und AM-LCDs (active matrix LCDs).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von LEDs, LCDs, AM-
LCDs und OLEDs. Die so hergestellten LEDs, LCDs, AM-LCDs und OLEDs zeichnen sich gegenüber Displays wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind insbesondere durch eine hohe Auflösung aus.
Des erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung großflächiger LED-Anzeigen, da nach dem Stand der Technik zu deren Herstellung sowohl anorganische Halbleitermaterialien als auch organische Fluoreszenzfarbstoffe durch teure Verfahren wie Sublimation oder Aufdampfen aufwendig aufgebracht werden müssen.
Des Weiteren weisen insbesondere OLEDs, welche durch Photolitographie mit Photosäure hergestellt wurden, aufgrund nicht vollständig entfernter Photosäure nur eine beschränkte Haltbarkeit auf. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird dieser Nachteil des Stands der Technik ausgeräumt, so dass sich erfindungsgemäß erhältliche OLEDs durch eine hohe Haltbarkeit bzw. thermische Stabilität auszeichnen. Erfindungsgemäß erhältliche OLEDs eignen sich deshalb besonders zur Herstellung von True- Colour-Matrix-Displays.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Oberflächen, welche mit
Nanopartikeln, insbesondere Ag, Au, Pd, Pt, Cu, Quantum Dots, Vesikeln und/oder anorganische Katalysatoren beschichtet sind. Solche Nanopartikel können ausschließiich aus einem Element oder einer einzelnen Verbindung bestehen, oder sie können durch organische Moleküle, vorzugsweise Kohlenwasserstoffe, ummantelt sein.
Mit stromleitenden Nanopartikeln strukturierte Oberflächen können zur Bildung von leitenden Mikrostrukturen verwendet werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von leitenden Mikrostrukturen. Erfindungsgemäß hergestellte leitende Mikrostrukturen können in der Halbleiter- und Chiptechnologie eingesetzt werden. Mit anorganischen Katalysatoren beschichtete Oberflächen können ebenso wie Vesikel beschichtete Oberflächen, die beispielsweise eine Substanz in einer kontrollierten Weise freisetzen können, insbesondere im Rahmen von miniaturisierten Systemen, wie Mikrofluidsystemen, verwendet werden. Solche miniaturisierten Systeme sind beispielsweise in der Lage alle für einen bestimmten Syntheseweg notwendigen Reaktionen in kleinem Massstab auf engen Raum, beispielsweise ein Chip, durchzuführen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Oberflächen welche mit Polymeren und/oder Monomeren für eine anschließende Poiymerisationsreaktion beschichtet sind. Erfindungsgemäß können so Oberflächen-immobilisierte dreidimensionale Strukturen (Kammern, Röhren, Kanäle etc.) aufgebaut werden, wie sie beispielsweise in der Mikrofluidik und der Displaytechnologie Anwendung finden. Solche dreidimensionale Strukturen können sowohl Fluide aufnehmen, als auch bei entsprechender Funktionalisierung ihrer Oberflächen Reaktionen in aufgenommenen Fluiden katalysieren.
Beϊspiele
Chemischen Verschiebungen sind in ppm angegeben und beziehen sich auf Tetramethylsilan, CHCI3, H2O oder MeOH als internen Standard. Die Kopplungskonstanten J sind in Hertz (Hz) angegeben und die Signalmultiplizitäten werden wie folgt abgekürzt: s = Singulett, d = Dublett, dd = Dublett von Dubletts, t = Triplett, m = Multiplett, br = breites Signal, Z = Zucker, AS = Aminosäure. Die Zucker-Protonen bzw. Kohlenstoffe wurden mit 1-6 bezeichnet, beginnend am anomeren Zentrum.
Die FAB-Massenspektren wurden auf einem Finnigan MAT MS 70 Spektrometer gemessen. Als Matrix diente bei den FAB-Messungen standardmäßig 3-Nitrobenzylalkohol (3-NBA).
Als Trägergas für GC-MS-Untersuchungen wurde Helium und als Standardgradient folgender benutzt: 1 min 1000C, dann innerhalb von 5 min auf 2800C, die 5 min gehalten wurden.
Die spezifischen Drehwerte [α]D 20 beziehen sich auf die Na-D-Linie.
Zur analytischen Dünnschichtchromatographie wurden Kieselgeiplatten verwendet (KieselgeS 60 F254). Zur Detektion wurde UV-Licht der Wellenlängen 254 nm bzw. 366 nm und zur Anfärbung folgende Reagenzien verwendet: Reagenz A: 5 g Kaliumpermanganat auf 100 g Wasser;
Reagenz B: 2.5 g MoSybdatophosphorsäure, 1 g Cer(IV)-sulfat, 6 ml konz.
Schwefelsäure und 94 ml Wasser;
Reagenz C: 10% konz. Schwefelsäure in Ethanol.
Die entsprechenden Laufmittel und RrWerte sind bei den jeweiligen Verbindungen angegeben. Die säulenchromatographischen Trennungen erfolgten an Flash-Kieselgel mit einem Überdruck von 0.3-0.8 bar. Die präparative Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) wurde mit einem System der Firma Agilent (1100 Series) durchgeführt. Als Säulen fanden eine CC125/21 Nucleosil 120-5 C4 Säule bzw. CC125/21 Nucleodur 120-5 C18 Gravity der Firma Macherey&Nagel bei Flussraten von 25 ml/min Verwendung. Die analytische HPLC wurde mit einem HP 1100-Modell der Firma Hewlett-Packard mit CC125/4 Nucleosil 120-5 C4 Säule bzw. CC125/4 Nucleodur 120-5 C18 Gravity der Firma Macherey & Nagel mit Flussraten von 1 ml/min durchgeführt. Die Detektion erfolgte jeweils bei den Wellenlängen 210 nm und 280 nm. Als Laufmittel wurden Wasser + 0.1 VoI.- % TFA (A) und Acetonitril + 0.1 Vol.-% TFA (B) verwendet. Als Standardgradienten wurden folgende benutzt:
Analytische HPLC: 1 min 10 % B, dann innerhalb von 10 min auf 90 % B; Präparative HPLC: 3 min 10% B, dann innerhalb von 15 min auf 100 % B. Alle weiteren genutzten Gradienten sind individuell angegeben.
Die Silicium-Wafer (SSP, Dicke: 125 mm, Größe: 2.5x7.5 cm2) wurden mit einer beschichteten Oberseite (1μm PECVD-SiO2) hergestellt. Die verschieden funktionalisierten Dendrimer-modifizierten Glas- und Siliciumträger wurden von der Firma Chimera Biotec GmbH, Dortmund, bezogen.
Für die Photolithografie wurde zum Auftragen der Substanzen ein Spin- Coater der Firma Laurell zusammen mit einem Chuck-Adapter aus Mylar- Folie (zur Sicherstellung des benötigten Vakuums) benutzt und die Belichtung wurde mit der Anlage MA6 (Firma Süss, Wellenlänge: 365 nm, Leistung: 20 mW/cm2, Programm: Softkontakt) mit der Maske PKI im Institut für Hochfrequenztechnik durchgeführt. Die Belichtung ohne photolithografische Anlage wurde mit Hilfe einer Quecksilberdampflampe („Pen Ray"-Lampe von der Firma UVP1 Kalifornien, USA, Wellenlängenmaximum 365 nm, Leistung 5.5 W, Länge 2 1/8 inches) ausgeführt. Die photochemische Immobilisierung am Laser-Rastermikroskop der Firma Biorad, Typ MRC-1024, wurde mit einem Kr-Ar-Laser durchgeführt. Die Fluoreszenzsignale wurden mit dem Microarray-Fluorescence-Reader 4000B der Firma Axon ausgelesen und mit dem Programm Axon Gene Pix Pro 4.0 ausgewertet. Streptavidin-Cy5 wurde von der Firma Chimera Biotec zur Verfügung gestellt und stammt von der Firma Zyomed. Alexa-Fluor-647- markiertes Concanavalin A wurde von der Firma Molecular Probes, anti- Phosphotyrosin-Biotin von der Firma BIOTREND Chemikalien bezogen. Für biologische Tests und Nachweise verwendete Puffer: TETBS: 20 mM TRIS-CI, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 0.05% Tween-20, pH 7.5, bei Bedarf + DTT;
MESTBS: 20 mM TRIS-CI, 150 mM NaCI, 4.5% Milchpulver (Oxoid), 5 mM EDTA, 0.2% NaN3, 1 mg/ml DNA MB Grade (Roche);
Der Nachweis der immobilisierten Substanzen wurde von der Firma Chimera Biotec GmbH, Dortmund, durchgeführt.
