WO2006112390A1

WO2006112390A1 - 脂肪由来前駆細胞およびその利用

Info

Publication number: WO2006112390A1
Application number: PCT/JP2006/307926
Authority: WO
Inventors: Noritoshi Nagaya; Kunio Miyatake; Kenji Kangawa; Masaharu Kataoka
Original assignee: Japan As Represented By General Director Of Agency Of National Cardiovascular Center; Hubit Genomix, Inc.
Priority date: 2005-04-14
Filing date: 2006-04-14
Publication date: 2006-10-26
Also published as: US20080317720A1; JPWO2006112390A1; EP1878789A4; EP1878789A1

Abstract

〔課題〕　本発明は、多分化能を有する細胞を、アドレノメデュリン(AM)および／または血管内皮増殖因子（VEGF）を含む培地で培養することにより、エクスビボにおいても高い増殖能を示し、血管新生または心筋再生を促進する前駆細胞を製造する方法の提供を課題とする。また、本発明は、該前駆細胞、およびその利用法を提供することも課題とする。〔解決手段〕　上記課題を解決するために、本願発明者らは、アドレノメデュリン(AM)および／または血管内皮増殖因子（VEGF）を用いることで、脂肪組織から従来よりも効率的に前駆細胞を作製する新たな培養技術を開発することに成功した。本発明者らが作製した前駆細胞は、強力な増殖能、血管再生能、および心筋再生能を持った特殊な細胞であり、また脂肪細胞への分化誘導をかけても脂肪細胞にはならないという特徴を持つため、難治性の脳・肺・肝・腎疾患等に対する有効な薬剤となりうる。

Description

明細書

脂肪由来前駆細胞およびその利用

技術分野

[0001] 本発明は、脂肪組織由来の前駆細胞、該細胞の製造方法、および、該細胞の利用に関する。

背景技術

[0002] 肺動脈高血圧症は、進行性肺高血圧および右心不全を特徴とし、稀ではあるものの命に関わる疾患である（非特許文献 1)。これら肺高血圧症の発症には肺血管内皮の機能不全が重要な役割を果たしていると考えられている。このため、肺血管内皮は原発性肺高血圧症をはじめとする肺高血圧症の治療のための治療標的となると思われる (非特許文献 2)。

また、虚血性心疾患 (狭心症や心筋梗塞）は冠動脈の狭窄や閉塞によって心筋が虚血ゃ壊死に陥った状態であり、陳旧性心筋梗塞は、慢性心不全の原因として重要である。慢性心不全に対しては不整脈や心筋梗塞の再発、動脈硬化の進展の防止等を目的とした薬物治療が行われるが、壊死した心筋を回復させる有効な治療法は存在しない。近年、顆粒球コロニー刺激因子を用いて骨髄細胞を心筋障害部位に動員し、血管や心筋の再生を促すことで心機能を改善させる試みがなされ始めたが、副作用の問題など力も治療薬としては定着して、な、。

[0003] 骨髄'成体末梢血 ·臍帯血中に血管内皮前駆細胞が存在することが知られており（非特許文献 3)、現在、血管内皮前駆細胞を用いた血管再生治療が行われている。これらの血管内皮前駆細胞は、組織虚血または外傷性損傷に応答して骨髄力末梢血に移動し、損傷を来した血管内皮部位に遊走して、その場で成熟内皮細胞に分ィ匕することがわ力ている（非特許文献 4〜6)。さらに、本発明者らおよび他の研究者により、血管内皮前駆細胞の投与によってモノクロタリン (以下 MCTと表記することもある)誘発性肺高血圧症が改善されることがわ力つている（非特許文献 7、 8)。し力しながら、従来の幹細胞移植法にぉ、て移植されてきた血管内皮前駆細胞は、増殖能が低いため体外での培養による細胞数確保が難しいとされてきた。また、虚血性心疾患 ·末梢動脈閉塞症 ·肺高血圧症などの炎症性疾患を持つ患者においては、患者体内の血管内皮前駆細胞機能や細胞生存能 ·分化能が低下していると報告されている。

[0004] 治療に必要な細胞数の採取のために、 600〜800 mlの骨髄液、もしくは大量の末梢血を患者力採取する必要があり、これは高侵襲な処置を患者へ施し危険を伴うため、十分な数の血管内皮前駆細胞を入手することは困難であるとされていた。そのため、従来の前駆細胞に代わりうる移植細胞の開発が必要とされてきた。

脂肪組織は近年、多能性幹細胞の供給源として大きな注目 ^^めてヽる (非特許文献 9)。脂肪組織は成熟脂肪細胞および脂肪間質細胞力なり、後者は多様な細胞系譜に分ィ匕しうることがわ力つている（非特許文献 10〜17)。脂肪間質細胞には接着性があり、培養下で増殖可能なため、脂肪組織の小塊力培養により大量の脂肪間質細胞を得ることは容易である (非特許文献 18)。しかしながら、脂肪細胞から効率よく血管内皮前駆細胞を誘導する培養技術は確立していない。

[0005] なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。

非特許文献 1 : Rich S, et al. Ann Intern Med. 1987； 107： 216-223.

非特許文献 2 : Archer S, et al. Circulation. 2000； 102： 2781-2791.

非特許文献 3 :Asahara T, et al. Science. 1997； 275： 965-967.

非特許文献 4 : Takahashi T, et al. Nat Med. 1999； 5： 434-438.

非特許文献 5 : Shintani S, et al. Circulation. 2001； 103： 897-903.

非特許文献 6 : Shintani S, et al. Circulation. 2001； 103： 2776-2779.

非特許文献 7 : Nagaya N, et al. Circulation. 2003； 108： 889-895.

非特許文献 8 : Takahashi M, et al. Tissue Eng. 2004； 10： 771-779.

非特許文献 9 : Zuk PA, et al. Mol Biol Cell. 2002； 13： 4279-4295.

非特許文献 10 : Zuk PA, et al. Tissue Eng. 2001； 7： 211-228.

非特許文献 l l : Hicok KC, et al. Tissue Eng. 2004； 10： 371-380.

非特許文献 12 : Erickson GR, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002； 290： 763 -769.

非特許文献 13 : Cousin B, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2003； 301： 1016— 1022.

非特許文献 14:Safford KM, et al. Biochem Biophys Res Commun.2002； 294： 371- 379.

非特許文献 15:Miranville A, et al. Circulation.2004； 110： 349-355.

非特許文献 16:Planat- Benard V, et al. Circ Res.2004； 94： 223-229.

非特許文献 17:Planat- Benard V, et al. Circulation.2004； 109： 656-663.

非特許文献 18:Ailhaud G, , et al. Annu Rev Nutr.1992； 12： 207-233.

非特許文献 19:Kitamura K, et al. Biochem Biophys Res Commun.1993； 192： 553-

560.

非特許文献 20:Nagaya N, et al. Peptides.2004； 25： 2013-2018.

非特許文献 21:Nagaya N, et al. Circulation.2000； 101： 498-503.

非特許文献 22:Nagaya N, et al. Circulation.2004； 109： 351-356.

非特許文献 23:Nakamura R, et al. Circulation.2004； 110： 426-431.

非特許文献 24:Tokunaga N, et al. Circulation.2004； 109： 526-531.

非特許文献 25 : Okumura H, et al. Circulation.2004； 109： 242-248.

非特許文献 26:Okumura H, et al. Hypertens Res.2003； 26： S99- S104.

非特許文献 27:Zachary I. Am J Physiol Cell Physiol.2001； 280： C1375- C1386. 非特許文献 28:Gehling UM, et al. Blood.2000； 95： 3106-3112.

非特許文献 29:Dimmeler S, et al. J Clin Invest.2001； 108： 391-397.

