WO2006125838A1 - Métodos para el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades desmielinizantes y para el desarrollo de medicamentos contra las enfermedades desmielinizantes - Google Patents

Métodos para el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades desmielinizantes y para el desarrollo de medicamentos contra las enfermedades desmielinizantes Download PDF

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WO2006125838A1
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eaat2
glutamic acid
egf
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subject
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Carlos Matute Almau
María Domercq García
Alberto PÉREZ SAMARTÍN
Fernando PÉREZ CERDÁ
Ainara Vallejo Illarramendi
Estibaliz Etxebarria Galnares
Ormaetxea Olatz Pampliega
Pablo VILLOSLADA DÍAZ
Alfredo RODRÍGUEZ-ANTIGÜEDAD ZARRANZ
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Universidad Del Pais Vasco
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Definitions

  • the present invention falls within the scope of demyelinating diseases, preferably in the case of multiple sclerosis, and is related to the use of glutamic acid transporters as markers of the mentioned diseases and to the use of substances that enhance the expression of said conveyors for the treatment of the above diseases.
  • MS Multiple sclerosis
  • CNS central nervous system demyelinating disease
  • HLA human leukocyte antigens
  • MOG myelin oligodendrocytic glycoprotein
  • the primary phase begins with the activation of myelin-specific T cells, which cross the blood brain barrier. Once inside the CNS, they release pro-inflammatory cytokines, triggering an immunological cascade that leads to the destruction of myelin and death of oligodendrocytes, partly reversible after the inflammatory outbreak.
  • Knowledge with a certain detail of the autoimmune process has served to develop immunomodulatory agents whose therapeutic efficacy is very modest.
  • glutamic acid homeostasis in MS is altered, which supports the glutamatergic MS hypothesis.
  • glutamic acid levels are increased in the cerebrospinal fluid of patients with acute MS (Stover et al., 1997, Eur J Clin Invest 27, 1038-1043) and secondary progressive MS (Sarchielli et al., 2003, Arch Neurol 60, 1082-1088), as well as serum before the onset of the outbreak (Westall et al., 1980, J Neurol Sci 47, 353-364).
  • EAATs Glutamic acid transporters
  • EAATl and EAAT2 are mainly expressed in cells of glial origin, EAAT3 (and their homologue in rat EAACl) and EAAT4 in neurons, and EAAT5 is located exclusively in the retina.
  • Glutamic acid transporters are widely distributed throughout the brain and spinal cord (Danbolt, 2001, Prog Neurobiol 65, 1-105) as well as in white matter tracts, such as the optic nerve (Domercq et al., 1999, Eur J Neurosci 11, 2226-2236).
  • mice deficient in the GLT-I transporter develop a lethal spontaneous epileptic activity and have a greater susceptibility to acute cortical damage (Tanaka et al., 1997, Science 276, 1699-1702).
  • EAATl / GLAST and EAAT2 / GLT-1 transporters Given the essential role of the EAATl / GLAST and EAAT2 / GLT-1 transporters, it is possible that an alteration in their expression or function may contribute to increasing the levels of glutamic acid that occur in some CNS pathologies, such as demyelinating diseases.
  • the main objective of the present invention is to provide an in vitro method to detect the presence of demyelinating diseases, and in particular of MS, to determine their prognosis, and to monitor the effect of the treatments used for said diseases.
  • An additional objective is to provide a series of compounds for the treatment of demyelinating diseases, and in particular of MS.
  • the present invention is based on the discovery that inhibition of the activity of glutamic acid transporters produces oligodendroglial death in vitro and neurological damage in vivo such as demyelination and axonal damage, which are characteristic of the neurodegenerative phase of MS; in the discovery that the expression of said transporters is regulated by glutamic acid levels; and in the discovery that glutamic acid levels and expression levels of EAAT1 and EAAT2 transporters are increased in blood samples as well as in post-mortem optic nerve samples of patients with MS with respect to unaffected control patients of MS, said overexpression being a response mechanism due to the increase in glutamic acid levels and produced by epidermal growth factor (EGF), positive modulator of transcription of EAAT1 and EAAT2.
  • EGF epidermal growth factor
  • the invention relates, in general, to the use of EAATl and EAAT2 transporters, glutamic acid and / or the EGF modulator as markers of demyelinating diseases and, in particular, of MS, as well as to methods and kits for the implementation of the present invention.
  • the invention relates to an in vitro method to detect a demyelinating disease in a subject, or to determine the stage or severity of said disease in a subject, or to monitor the effect of therapy administered to a subject presenting said disease, which includes the use of EAAT1 and EAAT2, of glutamic acid and / or of the EGF modulator as markers of demyelinating diseases.
  • the invention relates to the use of a nucleotide sequence of a gene selected from the EAATl gene, the EAAT2 gene and the EGF gene, or a peptide sequence of a protein selected from EAATl, EAAT2 and EGF, or an antibody capable of binding to a protein selected from EAATl, EAAT2 and EGF or fragments thereof containing antigenic determinants, or of the enzyme glutamic acid dehydrogenase, to detect in vitro a demyelinating disease in a subject, or to determine in vitro the state or severity of said demyelinating disease, or to determine in vitro the effect of treatment in a subject presenting a demyelinating disease.
  • the invention relates to a method for screening, search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for the treatment of demyelinating diseases based on the quantification of a gene selected from the genes EAATl, EAAT2, EGF and combinations thereof, or in the quantification of glutamic acid levels.
  • the invention relates to the use of (i) a nucleotide sequence of a gene selected from the EAATl, EAAT2 and EGF genes, or (ii) an amino acid sequence of a protein selected from EAATl, EAAT2 and EGF, or of (iii) an antibody capable of binding my protein selected from EAATl, EAAT2 and EGF or fragments thereof containing antigenic determinants, in a method of screening, search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for the treatment of demyelinating diseases.
  • the invention relates to an in vitro method for the identification and evaluation of the efficacy of treatments of demyelinating diseases comprising the quantification of glutamic acid levels, or the quantification of EAAT1, EAAT2 and / or protein levels. or EGF, or the quantification of the levels of expression of the genes EAATl, EAAT2 and / or EGF in the same subject throughout the different phases or stages of the disease, or during the periods of treatment and absence thereof, and its comparison with control values considered normal or with previous values of the same patient.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a compound that blocks the inhibition of the expression or activity of a glutamic acid transporter selected between the EAAT1 and EAAT2 transporters, or of a compound that promotes or enhances the expression of said EAAT1 and / or EAAT2 transporters, or of a compound that lowers the level of glutamic acid, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients and / or carriers.
  • said pharmaceutical composition comprises a positive modulator of the expression of EAAT1 and EAAT2 transporters, such as EGF.
  • the invention relates to the use of a compound that blocks the inhibition of the expression or activity of a glutamic acid transporter selected between the EAAT1 and EAAT2 transporters, or of a compound that promotes or enhances the expression of said EAATl and / or EAAT2 transporters, or a compound that lowers the level of glutamic acid, in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of demyelinating diseases.
  • the invention relates to a kit, such as an appropriate kit for detecting a demyelinating disease in a subject, or for determining the stage or severity of said disease in a subject, or for monitoring the effect of therapy administered to a subject presenting said disease.
  • Figure 1 shows the electrophysiological properties of glutamic acid transporters in oligodendrocytes in culture.
  • the application of glutamic acid and aspartate produces a slow, non-desensitizing comment, inhibited by replacing extracellular Na with Li + and in the presence of the TBOA inhibitor, and enhanced in the presence of SCN ions " at the intracellular level.
  • Pharmacological characteristics indicate the expression of the EAAT1 / GLAST and EAAT2 / GLT-1 subtypes.
  • Figure 2 shows that inhibition of glutamic acid transporters causes oligodendroglial death in vitro. Death occurs due to the activation of AMPA / Kainate receptors as it is enhanced in the presence of cyclothiazide and concanavalin A, inhibitors of receptor desensitization AMPA and Kainate respectively, and it is blocked in the presence of CNQX, AMPA / kainate receptor antagonist.
  • Figure 3 demonstrates that the inhibition of glutamic acid transporters in the optic nerve in situ results in alterations in glutamic acid homeostasis, which produce oligodendroglial death by overactivation of AMPA / Kainate receptors.
  • Figure 4 shows how the slow infusion (1 ⁇ l / hour; 3 days) of antisense oligonucleotides against the GLT-I transporter (1 ⁇ M) produces lesions in the optic nerve, in which tissue damage with microgliosis can be seen, as well as disappearance of myelin in the damaged area and axon rupture.
  • Figure 5 shows that the levels of RNA coding for EAATl and EAAT2 are elevated in the optic nerve of patients with MS.
  • Figure 6 demonstrates that EAAT2 levels are increased only in optic nerves with visual disturbances, such as optic neuritis, and that EAAT2 expression correlates with EGF, a positive modulator of its transcription.
  • FIG 7 shows the in situ expression of glutamic acid transporters in post-mortem human optic nerve. It is shown that the protein levels of EAAT1 and EAAT2 as well as their functionality are elevated in the optic nerve of patients with MS.
  • FIG 8 shows that glutamic acid levels as well as EAAT1 and EAAT2 levels are elevated peripherally, in blood samples from patients with MS. These increases are due to the effect of the positive modulator EGF, which is also increased in these samples.
  • Figure 9 demonstrates that stimulation with glutamic acid in the optic nerve in situ is sufficient to induce an increase in the expression of the EAATl (GLAST) and EAAT2 (GLT-I) transporters, and that these increases are accompanied by increases in the modulator EGF positive.
  • EAATl GLAST
  • GLT-I EAAT2
  • subject refers to a member of a species of a mammalian animal, and includes, but is not limited to, domestic animals, primates and humans; The subject is preferably a human being, male or female, of any age or race.
  • demyelinating diseases refers to those diseases in which the pathogenic process causes the destruction of myelin, which is the lipoprotein layer that covers the nerves and facilitates the transmission of impulses through nerve fibers;
  • demyelinating diseases include: multiple sclerosis (MS), Devic syndrome, Baló disease, Marchiafava-Bignami disease, central pontine myelinolysis, disseminated acute encephalomyelitis and acute necrotizing hemorrhagic encephalomyelitis.
  • protein refers to a molecular chain of amino acids, linked by covalent or non-covalent bonds.
  • the term includes all forms of post-translational modifications, for example glycosylation, phosphorylation or acetylation.
  • antibody refers to a protein with specific binding capacity to an "antigen.”
  • antibody comprises monoclonal antibodies, or intact polyclonal antibodies, or fragments thereof that retain the ability to bind to the antigen, recombinant antibodies, combibodies, etc., both human or humanized and of non-human origin.
  • oligonucleotide primer refers to a nucleotide sequence, which is complementary to a nucleotide sequence of a gene selected from the gene encoding the glutamic acid transporter subtype 1 (EAATl) [ EAAT1 gene], the gene encoding glutamic acid transporter subtype 2 (EAAT2) [EAAT2 gene] and the gene encoding epidermal growth factor (EGF) [EGF gene].
  • EAATl glutamic acid transporter subtype 1
  • EAAT2 glutamic acid transporter subtype 2
  • EAF epidermal growth factor
  • the present invention is based on the discovery that the expression of EAAT1 and / or EAAT2 genes as well as that of their corresponding proteins is increased in patients with MS with respect to control subjects; in the discovery that glutamic acid levels in patients with MS are increased with respect to control subjects; and in the discovery that the expression of the gene encoding the EGF, positive modulator of the promoter of the transporters, as well as the corresponding protein, are increased in patients with MS with respect to control subjects.
  • the evaluation and comparison of the levels of the EAATl and / or EAAT2 genes as well as their corresponding proteins, and / or the evaluation and comparison of the level of the gene encoding the EGF as well as that of the corresponding protein (EGF) , and / or the evaluation and comparison of glutamic acid levels in a biological sample of a subject can be used for diagnostic or prognostic purposes of demyelinating diseases in general, and, in particular, of MS.
