WO2006106959A1 - 抗ｃｄ２０モノクローナル抗体 - Google Patents

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Tetsuo Nakamura
Sadakazu Usuda
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    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody against human CD20 antigen, and further, a chimeric anti-CD20 monoclonal antibody and a humanized anti-CD20 monoclonal antibody by genetic recombination, or a B-cell tumor or immunity containing the same as an active ingredient. It relates to the treatment for the disease.
  • Known monoclonal antibodies that recognize the CD20 antigen include Bl, 2B8 (chimeric antibody name is rituxim ab), 1F5, 2H7, and the like.
  • rituximab a chimeric anti-CD20 monoclonal antibody developed by the US IDEC Pharmaceuticals Corporation, has been established as a standard treatment for low-grade non-Hodgkin's lymphoma (NHL), and many immune diseases involving B cells. Has been shown to have a therapeutic effect.
  • autoimmune diseases considered to involve pathogenic autoantibodies such as autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia and purpura in addition to malignant tumors such as chronic lymphocytic leukemia, rheumatoid arthritis and multiple It is considered effective against inflammatory diseases such as sexual sclerosis (non-patent documents 1 to 4: 17).
  • pathogenic autoantibodies such as autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia and purpura in addition to malignant tumors such as chronic lymphocytic leukemia, rheumatoid arthritis and multiple It is considered effective against inflammatory diseases such as sexual sclerosis (non-patent documents 1 to 4: 17).
  • CD20 is a molecule expressed on the surface of B lymphocytes, and is expressed on most of other malignant tumor B cells such as peripheral blood, spleen, tonsils, normal B cells in bone marrow and the like. This molecule consists of 297 amino acids, which penetrates the cell membrane four times, has both C and N termini in the cell, and consists of 43 amino acid residues without sugar chain between the third and fourth transmembrane domains. Have extracellularly exposed loops (Non-patent Documents 1 and 9). The CD20 molecule usually exists as a tetramer and is considered to form a heterocomplex with other minor components (Non-patent Document 18).
  • the CD20 protein In addition to the absence of extracellular secretion and cleavage, the CD20 protein has almost no uptake into cells due to antibody binding, and thus an effective cytotoxic mechanism against the target cells by the antibody may be exerted. It can be expected (non-patent documents 1 to 3).
  • CD20 has an expression form as an extracellular complex. Because of the influence of the condition, the epitope is diverse, and the antibodies that bind to it mediate different biological responses. For example, downregulation of B cell receptors, increased expression of MHC class II antigens and adhesion molecules, activation of Ca 2+ release under hyper-cross-linking, function-related antigen 1 -independent homotypic adhesion of lymphocytes The activities such as inhibition, induction of apoptosis or promotion of cell growth reversely differ greatly (Non-patent documents 4 to 13). The characteristics and biological functions of representative anti-CD20 antibodies rituximab, Bl, 1F5 and 2H7 are also different, and it is not possible to specify their biological properties just by a monoclonal antibody that binds to CD20. .
  • Molecules that constitute the extracellular domain of CD20 are insoluble.
  • the ability of CD20 molecules from cell lysates or as recombinant proteins to be solubilized using detergents or strong alkalis It is difficult to maintain the natural conformation under such processing conditions. For this reason, it is not easy to obtain a weakly mature antibody producing cell clone that is weakly immunostimulatory and uses a CD20 positive B cell line as an immunogen for obtaining an antibody.
  • rituximab which is a mouse / human chimera.
  • anti-CD20 antibodies have almost no antigenicity because they have the property of targeting and removing all B cells including normal cells. It is assumed that it is ⁇ .
  • a few percent have reported cases of inducing neutralizing antibodies during the treatment period, and depending on the amount and period of administration, the possibility is further increased. It is desirable to develop a humanized or human antibody having the Another disadvantage of chimeric antibodies is their short half-lives in blood, with a ⁇ half-life of only 3 to 4 days.
  • the response rate of Rituximab's recurrent low grade NHL in clinical trials in the United States has been reported to be less than 50% by single administration, and more than 50% of patients with rituximab are effective or are not effective. Indicates that the The response rate for medium grade NHL is even lower, only about 30% (Non-patent Document 14). For this reason, it is desirable to develop an antibody that has a better effect while it is necessary to investigate causes and backgrounds that differ in response depending on the patient.
  • Non Patent Literature 1 Leukocyte Fact Book 2 2 Edition, Academic Press
  • Non-Patent Document 2 Stashenko P et al., J Immunol 1980; 125: 1678-85
  • Non-patent literature 3 Anderson KC et al., Blood 1984; 63: 1424-33
  • Non-patent literature 4 Shan D et al., Blood 1998; 91: 1644-52
  • Non-patent document 5 Flieger D et al., Cell Immunol 2000; 204: 55-63.
  • Non-Patent Document 6 Mathas S et al., Cancer Res 2000; 60: 7170-6
  • Non-patent document 7 Cardarelli PM et al., Cancer Immunol Immunother 2002; 51: 15-24
  • Non-patent document 8 Pedersen IM et al., Blood 2002; 99: 1314-9
  • Non-patent literature 9 Deans JP et al "Imminol 2002; 107: 176-82
  • Non-patent literature 10 Golay JT et al, J Immunol 1992; 149: 300-8
  • Non-patent literature 11 Bourger I et al., Eur J Immunol 1993; 23: 768-71
  • Non-patent literature 12 White MW et al., J Immunol 1991; 146: 846-53
  • Non-patent literature 13 Shan D et al., Cancer Immunol Immnother 2000; 48: 673-83
  • Non-patent literature 14 Coiffier B et al., Blood 1998; 92: 1927-32
  • Non-patent literature 15 Edward JC et al., Rheumatology (Oxford) 2001; 40: 205-11
  • Non-patent literature 16 Zaja F et al., Heamatologica 2002; 87: 189-95
  • Non-patent literature 17 Perrotta S et al., Br J Haematol 2002; 116: 465-7
  • Non-patent literature 18 Polyak MJ et al., Blood 2002; 99: 3256-62
  • An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody having biological function superior to conventional anti-CD20 monoclonal antibody therapeutic agents.