非特許文献 30: Oswald J, et al. Stem Cell.2004； 22： 377-384.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

アドレノメデュリン (以下 AMと表記することもある）は強力な血管拡張性ペプチドであり、最初はヒト褐色細胞腫から単離された (非特許文献 19〜23)。 AMは、少なくとも部分的にはホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ (PI3K) ZAkt経路を介して、血管新生を誘導することが示されている（非特許文献 24〜26)。また、 AMの血管新生促進能力は血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor：以下 VEGFと表記することもある）のものとは関係しな、ことが知られて！/、る（非特許文献 27〜30)。 AM と VEGFの併用が、脂肪間質細胞の内皮細胞系譜または心筋細胞系譜への分化にどのような影響を与えるかは、これまでに検討されてこな力つた。

[0007] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、多分化能を有する細胞を、アドレノメデュリン (AM)および Zまたは血管内皮増殖因子 (VEGF)を含む培地で培養することにより、エタスビボにおいても高い増殖能を示し、血管新生や心筋再生を促進する前駆細胞を製造する方法を提供することにある。また、本発明は、該細胞、または該細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復する薬剤を提供することも課題とする。さらに、該細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法を提供することも課題とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、ラットの腹部皮下脂肪組織から採取した脂肪間質細胞を、アドレノメデュリン (AM)および Zまたは血管内皮増殖因子 (VEGF)とともに培養を行った。その結果、培養細胞は血管内皮カドヘリンおよび CD31などの内皮細胞系譜マーカーを発現し、さらに、 AMと VEGFの併用により、 PI3 Kシグナル伝達経路を介した脂肪間質細胞の血管内皮分ィ匕が増強されることが明らカゝとなった。

次に、脂肪間質細胞由来の前駆細胞の細胞性機能を調べた所、マトリゲルアツセィでは、 AMおよび VEGFは、ずれも単独で脂肪間質細胞の血管新生促進能力を増強し、 AMと VEGFとの併用は、 AMまたは VEGFのいずれか単独の場合と比べて、脂肪間質細胞の血管新生促進能力をさらに増強することが明らかとなった。

[0009] また、脂肪細胞形成アツセィにより、 AMまたは VEGFを添加しなヽで培養した脂肪間質細胞は、脂肪細胞形成を誘導した場合、容易に脂肪細胞に分化するのに対し、 AMおよび Zまたは VEGFとともに培養した脂肪間質細胞は、脂肪細胞形成を誘導しても脂肪細胞に分ィ匕しにくいことがわ力つた。

また、本発明者らは、モノクロタリン (MCT)による肺高血圧症モデルラットに対する、本発明の前駆細胞の効果について検討を行った。 MCT注射から 3日後に脂肪由来前駆細胞を静脈内に投与したところ、前駆細胞の一部は肺血管に組み込まれ、肺での血管生成に加わることが明ら力となった。さらに、本発明の細胞を MCTラットに投与することによって、肺毛細血管密度の低下は減弱し、 MCT誘発性肺高血圧症を有意に回復させるとともに、 MCTラットの生存期間を改善することも明ら力となった。

また、本発明の前駆細胞を心筋梗塞モデルラットに投与することによって、心筋梗塞域の縮小と血行動態の改善がみられることが明ら力となった。また本発明の前駆細胞は、新生児ラットの心筋細胞と共培養することにより、自己拍動を起こすことを確認した。さらに、心筋特異的マーカーを用いることで、本発明の前駆細胞が心筋細胞へ分ィ匕していることを明らかにした。

即ち、本発明者らは、循環調節ペプチドであるアドレノメデュリンを用いて、脂肪組織から従来よりも効率的に血管内皮細胞および心筋細胞の両系譜に分化しうる前駆細胞を作製する新たな培養技術を開発することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。本発明者らが作製した前駆細胞は、強力な増殖能、血管再生能、心筋再生能を持った特殊な細胞であり、また脂肪細胞への分ィヒ誘導をかけても脂肪細胞にはならな!ヽと!、う特徴を持っため、難治性の脳 '肺 ·肝 ·腎疾患等に対する有効な薬剤となりうる。

即ち、本発明は、以下の〔1〕〜〔15〕を提供するものである。

〔1〕多分ィヒ能を有する細胞を以下の (i)〜 (iii)のいずれかに記載の増殖因子を含む培地で培養する工程を含む、前駆細胞の製造方法。

(i)アドレノメデュリン (AM)

(ii)血管内皮増殖因子 (VEGF)

(iii)アドレノメデュリン (AM)および血管内皮増殖因子 (VEGF)

〔2〕多分化能を有する細胞が、脂肪間質細胞、胚性幹細胞、成人幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、または人為的に多分ィ匕能を獲得した細胞である、〔1〕に記載の方法。

〔3〕多分ィ匕能を有する細胞が、脂肪組織中に含まれる脂肪間質細胞である、〔1〕に記載の方法。

〔4〕多分ィ匕能を有する細胞が、哺乳類動物由来の細胞である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。

〔5〕〔1〕〜〔4〕の、ずれかに記載の方法により製造された前駆細胞。〔6〕 [5]に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法。

〔7〕 [5]に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血管を新生または再生させる方法。

〔8〕 [5]に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の細胞を新生または再生させる方法。

〔9〕増殖因子を前駆細胞と同時に対象に投与する工程を含む、〔6〕〜〔8〕の、ずれかに記載の方法。

〔10〕増殖因子が以下の (i)〜 (iii)の、ずれかに記載の増殖因子である、〔9〕に記載の方法。

(i)アドレノメデュリン (AM)

(ii)血管内皮増殖因子 (VEGF)

(iii)アドレノメデュリン (AM)および血管内皮増殖因子 (VEGF)

〔11〕障害組織が、虚血性心疾患、または肺高血圧症における障害組織である、〔6〕〜〔10〕の!、ずれかに記載の方法。

〔12〕 [5]に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤。

〔13〕 [5]に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の末梢血管を新生または再生させる薬剤。

〔14〕 [5]に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の細胞を新生または再生させる薬剤。

〔15〕障害組織が、虚血性心疾患、末梢動脈閉塞症、または肺高血圧症における障害組織である、〔12〕〜〔14〕のいずれかに記載の薬剤。

図面の簡単な説明

[図 1]脂肪間質細胞の形態変化を示す写真である。培養第 7日目の脂肪間質細胞は紡錘状の形態を呈し、対照培地中では第 28日まで不変のまま保たれた。アドレノメデュリン (AM)および血管内皮増殖因子 (VEGF)とともに培養した脂肪間質細胞は第 28 日目には敷石状の外観を示した。スケールバー： 100 μ m。圆 2-l]28日間の培養期間中の脂肪間質細胞の特徴を蛍光活性ィ匕セルソーター (F ACS)により分析した結果を示す図である。 AM群、 VEGF群および AM+VEGF群では、血管内皮 (VE) -カドヘリン (A)および CD31 (B)などの内皮細胞特異的マーカーを発現する脂肪間質細胞が徐々に増カロしたが、対照群では増カロしな力つた。

[図 2- 2]第 28日の対照群および AM+VEGF群における VE-カドヘリン、 CD31、フォンビルブラント因子（vWF)、 CD34および CD45の発現を示す図である。データは平均士 SEMである。

[図 3]AMおよび VEGFは脂肪間質細胞の内皮分ィ匕を、少なくとも部分的にはホスファチジルイノシトール 3-キナーゼシグナル伝達経路を介して誘導する。脂肪間質細胞を第 21日から第 28日までウォルトマンニンの存在下または非存在下で培養し、 VE-力ドヘリンの発現を FACSにより第 28日に分析した。データは平均士 SEMである。 *P〈0.0 5、対照との比較；†P〈0.05、 VEGFとの比較； P〈0.05、 AMとの比較； § P〈0.05、 AM+V EGFとの比較。

