WO2006117414A1 - Modelo animal no humano de sarcoma - Google Patents

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WO2006117414A1
WO2006117414A1 PCT/ES2005/000234 ES2005000234W WO2006117414A1 WO 2006117414 A1 WO2006117414 A1 WO 2006117414A1 ES 2005000234 W ES2005000234 W ES 2005000234W WO 2006117414 A1 WO2006117414 A1 WO 2006117414A1
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animal
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tumor
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Fernando Lecanda Cordero
Iranzu GONZÀLEZ DE LA TAJADA
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Proyecto De Biomedicina Cima, S.L.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
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    • A01K2227/10—Mammal
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    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases

Definitions

  • the present invention falls within the field of non-human animal models, in this case it is a model for studying sarcomas.
  • a sarcoma is a general type of rare cancer, where cancer cells arise from, or resemble, normal body cells, which are part of the "connective tissues.”
  • Normal “connective tissues” include fatty tissue, muscle, blood vessels, deep skin tissues, nerves, bones and cartilage. Cell cancers that resemble any of these normal tissues are known as sarcomas.
  • Sarcomas in turn are subclassified based on the specific cell type that makes up the tumor.
  • Liposarcomas are malignant tumors that develop from fatty tissue. They can develop in any part of the body, but most of the time they grow in the retroperitoneum.
  • - Leiomyosarcomas are malignant tumors that develop from smooth muscle. They can arise anywhere in the body but the uterus and the gastrointestinal tract are two relatively frequent locations for this type of tumor.
  • - Rhabdomyosarcomas are malignant tumors that resemble developing skeletal muscle. These tumors appear in most cases in arms or legs, but can also develop in the head or neck area, as well as in the urinary and reproductive organs.
  • Synovial sarcoma is a malignant tumor composed of cells that resemble cells present in the joints (synovial cells, lining the joints). However, these tumors do not necessarily develop in any joint, and the name is likely to mislead because the cells have a different origin. Synovial sarcomas develop at any point of the body, and often occur in young adults. Ewing's sarcoma, also known as peripheral neuroectodermal tumor, has its origin in very primitive cells of the body.
  • Angiosarcoma is a malignant tumor that resembles blood or lymph vessels.
  • Fibrosarcoma is a cancer of fibroblast cells.
  • Malignant peripheral nerve sheath tumor MPNST: malignant peripheral nerve sheath tumor
  • neurofibrosarcoma also called neurofibrosarcoma.
  • the gastrointestinal stromal tumor is a tumor of the connective cells that support the gastrointestinal tract.
  • Osteosarcoma is a tumor of bone cells.
  • Chondrosarcoma is a tumor of the cells that form the cartilage.
  • a recurrent genetic alteration such as a chromosomal translocation as it occurs in the synovial sarcoma, myxoid sarcoma, clear cell sarcoma or Ewing's tumor.
  • these chromosomal translocations give rise to chimeric transcription factors that deregulate the expression of their target genes.
  • One of the most frequent genes that is part of these chimeric proteins is the EWS gene.
  • Ewing tumors represent the second most common solid tumor neoplasm in children.
  • tumors appear in bone and soft tissues and from an unknown cell type. These tumors are characterized by the presence of specific chromosomal translocations that juxtapose the EWS gene in 22ql2, with an ETS family gene, the most common being FLIl in Ilq24.
  • the EWS-FLIl fusion protein is the most prevalent fusion with a 95% incidence of tumors, although EWS can also be translocated with other genes. This chimeric protein acts as an aberrant transcription factor with oncogenic properties.
  • EWS-FLIl fusions There are 12 described types of EWS-FLIl fusions, although the most frequent are those of type 1, EWS exon 7 juxtaposed to exon 6 of FLIl (7.6); type 2, EWS exon 7 juxtaposed to exon 5 of FLIl (7.5); and type 3, EWS exon 10 juxtaposed to exon 6 of FLIl (10.6).
  • the NIH3T3 murine fibroblast cell line recapitulates the fibroblastic characteristics and represents an untransformed line immortalized with the protocol, 3T3. Precisely because of the ease of growth and the availability of the line, it has been widely used as a cellular system for the induction of chimeric fusion. Among the most relevant conclusions of these studies are: chimeric fusion promotes cell growth independent of anchorage (May, WA, et al., EWS / FLI-induced manic fringe renders NIH-3T3 tumorigenic cells. Nat. Genet., 1997 17 (4): p.
  • C2C12 (ATCC / CRL-1772) is a murine line of undifferentiated mesenchymal cells capable of differentiating myoblasts in vitro, and, by appropriate stimuli, towards osteoblasts or adipocytes, characteristic phenotypes of a mesenchymal cellular origin.
  • the introduction of the chimeric fusion in this cellular context has been carried out to know new relevant genes in the differentiation processes associated with the chimeric fusion and in order to recapitulate the histogenesis of the tumor (Eliazer, S. et al. Alteration of mesodermal cell differentiation by EWS / FLIl, the oncogene implicated in Ewing 's sarcoma Mol. Cell Biol. 2003 Jan; 23
  • the chimeric fusion is able to drastically inhibit the myogenic differentiation processes of the cell line.
  • the cells transfected with the fusion showed a significant delay in the expression of Myo D and very low expression or total absence of genes induced by Myo D such as myogenin, demines and actin.
  • Myo D genes induced by Myo D
  • the transfected cells did not follow an osteogenic differentiation pattern, they were positive for alkaline phosphatase although they did not show a constitutive increase in other bone markers such as osteocalcin or type I collagen. Therefore, in the C2C12 line a disturbance of the process of differentiation to osteoblasts and myocytes.
  • the cellular morphology was subtly altered, since the transfected cells acquired a more cubic morphology reminiscent of human tumors and was far from the typical fibrillar muscle morphology.
  • chimeric fusion is unable to transform primary cultures of mouse fibroblasts, and immortalized fibroblast lines without cooperating mutations (Ture, et al., Chromosome study of Ewing 's sarcoma (ES) cell lines. Consistency of a reciprocal • .translocation t (ll; 22) (q24; gl2). Genet Cancer Cytogent , 1984. 12 (1): p. 1-19).
  • Seconds decrease chimeric protein-induced apoptosis and promote EWS-FLI1-induced tumorigenesis in normal mouse fibroblasts.
  • MCS cells are able to differentiate into multiple cell types such as osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, skeletal muscle fibers, smooth muscle, neurons and astrocytes.
  • the induction of the chimeric fusion in this model blocks osteoblastic and adipocytic differentiation. It is speculated that the blockade of differentiation processes is a tumorigenic mechanism directed by the chimeric protein relevant to tumor pathogenesis (Plougastel, B. et al., Cloning and chromosome localization of the mouse EWS gene. Genomics, 1994, 23 (1 ): p. 278-81).
  • the transfected cells had a more rounded morphology and the nucleus occupied a central position.
  • the authors through specific mutations in any of the regions of the chimeric protein, demonstrated that the presence of the ETS domain of FLI-I is decisive for the inhibition of osteoblastic differentiation, while it is expendable for the blockade of differentiation to fatty tissue .
  • the development of animal models allows to recapitulate many aspects of the growth and development of. a tumor, such as the acquisition of genetic alterations associated with progression phenomena, or the ability of a paxa tumor to generate metastases.
  • a tumor such as the acquisition of genetic alterations associated with progression phenomena, or the ability of a paxa tumor to generate metastases.
  • the formation of new tumors from human cell lines or tumors is complicated by the inability of cells to grow in the new cell microenvironment.
  • Animal models for Ewing's tumor are scarcer than animal models for other solid pediatric tumors such as neuroblastoma or rhabdomyosarcoma (Beltlinger, C. et al., Murine models for experimental therapy of pediatric solid tumors with poor prognosis. Int. J. Cancer, 2001. 92 (3): p. 313-8). It is known that the ability to form tumors is completely dependent on the activity of the immune system. The development of tumors in normal mice has only been possible after their treatment with immunosuppressive agents.
  • Models include xenotransplants by administration of human Ewing cells to immunosuppressed mice. Ignorance of the cell type in which Ewing's tumor originates is perhaps the greatest obstacle to the development of new models. The lack of good syngeneic models prevents the development of potentially useful therapeutic strategies.
  • One way to generate tumor models in animals is to administer directly in the area of the animal's body in which the tumor in question is formed, cells that express the genetic alterations characteristic of the tumor. This allows the study of tumor development in situ. To this end, it is possible to use previously transformed cell lines or stem cells with the characteristic marker.
  • the present invention relates to a method for obtaining a non-human animal model of sarcoma characterized in that it comprises: transfecting cells of multipotent mesenchymal origin, other than human embryonic cell lines, with an expression vector containing a polynucleotide encoding a fusion protein selected from EWS-FLIl, EWS-ERG, EWS-ETVl, EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS-WTl, EWS-NR4A3 and EWS-DDIT3; and
  • multipotent mesenchymal cell line and “cell of multipotent mesenchymal origin” refer to any cell that, by inducing a genetic program of cellular differentiation under appropriate stimuli, is capable of generate various mesenchymal cell types (within the same embryonic layer) such as muscle cells or myoblasts, adipocytes, chondrocytes and / or osteoblasts.
  • MPC multipotent adult progenitor cells
  • said multipotent mesenchymal cell line is the C3HT10 1/2 cell line (ATCC / CCL-226).
  • the multipotent cell line is transfected with an expression vector encoding a fusion protein comprising a fragment of the EWS protein.