Soweit nicht anders beschrieben wurden die Reaktionen bei RT durchgeführt.
Die prozentualen und die anteiligen Lösungsmittelzusammensetzungen sind soweit nicht anders angegeben in v/v angegeben.
Beispiel 1 : Immobilisierung von Haptenen mitteis Licht-induzierter Addition von Mercaptanen an terminale Doppelbindungen Die Immobilisierungsreaktion wurde mit Hilfe des Biotinallylamids 143 mit Streptavidin-Cy5 als Nachweis evaluiert. Die benötigten Thiol- funktionalisierten Glasträger wurden wie in Schema 2 gezeigt synthetisiert. Dendrimer-überzogene Carbonsäure-funktionlisierte Objektträger der Firma Chimera Biotec wurden mit DCC und Cystamindihydrochlorid umgesetzt und anschließend wurde Disulfid 150 mit DTT zum Thiol reduziert.
Die Anwesenheit der Thiole auf der Oberfläche wurde mit dem Thio! Quantification Kit (Molecular Probes) überprüft. Im ersten Immobiüsierungsexperiment wurden Biotinallylamid 143 (Schema 1 ) und Biotinpropylamid 38 in den Lösungsmitteln abs. DMF, abs. DMF/Toluol (3:1) in einer Konzentration von 0.1 mM auf die Oberfläche 151 mit einer Eppendorfpipette gespottet. Nach dem Spotten wurden die Glasträger 3 h belichtet und mit DMF und Wasser intensiv gewaschen. Der Nachweis wurde durch Inkubation mit einer 100 nM Lösung von Streptavidin-Cy5 von ausgeführt (Figur 2).
Figur 2 zeigt das Ergebnis der Dendrimer-überzogenen Thiol- funktionalisierten Glasträger. Das Experiment zeigt eindeutig, dass die Anbindung über die Doppelbindung verläuft, da die Negativkontrolle 38 nicht detektiert werden konnte. Bezüglich der Lösungsmittel lief die Reaktion in DMF/Toluol (3:1) am besten ab.
Die Stabilität der Bindung zur Oberfläche wurde in einem Regenerierungsexperiment nachgewiesen. Biotinallylamid 143 wurde in den Konzentrationen von 0.1 mM und 0.01 mM auf einem Thiol-funktionalisierten Glasträger immobilisiert. Nach dem Nachweis mit einer 100 nM Lösung von Streptavidin-Cy5 (Figur 3A) wurde der Glasträger mehrmals stringent mit 0.1%iger Natriumdodecylsulfat-Lösung bei 800C gewaschen (Figur 3B und 3C). Anschließend wurde wieder mit Streptavidin-Cy5 inkubiert (Figur 3D).
Die erneute Inkubation mit Streptavidin-Cy5 lieferte den Nachweis, dass das Biotin fortwährend auf der Oberfläche anwesend war. Die Fluoreszenzsignale zeigten eine Intensität, die in dem Bereich der ursprünglichen lag. Die Anbindung des Biotins an die Oberfläche beruht somit auf einer stabilen, kovalenten Bindung.
Zum Nachweis der Abhängigkeit der Reaktion von der Belichtung wurden Biotinallylamid 143 und Biotinpropylamid 38 in einem Konzentrationsgradienten mit einem Handspotter auf zwei Thiol- funktionalisierte Glasträger gespottet. Einer der Glasträger wurde 3 h bei 365 nm belichtet, der andere wurde nach dem Spotten unter Laborlicht 3 h im Dunkeln verwahrt. Nach intensivem Waschen mit DMF und Wasser wurde die Anbindung wiederum mit einer 100 nM Lösung von Streptavidin- Cy5 nachgewiesen (Figur 4).
In Figur 4A ist der Glasträger dargestellt, der 3 h belichtet worden ist. Die Signalintensitäten entsprechen dem Konzentrationsgradienten und die Nachweisgrenze für das Biotinallylamid 143 liegt bei 1 μM. Es ist ein klarer Intensitätsunterschied beim Nachweis des Biotinallylamids zur Negativkontrolle 38 zu sehen. Die Spuren der Negativkontrolle, die nachgewiesen wurden, sind in der Eintrocknung der Substanz und ungenügendem Waschen begründet. Der in Figur 4B dargestellte Glasträger war unter Laborlicht gespottet und dann im Dunkeln verwahrt worden. Im Vergleich zu dem belichteten Träger wurden wesentlich geringere Signale detektiert. Dies wird in dem in Figur 4C dargestellten Histogramm verdeutlicht.
In einem weiteren Versuchsansatz wurde Mannosallylamid 155 synthetisiert (Schema 3). Immobilisierung zusammen mit Mannose 44, intensives Waschen mit DMF und Wasser und Nachweis mit Concanavalin A ergaben Fluoreszenzsignale entsprechend dem gespotteten Konzentrationsgradienten (Figur 5).
Als weiteres Beispiel für die Selektivität und Effizienz dieser Immobilisierungsreaktion wurde das Phosphopeptid 158 immobilisiert und mit anti-pTyr-Antikörper nachgewiesen. Es wurde in Lösung hergestellt (Schema 4).
Spotten im Konzentrationsgradienten, dreistündige Belichtung, Waschen mit DMF und Wasser und Nachweis mit dem Konjugat aus biotinyliertem anti- pTyr-Antikörper-und Streptavidin-Cy5 (50 nM, Figur 6) ergaben hohe Fluoreszenzsignalintensitäten. Dies zeigt, dass das Phosphotyrosin weder durch die Schwefelradikale noch durch die Einstrahlung des UV-Lichts beschädigt worden war. Wie die Resultate der Immobilisierung des Mannoseallylamids 155 zeigen auch die Ergebnisse für das Phosphopeptid 158 eine gute Bindungseffektivität und Selektivität.
Anschließend wurde gezeigt, dass die Licht-induzierte Reaktion nach einem bestimmten Zeitraum eine Sättigung erreicht. Phosphopeptid 158 wurde hierzu in einer Konzentration von 1 mM auf Thiol-funktionalisierte Glasstücke gespottet, welche dann belichtet wurden. Nach jeweils 45 Minuten wurde ein Glasstück unter der UV-Lampe hervorgenommen und mit DMF und Wasser gewaschen. Als Negativkontrolle (nk) diente ein bespottetes Glasstück, welches 315 Minuten im Dunkeln aufbewahrt worden war. Im Anschluß erfolgte der Nachweis wiederum mit dem anti-pTyr- Antikörper Konjugat (50 nM) (Figur 7). Dabei wurde festgestellt, dass sich die Signalintensität bereits nach 135 Minuten nicht weiter erhöhte, d.h. eine Sättigung eingetreten war. Dies zeigte ebenso, dass die Anbindung des Phosphopeptids von der Lichteinstrahlung abhängig war. Die Signalintensität der Negativkontrolle lag im Bereich derjenigen nach 45 Minuten Belichtungszeit, was bedeutet, dass 45 Minuten für eine sichtbare Immobilisierung mittels der verwendeten UV-Lampe nicht ausreichen.