圆 4]マトリゲル上での血管新生測定を示す写真および図である。 A：管形成の代表的写真を示す。スケールバー： 100 m。 B :管形成領域の定量分析を示す。この場合には対照群を 1.0に指定した。データは平均士 SEMである。 *Pく 0.05、対照との比較； †P〈0.05、 AMとの比較； ίΡ〈0.05、 VEGFとの比較。

圆 5]脂肪細胞形成測定を示す写真および図である。 A:第 7日にオイルレッド 0溶液で染色した脂肪間質細胞の脂肪細胞化の代表的写真、ならびに第 28日の対照群および AM+VEGF群の写真を示す。スケールバー： 100 μ m。 B :脂肪細胞化の定量分析を示す図である。脂肪細胞形成を行わな力つた第 7日の脂肪間質細胞を 1.0に指定した。データは平均士 SEMである。 *Pく 0.05、脂肪細胞形成を行わな力つた第 7日の脂肪間質細胞との比較;†Pく 0.05、脂肪細胞形成を行った第 7日の脂肪間質細胞との比較; ίΡく 0.05、脂肪細胞形成を行った第 28日の対照との比較。

[図 6]モノクロタリン (MCT)を投与したラット（MCTラット）の肺における、インビボでの脂肪由来前駆細胞の組み込み、分布および分化を示す写真である。 Α:静脈内投与した蛍光 (ΡΚΗ26)標識脂肪由来前駆細胞は肺細動脈壁に取り込まれた。矢印は蛍光標識された脂肪由来前駆細胞を示す。 B : DAPI染色により、細胞核が示されている。 C :移植した PKH26標識脂肪由来前駆細胞は肺組織上に分布した。肺血管は FITC を結合させた抗 vWFによって検出した。 D :内皮再生の代表的写真。 PKH26/vWF 二重陽性細胞が肺肺胞の間に観察され、これは DAPI染色を伴っていた。矢印は PK H26ZvWF二重陽性細胞を示す。スケールバー： 20 /ζ πι。

[図 7]Α：培地を投与した偽処置ラット (偽処置群)、培地を投与した MCTラット (賦形剤群)および脂肪由来前駆細胞を投与した MCTラット (脂肪由来前駆細胞群)の肺における免疫組織ィ匕学法による vWFの存在を示す写真である。脂肪由来前駆細胞群における毛細血管密度は賦形剤群のものよりも有意に高力つた。スケールバー： 100 μ m。 B :毛細血管密度の定量分析を示す図である。データは平均士 SEMである。 *P〈0. 05、偽処置との比較;†Pく 0.05、賦形剤との比較。

[図 8]A,B：右室（RV)収縮期圧 (A)および RV重量と体重との比（RV/BW) (B)に対する脂肪由来前駆細胞移植の影響を示す図である。データは平均士 SEMである。 *Pく 0 .05、偽処置との比較;†Pく 0.05、賦形剤との比較。 C :MCT注射力も 3週後の末梢肺動脈の代表的写真である。スケールバー： 10 ^ mo D :末梢肺動脈の壁厚の変化率に関する定量分析を示す図である。データは平均士 SEMである。 *P〈0.05、偽処置との比較;†Pく 0.05、賦形剤との比較。 E: Kaplan-Meier生存曲線を示す図である。これは脂肪由来前駆細胞群（參）の方が賦形剤群（〇）よりも生存率が有意に高、ことを示して、る（ログランク検定、 Pく 0.05)。偽処置 (Sham)、培地を投与した偽処置ラット；賦形剤 (Vehicle)、培地を投与した MCTラット;脂肪由来前駆細胞、脂肪由来前駆細胞を投与した MCTラット； RV、右室； RVZBW、 RV重量と体重との比； LV+SZBW、左室 +中隔重量と体重との比。データは平均士 SEMである。 *P〈0.05、偽処置との比較;†P〈0.05、賦形剤との比較。

圆 9]急性心筋梗塞後 4週間での、脂肪由来前駆細胞移植の影響を示す写真および図である。 A:マッソントリクロム染色した、対照群および脂肪由来前駆細胞移植群の梗塞域の代表写真。 B：脂肪由来前駆細胞移植で顕著に梗塞サイズが減少したことを実証する半定量分析の結果を示す図。データは平均士 SEMである。 *Pく 0.05、対照との比較。

圆 10]血行動態パラメータにおける脂肪由来前駆細胞移植の影響を示す図である。 A： LV拡張終期圧（LVEDP)、 B： LV短縮率（FS%)、 C： LV最大 dP/dt (Max dP/dt)および D: LV最小 dP/dt (Min dP/dt)。データは平均士 SEMである。 *P < 0.05、偽処置との比較;†P < 0.05、対照との比較。

[図 11]虚血心筋における移植脂肪由来前駆細胞の生着および分ィ匕を示す写真である。 A— C : GFP陽性脂肪由来前駆細胞は、心臓 troponin I陽性であることを示す写真。倍率 400倍。 D— F : GFP陽性脂肪由来前駆細胞が血管構造を形成し、 vWFが染色されることを示す写真。倍率 630倍。核は DAPIで染色した。

[図 12]A:梗塞周辺部位において vWFを免疫組織ィ匕学的に示した写真である。倍率 200倍。 B:梗塞周辺部位における毛細血管密度の定量分析を示す図である。脂肪由来前駆細胞群の毛細血管密度は対照群と比較して顕著に高力つた。データは平均士 SEMである。 *P < 0.05、偽処置との比較;†P < 0.05、対照との比較。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明は、多分化能を有する細胞を、増殖因子を含む培地で培養する工程を含む、前駆細胞の製造方法に関する。

本発明において、「多分ィ匕能を有する細胞」としては、例えば脂肪間質細胞、胚性幹細胞 (ES細胞）、成人幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、または人為的に多分化能を獲得した細胞が挙げられるが、種々の種類の細胞に分化する能力を有している細胞であれば、本発明の多分化能を有する細胞に含まれる。本発明の多分化能を有する細胞としては、好ましくは脂肪組織中に含まれる脂肪間質細胞を挙げることが出来る。また、成熟脂肪細胞から分化された脂肪間質細胞も、脂肪間質細胞として本発明に使用することが出来る。本発明の多分ィ匕能を有する細胞は、好ましくは哺乳動物由来の細胞が挙げられるが、特に由来は限定されるものではない。「人為的に多分化能を獲得した細胞」としては、例えば遺伝子操作を含むクローン技術により多分ィ匕能を獲得した体細胞を挙げることができる。

[0013] 本発明において、「増殖因子」としては、アドレノメデュリン (AM)、血管内皮増殖因子

(VEGF)を挙げることができる。これらの増殖因子は分ィ匕誘導時に、それぞれ単独で培地に添加されていても良いし、混合した状態で培地に添加されていてもよい。混合する際には、各増殖因子の濃度は特に限定されず、同濃度であってもよいし、違う濃度であってもよい。また、培養中に途中から各増殖因子を段階的に培地に添加してちょい。

本発明において「アドレノメデュリン」とは、血小板中の cAMPの増加活性を指標にヒト褐色細胞腫組織抽出液より発見された強力な降圧作用を有する生理活性ペプチドである。「アドレノメデュリン」の前駆体の cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、該 DNA 力 Sコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。

[0014] 本発明の「アドレノメデュリン」の前駆体としては、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズする天然由来の DNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、「アドレノメデュリン」の前駆体として挙げることができる。

活性型の「アドレノメデュリン」は、該「アドレノメデュリン」前駆体の一部分であり、配列番号： 3に示すアミノ酸配列を有する。本発明において用いられるアドレノメデュリンは、好ましくは配列番号： 3に示すアミノ酸配列を有するが、それらに限定されず、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力もなる天然由来のタンパク質であって、配列番号: 3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も挙げることが出来る。また、配列番号： 1に記載の塩基配列の 447位から 602位に相当する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする天然由来の DNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、活性型「アドレノメデュリン」として挙げることができる。

[0015] 本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、 30アミノ酸以内であり、好ましくは 15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 3 アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸（R、 D 、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 Aゝ V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 Τ、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは当業者に公知な事項である。