  • said fusion protein has been selected from EWS-FLIl, EWS-ERG, EWS-ETVl, EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS-WTl, EWS-NR4A3 and EWS-DDIT3.
  • the sarcoma of the method of the invention can be any sarcoma whose characteristic chromosomal alteration results in the expression of a fusion protein comprising part of the EWS gene.
  • said sarcoma is an Ewing tumor, clear cell sarcoma, desmoplastic small and round cell tumor, myxoid chondrosarcoma or myxoid liposarcoma.
  • the choice of the type of fusion protein is made according to the sarcoma model that you want to develop. In a particular embodiment, the selection is made according to the following table:
  • the method of the invention is a method for obtaining a non-human animal model of Ewing's tumor characterized in that it comprises: Transfect cells of muitipotent mesenchymal origin, other than human embryonic cell lines, with an expression vector containing a polynucleotide encoding a fusion protein selected from EWS-FLIl type 1, EWS-FLIl type 2, and EWS-FLIl type 3 ; and
  • the animal of the model is a rodent.
  • said animal is an immunosuppressed animal.
  • said animal is an immunosuppressed rodent.
  • said method is characterized in that the animal is a nude, athymic nude mouse.
  • said method is characterized in that said multipotent cells of mesenchymal origin is the C3HT10 1/2 cell line (ATCC / CCL-226).
  • the C3HT10 1/2 mesenchymal origin line is able to differentiate after induction with the chimeric transcript, to other aberrant cell types that are reminiscent of an origin.
  • the transfected cells are injected intramuscularly.
  • the method for obtaining an animal model of sarcoma is characterized in that the polynucleotide expressing the fusion protein is operatively linked to an inducible transactivator, whose expression regulates transcription of the polynucleotide encoding said fusion protein.
  • said inducible transactivator is an rtTA transactivator, adjustable by tetracycline or by other products of the tetracycline family, such as doxycycline.
  • a non-human animal model of sarcoma is also object of the present invention, characterized in that it is obtained by: transfection of cells of multipotent mesenchymal origin, other than human embryonic cell lines, with an expression vector containing a polynucleotide encoding a fusion protein selected from EWS-FLIl, EWS-ERG,
  • EWS-ETVl EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS-WTl, EWS-NR4A3 and EWS-DDIT3; Y
  • the sarcoma model of the invention can be any sarcoma whose characteristic chromosomal alteration results in the expression of a fusion protein comprising part of EWS.
  • said sarcoma is an Ewing tumor, clear cell sarcoma, desmoplastic small and round cell tumor, myxoid chondrosarcoma or myxoid liposarcoma.
  • the non-human animal model is an Ewing tumor model, characterized in that it is obtained by:
  • said animal model is a rodent.
  • said model is a immunosuppressed animal
  • said animal model is a nude nude mouse.
  • said multipotent cells of mesenchymal origin are the C3HT10 1/2 cell line (ATCC / CCL-226).
  • the polynucleotide expressing the fusion protein is operably linked to an inducible transactivator, for example rtTA, whose expression regulates the transcription of the polynucleotide encoding said fusion protein.
  • an inducible transactivator for example rtTA
  • the present invention relates to the use of a non-human animal model of sarcoma, preferably Ewing's tumor, obtained by the method described above, to test the anti-tumor pharmacological activity of a compound.
  • said invention relates to the use of a non-human animal model of sarcoma, preferably Ewing's tumor, in a method for selecting compounds with anti-tumor activity " characterized in that it comprises: administering the compound whose antitumor activity is wants to test, to said model animal, - compare the effect of said compound on the tumors of said animal, with the tumors of control animals that have not been treated with said compound.
  • a preferred embodiment of the invention relates to the use of the nonhuman animal model of sarcoma, preferably Ewing's tumor, described above, in a method for identifying markers associated with said sarcoma characterized in that it comprises comparing the presence, or absence, or the level of gene expression in tumor tissue samples of said model animal, with gene expression in the tissue of a second animal that has not received injection of transfected cells.
  • the invention also relates to a transformed cell line characterized in that.
  • the expression vector polynucleotide encodes a fusion protein selected from EWS-FLIl type 1, EWS-FLIl type 2 and EWS-FLIl type 3.
  • said multipotent cells of mesenchymal origin are an adult stem cell line (MAPC).
  • MPC adult stem cell line
  • said transformed cell line is derived from the C3HT10 1/2 cell line (ATCC / CCL-226).
  • said cell line described above is characterized in that the polynucleotide expressing the fusion protein is operatively linked to an inducible transactivator whose expression regulates the transcription of the polynucleotide encoding said fusion protein.
  • said cell line is characterized in that said inducible transactivator is rtTA.
  • the present invention also relates to the use of the transformed cell lines described above, in an in vitro method for testing the anti-tumor activity of a compound, characterized in that it comprises: culturing a sample of said cells with the compound to be tested. ; and evaluate the effect of said compound on said cells by analyzing genotypic or phenotypic traits of interest with respect to a sample of the same cells not treated with said compound.
  • FIGURES Figure 1 Mechanisms of activation of the retroviral vector.
  • FIG. 1 The upper figure shows the absence of expression of the chimeric fusion in both parental cells and those transfected with the empty vector.
  • the bottom gel shows the loading PCR product for Beta-actin, which was used for normalization of expression levels.
  • the positive control used corresponded to an Ewing Tumor cell line with an EWS-FLIl type 2 fusion.
  • B The figure shows the expression of the chimeric fusion in different clones.
  • Clones 7.5, 10.6 and 10.6 TE were positive for chimeric fusion after induction of the vector with doxycycline (2 ⁇ g / ml Dox, 48 h). All clones had an adjustable expression, the expression of the fusion being void in the absence of doxycycline. Clone 10.6 TE presented levels of fusion expression higher than those of clones 7.5 and 10.6. Other clones carrying inserts type 7.6 and 7.5 were also isolated that did not have a regulated expression for fusion and were therefore discarded for the study. Beta-actin amplification was used for normalization of fusion expression levels.
  • Figure 3 Induction of the chimeric fusion by Doxycycline.
  • A. Superior GeI. Induction of the chimeric fusion after treatment of the cells with increasing doses of doxycycline (0-3 ⁇ g / ml) in clone 7.5. The maximum induction was obtained for a dose of 2.5 ⁇ g / ml of doxycycline. Lower geI. The quantity of amplified product was identical in all cases as indicated by Beta-actin.
  • B GeI higher. The induction for clone 10.6 was maximal at a dose of 1.5 ⁇ g / ml of doxycycline. Higher doses produced saturation in the promoter's response. Lower geI. Beta-actin Figure 4.
  • EXAMPLE 1, 1 The murine C3HT10 1/2 cell line was obtained from the ATCC (ATCC / CCL-226). This line was used as a parental cell line in cell transformation studies. It was isolated in 1973, from mouse embryonic cells (strain C3H). It has fibroblastic morphology, grows in adherence, and is sensitive to contact inhibition. It is a pluripotent murine cell line that can
  • osteoblasts differentiate by specific inducers towards osteoblasts, chondrocytes, adipocytes and myoblasts.
  • This vector consists of two complementary expression systems.
  • One of the systems is an expression vector for the transactivator protein (rtTA), which expresses this protein constitutively.
  • the other system consists of an inducible expression system by doxycycline, which, when active, results in the transcription of the gene of interest, under the cytomegalovirus (CMV) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • the vector has two resistance genes for ampicillin and blasticidine for selection in prokaryotic and eukaryotic cells, respectively. In the presence of the effector (doxycycline), the rtTA protein is able to recognize its target sequence
  • EWS-FLI-I fusions (EWS-FLI-I fusions; type 1, 2 and 3) originally cloned into the pcDNA 3.1 +/- vector (Lin PP, et al. Differential transactivation by alternative) were obtained by PCR EWS-FL Fusion proteins correlates with clinical heterogeneity in Ewing's sarcoma; Cancer Res. 1999; 59: 1428-32).
  • a high-fidelity DNA Polymerase enzyme was used (Invitrogen / 11304-011).
  • the primers used for the amplification were designed to provide two inserts useful restriction targets for subsequent cloning of the same into the vector ⁇ retroviral.
  • the amplicon thus obtained introduced in the sequence 5 "a restriction target for the enzyme Xho I (CTCGAG) and at the 3" end a restriction target for Not I (CGGCCGC).
  • Table 1 shows its sequence and its hybridization temperature (TH).
  • the amplification conditions were:
  • the bands corresponding to the amplification products were cut from the gel and purified with the commercial method of Qiagen, Qiagen gel Extraction Kit (Qiagen / 28704) following the manufacturer's instructions
  • Retroviral vector 0.5 ⁇ g or Insert (3 ⁇ L of PCR product for each type of fusion)
  • Digestion buffer (5OmM Tris-HCl, 1OmM MgCl 2 , 10OmM NaCl, ImM DTT, pH7.9)
  • Each of the digested products was run again on a 1% agarose gel, and after verifying its size, it was trimmed from the gel and purified as described above.
  • the ligation reaction on the purified products was carried out at 15 0 C overnight, using 1 uL of T4 Ligase (New England Biolabs / 202) and 1 uL of ligation buffer 1Ox supplied by the company.
  • 0.5 ⁇ L of previously digested retroviral vector was used and between 0 and 1 ⁇ L for each type of insert. As a control, the same reaction was performed without including the insert.
