ES2304818A1 - Metodos para el diagnostico y pronostico de las enfermedades desmielinizantes y para el desarrollo de medicamentos contra las enfermedades desmielinizantes. - Google Patents

Metodos para el diagnostico y pronostico de las enfermedades desmielinizantes y para el desarrollo de medicamentos contra las enfermedades desmielinizantes. Download PDF

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Abstract

Métodos para el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades desmielinizantes y para el desarrollo de medicamentos contra las enfermedades desmielinizantes. La presente invención se refiere al uso de los transportadores de ácido glutámico, del ácido glutámico y de EGF para detectar la presencia de enfermedades desmielinizantes en un sujeto, para determinar el estado o severidad de las mismas, o para monitorizar los efectos de una terapia en un sujeto que sufra dichas enfermedades; al uso de dichos marcadores para la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de dichas enfermedades con el propósito de desarrollar nuevos medicamentos; al uso de compuestos que promuevan la expresión de los transportadores EAAT1 y EAAT como el factor EGF para el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes. Los métodos y compuestos de la invención son preferentemente de aplicación para la EM.

Description

Métodos para el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades desmielinizantes y para el desarrollo de medicamentos contra las enfermedades desmielinizantes.
Campo de la invención
La presente invención se enmarca en el ámbito de las enfermedades desmielinizantes, preferentemente en el de la esclerosis múltiple, y se relaciona con el empleo de los transportadores de ácido glutámico como marcadores de las enfermedades mencionadas y con el empleo de sustancias potenciadoras de la expresión de dichos transportadores para el tratamiento de las enfermedades antedichas.
Antecedentes de la invención
La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) más frecuente. Afecta a un millón y medio de personas en el mundo, y sus síntomas aparecen en general en adultos jóvenes, por lo que sus consecuencias a nivel personal y socioeconómico son muy graves.
Se piensa que la susceptibilidad a la EM se debe a factores genéticos y ambientales desconocidos. La prevalencia de la enfermedad se sitúa entre 50 a 100 personas por cada 100.000 habitantes en las regiones de alto riesgo, que se localizan principalmente en las zonas septentrionales del hemisferio norte, en Europa y América. El riesgo a padecer EM aumenta 10-20 veces en parientes de primer grado de enfermos, y la concordancia entre gemelos monocigóticos (idénticos genéticamente) se eleva hasta el 30-35%, mientras que gemelos dicigóticos sólo alcanza el 2-5%. La susceptibilidad genética no está caracterizada. Hasta el momento se tienen evidencias de que puede residir en algún polimorfismo de los genes que codifican antígenos leucocitarios humanos (HLA), glicoproteína oligodendrocítica de la mielina (MOG) y otros genes de los cromosomas 10 y 15.
Existe un consenso entre los investigadores de la EM según el cual la enfermedad tiene dos fases; una primaria inflamatoria, de naturaleza autoinmune, y otra secundaria neurodegenerativa progresiva. La fase primaria se inicia con la activación de las células T específicas para mielina, que atraviesan la barrera hematoencefálica. Una vez dentro del SNC, liberan citoquinas proinflamatorias desencadenando una cascada inmunológica que conduce a la destrucción de la mielina y muerte de los oligodendrocitos, en parte reversible tras el brote inflamatorio. El conocimiento con un cierto detalle del proceso autoinmune ha servido para desarrollar agentes de naturaleza inmunomoduladora cuya eficacia terapéutica es muy modesta. Sin embargo, no se ha generado ningún medicamento que retrase o detenga el avance de la fase neurodegenerativa de la enfermedad que cursa con deterioro neurológico progresivo e invalidez, y que se caracteriza por la aparición de lesiones desmielinizantes permanentes y graves en la sustancia blanca con pérdida masiva de oligodendrocitos, atrofia y daño axonal severo.
Hasta ahora se han descrito diversas dianas terapéuticas para la intervención durante la fase inflamatoria de la EM (Zamvil y Steinman, 2003, Neuron 38, 685-688). Entre ellas se encuentran las que se dirigen a reducir la inflamación del sistema nervioso iniciada por la activación de células T específicas de mielina, que penetran en el tejido nervioso central y liberan en él citoquinas proinflamatorias como el interferón-\gamma y el factor de la necrosis tumoral-\alpha. En este sentido, el inmunomodulador interferón-\beta, aprobado para el tratamiento de la EM remitente-recurrente, previene las interacciones celulares que llevan a la penetración de las células T activadas a través del endotelio vascular. Otros tratamientos en fase de ensayo clínico están dirigidos a neutralizar la actividad de las citoquinas proinflamatorias y/o a potenciar las antiinflamatorias. Un estudio reciente realizado en un modelo animal de EM, la encefalitis autoinmune experimental (EAE; Youssef y cols., 2002, Nature 420, 78-84), ha puesto de manifiesto que el medicamento atorvastatina empleado en el tratamiento de la hipercolesterolemia, es también un potente inmunomodulador que puede prevenir o revertir la EAE crónica mediante la potenciación de la secreción de citoquinas antiinflamatorias y la inhibición de la producción de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, no existe ninguna diana terapéutica para la intervención durante la fase secundaria progresiva, la cual está más relacionada con la degeneración irreversible del SNC del paciente.
Un hallazgo importante de los últimos años que ha contribuido a entender la etiología de la EM ha sido el descubrimiento de la sensibilidad de los oligodendrocitos al ácido glutámico (Matute y cols., 2001, TINS 24, 224-230). Así, la estimulación de los receptores glutamatérgicos de los subtipos ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA) y kainato en oligodendrocitos induce la muerte de los mismos, fenómeno conocido como excitotoxicidad oligodendroglial (Matute y cols., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94, 8830-8835; McDonald y cols., 1998, Nat Med 4, 291-297). Además, la aplicación de agonistas de dichos receptores en animales in vivo provoca una atrofia del nervio óptico asociada a una desmielinización masiva, que recuerda a lo acontecido en la EM (Matute, 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 10229-10234). La hipótesis de la implicación de la excitoxicidad oligodendroglial en la EM ha sido posteriormente reforzada tras el hallazgo de que los antagonistas de los receptores AMPA y kainato reducen la severidad y previenen la aparición de brotes en animales con EAE (Smith y cols., 2000, Nat Med 6,62-66; Pitt y cols., 2000, Nat Med 6, 67-70). Dichos estudios indican que como consecuencia de la reacción inmune en la EAE se produce una alteración en la homeostasis de ácido glutámico que conlleva una sobreactivación de los receptores glutamatérgicos y muerte oligodendroglial.
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Al igual que en la EAE, la homeostasis del ácido glutámico en la EM está alterada, lo que apoya la hipótesis glutamatérgica de la EM. Así, los niveles de ácido glutámico están incrementados en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EM aguda (Stover y cols., 1997, Eur J Clin Invest 27, 1038-1043) y EM secundaria progresiva (Sarchielli y cols., 2003, Arch Neurol 60, 1082-1088), así como en suero antes del comienzo del brote (Westall y cols., 1980, J Neurol Sci 47, 353-364). Además, la expresión de las enzimas glutamina sintetasa y ácido glutámico deshidrogenasa, responsables de la degradación del ácido glutámico, se encuentra reducida mientras que la enzima glutaminasa, productora de ácido glutámico, está elevada en la sustancia blanca proveniente de pacientes con EM (Werner y cols., 2001, Ann Neurol 50, 169-180), sugiriendo una alteración en los niveles de dicho neurotransmisor. Sin embargo, se sabe poco sobre la expresión y función de los transportadores de ácido glutámico en la EM.