[0016] 本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、該タンパク質と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、該タンパク質の生物学的機能や生化学的機能としては、対象における障害組織を再生または修復させる機能、該障害組織の末梢血管を新生または再生させる機能、または、該障害組織の細胞を新生または再生させる機能等を挙げることが出来る。このような機能の測定方法としては、実施例に記載の方法が例示できる力それらの方法に限定されない。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードする DNAを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ノ、イブリダィゼーシヨン技術やポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、「アドレノメデュリン」の塩基配列（配列番号： 1)もしくはその一部をプローブとして、また「ァドレノメデュリン」の塩基配列（配列番号： 1)に特異的にハイブリダィズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、「アドレノメデュリン」と高、相同性を有する DNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダィズ技術や PCR技術により単離しうる「アドレノメデュリン」と同等の機能を有するタンパク質をコードする DNAもまた本発明の DNAに含まれる。

[0017] このような DNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーシヨン反応を行う。本発明にお、てストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件とは、 6M尿素、 0.4%SDS、 0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジエンシーのハイブリダィゼーシヨン条件を指す。よりストリンジエンシーの高い条件、例えば、 6 M尿素、 0.4%SDS、 O.lxSSCの条件を用いることにより、より相同性の高い DNAの単離を期待することができる。これにより単離された DNAは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、ァミノ酸配列全体で、少なくとも 50%以上、さらに好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90%以上（例えば、 95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチユールによるアルゴリズム BLASTを用 V、て決定できる。 BLASTのアルゴリズムに基づ!/、た BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。 BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメ一ターは、例えば score= 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score=50、 wordlength=3とする。 B LASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメ一ターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。

本発明において、「血管内皮増殖因子 (VEGF)」とは、血管内皮細胞に特異的な増殖因子であり、血管内皮増殖因子は血管の内側にある内皮細胞の受容体に結合して増殖を促す。血管内皮増殖因子には分子量の異なる 5種類 (VEGF121, 145,165,1 89,206)のァイソフォームが知られて!/、るが、本発明にお!/、て培地に添加される血管内皮増殖因子の種類は特に限定されるものではない。

上記、アドレノメデュリンおよび血管内皮増殖因子の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。

本発明の培養方法において、脂肪間質細胞を用いる場合、分化誘導前に、実施例のように前培養を行ってもよいが、この工程を省略することもできる。この前培養工程において、多分化能を維持した状態で、未分化脂肪間質細胞を増殖させることが可能である。

前培養における、培地条件は特に制限されるものではなぐ当業者に公知の培地および添加物 (好ましくはへノ^ンまたは抗生物質)を用いることが出来る。前培養の期間は特に制限されるものではなぐ好ましくは 7日〜28日の期間を挙げることが出来る。 [0019] 本発明における細胞培養法は、マトリクスコーティングが異なる培養皿、またはマトリクスコ一ティングの有無が異なる培養皿を用いた二次元培養法、マトリジエル等のソフトゲルやコラーゲンスポンジ等を用いた三次元培養法、またはそれらを併用する方法が挙げられる力好ましくは、マトリクスコーティングが異なる培養皿を挙げることが出来る。前培養段階においては、上記の培養皿を用いなくてもよい。

また、本発明の方法において、脂肪間質細胞以外の多分ィ匕能を有するヒト由来の細胞を用いる場合は、実施例の脂肪間質細胞の例を参考に、適宜、培養皿を選択することが出来る。

また、本発明の実施例において、前培養工程および分化誘導後の培養工程の詳細な培養条件が開示されているが、本発明の方法の培養条件はこれら特定の条件に限定されるものではなぐ一般的に許容される条件を取りうる。

本発明の方法における培養期間は、特に制限はないが、本発明の方法において、脂肪間質細胞を用いる場合、好ましくは 7日〜28日の期間を挙げることが出来る。

[0020] 本発明におヽては、上記分化誘導方法によって、前駆細胞を製造できる。本発明において、前駆細胞は特に限定されないが、好ましくは血管内皮前駆細胞、心筋前駆細胞を挙げることが出来る。

本発明において製造させた分化細胞が、前駆細胞であることは、各組織の細胞マ一力一、または各細胞の機能を指標に確認できる。

各組織の細胞マーカーとして、好ましくは血管内皮細胞マーカー、心筋細胞マーカ一を用いることが出来る。血管内皮細胞マーカーとしては、モノクローナル抗体： CD 31 (クローン TLD- 3A12、 Becton Dickinson)、血管内皮（VE) -カドヘリン（クローン F- 8 、 Santa Cruz)、 CD45 (クローン OX- 1、 Becton Dickinson)、 CD34 (クローン ICOl 15、 S anta Cruz)およびフォンビルブラント因子（vWF)に対するゥサギポリクローナル抗体（ Dako)を挙げることが出来る。心筋細胞マーカーとしては、 troponin I, ANP, connexin 43を挙げることが出来る。

[0021] 血管内皮前駆細胞の機能は、血管新生を誘導する力否かをインビトロまたはインビボで確認することによって確認が出来る。例えば、実施例のように、マトリゲル上での管形成アツセィを行っても良ヽし、肺高血圧症モデル動物である MCTラットに本発明の細胞を投与して、肺高血圧症が改善されるかを確認してもよ、。

心筋前駆細胞の機能は、心筋細胞新生を誘導する力否かをインビトロまたはインビボで確認することによって確認が出来る。例えば、実施例のように、新生児ラットの心筋細胞と共培養することにより、培養細胞が自己拍動を行うかどうか確認してもよいし、心筋梗塞モデルラットに本発明の細胞を投与して、心筋細胞が新生されるかどうかを確認してもよい。

本発明の方法において、脂肪間質細胞以外の多分ィ匕能を有するヒト由来の細胞を用いる場合でも、当業者に公知の検出方法 (各細胞のマーカーを用いた検出方法や、各細胞特有のアツセィ方法）により、製造された前駆細胞の確認を行うことができる。

[0022] 本発明は、本発明の方法により製造された前駆細胞を提供する。本発明の方法により製造された前駆細胞は、従来の方法により製造された前駆細胞に比べエタスビボにおける製造が容易に行える。また、本発明の方法では脂肪間質細胞等から前駆細胞を分化誘導することが出来るため、患者に対し低侵襲の処置のみで、治療に必要な量の前駆細胞を得られるという利点がある。よって、本発明の前駆細胞は、例えば医療分野 (例えば再生医療分野）において有用である。

[0023] 本発明は、本発明の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法に関する。本発明において、障害組織を再生または修復するとは、より具体的には、障害組織の末梢血管を新生または再生する、または障害組織の細胞を新生または再生することも含まれる。

本発明において、「対象」とは、本発明の方法によって処置されるべき生物体、該生物体の体内の一部分 (例えば脳、肺、心臓、肝臓、腎蔵等の臓器、およびそれらの臓器中の血管または一組織)、または生物体より摘出または排出されたその一部分をいう。生物体は、動物 (例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物)であれば特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含む。本発明において、「対象」とは、障害を受けている組織 (障害組織)そのものを示すこともできる。

[0024] 本発明において、「投与する」とは、非経口的に投与することが含まれる。

非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。注射剤を投与する方法としては、対象となる生物体の体内の一部分 (臓器等の一組織) を標的として局所的に投与を行っても良いし、血管に投与することにより、生物体全体に本発明の細胞を循環させてもよい。また、複数箇所の標的に同時に投与を行つてもよい。また、本発明の細胞を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用により投与することも可能である。

[0025] 投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該細胞に含有される活性成分の種類などにより異なり特に制限されるものではない。

また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に投与を行う際には、本発明の細胞を生物体の一部に「接触」させてもょ、。