Beispiel 2: Anwendung der Licht-inciuzierten Addition von Mercaptanen an Bϊotinaüylamiel 143 zur Strukturierung von Oberflächen durch Photolithographie
Zur Photolithographie wurden Siliciumträger verwendet, die eine Reflexion oder Weiterleitung des Lichts im Träger verhindern. Dazu wurden Siliciumplatten mit einer ca. 1 μm dicken SiO2-Schicht hergestellt und in die Form von Objektträgern geschnitten. Anschließend wurden diese Siliciumträger mit Dendrimeren beschichtet. Die Thiol-Funktionalisierung erfolgte wie bereits für die Glasträger beschrieben (Schema 2).
Die Träger wurden durch Spin-Coating mit der Biotinallylamid 143-Lösung benetzt. Dies wurde mit einer 1 mM und 10 mM Biotinallylamid-Lösung und Belichtungszeiten von 10 und 30 min realisiert. Anschließend wurde mittels Zentrifugation gewaschen und mit Streptavidin-Cy5 (100 nM) inkubiert (Figur 8).
Der Nachweis der Immobilisierung von Biotinallylamid 143 (10 mM) durch zehnminütige Belichtungszeit ergab eine Signalintensität der belichteten Stellen (Figur 8A), die derjenigen beim Nachweis der Immobilisierung von Biotinallylamid (1 mM) durch dreißigminütige Belichtungszeit entsprach (Figur 8D). Die geringste Intensität der belichteten Stellen wurde bei der Reaktion der 1 mM Lösung von Verbindung 143 nach 10 min erhalten (Figur 8C), die höchste bei derjenigen der 10 mM Lösung nach 30 min (Figur 8B, unterschiedliche Kontrasteinstellungen bei der Darstellung). Das Signal/Hintergrund-Verhältnis konnte bei der dreißigminütigen Belichtung der 10 mM Biotinallylamid-Lösung auf 9:1 verbessert werden.
Vergrößert man den oberen Abschnitt des in Figur 8A gezeigten Experimentes wird deutlich, dass die Auflösung der Licht-induzierten Oberflächenstrukturierung der Auflösung von 5 μm entspricht, was der höchsten Auflösung des Fluoreszenz-Scanners entspricht (Figur 9). Dies ist daran zu erkennen, dass die 3 μm breite Linie in der Mitte einmal etwas nach unten verschoben wird, was durch den Wechsel zwischen Pixel-Reihen des Scanners bei einer Abweichung der Linie von der horizontalen Ebene bedingt ist. Moleküle werden daher nur an den Stellen immobilisiert, an denen sie belichtet werden, mit einer möglichen Abweichung von ± 2 μm.
Da die Auflösung der Licht-induzierten Oberflächenstrukturierung in diesen Experimenten lediglich die Auflösung des Fluoreszenz-Scanners beschränkt war, ist es femer möglich, Strukturen im sub-Mikrometer-Bereich herzustellen und mittels hochauflösenden Techniken wie beispielsweise der Mikroskopie nachzuweisen. Beispiel 3: Anwendung der Licht-Indyzlerten Addition von Wercaptanen an Phosphopeptϊd 158 und Pentensäure- funktionalisiertes Streptavidin 161 zur Strukturierung von Oberflächen durch Photolithographie Zum einen wurde das Phosphopeptid 158 und zum anderen Pentensäure- funktionalisiertes Streptavidin 161 zur Strukturierung von Oberflächen verwendet (Figur 10D). Es wurde für dieses Experiment eine 0.5 mM Lösung des Peptids in absolutem DMF/Toluol (3:1) benutzt und nach dem dreißigminütigen Belichten mit DMF, Methanol und TETBS-Puffer abzentrifugiert. Das Pentensäure-funktionalisierte Streptavidin 161 wurde in einer 200 μM Lösung in Wasser eingesetzt. Da Wasser eine hohe Oberflächenspannung hat, war das gleichmäßige Verteilen durch Zentrifugation problematisch. Das Wasser bildete einen großen Tropfen in der Mitte, der während der Zentrifugation trocknete. In zukünftigen Experimenten sollte deshalb etwas Detergenz hinzugegeben werden. Nach dreißigminütigen Belichten wurde mit TETBS-Puffer und Wasser abzentrifugiert. Das Auslesen wurde bei der Immobilisierung des Phosphopeptids mit dem Konjugat aus biotinyliertem anti-pTyr-Antikörper- und Streptavidin-Cy5 (50 nM) und bei der des Streptavidins mit Biotin-Cy5 (10 nM) vollzogen. Die Ergebnisse sind in Figuren 10A und C dargestellt.
Beide Haptene konnten an den belichteten Stellen nachgewiesen werden. Streptavidin wird somit nicht durch die UV-Strahlung zerstört und die Immobilisierung ist Licht-abhängig. Die Tatsache, dass für ein gutes Immobilisierungsergebnis nur eine 200 μM Lösung des Streptavidins notwendig war, ist durch die vier Bindungsstelien des Streptavidins für das Biotin zu erklären, weil die mögliche vierfache Bindung des Biotin-Cy5 einen Signalintensitäts-verstärkenden Effekt hat.
Dass das Streptavidin tatsächlich über die Doppelbindung an die Oberfläche bindet wurde mittels unfunktionalisiertem Streptavidin 162 gezeigt, welches der gleichen Immobilisierungsprozedur wie das Streptavidin 161 unterzogen wurde. In Figur 10B ist das Resultat gezeigt. Zwar ist eine Strukturierung mittels Streptavidin zu erkennen, aber das Signal/Hintergrund-Verhältnis ist mit -6:1 wesentlich geringer als das durch die Immobilisierung von Streptavidin 161 erzielte (-50:1 ). Somit findet zwar eine geringe Nebenreaktion statt, aber die Anbindung verläuft hauptsächlich durch die Addition der Thiole auf der Oberfläche an die terminalen Doppelbindungen, welche am Streptavidin lokalisiert sind.
Es konnte anhand verschiedener Verbindungen, die durch unterschiedliche biologische Wechselwirkungen nachgewiesen wurden, die Oberflächenstrukturierung mittels Photolithographie realisiert werden.
Beispiel 4: Anwendung der Laser-induzierten Addition von Mercaptanen an Biotinallylamid 143 und Strukturierung von Oberflächen durch Photolifhographle
Dazu wurde ein konfokales Lasermikroskop verwendet. Energie Wellenlänge 365 nm wurde durch Zwei-Photonen-Anregung erzeugt. Die Multi-Photonen- Anregung ist kein linearer Prozess und daher erreicht man bei einer eingestrahlten Wellenlänge von 728 nm nur theoretisch den halbierten Wert von 364 nm. Unter Berücksichtigung dieses Hintergrunds wurde in eine Hybridisierungskammer auf einem Thiol-funktionalisierten Glasträger eine Lösung von Biotinailylamid 143 in DMF/Toluol (3:1) (1 mM) gegeben. Innerhalb dieser Hybridisierungskammer wurde jeweils eine Fläche von 338.4 μm2 (512x512 Pixel) gescannt, wobei der Scan pro Fläche 10, 30 und 100maS wiederholt wurde. Zwischen diesen drei Scans wurde der Objektträger geringfügig mit der Hand verschoben, so dass die gescannten Felder in einer Reihe lagen (Figuren 11A und B). 30 Scanwiederholungen entsprechen einer Belichtungszeit von IxIO-4 Sekunden pro Pixel. Die Laserintensität wurde bei 100% gewählt. Nach dem Scannen wurde der Glasträger sofort stringent mit DMF und Wasser gespült. Anschließende Inkubation mit Streptavidin-Cy5 (100 nM) ergab die in Figur 11A und vergrößert in 11 B gezeigten quadratischen Signale. Die Fluoreszenzsignalintensitäten entsprechen der jeweiligen Scanwiederholung, also der Belichtungszeit. Das bedeutet, dass eine geringere Scanwiederholung und dementsprechend eine niedrigere Belichtungszeit ein Signal mit geringerer Intensität lieferten.
Durch die Immobilisierung von Biotinallylamid 143 (100 nM) in DMF/Toluol (3:1 ) mit einer Laserintensität von 100% und 100facher Scanwiederholung wurde ein Muster auf der Oberfläche immobilisiert. Dazu wurden drei Felder im rechten Winke! gescannt. Anschließendes Waschen wie zuvor und Inkubation mit Streptavidin-Cy5 (100 nM) ergab das in Figur 11C dargestellte Muster. Das hergestellte Muster ist deutlich zu erkennen.