Los transportadores de ácido glutámico (EAATs) son los responsables de mantener bajos los niveles extracelulares de dicho aminoácido y, en particular, a nivel sináptico, lo que permite mantener una relación señal-ruido adecuada y evitar la sobreactivación de los receptores glutamatérgicos y la muerte celular (Danbolt, 2001, Prog Neurobiol 65, 1-105). Hasta la fecha, han sido clonados 5 subtipos de EAATs (Arriza y cols., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 94, 4155-4160; Danbolt, 2001, Prog Neurobiol 65, 1-105). Los subtipos EAAT1 y EAAT2 (y sus homólogos en rata GLAST y GLT-l) se expresan principalmente en células de origen glial, EAAT3 (y su homólogo en rata EAAC 1) y EAAT4 en neuronas, y EAAT5 se localiza exclusivamente en retina. Los transportadores de ácido glutámico se encuentran ampliamente distribuidos por el cerebro y médula espinal (Danbolt, 2001, Prog Neurobiol 65, 1-105) así como en tractos de sustancia blanca, como el nervio óptico (Domercq y cols., 1999, Eur J Neurosci 11, 2226-2236). La recaptación del ácido glutámico extracelular tiene lugar mayoritariamente a través de los transportadores gliales y el bloqueo de los mismos da lugar a procesos de neurodegeneración crónica como resultado del incremento en la concentración extracelular de ácido glutámico (Rothstein y cols., 1996, Neuron 16:675-686). De hecho, los ratones deficientes en el transportador GLT-1 desarrollan una actividad epiléptica espontánea letal y presentan una mayor susceptibilidad al daño cortical agudo (Tanaka y cols., 1997, Science 276, 1699-1702). Dado el papel esencial de los transportadores EAAT1/GLAST y EAAT2/GLT-1, es posible que una alteración en su expresión o función pueda contribuir a incrementar los niveles de ácido glutámico que acontecen en algunas patologías del SNC, como las enfermedades desmielinizantes.
Compendio de la invención
El objetivo principal de la presente invención es proporcionar un método in vitro para detectar la presencia de enfermedades desmielinizantes, y en particular de la EM, para determinar el pronóstico de las mismas, y para monitorizar el efecto de los tratamientos usados para dichas enfermedades. Un objetivo adicional consiste en proporcionar una serie de compuestos para el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes, y en particular de la EM.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que la inhibición de la actividad de los transportadores de ácido glutámico produce muerte oligodendroglial in vitro y danos neurológicos in vivo como desmielinización y daño axonal, que son característicos de la fase neurodegenerativa de la EM; en el descubrimiento de que la expresión de dichos transportadores está regulada por los niveles de ácido glutámico; y en el descubrimiento de que los niveles de ácido glutámico y los niveles de expresión de los transportadores EAAT1 y EAAT2 están incrementados en muestras de sangre así como en muestras de nervio óptico post-mortem de pacientes con EM con respecto a pacientes controles no afectados de EM, constituyendo dicha sobreexpresión un mecanismo de respuesta debido al incremento de los niveles de ácido glutámico y producido por el factor de crecimiento epidérmico (EGF), modulador positivo de la transcripción de EAAT1 y EAAT2.
Por tanto, la invención se relaciona, en general, con el uso de los transportadores EAAT1 y EAAT2, del ácido glutámico y/o del modulador EGF como marcadores de enfermedades desmielinizantes y, en particular, de la EM, así como a métodos y kits para la puesta en práctica de la presente invención.
En un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad, que comprende el empleo de los EAAT1 y EAAT2, del ácido glutámico y/o del modulador EGF como marcadores de enfermedades desmielinizantes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre el gen EAAT1, el gen EAAT2 y el gen EGF, o de una secuencia peptídica de una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF, o de un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinante antigénicos, o de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa, para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes basado en la cuantificación de un gen seleccionado entre los genes EAAT1, EAAT2, EGF y combinaciones de los mismos, o en la cuantificación de los niveles de ácido glutámico.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de (i) una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre los genes EAAT1, EAAT2 y EGF, o de (ii) una secuencia aminoacídica de una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF, o de (iii) un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinante antigénicos, en un método de screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación y evaluación de la eficacia de tratamientos de enfermedades desmielinizantes que comprende la cuantificación de los niveles de ácido glutámico, o la cuantificación de los niveles de proteínas EAAT1, EAAT2 y/o EGF, o la cuantificación de los niveles de expresión de los genes EAAT1, EAAT2 y/o EGF en un mismo sujeto a lo largo de las distintas fases o etapas de la enfermedad, o durante los periodos de tratamiento y de ausencia del mismo, y su comparación con valores control considerados normales o con valores previos del mismo paciente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAAT1 y EAAT2, o de un compuesto que promueve o potencia la expresión de dichos transportadores EAAT1 y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende un modulador positivo de la expresión de los transportadores EAAT1 y EAAT2, tal como el EGF.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAAT1 y EAAT2, o de un compuesto que promueve o potencia la expresión de dichos transportadores EAAT1 y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, tal como un kit apropiado para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra las propiedades electrofisiológicas de los transportadores de ácido glutámico en oligodendrocitos en cultivo. La aplicación de ácido glutámico y de aspartato produce una corriente lenta, no desensitizante, inhibida al sustituir el Na^{+} extracelular por Li^{+} y en presencia del inhibidor TBOA, y potenciada en presencia de iones SCN- a nivel intracelular. Las características farmacológicas indican la expresión de los subtipos EAAT1/GLAST y EAAT2/GLT-1.
La figura 2 pone de manifiesto que la inhibición de los transportadores de ácido glutámico produce muerte oligodendroglial in vitro. La muerte se produce debido a la activación de los receptores AMPA/Kainato dado que se potencia en presencia de ciclotiazida y concanavalina A, inhibidores de la desensitización de los receptores AMPA y Kainato respectivamente, y se bloquea en presencia de CNQX, antagonista de los receptores AMPA/kainato.
La figura 3 demuestra que la inhibición de los transportadores de ácido glutámico en nervio óptico in situ da lugar a alteraciones en la homeostasis de ácido glutámico, que producen muerte oligodendroglial por sobreactivación de los receptores AMPA/Kainato.
La figura 4 muestra cómo la infusión lenta (1 \mul/hora; 3 días) de oligonucleótidos antisentido contra el transportador GLT-1 (1 \muM) produce lesiones en el nervio óptico, en las que se aprecia daño tisular con microgliosis, así como desaparición de la mielina en el área dañada y rotura de los axones. En la Figura 4C se muestra el número de células que sufren apoptosis por milímetro cuadrado (Tunel^{+} célula/mm^{2}) en presencia de oligonucleótidos antisentido para los transportadores de ácido glutámico (aGLT1 y aGLAST) y en presencia de oligonucleótidos sentido para el transportador GTT-1 (sGLT-1). En la Figura 4D se muestra el daño axonal mediante midiendo la inmunoreactividad de los neurofilamentos de cadena pesada desfosforilados (inmunoreactividad NFH) en presencia de en presencia de oligonucleótidos antisentido para los transportadores de ácido glutámico (aGLT1 y aGLAST) y en presencia de oligonucleótidos sentido para el transportador GTT-1 (sGLT-1).
La figura 5 pone de manifiesto que los niveles de RNA codificante para EAAT1 y EAAT2 están elevados en nervio óptico de pacientes con MS.
La figura 6 demuestra que los niveles de EAAT2 se encuentran incrementados sólo en los nervios ópticos con alteraciones visuales, tales como neuritis óptica (DON), mientras que no lo están en nervios ópticos de apariencia normal (NAON) [Figura 6A] y que la expresión de EAAT2 se correlaciona con EGF, modulador positivo de su transcripción [Figura C].