また、本発明において「接触」は、生物体の状態に応じて行う。例えば、生物体の一部への本発明の細胞の散布、あるいは、生物体の一部の破砕物への本発明の細胞の添加等を挙げることができる力これらの方法に制限されない。

本発明の方法を実践する際に、本発明の細胞は、少なくとも 1つの既知の化学療法剤と共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。一つの態様において、本発明の細胞および既知の化学療法剤は、実質的に同時に投与されてもよい。

また、本発明の細胞は、少なくとも 1つの既知の増殖因子と供に同時に投与されてもよい。同時に投与される増殖因子は特に制限されないが、好ましくはアドレノメデュリンまたは血管内皮増殖因子を挙げることが出来る。アドレノメデュリンおよび血管内皮増殖因子はそれぞれ単独で投与されてもよいし、同時に投与されてもよい。

また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に本発明の細胞を投与し、摘出または排出を行った生物体または他の生物体に、該生物体の一部分を戻すことも可能である。

[0026] 本発明における「障害組織」とは、何らかの理由により障害を受けた組織を挙げることが出来る。通常、正常細胞に外的または内的刺激が加わった場合には、直ちに細胞障害に至らず適応現象が生じ、細胞組織の萎縮、肥大、過形成が起こることがある。しかし、外的または内的刺激が適応範囲を超えると、それらの刺激に伴った形態変ィ匕、例えば変性、壊死が起こり、本発明ではこれらの現象を「障害」と定義することにする。

本発明において、障害組織における「変性」とは、可逆性細胞障害として普遍的に認められる細胞 ·組織変化のことを表す。変性の際に蓄積する物質は生体に正常に存在するものと存在しない病的なものがあり、蓄積した物質によって蛋白変性または脂肪変性と呼ばれる。変性状態としては、粘液変性、アミロイド変性、 OC 1アンチトリプシン欠損症における変性、尿酸代謝障害における変性、硝子滴変性、水腫様変性、空胞変性、フイブリノイド変性、または角質変性等を挙げることが出来る。

本発明において、「壊死」とは、細胞 '組織の不可逆的変化のことを表す。壊死状態としては、凝固壊死 (循環障害)、融解壊死、壊疽 (壊死に細菌感染が合併した状態）、または枯死 (細胞障害による病的死ではなく組織内で生じる生理的な死)等を挙げることが出来る。

本発明にお、て「対象における障害組織」としては、循環器、呼吸器、脳神経系、消化器、内分泌系、泌尿器、または皮膚等に発症する疾患における障害組織を挙げることが出来る。

上記の疾患としては、心筋梗塞、不整脈、動脈硬化、血液攣縮、虚血再循環障害、肺炎、感染症、肺線維症 (制ガン剤副作用）、 ARDS、パラコート中毒、喫煙障害、肺気腫、高酸素療法、インフルエンザ、脳浮腫、脳梗塞、脳出血、てんかん、脳欠陥攣縮、パーキンソン病、自律神経障害 (Reilly現象)、遅発性神経障害、脊髄損傷、神経原性肺浮腫、急性胃粘膜障害、胃潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、肺炎、肝硬変、薬物性肝障害、肝移植病態、各種の黄疸病態、脾炎、糸球体腎炎、溶血性腎障害、薬物性腎障害、火傷、日光皮膚炎、アトピー性皮膚炎、皮膚潰瘍、網膜変症、白内障、角膜腫瘍等を挙げることができ、好ましくは、難治性心肺疾患、末梢性血管疾患、腎疾患、肝疾患または脳血管疾患、より好ましくは、肺高血圧症または虚血性心疾患（心筋梗塞または狭心症）を挙げることができる。

本発明の「対象における障害組織」として、より具体的には肺胞、肺血管における障害組織、または心筋細胞を挙げることが出来る。 [0028] 本発明にお、て「再生または修復する」とは、上記の障害組織を、変性が起こる以前の状態に再生すること、または壊死してしまった障害組織を、新たに新生することを表す。例えば、対象における障害組織の末梢血管を新生または再生させること、または障害組織の細胞組織を新生または再生させることも、本発明における「再生または修復」に該当することとして挙げることができる。

障害組織の再生または修復が起こる期間は特に限定されないが、一時的な再生または修復であってもよいし、一定期間の再生または修復であってもよい。また、再生または修復が完全に進む、すなわち組織が元の状態に完全に戻ることが好ましいが、組織の部分的な再生または修復であってもよ、。

「再生または修復」の、より具体的な例としては、肺気腫状態の肺胞または肺血管における、変性した末梢血管の修復、また壊死した末梢血管に置き換わる新たな血管の再生を挙げることが出来る。結果として、肺高血圧症が改善された場合にも、肺組織の修復 '再生が行われたと解釈することが出来る。また、心筋梗塞や狭心症における、変性した心筋細胞または末梢血管の修復を挙げることもできる。結果として、心筋梗塞または狭心症の症状が改善された場合にも、心臓組織の修復'再生が行われたと解釈することが出来る。

[0029] 本発明は、本発明の前駆細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤に関する。また、本発明の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の末梢血管を新生または再生させる薬剤、または障害組織の細胞を新生または再生させる薬剤に関する。

本発明の薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体を添加してもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の活性を有さない材料であって、上記の薬剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。

[0030] 注射剤を調製する場合、必要により、 pH調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。また、一投与量を容器に収納してもよぐまた、投与量を同一の容器に収納してもよい。

なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。実施例

[0031] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。本実施例においては、データはすべて平均士 SEMとして表した。群間のパラメーターの比較は、片側 ANOVA検定の後に Newman- Keuls検定によって行った。また、群間のパラメーターの経時的推移の比較は、反復測定値に対する両側 ANOVA検定の後に Newman- Keuls検定によって行った。生存曲線を Kaplan Meier方法によって作成し、ログランク検定によって比較した。値が Pく 0.05であれば統計学的に有意であるとみなした。

[0032] 〔実施例 1〕脂肪組織力の脂肪間質細胞の単離および培養

体重 90〜110gの雄性 Wistarラットを本実施例に用いた。ラットの手術を行い、両側腹部の小切開により皮下脂肪組織を摘出した。脂肪組織を破砕して、 O.lmgZmlの 1 型コラゲナーゼ (Worthington Biochemical)を含むリン酸緩衝食塩水に入れ、静かに攪拌しながら 37°Cで 1時間消化処理を行った。未消化断片を 25 mのフィルタ一による濾過によって除去し、遠心処理 (2000rpm、 10分間）によって成熟脂肪細胞を脂肪間質細胞のペレットから分離した。以前の報告の通りに（Bjorntorp P, et al. J Lipid R es. 1978;19:316-324.)、上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁した上で通常の培養皿に播き、 10%ゥシ胎仔血清 (FCS)、へパリンおよび抗生物質を含む α培地中で培養した。

[0033] 培養第 7日に付着性脂肪間質細胞を継代し、以下の 4つの群に分けた： 10%FCSおよび抗生物質を含む (X培地 (対照培地）中で培養した脂肪間質細胞 (対照群)、 10"⁷ molZlの AMを含む対照培地中で培養した脂肪間質細胞 (AM群）、 20ngZmlの VEG Fを含む対照培地中で培養した脂肪間質細胞 (VEGF群）、 10^_7mol/lの AMおよび 2 OngZmlの VEGFの両方を含む対照培地中で培養した脂肪間質細胞 (AM+VEGF群

) o

培養第 7日の脂肪間質細胞は紡錘状の形態を呈し、対照培地中では第 28日まで不変のまま保たれた（図 1)。これに対して、 AMおよび VEGFとともに培養した脂肪間質細胞は第 28日には敷石様の外観を示した（図 1)。