  • Top ® 10 (Invitrogen / K4575-01), according to the manufacturer's instructions. Once transformed, they were seeded on agar plates with ampicillin (50 ⁇ g / mL). Several ampicillin-resistant clones were selected for each type of insert and grown separately in 5 mL liquid LB
  • the plasmids were grown in a LB broth of greater volume (200 mL), containing ampicillin at a concentration of 100 ⁇ g per mL which was grown for 16 hours at 37 0 C and 300 rpm.
  • Plasmid DNAs were extracted using the Clontech method (Clontech / PT3178-2). They were resuspended at a concentration of 1 .mu.g / mL in TE buffer and frozen at -20 0 C until use.
  • the AmphoPack TM cell line (BD Biosciences C3201-1) was transfected.
  • LIPOFECTAMINE TM 2000 (Invitrogen / 11668-027) was used to perform the transfections. Transfection was performed in cells grown in 6-well plates (CORNING / 3506) up to 80% confluence.
  • the cells were left in 2 mL of OPTI-MEM medium with Glutamax (Invitrogen / 51985-026) per well.
  • OPTI-MEM medium with Glutamax (Invitrogen / 51985-026) per well.
  • Glutamax Invitrogen / 51985-026
  • the two solutions were mixed and incubated 30 min. at room temperature (TA).
  • TA room temperature
  • the mixture was deposited on the cells.
  • the transfection was carried out in this medium
  • OPTI-MEM without fetal serum (SF) overnight after which the transfection medium was completely replaced. After 48 hours, the medium was collected, centrifuged, filtered through a filter pore size of 45 microns and stored at -70 0 C until use.
  • the C3HT10 1/2 cell line was cultured in 6-well plates, at a density of Ix 10 5 cells / well. After 24 hours, the supernatant obtained from the transfection of the cells was added to these cells
  • AmphoPack TM previously centrifuged and diluted 1: 2, 1: 4 and
  • blasticidine The selective dose of blasticidine was established from a previous cytotoxicity experiment for the parental line C3HT10 1/2, which was subjected to increasing doses of blasticidine (0.3, 0.6, 0.8, 1, 1.5, 2, 2.5,
  • the dose of 2 ⁇ g / mL was determined as the lowest dose that induced 100% death by cytotoxicity.
  • clones containing more than 200 cells were isolated. Be collected between 5-8 clones for each type of fusion using filter discs (Pgc Scientifics / 17-2). For this, the plates were washed with PBS and the filter discs slightly impregnated with trypsin-EDTA were deposited on the clones. After 5-10 minutes in the incubator at 37 ° C, they were transferred by forceps to a 24-well plate containing complete medium. It was gently shaken to facilitate the distribution of the cells in the well. All clones were grown to obtain sufficient number of cells for freezing. Before the molecular analysis of the transfectants, they were grown for at least a month and a half in the presence of an antibiotic. In addition, cell passes during that time of selection were performed at low density.
  • Clone transdifferentiation 10.6 When the selected cells reached pass 36, antibiotic was added again in order to verify the clonality of the culture. The cells maintained their viability after the antibiotic was added, showing that they were still carrying the retroviral vector. However, a spontaneous morphological change was observed in clone 10.6.
  • Clones 7.5 and 10.6 were subjected to increasing doses of doxycycline for 48 hours, after which the presence of the fusion was examined by RT-PCR.
  • Concentrations greater than 1.5-2 ⁇ g / ml were unable to cause greater induction of the chimeric transcript.
  • EWS-FLIl protein was analyzed by immunoprecipitation in clones 7.5 and 10.6.
  • Cell lysates of clones 7.5 and 10.6 were immunoprecipitated with an antibody against PLIl. After the development of the gel and the transfer of the immunoprecipitated protein, the detection was carried out with an antibody against EWS.
  • This expression system being adjustable, has the following advantages: 1. - It allows discriminating whether it is necessary that there is an "expression threshold" of the transcript so that it is related to a transformed phenotype.
  • mice A total of 96 nude mice (“athymic nude”) divided into the following groups were used in the developed animal model: For each of the clones under study (EWS-FLI-I type 1, 2 and 3 fusions) 24 mice were used for each type of fusion. These groups were subdivided into two subgroups of 12 animals / group, depending on whether they were supplied or not doxycycline. The dose of doxycycline that was administered was 1.5 mg / ml in the drinking water.
  • mice For mice that were injected with parental cells or transformed with the empty vector, 16 mice were used per cell type (parental / empty vector) that were again subdivided into two subgroups of 8 mice / group depending on whether they were supplied or not doxycycline in drinking water.
  • Each mouse was injected intramuscularly into the posterior Tibial muscle using a 29G needle,
  • mice that were injected with the parental cells or those transformed with the empty vector developed tumors.
  • Tumor efficiency was up to 100% for type 2 fusions, a fact that highlights the high Tumorgenic efficiency of cells transformed with the chimeric transcript.

Abstract

La invención objeto de la presente solicitud se refiere a un método para la obtención de un modelo animal no humano de sarcoma caracterizado porque comprende: transfectar células derivadas de una línea celular mesenquimal pluripotente, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLI1, EWS-ERG, EWS-ETV1, EWS­ETV4, EWS-FEV, EWS-ATF1, EWS-WT1, EWS-NR4A3 y EWS-DDIT3; e inyectar dichas células transfectadas en dicho animal objeto del modelo. Asimismo, la presente invención se refiere al propio modelo animal y sus aplicaciones, así como a la línea celular transfectada y las aplicaciones de la misma.

Description

MODELO ANIMAL NO HUMLMTO DE SARCOMA
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se engloba dentro del campo de los modelos animales no humanos, en este caso se trata de un modelo para estudiar sarcomas .
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN
Un sarcoma es un tipo general de cáncer poco frecuente, donde las células cancerosas surgen a partir de, o se parecen a, células normales del cuerpo, que forman parte de los "tejidos conectivos". Los "tejidos conectivos" normales incluyen el tejido graso, el músculo, vasos sanguíneos, tejidos profundos de la piel, nervios, huesos y cartílago. Los cánceres de células que se parecen a cualquiera de estos tej idos normales se conocen con el nombre de sarcomas . Los sarcomas a su vez están subclasificados en función del tipo celular específico que compone el tumor. Algunos de los subtipos más comunes de sarcoma se mencionan a continuación.
Los liposarcomas son tumores malignos que se desarrollan a partir del tejido graso. Pueden desarrollarse en cualquier parte del cuerpo, pero la mayoría de las veces crecen en el retroperitoneo. - Los leiomiosarcomas son tumores malignos que se desarrollan a partir del músculo liso. Pueden surgir en cualquier parte del cuerpo pero el útero y' el tracto gastrointestinal son dos localizaciones relativamente frecuentes para este tipo de tumor. - Los rabdomiosarcomas son tumores malignos que se parecen al músculo esquelético en desarrollo. Estos tumores aparecen en la mayor parte de los casos en brazos o piernas, pero también pueden desarrollarse en la zona de la cabeza o cuello, además de en los órganos urinarios y reproductivos.
El sarcoma sinovial es un tumor maligno compuesto por células que se parecen a las células presentes en las articulaciones (células sinoviales, que revisten las articulaciones) . Sin embargo, estos tumores no se desarrollan necesariamente en ninguna articulación, y el nombre probablemente induzca a error por poseer las células otro origen distinto. Los sarcomas sinoviales se desarrollan en cualquier punto del cuerpo, y frecuentemente se presentan en adultos jóvenes. El sarcoma de Ewing, también conocido como tumor neuroectodérmico periférico, tiene su origen en células muy primitivas del cuerpo.
El angiosarcoma es un tumor maligno que se parece a los vasos sanguíneos o linfáticos.
El fibrosarcoma es un cáncer de células de tipo fibroblasto . El tumor maligno de la vaina nerviosa periférica (MPNST: malignant peripheral nerve sheath tumor) también denominado neurofibrosarcoma .
El tumor estromal gastrointestinal es un tumor de las células conectivas que soportan el tracto gastrointestinal.
El osteosarcoma es un tumor de las células óseas .
El condrosarcoma es un tumor de las células que forman el cartílago.
En función de las alteraciones moleculares causantes de dichos sarcomas, éstos se pueden dividir en sarcomas derivados de aberraciones genéticas no recurrentes, y en sarcomas caracterizados por la presencia de una alteración genética recurrente, como puede ser una translocación cromosómica tal y como se produce en el sarcoma sinovial, el sarcoma mixoide, sarcoma de células claras o en el tumor de Ewing. Generalmente, estas translocaciones cromosómicas dan lugar a factores de transcripción quiméricos que desregulan la expresión de sus genes diana. Uno de los genes más frecuentes que forma parte de estas proteínas quiméricas es el gen EWS . Los tumores de Ewing representan la segunda neoplasia de tumores sólidos más frecuente en niños. Estos tumores aparecen en hueso y en tejidos blandos y a partir de un tipo celular desconocido. Estos tumores se caracterizan por la presencia de translocaciones cromosómicas específicas que yuxtaponen el gen EWS en 22ql2, con un gen de la familia de ETS, siendo el más común FLIl en Ilq24. La proteína de fusión EWS-FLIl es la fusión más prevalente con una incidencia del 95% de los tumores, aunque EWS también puede translocarse con otros genes. Esta proteína quimérica actúa como un factor de transcripción aberrante con propiedades oncogénicas .