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La figura 7 muestra la expresión in situ de transportadores de ácido glutámico en nervio óptico humano post-mortem. Se pone de manifiesto que los niveles proteicos de EAAT1 y EAAT2 así como la funcionalidad de los mismos se encuentran elevados en nervio óptico de pacientes con EM.
La figura 8 muestra que los niveles de ácido glutámico así como los niveles de EAAT1 y EAAT2 se encuentran elevados a nivel periférico, en muestras de sangre provenientes de pacientes con EM. Dichos incrementos se deben al efecto del modulador positivo EGF, que también se encuentra incrementado en dichas muestras.
La figura 9 demuestra que la estimulación con ácido glutámico en nervio óptico in situ es suficiente para inducir un incremento en la expresión de los transportadores EAAT1 (GLAST) y EAAT2 (GLT-1), y que dichos incrementos van acompañados de incrementos en el modulador positivo EGF. CNQX, 6-cian-7-nitroquinoxalin-2,3-diona.
Descripción detallada de la invención
Para facilitar la comprensión de la invención objeto de la presente solicitud de patente, a continuación se expone el significado de algunos términos y expresiones en el contexto de la invención:
El término "sujeto" se refiere a un miembro de una especie de un animal mamífero, e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.
La expresión "enfermedades desmielinizantes" se refiere a aquellas enfermedades en las que el proceso patogénico provoca la destrucción de la mielina, que es la capa lipoproteica que recubre los nervios y facilita la transmisión de los impulsos a través de las fibras nerviosas; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades desmielinizantes incluyen: esclerosis múltiple (EM), síndrome de Devic, enfermedad de Baló, enfermedad de Marchiafava-Bignami, mielinolisis central pontina, encefalomielitis aguda diseminada y encefalomielitis hemorrágica necrotizante aguda.
El término "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones post-traduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación o acetilación.
El término "anticuerpo" se refiere a una proteína con capacidad de unión específica a un "antígeno". El término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos que conservan la capacidad de unirse al antígeno, anticuerpos recombinantes, combibodies, etc., tanto humanos o humanizados como de origen no humano.
El término "oligonucleótido cebador", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una secuencia nucleotídica, que es complementaria de una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAAT1) [gen EAAT1], el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) [gen EAAT2] y el gen que codifica el factor de crecimiento epidérmico (EGF) [gen EGF]. Cada cebador hibrida con su secuencia nucleotídica diana y actúa como un sitio de inicio para la polimerización del ADN.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que la expresión de los genes EAAT1 y/o EAAT2 así como la de sus correspondientes proteínas está incrementada en pacientes con EM con respecto a sujetos control; en el descubrimiento de que los niveles de ácido glutámico en pacientes con EM están incrementados con respecto a sujetos control; y en el descubrimiento de que la expresión del gen que codifica el EGF, modulador positivo del promotor de los transportadores, así como la proteína correspondiente, están incrementados en pacientes con EM con respecto a sujetos control.
En consecuencia, la evaluación y comparación de los niveles de los genes EAAT1 y/o EAAT2 así como de sus correspondientes proteínas, y/o la evaluación y comparación del nivel del gen que codifica el EGF así como el de la proteína correspondiente (EGF), y/o la evaluación y comparación de los niveles de ácido glutámico en una muestra biológica de un sujeto puede ser utilizada con fines diagnósticos o de pronóstico de enfermedades desmielinizantes en general, y, en particular, de EM. A modo ilustrativo, un nivel elevado de dichos marcadores respecto a los niveles de sujetos control (es decir, sujetos sin historial clínico de enfermedades desmielinizantes y/o que no presentan enfermedades desmielinizantes, e.g., EM) o con valores normales de referencia (obtenidos, en general, a partir de sujetos control) es indicativo de una enfermedad desmielinizante, o de un mayor riesgo o predisposición de un sujeto a desarrollar dicha enfermedad. La comparación de los niveles de dichos marcadores, en un momento dado, en un sujeto, diagnosticado o no de una enfermedad desmielinizante, con los de muestras previas del mismo sujeto puede ser indicativo de la evolución y pronóstico de dicha enfermedad desmielinizante o de su predisposición a desarrollar dicha enfermedad.
El hallazgo previamente mencionado puede ser utilizado, entre otras aplicaciones, en ensayos de diagnóstico o de evaluación del riesgo o predisposición de un sujeto a desarrollar una enfermedad desmielinizante, en ensayos de pronóstico, en ensayos de monitorización del efecto de la terapia administrada a un sujeto para analizar la eficacia de la terapia y la evolución de la enfermedad, y en ensayos de screening de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
La invención proporciona, por consiguiente, métodos para detectar y cuantificar la expresión de los genes EAAT1 y EAAT2 y del gen que codifica el EGF, y la de sus correspondientes proteínas, así como para detectar y cuantificar los niveles de ácido glutámico en una muestra biológica. La invención también proporciona métodos para detectar interacciones entre dichos productos y otros compuestos, por ejemplo, antagonistas.
En un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad, en adelante método de la invención, que comprende:
a)
cuantificar el nivel de expresión de un gen en una muestra de dicho sujeto, en donde dicho gen se selecciona entre el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAAT1) [gen EAAT1], el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) [gen EAAT2] y el gen que codifica el factor de crecimiento epidérmico (EGF) [gen EGF], y combinaciones de los mismos; y
b)
comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante;
\vskip1.000000\baselineskip
o, alternativamente,
a)
cuantificar el nivel de una proteína en una muestra de dicho sujeto, en donde dicha proteína se selecciona entre el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAAT1), el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF), y combinaciones de las mismas; y
b)
comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante;
\vskip1.000000\baselineskip
o, alternativamente,
a)
cuantificar el nivel de ácido glutámico en una muestra de dicho sujeto; y
b)
comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante.
El método proporcionado por esta invención presenta una alta sensibilidad y especificidad, y se basa en el hecho de que los sujetos con diagnóstico de una enfermedad desmielinizante, especialmente EM, presentan altos niveles de ácido glutámico y de ARNm codificado por los genes EAAT1, EAAT2 y/o EGF, y/o concentraciones elevadas de las proteínas EAAT1, EAAT2 y/o EGF, en comparación con los niveles en muestras de sujetos control sin ningún historial clínico de enfermedad desmielinizante.
Para la puesta en práctica del método de la invención, se obtiene una muestra biológica del sujeto a estudiar. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas muestras incluyen distintos tipos de fluidos biológicos, tales como sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal, heces, orina y saliva, así como muestras de tejidos. Las muestras de fluidos biológicos pueden ser obtenidas por cualquier método convencional al igual que las muestras de tejidos; a modo ilustrativo dichas muestras de tejidos pueden ser muestras de biopsias obtenidas por resección quirúrgica. Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos diagnosticados previamente con una enfermedad desmielinizante (pacientes), por ejemplo, EM, o bien de sujetos no diagnosticados, o bien de pacientes bajo tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, o bien de pacientes que han sido previamente tratados de las mismas.
En una realización particular, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de expresión de un gen seleccionado entre el gen EAAT1, el gen EAAT2 y el gen EGF, y combinaciones de los mismos, en una muestra de dicho sujeto y su comparación con el de una muestra de control, en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante, por ejemplo, EM. El método de la invención incluye la posibilidad de cuantificar no sólo el nivel de uno sólo de dichos genes, sino la posibilidad de cuantificar los niveles de dos de dichos genes, e incluso de dichos tres genes.