[0034] 〔実施例 2〕蛍光活性ィ匕セルソーターによる分析培養細胞の内皮表現型は、 VE-カドヘリン、 CD31および vWFといった内皮細胞特異的マーカーの存在を実証することによって確認した。具体的には、培養第 7日、第 1 4日、第 21日および第 28日の時点で、各群の脂肪間質細胞を蛍光活性化細胞分取法（FACS ;FACS SCANフローサイトメーター、 Becton Dickinson)により分析した。これらの脂肪間質細胞を、以下のそれぞれに対するマウスモノクローナル抗体: CD31 ( クローン TLD- 3A12、 Becton Dickinson)、血管内皮（VE) -カドヘリン（クローン F- 8、 S anta Cruz)、 CD45 (クローン OX- 1、 Becton Dickinson) , CD34 (クローン IC0115、 San ta Cruz)およびフォンビルブラント因子（vWF)に対するゥサギポリクローナル抗体（Da ko)とともに 4°Cで 30分間インキュベートした。 VE-カドヘリンの細胞内染色のために透過化処理用緩衝液 (Santa Cruz)を用いた。アイソタイプが同一な抗体を対照として用いた。

これらの結果、脂肪間質細胞の大半は VE-カドヘリンに関して陰性であることがわかった（第 7日には 6.4± 1.8%、第 28日には 7.2±2.4%) (図 2-1上図）。しかし、 VE-力ドヘリンを発現する脂肪間質細胞は、 AMまたは VEGFの、ずれかと培養することによつて徐々に増加することがわかった（第 28日にそれぞれ 28 ±7%および 22 ±3%)。また重要なことに、 AMおよび VEGFの両方と培養すると、 VE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞はさらに増カロ (第 28日に 49±7%)することがわ力つた。 CD31を発現する脂肪間質細胞の数は対照培地中では徐々に減少したが（第 7日の 6.4± 1.2%から第 28日には 2.6±0.7%に）、 AMまたは VEGFのいずれ力と培養した場合には有意に増加（第 28日にそれぞれ 16± 11%および 11士 7%)することがわかった（図 2-1下図）。 A Mと VEGFとの併用により、 CD31を発現する脂肪間質細胞の数はさらに増カロ（第 28日で 26± 11%)し、同様に、 vWFを発現する脂肪間質細胞も、 AMおよび VEGFの両方との培養により、第 7日の 12±3%力第 28日には 70± 13%に増加することがわかつた（図 2-2)。一方、 CD34および CD45の発現はどの群も変化しなかった。

培養下で VE-カドヘリンまたは CD31の発現が増加するという以上の結果より、 AMは VEGFと同様に、脂肪間質細胞の内皮細胞系譜への分ィ匕を増強する能力があることが分かった。

さらに、分ィ匕シグナル伝達への AMの関与に関しては、以前の報告の通り〖こ（Kim W , et al. FASEB J. 2003;17:1937-1939.)、脂肪間質細胞を第 21日力第 28日まで、 PI 3K阻害剤であるウォルトマンニン（Sigma) 30nmolZlの存在下または非存在下で、培地を 24時間毎に交換しながら培養することで検討した。 VE-カドヘリンの発現は、 FA CSにより第 28日目に分析した。

[0036] その結果、 AM、 VEGFまたは AM + VEGFによる VE-カドヘリンの発現増強は PI3K阻害剤投与により、減弱することがわ力つた (図 3)。 VE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞の数に関しては、三群間に有意差はないことが明ら力となった: 20ngZml VEGF で 22±3%、 50ng/ml VEGFで 25±6%、および lOOngZml VEGFで 20±4%。

以前の研究により、 PI3Kシグナル伝達における下流因子力胚性幹細胞における VEGF誘導性内皮分ィ匕に重要な役割を果たすことが示されている (Miyashita H, et al . Blood. 2002;99:3241-3249., Yamazaki T, et al. Blood. 2004;104:2345-2352.) ₀本発明においては、 PI3K阻害剤との培養により、 AMまたは VEGFの存在下での VE-力ドヘリンを発現する脂肪間質細胞数の増加が抑制された。これらの結果から、 PI3Kシグナル伝達が AMまたは VEGFで誘導される脂肪間質細胞の内皮細胞への分化に重要な役割を果たすものと示唆される。

また、比較的高濃度の VEGF (20ng/mlを上回る）でも VE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞の数は増加しなかったのに対し、 AMと VEGFの併用は AMまたは VEGFの!ヽずれか単独に比べて脂肪間質細胞の内皮細胞系譜への分化をより強力に誘導した。これらの結果は、脂肪間質細胞の VEGF誘導性内皮分ィ匕の増強に AMが重要な役割を果たすことを示唆して、る。

[0037] 〔実施例 3〕マトリゲル上での血管新生測定

脂肪間質細胞による血管様構造の形成、すなわち脂肪間質細胞が血管新生を誘導するか否かを、基底膜マトリックス調製物 (マトリゲル)上で評価した。各群の培養脂肪間質細胞を、マトリゲル（Becton Dickinson)をコーティングした 12ゥエルプレートに 2 .0 X 10⁵個 Zゥェルとして播き、 37°Cで 6時間インキュベートした。管形成を光学顕微鏡を用いて観察し、コンピュータシステムを用いて画像を取り込んだ。管形成領域のピクセル解析は以前の報告の通りに行った（Miura S, et al. Arterioscler Thromb Vas c Biol. 2003;23:802-808.) o簡潔に述べると、この領域の画像をモノクロスケール（bla ck-scale)に変換し、ピクセルの総数を算出するための画像処理を行った。各試料に関してピクセル数を 5つの異なる領域で計測し、平均値を求めた。

[0038] その結果、 AM群および VEGF群では対照群に比べて 1.9倍および 1.6倍、管形成の増加が検出された（図 4Aおよび B)。さらに重要なことに、管形成のさらなる増加が AM +VEGF群で検出され、その定量により、対照群に比べて 2.3倍高度である上に、 AM 群または VEGF群のいずれよりも有意に高度であることが示された。

以上の結果より、 AMおよび VEGFはヽずれも単独で脂肪間質細胞の血管新生促進能力を増強し、 AMと VEGFの併用は AMまたは VEGF単独に比べて、さらに血管新生促進能力を増強することが明らかとなった。

[0039] 〔実施例 4〕脂肪細胞形成に対する AMの阻害作用の検出

脂肪細胞形成に対する AMの阻害作用につ、て検討を行った。

各群の第 7日および第 28日の脂肪間質細胞を、 10%FCSおよび抗生物質を含むダルべッコ変法イーグル培地（DMEM :標準培地）中に再懸濁し、直径 22mmのゥエル 1 つ当たり 1.2 X 10⁵個を播いた。 0.5mmolZlの 3-イソブチル -1-メチルキサンチンおよび 1 μ molZlのデキサメタゾンを含む標準培地中で 48時間培養した後に、 10 μ g/ml のインスリンを含む標準培地中で 48時間培養することにより、脂肪間質細胞は脂肪細胞に分ィ匕した。添加物質を含まない標準培地中に 48時間保った後に、細胞をオイルレッド 0溶液によって染色した。オイルレッド 0染色の定量によって脂質蓄積を計測するために、以前の報告の通りに（Landsberg RL, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 200 3;100:2456-2461., Selvarajan S, et al. Nat Cell Biol. 2001;3:267-275.)、染色処理を行った培養皿にイソプロピルアルコールを添カ卩し、抽出された色素を穏やかなピぺッティングによって直ちに採取した上で、その 490nmでの吸光度を分光光度計によってモニターした。

[0040] 上記の結果、脂肪細胞形成条件下で脂肪細胞に分化した第 7日の脂肪間質細胞のオイルレッド 0染色は、脂肪細胞形成を行わな力つた第 7日の脂肪間質細胞に比して 2.2倍高度であることがわ力つた（図 5Aおよび B)。対照培地中の第 28日の脂肪間質細胞も第 7日の脂肪間質細胞とほとんど同じレベルで脂肪細胞に分ィ匕した。しかしながら、興味深いことに、第 28日の脂肪間質細胞の脂肪細胞化 (adipose conversion )は、脂肪細胞形成条件下でも AM、 VEGFおよび AM+VEGFによってほぼ完全に抑制されることがわ力つた。