  • the present inventors have fused multiple CD20 antigen-positive B cell lines, mammalian cells that genetically express human CD20 antigen on the cell membrane, and fused GST (glutathione S-transferase) proteins.
  • human CD20 protein as an immunogen in arbitrary combination, a mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibody that specifically binds to human CD20 antigen was obtained.
  • the present invention provides the following.
  • a chimeric anti-CD20 monoclonal antibody in which the variable region amino acid sequence of the anti-CD20 monoclonal antibody of (2) and a human immunoglobulin constant region amino acid sequence are fused.
  • An anti-CD20 monoclonal antibody which has been prepared using the amino acid sequence of the variable region CDR of the anti-CD20 monoclonal antibody of (2) and the amino acid sequence of human immunoglobulin.
  • Combinations of L chain variable region amino acid sequences of H chain variable region amino acid sequences are SEQ ID NOs 19 and 23, SEQ ID NOs 19 and 24, SEQ ID NOs 19 and 25, SEQ ID NOs 19 and 26, SEQ ID NO 20, respectively. And 23, SEQ ID NO 20 and 24, SEQ ID NO 20 and 25, SEQ ID NO 20 and 26, SEQ ID NO 21 and 23, SEQ ID 21 and 24, SEQ ID 21 and 25, SEQ ID 21 and 26, SEQ ID 22 and 23 Human anti-CD20 monoclonal antibody according to (5), which is SEQ ID NO: 22 and 24, SEQ ID NO: 22 and 25, or SEQ ID NO: 22 and 26.
  • the mammalian cell of (8) which is a CHO cell.
  • a combination of the H chain variable region amino acid sequence and the L chain variable region amino acid sequence is SEQ ID NO: 3 and 9, SEQ ID NO: 4 and 10, SEQ ID NO: 5 and 11, SEQ ID NO: 6 and 12, or SEQ ID NO: 16 respectively. And 18, a mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibody.
  • (11) A hybridoma that produces the anti-CD20 monoclonal antibody of (10).
  • a chimeric anti-CD20 monoclonal antibody in which the variable region amino acid sequence of the anti-CD20 monoclonal antibody of (10) and a human immunoglobulin constant region amino acid sequence are fused.
  • a diagnostic agent comprising the anti-CD20 monoclonal antibody of any one of (2), (4) to (7), (10) and (12) to (: 14) as an active ingredient.
  • a therapeutic agent comprising the anti-CD20 monoclonal antibody of any one of (4) to (7) and (12) to (14) as an active ingredient.
  • amino acid sequence of the monoclonal antibody defined in these is a monoclonal antibody in which such an amino acid sequence may be substituted, which may be substituted with another amino acid as long as the secondary structure and its biological properties are not significantly changed. Also included in the claims of this application. Brief description of the drawings
  • FIG. 1 shows the structure of a recombinant antibody expression vector pN • W_Ab.
  • Fig. 2 shows the structure of the protein expression vector pNOW-Ag.
  • FIG. 3 shows primer sequences for human CD20 gene cloning.
  • FIG. 4 shows the amino acid sequences of mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibody variable regions H chain and L chain.
  • FIG. 5 shows the results of apoptosis test of mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibody.
  • FIG. 6 shows the results of cell growth inhibition test with mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibody.
  • FIG. 7 shows the results of complement dependent cytotoxicity test with chimeric anti-CD20 monoclonal antibody.
  • FIG. 8A Amino acid sequences of humanized anti-CD20 monoclonal antibody variable region H chain and L chain, and The base sequences 1J corresponding to them are shown.
  • FIG. 8B Amino acid alignment IJ of human anti-CD20 monoclonal antibody variable region H chain and L chain, and base alignment 1J corresponding thereto.
  • FIG. 9 shows the results of cell growth inhibition test with humanized anti-CD20 monoclonal antibody.
  • antibody is used to include general antibodies and the H chain and L chain that constitute them, and fragments thereof.
  • the present invention relates to an anti-CD20 monoclonal antibody that binds to human CD20 antigen on a cell membrane and has desirable biological activity for inducing a therapeutic effect.
  • the antibody of the first aspect of the present invention is a monoclonal antibody that specifically binds to human CD20 antigen on the cell membrane, and the cell culture of human CD20 antigen-expressing without the help of effector cells.
  • the antibody has an proliferation inhibitory activity including apoptosis to the human CD20 antigen-expressing cells.
  • This is originally a mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibody, and further includes an anti-CD20 monoclonal antibody obtained by chimerizing or humanizing them.
  • These antibodies have direct growth inhibitory activity including apoptosis for CD20 antigen-expressing cells in in vitro human CD20 antigen-expressing cell culture without the help of effector cells.
  • These chimeric or humanized anti-CD20 monoclonal antibodies have complement-dependent and Z- or antibody-dependent cytotoxicity.
  • the binding to the CD20 antigen on the cell membrane can be determined by cell ELISA in which cells expressing CD20 such as SB cells and Raji cells are attached to a plate and reacted with a monoclonal antibody which is a subject.