El nivel de expresión de un gen puede ser cuantificado mediante la cuantificación del nivel de ARNm codificado por dicho gen, o, alternativamente, del nivel del ADN complementario (ADNc) a dicho ARNm. En este caso, el método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener un extracto que comprende el RNA total, un extracto proteico, plasma o suero, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales (Chomczynski y cols., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532).
Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm codificados por EAAT1, EAAT2 y/o EGF o de sus ADNc correspondientes. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm codificados por dichos genes pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNm y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesis y tinción, o alternativamente, mediante Southern blot y empleo de sondas apropiadas, Northern blot y empleo de sondas específicas del ARNm del gen de interés (EAAT1, EAAT2 o EGF) o de sus ADNc correspondientes, mapeo con la nucleasa S1, RT-LCR, hibridación, microarrays, etc., preferentemente, mediante PCR cuantitativa a tiempo real usando un marcador apropiado (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción). Análogamente, los niveles de los ADNc correspondientes a dichos ARNm codificados por EAAT1, EAAT2 y/o EGF también pueden ser cuantificados mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc; en una realización particular, la amplificación se lleva a cabo de manera cualitativa o cuantitativa, mediante PCR, usando oligonucleótidos cebadores que amplifican específicamente regiones de los genes EAAT1, EAAT2 o EGF.
En otra realización particular, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de una proteína seleccionada entre las proteínas EAAT1, EAAT2 y EGF, y combinaciones de las mismas, en una muestra de dicho sujeto y su comparación con el de una muestra de control, en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante, por ejemplo, EM. El método de la invención incluye la posibilidad de cuantificar no sólo el nivel de una sóla de dichas proteínas, sino la posibilidad de cuantificar los niveles de dos de dichas proteínas, e incluso de dichas tres proteínas.
El nivel (concentración) de dichas proteínas EAAT1, EAAT2 y/o EGF puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dichas proteínas en una muestra de un sujeto. En este caso, el método de la invención incluye la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener un extracto proteico que contenga dichas proteínas, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales (Chomczynski y cols., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532).
Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de EAAT1, EAAT2 y/o EGF. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dichas proteínas pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a EAAT1, EAAT2 o EGF (o a fragmentos de las mismas que contengan determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos formados. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar dichas proteínas EAAT1, EAAT2 o EGF, incluyen técnicas de cromatografia de afinidad, ensayos de unión a ligando, etc.
En una realización particular, la cuantificación de los niveles de EAAT1, EAAT2 y/o EGF se lleva a cabo mediante el empleo de anticuerpos con capacidad para unirse a EAAT1, EAAT2 o EGF (o a fragmentos de las mismas que contengan determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos formados, por ejemplo, mediante técnicas inmunoquímicas que permitan la cuantificación de la unión antígeno- anticuerpo, por ejemplo, Western blot, ELISA, biochips de proteína, etc.; preferentemente, la cuantificación de los niveles de EAAT1, EAAT2 y/o EGF se lleva a cabo mediante Western blot utilizando anticuerpos apropiados capaces de unirse a dichas proteínas [existen anticuerpos comerciales con capacidad para unirse a dichas proteínas (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción)].
La funcionalización de los transportadores EAAT1 y EAAT2 puede ser determinada por métodos convencionales, por ejemplo, mediante ensayos de captación de ácido glutámico en preparados vesiculares de membrana glial (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción)].
En otra realización particular, el método de la invención comprende cuantificar el nivel de ácido glutámico en una muestra de dicho sujeto y su comparación con el de una muestra de control, en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante.
El nivel (concentración) del ácido glutámico puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dicho compuesto en una muestra de un sujeto. Preferentemente, el nivel de ácido glutámico se determina en una muestra de sangre, plasma o suero del sujeto, por lo que, en este caso, el método de la invención puede incluir la realización de un tratamiento previo para separar el plasma o el suero, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales.
Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar el nivel de ácido glutámico. A modo ilustrativo, no limitativo, el nivel de dicho compuesto puede ser cuantificado mediante métodos enzimáticos, por ejemplo, mediante una reacción enzimática utilizando la enzima ácido glutámico deshidrogenasa (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción).
El método de la invención también comprende la etapa de comparar los niveles de expresión de los genes EAAT1, EAAT2 y/o EGF, (obtenidos, por ejemplo, mediante cuantificación de los niveles de los ARNm correspondientes a dichos genes, o de sus ADNc) o de los niveles de las proteínas EAAT1, EAAT2 y/o EGF, o del nivel de ácido glutámico, determinados en la muestra del sujeto objeto de estudio con los niveles de una muestra de control (es decir, con los valores de referencia). Los niveles de expresión de los genes EAAT1, EAAT2 y/o EGF, así como los niveles de las proteínas EAAT1, EAAT2 y/o EGF, o de ácido glutámico, pueden ser determinados por las técnicas mencionadas previamente en muestras de sujetos sin enfermedades desmielinizantes o sin historiales clínicos de enfermedades desmielinizantes. Un incremento en los niveles de expresión de los genes EAAT1, EAAT2 y/o EGF, o de los niveles de las proteínas EAAT1, EAAT2 y/o EGF, o del nivel de ácido glutámico, en la muestra del sujeto objeto de estudio respecto a los niveles correspondientes en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante, por ejemplo, EM.
Las secuencias nucleotídicas de los genes EAAT1, EAAT2 y EGF así como las secuencias aminoacídicas (peptídicas) de dichas proteínas y anticuerpos con capacidad de unirse a dichas proteínas o fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos específicos de dichas proteínas pueden ser utilizadas para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una secuencia nucleotídica de un gen para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante, en el que dicho gen se selecciona entre el gen EAAT1, el gen EAAT2 y el gen EGF. En una realización particular, dicha enfermedad desmielinizante es EM. Dicha secuencia nucleotídica puede ser una sonda complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en dichos genes EAAT1, EAAT2 o EGF, útil para detectar dicha secuencia de nucleótidos de dichos genes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una secuencia peptídica de una proteína para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante, en el que dicha proteína se selecciona entre las proteínas EAAT1, EAAT2 y EGF. En una realización particular, dicha enfermedad desmielinizante es EM. Dicha secuencia peptídica puede ser una secuencia que comprende un epítopo de dichas proteínas EAAT1, EAAT2 o EGF.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un anticuerpo para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos de dichas proteínas. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos que conservan la capacidad de unirse a dichas proteínas (EAAT1, EAAT2 o EGF), por ejemplo, fragmentos Fab, scFv, etc., anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano. En una realización particular, dicha enfermedad desmielinizante es EM.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa para detectar (diagnosticar) in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante. En una realización particular, dicha enfermedad desmielinizante es EM.
Dicha secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre los genes EAAT1, EAAT2 y EGF, así como dicha secuencia aminoacídica de una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF y dicho anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF (o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos) pueden ser utilizados en el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, de EM.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que expresa un gen con el compuesto a ensayar, y (ii) evaluar la expresión de dicho gen, de manera que si se sobreexpresa dicho gen el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, en donde dicho gen se selecciona entre los genes EAAT1, EAAT2, EGF y combinaciones de los mismos. Dicho sistema celular puede ser prácticamente cualquier sistema celular (e.g., célula) que expresa de forma natural o recombinante un gen seleccionado entre los genes EAAT1, EAAT2, EGF y combinaciones de los mismos. La expresión de dichos genes puede ser evaluada por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante la cuantificación de los ARNm que expresan dichos genes o sus ADNc correspondientes, o bien mediante la cuantificación de dichas proteínas EAAT1, EAAT2 o EGF por cualquiera de los métodos mencionados previamente. Cuando un compuesto aumente la expresión de EAAT1, EAAT2 o EGF, dicho compuesto se convierte en un candidato potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, en particular, un candidato potencialmente útil para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM.