  • a high level of said markers with respect to the levels of control subjects i.e., subjects without a clinical history of demyelinating diseases and / or who do not have demyelinating diseases, eg, MS) or with normal reference values (obtained, in general, from control subjects) is indicative of a demyelinating disease, or of a greater risk or predisposition of a subject to develop said disease.
  • the comparison of the levels of said markers, at any given time, in a subject, diagnosed or not of a demyelinating disease, with those of previous samples of the same subject it may be indicative of the evolution and prognosis of said demyelinating disease or of its predisposition to develop said disease.
  • the aforementioned finding can be used, among other applications, in diagnostic or risk assessment tests or predisposition of a subject to develop a demyelinating disease, in prognostic tests, in monitoring trials of the effect of therapy administered to a subject. to analyze the efficacy of the therapy and the evolution of the disease, and in screening trials of potentially useful compounds for the treatment of demyelinating diseases.
  • the invention therefore provides methods for detecting and quantifying the expression of the EAAT1 and EAAT2 genes and of the gene encoding the EGF, and that of their corresponding proteins, as well as for detecting and quantifying glutamic acid levels in a biological sample. .
  • the invention also provides methods for detecting interactions between said products and other compounds, for example, antagonists.
  • the invention relates to an in vitro method to detect a demyelinating disease in a subject, or to determine the stage or severity of said disease in a subject, or to monitor the effect of therapy administered to a subject presenting said disease, hereinafter method of the invention, comprising:
  • EAATl glutamic acid transporter subtype 1
  • EAAT2 the gene encoding the transporter of glutamic acid subtype 2
  • EAF epidermal growth factor
  • EAATl glutamic acid transporter subtype 1
  • EAAT2 glutamic acid transporter subtype 2
  • EGF epidermal growth factor
  • the method provided by this invention has high sensitivity and specificity, and is based on the fact that subjects diagnosed with a demyelinating disease, especially MS, have high levels of glutamic acid and mRNA encoding the EAATl, EAAT2 and / or EGF, and / or high concentrations of EAATl, EAAT2 and / or EGF proteins, compared to levels in samples of control subjects without any clinical history of demyelinating disease.
  • a biological sample of the subject to be studied is obtained.
  • Illustrative, non-limiting examples of such samples include different types of biological fluids, such as blood, cerebrospinal fluid, peritoneal fluid, feces, urine and saliva, as well as tissue samples.
  • Biological fluid samples can be obtained by any conventional method as well as tissue samples; By way of illustration, said tissue samples may be biopsy samples obtained by surgical resection. Samples can be obtained from subjects previously diagnosed with a demyelinating disease (patients), for example, MS, or from undiagnosed subjects, or from patients under treatment of demyelinating diseases, for example, MS, or from patients who have previously treated of them.
  • patients for example, MS
  • demyelinating diseases for example, MS
  • MS demyelinating diseases
  • the method of the invention comprises quantifying the level of expression of a gene selected from the EAAT1 gene, the EAAT2 gene and the EGF gene, and combinations thereof, in a sample of said subject and its comparison with the of a control sample, where an increase in said level with respect to the level in the control sample is indicative of a demyelinating disease, for example, MS.
  • the method of the invention includes the possibility of quantifying not only the level of only one of said genes, but the possibility of quantifying the levels of two of said genes, and even of said three genes.
  • the level of expression of a gene can be quantified by quantifying the level of mRNA encoding said gene, or, alternatively, the level of the complementary DNA (cDNA) to said mRNA.
  • the method of the invention includes performing an extraction step in order to obtain the total RNA, which can be performed by conventional techniques (Chomczynski et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532).
  • any conventional method can be used within the scope of the invention to detect and quantify mRNA levels encoding EAAT1, EAAT2 and / or EGF or their corresponding cDNAs.
  • the levels of mRNA encoding said genes can be quantified by using conventional methods, for example, methods comprising the amplification of the mRNA and quantification of the product of the amplification of said mRNA, such as electrophoresis and staining, or alternatively, by Southern blot and use of appropriate probes, Northern blot and use of specific mRNA probes of the gene of interest (EAATl, EAAT2 or EGF) or its corresponding cDNAs, mapping with Sl nuclease, RT-LCR, hybridization, microarrays, etc., preferably, by real-time quantitative PCR using an appropriate marker (see the Example accompanying this description).
  • the levels of the cDNAs corresponding to said mRNAs encoding EAAT1, EAAT2 and / or EGF can also be quantified using conventional techniques; in this case, the method of the invention includes a step of synthesis of the corresponding cDNA by reverse transcription (RT) of the corresponding mRNA followed by amplification and quantification of the amplification product of said cDNA; In a particular embodiment, the amplification is carried out qualitatively or quantitatively, by PCR, using oligonucleotide primers that specifically amplify regions of the EAAT1, EAAT2 or EGF genes.
  • the method of the invention comprises quantifying the level of a protein selected from EAAT1, EAAT2 and EGF proteins, and combinations thereof, in a sample of said subject and its comparison with that of a control sample, wherein an increase in said level with respect to the level in the control sample is indicative of a demyelinating disease, for example, MS.
  • the method of the invention includes the possibility of quantifying not only the level of only one of said proteins, but the possibility of quantifying the levels of two of said proteins, and even of said three proteins.
  • the level (concentration) of said EAATl, EAAT2 and / or EGF proteins can be quantified by any conventional method that allows detecting and quantifying said proteins in a sample of a subject.
  • the method of the invention includes carrying out an extraction step in order to obtain a protein extract containing said proteins, which can be done by conventional techniques (Chomczynski et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532).
  • Virtually any conventional method can be used within the framework of the invention to detect and quantify the levels of EAATl, EAAT2 and / or EGF.
  • the levels of said proteins can be quantified by the use of conventional methods, for example, by the use of antibodies capable of binding to EAATl, EAAT2 or EGF (or fragments thereof containing antigenic determinants ) and subsequent quantification of the complexes formed.
  • the antibodies used in these assays may or may not be labeled.
  • markers include radioactive isotopes, enzymes, fluorophores, chemiluminescent reagents, enzyme substrates or cofactors, enzyme inhibitors, particles, dyes, etc.
  • the quantification of the levels of EAATl, EAAT2 and / or EGF is carried out by using antibodies capable of binding to EAATl, EAAT2 or EGF (or fragments thereof containing antigenic determinants) and subsequent quantification of complexes formed, for example, by immunochemical techniques that allow quantification of the antigen-antibody binding, for example, Western blot, ELISA, protein biochips, etc .; preferably, the quantification of the levels of EAATl, EAAT2 and / or EGF is carried out by Western blot using appropriate antibodies capable of binding said proteins [there are commercial antibodies capable of binding said proteins (see the Example accompanying this description)].
  • the functionalization of the EAAT1 and EAAT2 transporters can be determined by conventional methods, for example, by tests of glutamic acid uptake in vesicular glial membrane preparations (see the Example accompanying this description)].
  • the method of the invention comprises quantifying the level of glutamic acid in a sample of said subject and its comparison with that of a control sample, wherein an increase in said level with respect to the level in the control sample is indicative of a demyelinating disease.
  • the level (concentration) of glutamic acid can be quantified by any conventional method that allows detecting and quantifying said compound in a sample of a subject.
  • the level of glutamic acid is determined in a sample of blood, plasma or serum of the subject, so that, in this case, the method of the invention may include performing a pretreatment to separate the plasma or serum, what can be done by conventional techniques.
  • any conventional method can be used within the framework of the invention to detect and quantify the level of glutamic acid.
  • the level of said compound can be quantified by enzymatic methods, for example, by an enzymatic reaction using the enzyme glutamic acid dehydrogenase (see the Example accompanying this description).
  • the method of the invention also comprises the step of comparing the expression levels of the EAAT1, EAAT2 and / or EGF genes, (obtained, for example, by quantifying the levels of the mRNAs corresponding to said genes, or their cDNAs) or of the levels of the EAATl, EAAT2 and / or EGF proteins, or of the level of glutamic acid, determined in the sample of the subject under study with the levels of a control sample (i.e., with the reference values).
  • the expression levels of the EAATl, EAAT2 and / or EGF genes, as well as the levels of the EAATl, EAAT2 and / or EGF proteins, or glutamic acid can be determined by the techniques mentioned previously in samples of subjects without demyelinating diseases or without medical records of demyelinating diseases.
  • a increase in the levels of expression of the EAATl, EAAT2 and / or EGF genes, or of the levels of the EAATl, EAAT2 and / or EGF proteins, or of the level of glutamic acid, in the sample of the subject under study with respect to Corresponding levels in the control sample is indicative of a demyelinating disease, for example, MS.
  • the nucleotide sequences of the EAAT1, EAAT2 and EGF genes as well as the amino acid (peptide) sequences of said proteins and antibodies capable of binding to said proteins or fragments thereof containing specific antigenic determinants of said proteins can be used to detect ( diagnose) in vitro a demyelinating disease in a subject, or to determine in vitro the state or severity of said demyelinating disease, or to determine in vitro the effect of treatment in a subject presenting a demyelinating disease.
  • the invention relates to the use of a nucleotide sequence of a gene to detect (diagnose) in vitro a demyelinating disease in a subject, or to determine in vitro the state or severity of said demyelinating disease, or to determine in vitro the effect of the treatment on a subject presenting a demyelinating disease, in which said gene is selected from the EAATl gene, the EAAT2 gene and the EGF gene.
  • said demyelinating disease is MS.
  • Said nucleotide sequence may be a probe complementary to a nucleotide sequence present in said EAAT1, EAAT2 or EGF genes, useful for detecting said nucleotide sequence of said genes.
  • the invention relates to the use of a peptide sequence of a protein to detect (diagnose) in vitro a demyelinating disease in a subject, or to determine in vitro the state or severity of said demyelinating disease, or to determine in In vitro, the effect of treatment on a subject presenting a demyelinating disease, wherein said protein is selected from EAATl, EAAT2 and EGF proteins.
  • said demyelinating disease is MS.
  • Said peptide sequence may be a sequence comprising an epitope of said EAAT1, EAAT2 or EGF proteins.
  • the invention relates to the use of an antibody to detect (diagnose) in vitro a demyelinating disease in a subject, or to determine in vitro the state or severity of said demyelinating disease, or to determine in vitro the effect of treatment in a subject presenting a demyelinating disease, wherein said antibody is an antibody capable of binding to a protein selected from EAAT1, EAAT2 and EGF or fragments thereof containing antigenic determinants of said proteins.
  • Such antibodies may be recombinant antibodies, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, intact, or fragments thereof that retain the ability to bind to said proteins (EAATl, EAAT2 or EGF), for example, Fab fragments, scFv, etc., human antibodies, Humanized or of non-human origin.
  • said demyelinating disease is MS.
  • the invention relates to the use of the enzyme glutamic acid dehydrogenase to detect (diagnose) in vitro a demyelinating disease in a subject, or to determine in vitro the state or severity of said demyelinating disease, or to determine in vitro the effect of treatment on a subject who has a demyelinating disease.
  • said demyelinating disease is MS.
  • Said nucleotide sequence of a gene selected from the EAATl, EAAT2 and EGF genes, as well as said amino acid sequence of a protein selected from EAATl, EAAT2 and EGF and said antibody capable of binding to a protein selected from EAATl, EAAT2 and EGF (or fragments thereof containing antigenic determinants) can be used in the screening, search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for the treatment of demyelinating diseases, for example, of MS.
  • the invention relates to a method for screening, search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for the treatment of demyelinating diseases comprising (i) contacting a cellular system that expresses a gene with the compound to be tested, and (ii) evaluate the expression of said gene, so that if said gene is overexpressed the compound Assayed is a compound potentially useful for the treatment of demyelinating diseases, wherein said gene is selected from the EAAT1, EAAT2, EGF genes and combinations thereof.
  • Said cellular system can be practically any cellular system (eg, cell) that naturally or recombinantly expresses a gene selected from the EAAT1, EAAT2, EGF genes and combinations thereof.
  • the expression of said genes can be evaluated by any conventional method, for example, by quantifying the mRNAs that express said genes or their corresponding cDNAs, or by quantifying said EAATl, EAAT2 or EGF proteins by any of the mentioned methods. previously.