  • the reactivity is sensitive because the expression level of CD20 antigen in those cells is not sufficient. Therefore, in the present invention, a cell ELISA of a system in which CHO cells (CD20 / CHO cells) in which a large amount of CD20 is expressed by gene recombination is attached to a plate and a monoclonal antibody as a subject is reacted was developed.
  • the Cell ELISA using CD20 / CHO cells shows the same pattern as the Cell ELISA using SB cells or Raji cells in the reactivity test of monoclonal antibodies, and it is confirmed that it is sensitive.
  • Direct measurement of cell growth inhibitory activity in in vitro human CD20 antigen-expressing cell culture in the absence of effector cells can be measured by a general method (Miyamoto T et al. Avian Dis. Vol 46 (1) , 10-16).
  • the apoptosis induction ability can be measured by a test using flow cytometry (Annexin VI PI staining).
  • the combination of the H chain variable region amino acid sequence and the L chain variable region amino acid sequence has SEQ ID NO: 1 and 7, SEQ ID NO: 2 and 8, or SEQ ID NO: 15 and 17, respectively.
  • mouse anti-CD20 monoclonal antibodies as defined, as well as anti-CD20 monoclonal antibodies which have been chimerized or humanized. These antibodies have direct growth inhibitory activity, including apoptosis, on CD20 antigen-expressing cells in in vitro human CD20 antigen-expressing cell culture without the aid of effector cells. They also have complement dependent and / or antibody dependent cytotoxicity.
  • the present invention also includes a hybridoma that produces a mouse-derived antibody, and a mammalian cell (in the example, CHO cell) into which a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of a chimeric antibody or a humanized antibody has been incorporated.
  • a mammalian cell in the example, CHO cell
  • Chimerization is achieved by fusing the heavy chain variable region amino acid sequence of a mouse-derived monoclonal antibody with the human immunoglobulin heavy chain constant region amino acid sequence and the light chain variable region amino acid sequence with the human immunoglobulin light chain constant region amino acid sequence. (Ishida T et al. Nippon Rins ho Vol 60, No 3, 439-444), and humanization is designed using the variable region CDR amino acid sequence of a mouse-derived monoclonal antibody and the amino acid sequence of human immunoglobulin.
  • a preferred anti-CD20 monoclonal antibody as a therapeutic agent is selected by comparing the characteristics of different designed antibodies (Padlan EA, Mol Immunol Vol 28, No 4/5, 489-49 8; Wu TT and Kabat EA, Mol Immunol Vol 29, No 9, 1141-1146; Padlan EA et al., FASEB J Vol 9, 133-139).
  • the chimerized or humanized anti-CD20 monoclonal antibody further has complement dependent cytotoxicity (CDC) and antibody dependent cytotoxicity (ADCC) in the presence of effector cells.
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • ADCC antibody dependent cytotoxicity
  • the commonly used methods can be referred to for the test methods relating to these CDC and ADCC (Manches et al., Blood 2003; 101 (3): 949-54; Idusogie EE et al. J Immunol 2000; 164: 4178-4184).
  • Examples of specific humanized anti-CD20 monoclonal antibodies include combinations of H chain variable region amino acid sequences and L chain variable region amino acid sequences as SEQ ID NOs 19 and 23, SEQ ID NOs 19 and 24, and SEQ ID NOs 19 and 25 respectively.
  • the antibody according to the second aspect of the present invention is a mouse-derived monoclonal antibody that specifically binds to human CD20 antigen on the cell membrane.
  • the activity is not so high.
  • these mouse-derived antibodies can acquire CDC or ADCC activity by chimerization or humanization.
  • These cytotoxic activities are also important biological activities, therefore the anti-CD20 monoclonal antibody of the second aspect may also be a promising candidate as a therapeutic agent.
  • the combination of the H chain variable region amino acid sequence and the L chain variable region amino acid sequence is SEQ ID NO: 3 and 9, SEQ ID NO: 4 and 10, SEQ ID NO: 5 and 11, respectively.
  • the mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibodies that are SEQ ID NOs: 6 and 12, or SEQ ID NOs: 16 and 18, and further, anti-CD20 monoclonal antibodies obtained by chimerizing or humanizing them are included.
  • the present invention also includes a hybridoma that produces the mouse-derived antibody, and a mammalian cell (in the example, CHO cell) into which a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the chimeric antibody and the humanized antibody has been incorporated.
  • the chimeric anti-CD20 monoclonal antibody or the human anti-CD20 monoclonal antibody described as the antibody of the first aspect and the second aspect are both immune to which the antibody produced by B cell malignancy and B cell or B cell is involved
  • the present invention can be expected to have excellent effects as a therapeutic agent for diseases, and the present invention is directed to the development of a therapeutic agent comprising either a chimeric or human anti-CD20 monoclonal antibody, preferably a humanized anti-CD20 monoclonal antibody as an active ingredient.
  • a therapeutic agent comprising either a chimeric or human anti-CD20 monoclonal antibody, preferably a humanized anti-CD20 monoclonal antibody as an active ingredient.
  • the porpose is to do.
  • Target diseases include non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic rheumatoid arthritis, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenic purpura, systemic lupus erythematosus, antiphospholipid syndrome Sheer- Spotify syndrome, Crohn's disease, scleroderma, multiple sclerosis, type I diabetes and the like.
  • the mouse-derived monoclonal antibody of the present invention can be produced by the following method.
  • SB cells which are cell lines expressing human CD20 antigen, Raji cells, or CHO cells in which human CD20 antigen is expressed can be used in combination.
  • human CD20 protein (GST-CD20) fused with GST may be used as a complementary sensitizing antigen.