A nivel genómico los puntos de rotura para el gen EWS se extienden en una región de 8 Kb mientras que para FLI-I están dispersos a lo largo de aproximadamente 35 Kb. Esto da lugar a múltiples tipos de fusiones que incorporan diferentes exones para cada gen. Existen 12 tipos descritos de fusiones EWS-FLIl, aunque las más frecuentes son las de tipo 1, EWS exón 7 yuxtapuesto al exón 6 de FLIl (7.6); tipo 2, EWS exón 7 yuxtapuesto al exón 5 de FLIl (7.5); y tipo 3, EWS exón 10 yuxtapuesto al exón 6 de FLIl (10.6).
La alta prevalencia de fusiones EWS-ETS en la familia de tumores de Ewing y el gran número de evidencias experimentales descritas en la literatura, indican que la proteína quimérica es clave para la génesis y el mantenimiento del tumor.
Aunque experimentos in vitro han demostrado la capacidad transformante de la expresión del transcrito quimérico, hasta el momento se desconoce el tipo celular en el que se origina la translocación. Este desconocimiento hace difícil la comprensión de la biología tumoral e imposibilita el establecimiento de un patrón de progresión en el que se determinen dianas moleculares, sin las cuales resulta difícil el desarrollo de una terapéutica eficaz. Por lo tanto, el establecimiento de modelos encaminados a la comprensión de los mecanismos moleculares de transformación tumoral, así como la determinación del tipo celular originario del tumor de Ewing, representan dos de los objetivos más decisivos en la investigación de este tumor .
La inducción del transcrito quimérico en diversos contextos celulares, ha sido una de las estrategias más utilizadas para dilucidar los procesos moleculares de diferenciación asociados, así como los genes diana inducidos directamente por la fusión. Así, se han realizado estudios en diversas líneas celulares de ratón: - NIH3T3
La línea celular de fibroblastos murinos NIH3T3 recapitula las características fibroblásticas y representa una línea no transformada inmortalizada con el protocolo, 3T3. Precisamente por la facilidad de crecimiento y la disponibilidad de la línea, ha sido ampliamente utilizada como sistema celular para la inducción de la fusión quimérica. Entre las conclusiones más relevantes de estos estudios destacan: la fusión quimérica promueve el crecimiento celular en independencia de anclaje (May, W.A. , et al., EWS/FLIl-induced manic fringe renders NIH-3T3 cells tumorigenic. Nat . Genet . , 1997. 17(4) :p. 495-7) y la formación de tumores en ratones inmunodeprimidos (Thompson, A. D., et al., Divergent Ewing 's sarcoma EWS/ETS fusions confer a common tumorigenic phenotype on NIH3T3 cells. Oncogene, 1999. 18(40): p. 5506-13). Es decir, la inducción del transcrito quimérico en células inmortalizadas confiere capacidad tumorogénica y afecta profundamente a la morfología celular (Teitell, M.A. , et al. EWS/ETS fusión genes induce epithelial and neuroectodermal differentiation. Lab Invest, 1999. 79(12) :p. 1535-43).
- C2C12
C2C12 (ATCC/CRL-1772) es una línea murina de células mesenquimales indiferenciadas capaz de diferenciarse in vitro a mioblastos, y, mediante los estímulos adecuados, hacia osteoblastos o adipocitos, fenotipos característicos de un origen celular mesenquimal . La introducción de la fusión quimérica en este contexto celular se ha llevado a cabo para conocer nuevos genes relevantes en los procesos de diferenciación asociados a la fusión quimérica y con objeto de recapitular la histogénesis del tumor (Eliazer, S. et al . Alteration of mesodermal cell differentiation by EWS/FLIl, the oncogene implicated in Ewing ' s sarcoma. Mol. Cell Biol . 2003 Jan; 23
(2) : 482-92) .
En este microambiente celular la fusión quimérica es capaz de inhibir drásticamente los procesos de diferenciación miogénicos de la línea celular. Las células transfectadas con la fusión mostraron un importante retardo en la expresión de Myo D y muy baja expresión o ausencia total de genes inducidos por Myo D como miogenina, desmina y actina. Sin embargo, aunque las células transfectadas no siguieron tampoco un patrón de diferenciación osteogénica, fueron positivas para fosfatasa alcalina a pesar de que no mostraron un aumento constitutivo de otros marcadores óseos como osteocalcina o colágeno tipo I. Por tanto, en la línea C2C12 se produce una perturbación del proceso de diferenciación a osteoblastos y a miocitos.
La morfología celular se vio sutilmente alterada, ya que las células transfectadas adquirieron una morfología más cúbica que recordaba a los tumores humanos y distaba mucho de la morfología fibrilar típica del músculo.
La inducción de la fusión también modificó la expresión de genes reguladores del ciclo celular. Dos moléculas importantes para el paso del punto de restricción del ciclo celular Gl se vieron afectadas. P2iWAF1/CIP1 disminuyó drásticamente su expresión, mientras que la expresión de ciclina Dl se vio notablemente reforzada.
- CÉLULAS PRIMARIAS DE RATÓN
Curiosamente, la fusión quimérica es incapaz de transformar cultivos primarios de fibroblastos de ratón, y líneas inmortalizadas de fibroblastos sin mutaciones cooperantes (Ture, et al., Chromosome study of Ewing ' s sarcoma (ES) cell lines. Consistency of a reciprocal • .translocation t(ll;22) (q24;gl2) . Cáncer Genet . Cytogent . , 1984. 12 (1) : p. 1-19) .
Células normales de ratón en las que se ha introducido la fusión quimérica son incapaces de sostener una expresión
. estable de la proteína quimérica, debido probablemente, al efecto tóxico de la misma en ese ambiente celular no permisivo. Este fenómeno también se ha observado en líneas celulares inmortalizadas de linajes celulares - mesenquimáticos (Rat-1) , epiteliales (HeLa) y neuroectodérmicos (NCM-I). Además, la introducción de la
••'fusión quimérica en fibroblastos normales de ratón provoca,
;,: sorprendentemente, la inducción de apoptosis y parada del
';',"ciclo celular. Este fenómeno es común a otros oncogenes :¡ ,corao c-Myc o Ras, en los que también se ha observado
>' /"apoptosis celular e inhibición del crecimiento tras ser
.' introducidos en fibroblastos normales (Delattre, 0., et
•. al. , , Gene fusión with an ETS DNA-binding domain caused by
', chromosome translocation in human tumours . Nature, 1992 ']. 359(6391) :p. 162-5; Plougastel, B., et al., Genomic
'•ή structure of the EWS gene and it ' s relationship to EWSRl, a
•• site of tumor-associated chromosome translocation.
Genomics, 1993, 18(3) :p. 609-15). Sin embargo, la
,.-,' interrupción de las vías de señalización de plθ^*1 y p53 o "* la expresión de los genes E6 y E7 del virus del papiloma
.humano, permiten la expresión estable de la proteína en
'¡'fibroblastos normales. Además, estas alteraciones
^secundarias disminuyen la apoptosis inducida por la proteína quimérica y promueven la tumorogénesis inducida por EWS-FLIl en fibroblastos normales de ratón.
- CÉLULAS MULTIPOTENTES DERIVADAS DEL ESTROMA DE MÉDULA ÓSEA (MCS) HUMANAS.
La transfección de la fusión en células multipotentes humanas también se ha utilizado como modelo para recapitular la histogénesis del tumor. Las células MCS son capaces de diferenciarse hacia múltiples tipos celulares como son osteoblastos, adipocitos, condrocitos, fibras de músculo esquelético, músculo liso, neuronas y astrocitos . La inducción de la fusión quimérica en este modelo, bloquea la diferenciación osteoblástica y adipocítica. Se especula que el bloqueo de los procesos de diferenciación es un mecanismo tumorogénico dirigido por la proteína quimérica relevante para la patogenia tumoral (Plougastel, B. et al., Cloning and chromosome localization of the mouse EWS gene. Genomics, 1994, 23(1): p. 278-81). Además, al igual que en otros modelos, las células transfectadas presentaban una morfología más redondeada y el núcleo ocupaba una posición central . Los autores, mediante mutaciones concretas en alguna de las regiones de la proteína quimérica, demostraron que la presencia del dominio ETS de FLI-I es determinante para la inhibición de la diferenciación osteoblástica, mientras que es prescindible para el bloqueo de la diferenciación a tejido graso.
MODELOS ANIMALES
Por otra parte, el desarrollo de modelos animales permite recapitular muchos aspectos del crecimiento y el desarrollo de . un tumor, como son la adquisición de alteraciones genéticas asociadas con fenómenos de progresión, o la capacidad de un tumor paxa generar metástasis. No obstante, la formación de nuevos tumores a partir de líneas celulares o tumores humanos resulta complicado por la incapacidad de las células de crecer en el nuevo microambiente celular.
Los modelos animales para el tumor de Ewing son más escasos que los modelos animales para otros tumores pediátricos sólidos como el neuroblastoma o el rabdomiosarcoma (Beltlinger, C. et al., Murine models for experimental therapy of pediatric solid tumors with poor prognosis. Int. J. Cáncer, 2001. 92(3): p. 313-8). Se sabe que la capacidad para formar tumores es completamente dependiente de la actividad del sistema inmune. El desarrollo de tumores en ratones normales sólo ha sido posible tras el tratamiento de los mismos con agentes inmunosupresores . Este tratamiento, a diferencia de otros tumores como los osteosarcomas, no modifica la histología de los tumores derivados (Floersheim, G. L. et al., Growth of human tumors in mice after short-term immunosuppression with procarbazine, cyclophosphamide, and antilymphocyte serum. Transplantation, 1980. 30(4): p. 275- 80) . Se sabe incluso que la formación de tumores es más eficiente en ratones atímicos tras la inhibición de los macrófagos y/o células asesinas naturales de los mismos. De hecho la formación de tumores aumenta en más de un 60% tras el bloqueo de estos tipos celulares (Torhorst, J. , Growth stimulation in a Ewing sarcoma after "macrophage blockade" in athymic (nude) mice. Schweiz Med. Wochenschr, 1981. 111 (36) : p. 1319-21) .