  • a compound increases the expression of EAAT1, EAAT2 or EGF, said compound becomes a potentially useful candidate for the treatment of demyelinating diseases, for example, MS, in particular, a candidate potentially useful for the treatment of the neurodegenerative phase of diseases. demyelinating, for example, MS.
  • the level of glutamic acid can also be used in the screening, search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for the treatment of demyelinating diseases, for example, of MS.
  • the invention relates to a method for screening, search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for the treatment of demyelinating diseases comprising (i) contacting a cellular system that produces acid glutamic acid with the compound to be tested, and (ii) evaluate the expression of glutamic acid, so that if the level of glutamic acid is decreased, the compound tested is a compound potentially useful for the treatment of demyelinating diseases.
  • Said cellular system can be practically any cellular system (eg, cell) that produces, naturally or recombinantly, glutamic acid.
  • the production of glutamic acid can be evaluated by any conventional method, for example, by enzymatic methods using the enzyme glutamic acid dehydrogenase as previously mentioned.
  • a compound decreases the production of glutamic acid, said compound becomes a potentially useful candidate for the treatment of demyelinating diseases, for example, MS, in particular, a candidate potentially useful for the treatment of the neurodegenerative phase of demyelinating diseases, for example, MS.
  • the invention relates to the use of (i) a nucleotide sequence of a gene selected from the EAATl, EAAT2 and EGF genes, or of (ii) an amino acid sequence of a protein selected from EAATl, EAAT2 and EGF, or (iii) an antibody capable of binding to a protein selected from
  • EAATl EAAT2 and EGF (or fragments thereof containing antigenic determinants), in a method of screening, search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for the treatment of demyelinating diseases, for example, MS.
  • the invention in another aspect, relates to an in vitro method for the identification and evaluation of the efficacy of treatments of demyelinating diseases, for example, MS.
  • the method contemplates the quantification of glutamic acid levels and the levels of EAATl, EAAT2 and / or EGF proteins or the levels of expression of the EAATl, EAAT2 and / or EGF genes in the same subject along the same different phases or stages of the disease, or during periods of treatment and absence thereof, and its comparison with control values considered normal or with previous values of the same patient.
  • an agent When an agent lowers glutamic acid levels or increases the expression of EAATl, EAAT2 or EGF, that agent becomes a candidate for the treatment of demyelinating diseases, and in particular a candidate for the treatment of the neurodegenerative phase of the demyelinating diseases, for example, of MS.
  • Compounds that block the inhibition of the expression or activity of a glutamic acid transporter selected from the EAATl and EAAT2 transporters, as well as compounds that promote or enhance the expression of the EAATl and / or EAAT2 transporters, and compounds that decrease the levels of Glutamic acid can be used in the treatment of demyelinating diseases, for example, MS, in particular, in the treatment of the neurodegenerative phase of said diseases.
  • Illustrative, non-limiting examples of said compounds include cytotoxic agents, chemotherapeutic agents, including organic and inorganic molecules, peptides, phosphopeptides, antibiotics and growth factors that promote the expression of EAAT1 and / or EAAT2 transporters, that is, positive modulators of the expression of said transporters, for example, EGF.
  • cytotoxic agents including organic and inorganic molecules, peptides, phosphopeptides, antibiotics and growth factors that promote the expression of EAAT1 and / or EAAT2 transporters, that is, positive modulators of the expression of said transporters, for example, EGF.
  • chemotherapeutic agents including organic and inorganic molecules, peptides, phosphopeptides, antibiotics and growth factors that promote the expression of EAAT1 and / or EAAT2 transporters, that is, positive modulators of the expression of said transporters, for example, EGF.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a compound that blocks the inhibition of the expression or activity of a glutamic acid transporter selected between the EAAT1 and EAAT2 transporters, or of a compound that promotes or enhances the expression of said EAAT1 and / or EAAT2 transporters, or of a compound that lowers the level of glutamic acid, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients and / or carriers.
  • Illustrative, non-limiting examples of said compounds that block the inhibition of the expression or activity of EAAT1 and / or EAAT2 transporters, or of compounds that promote or enhance the expression of said EAATl and / or EAAT transporters, or of compounds that Decreased levels of glutamic acid include cytotoxic agents, chemotherapeutic agents, including organic and inorganic molecules, peptides, phosphopeptides, antibiotics and growth factors that promote the expression of EAAT1 and / or EAAT2 transporters.
  • said pharmaceutical composition comprises a positive modulator of the expression of said transporters, for example, EGF.
  • the excipients, vehicles and auxiliary substances must be pharmaceutically and pharmacologically tolerable and must be able to be combined with other components of the formulation or preparation and not have any adverse effect on the treated subject.
  • the pharmaceutical compositions may be presented in any form of appropriate administration, for example, in pharmaceutical forms suitable for oral and parenteral administration (including, eg, intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal and intrathecal administration).
  • the formulations can be of a single dose, and will be prepared according to the classic galenic methods.
  • a review of the different pharmaceutical forms of drug administration and their preparation can be found in the book "Galenica Pharmacy Treaty", by C. Faul ⁇ i Trillo, 10 Edition, 1993, Luzán 5, SA de Ediations.
  • the invention relates to the use of a compound that blocks the inhibition of the expression or activity of a glutamic acid transporter selected between the EAAT1 and EAAT2 transporters, or of a compound that promotes the expression of said EAATl transporters. and / or EAAT2, or a compound that lowers the level of glutamic acid, in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of demyelinating diseases, for example, MS, in particular, in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of the neurodegenerative phase of said demyelinating disease.
  • the present invention relates to a kit useful for the implementation of the methodology described herein.
  • said kit may contain the reagents necessary for the detection of glutamic acid levels, or for the detection of mRNA expression levels expressed by EAATl, EAAT2 or EGF, or their corresponding cDNAs, including: a ) the enzyme glutamic acid dehydrogenase (for the detection of glutamic acid); and / or b) one or more antibodies capable of binding to a protein selected from EAAT1, EAAT2 and EGF, or fragments thereof containing antigenic determinants; and / or c) one or more pairs of oligonucleotide primers capable of specifically amplifying a fragment of the mRNAs or cDNAs encoding EAAT1, EAAT2 and EGF.
  • the kit of the invention can be used to detect a demyelinating disease in a subject, or to determine the stage or severity of said disease in a subject, or to monitor the effect of therapy administered to a subject presenting said disease.
  • Electrophysiological records were performed in cultures of 2 to 5 days, following the guidelines indicated in previous work (Patneau et al., 1994, Neuron 12, 357-371).
  • the cells were recorded in a chamber that allows the composition of the extracellular medium to be varied through a constant flow (0.5-1 mL / min).
  • the recording electrodes used were glass capillaries containing specific solutions compatible with cytoplasmic ionic concentrations.
  • the study of responses mediated by glutamic acid transporters was carried out using the whole-cell patch-clamp voltage control technique.
  • the nerves were isolated from young adult rats, and perfused for 30 minutes in artificial cerebrospinal fluid (CSF) saturated in oxygen by bubbling
  • CSF cerebrospinal fluid
  • the optic nerve experiments were performed in rabbits (New Zealand White) which, due to their size, allow a better experimental surgical manipulation.
  • the procedure used is that described previously (Matute, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. 95, 10229-10234).
  • the oligodeoxynucleotides were applied by osmotic micropumps that release small amounts of solute for a certain time. Subsequently, the effect of this application on the nerve was evaluated with a panel of markers of oligodendrocytes and their progenitors, myelin, axonal integrity, astrogliosis and microgliosis.
  • the expression of the glutamic acid transporters EAAT1 and EAAT2 and the epidermal growth factor (EGF) was analyzed by real-time quantitative PCR using the SYBRGreen PCR universal master mix reagent (Applied Biosystems) as a marker.
  • the protein levels of EAATl and EAAT2 were analyzed by immunohistochemistry and conventional Western blot (Domercq et al., 1999, Eur J Neurosci 11, 2226-2236).
  • the functionality of the transporters was determined by tritiated glutamic acid uptake assays in vesicular glial membrane preparations according to the methodology previously described (Nakamura et al., 1993, GHa 9, 48-56).
  • the levels Plasma glutamic acid was determined by an enzymatic assay based on the activity of the enzyme glutamic acid dehydrogenase (Veis et al., 1998, Nature 391, 281-285).
  • tritiated glutamic acid uptake and immunocytochemical assays were used.
  • the antisense oligonucleotides were infused against the GLAST and GLT-I transporter subtypes (aGLAST and aGLT-1, respectively) in the rabbit optic nerve in vivo by osmotic pumps that release very small amounts of solute at 3 days long, after 7 days its effect is analyzed by immunohistochemical techniques.
  • ODNs antisense oligonucleotides
  • Such antisense oligonucleotides effectively decrease the expression of the GLAST and GLT-I transporters in rabbit optic nerve, as observed with the immunhistochemical analysis (Fig. 4A).
  • the application of antisense ODNs against GLT-I induces severe tissue damage and oligodendroglial death (Fig. 4B).
  • this area has an intense gliosis, lack of myelin and axonal damage (Fig. 4B, C, D).
  • the application of antisense ODNs against GLAST produces lesions in more restricted areas characterized mainly by axonal damage (Fig. 4D).
  • the administration of ODNs felt against GLT-I (sGLT-1), used as a control did not produce any alteration in the optic nerves (Fig. 4C, D).
  • EAATl Quantitative PCR analyzed the expression of EAATl, EAAT2 and EAAT3 transcripts in samples from control subjects and patients with MS.
  • EAAT3 levels there is no alteration in EAAT3 levels in the MS samples analyzed (Fig. 5B).
  • the expression of EAAT2 is greater in the optic nerves that present visual alterations compared to the normal-looking nerves (2.5 times more; p ⁇ 0.05; Fig. 6A).
  • EAATl and EAAT2 transporters were used to assess the protein level alteration.
  • the distribution of EAATl and EAAT2 transporters in human optic nerve is similar to that observed in rat white matter tracts (Domercq et al., 1999, Eur J Neurosci 1 1, 2226-2236).
  • the EAATl transporter is located in oligodendrocytes labeled with APC while EAAT2 is distributed in GFAP astrocyte processes (Fig. 7A).
  • Fig. 7A In the optic nerves from patients with MS there is an increase in immunoreactivity without detecting changes in the pattern of expression.
  • oligodendrocytes and white matter tracts have glutamic acid transporters.
  • electrophysiological, pharmacological and molecular properties of these transporters are detailed, as well as the effects that such cells or tracts produce their inhibition.
  • Conveyor blockade is toxic to oligodendrocytes and produces tissue damage and demyelination due to overactivation of glutamatergic receptors reminiscent of the lesions observed in MS. So, Mechanisms aimed at enhancing the expression of transporters can be beneficial in preventing oligodendroglial death and axonal damage.
  • Glutamic acid transporters can be blocked by oxidative stress, as well as by pro-inflammatory cytokines such as TNF ⁇ , which would cause alterations in the concentration of glutamic acid.
  • transporters have a dynamic regulation mechanism to increase their expression when there is an alteration in glutamic acid homeostasis. Since the levels of glutamic acid are increased in patients with MS, in this pathology there is an increase in the expression of the EAATl and EAAT2 transporters to try to recover the levels of glutamic acid and, therefore, alleviate the damage.
  • the most potent positive modulator of the expression of the EAAT1 and EAAT2 transporters is EGF, whose expression is elevated in both blood and optic nerve, indicating its suitability as a therapeutic tool to prevent excitotoxicity in said disease.
  • the invention described here constitutes, first of all, a diagnostic marker for MS that allows the patient's clinical status to be correlated with a variable such as the level of glutamic acid or expression of the EAAT1 and EAAT2 transporters and the EGF factor.
  • Biological markers in body fluids such as cerebrospinal fluid and blood can provide an objective biological indicator of the patient's prognosis and give the patient more information about future attacks.