  • Preparation of monoclonal antibody-producing hybridomas is carried out by (1) immunizing an animal (murine) to be immunized, (2) preparing lymphocytes from the immunized animal, and (3) preparing parent cells. , (4) cell fusion of lymphocytes and parent cells, (5) screening, and (6) cloning (Ailsa M. Campbell (Author), Osawa Toshiaki (translation) biochemical experiment) Act; monoclonal antibody, Tokyo Kagaku Dojin, 1989).
  • the cloning of the anti-CD20 monoclonal antibody that specifically binds to the CD20 antigen on the cell surface can be performed by reacting the monoclonal antibody that is the subject with a Cell ELISA in which CD20 / CHO cells are immobilized on a plate.
  • the expression vector may be commercially available S, because it is necessary to express the CD20 antigen at high density on CHO cells, the mammalian cell high expression vector pNOW (Japanese Patent No. 3582965) may also be used. Good.
  • the selection criteria for monoclonal antibodies are to exhibit the same or higher reactivity in comparison with positive control.
  • Chimerization and production of a humanized antibody may be performed according to a conventional gene recombination method.
  • an expression vector can use pNOW-Ab in which two sets of multicloning sites are arranged in tandem for antibody production and in which human heavy chain and light chain constant region genes have been previously incorporated ( Figure 1). ).
  • the cDNA library was also excised by using the 5 'primer 1 described in SEQ ID NO: 13 and the 3' primer described in SEQ ID NO: 14 specific to the gene encoding the entire human CD20 molecule (Multiple Choice cDNA human Spleen, Origene Technologies, In c. 6 Taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850). Specifically, the primers shown in FIG. 3 were used.
  • the CD20 gene was transfected into CHO cell which is a host cell after being incorporated into pNOW-Ag (FIG. 2) which is a high expression vector for mammalian cells.
  • CHO cells By FACS analysis, recombinant CHO cells (CD20 / CHO cells) highly expressing CD20 molecules on the cell surface were established. In addition, when stained with FITC-labeled anti-CD20 monoclonal antibody, those with a fluorescence intensity three or more times higher than that of SB cells were highly expressed.
  • Complementary immunogen GST-CD20 was prepared by fusing GST to the N-terminal of 43 amino acids of CD20 extracellular domain using pGEX-4T2 vector (G et al. AM, Electrophoresis Vol 20 (2) : 344-348)
  • SB cells or Raji cells were cultured in 10% FCS-supplemented RPMI 1640 medium.
  • CD20 / CHO cells were cultured using CHO-S-SFM II medium (GIBCO, Cat. No. 12052-098) supplemented with 800 / ig / ml of G418. After these cultures were centrifuged (1100 rpm, 5 minutes), the cells were suspended with Dulbecco's PBS (-), suspended, and centrifuged again. This washing procedure was repeated once again, and a suspension prepared by adding saline to the cells (the number of cells per ml is 1 to 3 ⁇ 10 7 ) was used for immunization.
  • PGEX-4T2 into which GST-CD20 had been incorporated was introduced into E. coli competent cells. The competent cells were lysed after culture, and GST-CD20 was crudely purified from the lysed cells and then solubilized by adding 0.1 N caustic soda.
  • mice 7-11 week old Balb strain female mice were used as the animals to be immunized.
  • SB cells Raji cells and CD20 / CHO cells
  • different cell antigens SB cells, Raji cells or CD20 / CHO cells
  • the number of cells administered was 1 to 3 ⁇ 10 7 cells per mouse.
  • GST-CD20 was used to perform complementary immunization.
  • mouse spleen cells are removed and suspended in RPMI medium, followed by PEG A fusion reaction with mouse myeloma (NS-1) was carried out in the presence of -1500 (Oi, VT et. Herz enberg, 1980, m: Selected Methods m Cellular Immunology; Misnell B et al (Freeman and Co. San Francisco , CA) p. 351).
  • CD20 CHO cell ELISA is a sensitive measurement system, showing a sufficiently detectable level of absorbance even at relatively low concentrations of the test antibody sample due to the high antigen density on the cell surface attached to the plate. It has been found. Specific measurement results are shown in Table 1.
  • Cell ELISA was performed using a 96-well plate to which CD20 / CHO cells or CHO cells (CD20 parent strain) were attached, and wells producing antibodies specifically reactive with CD20 were selected. 2B8 was used as a positive control, and a mouse monoclonal antibody against human CD3 antigen (BD PharMingen) was used as a negative control. Specifically, CD20 / C attached to Poly-L-Lysine coated 96 well plate (Asahi Techno Glass, Cat. No. 11-023-018) HO cells or CHO cells (parent strain) were used for Cell ELISA. 150 ⁇ l of blocking solution (0.2% -Gelatine, 0.5% -BSA solution) was added to each well, and allowed to stand at 37 ° C.
  • blocking solution 0.2% -Gelatine, 0.5% -BSA solution
  • the limiting dilution was performed. After culturing the cells in a 96-well plate and culturing the culture supernatant of one colony, CD20 / CHO cells Cell ELISA was performed to select clones producing specific antibodies.
  • the specific antibody-producing clones are cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, and when the cell density is around 5 ⁇ 10 5 / ml, the culture medium is changed to serum-free medium ASF-104N (Ajinomoto) and culture is performed. The Two to four days after that, the culture solution was centrifuged to recover the culture supernatant, and then purification was performed using a protein G column, and the eluted monoclonal antibody solution was dialyzed against 150 mM NaCl. Filter sterilization was performed with a 0.2 ⁇ filter and used as a test antibody (anti-human CD20 mouse monoclonal antibody).