Entre los modelos destacan los xenotransplantes mediante administración de células humanas de Ewing a ratones inmunodeprimidos . El desconocimiento del tipo celular en el que se origina el tumor de Ewing constituye quizás, el mayor obstáculo para el desarrollo de nuevos modelos . La falta de buenos modelos singénicos impide el desarrollo de estrategias terapéuticas potencialmente útiles .
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Una forma de generar modelos tumorales en animales, consiste en administrar directamente en la zona del cuerpo del animal en la que se forma el tumor en cuestión, células que expresan las alteraciones genéticas características del tumor. Esto permite el estudio del desarrollo in situ del tumor . Con este fin, es posible utilizar líneas celulares o células madre previamente transformadas con el marcador característico .
La presente invención se refiere a un método para la obtención de un modelo animal no humano de sarcoma caracterizado porque comprende: transfectar células de origen mesenquimal multipotente, distintas de las líneas celulares embrionarias humanas, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl, EWS-ERG, EWS-ETVl, EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS-WTl, EWS- NR4A3 y EWS-DDIT3; e
- inyectar dichas células transfectadas en dicho animal objeto del modelo.
Para obtener el modelo de sarcoma al que se refiere la invención es posible utilizar cualquier tipo de línea celular mesenquimal multipotente. Tal y como se utilizan en esta invención los términos "línea celular mesenquimal multipotente" y "célula de origen mesenquimal multipotente"' se refieren a cualquier célula que, mediante la inducción de un programa genético de diferenciación celular bajo los estímulos adecuados, es capaz de generar diversos tipos celulares mesenquimales (dentro de la misma capa embrionaria) como son las células musculares o mioblastos, adipocitos, condrocitos y/o osteoblastos. Dichos términos incluyen también las células progenituras adultas multipotentes derivadas de médula ósea (MAPC: multipotent adult progenitor cells) , que pueden generar o dar lugar a tipos celulares diferentes, tanto mesenquimales como a otros tipos celulares pertenecientes a otras capas embrionarias distintas a la suya.
En una realización preferente de la invención, dicha línea celular mesenquimal multipotente es la línea celular C3HT10 1/2 (ATCC/CCL-226) .
Según la invención la línea celular multipotente es transfectada con un vector de expresión que codifica una protelna de fusión que comprende un fragmento de la proteína EWS. En una realización particular dicha proteína de fusión se ha seleccionado entre EWS-FLIl, EWS-ERG, EWS-ETVl, EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS-WTl, EWS-NR4A3 y EWS-DDIT3.
El sarcoma del método de la invención puede ser cualquier sarcoma cuya alteración cromosómica característica resulte en la expresión de una proteína de fusión que comprende parte del gen EWS. En una realización particular dicho sarcoma es un tumor de Ewing, sarcoma de células claras, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, condrosarcoma mixoide o liposarcoma mixoide. La elección del tipo de proteína de fusión se realiza atendiendo al modelo de sarcoma que se quiere desarrollar. En una realización particular, la selección se realiza según la siguiente tabla:
Tabla 1. Tipos de sarcoma y sus alteraciones asociadas
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En una realización particular el método de la invención es un método para la obtención de un modelo animal no humano de tumor de Ewing caracterizado porque comprende: transfectar células de origen mesenquimal muítipotente, distintas de las líneas celulares embrionarias humanas, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl tipo 1, EWS-FLIl tipo 2, y EWS-FLIl tipo 3; e
- inyectar dichas células transíectadas en dicho animal objeto del modelo.
-.!- En una realización concreta, el método objeto de la
.presente solicitud, está caracterizado porque el animal del modelo es un roedor. En una realización preferente de la presente invención, dicho animal es un animal inmunodeprimido. En una realización preferente, dicho animal es un roedor inmunodeprimido.
•'*fψ, En una realización más preferente de la invención, dicho método está caracterizado porque el animal es un ratón , atímico desnudo (athymic nude) .
- En una realización preferente de la invención, dicho método está caracterizado porque dichas células multipotentes de origen mesenquimal es la línea celular C3HT10 1/2 (ATCC/CCL-226) . En este caso, la línea de origen mesenquimal C3HT10 1/2 es capaz de diferenciarse tras la inducción con el transcrito quimérico, a otros tipos celulares aberrantes que son reminiscentes de un origen
;'ήeuroectodérmico, por la presencia de , marcadores específicos neuronales como Neurofilamento M, Neu y tubulina III. En otra realización concreta de la invención, las células transfectadas se inyectan por vía intramuscular.
En una realización concreta de la invención, el método para la obtención de un modelo animal de sarcoma, por ejemplo tumor de Ewing, está caracterizado porque el polinucleótido que expresa la proteína de fusión está operativamente unido a un transactivador inducible, cuya expresión regula la transcripción del polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión. En una realización preférente del método objeto de la presente invención, dicho transactivador inducible es un transactivador rtTA, regulable por tetraciclina o por otros productos de la familia de las tetraciclinas, como la doxiciclina.
Por otro lado, también es objeto de la presente invención un modelo animal no humano de sarcoma, caracterizado porque se obtiene mediante: transfección de células de origen mesenquimal multipotente, distintas de las líneas celulares embrionarias humanas, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl, EWS-ERG,
EWS-ETVl, EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS-WTl, EWS- NR4A3 y EWS-DDIT3; y
- la inyección de dichas células transfectadas en dicho animal objeto del modelo.
El modelo de sarcoma de la invención puede ser cualquier sarcoma cuya alteración cromosómica característica resulte en la expresión de una proteína de fusión que comprende parte de EWS. En una realización particular dicho sarcoma es un tumor de Ewing, sarcoma de células claras, tumor desmoplásico de células pequeñas- y redondas, condrosarcoma mixoide o liposarcoma mixoide . En una realización particular el modelo animal no humano es un modelo de tumor de Ewing, caracterizado porque se obtiene mediante:
-la transfección de células de origen mesenquimal multipotente, distintas de las líneas celulares embrionarias humanas, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl tipo 1, EWS-FLIl tipo 2, y EWS-FLIl tipo 3; y
-la inyección de dichas células transfectadas en dicho animal objeto del modelo.
En una realización concreta, dicho modelo animal es un roedor. En una realización preferente, dicho modelo es un animal inmunodeprimído . En una realización más preferente, dicho modelo animal es un ratón atímico desnudo.
En una realización particular del presente modelo, dichas células multipotentes de origen mesenquimal son la línea celular C3HT10 1/2 (ATCC/CCL-226) .
En una realización preferente del presente modelo animal, el polinucleótido que expresa la proteína de fusión está operativamente unido a un transactivador inducible, por ejemplo rtTA, cuya expresión regula la transcripción del polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión.
Además, la presente invención se refiere al uso de un modelo animal no humano de sarcoma, preferentemente tumor de Ewing, obtenido por el método anteriormente descrito, para ensayar la actividad farmacológica anti-tumoral de un compuesto .
En una realización concreta, dicha invención se refiere al uso de un modelo animal no humano de sarcoma, preferentemente tumor de Ewing, en un método para seleccionar compuestos con actividad anti-tumoral" caracterizado porque comprende: administrar el compuesto cuya actividad anti- tumoral se quiere ensayar, a dicho animal modelo, - comparar el efecto de dicho compuesto sobre los tumores de dicho animal, con los tumores de animales control que no han sido tratados con dicho compuesto.
Asimismo, una realización preferente de la invención se refiere al uso del modelo animal no humano de sarcoma, preferentemente tumor de Ewing, descrito anteriormente, en un método para identificar marcadores asociados a dicho sarcoma caracterizado porque comprende comparar la presencia, o ausencia, o el nivel de expresión génica en muestras de tejido tumoral de dicho animal modelo, con la expresión génica en el tejido de un segundo animal que no ha recibido inyección de células transfectadas . La invención también se refiere a una linea celular transformada caracterizada porque . es una línea celular derivada de células multipotentes de origen mesenquimal diferentes de líneas celulares embrionarias humanas, transfectada con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl, EWS-ERG, EWS-ETVl, EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS-WTl, EWS-NR4A3 y EWS-DDIT3.
En una realización preferente el polinucleótido del vector de expresión codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl tipo 1, EWS-FLIl tipo 2 y EWS- FLIl tipo 3.
En una realización particular, dichas células multipotentes de origen mesenquimal son una línea de células madre progenituras procedentes de adultos (MAPC) .
En otra realización concreta de la invención, dicha línea celular transformada procede de la línea celular C3HT10 1/2 (ATCC/CCL-226) .
Asimismo, en una realización preferente de la invención, dicha línea celular descrita anteriormente está caracterizada porque el polinucleótido que expresa la proteína de fusión, está operativamente unido a un transactivador inducible cuya expresión regula la transcripción del polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión. En una realización preferida, dicha línea celular está caracterizada porque dicho transactivador inducible es rtTA.
Por último, la presente invención también se refiere al uso de las líneas celulares transformadas descritas anteriormente, en un método in vitro para ensayar la actividad anti-tumoral de un compuesto, caracterizado porque comprende : cultivar una muestra de dichas células con el compuesto a ensayar; y evaluar el efecto de dicho compuesto sobre dichas células analizando rasgos genotípicos o fenotípicos de interés con respecto a una muestra de las mismas células no tratadas con dicho compuesto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Mecanismos de activación del vector retroviral .