  • markers of inflammatory activity there are different types of markers of inflammatory activity, however there are no markers of axonal damage or the neurodegenerative phase of the disease (Teunissen et al., 2005, Lancet 4, 32-41).
  • Glutamic acid has been related to the neurodegenerative phase since it produces oligodendroglial death (Matute et al., 1997, Proc Nati Acad Sci USA 94, 8830-8835) and that its levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with MS ( Stover et al., 1997, Eur J Clin Invest 27, 1038-1043; Sarchielli et al., 2003, Arch Neurol 60, 1082-1088). However, the origin of the alteration of glutamic acid homeostasis in MS is not yet known.
  • the increases in the CNS level are due to an alteration in the blood brain barrier, as a consequence of the immune attack, which would condition the entry of glutamic acid from the blood system to the given brain.
  • the existence of a positive gradient (Westergren et al., 1994, J Neurochem 62, 159-165). Therefore, the monitoring of the molecules involved in glutamatergic signaling such as glutamic acid itself and its blood transporters constitute a potential marker for the prognosis and for the study of demyelinating diseases.
  • a preferred embodiment of the invention contemplates said parameters as MS markers.
  • the positive modulators of the transcription of the transporters such as the molecules that signal through the EGF receptor pathway, among them the EGF factor, act by decreasing the extracellular concentration of glutamic acid and therefore preventing cell damage.
  • This may constitute a defense mechanism that exists endogenously and that contributes to the restoration of balance in the face of any stimulus or insult that produces alterations in glutamic acid levels. Therefore, the invention contemplates enhancing these defense mechanisms by external contribution of factors that promote the expression of EAAT1 and EAAT2 as EGF.

Abstract

La presente invención se refiere al uso de los transportadores de ácido glutámico, del ácido glutámico y de EGF para detectar la presencia de enfermedades desmielinizantes en un sujeto, para determinar el estado o severidad de las mismas, o para monitorizar los efectos de una terapia en un sujeto que sufra dichas enfermedades; al uso de dichos marcadores para la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de dichas enfermedades con el propósito de desarrollar nuevos medicamentos; al uso de compuestos que promuevan la expresión de los transportadores EAAT1 y EAAT como el factor EGF para el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes. Los métodos y compuestos de la invención son preferentemente de aplicación para la EM.

Description

MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO Y PRONÓSTICO DE LAS
ENFERMEDADES DESMIELINIZANTES Y PARA EL DESARROLLO DE
MEDICAMENTOS CONTRA LAS ENFERMEDADES DESMIELINIZANTES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se enmarca en el ámbito de las enfermedades desmielinizantes, preferentemente en el de la esclerosis múltiple, y se relaciona con el empleo de los transportadores de ácido glutámico como marcadores de las enfermedades mencionadas y con el empleo de sustancias potenciadoras de la expresión de dichos transportadores para el tratamiento de las enfermedades antedichas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) más frecuente. Afecta a un millón y medio de personas en el mundo, y sus síntomas aparecen en general en adultos jóvenes, por lo que sus consecuencias a nivel personal y socioeconómico son muy graves.
Se piensa que la susceptibilidad a la EM se debe a factores genéticos y ambientales desconocidos. La preval encia de la enfermedad se sitúa entre 50 a 100 personas por cada 100.000 habitantes en las regiones de alto riesgo, que se localizan principalmente en las zonas septentrionales del hemisferio norte, en Europa y América. El riesgo a padecer EM aumenta 10-20 veces en parientes de primer grado de enfermos, y la concordancia entre gemelos monocigóticos (idénticos genéticamente) se eleva hasta el 30-35%, mientras que gemelos dicigóticos sólo alcanza el 2-5%. La susceptibilidad genética no está caracterizada. Hasta el momento se tienen evidencias de que puede residir en algún polimorfismo de los genes que codifican antígenos leucocitarios humanos (HLA), glicoproteína oligodendrocítica de la mielina (MOG) y otros genes de los cromosomas 10 y 15. Existe un consenso entre los investigadores de la EM según el cual la enfermedad tiene dos fases; una primaria inflamatoria, de naturaleza autoinmune, y otra secundaria neurodegenerativa progresiva. La fase primaria se inicia con la activación de las células T específicas para mielina, que atraviesan la barrera hematoencefálica. Una vez dentro del SNC, liberan citoquinas proinflamatorias desencadenando una cascada inmunológica que conduce a la destrucción de la mielina y muerte de los oligodendrocitos, en parte reversible tras el brote inflamatorio. El conocimiento con un cierto detalle del proceso autoinmune ha servido para desarrollar agentes de naturaleza inmunomoduladora cuya eficacia terapéutica es muy modesta. Sin embargo, no se ha generado ningún medicamento que retrase o detenga el avance de la fase neurodegenerativa de la enfermedad que cursa con deterioro neurológico progresivo e invalidez, y que se caracteriza por la aparición de lesiones desmielinizantes permanentes y graves en la sustancia blanca con pérdida masiva de oligodendrocitos, atrofia y daño axonal severo.
Hasta ahora se han descrito diversas dianas terapéuticas para la intervención durante la fase inflamatoria de la EM (Zamvil y Steinman, 2003, Neuron 38, 685-688). Entre ellas se encuentran las que se dirigen a reducir la inflamación del sistema nervioso iniciada por la activación de células T específicas de mielina, que penetran en el tejido nervioso central y liberan en él citoquinas proinflamatorias como el interferón-γ y el factor de la necrosis tumoral-α. En este sentido, el inmunomodulador interferón-β, aprobado para el tratamiento de la EM remitente-recurrente, previene las interacciones celulares que llevan a la penetración de las células T activadas a través del endotelio vascular. Otros tratamientos en fase de ensayo clínico están dirigidos a neutralizar la actividad de las citoquinas proinflamatorias y/o a potenciar las antiinflamatorias. Un estudio reciente realizado en un modelo animal de EM, la encefalitis autoinmune experimental (EAE; Youssef y cois., 2002, Nature 420, 78-84), ha puesto de manifiesto que el medicamento atorvastatina empleado en el tratamiento de la hipercolesterolemia, es también un potente inmunomodulador que puede prevenir o revertir la EAE crónica mediante la potenciación de la secreción de citoquinas antiinflamatorias y la inhibición de la producción de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, no existe ninguna diana terapéutica para la intervención durante la fase secundaria progresiva, la cual está más relacionada con la degeneración irreversible del SNC del paciente.
Un hallazgo importante de los últimos años que ha contribuido a entender la etiología de la EM ha sido el descubrimiento de la sensibilidad de los oligodendrocitos al ácido glutámico (Matute y cois., 2001, TINS 24, 224-230). Así, la estimulación de los receptores glutamatérgicos de los subtipos ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- isoxazolpropiónico (AMPA) y kainato en oligodendrocitos induce la muerte de los mismos, fenómeno conocido como excitotoxicidad oligodendroglial (Matute y cois., 1997, Proc Nati Acad Sci USA 94, 8830-8835; McDonald y cois., 1998, Nat Med 4, 291-297). Además, la aplicación de agonistas de dichos receptores en animales in vivo provoca una atrofia del nervio óptico asociada a una desmielinización masiva, que recuerda a lo acontecido en la EM (Matute, 1998, Proc Nati Acad Sci USA 95, 10229- 10234). La hipótesis de la implicación de la excitoxicidad oligodendroglial en la EM ha sido posteriormente reforzada tras el hallazgo de que los antagonistas de los receptores AMPA y kainato reducen la severidad y previenen la aparición de brotes en animales con EAE (Smith y cois., 2000, Nat Med 6,62-66; Pitt y cois., 2000, Nat Med 6, 67-70). Dichos estudios indican que como consecuencia de la reacción inmune en la EAE se produce una alteración en la homeostasis de ácido glutámico que conlleva una sobreactivación de los receptores glutamatérgicos y muerte oligodendroglial.
Al igual que en la EAE, la homeostasis del ácido glutámico en la EM está alterada, lo que apoya la hipótesis glutamatérgica de la EM. Así, los niveles de ácido glutámico están incrementados en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EM aguda (Stover y cois., 1997, Eur J Clin Invest 27, 1038-1043) y EM secundaria progresiva (Sarchielli y cois., 2003, Arch Neurol 60, 1082-1088), así como en suero antes del comienzo del brote (Westall y cois., 1980, J Neurol Sci 47, 353-364). Además, la expresión de las enzimas glutamina sintetasa y ácido glutámico deshidrogenasa, responsables de la degradación del ácido glutámico, se encuentra reducida mientras que la enzima glutaminasa, productora de ácido glutámico, está elevada en la sustancia blanca proveniente de pacientes con EM (Weraer y cois., 2001, Ann Neurol 50, 169-180), sugiriendo una alteración en los niveles de dicho neurotransmisor. Sin embargo, se sabe poco sobre la expresión y función de los transportadores de ácido glutámico en la EM.
Los transportadores de ácido glutámico (EAATs) son los responsables de mantener bajos los niveles extracelulares de dicho aminoácido y, en particular, a nivel sináptico, lo que permite mantener una relación señal-ruido adecuada y evitar la sobreactivación de los receptores glutamatérgicos y la muerte celular (Danbolt, 2001, Prog Neurobiol 65, 1-105). Hasta la fecha, han sido clonados 5 subtipos de EAATs (Arriza y cois., 1994, Proc Nati Acad Sci USA 94, 4155-4160; Danbolt, 2001, Prog Neurobiol 65, 1- 105). Los subtipos EAATl y EAAT2 (y sus homólogos en rata GLAST y GLT-I) se expresan principalmente en células de origen glial, EAAT3 (y su homólogo en rata EAACl) y EAAT4 en neuronas, y EAAT5 se localiza exclusivamente en retina. Los transportadores de ácido glutámico se encuentran ampliamente distribuidos por el cerebro y médula espinal (Danbolt, 2001, Prog Neurobiol 65, 1-105) así como en tractos de sustancia blanca, como el nervio óptico (Domercq y cois., 1999, Eur J Neurosci 11, 2226-2236). La recaptación del ácido glutámico extracelular tiene lugar mayoritariamente a través de los transportadores gliales y el bloqueo de los mismos da lugar a procesos de neurodegeneración crónica como resultado del incremento en la concentración extracelular de ácido glutámico (Rothstein y cois., 1996, Neuron 16:675- 686). De hecho, los ratones deficientes en el transportador GLT-I desarrollan una actividad epiléptica espontánea letal y presentan una mayor susceptibilidad al daño cortical agudo (Tanaka y cois., 1997, Science 276, 1699-1702). Dado el papel esencial de los transportadores EAATl /GLAST y EAAT2/GLT-1, es posible que una alteración en su expresión o función pueda contribuir a incrementar los niveles de ácido glutámico que acontecen en algunas patologías del SNC, como las enfermedades desmielinizantes.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
El objetivo principal de la presente invención es proporcionar un método in vitro para detectar la presencia de enfermedades desmielinizantes, y en particular de la EM, para determinar el pronóstico de las mismas, y para monitorizar el efecto de los tratamientos usados para dichas enfermedades. Un objetivo adicional consiste en proporcionar una serie de compuestos para el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes, y en particular de la EM.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que la inhibición de la actividad de los transportadores de ácido glutámico produce muerte oligodendroglial in vitro y daños neurológicos in vivo como desmielinización y daño axonal, que son característicos de la fase neurodegenerativa de la EM; en el descubrimiento de que la expresión de dichos transportadores está regulada por los niveles de ácido glutámico; y en el descubrimiento de que los niveles de ácido glutámico y los niveles de expresión de los transportadores EAATl y EAAT2 están incrementados en muestras de sangre así como en muestras de nervio óptico post-mortem de pacientes con EM con respecto a pacientes controles no afectados de EM, constituyendo dicha sobreexpresión un mecanismo de respuesta debido al incremento de los niveles de ácido glutámico y producido por el factor de crecimiento epidérmico (EGF), modulador positivo de la transcripción de EAATl y EAAT2.
Por tanto, la invención se relaciona, en general, con el uso de los transportadores EAATl y EAAT2, del ácido glutámico y/o del modulador EGF como marcadores de enfermedades desmielinizantes y, en particular, de la EM, así como a métodos y kits para la puesta en práctica de la presente invención.