Por otra parte, el nivel de ácido glutámico también puede ser utilizado en el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, de EM.
En consecuencia, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que produce ácido glutámico con el compuesto a ensayar, y (ii) evaluar la concentración de ácido glutámico, de manera que si se disminuye el nivel de ácido glutámico el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes. Dicho sistema celular puede ser prácticamente cualquier sistema celular (e.g., célula) productor, de forma natural o recombinante, ácido glutámico. La producción de ácido glutámico puede ser evaluada por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante métodos enzimáticos utilizando la enzima ácido glutámico deshidrogenasa tal como se ha mencionado previamente. Cuando un compuesto disminuya la producción de ácido glutámico, dicho compuesto se convierte en un candidato potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, en particular, un candidato potencialmente útil para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de (i) una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre los genes EAAT1, EAAT2 y EGF, o de (ii) una secuencia aminoacídica de una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF, o de (iii) un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF (o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos), en un método de screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación y evaluación de la eficacia de los tratamientos de las enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM. El método contempla la cuantificación de los niveles de ácido glutámico y de los niveles de proteínas EAAT1, EAAT2 y/o EGF o bien de los niveles de expresión de los genes EAAT1, EAAT2 y/o EGF en un mismo sujeto a lo largo de las distintas fases o etapas de la enfermedad, o durante los periodos de tratamiento y de ausencia del mismo, y su comparación con valores control considerados normales o con valores previos del mismo paciente. Cuando un agente disminuya los niveles de ácido glutámico o aumente la expresión de EAAT1, EAAT2 o EGF, dicho agente se convierte en un candidato para el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes, y en particular en un candidato para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de las enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, de EM.
Compuestos que bloquean la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAAT1 y EAAT2, así como compuestos que promueven o potencian la expresión de los transportadores EAAT1 y/o EAAT2, y compuestos que disminuyen los niveles de ácido glutámico, pueden ser utilizados en el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, en particular, en el tratamiento de la fase neurodegenerativa de dichas enfermedades. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos compuestos incluyen agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, incluyendo moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, antibióticos y factores de crecimiento que promueven la expresión de los transportadores EAAT1 y/o EAAT2, es decir, moduladores positivos de la expresión de dichos transportadores, por ejemplo, EGF.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAAT1 y EAAT2, o de un compuesto que promueve o potencia la expresión de dichos transportadores EAAT1 y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos compuestos que bloquean la inhibición de la expresión o la actividad de los transportadores EAAT1 y/o EAAT2, o de compuestos que promueven o potencian la expresión de dichos transportadores EAAT1 y/o EAAT, o de compuestos que disminuyen los niveles de ácido glutámico incluyen agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, incluyendo moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, antibióticos y factores de crecimiento que promueven la expresión de los transportadores EAAT1 y/o EAAT2. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende un modulador positivo de la expresión de dichos transportadores, por ejemplo, EGF.
Los excipientes, vehículos y sustancias auxiliares deben ser farmacéuticamente y farmacológicamente tolerables y han de poder ser combinados con otros componentes de la formulación o preparación y no ejercer ningún efecto adverso sobre el sujeto tratado. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en cualquier forma de administración apropiada, por ejemplo, en formas farmacéuticas adecuadas para la administración oral y parenteral (incluyendo, e.g., la administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal e intratecal). Las formulaciones pueden ser de una única dosis, y serán preparadas de acuerdo con los métodos clásicos de galénica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto que bloquea la inhibición de la expresión o la actividad de un transportador de ácido glutámico seleccionado entre los transportadores EAAT1 y EAAT2, o de un compuesto que promueve la expresión de dichos transportadores EAAT1 y/o EAAT2, o de un compuesto que disminuye el nivel de ácido glutámico, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, EM, en particular, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de dicha enfermedad desmielinizante.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un kit útil para la puesta en práctica de la metodología aquí descrita. Así, dicho kit puede contener los reactivos necesarios para la detección de los niveles de ácido glutámico, o para la detección de los niveles de expresión de ARNm codificado por EAAT1, EAAT2 o EGF, o sus correspondientes ADNc, entre los que se incluyen:
a)
la enzima ácido glutámico deshidrogenasa (para la detección del ácido glutámico); y/o
b)
uno o más anticuerpos con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF, o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos; y/o
c)
una o más parejas de oligonucleótidos cebadores capaces de amplificar específicamente un fragmento de los ARNm o ADNc codificantes para EAAT1, EAAT2 y EGF.
El kit de la invención puede ser utilizado para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente dicha enfermedad.
El siguiente ejemplo ilustra la invención aunque no debe ser considerado en sentido limitativo de la misma.
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Ejemplo 1 I. Procedimientos experimentales Cultivos de oligodendrocitos
Los cultivos celulares se realizaron a partir de nervio óptico de rata de 12 días siguiendo protocolos establecidos, que se han adaptado e introducido en el laboratorio según descripción reciente (Matute y cols, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8830-8835).
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Registros electrofisiológicos en oligodendrocitos in vitro
Los registros electrofisiológicos se realizaron en cultivos de 2 a 5 días, siguiendo las pautas indicadas en trabajos previos (Patneau y cols, 1994, Neuron 12, 357-371). Las células se registraron en una cámara que permite variar la composición del medio extracelular a través de un flujo constante (0,5-1 mL/min). Los electrodos de registro utilizados fueron capilares de vidrio que contenían soluciones específicas compatibles con las concentraciones iónicas citoplasmáticas. El estudio de las respuestas mediadas por los transportadores de ácido glutámico se realizó mediante la técnica de control de voltaje de la célula entera ("whole-cell patch-clamp").
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Experimentos en nervio óptico aislado
Los nervios se aislaron de ratas adultas jóvenes, y se perfundieron durante 30 minutos en líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) saturado en oxígeno mediante burbujeo de 95% de oxígeno y 5% de CO_{2}, en condiciones comparables a las descritas para oligodendrocitos en cultivo (Fern y Moller, 2000, J. Neurosci. 20, 34-42). A continuación, se incubaron con inhibidores de los transportadores durante 6 horas con LCRa normal saturado de oxígeno. Transcurrido ese tiempo, el daño se evaluó histológicamente tal y como se ha descrito in vivo (Matute, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10229-10234) y se analizaron los cambios bioquímicos que subyacen a dicho daño.
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Métodos inmunoquímicos en cultivos de oligodendrocitos y en nervio óptico
Para el estudio de la presencia de marcadores del linaje oligodendroglial, componentes de la mielina, astrocitos y microglía se emplearon anticuerpos comerciales. Las técnicas incluyeron la inmunocitoquímica, inmunohistoquímica e inmunoblotting (Western blot), todas ellas descritas en detalle (ver por ejemplo, Domercq y cols., 1999, Eur. J. Neurosci. 11, 2226-2236).
Aplicación de sustancias en el nervio óptico in vivo
Los experimentos en nervio óptico se realizaron en conejos (New Zealand White) que, por su tamaño, permiten una mejor manipulación quirúrgica experimental. El procedimiento empleado es el descrito previamente (Matute, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 10229-10234). Los oligodeoxinucleótidos se aplicaron mediante microbombas osmóticas que liberan cantidades pequeñas de soluto durante un tiempo determinado. Posteriormente, se evaluó el efecto de dicha aplicación sobre el nervio con un panel de marcadores de oligodendrocitos y sus progenitores, mielina, integridad axonal, astrogliosis y microgliosis.