Somit konnte durch Zwei-Photonen-Anregung die Oberflächenstrukturierung mittels Laser erfolgreich durchgeführt werden.
Beispiel 5: Biotin-S-amidocapronsäureallylamsεl (143) Eine Lösung von 50 mg (0.14 mmol) Biotin-6-amidocapronsäure in 3 ml abs. DMF wurde hergestellt, indem die durch Zugabe erhaltene Suspension mit einem Heißluftfön erhitzt wurde und, nachdem sich alles gelöst hatte, wieder auf rt abgekühlt wurde. Dann wurden 30 mg (0.15 mmol) EDC und 24 mg (0.15 mmol) HOBt zugegeben und 1 h gerührt. Danach wurden 23 μl (0.3 mmol) Allylamin hinzugefügt und 18 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde i. Vak. entfernt, der Rest wurde in wenig MeOH aufgenommen und mit viel Et2O das Produkt ausgefällt. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt. Gräulicher Feststoff.
Ausbeute: 49 mg (0.12 mmol), 86%.
Schmp.: 134°C.
[α]D 20 = +31.0° (c = 0.6, DMSO).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6): δ = 7.92-7.81 (br, 1H1 Amid-NH), 7.74-7.67 (br, 1 H, Amid-NH), 6.38 (s, 1 H1 Biotin-NH), 6.32 (s, 1 H, Biotin-NH), 5.82- 5.68 (m, 1 H, CH=CH2), 5.16-4.96 (m, 2H, CH=CH2), 4.28-4.23 (m, 1 H, CH- CH2-S), 4.10-4.05 (m, 1H, CH-CH-S), 3.81-3.75 (m, 1 H, CHa-CH=CH2), 3.65-3.60 (m, 1 H, CHb-CH=CH2), 3.08-3.01 (m, 1 H, S-CH), 3.01-2.92 (m, 2H, AmJd-NH-CH2), 2.77 (cid, 2J = 5.1 Hz, 3J = 12.6 Hz, 1 H, S-CHa), 2.53 (d, 3J = 12.6 Hz1 1H, S-CHb)1 2.14 (t, 3J = 7.3 Hz, 1 H, HCH), 2.06-1.96 (m, 3H, HCH, CH2), 1.49-1.15 (m, 12H, 6 CH2).
Figure imgf000039_0001
FAB-HR: ber.: 397.2273 [M + H]+ gef.: 397.2261 [M + H]+
Beispiel 6: Ethoxy-[(4V-allyloxycarbonyl)-aminoethyl]-ether (156) Es wurden 1.94 ml (19.4 mmoi) 2.2-Aminoethoxyethanol und 1.08 g (27.0 mmol) NaOH in 20 ml Dioxan und 10 ml Wasser gelöst. Unter Eiskühlung und Rühren wurde innerhalb von 40 min 2.48 ml (23.3 mmol) Allylchloroformat in 20 ml Dioxan hinzugetropft, wobei eine weiße Suspension entstand. Die Mischung wurde anschließend 21 h bei rt gerührt und dann wurde das Lösungsmittelgemisch i. Vak. entfernt. Der Rückstand wurde mit 100 ml Chloroform und 100 ml Wasser überschichtet und mit 1 M HCI-Lösung auf pH 5 gebracht und die Phasen nach Extraktion getrennt. Die wässrige Phase wurde drei weitere Male mit Chloroform extrahiert. Danach wurde per DC (DCM/MeOH/NH3 = 10:8:0.5) die wässrige Phase auf Produkt kontrolliert und weitere zwei Male extrahiert, bis kein Produkt mehr in der wässrigen Phase enthalten war. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt. Farblose Flüssigkeit. Ausbeute: 4.05 g, (ca. 19.4 mmol), quantitativ. Rf = 0.52 (DCM/MeOH/NH3 = 10:8:0.5).
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ = 5.95-5.84 (m, 1H, CH=CH2), 5.28 (dd, 2J = 1.6 Hz, 3J = 17.2 Hz, 1H, CH=CHa), 5.18 (dd, 2J = 1.4 Hz1 3J = 10.4 Hz, 1H, CH=CHa), 4.54 (d, 3J = 5.7, 2H, CH2-CH=CH2), 3.71 (t, 3J = 4.5 Hz1 2H1 CH2- OH), 3.57-3.53 (m, 4H1 CH2-O-CH2), 3.36 (t, 3J = 5.2 Hz, 2H, CH2-NH). 13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ = 156.7, (C=O), 133.1 (CH=CH2), 117.9 (CH=CH2), 72.5, 70.3 (CH2-O-CH2), 65.8, 61.9, 41.1 (3 CH2). C8H15NO4 (189.10). Beispiel 7:[Of«(283,4,6-Tetra-O"-acetyI-α-D-ιnanιnopyranosyl)ethoxy]-[2-(
W-allyloxycarbonyl)-aminoethyl]ether (157)
Es wurden 500 mg (1.21 mmol) Acetobromomannose unter Argon in einem ausgeheizten Schlenkkolben zusammen mit 117 mg Drierite und 213 mg (1.13 mmol) Λ/-Alloc-aminoethyl-2-ethoxyethanol 156 in abs.
Toluol/Nitromethan = 1 :1 gelöst. Dann wurden 260 mg (1.03 mmol) Hg(CN)2 hinzu gegeben und die Mischung für 16.5 h gerührt. Die Mischung wurde durch Celite filtriert und i. Vak. eingeengt. Die säulenchromatographische
Aufreinigung mit dem Laufmittel Cy/EΞA = 1 :1 lieferte einen leicht gelblichen Sirup.
Ausbeute: 242 mg (0.47 mmol), 39%.
Rf = 0.23 (Cy/EΞA = 1 :1).
1H-NMR (400 MHz1 CDCI3): δ = 5.98-5.86 (m, 1 H, CH=CH2), 5.32-5.15 (m,
5H1 CH=CH2, Z-H2, Z-H3, Z-H4), 4.89 (d, 3J = 1.6 Hz, 1 H, Z-H 1), 4.52 (d, 3J = 5.3 Hz, 2H, CH2-CH=CH2), 4.26-4.21 (dd, 2J = 5.5 Hz, 3J = 12.5 Hz, 1 H, Z-
O-CHa), 4.13-4.07 (m, 2H, Z-O-CHb, Z-H5), 3.78 (m, 1H, Z-H6a), 3.72-3.65
(m, 3H, Z-H6b, CH2), 3.55 (t, 3J = 5.6 Hz, 2H, CH2), 3.37 (m, 2H, CH2), 2.15,
2.09, 2.03, 1.99 (4s, je 3H, 4 (C=O)CH3).
13C-NMR (100 MHz1 CDCI3): δ = 170.9, 170.3, 170.1 , 170.0 (4 C=O), 133.2 (CH=CH2), 117.7 (CH=CH2), 97.8 (Z-C1), 70.5, 70.2, 69.9, 69.2, 68.7, 67.3,
66.5, 65.7, 62.8 (5 Z-C, 4 CH2), 41.1 (N-CH2), 21.2, 21.1 , 21.0, 20.9 (4
(C=O)-CH3).