  • the apoptosis inducing ability of the test antibody was measured using flow cytometry (Annexin V / PI staining). 2B8 was used as a positive control, and a mouse monoclonal antibody (BD PharMingen) to human CD3 was used as a negative control.
  • the operation procedure is as follows.
  • Raji cells are centrifuged and suspended in fresh RPMI 1640 medium (Sigma, Cat. No. R8758, Lot. 44K2416) containing 10% FCS (non-activated) (ICN, Cat. No. 2916754, Lot. 8005 C)
  • RPMI 1640 medium Sigma, Cat. No. R8758, Lot. 44K2416
  • FCS non-activated
  • Each well of the 12 well plate was filled with 1 ml at a density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • Each antibody was added to a final concentration of 2 ⁇ g / ml or 4 ⁇ g / ml using 12 wells for each antibody. (3 wells x 2 species concentration x 2 time point, 12 wells in total)
  • FIG. 1 The measurement results of representative eight types of mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibodies, a positive control (2B8), and a negative control (anti-CD3 antibody) are shown in FIG.
  • 2B8 to induce apoptosis is considered to be high, but a clone (1K1791) in which the H chain variable region amino acid sequence and the L chain variable region have the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 2 and 8, respectively High apoptosis induction was observed. Apparent cell death was also observed when the heavy chain variable region amino acid sequence and the light chain variable region were clones of SEQ ID NOS: 1 and 7 (1K1422) or SEQ ID NOS: 15 and 17 (1 ⁇ 0924), respectively.
  • a suspension of 5 ⁇ 10 4 cells / ml of Raji cells was prepared in 10% FCS-added RPMI 1640 medium, and 100 ⁇ l / well of each was added to 96-well plates and cultured. After 24 hours, each antibody solution was subjected to 50 ⁇ l / ml addition so that the antibody concentrations would be 0.01 ⁇ g / ml, ⁇ . ⁇ g / ml and 1 ⁇ g / ml, respectively, and culture was continued. 72 hours after antibody addition Chromogenic dye Cell Counting Kit_8 (Dojin Kagaku Cat. No. 34 After 10- / i 1 / well of 3-07623 (Lot.
  • FIG. 6 shows the viable cell count of eight representative mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibodies and a positive control (2B8) as a percentage of the negative control (100%).
  • the cell growth inhibitory effect can be estimated by the proportion of the reduced number of living cells in comparison with the negative control. Clear cell growth inhibition was observed in 1K0924, 1K1422, 1K1791 and the positive control 2B8, particularly in 1K1791. This tendency is also consistent with the results of the apoptosis induction test.
  • variable region genes of the heavy chain and light chain of each mouse-derived antibody were integrated into a high expression vector pNOW_Ab for CHO cells, which has human immunoglobin heavy chain and light chain ( ⁇ :) constant region genes as a cassette in advance.
  • the expression vector was transfected into CHO cells, and each clone was screened for high productivity.
  • the produced eight chimeric anti-CD20 monoclonal antibodies were tested for their reactivity to human CD20 antigen by CD20 / CHO Cell ELISA.
  • rituximab c2 B8
  • the test results are shown in Table 2.
  • Cell ELISA measurements (A492) reflect the strength of binding.
  • the affinity of C1K0924 and C1K1422 showed almost the same or higher affinity except that the affinity tended to be slightly lower than that of the control.
  • Antibody ⁇ body concentration (ng / ml)
  • the CDC activity was examined for the eight chimeric anti-CD20 monoclonal antibodies produced.
  • Rituximab (c2B8) was used as a positive control.
  • RC-K8 (obtained from Kochi University School of Medicine) was used as the target cell.
  • RHB basic medium: RPMI-1640, additives: 0.1% BSA, 20 mM HEPES (pH 7.2), 2 mM gnoletamine, penicillin G 100 unit / ml, streptomycin 100 zg / ml
  • the target cells were washed with RHB and resuspended to 10 6 cells / ml.
  • Test chimeric antibodies and rituximab respectively, 50 ⁇ l of different solutions at different concentrations, 4-fold diluted solutions of commercially available human complement (Quidel, San Diego, CA, Cat. A113) 50 ⁇ l, and 10 6
  • a 50 ⁇ l cell suspension of cells / ml was added to each well of a flat-bottomed 96-well tissue culture plate (black).
  • the antibody concentration in 150 ⁇ l / well was set at 0.1 zg / ml, 1 ⁇ g / ml, and 10 ⁇ g / ml.
  • 5% CO to promote complement-mediated cell lysis
  • % CDC activity 100 X ⁇ RFU (no antibody added)-RFU (with antibody added) / ⁇ RFU (carried without antibody attached)-RFU (with Triton X-100 added) ⁇
  • Mouse-derived anti-CD20 monoclonal antibody 1K1791 was designed for humanization based on the variable region CDRs.
  • Four types of humanized sequences for H chain and L chain were prepared by changing the design method after structural analysis from amino acid sequence (Padlan EA, Mol Immunol Vol 28, No 4/5, 489-498) Wu TT and Kabat EA, Mol Immunol Vol 29, No 9, 1141-1 146; Padlan EA et al., FASEB J Vol 9, 133-139).
  • Antibodies were produced in all four combinations of H chain and L chain.
  • SEQ ID NOs 19 and 23 SEQ ID NOs 19 and 24, SEQ ID NOs 19 and 25, SEQ ID NOs 19 and 26, SEQ ID NOs 20 and 23, sequences Numbers 20 and 24, SEQ ID NOs 20 and 25, SEQ ID NOs 20 and 26, SEQ ID 21 and 23, SEQ ID 21 and 24, SEQ ID 21 and 25, SEQ ID 21 and 26, SEQ ID 22 and 23, SEQ ID 22 And 24, SEQ ID NOs: 22 and 25, SEQ ID NOs: 22 and 26 (FIGS. 8A and 8B).