En un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad, que comprende el empleo de los EAATl y EAAT2, del ácido glutámico y/o del modulador EGF como marcadores de enfermedades desmielinizantes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre el gen EAATl, el gen EAAT2 y el gen EGF, o de una secuencia peptídica de una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF, o de un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinante antigénicos, o de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa, para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes basado en la cuantificación de un gen seleccionado entre los genes EAATl, EAAT2, EGF y combinaciones de los mismos, o en la cuantificación de los niveles de ácido glutámico.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de (i) una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre los genes EAATl, EAAT2 y EGF, o de (ii) una secuencia aminoacídica de una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF, o de (iii) un anticuerpo con capacidad para unirse a mía proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinante antigénicos, en un método de screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación y evaluación de la eficacia de tratamientos de enfermedades desmielinizantes que comprende la cuantificación de los niveles de ácido glutámico, o la cuantificación de los niveles de proteínas EAATl, EAAT2 y/o EGF, o la cuantificación de los niveles de expresión de los genes EAATl, EAAT2 y/o EGF en un mismo sujeto a lo largo de las distintas fases o etapas de la enfermedad, o durante los periodos de tratamiento y de ausencia del mismo, y su comparación con valores control considerados normales o con valores previos del mismo paciente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAATl y EAAT2, o de un compuesto que promueve o potencia la expresión de dichos transportadores EAATl y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende un modulador positivo de la expresión de los transportadores EAATl y EAAT2, tal como el EGF.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAATl y EAAT2, o de un compuesto que promueve o potencia la expresión de dichos transportadores EAATl y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, tal como un kit apropiado para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra las propiedades electrofisiológicas de los transportadores de ácido glutámico en oligodendrocitos en cultivo. La aplicación de ácido glutámico y de aspartato produce una comente lenta, no desensitizante, inhibida al sustituir el Na extracelular por Li+ y en presencia del inhibidor TBOA, y potenciada en presencia de iones SCN" a nivel intracelular. Las características farmacológicas indican la expresión de los subtipos EAAT1/GLAST y EAAT2/GLT-1.
La figura 2 pone de manifiesto que la inhibición de los transportadores de ácido glutámico produce muerte oligodendroglial in vitro. La muerte se produce debido a la activación de los receptores AMPA/Kainato dado que se potencia en presencia de ciclotiazida y concanavalina A, inhibidores de la desensitización de los receptores AMPA y Kainato respectivamente, y se bloquea en presencia de CNQX, antagonista de los receptores AMPA/kainato.
La figura 3 demuestra que la inhibición de los transportadores de ácido glutámico en nervio óptico in situ da lugar a alteraciones en la homeostasis de ácido glutámico, que producen muerte oligodendroglial por sobreactivación de los receptores AMPA/Kainato.
La figura 4 muestra cómo la infusión lenta (1 μl/hora; 3 días) de oligonucleótidos antisentido contra el transportador GLT-I (1 μM) produce lesiones en el nervio óptico, en las que se aprecia daño tisular con microgliosis, así como desaparición de la mielina en el área dañada y rotura de los axones.
La figura 5 pone de manifiesto que los niveles de RNA codificante para EAATl y EAAT2 están elevados en nervio óptico de pacientes con MS.
La figura 6 demuestra que los niveles de EAAT2 se encuentran incrementados sólo en los nervios ópticos con alteraciones visuales, tales como neuritis óptica, y que la expresión de EAAT2 se correlaciona con EGF, modulador positivo de su transcripción.
La figura 7 muestra la expresión in situ de transportadores de ácido glutámico en nervio óptico humano post-mortem. Se pone de manifiesto que los niveles proteicos de EAATl y EAAT2 así como la funcionalidad de los mismos se encuentran elevados en nervio óptico de pacientes con EM.
La figura 8 muestra que los niveles de ácido glutámico así como los niveles de EAATl y EAAT2 se encuentran elevados a nivel periférico, en muestras de sangre provenientes de pacientes con EM. Dichos incrementos se deben al efecto del modulador positivo EGF, que también se encuentra incrementado en dichas muestras. La figura 9 demuestra que la estimulación con ácido glutámico en nervio óptico in situ es suficiente para inducir un incremento en la expresión de los transportadores EAATl (GLAST) y EAAT2 (GLT-I), y que dichos incrementos van acompañados de incrementos en el modulador positivo EGF.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Para facilitar la comprensión de la invención objeto de la presente solicitud de patente, a continuación se expone el significado de algunos términos y expresiones en el contexto de la invención:
El término "sujeto" se refiere a un miembro de una especie de un animal mamífero, e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.
La expresión "enfermedades desmielinizantes" se refiere a aquellas enfermedades en las que el proceso patogénico provoca la destrucción de la mielina, que es la capa lipoproteica que recubre los nervios y facilita la transmisión de los impulsos a través de las fibras nerviosas; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades desmielinizantes incluyen: esclerosis múltiple (EM), síndrome de Devic, enfermedad de Baló, enfermedad de Marchiafava-Bignami, mielinolisis central pontina, encefalomielitis aguda diseminada y encefalomielitis hemorrágica necrotizante aguda.
El término "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones post-traduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación o acetilación.
El término "anticuerpo" se refiere a una proteína con capacidad de unión específica a un "antígeno". El término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos que conservan la capacidad de unirse al antígeno, anticueφos recombinantes, combibodies, etc., tanto humanos o humanizados como de origen no humano.
El término "oligonucleótido cebador", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una secuencia nucleotídica, que es complementaria de una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAATl) [gen EAATl], el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) [gen EAAT2] y el gen que codifica el factor de crecimiento epidérmico (EGF) [gen EGF]. Cada cebador híbrida con su secuencia nucleotídica diana y actúa como un sitio de inicio para la polimerización del ADN.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que la expresión de los genes EAATl y/o EAAT2 así como la de sus correspondientes proteínas está incrementada en pacientes con EM con respecto a sujetos control; en el descubrimiento de que los niveles de ácido glutámico en pacientes con EM están incrementados con respecto a sujetos control; y en el descubrimiento de que la expresión del gen que codifica el EGF, modulador positivo del promotor de los transportadores, así como la proteína correspondiente, están incrementados en pacientes con EM con respecto a sujetos control.
En consecuencia, la evaluación y comparación de los niveles de los genes EAATl y/o EAAT2 así como de sus correspondientes proteínas, y/o la evaluación y comparación del nivel del gen que codifica el EGF así como el de la proteína correspondiente (EGF), y/o la evaluación y comparación de los niveles de ácido glutámico en una muestra biológica de un sujeto puede ser utilizada con fines diagnósticos o de pronóstico de enfermedades desmielinizantes en general, y, en particular, de EM. A modo ilustrativo, un nivel elevado de dichos marcadores respecto a los niveles de sujetos control (es decir, sujetos sin historial clínico de enfermedades desmielinizantes y/o que no presentan enfermedades desmielinizantes, e.g., EM) o con valores normales de referencia (obtenidos, en general, a partir de sujetos control) es indicativo de una enfermedad desmielinizante, o de un mayor riesgo o predisposición de un sujeto a desarrollar dicha enfermedad. La comparación de los niveles de dichos marcadores, en un momento dado, en un sujeto, diagnosticado o no de una enfermedad desmielinizante, con los de muestras previas del mismo sujeto puede ser indicativo de la evolución y pronóstico de dicha enfermedad desmielinizante o de su predisposición a desarrollar dicha enfermedad.
El hallazgo previamente mencionado puede ser utilizado, entre otras aplicaciones, en ensayos de diagnóstico o de evaluación del riesgo o predisposición de un sujeto a desarrollar una enfermedad desmielinizante, en ensayos de pronóstico, en ensayos de monitorización del efecto de la terapia administrada a un sujeto para analizar la eficacia de la terapia y la evolución de la enfermedad, y en ensayos de screening de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
La invención proporciona, por consiguiente, métodos para detectar y cuantifϊcar la expresión de los genes EAATl y EAAT2 y del gen que codifica el EGF, y la de sus correspondientes proteínas, así como para detectar y cuantificar los niveles de ácido glutámico en una muestra biológica. La invención también proporciona métodos para detectar interacciones entre dichos productos y otros compuestos, por ejemplo, antagonistas.
En un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad, en adelante método de la invención, que comprende:
a) cuantificar el nivel de expresión de un gen en una muestra de dicho sujeto, en donde dicho gen se selecciona entre el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAATl) [gen EAATl], el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) [gen EAAT2] y el gen que codifica el factor de crecimiento epidérmico (EGF) [gen EGF], y combinaciones de los mismos; y
b) comparar dicho nivel con el de una muestra de control; en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante;
o, alternativamente,
a) cuantifícar el nivel de una proteína en una muestra de dicho sujeto, en donde dicha proteína se selecciona entre el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAATl), el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF), y combinaciones de las mismas; y
b) comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante;
o, alternativamente,
a) cuantifícar el nivel de ácido glutámico en una muestra de dicho sujeto; y
b) comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante.
El método proporcionado por esta invención presenta una alta sensibilidad y especificidad, y se basa en el hecho de que los sujetos con diagnóstico de una enfermedad desmielinizante, especialmente EM, presentan altos niveles de ácido glutámico y de ARNm codificante para los genes EAATl, EAAT2 y/o EGF, y/o concentraciones elevadas de las proteínas EAATl, EAAT2 y/o EGF, en comparación con los niveles en muestras de sujetos control sin ningún historial clínico de enfermedad desmielinizante. Para la puesta en práctica del método de la invención, se obtiene una muestra biológica del sujeto a estudiar. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas muestras incluyen distintos tipos de fluidos biológicos, tales como sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal, heces, orina y saliva, así como muestras de tejidos. Las muestras de fluidos biológicos pueden ser obtenidas por cualquier método convencional al igual que las muestras de tejidos; a modo ilustrativo dichas muestras de tejidos pueden ser muestras de biopsias obtenidas por resección quirúrgica. Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos diagnosticados previamente con una enfermedad desmielinizante (pacientes), por ejemplo, EM, o bien de sujetos no diagnosticados, o bien de pacientes bajo tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, o bien de pacientes que han sido previamente tratados de las mismas.
En una realización particular, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de expresión de un gen seleccionado entre el gen EAATl, el gen EAAT2 y el gen EGF, y combinaciones de los mismos, en una muestra de dicho sujeto y su comparación con el de una muestra de control, en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante, por ejemplo, EM. El método de la invención incluye la posibilidad de cuantificar no sólo el nivel de uno sólo de dichos genes, sino la posibilidad de cuantificar los niveles de dos de dichos genes, e incluso de dichos tres genes.
El nivel de expresión de un gen puede ser cuantificado mediante la cuantificación del nivel de ARNm codificante de dicho gen, o, alternativamente, del nivel del ADN complementario (ADNc) a dicho ARNm. En este caso, el método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener el RNA total, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales (Chomczynski y cois., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532).
Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm codificantes para EAATl, EAAT2 y/o EGF o de sus ADNc correspondientes. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm codificantes para dichos genes pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNm y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesis y tinción, o alternativamente, mediante Southern blot y empleo de sondas apropiadas, Northern blot y empleo de sondas específicas del ARNm del gen de interés (EAATl, EAAT2 o EGF) o de sus ADNc correspondientes, mapeo con la nucleasa Sl, RT-LCR, hibridación, microarrays, etc., preferentemente, mediante PCR cuantitativa a tiempo real usando un marcador apropiado (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción). Análogamente, los niveles de los ADNc correspondientes a dichos ARNm codificantes para EAATl, EAAT2 y/o EGF también pueden ser cuantificados mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc; en una realización particular, la amplificación se lleva a cabo de manera cualitativa o cuantitativa, mediante PCR, usando oligonucleótidos cebadores que amplifican específicamente regiones de los genes EAATl, EAAT2 o EGF.