Figure imgf000040_0001
ESI-MS: ber.: 542.2 [M + Na]+ gef.: 542.4 [M + Na]+
Beispiel 8:[(O'-α-D-mannopyranosyI)ethoxy]-[2-(M-a!IyIoxycarbonyI)- aminoethyllether (155)
Zu einer Lösung von 226 mg (0.44 mmol) 157 in 2 ml abs. MeOH wurde unter Argon 1 M NaOMe in MeOH solange hinzugetropft, bis pH 10 erreicht war (insgesamt 0.7 ml). Der Umsatz der Reaktion wurde mittels DC (Laufmittel MeOH/EA = 1 :9) kontrolliert. Nach 1.5 h wurde Na+-Amberlite Ionenaustauscher hinzugefügt, bis pH 8 erreicht war. Die Mischung wurde filtriert und das Lösungsmittel anschließend i. Vak. entfernt. Zur Entfernung restlicher Salze wurde in Ethanol suspendiert, filtriert und wieder eingeengt. Ausbeute: 142 mg (0.41 mmol), 93%. Leicht gelblicher Sirup. Rf = 0.34 (MeOH/EΞA = 1 :9), lang gezogener Fleck. [α]D 20 = +46.9° (c =1 , MeOH).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 5.98-5.86 (m, 1 H, CH=CH2), 5.32-5.26 (dd, 2J = 1.4 Hz1 3J = 17.2 Hz, 1 H, CH=CHa), 5.17 (d, 3J = 10.6 Hz, 1 H, CH=CHb), 4.78 (s, 1 H, Z-H1 ), 4.52 (d, 3J = 5.3 Hz, 2H, CH2-CH=CH2), 3.85-3.80 (m, 3H, Z-H1 Z-O-CH2), 3.73-3.68 (rn, 2H1 2 Z-H), 3.65-3.52 (m, 7H, 3 Z-H, 2 CH2), 3.28 (in, 2H, CH2).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 163.0 (C=O)1 133.3 (CH=CH2), 116.3 (CH=CH2), 100.5 (Z-C1 ), 73.4, 71.4, 70.9, 70.0, 69.8, 67.5, 66.6, 65.2, 61.8 (5 Z-C, 4 CH2) 40.5 (N-CH2). C14H25NO9 (351.15).
FAB-HR: ber.: 374.1422 [M + Na]+ gel: 374.1429 [M + Na]+ ber.: 352.1602 [M + H]+ gef.: 352.1608 [M + H]+
Beispiel 9: W-FIuorenmethySoxycarbonyl-asparagfnsäureCO-fert-butyl) allylamid (160)
Unter Argon wurden 100 mg (0.24 mmol, 1 Äq) Fmoc-Asp(OtBu)-OH in einem Schlenkkolben in 2 ml abs. DCM/DMF = 1 :1 gelöst, 37 mg (0.24 mmol, 1 Äq) HOBt, 45.2 μl DIC (0.29 mmol, 1.2 Äq) sowie 84.9 μl (0.49 mmol, 2 Äq) DIPEA wurden hinzu gegeben und alles 10 min gerührt. Dann wurden 18.3 μl (0.24 mmol, 1 Äq) Aliylamin hinzugefügt und 24 h gerührt.
Anschließend wurde das Lösungsmittelgemisch i. Vak. Entfernt und das Produkt säulenchromatographisch (Laufmittel 2% MeOH in DCM) aufgereinigt.
Farbloser Feststoff.
Ausbeute: 109 mg (0.24 mmol), 100%. Rf = 0.39 (2% MeOH in DCM).
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ = 8.00 (s, 1H1 NH)1 7.75 (d, 3J = 7.4 Hz, 2H, 2
Fmoc-ar-H), 7.57 (d, 3J = 7.6 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.39 (t, 3J = 7.4 Hz, 2H,
2 Fmoc-ar-H), 7.33-7.27 (m, 2H1 2 Fmόc-ar-H), 5.85-5.74 (m, 1 H1 CH=CH2), 5.16 (d, 3J = 17.2 Hz, 1 H1 CH=CHa), 5.11 (dd, 2J = 1.4 Hz1 3J = 10.4 Hz1 1 H,
CH=CHb)1 4.72 (m, 1 H1 Asp-α-H), 4.43 (d, 3J = 6.6, 2H, Fmoc-CH2), 4.21 (t, 3J = 6.9 Hz1 1 H, Fmoc-CH), 3.88-3.81 (m, 2H, CH2-CH=CH2), 2.59 (dd, 2J = 6.6 Hz, 3J = 17.4 Hz, 2H, Asp-CH2), 1.44 (s, 9H1 tBu).
13C-NMR (100 MHz1 CDCI3): δ = 171.5, 170.5 (2 C=O), 162.8 (Fmoc-C=O), 143.9, 141.6 (4 Fmoc-ar-C), 133.9 (CH=CH2), 128.0, 127.3, 125.2, 120.3 (8 Fmoc-ar-C). 116.6 (CH=CH2), 82.1 (C-(CHa)3), 67.4 (FmOc-CH2), 47.4, 42.2 (Asp-α-C, CH2-CH=CH2). 36.7, 31.7 (Asp-CH2, Fmoc-CH), 28.3 (C-(ChU)3). C26H30N2O5 (450.22).
Zur Fmoc-Entschützung wurde die Substanz zu 5 ml DCM/Diethylarnin = 4:1 gegeben und 4 h gerührt. Danach wurden 10 ml Toluol zugegeben, die Mischung i. Vak. eingeengt und im HV getrocknet.
Beispiel 10: JV-FluorenmethyloxycarbonyI-gIycyI-[asparaginsäure(O- ferf-butyl)]allylamid (zu 158)
Zu einer Lösung von 107 mg (0.36 mmol, 1.1 Äq) Fmoc-Gly-OH in 2 ml DMF/DCM = 1 :1 wurden nacheinander 55 mg (0.36 mmol, 1.1 Äq) HOBt, 127 μi (0.73 mmol, 2.2 Äq) DIPEA und 277 mg (0.36 mmol, 1.1 Äq) HBTLJ hinzu gegeben. Nach 10 min Rühren wurde die Mischung zu 0.33 mmol (1 Äq) Asp(OtBu)-allylamid gelöst in 1 ml DMF/DCM = 1 :1 gegeben. Nach 20 h Rühren wurde die Mischung i. Vak. konzentriert und das Produkt säulenchromatographisch (Laufmittel 2% MeOH in DCM) aufgereinigt. Farbloser Feststoff. Ausbeute: 145 mg (0.29 mmol), 87%. Rr = 0.31 (2% MeOH in DCM). 1H-NMR (400 MHz1 CDCi3): δ = 8.01 (s, 1 H1 NH)1 7.75 (d, 3J = 7.3 Hz, 2H1 2 Fmoc-ar-H), 7.58 (d, 3J = 7.4 Hz, 2H1 2 Fmoc-ar-H), 7.40 (m, 2H1 2 Fmoc-ar- H)1 7.31 (m, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 5.82-5.71 (m, 1 H, CH=CH2), 5.14 (dd, 2J = 1.4 Hz1 3J = 17.2 Hz, 1 H, CH=CHa)1 5.05 (dd, 2J = 1.4 Hz1 3J = 10.4 Hz1 1 H, s CH=CHb)1 4.77 (m, 1H, Asp-α-H), 4.44 (m, 2H1 Fmoc-CH2), 4.22 (t, 3J = 7.2 Hz, 1 H1 Fmoc-CH), 3.88 (d, 3J = 4.7 Hz1 2H1 GIy-CH2), 3.83 (t, 3J = 5.5 Hz, 2H, CH2-CH=CH2), 2.57 (dd, 2J = 6.7 Hz1 3J = 17.2 Hz1 2H, Asp-CH2), 1.40 (s, 9H, tBu). 13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ = 171.6, 170.1 , 169.1 (3 CH2-C=O)1 162.8 o (NH-C=O)1 143.9, 141.5 (4 Fmoc-ar-C), 133.9 (CH=CH2), 127.9, 127.3, 125.2, 120.2 (8 Fmoc-ar-C), 116.4 (CH=CH2), 82.2 (C-(CHa)3), 67.7 (Fmoc- CH2), 49.5 (Gly-cc-C), 47.3, 42.2 (Asp-α-C, CH2-CH=CH2), 36.8, 31.7 (Asp- CH2, Fmoc-CH), 28.2 (C-(CH3J3). C28H33N3O6 (507.24). 5
Die Fmoc-Gruppe wurde wie unter Beispiel 9 beschrieben abgespalten.