  • amino acid sequences of the four heavy chain variable regions and the four light chain variable regions are substituted with the most frequently used DNA (base) sequence in the human gene sequence, and further, the base or chain is the host. It was changed without changing the original amino acid in consideration of its suitability for CHO cells (Kim CH et al. Gene 1997; 15; 199 (1-2): 293-301).
  • SEQ ID NO: 27 corresponding to SEQ ID NO: 19
  • SEQ ID NO: 28 corresponding to acid SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 corresponding to SEQ ID NO: 21 respectively.
  • a total of eight types of nucleotide sequences of H chain variable region (nucleotide sequence numbers 27 to 30) and L chain variable region (nucleotide sequence numbers 31 to 34) are synthesized (Takara Shuzo Co., Ltd.), and then the multicloning site is The expression vector for mammalian cells pNOW-Ab was incorporated.
  • the expression vector into which these human-derived antibody genes had been incorporated was transfected into CHO cells, and each clone was selected to select a highly productive strain.
  • a suspension of 5 ⁇ 10 4 cells / ml of Raji cells was prepared in 10% FCS-supplemented QRPMI 1640 medium, and 100 ⁇ l / well of each was added to a 96-well plate and cultured. After 24 hours, the culture was continued by adding 50 ⁇ l / well of each antibody solution to an antibody concentration of 0.5 zg / ml. After 72 hours of antibody addition, 10 ⁇ l / ⁇ l of the coloring dye Cell Counting Kit_8 (Dojin Chemical Cat. ⁇ 343-07623, Lot. SG076) was added, and the cells were further cultured for 4 hours, and then the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured. . FIG.
  • the hybridomas producing these monoclonal antibodies are designated by the name of the antibody to be produced, and are operated by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (address: Postal Code 305-8566 Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan). An international deposit has been made under the Budapest Treaty on March 28, 2006, with the number 1) 1 Central 1) 1 Central 6), and the accession number is assigned as follows.
  • a biologically active monoclonal agent suitable for use as a therapeutic agent according to the present invention Antibody is provided.

Abstract

　細胞表面のCD20抗原に結合することにより特異的な生物学的反応を誘導するモノクローナル抗体を提供する。CD20抗原の細胞外エピトープに対して強い結合親和性を有し且つ細胞増殖阻害活性等の生物学的活性を有するモノクローナル抗体をクローニングする。さらにそのモノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化することによりＢ細胞が関与する疾患に対する治療薬を開発する。

Description

明 細 書
抗 CD20モノクローナル抗体
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト CD20抗原に対するモノクローナル抗体に関し、さらには遺伝子組換 によるキメラ抗 CD20モノクローナル抗体及びヒト化抗 CD20モノクローナル抗体、又は このいずれ力、を有効成分とする B細胞性腫瘍または免疫疾患に対する治療薬に関す る。
背景技術
[0002] CD20抗原を認識するモノクローナル抗体としては、 Bl， 2B8 (キメラ抗体名は rituxim ab)、 1F5、 2H7などが知られている。なかでも、米国 IDEC Pharmaceuticals Corporati onにより開発されたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体である rituximabは低悪性度非 ホジキンリンパ腫 (NHL)の標準治療薬として確立している他、 B細胞が関与する多く の免疫疾患に対して治療効果があることが明らかにされている。例えば、慢性リンパ 性白血病などの悪性腫瘍のほかに自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症 紫斑病などの病原性自己抗体が関与していると考えられる自己免疫疾患、慢性関節 リウマチや多発性硬化症といった炎症性疾患に対して効果的とされる (非特許文献 1 4〜： 17)。