En otra realización particular, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de una proteína seleccionada entre las proteínas EAATl, EAAT2 y EGF, y combinaciones de las mismas, en una muestra de dicho sujeto y su comparación con el de una muestra de control, en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante, por ejemplo, EM. El método de la invención incluye la posibilidad de cuantificar no sólo el nivel de una sola de dichas proteínas, sino la posibilidad de cuantificar los niveles de dos de dichas proteínas, e incluso de dichas tres proteínas.
El nivel (concentración) de dichas proteínas EAATl, EAAT2 y/o EGF puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dichas proteínas en una muestra de un sujeto. En este caso, el método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener un extracto proteico que contenga dichas proteínas, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales (Chomczynski y cois., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532). Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de EAATl, EAAT2 y/o EGF. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dichas proteínas pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a EAATl, EAAT2 o EGF (o a fragmentos de las mismas que contengan determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos formados. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS- ELISA (ELISA sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar dichas proteínas EAATl, EAAT2 o EGF, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, etc.
En una realización particular, la cuantificación de los niveles de EAATl, EAAT2 y/o EGF se lleva a cabo mediante el empleo de anticuerpos con capacidad para unirse a EAATl, EAAT2 o EGF (o a fragmentos de las mismas que contengan determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos formados, por ejemplo, mediante técnicas inmunoquímicas que permitan la cuantificación de la unión antígeno- anticuerpo, por ejemplo, Western blot, ELISA, biochips de proteína, etc.; preferentemente, la cuantificación de los niveles de EAATl, EAAT2 y/o EGF se lleva a cabo mediante Western blot utilizando anticuerpos apropiados capaces de unirse a dichas proteínas [existen anticuerpos comerciales con capacidad para unirse a dichas proteínas (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción)]. La funcionalización de los transportadores EAATl y EAAT2 puede ser determinada por métodos convencionales, por ejemplo, mediante ensayos de captación de ácido glutámico en preparados vesiculares de membrana glial (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción)].
En otra realización particular, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de ácido glutámico en una muestra de dicho sujeto y su comparación con el de una muestra de control, en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante.
El nivel (concentración) del ácido glutámico puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dicho compuesto en una muestra de un sujeto. Preferentemente, el nivel de ácido glutámico se determina en una muestra de sangre, plasma o suero del sujeto, por lo que, en este caso, el método de la invención puede incluir la realización de un tratamiento previo para separar el plasma o el suero, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales.
Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar el nivel de ácido glutámico. A modo ilustrativo, no limitativo, el nivel de dicho compuesto puede ser cuantificado mediante métodos enzimáticos, por ejemplo, mediante una reacción enzimática utilizando la enzima ácido glutámico deshidrogenasa (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción).
El método de la invención también comprende la etapa de comparar los niveles de expresión de los genes EAATl, EAAT2 y/o EGF, (obtenidos, por ejemplo, mediante cuantificación de los niveles de los ARNm correspondientes a dichos genes, o de sus ADNc) o de los niveles de las proteínas EAATl, EAAT2 y/o EGF, o del nivel de ácido glutámico, determinados en la muestra del sujeto objeto de estudio con los niveles de una muestra de control (es decir, con los valores de referencia). Los niveles de expresión de los genes EAATl, EAAT2 y/o EGF, así como los niveles de las proteínas EAATl, EAAT2 y/o EGF, o de ácido glutámico, pueden ser determinados por las técnicas mencionadas previamente en muestras de sujetos sin enfermedades desmielinizantes o sin historiales clínicos de enfermedades desmielinizantes. Un incremento en los niveles de expresión de los genes EAATl, EAAT2 y/o EGF, o de los niveles de las proteínas EAATl, EAAT2 y/o EGF, o del nivel de ácido glutámico, en la muestra del sujeto objeto de estudio respecto a los niveles correspondientes en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante, por ejemplo, EM.
Las secuencias nucleotídicas de los genes EAATl, EAAT2 y EGF así como las secuencias aminoacídicas (peptídicas) de dichas proteínas y anticuerpos con capacidad de unirse a dichas proteínas o fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos específicos de dichas proteínas pueden ser utilizadas para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una secuencia nucleotídica de un gen para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante, en el que dicho gen se selecciona entre el gen EAATl, el gen EAAT2 y el gen EGF. En una realización particular, dicha enfermedad desmielinizante es EM. Dicha secuencia nucleotídica puede ser una sonda complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en dichos genes EAATl , EAAT2 o EGF, útil para detectar dicha secuencia de nucleótidos de dichos genes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una secuencia peptídica de una proteína para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante, en el que dicha proteína se selecciona entre las proteínas EAATl, EAAT2 y EGF. En una realización particular, dicha enfermedad desmielinizante es EM. Dicha secuencia peptídica puede ser una secuencia que comprende un epítopo de dichas proteínas EAATl, EAAT2 o EGF. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un anticuerpo para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos de dichas proteínas. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos que conservan la capacidad de unirse a dichas proteínas (EAATl, EAAT2 o EGF), por ejemplo, fragmentos Fab, scFv, etc., anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano. En una realización particular, dicha enfermedad desmielinizante es EM.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante. En una realización particular, dicha enfermedad desmielinizante es EM.
Dicha secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre los genes EAATl, EAAT2 y EGF, así como dicha secuencia aminoacídica de una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF y dicho anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF (o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos) pueden ser utilizados en el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, de EM.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que expresa un gen con el compuesto a ensayar, y (ii) evaluar la expresión de dicho gen, de manera que si se sobreexpresa dicho gen el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, en donde dicho gen se selecciona entre los genes EAATl, EAAT2, EGF y combinaciones de los mismos. Dicho sistema celular puede ser prácticamente cualquier sistema celular (e.g., célula) que expresa de forma natural o recombinante un gen seleccionado entre los genes EAATl, EAAT2, EGF y combinaciones de los mismos. La expresión de dichos genes puede ser evaluada por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante la cuantificación de los ARNm que expresan dichos genes o sus ADNc correspondientes, o bien mediante la cuantificación de dichas proteínas EAATl, EAAT2 o EGF por cualquiera de los métodos mencionados previamente. Cuando un compuesto aumente la expresión de EAATl, EAAT2 o EGF, dicho compuesto se convierte en un candidato potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, en particular, un candidato potencialmente útil para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM.
Por otra parte, el nivel de ácido glutámico también puede ser utilizado en el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, de EM.
En consecuencia, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que produce ácido glutámico con el compuesto a ensayar, y (ii) evaluar la expresión de ácido glutámico, de manera que si se disminuye el nivel de ácido glutámico el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes. Dicho sistema celular puede ser prácticamente cualquier sistema celular (e.g., célula) productor, de forma natural o recombinante, ácido glutámico. La producción de ácido glutámico puede ser evaluada por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante métodos enzimáticos utilizando la enzima ácido glutámico deshidrogenasa tal como se ha mencionado previamente. Cuando un compuesto disminuya la producción de ácido glutámico, dicho compuesto se convierte en un candidato potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, en particular, un candidato potencialmente útil para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de (i) una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre los genes EAATl, EAAT2 y EGF, o de (ii) una secuencia aminoacídica de una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF, o de (iii) un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre
EAATl, EAAT2 y EGF (o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos), en un método de screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación y evaluación de la eficacia de los tratamientos de las enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM. El método contempla la cuantificación de los niveles de ácido glutámico y de los niveles de proteínas EAATl, EAAT2 y/o EGF o bien de los niveles de expresión de los genes EAATl, EAAT2 y/o EGF en un mismo sujeto a lo largo de las distintas fases o etapas de la enfermedad, o durante los periodos de tratamiento y de ausencia del mismo, y su comparación con valores control considerados normales o con valores previos del mismo paciente. Cuando un agente disminuya los niveles de ácido glutámico o aumente la expresión de EAATl, EAAT2 o EGF, dicho agente se convierte en un candidato para el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes, y en particular en un candidato para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de las enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, de EM.
Compuestos que bloquean la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAATl y EAAT2, así como compuestos que promueven o potencian la expresión de los transportadores EAATl y/o EAAT2, y compuestos que disminuyen los niveles de ácido glutámico, pueden ser utilizados en el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, en particular, en el tratamiento de la fase neurodegenerativa de dichas enfermedades. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos compuestos incluyen agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, incluyendo moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, antibióticos y factores de crecimiento que promueven la expresión de los transportadores EAATl y/o EAAT2, es decir, moduladores positivos de la expresión de dichos transportadores, por ejemplo, EGF.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAATl y EAAT2, o de un compuesto que promueve o potencia la expresión de dichos transportadores EAATl y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos compuestos que bloquean la inhibición de la expresión o la actividad de los transportadores EAATl y/o EAAT2, o de compuestos que promueven o potencian la expresión de dichos transportadores EAATl y/o EAAT, o de compuestos que disminuyen los niveles de ácido glutámico incluyen agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, incluyendo moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, antibióticos y factores de crecimiento que promueven la expresión de los transportadores EAATl y/o EAAT2. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende un modulador positivo de la expresión de dichos transportadores, por ejemplo, EGF.
Los excipientes, vehículos y sustancias auxiliares deben ser farmacéuticamente y farmacológicamente tolerables y han de poder ser combinados con otros componentes de la formulación o preparación y no ejercer ningún efecto adverso sobre el sujeto tratado. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en cualquier forma de administración apropiada, por ejemplo, en formas farmacéuticas adecuadas para la administración oral y parenteral (incluyendo, e.g., la administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal e intratecal). Las formulaciones pueden ser de una única dosis, y serán preparadas de acuerdo con los métodos clásicos de galénica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S. A. de Ediciones. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAATl y EAAT2, o de un compuesto que promueve la expresión de dichos transportadores EAATl y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, en particular, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de dicha enfermedad desmielinizante.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un kit útil para la puesta en práctica de la metodología aquí descrita. Así, dicho kit puede contener los reactivos necesarios para la detección de los niveles de ácido glutámico, o para la detección de los niveles de expresión de ARNm que expresa EAATl, EAAT2 o EGF, o sus correspondientes ADNc, entre los que se incluyen: a) la enzima ácido glutámico deshidrogenasa (para la detección del ácido glutámico); y/o b) uno o más anticuerpos con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF, o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos; y/o c) una o más parejas de oligonucleótidos cebadores capaces de amplificar específicamente un fragmento de los ARNm o ADNc codificantes para EAATl, EAAT2 y EGF.
El kit de la invención puede ser utilizado para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad.
El siguiente ejemplo ilustra la invención aunque no debe ser considerado en sentido limitativo de la misma. EJEMPLO 1
I. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Cultivos de oligodendrocitos
Los cultivos celulares se realizaron a partir de nervio óptico de rata de 12 días siguiendo protocolos establecidos, que se han adaptado e introducido en el laboratorio según descripción reciente (Matute y cois, 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94, 8830-8835).
Registros electrofísiológicos en oligodendrocitos in vitro
Los registros electrofísiológicos se realizaron en cultivos de 2 a 5 días, siguiendo las pautas indicadas en trabajos previos (Patneau y cois, 1994, Neuron 12, 357-371). Las células se registraron en una cámara que permite variar la composición del medio extracelular a través de un flujo constante (0,5-1 mL/min). Los electrodos de registro utilizados fueron capilares de vidrio que contenían soluciones específicas compatibles con las concentraciones iónicas citoplasmáticas. El estudio de las respuestas mediadas por los transportadores de ácido glutámico se realizó mediante la técnica de control de voltaje de la célula entera ("whole-cell patch-clamp").
Experimentos en nervio óptico aislado
Los nervios se aislaron de ratas adultas jóvenes, y se perfundieron durante 30 minutos en líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) saturado en oxígeno mediante burbujeo de
95% de oxígeno y 5% de CO2, en condiciones comparables a las descritas para oligodendrocitos en cultivo (Fera y Mδller, 2000, J. Neurosci. 20, 34-42). A continuación, se incubaron con inhibidores de los transportadores durante 6 horas con
LCRa normal saturado de oxígeno. Transcurrido ese tiempo, el daño se evaluó histológicamente tal y como se ha descrito in vivo (Matute, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci.