Beispiel 11 : W-FIy orenmethyloxycarbonyl-[tyrosyl-θ- 0 (ΪVf,Λ/"-Phosporsäurebisdimethylamido)]-glycyl-[asparaginsäure(O-teιt- butyl)]allylamid (zu 158)
Zu einer Lösung von 0.29 mmol (1 Äq) Gly-Asp(OtBu)-ally!amid in 3 ml abs.
DMF wurden nacheinander 169 mg (0.32 mmol, 1.1 Äq) Fmoc-pTyr[(NMe2)
2]-OH, 48 mg (0.32 mmol, 1.1 Äq) HOBt, 110 μl (0.63 mmol, 2.2 Äq) DIPEA 5 und 164 mg (0.32 mmol, 1.1 Äq) PyBOP hinzugefügt. Nach 12 h Rühren wurde die Mischung i. Vak. konzentriert und das Produkt säulenchromatographisch (Laufmittelgradient 3% MeOH in DCM, dann 6%
MeOH in DCM) aufgereinigt.
Farbloser Feststoff. o Ausbeute: 205 mg (0.25 mmol), 86%.
Rf = 0.45 (4% MeOH in DCM). 1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ = 7.73 (d, 3J = 7.2 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.53 (d, 3J = 7.4 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.36 (m, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.28 (m, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.15-7.01 (m, 4H1 4 Tyr-ar-H), 5.83-5.73 (m, 1 H, CH=CH2), 5.14
(m, 1 H1 CH=CHa), 5.04 (m, 1 H, CH=CHb), 4.75 (m, 1 H, Asp-α-H), 4.44-4.38 (m, 3H, FmOC-CH2, pTyr-α-H), 4.17 (t, 3J = 7.1 Hz, 1 H, Fmoc-CH), 3.94-3.72 (m, 4H, GIy-CH2, CH2-CH=CH2), 3.10-2.94 (m, 2H, pTyr-CH2), 2.71-2.62 (m, 14H, P[N(CHs)2J2, ASp-CH2), 1.40 (s, 9H, tBu). 31P-NMR (162 MHz, CDCI3): δ = 17.2 (P[N(CHa)2I2). C4IH53N6O9P (804.36).
Die Fmoc-Gruppe wurde wie unter Beispiel 9 beschrieben abgespalten.
Beispiel 12: Λf-teιt-BytyloxycarbonyI-IeucyI-[tyrosyl-O- fW,W"-PhosporsäyrebisdimethySamido)]-gIycyS-[asparaginsäure(O-fert- butyi)]a!!y!amid (zu 158)
Zu einer Lösung von 79 mg (0.32 mmol, 1.3 Äq) Boc-Leu-OH in 2 ml DMF/DCM = 1 :1 wurden nacheinander 48 mg (0.32 mmol, 1.3 Äq) HOBt, 110 μl (0.63 mmol, 2.6 Äq) DIPEA und 120 mg (0.32 mmol, 1.3 Äq) HBTU hinzu gegeben. Nach 10 min Rühren wurde die Mischung zu 0.25 mmol (1 Äq) pTyr[(NMe2)2]-Gly-Asp(OtBu)-allylamid gelöst in 1 ml DMF/DCM = 1 :1 gegeben. Nach 12.5 h Rühren wurde die Mischung i. Vak. konzentriert und der Rest danach wieder in 20 ml DCM aufgenommen. Die Lösung wurde mit 20 ml ges. NaHCO3-Lösung und anschließend mit 20 ml 1 M HCI-Lösung extrahiert, die Phasen getrennt, die organische Phase über MgSO4 getrocknet und i. Vak. eingeengt. C37H62N7Oi0P (795.43). ESI-MS: ber.: 818.4 [M + Na]+ gef.: 818.5 [M + Na]+, 662.7 [M - 2 tBu + Na]+ Beispiel 13: Leucyl-phosphotyrosyl-glycyl-asparagϊnsäureallylamiid
(158)
Das Rohprodukt wurde 3 h in 2 ml TFA/DCM/TES = 95:2.5:2.5 gerührt und dann wurden 2 ml Wasser hinzugefügt. Nach 13 h wurde dreimal mit je 20 ml Toluol koevaporiert, der Rest in 20 ml Wasser aufgenommen und mit 20 ml DCM extrahiert. Die wässrige Phase wurde i. Vak. konzentriert, das Rohprodukt in wenig MeOH gelöst und durch Zugabe von viel Et2O wieder ausgefällt. Abfiltrieren und im HV trocknen lieferte einen weißen Feststoff. Rohausbeute: 90 mg. Die Substanz wurde durch präparative HPLC (C18, Gradient: 3 min 5% B, dann innerhalb von 12 min auf 60 % B und nach weiteren 3 min auf 100%, die 2 min gehalten werden) aufgereinigt. Ausbeute: Fraktion 1 : 30 mg (0.05 mmol), 20% (sauberes Produkt);
Fraktion 2: 29 mg (gering verunreinigtes Produkt). HPLC (C18): tr = 4.94 min (Standardgradient).
[α]D 20 = +8.65° (C =L H2O). Schmp.: 1710C.
1H-NMR (400 MHz1 CD3OD): δ = 7.20 (d, 3J = 8.4 Hz, 2H, Tyr-ar-H meta zum O), 7.13 (d, 3J = 8.6 Hz, 2H, Tyr-ar-H Ortho zum O), 5.86-5.76 (m, 1 H, CH=CH2), 5.18 (m, 1H1 CH=CHa), 5.07 (m, 1 H, CH=CHb), 4.76 (t, 3J = 6.8 Hz, 1 H, Asp-α-H), 4.47 (dd, 2J = 6.5 Hz, 3J = 9.0 Hz, 1H1 pTyr-α-H), 3.99 (d, 3J = 16.8 Hz, 1 H, GIy-CHa), 3.86 (t, 3J = 6.8 Hz, 1 H, Leu-α-CH), 3.79 (d, 3J = 5.3 Hz, 2H1 CH2-CH=CH2), 3.66 (d, 3J = 16.8 Hz, 1 H, GIy-CHb)1 3.15 (dd, 2J = 6.3 Hz1 3J = 14.1 Hz, 1 H, pTyr-CHa), 3.01 (dd, 2J = 9.0 Hz, 3J = 13.9 Hz, 1H, pTyr-CHb), 2.88 (dd, 2J = 6.3 Hz1 3J = 16.8 Hz, 1H, Asp-CHa), 2.77 (dd, 2J = 7.2 Hz1 3J = 16.8 Hz1 1H1 Asp-CHb), 1.66 (m, 3H1 CH2-C H-(C Hs)2), 0.97 (t, 3J = 5.6 Hz, 6H1 CH-(CHj)2).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 172.9, 172.5, 171.5, 170.2, 170.1 (5 C=O), 151.9 (pTyr-ar-C am O), 133.9 (CH=CH2), 132.8 (pTyr-ar-C an CH2), 130.1 (2 pTyr-ar-C meta zum O), 120.3 (2 pTyr-ar-C Ortho zum O), 115.1 (CH=CH2), 56.0, 51.7 (pTyr-α-C, Leu-α-C), 50.1 (Gly-cc-C), 42.5, 41.7 (Asp- α-C, CH2-CH=CH2), 40.4 (LeU-CH2), 36.0, 35.8 (Asp-CH2> pTyr-CH2), 24.1 (C-(CHa)2), 22.1 , 20.6 (C-(QHa)2). 31P-NMR (162 MHz, CD3OD): δ = -3.9. C24H36N5O10P (585.22). FAB-HR: ber.: 586.2273 [M + H]+ gef.: 586.2253 [M + H]+
Beispiel 14: Allgemeine Arbeitsvorschrift zur ThioI-Funktionaüsierung von Oberflächen
Fünf Carbonsäure-funktionalisierte Glas- oder Siliciumträger wurden auf einem Teflonhalter in ein hohes, schlankes Schlenk-Gefäß mit Rührmagneten gegeben, wobei auf Sauberkeit des Gefäßes sowie der Oberflächen geachtet wurde. Wegen ihrer geringen Dicke mussten die Siliciumwafer zusätzlich mit Deckgläsern an ihrer unfunktionalisierbaren Seite im Teflonhalter festgesteckt werden. Das Schlenk-Gefäß wurde 10 min am HV angeschlossen und anschließend mit Argon gespült. Dann wurden 58 ml abs. DMF hinzugegeben, die Mischung in einem Eisbad auf 00C gekühlt und danach mit 40 mg (2.5 mM, 0.5 mM pro Träger) DCC versetzt und bei mittlerer Geschwindigkeit gerührt. Nach 15 min wurden 41 mg (3.0 mM Lösung, 0.6 mM pro Träger) Cystamindihydrochlorid, die in 1 ml abs. DMF und einem Tropfen H2O zusammen mit 59.5 μl (6.0 mM Lösung, 1.2 mM pro Träger) DIPEA gelöst