En presencia de Doxiciclina (Dox+) , la proteína transactivadora (rtTA) es capaz de reconocer la región teto, lo que permite la transcripción del gen de interés bajo el promotor del Citomegalovirus . Figura 2. Análisis de los clones seleccionados. A. La figura superior muestra la ausencia de expresión de la fusión quimérica tanto en las células parentales como en las transfectadas con el vector vacío. El gel inferior muestra la carga producto de PCR para Beta-actina, que fue utilizada para la normalización de los niveles de expresión. El control positivo utilizado correspondía a una línea celular de Tumor de Ewing con una fusión EWS-FLIl tipo 2. B. La figura muestra la expresión de la fusión quimérica en diferentes clones. Los clones 7.5, 10.6 y 10.6 TE fueron positivos para la fusión quimérica tras la inducción del vector con doxiciclina (2μg/ml de Dox, 48 h) . Todos los clones presentaban una expresión regulable, siendo nula la expresión de la fusión en ausencia de doxiciclina. El clon 10.6 TE presentó niveles de expresión de la fusión superiores a los de los clones 7.5 y 10.6. Se aislaron además otros clones portadores de insertos tipo 7.6 y 7.5 que no presentaron una expresión regul-ada para la fusión y fueron por tanto, descartados para el estudio. La amplificación de Beta-actina se utilizó para la normalización de los niveles de expresión de la fusión.
Figura 3. Inducción de la fusión quimérica por Doxiciclina. A. GeI superior. Inducción de la fusión quimérica tras tratamiento de las células con dosis crecientes de doxiciclina (0-3 μg/ml) en el clon 7.5. La máxima inducción se obtuvo para dosis de 2,5 μg/ml de doxiciclina. GeI inferior. La cantidad de producto amplificado fue idéntica en todos los casos tal y como indica la Beta-actina. B. GeI superior. La inducción para el clon 10.6 fue máxima a dosis de 1,5 μg/ml de doxiciclina. Dosis superiores produjeron una saturación en la respuesta del promotor. GeI inferior. Beta-actina . Figura 4. Inmunoprecipitación de los clones 7.5 y 10.6. La proteína EWS-FLIl se encontraba expresada de manera regulada en los clones 7.5 y 10. β. Tanto en las muestras sin tratar con doxiciclina como con el clon portador del vector vacío, el anticuerpo detectó una ligera banda del mismo peso molecular. La línea celular A673 fue incluida como control positivo en el experimento.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo que representa una realización concreta de la misma, de forma ilustrativa y en modo alguno limitativo.
EJEMPLO 1 , 1La línea celular murina C3HT10 1/2, fue obtenida de la ATCC (ATCC/CCL-226) . Esta línea se utilizó como línea celular parental en los estudios de transformación celular. Fue aislada en 1973, a partir de células embrionarias de ratón (cepa C3H) . Presenta morfología fibroblástica, crece en adherencia, y es sensible a la inhibición por contacto. Es una línea celular murina pluripotente que puede
'diferenciarse mediante inductores específicos hacia i osteoblastos, condrocitos, adipocitos y mioblastos.
1. -Construcción del vector inducible.
Para generar el modelo inducible, se empleó un vector retroviral regulable por tetraciclina o alguno de sus análogos (doxiciclina) .
Este vector consta de dos sistemas de expresión complementarios. Uno de los sistemas es un vector de expresión para la proteína transactivadora (rtTA) , que expresa esta proteína de manera constitutiva. El otro sistema consta de un sistema de expresión inducible por doxiciclina, que al estar activo da lugar a la transcripción del gen de interés, bajo el promotor del citomegalovirus (CMV) . Además, el vector presenta dos genes de resistencia para ampicilina y blasticidina para su selección en células procariotas y eucariotas, respectivamente. En presencia del efector (doxiciclina) , la proteína rtTA es capaz de reconocer su secuencia diana
(teto) dentro del vector, permitiendo por tanto la activación transcripcional del gen de interés (Figura 1) , desarrollado originalmente por Watsuji y colaboradores (Watsuji, T. et al., Controlled gene expression with a reverse tetracycline-regulated retroviral vector (RTRV) system. Biochem. Biophys . Res. Commun. , 1997. 234(3): p. 769-73) .
a) Amplificación
En primer lugar, se obtuvieron mediante PCR múltiples copias de- los insertos (fusiones EWS-FLI-I; tipo 1, 2 y 3) clonados originalmente en el vector pcDNA 3.1+/- (Lin PP, et al. Differential transactivation by alternative EWS-FLIl fusión proteins correlates with clinical heterogeneity in Ewing's sarcoma; Cáncer Res. 1999; 59: 1428-32).
Para ello se utilizó una enzima ADN Polimerasa, de alta fidelidad (Invitrogen/11304-011) . Los cebadores utilizados para la amplificación se diseñaron para dotar a los insertos de dos dianas de restricción útiles para la posterior clonación de los mismos en el vector ^retroviral . El amplicón así obtenido introducía en la secuencia 5" una diana de restricción para la enzima Xho I (CTCGAG) y en el extremo 3" una diana de restricción para Not I (CGGCCGC) . En la tabla 1 se recoge su secuencia y su temperatura de hibridación (TH) .
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Tabla 2. Secuencia y temperatura de hibridación de los cebadores utilizados para la amplificación del transcrito quimérico. S: sentido; AS: antisentido.
Las condiciones de amplificación fueron:
Desnaturalización inicial 940C 5 min
Reacción cíclica 940C 30 s
(40 ciclos) 58°C 45 s
720C 3 min
Extensión final 720C 7 min
Una vez desarrollado el gel y verificado que el tamaño de los insertos era el correcto, las bandas correspondientes a los productos de amplificación, fueron recortadas del gel y purificadas con el método comercial de Qiagen, Qiagen gel Extraction Kit (Qiagen/28704) siguiendo las instrucciones del fabricante.
b) Digestión
Una vez purificados, los productos fueron digeridos con las enzimas de restricción Xho I y JVot I . El vector retroviral original, portador de las dianas para las enzimas también fue digerido. La reacción de digestión consistió en una mezcla cuya composición final constaba de:
• Vector retroviral (0.5 μg) o Inserto (3μL de producto de PCR para cada tipo de fusión)
• Tampón de digestión (5OmM Tris-HCl, 1OmM MgCl2, 10OmM NaCl, ImM DTT, pH7.9)
• BSA 1% • Xho I (0.5 μL/New England Biolabs/R0146S)
• Not I (0.5 μL/New England Biolabs/R0189S)
• Agua hasta completar un volumen de 30 μL
La digestión se llevó a cabo a 370C durante 20 horas .
Cada uno de los productos digeridos se volvió a correr en un gel de agarosa al 1%, y tras verificar su tamaño, fue recortado del gel y purificado como se ha descrito anteriormente.
c) Ligación
La reacción de ligación sobre los productos purificados se llevo a cabo a 15 0C durante toda la noche, mediante el uso de 1 μL de Ligasa T4 (New England Biolabs/202) y 1 μL de tampón de ligación 1Ox suministrado por dicha compañía. Para la reacción se utilizó 0,5 μL de vector retroviral previamente digerido y entre 0 y 1 μL para cada tipo de inserto. Como control se realizó la misma reacción sin incluir el inserto.
d) Transformación, selección Y obtención del vector retroviral
Todo el producto de ligación de cada una de las muestras, se utilizó para transformar las bacterias E. colí
Top®10 (Invitrogen/K4575-01) , según las instrucciones del fabricante. Una vez transformadas, se sembraron en placas de agar con ampicilina (50 μg/mL) . Se seleccionaron varios clones resistentes a ampicilina para cada tipo de inserto y se crecieron separadamente en 5 mL LB líquido
(DIFCO/214050) durante toda la noche en agitación (300 rpm) a 37°C.
Se realizó un análisis de 4/5 colonias por cada una de las 3 ligaciones, utilizando el kit comercial de Roche. Tras la obtención del ADN plasmídico se digirió una alícuota de cada uno de los plásmidos con Xho I y Not I de forma semejante a lo descrito anteriormente. Se corrió el producto de la digestión en un gel de agarosa y se detectaron las colonias positivas para la presencia de inserto. Posteriormente se llevó a cabo la secuenciación mediante fluorescencia.
Una vez verificada la fidelidad e integridad de la secuencia de ADN para cada una de las fusiones tras la reacción de ligación, se crecieron los plásmidos en un caldo de LB de mayor volumen (200 mL) , conteniendo ampicilina a concentración de 100 μg por mL, que se dejó crecer durante 16 horas a 37 0C y 300 rpm.
Se extrajeron los ADNs plasmídicos mediante el método de Clontech (Clontech/PT3178-2) . Se resuspendieron a una concentración de 1 μg/mL en buffer TE y se congelaron a -20 0C hasta su posterior utilización.
2. - Obtención de retrovirus transfectantes
Para la obtención de partículas virales, se transfectó la línea celular AmphoPack™ (BD Biosciences C3201-1) .