USA 95, 10229-10234) y se analizaron los cambios bioquímicos que subyacen a dicho daño. Métodos inmunoquímicos en cultivos de oligodendrocitos y en nervio óptico
Para el estudio de la presencia de marcadores del linaje oligodendroglial, componentes de la mielina, astrocitos y microglía se emplearon anticuerpos comerciales. Las técnicas incluyeron la inmunocitoquímica, inrnunohistoquímica e inmunoblotting (Western blot), todas ellas descritas en detalle (ver por ejemplo, Domercq y cois., 1999, Eur. J. Neurosci. 1 1, 2226-2236)
Aplicación de sustancias en el nervio óptico in vivo
Los experimentos en nervio óptico se realizaron en conejos (New Zealand White) que, por su tamaño, permiten una mejor manipulación quirúrgica experimental. El procedimiento empleado es el descrito previamente (Matute, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. 95, 10229-10234). Los oligodeoxinucleótidos se aplicaron mediante microbombas osmóticas que liberan cantidades pequeñas de soluto durante un tiempo determinado. Posteriormente, se evaluó el efecto de dicha aplicación sobre el nervio con un panel de marcadores de oligodendrocitos y sus progenitores, mielina, integridad axonal, astrogliosis y microgliosis.
Análisis en muestras de sangre y de tejido humano post-mortem
La expresión de los transportadores de ácido glutámico EAATl y EAAT2 y del factor de crecimiento epidérmico (EGF) se analizó mediante PCR cuantitativa a tiempo real usando como marcador el SYBRGreen PCR universal master mix reagent (Applied Biosystems).
Los niveles proteicos de EAATl y EAAT2 se analizaron mediante inmunohistoquímica y Western blot convencional (Domercq y cois., 1999, Eur J Neurosci 11, 2226-2236). La funcionalidad de los transportadores se determinó mediante ensayos de captación de ácido glutámico tritiado en preparados vesiculares de membrana glial de acuerdo a la metodología descrita previamente (Nakamura y cois., 1993, GHa 9, 48-56). Los niveles de ácido glutámico en plasma se determinaron mediante un ensayo enzimático basado en la actividad de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa (Veis y cois., 1998, Nature 391, 281-285).
II. RESULTADOS
Expresión de transportadores de ácido glutámico funcionales en oligodendrocitos
Para demostrar la expresión de transportadores funcionales de ácido glutámico se realizaron registros electrofisiológicos en oligodendrocitos con fijación de voltaje a -70 mV. La aplicación de ácido glutámico induce una corriente rápida, desensitizante, debida a la activación de los receptores glutamatérgicos. Dicha corriente es seguida de una corriente permanente, no desensitizante (amplitud media = 16,54 ± 1,66 pA; n= 46;
Fig. 1 A, B). Dicha corriente es sensible a la sustitución del sodio extracellular por litio, lo que demuestra que se debe a la activación de los transportadores dependientes de sodio (n= 5; Fig.l A, B). Dichas comentes son activadas también por aspartato, sustrato del transportador (amplitud media = 14,26 ± 2,41 pA; n= 12; Fig. 1 B, C). Por último, las corrientes activadas tanto por ácido glutámico como por aspartato son inhibidas en presencia de ácido DL-í/zreo-β-benziloxiaspártico (TBOA; 1 mM; Fig. 1 D), inhibidor competitivo de los transportadores de ácido glutámico GLAST y GLT-I (Shimamoto y cois., 1998, Mol Pharmacol 53, 195-201).
Para caracterizar el subtipo de transportador se utilizaron ensayos de captación de ácido glutámico tritiado e immunocitoquimia. La captación de ácido glutámico dependiente de sodio en oligodendrocitos es inhibida totalmente en presencia de TBOA (n =3; Fig. 1 E). Por el contrario, el dihidrokainato (DHK), inhibidor selectivo del subtipo GLT-I, solo inhibe parcialmente la captación de glutamato (n=4; Fig. 1 E), indicando que ambos subtipos GLAST y GLT-I son funcionales en oligodendrocitos. De acuerdo con ello, ambos subtipos se detectan en oligodendrocitos in vitro mediante ensayos inmunocitoquímicos (Fig. 1 F).
La inhibición de los transportadores de ácido glutámico produce la muerte oligodendroglial La inhibición de los transportadores de ácido glutámico con TBOA (100 nM a 1 mM; 24 h) produce muerte oligodendroglial (EC5O=I 0,9 μM; n= 5), que es máxima a la concentración 1 mM del inhibidor (Fig. 2 A). La muerte oligodendroglial inducida por TBOA es potenciada en presencia de ciclotiazida (CTZ; 100 μM) y concanavalina A (ConA; 10 μM), inhibidores de la desensitización de los receptores AMPA y kainato respectivamente (EC5O= 5,5 μM y 13,6 μM respectivamente; n=3-5; Fig. 2A). La muerte inducida por TBOA es bloqueada en presencia de 6-cian-7-nitroquinoxalin-2,3- diona (CNQX; 30 μM), antagonista de los receptores AMPA y kainato, y reducida en gran medida en presencia de LY303070 (50 μM), antagonista de los receptores AMPA (n= 3; Fig. 2B), indicando que los receptores glutamatérgicos están implicados en la muerte inducida por la inhibición de los transportadores de ácido glutámico. TBOA solo o en presencia de CTZ (100 μM) o Con A (10 μM) produce condensación de la cromatina y activación de la caspasa-3 en los oligodendrocitos en proceso de muerte (Fig. 2C,D), lo que indica que la muerte se produce por apoptosis.
La inhibición de los transportadores de ácido glutámico mata oligodendrocitos in situ e in vivo
Para determinar si la inhibición de los transportadores de ácido glutámico es tóxica para los oligodendrocitos en una preparación de tejido nervioso in situ, se perfundieron nervios ópticos enteros aislados de ratas adultas en LCRa con TBOA durante 6 h. En estas condiciones los niveles extracelulares de ácido glutámico se incrementan al doble a la concentración máxima de TBOA (EC5O= 78,2 μM; n= 3-5; Fig. 3A).
La alteración de la homeostasis producida por el TBOA origina un incremento superior a 3 veces en el número de células que mostraban condensación de la cromatina (visualizado con el marcador Hoechst, ver Fig. 3B) y activación de la caspasa-3 en comparación con los nervios controles (EC5O =I 13.2 μM; n= 6-12; Fig. 3B,C,D). Las células dañadas se orientan en el eje longitudinal del nervio y forman parte de hileras de oligodendrocitos interfasciculares (Fig. 3B). La incubación con TBOA en presencia de CNQX (30 μM) previene de la muerte de los oligodendrocitos (Fig. 3D). A continuación, se infundieron los oligonucleótidos (ODNs) antisentido contra los subtipos de transportador GLAST y GLT-I (aGLAST y aGLT-1, respectivamente) en el nervio óptico de conejos in vivo mediante bombas osmóticas que liberan cantidades de soluto muy pequeñas a lo largo de 3 días, analizándose tras 7 días su efecto mediante técnicas inmunohistoquímicas. Dichos oligonucleótidos antisentido disminuyen de forma eficaz la expresión de los transportadores GLAST y GLT-I en nervio óptico de conejo, como se observa con el análisis immunhistoquímico (Fig. 4A). La aplicación de ODNs antisentido contra GLT-I induce daño tisular severo y muerte oligodendroglial (Fig. 4B). Además, dicha zona presenta una gliosis intensa, falta de mielina y daño axonal (Fig. 4B,C,D). Por el contrario, la aplicación de ODNs antisentido contra GLAST produce lesiones en áreas más restringidas caracterizadas principalmente por el daño axonal (Fig. 4D). Por último, la administración de ODNs sentido contra GLT-I (sGLT-1), usados como control, no produjo ninguna alteración en los nervios ópticos (Fig. 4C,D). En su conjunto estos resultados indican que la inhibición de los transportadores de ácido glutámico provoca la muerte de los oligodendrocitos in situ y que las lesiones in vivo comparten propiedades propias de las placas de EM como la inflamación local y la desmielinización.
Análisis de la expresión de EAATl, 2 y 3 en nervio óptico control y en pacientes con EM
Mediante PCR cuantitativa se analizó la expresión de los transcritos EAATl, EAAT2 y EAAT3 en muestras de sujetos control y de pacientes con EM. Los niveles de los transportadores EAATl y EAAT2 están incrementados en la EM con respecto a los controles. Estos incrementos aparecen en 1 1 de las 13 muestras analizadas para el subtipo EAATl (incremento medio = 1,75; p<0,005; Fig. 5A and B). La expresión de EAAT2, por el contrario, es más variable con incrementos en 8 muestras, ausencia de cambios en 4, y disminución en un caso (Fig. 5A), observándose en su conjunto incrementos significativos en la expresión de EAAT2 en pacientes con EM (incremento medio = 1,87; p<0,05; Fig. 5B). Por ultimo, no existe ninguna alteración en los niveles de EAAT3 en las muestras de EM analizadas (Fig. 5B). A continuación se analizó si los niveles de expresión de EAATs guardaban alguna correlación con los datos clínicos y patológicos de cada paciente. No existe ninguna correlación entre los distintos subtipos de EM y los niveles de expresión de EAATl y EAAT2. En cambio, la expresión de EAAT2 es mayor en los nervios ópticos que presentan alteraciones visuales en comparación con los nervios de apariencia normal (2,5 veces mas; p<0,05; Fig. 6A). Además, la expresión de EAAT2 se correlaciona con los niveles de GFAP (r=0,56; Fig. 6B) y con EGF (r=0,455; Fig. 6D), potente modulador positivo de la transcripción de los EAATs (Su y cois., 2003, Proa Nati. Acad. Sci. USA 100, 1955-1960; Kim y cois., 2003, J. Neurochem. 87(6), 1485-1498). Todo ello indica que el transportador EAAT2 se sobreexpresa en astrocitos debido a la acción del modulador positivo EGF.
Para valorar la alteración a nivel proteico se usaron técnicas convencionales tales como Western blot e inmunohistoquímica. La distribución de los transportadores EAATl y EAAT2 en nervio óptico humano es similar a la observada en tractos de sustancia blanca de rata (Domercq y cois., 1999, Eur J Neurosci 1 1, 2226-2236). Así, el transportador EAATl se localiza en oligodendrocitos marcados con APC mientras que EAAT2 se distribuye en procesos astrocitarios GFAP (Fig. 7A). En los nervios ópticos provenientes de pacientes con EM aparece un incremento en la inmunoreactividad sin detectarse cambios en el patrón de expresión. De igual manera, el análisis mediante Western blot demuestra que los niveles proteicos de EAATl y EAAT2 se encuentran incrementados de forma significativa en homogeneizados proteicos provenientes de nervio óptico con EM (n= 13; p<0,05; Fig. 7B). Para valorar la relevancia de dichos cambios proteicos se realizaron ensayos funcionales de captación de ácido glutámico en preparados vesiculares de membrana glial (GPVs) provenientes de nervio óptico humano. La capacidad de transporte sodio-dependiente de los GPVs de nervio óptico humano es baja con respecto a otras regiones, 12,4 pmol/mg prot/min. Sin embargo, la captación de ácido glutámico en GPVs de muestras de pacientes con EM está incrementada significativamente con respecto a muestras controles (n= 6; p<0,05; Fig. 7C).
Expresión y modulación de los transportadores en sangre de sujetos control y de pacientes con EM Los niveles de expresión de los transportadores podrían ser un reflejo del incremento de los niveles de ácido glutámico en sangre y relacionarse con el estado clínico del paciente. Por ello, se analizaron la expresión de los transportadores así como el nivel de ácido glutámico en plasma de controles y de enfermos con EM. La concentración de ácido glutámico a nivel sanguíneo está elevada en pacientes con EM con respecto a sujetos control (n= 35; Fig. 8). Paralelamente a dicho incremento, los pacientes con EM muestran incrementos en la expresión de los transportadores EAATl y EAAT2 (11= 20 y 39 respectivamente; Fig. 8). Por último, la expresión del modulador positivo EGF se encuentra elevada al igual que ocurre en el nervio óptico, mientras que no se detectan incrementos en los niveles de TNFα, modulador negativo de la expresión de los transportadores (n= 22; Fig. 8).