[0003] CD20は Bリンパ細胞表面に発現している分子であり、末梢血、脾臓、扁桃、骨髄中 の正常 B細胞などの他ほとんどの悪性腫瘍 B細胞に発現がみられる。この分子は 297 アミノ酸よりなり、細胞膜を 4回貫通し C末端、 N末端の両方を細胞内に有し、 3回目と 4 回目膜貫通ドメイン間に糖鎖不含の 43アミノ酸残基よりなる唯一の細胞外に露出した ループをもつ（非特許文献 1、 9)。 CD20分子は通常 4量体として存在し、さらに他の マイナーな成分とヘテロな複合体を形成しているものと考えられている (非特許文献 1 8)。 CD20タンパクは、細胞外への分泌や切断が無いのに加え、抗体結合による細胞 内への取り込みがほとんど無いことから、抗体による標的細胞に対する細胞傷害性メ 力二ズムが効果的に働くことが期待できる (非特許文献 1〜3)。
[0004] 分子サイズが小さいにも拘わらず、 CD20は細胞外における複合体としての発現形 態の影響もありェピトープは多様性を有し、それに結合する抗体はさまざまに異なる 生物学的応答を介在する。例えば、 B細胞レセプターのダウンレギュレーション、 MH Cクラス II抗原や接着分子の発現増加、 hyper-cross-linking下での Ca2+放出活性化、 リンパ細胞の機能関連の antigen 1非依存性同型接着の阻害、アポトーシス誘導また はその逆の細胞増殖促進などの活性が大きく異なっている (非特許文献 4〜： 13)。代 表的抗 CD20抗体である rituximab、 Bl、 1F5、 2H7においても、その特性及び生物学 的機能は異なっており、 CD20に結合するモノクローナル抗体というだけではその生 物学的性質を特定し得ない。
[0005] CD20の細胞外ドメインを構成する分子は不溶性である。細胞溶解物由来又は遺伝 子組換タンパクとしての CD20分子は界面活性剤又は強アルカリを用いて可溶化し得 る力 このような処理条件下では自然の立体構造を維持することは困難である。この ため、抗体を得るための免疫原として CD20陽性 B細胞株が用いられる力 S、免疫刺激 性は弱く成熟した抗体産生細胞クローンを得ることは容易ではない。
[0006] 2005年現在、治療薬として認可されている抗 CD20モノクローナル抗体はマウス/ヒ トのキメラである rituximabだけである。異種動物とのキメラ分子は抗原性を有するため 治療薬として一般には好まれなレ、が、抗 CD20抗体は正常細胞を含む全ての B細胞 を標的し除去する性質を有するため抗原性がほとんど無いとされてレ、る。しかしなが ら、数パーセントではあるが治療期間中に中和抗体を誘起する事例が報告されてお り投与する量や期間によってはさらにその可能性が高まることから、よりヒトに近い配 歹 IJを有するヒト化抗体またはヒト抗体の開発が望まれる。キメラ抗体のもう一つの不利 な点は血中半減期が短いことであり、 β半減期は 3〜4日に過ぎない。 Rituximabの再 発低悪性度 NHLに対する米国での臨床試験の奏効率は単独投与で 50%弱であった ことが報告されており、 rituximabが効かなレ、かまたは効きの悪い患者が 50%以上いる ことを示している。中悪性度 NHLの場合の奏効率はさらに低く 30%程度に過ぎない（ 非特許文献 14)。このため、患者により反応が異なる原因 ·背景の追究が必要である と同時により優れた効果を有する抗体の開発が望まれる。
非特許文献 1： Leukocyte Fact Book 2η Edition, Academic Press
非特許文献 2 : Stashenko P et al., J Immunol 1980; 125: 1678-85 非特許文献 3: Anderson KC et al., Blood 1984; 63:1424-33
非特許文献 4: Shan D et al., Blood 1998; 91:1644-52
非特許文献 5 : Flieger D et al., Cell Immunol 2000; 204:55-63
非特許文献 6 : Mathas S et al., Cancer Res 2000; 60:7170-6
非特許文献 7 : Cardarelli PM et al., Cancer Immunol Immunother 2002; 51:15-24 非特許文献 8 : Pedersen IM et al., Blood 2002; 99:1314-9
非特許文献 9: Deans JP et al" Imminol 2002; 107:176-82
非特許文献 10:Golay JT et al, J Immunol 1992; 149:300-8
非特許文献 11 :Bourger I et al., Eur J Immunol 1993; 23:768-71
非特許文献 12: White MW et al., J Immunol 1991; 146:846-53
非特許文献 13: Shan D et al., Cancer Immunol Immnother 2000; 48:673-83 非特許文献 14:Coiffier B et al., Blood 1998; 92:1927-32
非特許文献 15: Edward JC et al., Rheumatology (Oxford) 2001; 40:205-11 非特許文献 16:Zaja F et al., Heamatologica 2002; 87:189-95
非特許文献 17:Perrotta S et al., Br J Haematol 2002; 116:465-7
非特許文献 18:Polyak MJ et al., Blood 2002; 99:3256-62
発明の開示
[0007] 本発明の課題は、従来の抗 CD20モノクローナル抗体治療薬よりも優れた生物学的 機能を有するモノクローナル抗体を提供することである。
[0008] 本発明者らは、複数の CD20抗原陽性 B細胞株、遺伝子工学的にヒト CD20抗原を 細胞膜上に発現させた哺乳動物細胞、及び GST( glutathione S-transferase)タンパ クを融合させたヒト CD20タンパクを免疫原として任意に組み合わせて用いることにより ヒト CD20抗原に対して特異的に結合するマウス由来抗 CD20モノクローナル抗体を得 た。このうちいくつかはエフヱクタ一細胞非存在下の in vitro CD20発現細胞培養に おいてアポトーシスを含む直接的な細胞増殖阻害活性を有していた。また、アポトー シスなどの細胞増殖阻害活性の有無に拘わらず、他の選択されたマウス由来抗 CD2 0モノクローナル抗体も含め、キメラ化により効果的な補体又は抗体依存性の細胞障 害性を有した。これらの中から最も望ましい生物学的活性を有すると判断された抗体 のアミノ酸配列をヒト化することにより治療薬として使用できる抗 CD20モノクローナル 抗体が作製された。これにより、本発明は完成された。
本発明は、以下のものを提供する。
(1)エフェクター細胞非存在下でのヒト CD20抗原発現細胞培養において該 CD20抗 原発現細胞に対してアポトーシスを含む増殖阻害活性を有するマウス由来抗 CD20 モノクローナル抗体。
(2) H鎖可変領域アミノ酸配列と L鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ 配列番号 1及び 7、配列番号 2及び 8、又は配列番号 15及び 17である（1)の抗 CD20 モノクローナル抗体。
(3) (1)又は（2)の抗 CD20モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