Las condiciones de máxima eficiencia de transfección se determinaron mediante un experimento previo en el que se transfectó la misma línea celular, con un vector que portaba el gen de la β-galactosidasa. Para realizar las transfecciones se utilizó LIPOFECTAMINE™ 2000 (Invitrogen/11668-027) . La transfección se realizó en células crecidas en placas de 6 pocilios (CORNING/3506) hasta un 80% de confluencia. Para
® ello, las células se dejaron en 2 mL de medio OPTI-MEM con Glutamax (Invitrogen/51985-026) por pocilio. Para cada tipo de fusión se mezclaron, 8 μg de ADN de vector con inserto
® diluidos en un volumen de 500 μL de medio OPTI-MEM junto con 20 μL de LIPOFECTAMINE™ 2000 diluidos también en 500 μL de OPTI-MEM, siguiendo las instrucciones del fabricante. Como controles se realizaron la transfección del vector vacío (sin inserto) , y con la solución de LIPOFECTAMINE™ 2000 sin ningún tipo de ADN plasmídico.
Las dos soluciones (medio; vector y medio; lipofectamina) se mezclaron y se incubaron 30 min. a temperatura ambiente (TA) . La mezcla se depositó sobre las células. La transfección fue llevada a cabo en este medio
OPTI-MEM sin suero fetal (SF) durante toda la noche, al cabo de la cual el medio de transfección fue sustituido por medio completo. Tras 48 horas, el medio fue recogido, centrifugado, filtrado mediante filtro de un tamaño de poro de 45 mieras y almacenado a -700C hasta su utilización.
3. - Transducción
Se cultivó la línea celular C3HT10 1/2 en placas de 6 pocilios, a una densidad Ix 105 céls/pocillo . Tras 24 horas, sobre estas células se añadió el sobrenadante obtenido a partir de la transfección de las células
AmphoPack™, previamente centrifugado y diluido 1:2, 1:4 y
1:6 'en medio de cultivo completo. Tras 24 horas en ' presencia de este sobrenadante diluido., el medio fue reemplazado por medio completo.
4. - Selección de clones
Tras 48 horas, se comenzó la selección mediante .i.tratamiento con blasticidina (2 μg/mL) para la selección de 'células positivamente infectadas con los viriones celulares .
La dosis selectiva de blasticidina fue establecida a partir de un experimento previo de citotoxicidad para la línea parental C3HT10 1/2, que fue sometida a dosis crecientes de blasticidina (0.3, 0.6, 0.8, 1, 1.5, 2, 2.5,
3 μg/mL) . Se determinó la dosis de 2 μg/mL, como la dosis más baja que inducía el 100% de muerte por citotoxicidad.
Aproximadamente 2 semanas después de la transfección, los clones que contenían más de 200 células se aislaron. Se recogieron entre 5-8 clones por cada tipo de fusión mediante discos de filtro (Pgc Scientifics/17-2) . Para ello se lavaron las placas con PBS y se depositaron sobre los clones los discos de filtro ligeramente impregnados en tripsina-EDTA. Tras 5-10 minutos en el incubador a 37 °C, se trasladaron mediante fórceps a una placa de 24 pocilios conteniendo medio completo. Se agitó suavemente para facilitar la distribución de las células en el pocilio. Se crecieron todos los clones hasta obtener suficiente número de células para su congelación. Antes del análisis molecular de los transfectantes, éstos se crecieron al menos durante un mes y medio en presencia de antibiótico. Además, los pases celulares durante ese tiempo de selección se realizaron a baja densidad.
Análisis de los clones seleccionados.
Se analizó la presencia de la fusión quimérica mediante RT-PCR en los clones obtenidos a partir de la selección con blasticidina.. Como controles se utilizaron células parentales no transducidas y las transducidas con el vector vacío que resultaron negativas para la fusión EWS-FLIl. Utilizando los cebadores para la amplificación, se obtuvieron clones positivos para los tres tipos de fusiones (7.5, 7.6 y 10.6) . No obstante, únicamente se encontraron clones inducibles para las fusiones tipo 2 (7.5) y tipo 3 (10.6) (Figura 2) .
Transdiferenciación del clon 10.6. Cuando las células seleccionadas alcanzaron el pase 36, se volvió a añadir antibiótico con el fin de verificar la clonalidad del cultivo. Las células mantuvieron su viabilidad tras la adición del antibiótico, poniendo de manifiesto que seguían portando el vector retroviral . Sin embargo, se observó un cambio morfológico espontáneo en el clon 10.6.
Dentro del cultivo celular surgieron células fenotípicamente diferentes al clon 10.6, que fueron designadas como Tipo-Ewing (10.6 TE), por su parecido morfológico a las células del tumor. Éstas se separaron del cultivo y se crecieron aisladamente en presencia o ausencia de blasticidina, con el fin de determinar si el fenotipo de las mismas variaba. Las células aisladas mantuvieron su fenotipo constante a lo largo del tiempo, siendo éste independiente de la presencia o ausencia de blasticidina en el medio de cultivo. El análisis molecular de este subclon reveló la presencia de una fusión EWS-FLIl tipo 3, igual al clon 10.6 del que derivaba. Sin embargo, sorprendentemente, los estudios de RT-PCR pusieron de manifiesto que los niveles de expresión de la fusión quimérica eran mayores en este subclon que en el clon 10.6 del que derivaban ya que eran necesarios menos ciclos de PCR para lograr un nivel similar de amplificación.
Inducción de la fusión quimérica por doxiciclina.
Los clones 7.5 y 10.6 fueron sometidos a dosis crecientes de doxiciclina durante 48 horas, transcurridas las cuales se examinó por RT-PCR la presencia de la fusión.
Para el clon 7.5 dosis de 0,3 μg/ml de doxiciclina fueron capaces de provocar una ligera inducción que fue dosis dependiente, siendo máxima a concentraciones de doxiciclina de 2,5 μg/ml. En el clon 10.6, también se encontró inducción de la fusión a partir de dosis de 0,3 μg/ml de doxiciclina.
Concentraciones superiores a 1,5-2 μg/ml fueron incapaces de provocar mayor inducción del transcrito quimérico.
En ausencia de doxiciclina, el vector se encontraba inhibido y ambos clones fueron negativos para la fusión quimérica (Figura 3)
Inmunoprecipitación .
Se analizó la presencia de la proteína EWS-FLIl mediante inmunoprecipitación en los clones 7.5 y 10.6.
Además, como controles se incluyeron en el experimento el clon portador del vector vacío y la línea celular de tumor de Ewing A673.
Lisados celulares de los clones 7.5 y 10.6 (tratados con o sin doxiciclina, DXC+/-, respectivamente), fueron inmunoprecipitadas con un anticuerpo contra PLIl. Tras el desarrollo del gel y la transferencia de la proteína inmunoprecipitada, la detección se llevó a cabo con un anticuerpo contra EWS .
La detección reveló que ambos clones expresaban de manera regulada la proteína quimérica, ya que los niveles de expresión fueron mucho mayores en presencia de doxiciclina. Se observó una ligera banda del mismo peso molecular que la proteína quimérica, tanto en las muestras de los clones no estimulados con doxiciclina como en las células transfectadas con el vector vacío (Figura 4) .
Este sistema de expresión al ser regulable, presenta las siguientes ventajas: 1. - Permite discriminar si es necesario que exista un "umbral de expresión" del transcrito para que éste se relacione con un fenotipo transformado.
2.- Permite conocer si existen genes regulados de manera temprana/tardía por la fusión, que estén implicados en mecanismos de iniciación/progresión tumoral .
En los estudios mencionados anteriormente realizados en la línea celular C2C12 y la línea -mesenquimal pluripotente de ratón, se emplean sistemas de expresión estables, y en ninguno de los dos casos, se demuestra la transformación de las células transfectadas ni in vivo ni in vi tro .
EJEMPLO 2
En el modelo animal desarrollado se utilizaron un total de 96 ratones desnudos ("athymic nude") divididos en los siguientes grupos : Para cada uno de los clones en estudio (fusiones EWS- FLI-I tipo 1, 2 y 3) se utilizaron 24 ratones por cada tipo de fusión. Estos grupos fueron subdivididos en dos subgrupos de 12 animales/grupo, en función de si se les suministraba o no doxiciclina. La dosis de doxiciclina que se administró fue de 1,5 mg/ml en el agua de bebida.
Para los ratones a los que se les inyectaron células parentales o transformadas con el vector vacío, se utilizaron 16 ratones por tipo celular (parental/vector vacío) que fueron nuevamente subdivididos en dos subgrupos de 8 ratones/grupo en función de si se les suministraba o no doxiciclina en el agua de bebida.
A cada ratón, se le inyectaron intramuscularmente en el músculo Tibial posterior mediante una aguja de 29G,
200.000 céls. obtenidas de un cultivo celular exponencial resuspendidas en lOOμL de PBS estéril, que presentaban un grado de viabilidad superior al 95 %.
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Tabla 3. Inducción de tumores in vivo
Figure imgf000026_0001
Ninguno de los ratones a los que se les inyectaron las células parentales o las transformadas con el vector vacío desarollaron tumores.
Como recoge la tabla, los tres clones fueron capaces de crecer in vivo. La eficiencia tumoral fue de hasta el 100% para las fusiones tipo 2, hecho que subraya la alta eficiencia tumorogénica de las células transformadas con el transcrito quimérico.

Claims

REIVINDICACIONES
Un método para la obtención de un modelo animal no humano de sarcoma caracterizado porque comprende: transfectar células de origen mesenquimal multipotente, distintas de las líneas celulares embrionarias humanas, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl, EWS-ERG, EWS-ETVl, EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS-WTl, EWS- NR4A3 y EWS-DDIT3; e inyectar dichas células transfectadas en dicho animal objeto del modelo.