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Análisis en muestras de sangre y de tejido humano post-mortem
La expresión de los transportadores de ácido glutámico EAAT1 y EAAT2 y del factor de crecimiento epidérmico (EGF) se analizó mediante PCR cuantitativa a tiempo real usando como marcador el SYBRGreen PCR universal master mix reagent (Applied Biosystems).
Los niveles proteicos de EAAT1 y EAAT2 se analizaron mediante inmunohistoquímica y Western blot convencional (Domercq y cols., 1999, Eur J Neurosci 11, 2226-2236). La funcionalidad de los transportadores se determinó mediante ensayos de captación de ácido glutámico tritiado en preparados vesiculares de membrana glial de acuerdo a la metodología descrita previamente (Nakamura y cols., 1993, Glia 9, 48-56). Los niveles de ácido glutámico en plasma se determinaron mediante un ensayo enzimático basado en la actividad de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa (Veis y cols., 1998, Nature 391, 281-285).
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II. Resultados Expresión de transportadores de ácido glutámico funcionales en oligodendrocitos
Para demostrar la expresión de transportadores funcionales de ácido glutámico se realizaron registros electrofisiológicos en oligodendrocitos con fijación de voltaje a -70 mV. La aplicación de ácido glutámico induce una corriente rápida, desensitizante, debida a la activación de los receptores glutamatérgicos. Dicha corriente es seguida de una corriente permanente, no desensitizante (amplitud media = 16,54 \pm 1,66 pA; n= 46; Fig. 1 A, B). Dicha corriente es sensible a la sustitución del sodio extracellular por litio, lo que demuestra que se debe a la activación de los transportadores dependientes de sodio (n= 5; Fig.1 A, B). Dichas corrientes son activadas también por aspartato, sustrato del transportador (amplitud media = 14,26 \pm 2,41 pA; n= 12; Fig. 1 B, C). Por último, las corrientes activadas tanto por ácido glutámico como por aspartato son inhibidas en presencia de ácido DL-threo-\beta-benziloxiaspártico (TBOA; 1 mM; Fig. 1 D), inhibidor competitivo de los transportadores de ácido glutámico GLAST y GLT-1 (Shimamoto y cols., 1998, Mol Pharmacol 53, 195-201).
Para caracterizar el subtipo de transportador se utilizaron ensayos de captación de ácido glutámico tritiado e immunocitoquimia. La captación de ácido glutámico dependiente de sodio en oligodendrocitos es inhibida totalmente en presencia de TBOA (n =3; Fig. 1 E). Por el contrario, el dihidrokainato (DHK), inhibidor selectivo del subtipo GLT-1, solo inhibe parcialmente la captación de glutamato (n=4; Fig. 1 E), indicando que ambos subtipos GLAST y GLT-1 son funcionales en oligodendrocitos. De acuerdo con ello, ambos subtipos se detectan en oligodendrocitos in vitro mediante ensayos inmunocitoquímicos (Fig. 1 F).
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La inhibición de los transportadores de ácido glutámico produce la muerte oligodendroglial
La inhibición de los transportadores de ácido glutámico con TBOA (100 nM a 1 mM; 24 h) produce muerte oligodendroglial (EC_{50}=10,9 \muM; n= 5), que es máxima a la concentración 1 mM del inhibidor (Fig. 2 A). La muerte oligodendroglial inducida por TBOA es potenciada en presencia de ciclotiazida (CTZ; 100 \muM) y concanavalina A (ConA; 10 \muM), inhibidores de la desensitización de los receptores AMPA y kainato respectivamente (EC_{50}= 5,5 \muM y 13,6 \muM respectivamente; n=3-5; Fig. 2A). La muerte inducida por TBOA es bloqueada en presencia de 6-cian-7-nitroquinoxalin-2,3-diona (CNQX; 30 \muM), antagonista de los receptores AMPA y kainato, y reducida en gran medida en presencia de LY303070 (50 \muM), antagonista de los receptores AMPA (n= 3; Fig. 2B), indicando que los receptores glutamatérgicos están implicados en la muerte inducida por la inhibición de los transportadores de ácido glutámico. TBOA solo o en presencia de CTZ (100 \muM) o Con A (10 \muM) produce condensación de la cromatina y activación de la caspasa-3 en los oligodendrocitos en proceso de muerte (Fig. 2C,D), lo que indica que la muerte se produce por apoptosis.
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La inhibición de los transportadores de ácido glutámico mata oligodendrocitos in situ e in vivo
Para determinar si la inhibición de los transportadores de ácido glutámico es tóxica para los oligodendrocitos en una preparación de tejido nervioso in situ, se perfundieron nervios ópticos enteros aislados de ratas adultas en LCRa con TBOA durante 6 h. En estas condiciones los niveles extracelulares de ácido glutámico se incrementan al doble a la concentración máxima de TBOA (EC_{50}= 78,2 \muM; n= 3-5; Fig. 3A).
La alteración de la homeostasis producida por el TBOA origina un incremento superior a 3 veces en el número de células que mostraban condensación de la cromatina (visualizado con el marcador Hoechst, ver Fig. 3B) y activación de la caspasa-3 en comparación con los nervios controles (EC_{50} =113.2 \muM; n= 6-12; Fig. 3B, C, D). Las células dañadas se orientan en el eje longitudinal del nervio y forman parte de hileras de oligodendrocitos interfasciculares (Fig. 3B). La incubación con TBOA en presencia de CNQX (30 \muM) previene de la muerte de los oligodendrocitos (Fig. 3D).
A continuación, se infundieron los oligonucleótidos (ODNs) antisentido contra los subtipos de transportador GLAST y GLT-1 (aGLAST y aGLT-1, respectivamente) en el nervio óptico de conejos in vivo mediante bombas osmóticas que liberan cantidades de soluto muy pequeñas a lo largo de 3 días, analizándose tras 7 días su efecto mediante técnicas inmunohistoquímicas. Dichos oligonucleótidos antisentido disminuyen de forma eficaz la expresión de los transportadores GLAST y GLT-1 en nervio óptico de conejo, como se observa con el análisis immunhistoquímico (Fig. 4A). La aplicación de ODNs antisentido contra GLT-1 induce daño tisular severo y muerte oligodendroglial (Fig. 4B). Además, dicha zona presenta una gliosis intensa, falta de mielina y daño axonal (Fig. 4B,C,D). Por el contrario, la aplicación de ODNs antisentido contra GLAST produce lesiones en áreas más restringidas caracterizadas principalmente por el daño axonal (Fig. 4D). Por último, la administración de ODNs sentido contra GLT-1 (sGLT-1), usados como control, no produjo ninguna alteración en los nervios ópticos (Fig. 4C,D). En su conjunto estos resultados indican que la inhibición de los transportadores de ácido glutámico provoca la muerte de los oligodendrocitos in situ y que las lesiones in vivo comparten propiedades propias de las placas de EM como la inflamación local y la desmielinización.
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Análisis de la expresión de EAAT1, 2 y 3 en nervio óptico control y en pacientes con EM
Mediante PCR cuantitativa se analizó la expresión de los transcritos EAAT1, EAAT2 y EAAT3 en muestras de sujetos control y de pacientes con EM. Los niveles de los transportadores EAAT1 y EAAT2 están incrementados en la EM con respecto a los controles. Estos incrementos aparecen en 11 de las 13 muestras analizadas para el subtipo EAAT1 (incremento medio = 1,75; p<0,005; Fig. 5A y B). La expresión de EAAT2, por el contrario, es más variable con incrementos en 8 muestras, ausencia de cambios en 4, y disminución en un caso (Fig. 5A), observándose en su conjunto incrementos significativos en la expresión de EAAT2 en pacientes con EM (incremento medio = 1,87; p<0,05; Fig. 5B). Por ultimo, no existe ninguna alteración en los niveles de EAAT3 en las muestras de EM analizadas (Fig. 5B).