worden waren, hinzu gegeben. Das Gefäß, in dem diese Lösung angesetzt worden war, wurde mit 1 ml abs. DMF gespült und dieses dann zu den Trägern gegeben. Die Träger wurden mindestens 14 h in der Reaktionslösung gerührt, wobei die Mischung sich auf rt erwärmte. Die Reaktionslösung wurde mittels einer Spritze mit dicker, langer Kanüle entfernt, die Träger mit DMF im Gefäß gespült, das DMF wieder entfernt und anschließend wurden die Träger 30 min in 80 ml DMF/H2O = 3:1 (v/v) wie beschrieben gerührt. Sowohl bei der Reaktion als auch bei dem Waschvorgang müssen alle Träger mit Flüssigkeit bedeckt sein. Die Flüssigkeit wurde wieder entfernt, die Träger nacheinander mit DMF und H2O gespült und im Schlenk-Gefäß am HV getrocknet. Nach mindestens 5 h Trocknung wurden unter Argon 60 ml abs. DMF, 230 mg (25 mM Lösung, 5 mM pro Träger) DTT und 104 μl (12.5 mM Lösung, 2.5 mM pro Träger) TEA zu den Trägern gegeben. Die Lösung wurde durch drei Zyklen Vakuum/Argon nochmals entgast und mindestens 16 h unter Argon gerührt. Die Reaktionslösung wurde entfernt, die Träger mit abs. DMF im Gefäß gespült, das DMF wieder entfernt und anschließend wurden die Träger 15 min in 60 ml abs. DMF gerührt. Das DMF wurde entfernt, die Träger mit abs. DCM gespült und 60 ml abs. DCM hinzugefügt. Alle Waschvorgänge wurden unter Argon durchgeführt. Nach 15 min Rühren wurde das DCM entfernt, die Träger mit abs. DCM nochmals gespült, im HV getrocknet und unter Argon aufbewahrt.
Beispiel 15: Allgemeine Arbeltsvorschrϊft zum Handl-Bespotfen ThSoI- funktϊonalisierter Glasträger
In ein weites Becherglas mit Teflonhaltern (zwei pro Glasträger) wurde DMF gegeben, bis die Teflonhalter bis zur Hälfte in DMF standen. Dann wurde das Becherglas mit einem größeren abgedeckt und durch eine kleine Öffnung Argon durch das DMF geblubbert. Für die Bespottung mit dem Handspotter wurden in eine 384 well Mikrotiterplatte pro Spot 40 μl der entsprechenden Lösung vorgelegt, die Nadeln des Handspotters dort eingetaucht und dann die Tröpfchen auf dem Glasträger abgesetzt. Bei der Bespottung durch Eppendorfpipetten wurden in einem gewünschten Muster 0.5 μl Tröpfchen abgesetzt. Das Durchblubbern mit Argon wurde beendet und das zweite, größere Becherglas entfernt. Direkt nach der Bespottung wurden die Glasträger auf jeweils zwei Teflonhalter in das Becherglas gelegt. Die UV-Lampe wurde ca. 10 cm über dem Becherglas mit den Glasträgern angebracht. Nach dem Belichten wurden die Glasträger mit DMF gespült, dann 30 min in DMF/H2O = 2:1 in einer slide-Box geschüttelt, wieder mit DMF und H2O gespült und im HV getrocknet. Beispiel 16:AIIgemeine Arbeitsvorschrift zur Photoimmobilisierung durch eine Maske oder ein Lasermikroskop auf Glasträgern Auf einen Thiol-modifizierten Glasträger wurden drei 25 μl (1.0 x 1.0 cm, AB- 0576) Rahmen der Firma ABGene, Surrey, UK, aufgebracht. Es wurde die entsprechenden Lösung im Dunkeln in die Rahmen gefüllt und anschließend wurde der Glasträger entweder in die Maske hineingelegt und von oben durch die geschlossene Maske mit der ca. 10 cm entfernten UV-Lampe oder auf einem Lasermikroskop durch ein Objektiv von unten belichtet. Danach wurde der Glasträger sofort intensiv mit DMF und H2O gespült und am HV getrocknet.
Einstellungen der Laser-Belichtung: Slow scan,
40er Objektiv extra long working distance, Scanwiederholung: 100, Größe der belichteten Quadrate: 512x512 pixel = 338.4 μm2 (0.661 μm = 1 Pixel),
Laserpower: 100% bei 728 nm ca. 150-200 mW (zwei Photonen-Anregung ergab theor. 364 nm).
Beispiel 17: Allgemeine Arbeitsvorschrift zu PhotoSithografie- Experimenten auf Siliclumwafern
Auf Thiol-funktionalisierte Siliciumwafer wurden 400 μl der entsprechenden Lösung aufgegeben. Die Lösung wurde durch Zentifugation gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt. Das Programm zur Zentrifugation lautete:
7 .. , v Geschwindigkeit Beschleunigung .leii ^sec; ^j (QCC jn(jeχ)
5 500 12
40 1000 3
20 0 1 Nach der Auftragung wurde der Siliciumwafer 10 min unter Stickstoffstrom im Spin-Coater zum Trocknen gelassen. Dann wurde mit variabler Dauer belichtet. Nach der Belichtung wurde mit dem gleichen Zentrifugationsprogramm gewaschen:
Haptene
Biotin Phosphopeptid STV
1. DMF 1. DMF 1. TETBS
2. MeOH 2. MeOH 2. H2O
3. TETBS
Für jeden Waschschritt wurde das Zentrifugationsprogramm einmal durchlaufen. Anschließend wurden die Wafer weiter gewaschen: Biotin: - je einmal mit DMF, H2O und MeOH gespült, in der slide-Box jeweils einmal 30 sec mit DMF/H2O=1 :1 und MeOH geschüttelt, mit MeOH abgespült; Phosphopeptid: - je einmal mit DMF, TETBS und MeOH gespült, in der slide-Box jeweils einmal 30 sec mit DMF,
TETBS sowie MeOH geschüttelt, mit MeOH abgespült; Streptavidin: - je einmal mit TETBS und H2O gespült, in der slide-Box jeweils einmal 30 sec mit TETBS und H2O geschüttelt, - wieder je einmal mit TETBS und H2O abgespült.
Nach dem Waschprozess wurden die Wafer an der Luft zum Trocknen stehengelassen. Kurze Beschreibung der Schemata und Figuren:
Schema 1 : Synthese der zur Testreaktion benötigten Verbindung 143. Schema 2: Funktionalisierung von Glasträgern mit Thiolen. Schema 3: Synthese des Mannoseallyiamids 155.
Schema 4: Synthese des Phosphopeptids 158 in Lösung, a:
DCM/Diethylamin (4:1); b: Fmoc-GIy-OH, HOBt, DIPEA, HBTU, DMF/DCM (1 :1), RT, 20 h; c: Fmoc-pTyr[(NMe2)2]-OH, HOBt, DIPEA, PyBOP, DMF, RT, 12 h; d: Boc-Leu-OH, HOBt, DIPEA, HBTU, DMF/DCM (1 :1), RT, 12.5 h; e: 1. TFA/DCM/TES
(95:2.5:2.5), RT, 3 h, 2. H2O, RT, 13 h.