Un método según la reivindicación 1 caracterizado porque el sarcoma está seleccionado entre: tumor de Ewing, sarcoma de células claras, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, condrosarcoma mixoide o liposarcoma mixoide.
Un método para la obtención de un modelo animal no humano de tumor de Ewing caracterizado porque comprende : transfectar células de origen mesenquimal multipotente, distintas de las líneas celulares embrionarias humanas, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica uña proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl tipo 1, EWS- FLIl tipo 2, y EWS-FLIl tipo 3; e inyectar dichas células transfectadas en dicho animal objeto del modelo.
4. Un método según una de las reivindicación 1 a 3, caracterizado porque el modelo animal es un roedor.
5. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el animal es un animal inmunodeprimido .
6. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho animal es un roedor inmunodeprimido .
7. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el animal es un ratón atímico desnudo (athymic-nude) .
8. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la línea celular mesenquimal multipotente es la línea celular C3HT10 1/2 (ATCC/CCL- 226) .
9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dichas células transfectadas se inyectan por vía intramuscular.
10. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el polinucleótido que expresa la proteína de fusión está operativamente unido a un transactivador inducible cuya expresión regula la transcripción del polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión.
11. Un método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho transactivador inducible es un transactivador rtTA.
12. Un modelo animal no humano de sarcoma, caracterizado porque se obtiene mediante: - transfección de células de origen mesenquimal multipotente, distintas de las líneas celulares embrionarias humanas, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl, EWS-ERG, EWS-ETVl, EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS-WTl, EWS- NR4A3 y EWS-DDIT3; e inyección de dichas células transfectadas en dicho animal objeto del modelo.
13. Un modelo animal no humano de tumor de Ewing caracterizado porque se obtiene mediante: transfección de células de origen mesenquimal multipotente, distintas de las líneas celulares embrionarias humanas, con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl tipo 1, EWS-FLIl tipo 2, y EWS-FLIl tipo 3; e - inyección dichas células transfectadas en dicho animal objeto del modelo.
14. Un modelo animal según una de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque dicho animal es un roedor. •
15. Un modelo animal según una de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque dicho animal es un animal inmunodeprimido .
16. Un modelo animal según una de las reivindicaciones 12 a 13, caracterizado porque dicho animal es un ratón atímico desnudo (athymic nude) .
17. Un modelo animal según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque dichas células multipotentes de origen mesenquimal son la línea celular C3HT10 1/2 (ATCC/CCL-226) .
18. Un modelo animal según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizado porque el polinucleótido que expresa la proteína de fusión está operativamente unido a un transactivador inducible. -SOIS. Un modelo animal según la reivindicación 18, caracterizado porque dicho transactivador inducible es rtTA.
20. Uso de un modelo animal no humano sarcoma definido en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, para ensayar la actividad farmacológica anti-tumoral de un compuesto.
21. Uso según la reivindicación 20 de un modelo animal no humano de sarcoma definido en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en un método para seleccionar compuestos con actividad anti-tumoral caracterizado porque dicho método comprende : - administrar el compuesto cuya actividad anti-tumoral se quiere ensayar, a dicho animal modelo, y comparar el efecto de dicho compuesto sobre los tumores de dicho animal, con los tumores de animales control que no han sido tratados con dicho compuesto.
22. Uso de un modelo animal no humano de sarcoma, definido en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en un método para identificar marcadores asociados a dicho sarcoma caracterizado porque comprende comparar la presencia, o ausencia, o el nivel de expresión génica en muestras de tejido tumoral de dicho animal modelo, con la expresión génica en el tejido de 'un segundo animal que no ha recibido inyección de células transíectadas .
23. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 donde el sarcoma es un tumor de Ewing.
24. Una línea celular transformada caracterizada porque es una línea celular derivada de células multipotentes de origen mesenquimal diferentes de líneas celulares embrionarias humanas, transfectada con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS-FLIl, EWS-ERG, EWS-ETVl, EWS-ETV4, EWS-FEV, EWS-ATFl, EWS- WTl, EWS-NR4A3 y EWS-DDIT3.
25. Una línea celular según la reivindicación 24 caracterizada porque ha sido transfectada con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión seleccionada entre EWS- FLIl tipo 1, EWS-FLIl tipo 2 y EWS-FLIl tipo 3.
26. Una línea celular según una de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizada porque dicha línea celular procede de la línea celular C3HT10 1/2 (ATCC/CCL-226) .
27. Una línea celular según una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, caracterizada porque el polinucleótido que expresa la proteína de fusión está operativamente unido a un transactivador inducible cuya expresión regula la transcripción del polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión.
28. Una línea celular según la reivindicación 27, caracterizada porque dicho transactivador inducible es rtTA.
29. Uso de las líneas celulares definidas en las reivindicaciones 24 a 28, en un método in^vitro para ensayar la actividad anti-tumoral de un compuesto caracterizado porque comprende: - cultivar una muestra de dichas células con el compuesto a ensayar; y evaluar el efecto de dicho compuesto sobre dichas células analizando rasgos genotípicos o fenotípicos de interés con respecto a una muestra de las mismas células no tratadas con dicho compuesto.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2124910A2 (en) * 2006-12-29 2009-12-02 Georgetown University Targeting of ews-fli1 as anti-tumor therapy
US9290449B2 (en) 2012-04-12 2016-03-22 Georgetown University Methods and compositions for treating Ewings sarcoma family of tumors
US9511050B2 (en) 2013-10-24 2016-12-06 Georgetown University Methods and compositions for treating cancer
US9604927B2 (en) 2014-10-09 2017-03-28 Oncternal Therapeutics, Inc. Indolinone compounds and uses thereof
US9758481B2 (en) 2006-12-29 2017-09-12 Georgetown University Targeting of EWS-FLI1 as anti-tumor therapy
US9822122B2 (en) 2016-03-31 2017-11-21 Oncternal Therapeutics, Inc. Indoline analogs and uses thereof
US10159660B2 (en) 2016-07-29 2018-12-25 Oncternal Therapeutics, Inc. Uses of indolinone compounds

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107226862A (zh) * 2017-05-27 2017-10-03 南京川博生物技术有限公司 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BELTINGER ET AL.: "Murine models for experimental therapy of pediatric solid tumors with poor prognosis", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 92, no. 3, 1 May 2001 (2001-05-01), pages 313 - 318 *
ENGLER S. ET AL.: "A novel metastatic animal model reflecting the clinical appearance of human neuroblasoma: growth arrest of orthotopic tumors by natural, cytotoxic human immunoglobulin M antibodies", CANCER RES., vol. 61, no. 7, 1 April 2001 (2001-04-01), pages 2968 - 2973, XP003002142 *
MAY W.A. ET AL.: "EWS/FLI1-induced manic fringe renders NIH 3T3 cells tumorigenic", NATURE GENETICS, vol. 17, no. 4, 1997, pages 495 - 497, XP009045648 *
THOMPSON A.D. ET AL.: "Divergent Ewing's sarcoma EWS/ETS fusions confer a common tumorigenic phenotype on NIH3T3 cells", ONCOGENE, vol. 18, no. 40, 30 September 1998 (1998-09-30), pages 5506 - 5513, XP003002140 *
TORCHIA E.C. ET AL.: "Ewing tumor fusion proteins block the differentiation of pluripotent marrow stromal cells", CANCER RES., vol. 63, no. 13, 1 July 2003 (2003-07-01), pages 3464 - 3468, XP003002141 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2124910A4 (en) * 2006-12-29 2012-02-15 Univ Georgetown ANTITUMOR THERAPY BY TARGETING EWS-FLI1
EP2124910A2 (en) * 2006-12-29 2009-12-02 Georgetown University Targeting of ews-fli1 as anti-tumor therapy
US9758481B2 (en) 2006-12-29 2017-09-12 Georgetown University Targeting of EWS-FLI1 as anti-tumor therapy
US9714222B2 (en) 2012-04-12 2017-07-25 Georgetown University Methods and compositions for treating Ewings sarcoma family of tumors
US9290449B2 (en) 2012-04-12 2016-03-22 Georgetown University Methods and compositions for treating Ewings sarcoma family of tumors
US9511050B2 (en) 2013-10-24 2016-12-06 Georgetown University Methods and compositions for treating cancer
US9604927B2 (en) 2014-10-09 2017-03-28 Oncternal Therapeutics, Inc. Indolinone compounds and uses thereof
US9895352B2 (en) 2014-10-09 2018-02-20 Oncternal Therapeutics, Inc. Indolinone compounds and uses thereof
US9987251B2 (en) 2014-10-09 2018-06-05 Oncternal Therapeutics, Inc. Indolinone compounds and uses thereof
US9822122B2 (en) 2016-03-31 2017-11-21 Oncternal Therapeutics, Inc. Indoline analogs and uses thereof
US10351569B2 (en) 2016-03-31 2019-07-16 Oncternal Therapeutics, Inc. Indoline analogs and uses thereof
US10711008B2 (en) 2016-03-31 2020-07-14 Oncternal Therapeutics, Inc. Indoline analogs and uses thereof
US10159660B2 (en) 2016-07-29 2018-12-25 Oncternal Therapeutics, Inc. Uses of indolinone compounds
US10646470B2 (en) 2016-07-29 2020-05-12 Oncternal Therapeutics, Inc. Uses of indolinone compounds
US11285132B2 (en) 2016-07-29 2022-03-29 Oncternal Therapeutics, Inc. Uses of indolinone compounds

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