A continuación se analizó si los niveles de expresión de EAATs guardaban alguna correlación con los datos clínicos y patológicos de cada paciente. No existe ninguna correlación entre los distintos subtipos de EM y los niveles de expresión de EAAT1 y EAAT2. En cambio, la expresión de EAAT2 es mayor en los nervios ópticos que presentan alteraciones visuales en comparación con los nervios de apariencia normal (2,5 veces mas; p<0,05; Fig. 6A). Además, la expresión de EAAT2 se correlaciona con los niveles de GFAP (r=0,56; Fig. 6B) y con EGF (r=0,455; Fig. 6D), potente modulador positivo de la transcripción de los EAATs (Su y cols., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 1955-1960; Kim y cols., 2003, J. Neurochem. 87(6), 1485-1498). Todo ello indica que el transportador EAAT2 se sobreexpresa en astrocitos debido a la acción del modulador positivo EGF.
Para valorar la alteración a nivel proteico se usaron técnicas convencionales tales como Western blot e inmunohistoquímica. La distribución de los transportadores EAAT1 y EAAT2 en nervio óptico humano es similar a la observada en tractos de sustancia blanca de rata (Domercq y cols., 1999, Eur J Neurosci 11, 2226-2236). Así, el transportador EAAT1 se localiza en oligodendrocitos marcados con APC mientras que EAAT2 se distribuye en procesos astrocitarios GFAP^{+} (Fig. 7A). En los nervios ópticos provenientes de pacientes con EM aparece un incremento en la inmunoreactividad sin detectarse cambios en el patrón de expresión. De igual manera, el análisis mediante Western blot demuestra que los niveles proteicos de EAAT1 y EAAT2 se encuentran incrementados de forma significativa en homogeneizados proteicos provenientes de nervio óptico con EM (n= 13; p<0,05; Fig. 7B). Para valorar la relevancia de dichos cambios proteicos se realizaron ensayos funcionales de captación de ácido glutámico en preparados vesiculares de membrana glial (GPVs) provenientes de nervio óptico humano. La capacidad de transporte sodio—dependiente de los GPVs de nervio óptico humano es baja con respecto a otras regiones, 12,4 pmol/mg prot/min. Sin embargo, la captación de ácido glutámico en GPVs de muestras de pacientes con EM está incrementada significativamente con respecto a muestras controles (n= 6; p<0,05; Fig. 7C).
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Expresión y modulación de los transportadores en sangre de sujetos control y de pacientes con EM
Los niveles de expresión de los transportadores podrían ser un reflejo del incremento de los niveles de ácido glutámico en sangre y relacionarse con el estado clínico del paciente. Por ello, se analizaron la expresión de los transportadores así como el nivel de ácido glutámico en plasma de controles y de enfermos con EM. La concentración de ácido glutámico a nivel sanguíneo está elevada en pacientes con EM con respecto a sujetos control (n= 35; Fig. 8). Paralelamente a dicho incremento, los pacientes con EM muestran incrementos en la expresión de los transportadores EAAT1 y EAAT2 (n= 20 y 39 respectivamente; Fig. 8). Por último, la expresión del modulador positivo EGF se encuentra elevada al igual que ocurre en el nervio óptico, mientras que no se detectan incrementos en los niveles de TNF\alpha, modulador negativo de la expresión de los transportadores (n= 22; Fig. 8).
Por último, para demostrar que la sobreexpresión de los EAATs observada en sangre y en nervio óptico de pacientes con EM es debida a la alteración de los niveles de ácido glutámico, se analizó las consecuencias de la estimulación con concentraciones elevadas de dicho aminoácido en el preparado de nervio óptico aislado. Tras incubar 3 h con ácido glutámico (1 mM) se produce un incremento en la expresión de los transportadores EAAT1 y EAAT2 y del modulador positivo EGF (n= 5; Fig. 9). Por tanto, se puede concluir que la alteración en los niveles de ácido glutámico en la EM produce una sobreexpresión de los transportadores de dicho aminoácido con objeto de paliar los efectos tóxicos del mismo, y que dicha sobreexpresión está mediada principalmente por el modulador positivo de la trascripción EGF.
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III. Discusión
Los resultados mostrados anteriormente ponen de manifiesto que los oligodendrocitos y los tractos de sustancia blanca tienen transportadores de ácido glutámico. Asimismo, se detallan las propiedades electrofisiológicas, farmacológicas y moleculares de estos transportadores, así como los efectos que para dichas células o tractos produce la inhibición de los mismos. El bloqueo de los transportadores es tóxico para los oligodendrocitos y produce daño tisular y desmielinización por sobreactivación de los receptores glutamatérgicos que recuerdan a las lesiones observadas en la EM. Por tanto, los mecanismos encaminados a potenciar la expresión de los transportadores pueden resultar beneficiosos para prevenir la muerte oligodendroglial y el daño axonal.
Los transportadores de ácido glutámico pueden ser bloqueados por el estrés oxidativo, así como por citoquinas proinflamatorias tales como el TNF\alpha, lo que originaria alteraciones en la concentración de ácido glutámico. Sin embargo, los transportadores presentan un mecanismo de regulación dinámico para incrementar su expresión cuando se produce una alteración en la homeostasis del ácido glutámico. Dado que los niveles de ácido glutámico están incrementados en pacientes con EM, en dicha patología se produce un incremento en la expresión de los transportadores EAAT1 y EAAT2 para intentar recuperar los niveles de ácido glutámico y, por tanto, paliar el daño. El modulador positivo más potente de la expresión de los transportadores EAAT1 y EAAT2 es EGF, cuya expresión se encuentra elevada tanto en sangre como en nervio óptico, lo que indica su idoneidad como herramienta terapéutica para prevenir la excitotoxicidad en dicha enfermedad.
La invención aquí descrita constituye, en primer lugar, un marcador diagnóstico para la EM que permite correlacionar el estado clínico del paciente con una variable como el nivel de ácido glutámico o de expresión de los transportadores EAAT1 y EAAT2 y del factor EGF. Los marcadores biológicos en fluidos corporales como el líquido cefalorraquídeo y sangre, pueden proporcionar un indicador biológico objetivo del pronóstico del paciente y dar más información al paciente de futuros ataques. Para la EM existen distintos tipos de marcadores de la actividad inflamatoria, sin embargo no existen marcadores de daño axonal o de la fase neurodegenerativa de la enfermedad (Teunissen y cols., 2005, Lancet 4, 32-41). El ácido glutámico ha sido relacionado con la fase neurodegenerativa dado que produce muerte oligodendroglial (Matute y cols., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94, 8830-8835) y que sus niveles se encuentran elevados en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EM (Stover y cols., 1997, Eur J Clin Invest 27, 1038-1043; Sarchielli y cols., 2003, Arch Neurol 60, 1082-1088). Sin embargo, el origen de la alteración de la homeostasis del ácido glutámico en EM no es aún conocido. Una posibilidad es que los incrementos a nivel del SNC sean debidos a una alteración en la barrera hematoencefálica, como consecuencia del ataque inmune, que condicionaria la entrada de ácido glutámico del sistema sanguíneo al cerebro dada la existencia de un gradiente positivo (Westergren y cols., 1994, J Neurochem 62, 159- 165). Por tanto, el seguimiento de las moléculas implicadas en la señalización glutamatérgica como el mismo ácido glutámico y sus transportadores en sangre constituyen un marcador potencial para el pronóstico y para el estudio de las enfermedades desmielinizantes. Una realización preferida de la invención contempla dichos parámetros como marcadores de la EM.