Por último, para demostrar que la sobreexpresión de los EAATs observada en sangre y en nervio óptico de pacientes con EM es debida a la alteración de los niveles de ácido glutámico, se analizó las consecuencias de la estimulación con concentraciones elevadas de dicho aminoácido en el preparado de nervio óptico aislado. Tras incubar 3 h con ácido glutámico (1 mM) se produce un incremento en la expresión de los transportadores EAATl y EAAT2 y del modulador positivo EGF (n= 5; Fig. 9). Por tanto, se puede concluir que la alteración en los niveles de ácido glutámico en la EM produce una sobreexpresión de los transportadores de dicho aminoácido con objeto de paliar los efectos tóxicos del mismo, y que dicha sobreexpresión está mediada principalmente por el modulador positivo de la trascripción EGF.
III. DISCUSIÓN
Los resultados mostrados anteriormente ponen de manifiesto que los oligodendrocitos y los tractos de sustancia blanca tienen transportadores de ácido glutámico. Asimismo, se detallan las propiedades electrofisiológicas, farmacológicas y moleculares de estos transportadores, así como los efectos que para dichas células o tractos produce la inhibición de los mismos. El bloqueo de los transportadores es tóxico para los oligodendrocitos y produce daño tisular y desmielinización por sobreactivación de los receptores glutamatérgicos que recuerdan a las lesiones observadas en la EM. Por tanto, los mecanismos encaminados a potenciar la expresión de los transportadores pueden resultar beneficiosos para prevenir la muerte oligodendroglial y el daño axonal.
Los transportadores de ácido glutámico pueden ser bloqueados por el estrés oxidativo, así como por citoquinas proinflamatorias tales como el TNFα, lo que originaría alteraciones en la concentración de ácido glutámico. Sin embargo, los transportadores presentan un mecanismo de regulación dinámico para incrementar su expresión cuando se produce una alteración en la homeostasis del ácido glutámico. Dado que los niveles de ácido glutámico están incrementados en pacientes con EM, en dicha patología se produce un incremento en la expresión de los transportadores EAATl y EAAT2 para intentar recuperar los niveles de ácido glutámico y, por tanto, paliar el daño. El modulador positivo más potente de la expresión de los transportadores EAATl y EAAT2 es EGF, cuya expresión se encuentra elevada tanto en sangre como en nervio óptico, lo que indica su idoneidad como herramienta terapéutica para prevenir la excitotoxicidad en dicha enfermedad.
La invención aquí descrita constituye, en primer lugar, un marcador diagnóstico para la EM que permite correlacionar el estado clínico del paciente con una variable como el nivel de ácido glutámico o de expresión de los transportadores EAATl y EAAT2 y del factor EGF. Los marcadores biológicos en fluidos corporales como el líquido cefalorraquídeo y sangre, pueden proporcionar un indicador biológico objetivo del pronóstico del paciente y dar más información al paciente de futuros ataques. Para la EM existen distintos tipos de marcadores de la actividad inflamatoria, sin embargo no existen marcadores de daño axonal o de la fase neurodegenerativa de la enfermedad (Teunissen y cois., 2005, Lancet 4, 32-41). El ácido glutámico ha sido relacionado con la fase neurodegenerativa dado que produce muerte oligodendroglial (Matute y cois., 1997, Proc Nati Acad Sci USA 94, 8830-8835) y que sus niveles se encuentran elevados en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EM (Stover y cois., 1997, Eur J Clin Invest 27, 1038-1043; Sarchielli y cois., 2003, Arch Neurol 60, 1082-1088). Sin embargo, el origen de la alteración de la homeostasis del ácido glutámico en EM no es aún conocido. Una posibilidad es que los incrementos a nivel del SNC sean debidos a una alteración en la barrera hematoencefálica, como consecuencia del ataque inmune, que condicionaría la entrada de ácido glutámico del sistema sanguíneo al cerebro dada la existencia de un gradiente positivo (Westergren y cois., 1994, J Neurochem 62, 159- 165). Por tanto, el seguimiento de las moléculas implicadas en la señalización glutamatérgica como el mismo ácido glutámico y sus transportadores en sangre constituyen un marcador potencial para el pronóstico y para el estudio de las enfermedades desmielinizantes. Una realización preferida de la invención contempla dichos parámetros como marcadores de la EM.
Por otro lado, abren un abanico de estrategias terapéuticas basadas en la regulación de los transportadores en las enfermedades desmielinizantes, y en particular en la EM, una enfermedad que carece de tratamientos eficaces que ralenticen o frenen su progresión. Las vías de intervención que han originado fármacos en uso para el tratamiento de la EM o en fase de ensayos clínicos tienen mecanismos de acción que regulan el funcionamiento del sistema inmune. Sin embargo, la estrategia propuesta, al prevenir la alteración de la homeostasis de ácido glutámico, tiene mayor potencial terapéutico en la fase neurodegenerativa de esta enfermedad, fase que se prolonga durante decenios, y en la que los pacientes sufren un deterioro progresivo que cursa con trastornos motores y sensitivos que produce invalidez.
Por otro lado, los moduladores positivos de la transcripción de los transportadores como las moléculas que señalizan mediante la ruta del receptor EGF, entre ellas el factor EGF actúan disminuyendo la concentración extracelular de ácido glutámico y por tanto, previniendo el daño celular. Este puede constituir un mecanismo de defensa que exista de forma endógena y que contribuya a la restauración del equilibrio ante cualquier estímulo o insulto que produzca alteración en los niveles de ácido glutámico. Por tanto, la invención contempla potenciar estos mecanismos de defensa mediante aporte externo de factores que promuevan la expresión de EAATl y EAAT2 como EGF.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad, que comprende
a) cuantificar el nivel de expresión de un gen en una muestra de dicho sujeto, en donde dicho gen se selecciona entre el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAATl) [gen EAATl], el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) [gen EAAT2] y el gen que codifica el factor de crecimiento epidérmico (EGF) [gen EGF], y combinaciones de los mismos; y
b) comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante;
o, alternativamente,
a) cuantificar el nivel de una proteína en una muestra de dicho sujeto, en donde dicha proteína se selecciona entre el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAATl), el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF), y combinaciones de las mismas; y
b) comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante;
o, alternativamente, a) cuantificar el nivel de ácido glutámico en una muestra de dicho sujeto; y
b) comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad desmielinizante se selecciona entre esclerosis múltiple (EM), síndrome de Devic, enfermedad de Baló, enfermedad de Marchiafava-Bignami, mielinolisis central pontina, encefalomielitis aguda diseminada y encefalomielitis hemoiτágica necrotizante aguda.
3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra se selecciona entre una muestra de sangre, suero, plasma, orina, saliva, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal y una muestra de tejido.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, que comprende someter dicha muestra a un proceso de extracción para obtener un extracto que comprende el RNA total, un extracto proteico, plasma o suero.
5. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra a analizar se obtiene de un sujeto al que no se le ha diagnosticado previamente una enfermedad desmielinizante, o de un sujeto al que se le ha diagnosticado previamente una enfermedad desmielinizante, o de un sujeto que está recibiendo tratamiento para una enfermedad desmielinizante, o de un sujeto que ha recibido tratamiento para una enfermedad desmielinizante.
6. Método según la reivindicación 1, que comprende cuantificar el nivel de ARNm que expresa EAATl o de su ADNc correspondiente, el nivel de ARNm que expresa EAAT2 o de su ADNc correspondiente, y/o el nivel de ARNm que expresa EGF o de su ADNc correspondiente.
7. Método según la reivindicación 6, en el que la cuantificación de los niveles de dichos ARNm o de los correspondientes ADNc comprende una etapa de amplificación del ARNm o del correspondiente ADNc sintetizado por transcripción inversa del ARNm, y una etapa de cuantificación del producto de la amplificación de dichos ARNm o ADNc.
8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha amplificación se realiza de manera cualitativa o cuantitativa, mediante PCR, usando oligonucleótidos cebadores que amplifican específicamente un fragmento de los genes EAATl, EAAT2 o EGF.
9. Método según la reivindicación 8, en el que la cuantificación del nivel de ARNm que expresa EAATl, el nivel de ARNm que expresa EAAT2 o el nivel de ARNm que expresa EGF, se lleva a cabo mediante PCR cuantitativa a tiempo real.
10. Método según la reivindicación 1, que comprende cuantificar el nivel de una proteína seleccionada entre EAATl , EAAT2, EGF y combinaciones de las mismas.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la cuantificación del nivel de dicha proteína EAATl, EAAT2 o EGF se lleva a cabo mediante anticuerpos con capacidad para unirse a dichas proteínas o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos, y usando técnicas inmunoquímicas para cuantificar la unión antí geno-anticuerpo.
12. Método según la reivindicación 1, en el que la cuantificación del nivel de ácido glutámico se lleva a cabo en una muestra de plasma o suero mediante un ensayo enzimático basado en la actividad de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa.
13. Empleo de una secuencia nucleotídica de un gen para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante, en el que dicho gen se selecciona entre el gen EAATl, el gen EAAT2 y el gen EGF.
14. Empleo de una secuencia peptídica de una proteína para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante, en el que dicha proteína se selecciona entre las proteínas EAATl, EAAT2 y EGF.
15. Empleo de un anticuerpo para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinante antigénicos.
16. Empleo de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante.
17. Un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que expresa un gen con el compuesto a ensayar, y (ii) evaluar la expresión de dicho gen, de manera que si se sobreexpresa dicho gen el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, en donde dicho gen se selecciona entre los genes EAATl , EAAT2, EGF y combinaciones de los mismos.
18. Un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que produce ácido glutámico con el compuesto a ensayar, y (ii) evaluar la expresión de ácido glutámico, de manera que si se disminuye el nivel de ácido glutámico el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
19. Empleo de (i) una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre los genes EAATl, EAAT2 y EGF, o de (ii) una secuencia aminoacídica de una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF, o de (iii) un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinante antigénicos, en un método de screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
20. Un método in vitro para la identificación y evaluación de la eficacia de tratamientos de enfermedades desmielinizantes que comprende la cuantificación de los niveles de ácido glutámico, o la cuantificación de los niveles de proteínas EAATl, EAAT2 y/o EGF, o la cuantificación de los niveles de expresión de los genes EAATl, EAAT2 y/o EGF en un mismo sujeto a lo largo de las distintas fases o etapas de la enfermedad, o durante los periodos de tratamiento y de ausencia del mismo, y su comparación con valores control considerados normales o con valores previos del mismo paciente.
21. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAATl y EAAT2, o de un compuesto que promueve o potencia la expresión de dichos transportadores EAATl y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
22. Composición farmacéutica según la reivindicación 21, en la que dicho compuesto se selecciona del grupo formado por agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, incluyendo moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, antibióticos y factores de crecimiento que promueven la expresión de los transportadores EAATl y EAAT2.
23. Composición farmacéutica según la reivindicación 21 ó 22, que comprende un modulador positivo de la expresión de EAATl y EAAT2, preferentemente, EGF.
24. Empleo de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores
EAATl y EAAT2, o de un compuesto que promueve o potencia la expresión de dichos transportadores EAATl y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
25. Empleo de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAATl y EAAT2, o de un compuesto que promueve o potencia la expresión de dichos transportadores EAATl y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de una enfermedad desmielinizante.
26. Empleo según la reivindicación 24 ó 25, en el que dicha enfermedad desmielinizante es esclerosis múltiple.
27. Un kit que comprende a) la enzima ácido glutámico deshidrogenasa; y/o b) un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAATl, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos; y/o c) una pareja de oligonucleótidos cebadores capaces de amplificar específicamente un fragmento de los ARNm o ADNc codificantes para EAATl, EAAT2 y EGF.
28. Kit según la reivindicación 27, para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad.
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