脂肪細胞形成評価により、 AMおよび Zまたは VEGFとともに培養した脂肪間質細胞は脂肪細胞形成を誘導しても脂肪細胞に分化しな!ヽことが示されたが、脂肪間質細胞の脂肪細胞化の能力は長時間の培養を通じて維持された。以上の結果より、脂肪由来前駆細胞はインビボで脂肪細胞化を伴わずに血管新生を誘導する可能性が示唆された。

[0041] 〔実施例 5〕モノクロタリン (MCT)ラットへの脂肪由来前駆細胞の導入

肺高血圧症誘発剤であるモノクロタリン (MCT)は肺内皮損傷を誘導するとともに肺毛細血管の数を減少させ（Rosenberg H, et al. Am J Physiol. 1988;255:H1484- H149 1., Schraulhagel DE, et al. Am Rev Respir Dis. 1989;140: 1405—1409.)、これは MCT 誘発性肺高血圧症が発症する一因となる。そこで、本発明者らは、 MCTを投与し擬似的に肺高血圧症を発症させたラットに対する、脂肪由来前駆細胞の効果について検討を行った。

[0042] 末梢脂肪組織力入手した脂肪間質細胞を 10^_7molZlの AMおよび 20ngZmlの VE GFとともに 3週間培養した。本発明者らは、この脂肪間質細胞の培養によって誘導された細胞を、脂肪由来前駆細胞と定義した。培養第 18日目に、ラットに無作為に、 60 mgZkgの MCT (MCTラット郡)または 0.9%食塩水 (偽処置ラット郡）の皮下注射を行つた。 MCT注射力ら 3日後 (培養第 21日目）に、 1.5 X 10⁶個の自己脂肪由来前駆細胞または培地 (各 500 L)を左頸静脈カゝら静脈内投与した。偽処置ラットに対しても同じく培地 500 Lを静脈内投与した。用量反応実験に基づいて移植の最大限の効果を得るため、ラット 1匹当たり 1.5 X 10⁶個を用いた。このプロトコールの結果、以下の 3つの群が生じた。

脂肪由来前駆細胞を投与した MCTラット (脂肪由来前駆細胞群、 n= 10)、培地のみを投与した MCTラット (賦形剤群、 n= 10)および培地のみを投与した偽処置ラット ( 偽処置群、 n= 10)。

[0043] 〔実施例 6〕免疫蛍光染色および免疫組織化学染色

60mgZkgの MCT注射から 3日後に、赤色蛍光色素（PKH26、 Sigma)で標識した 1.5 X 10⁶個の自己脂肪由来前駆細胞を静脈内投与した。 MCT注射から 3週後に肺を摘出して凍結した。凍結切片に対する免疫蛍光染色を、 vWFモノクローナル抗体 (Dak 0)および対応する FITC標識二次抗体 (Dako)を用いて行った。

[0044] 脂肪由来前駆細胞の静脈内投与から 18日後の時点で脂肪由来前駆細胞は MCT ラットの肺細動脈壁に組み込まれ、肺血管を構成していた（図 6A)。移植した脂肪由来前駆細胞は肺組織上に分布していた（図 6B)。さらに、移植した脂肪由来前駆細胞の一部は vWFによって染色され、肺動脈の血管形成に加わっていた（図 6C)。

[0045] 各群の個々のラットの右肺から 4 m厚のパラフィン切片を入手した。切片に対する免疫組織化学染色を、 vWFに対して産生されたゥサギポリクローナル抗体 (DAKO) を用いて行った。肺胞および vWF陽性毛細血管（直径 100 μ m未満)の数を算定した。毛細血管密度は、以前の報告の通り (Itoh T, et al. Am J Respir Crit Care Med. 20 04;170:1204-1211.)、肺胞 100個当たりの毛細血管数として表した。

その結果、毛細血管密度は MCT注射後に有意に低下した力 MCTラットへの脂肪由来前駆細胞移植後に有意に上昇することが明らかとなった（図 7Aおよび B)。

上記の結果より、導入した脂肪由来前駆細胞の一部が成熟内皮細胞に分化して内皮細胞を誘導することが示唆された。

[0046] 〔実施例 7〕肺高血圧症に対する脂肪由来前駆細胞の効果

MCT注射から 3週間後に血行動態試験を行った。心拍数および平均動脈圧を測定するためにポリエチレン製カテーテル (PE-50)を右頸動脈に挿入し、 RV圧の測定のためにポリエチレン製カテーテル (PE-50)を右頸静脈力ゝら右室 (RV)に挿入した。その後、 2mmolの塩ィ匕カリウムをカテーテルを介して注入することによって心停止を誘導した。心室および肺を摘出して単離した。以前の報告の通りに（Nagaya N, et al. Ci rculation. 2000;102:2005-2012.)、 RV重量と体重との比（RVZBW)、左室 +中隔の重量と体重との比（LV+SZBW)を心室肥大の指標として算出した。プロトコールはいずれも、国立循環器病センター研究所 (大阪、日本)の動物管理倫理委員会の指針に準拠して行った。

[0047] 上記の結果、 RV収縮期圧は MCT注射から 3週後に有意に上昇することが明らかとなった（図 8A)。しかし、この上昇は脂肪由来前駆細胞群では有意に減弱した (-17% )o同様に、 MCTラットにおける RVZBWの上昇は脂肪由来前駆細胞群では有意に減弱した (-23%) (図 8B)。三群間に心拍数および平均動脈圧に関する有意差は認められな力つた (表 1)。

[表 1] 偽処置賦形剤脂肪由来前駆細胞 n 10 10 10 体重， g 268 ±2 221 ±5* 242 ± 6*† 心拍数， bpm 396 ±9 406 ±9 410±6 平均動脈圧， mmHg 119 ±3 101 ±6 106 ±7

RV収縮期圧， mmHg 35 ±2 66士 4* 55 ±3*†

RV/BW, g/kg体重 0.52 ±0.01 0.88 ±0.03* 0.68 ± 0.02*†

LV+S/BW, g/kg体重 1.97 ±0.02 2.51 ±0.07* 2.32土 0.06*ナ

[0049] 〔実施例 8〕肺動脈の形態計測的分析

4 m厚のパラフィン切片を右肺の中央部から入手し、光学顕微鏡による検査のためにへマトキシリンおよびェォシンで染色した。肺細動脈の外径および内壁厚を 20 本の筋性動脈 (外径 25〜100/z mの範囲）で測定した。内壁厚は以下の通りに表した：壁厚 = ([内壁厚 X 2] Z外径） X 100。以前の報告（Itoh T, et al. Am J Respir Crit Care Med.2004;169:34-38.)の通りに、肺切片を 3つの群の個々のラット（それぞれ n =5)から入手した。

これらの結果、代表的な写真により、脂肪由来前駆細胞群では賦形剤群に比して MCT注射肺血管壁の肥厚化が減弱してヽることが示された（図 8C)。定量分析で MC T注射後に壁厚百分率の有意な増加が示されたが、この変化は脂肪由来前駆細胞群では改善することが明ら力となった（図 8D)。

[0050] 〔実施例 9〕ラットの生存期間分析

MCT注射力 3日後に、ラット 20匹に対して、自己脂肪組織由来の 1.5 X10⁶個の脂肪由来前駆細胞 (脂肪由来前駆細胞群、 n= 10)または培地 (賦形剤群、 n=10)の静脈内注射を行った。生存期間の評価は MCT注射日力ゝらラットの死亡日または MCT 注射から 6週後まで行った。

これらの結果、 Kaplan- Meier生存曲線からは、脂肪由来前駆細胞を移植した MCT ラットの方が培地を投与した群よりも生存率が有意に高、ことが示された（図 8E)。上記のことより、脂肪由来前駆細胞の導入によって誘導される血管内皮細胞は肺血管再生の調節に重要な役割を果たし、肺高血圧症の改善をもたらすことが考えられる。