Por otro lado, abren un abanico de estrategias terapéuticas basadas en la regulación de los transportadores en las enfermedades desmielinizantes, y en particular en la EM, una enfermedad que carece de tratamientos eficaces que ralenticen o frenen su progresión. Las vías de intervención que han originado fármacos en uso para el tratamiento de la EM o en fase de ensayos clínicos tienen mecanismos de acción que regulan el funcionamiento del sistema inmune. Sin embargo, la estrategia propuesta, al prevenir la alteración de la homeostasis de ácido glutámico, tiene mayor potencial terapéutico en la fase neurodegenerativa de esta enfermedad, fase que se prolonga durante decenios, y en la que los pacientes sufren un deterioro progresivo que cursa con trastornos motores y sensitivos que produce invalidez.
Por otro lado, los moduladores positivos de la transcripción de los transportadores como las moléculas que señalizan mediante la ruta del receptor EGF, entre ellas el factor EGF actúan disminuyendo la concentración extracelular de ácido glutámico y por tanto, previniendo el daño celular. Este puede constituir un mecanismo de defensa que exista de forma endógena y que contribuya a la restauración del equilibrio ante cualquier estímulo o insulto que produzca alteración en los niveles de ácido glutámico. Por tanto, la invención contempla potenciar estos mecanismos de defensa mediante aporte externo de factores que promuevan la expresión de EAAT1 y EAAT2 como EGF.

Claims (25)

1. Un método in vitro para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto, que comprende
a)
cuantificar el nivel de expresión de un gen en una muestra de dicho sujeto, en donde dicho gen se selecciona entre el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAAT1) [gen EAAT1], el gen que codifica el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) [gen EAAT2] y el gen que codifica el factor de crecimiento epidérmico (EGF) [gen EGF], y combinaciones de los mismos; y
b)
comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante;
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o, alternativamente,
a)
cuantificar el nivel de una proteína en una muestra de dicho sujeto, en donde dicha proteína se selecciona entre el transportador de ácido glutámico subtipo 1 (EAAT 1), el transportador de ácido glutámico subtipo 2 (EAAT2) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF), y combinaciones de las mismas; y
b)
comparar dicho nivel con el de una muestra de control;
en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante;
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o, alternativamente,
a)
cuantificar el nivel de ácido glutámico en una muestra de dicho sujeto; y
b)
comparar dicho nivel con el de una muestra de control; en donde un incremento en dicho nivel respecto al nivel en la muestra de control es indicativo de una enfermedad desmielinizante.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad desmielinizante se selecciona entre esclerosis múltiple (EM), síndrome de Devic, enfermedad de Baló, enfermedad de Marchiafava-Bignami, mielinolisis central pontina, encefalomielitis aguda diseminada y encefalomielitis hemorrágica necrotizante aguda.
3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra se selecciona entre una muestra de sangre, suero, plasma, orina, saliva, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal y una muestra de tejido.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, que comprende someter dicha muestra a un proceso de extracción para obtener un extracto que comprende el RNA total, un extracto proteico, plasma o suero.
5. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra a analizar se obtiene de un sujeto al que no se le ha diagnosticado previamente una enfermedad desmielinizante, o de un sujeto al que se le ha diagnosticado previamente una enfermedad desmielinizante, o de un sujeto que está recibiendo tratamiento para una enfermedad desmielinizante, o de un sujeto que ha recibido tratamiento para una enfermedad desmielinizante.
6. Método según la reivindicación 1, que comprende cuantificar el nivel de ARNm que expresa EAAT1 o de su ADNc correspondiente, el nivel de ARNm que expresa EAAT2 o de su ADNc correspondiente, y/o el nivel de ARNm que expresa EGF o de su ADNc correspondiente.
7. Método según la reivindicación 6, en el que la cuantificación de los niveles de dichos ARNm o de los correspondientes ADNc comprende una etapa de amplificación del ARNm o del correspondiente ADNc sintetizado por transcripción inversa del ARNm, y una etapa de cuantificación del producto de la amplificación de dichos ARNm o ADNc.
8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha amplificación se realiza de manera cualitativa o cuantitativa, mediante PCR, usando oligonucleótidos cebadores que amplifican específicamente un fragmento de los genes EAAT1, EAAT2 o EGF.
9. Método según la reivindicación 8, en el que la cuantificación del nivel de ARNm que expresa EAAT1, el nivel de ARNm que expresa EAAT2 o el nivel de ARNm que expresa EGF, se lleva a cabo mediante PCR cuantitativa a tiempo real.
10. Método según la reivindicación 1, que comprende cuantificar el nivel de una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2, EGF y combinaciones de las mismas.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la cuantificación del nivel de dicha proteína EAAT1, EAAT2 o EGF se lleva a cabo mediante anticuerpos con capacidad para unirse a dichas proteínas o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos, y usando técnicas inmunoquímicas para cuantificar la unión antígeno-anticuerpo.
12. Método según la reivindicación 1, en el que la cuantificación del nivel de ácido glutámico se lleva a cabo en una muestra de plasma o suero mediante un ensayo enzimático basado en la actividad de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa.
13. Empleo de una secuencia nucleotídica de un gen para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, en el que dicho gen se selecciona entre el gen EAAT1, el gen EAAT2 y el gen EGF.
14. Empleo de una secuencia peptídica de una proteína para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, en el que dicha proteína se selecciona entre las proteínas EAAT1, EAAT2 y EGF.
15. Empleo de un anticuerpo para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinante antigénicos.
16. Empleo de la enzima ácido glutámico deshidrogenasa para detectar in vitro una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar in vitro el estado o severidad de dicha enfermedad desmielinizante, o para determinar in vitro el efecto del tratamiento en un sujeto que presenta una enfermedad desmielinizante.
17. Un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que expresa un gen con el compuesto a ensayar, y (ii) evaluar la expresión de dicho gen, de manera que si se sobreexpresa dicho gen el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes, en donde dicho gen se selecciona entre los genes EAAT1, EAAT2, EGF y combinaciones de los mismos.
18. Un método para el screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes que comprende (i) poner en contacto un sistema celular que produce ácido glutámico con el compuesto a ensayar, y (ii) evaluar la expresión de ácido glutámico, de manera que si se disminuye el nivel de ácido glutámico el compuesto ensayado es un compuesto potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
19. Empleo de (i) una secuencia nucleotídica de un gen seleccionado entre los genes EAAT1, EAAT2 y EGF, o de (ii) una secuencia aminoacídica de una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF, o de (iii) un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinante antigénicos, en un método de screening, búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
20. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del modulador positivo de la expresión de EAAT1 y EAAT2 EGF.
21. Empleo de EGF en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
22. Empleo de EGF en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de una enfermedad desmielinizante.
23. Empleo según la reivindicación 21 ó 22, en el que dicha enfermedad desmielinizante es esclerosis múltiple.
24. Un kit que comprende
a)
la enzima ácido glutámico deshidrogenasa; y/o
b)
un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína seleccionada entre EAAT1, EAAT2 y EGF o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos; y/o
c)
una pareja de oligonucleótidos cebadores capaces de amplificar específicamente un fragmento de los ARNm o ADNc codificantes para EAAT1, EAAT2 y EGF.
25. Kit según la reivindicación 24, para detectar una enfermedad desmielinizante en un sujeto, o para determinar el estadio o severidad de dicha enfermedad en un sujeto.
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