Figur 1: Reaktionen zur photochemischen Immobilisierung nach Blawas et al.1998. Figur 2: Nachweis der Immobilisierung von Biotinallyiamid 143 und
Biotinpropylamid 38 auf Thiol-funktionalisierten Oberflächen mit
STV-Cyδ; Effekte verschiedener Lösungsmittel auf einem
Dendrimer- Glasträger;
Figur 3: Experiment zur Regenerierung der Oberfläche; A: Nachweis von Biotin 143 durch Bindung von Streptavidin-Cy5; B und C:
Stringentes Waschen mit 0.1% SDS-Lösung; D: Erneutes Binden von Streptavidin-Cy5. Figur 4: Nachweis der Anbindung von in einem Konzentrationsgradienten immobilisierten Biotin 143 mit STV-Cy5; A: 3 h bei 365 nm belichteter Glasträger; B: 3 h im Dunkeln verwahrter Glasträger;
C: Histogramm der Signalintensitäten mit /rβι =
Fluoreszenzsignalintensität (relative Einheiten), b. = belichtet und n.b. = nicht belichtet.
Figur 5: Nachweis der immobilisierten Mannose 155 mit Concanavalin A (2 μM). Figur β: Nachweis des Phosphopeptids 158 mit dem biotinylierten anti- pTyr-Antikörper-Streptavidin-Cy5 Konjugat und Histogrammdarstetlung der Signalintensitäten.
Figur 7: Histogramm der Signalintensitäten der zeitabhängigen Immobilisierung von Phosphopeptid 158.
Figur 8: Nachweis von immobilisiertem Biotinallylamid 143 mit
Streptavidin-Cy5; Biotin 143 wurde in Konzentrationen von 1 und 10 mM eingesetzt und die Belichtungszeit wurde mit 10 und 30 min variiert. A: 10 mM Biotin 143, 10 min Belichtungszeit; B: 10 mM Biotin 143, 30 min Belichtungszeit; C: 1 mM Biotin 143, 10 min Belichtungszeit; D: 1 mM Biotin 143, 30 min Belichtungszeit.
Figur 9: Vergrößerung des oberen Abschnitts von Figur 8A.
Figur 10: A: Nachweis von immobilisiertem Streptavidin 161 mit Biotin-
Cy5; B: Nachweis von immobilisiertem Streptavidin 162 mit Biotin-Cy5 als Negativkontrolle zu A; C: Nachweis von immobilisiertem Phosphopeptid 158 mit dem Fluoreszenzmarkierten Antikörper-Konjugat; D: Pentensäure funktionalisiertes Streptavidin 161 (schematisch).
Figur 11: A: Nachweis von mittels Laserstrahl immobilisiertem Biotinallylamid 143 mit Streptavidin-Cy5; B: Vergrößerung von A;
C: Scan dreier Felder im rechten Winkel, nachgewiesen mit Streptavidin-Cy5.
Literatur: BT. Houseman, M. Mrksich, Chem. BIoL 2002, 9, 443-454.
A.S. Blawas, W.M. Reichert, Biomaterials 1998, 19, 595-609.
R. Benters, CM. Niemeyer, D. Wöhrle, ChemBioChem 2001 , 2, 686-694.
CD. Müller et al., Nature 2003, 421 ,829-833.
R.F. Ismagilov, Angew. Chem. 2003, 115, 4262-4264. S.P.A. Fodor, RJ. Leighton, M.C. Pirrung, L: Stryer, AT. Lu, D. Solas, Science 1991, 251, 767-776.
W.S. Dillmore, M.N. Yousaf, M. Mrksich, Langmuir 2004, 20, 7223-7231.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reaktion zwischen der ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe eines ersten Moleküls und einer Thiolgruppe eines zweiten Moleküls ausgeführt wird, wobei eines der beiden Moleküle auf der Oberfläche immobilisiert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion eine photochemische Reaktion oder eine Radikalinduzierte Reaktion ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion chemoselektiv abläuft.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das eine Thiolgruppe aufweisende Molekül auf der Oberfläche immobilisiert ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das eine Thiolgruppe aufweisende Molekül als selbstassemblierte Monoschicht auf der Oberfläche immobilisiert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das eine Thiolgruppe aufweisende Molekül ein Thiol- funktionalisiertes Dendrimer oder Silan ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül mit ungesättigter Kohlenwasserstoffgruppe eine terminale Doppelbindung aufweist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche eine Oberfläche ist, welche die Reflexion oder Weiterleitung von Licht im Träger minimiert oder verhindert.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche aus SiO2 ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche auf einem Träger, insbesondere einem Glasträger oder einem Siliziumwaver, aufgebracht ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die photochemische Reaktion Licht-induziert, insbesondere UV- Licht induziert wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die photochemische Reaktion unter Verwendung eines Lasers, insbesondere eines Lasermikroskops, induziert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die photochemische Reaktion unter Verwendung von optischer Raster-Nahfeldmikroskopie (SNOM) induziert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtexposition bzw. Belichtungszeit zur Induktion der photochemischen Reaktion 1 Sekunde bis 30 Minuten beträgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtung strukturiert, bevorzugt mikro- oder nanostrukturiert, erfolgt.
16. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die photochemische Reaktion zur Addition des nicht immobilisierten Moleküls nur in solchen Bereichen der Oberfläche stattfindet, die mit Licht bestrahlt werden, oder die Radikal-induzierte Reaktion zur Addition des nicht immobilisierten Moleküls nur in solchen Bereichen der Oberfläche stattfindet, die mit Radikalen behandelt werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass zur Festlegung von Bereichen in denen eine Reaktion zwischen ungesättigter Kohlenwasserstoffgruppe und Thiolgruppe erfolgt eine Maske verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass kein Abstand zwischen Maske und Oberfläche vorhanden ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Abweichung bei der Addition des zweiten Reaktanten höchstens ± 2 μm bezüglich der Maskenstruktur beträgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine strukturierte Beschichtung durch selektives Bestrahlen der Oberfläche, insbesondere mittels Laser, durchgeführt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Randunschärfe höchstens ± 1 μm beträgt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass nicht umgesetzte, nicht immobilisierte Moleküle nach der Reaktion von der Oberfläche entfernt wird und das Verfahren wiederholt wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche durch die Beschichtung funktionalisiert wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass als nicht immobilisiertes Molekül ein Molekül mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe oder einer Thiolgruppe eingesetzt wird, welches mit einem ersten Bindepartner eines hochaffinen Bindepaares funktionalisiert ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24 dadurch gekennzeichnet, dass ein weiteres Molekül umfassend den zweiten Bindepartner des hochaffinen Bindepaares zugegeben wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Nanopartikel-Strukturierung verwendet wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren automatisiert durchgeführt wird.
28. Beschichtete Oberfläche erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 27.
29. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Herstellung einer Oberfläche, die mit Naturstoffen wie beispielsweise
Zucker und Kohlenhydraten, Aminosäuren, Peptiden, Phosphopeptiden, Proteinen, Enzymen, Antikörpern, Lipiden, Nukleotiden, Nukleosiden und Nukleinsäuren, Farbstoffen, radioaktiv markierten Molekülen, Isotopen markierten Molekülen, Monomeren für Polymerisationsreaktionen oder Polymeren, lumineszierenden
Molekülen, insbesondere fluoreszierenden Molekülen, Flüssigkristallen elektrolumineszierenden Molekülen und/oder Polymeren, Nanopartikeln, Vesikeln und/oder anorganischen Katalysatoren zumindest teilweise beschichtet ist.
30. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 27 oder 29 zur Herstellung von mikrofluidischen Systemen, LCDs, AM- LCDs, LEDs, OLEDs, dreidimensionalen Strukturen, leitenden Mikrostrukturen, insbesondere für die Halbleiter- und Chiptechnologie, Mikroarrays, und/oder Biochips, insbesondere für das Hochdurchsatz-
Screening nach neuen pharmazeutischen Wirkstoffen oder leitenden Mikrostrukturen.
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