〔実施例 10〕心筋梗塞モデルラットへの脂肪由来血管前駆細胞の導入

ラットに対して開胸術後に冠動脈前下降枝を結さっして心筋梗塞を作成した。心筋梗塞作成数分後に梗塞境界域の心筋に 5 X 10⁶個の脂肪由来前駆細胞を注入した（脂肪由来前駆細胞群)。また対照群として同様に心筋梗塞を作成後に PBSlOO /z Lを梗塞境界域の心筋に注入した (対照群)。偽処置群には開胸術後に心筋梗塞を作成せずに PBSlOO /z Lを心筋注入した (偽処置群)。

心筋梗塞作成日より 4週間後に脂肪由来前駆細胞による治療効果を評価した。対象群および脂肪由来前駆細胞群のラットの左心室の心筋梗塞部位 (各群 n=5)を 10%ホルマリンで固定してパラフィン包埋し、マッソントリクロム染色を行った。また心筋梗塞域の大きさを測定した（図 9Aおよび B)。

次に、対象群および脂肪由来前駆細胞群のラットの冠動脈の結さつ 4週間後の血行動態を検討するため、血行動態パラメータとなる、 LV拡張終期圧 (LVEDP)、 LV短縮率（FS%)、 LV最大 dP/dt (Max dP/dt)および最小 dP/dt (Min dP/dt)を測定した（図 10A- D)。 1.5—Frマイクロナノメーターチップを付けたカテーテル（ミラーインスツルメント社)を右頸動脈より挿入し、平均動脈圧を測定した。次に、カテーテルを左心室まで進めて LV圧を測定した。測定は圧ドランスデューサーをポリグラフに連結して記録した。梗塞サイズは既報（Chien YW. Et al, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol , 254:R185-91, 1988)の通り測定を行った。

上記結果より、脂肪由来前駆細胞群では対照群と比較し心筋梗塞域の縮小と血行動態の改善を認めた。また、心エコー検査では脂肪由来前駆細胞群では心機能の改善を認めた。 [0052] 〔実施例 11〕培養上での脂肪由来前駆細胞の心筋細胞への分ィ匕

EGFP-transgenicラットの末梢脂肪組織力ゝら入手した脂肪間質細胞を初期培養 1週間後から 10^_7molZlの AM添加培地にて 1週間培養して脂肪由来前駆細胞を作製した。また、生後 1〜2日の新生児ラットから心筋細胞を分離培養して、培養 2日目に脂肪由来前駆細胞を加え共培養を開始した。共培養開始 5日目には脂肪由来前駆細胞は自己拍動を始めた。自己拍動は心筋細胞に特異的な現象であるため、新生児ラットの心筋細胞との共培養によって脂肪由来前駆細胞が心筋細胞に分ィ匕したことが確認された。脂肪由来前駆細胞が自己拍動を行う様子をビデオ画像に収めることに成功した。

共培養 5日目に培養皿上の細胞をパラホルムアルデヒドにて固定後に、心筋特異的マーカーである troponin I, ANP, connexin43の蛍光免疫染色を施行した。 troponin

I, ANP, connexin43を赤色に染色することにより、緑色の脂肪由来前駆細胞との重染色を認めた。そのため、脂肪由来前駆細胞が心筋細胞へ分ィ匕したことが示唆された。

[0053] 〔実施例 12〕心筋梗塞移植後の心筋切片での蛍光免疫染色および免疫組織化学染色

EGFP-transgenicラットの末梢脂肪組織力ゝら入手した脂肪間質細胞を初期培養 1週間後から 10^_7molZlの AM添加培地にて 1週間培養して脂肪由来前駆細胞を作製した。脂肪由来前駆細胞を心筋梗塞作成後のラットに移植して 2週間後に心臓を摘出した。心臓をホルマリンにて固定後にパラフィン切片を作成して、 troponin I, connexi n43, desmin, vWFを染色した。 troponin Iを染色した結果を図 11 A_Cに、 vWFを染色した結果を図 11D-Fに示す。心筋梗塞後の移植により脂肪由来前駆細胞が心筋細胞ゃ血管内皮細胞へ分化していることが示唆された。

[0054] また、各群の個々のラットの心筋からパラフィン切片を作成した。切片に対する免疫組織化学染色を、 vWFに対する抗体 (Dako)にて施行した（図 12A)。 vWF陽性毛細血管（直径 100 /z m未満)の数を算定した（図 12B)。その結果、心筋梗塞作成後の梗塞境界域の毛細血管密度は有意に低下していたが、脂肪由来前駆細胞移植後には有意に上昇することが明らかとなった。脂肪由来前駆細胞の移植により血管形成が促進されて心筋梗塞後の治療効果をもたらすことが示唆された。

産業上の利用可能性

本発明の方法を用いて、低侵襲の処置にて得た少量の脂肪細胞をエタスビボにて培養することにより、治療必要数の前駆細胞を作製することができる。そのため、本発明の細胞の製造方法および、製造された該細胞を用いた細胞移植治療は、患者に対し高侵襲の処置を施す必要が無!、と!、う点で、従来の課題を克服した画期的な治療法となる。

本発明の前駆細胞を、障害組織等に移植導入することにより、虚血下肢や虚血心筋における血流増加、血管新生増加、または心筋再生が期待できる。また、難治性の脳 '肺'肝 '腎疾患等に対して本発明の前駆細胞を用いることにより、血管再生または細胞再生を介して組織の修復が促進されることで、病変の縮小と機能改善が図れるものと考えられる。さらに、本発明の方法は自己由来の細胞を用いるため、免疫応答による拒絶反応の心配や倫理的な問題も少なぐ画期的な治療法となる。

Claims

請求の範囲

[I] 多分ィヒ能を有する細胞を以下の (i)〜 (iii)の、ずれかに記載の増殖因子を含む培地で培養する工程を含む、前駆細胞の製造方法。

(i)アドレノメデュリン (AM)

(ii)血管内皮増殖因子 (VEGF)

(iii)アドレノメデュリン (AM)および血管内皮増殖因子 (VEGF)

[2] 多分ィ匕能を有する細胞が、脂肪間質細胞、胚性幹細胞、成人幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、または人為的に多分ィ匕能を獲得した細胞である、請求項 1に記載の方法。

[3] 多分ィ匕能を有する細胞が、脂肪組織中に含まれる脂肪間質細胞である、請求項 1に記載の方法。

[4] 多分ィ匕能を有する細胞が、哺乳類動物由来の細胞である、請求項 1〜3のいずれ力ゝに記載の方法。

[5] 請求項 1〜4のいずれかに記載の方法により製造された前駆細胞。

[6] 請求項 5に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法。

[7] 請求項 5に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血管を新生または再生させる方法。

[8] 請求項 5に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の細胞を新生または再生させる方法。

[9] 増殖因子を前駆細胞と同時に対象に投与する工程を含む、請求項 6〜8のいずれかに記載の方法。

[10] 増殖因子が以下の (i)〜 (iii)のいずれかに記載の増殖因子である、請求項 9に記載の方法。

(i)アドレノメデュリン (AM)

(ii)血管内皮増殖因子 (VEGF)

(iii)アドレノメデュリン (AM)および血管内皮増殖因子 (VEGF)

[II] 障害組織が、虚血性心疾患、または肺高血圧症における障害組織である、請求項 6 〜 10のいずれかに記載の方法。

[12] 請求項 5に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤

[13] 請求項 5に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の末梢血管を新生または再生させる薬剤。

[14] 請求項 5に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の細胞を新生または再生させる薬剤。

[15] 障害組織が、虚血性心疾患、末梢動脈閉塞症、または肺高血圧症における障害組織である、請求項 12〜 14のいずれか〖こ記載の薬剤。