(4) (2)の抗 CD20モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン 定常域アミノ酸配列を融合させたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体。
(5) (2)の抗 CD20モノクローナル抗体の可変領域 CDRのアミノ酸配列とヒトイムノグロ ブリンのアミノ酸配列を用いてヒ H匕された抗 CD20モノクローナル抗体。
(6) H鎖可変領域アミノ酸配列の L鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞ れ配列番号 19及び 23、配列番号 19及び 24、配列番号 19及び 25、配列番号 19及 び 26、配列番号 20及び 23、配列番号 20及び 24、配列番号 20及び 25、配列番号 20及び 26、配列番号 21及び 23、配列番号 21及び 24、配列番号 21及び 25、配列 番号 21及び 26、配列番号 22及び 23、配列番号 22及び 24、配列番号 22及び 25、 又は配列番号 22及び 26である（5)のヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体。
(7)ヒト補体存在下で CD20抗原発現細胞に対して細胞障害性を有する (4)〜（6)の いずれ力 1項の抗 CD20モノクローナル抗体。
(8) (4)〜（7)のレ、ずれ力 4項の抗 CD20モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコード する塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞。
(9) CHO細胞である（8)の哺乳動物細胞。
(10) H鎖可変領域アミノ酸配列と L鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞ れ配列番号 3及び 9、配列番号 4及び 10、配列番号 5及び 11、配列番号 6及び 12、 又は配列番号 16及び 18であるマウス由来抗 CD20モノクローナル抗体。 (11) (10)の抗 CD20モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
(12) (10)の抗 CD20モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロプリ ン定常域アミノ酸配列を融合させたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体。
(13) (10)の抗 CD20モノクローナル抗体の可変領域 CDRのアミノ酸配列とヒトイムノ グロブリンのアミノ酸配列を用いてヒト化された抗 CD20モノクローナル抗体。
(14)ヒト補体存在下で CD20抗原発現細胞に対して細胞障害性を有する（12)また は（13)の抗 CD20モノクローナル抗体。
(15) (12)〜（： 14)のいずれ力 4項の抗 CD20モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコ ードする塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞。
(16) CHO細胞である（15)の哺乳動物細胞。
(17) (2)、（4)〜（7)、 (10)及び（12)〜（： 14)のいずれかの抗 CD20モノクローナル 抗体を有効成分とする診断薬。
(18) (4)〜（7)及び（12)〜（14)のレ、ずれかの抗 CD20モノクローナル抗体を有効 成分とする治療薬。
[0010] なお、これらに規定されるモノクローナル抗体のアミノ酸配列はその二次構造及び その生物学的性質を有意に変更しないかぎり他のアミノ酸で置換しても良ぐそうした アミノ酸配列を置換したモノクローナル抗体もこの本出願の請求の範囲に含まれる。 図面の簡単な説明
[0011] [図 1]組換抗体発現用ベクター pN〇W_Abの構造を示す。
[図 2]タンパク発現用ベクター pNOW-Agの構造を示す。
[図 3]ヒト CD20遺伝子クローニング用プライマー配列を示す。
[図 4]マウス由来抗 CD20モノクローナル抗体可変領域 H鎖及び L鎖のアミノ酸配列を 示す。
[図 5]マウス由来抗 CD20モノクローナル抗体のアポトーシス試験結果を示す。
[図 6]マウス由来抗 CD20モノクローナル抗体による細胞増殖阻害試験結果を示す。
[図 7]キメラ抗 CD20モノクローナル抗体による補体依存性細胞障害性試験結果を示 す。
[図 8A]ヒト化抗 CD20モノクローナル抗体可変領域 H鎖及び L鎖のアミノ酸配列、及び それらに対応する塩基配歹 1Jを示す。
[図 8B]ヒトイヒ抗 CD20モノクローナル抗体可変領域 H鎖及び L鎖のアミノ酸配歹 IJ、及び それらに対応する塩基配歹 1Jを示す。
[図 9]ヒト化抗 CD20モノクローナル抗体による細胞増殖阻害試験結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明において、「抗体」という用語は、抗体全般及びそれを構成する H鎖及び L鎖 、及びそれらのフラグメントを包含する意味で用いる。
[0013] 本発明は、細胞膜上のヒト CD20抗原に結合し、治療効果を誘導するのに望ましい 生物学的活性を有する抗 CD20モノクローナル抗体に関する。
[0014] 本発明の第 1の態様の抗体は、細胞膜上のヒト CD20抗原に対して特異的に結合す るモノクローナル抗体であって、エフェクター細胞の助けを借りることなくヒト CD20抗 原発現細胞培養において該ヒト CD20抗原発現細胞に対してアポトーシスを含む増 殖阻害活性を有する抗体である。これはオリジナルにはマウス由来抗 CD20モノクロ ーナル抗体であり、さらにはこれらをキメラ化又はヒトイ匕した抗 CD20モノクローナル抗 体をも含む。これらの抗体は、エフェクター細胞の助けを借りることなく in vitroヒト CD2 0抗原発現細胞培養において該 CD20抗原発現細胞に対してアポトーシスを含む直 接的な増殖阻害活性を有する。これらのキメラ化又はヒト化した抗 CD20モノクローナ ル抗体は、補体依存性及び Z又は抗体依存性の細胞障害性を有する。
[0015] 細胞膜上の CD20抗原への結合性は、 SB細胞や Raji細胞などの CD20発現細胞を プレートに付着させ被検体であるモノクローナル抗体を反応させる Cell ELISAにより 調べることが出来る。し力 ながら、それらの細胞の CD20抗原の発現量が充分では ないことから反応性は鋭敏でなレ、。このため、本発明では遺伝子組換により CD20を 多量に発現させた CHO細胞（CD20/CHO細胞）をプレートに付着させ、被検体であ るモノクローナル抗体を反応させる方式の Cell ELISAが開発された。本発明中の予 備試験において、 CD20/CHO細胞を用いた Cell ELISAはモノクローナル抗体の反応 性試験において SB細胞又は Raji細胞を用いた Cell ELISAと同様のパターンを示し、 且つ鋭敏であることが確認されている（実施例： CD20/CHO Cell ELISAスクリーニン グ法の確立、表 1を参照）。 [0016] エフェクター細胞非存在下での in vitroヒト CD20抗原発現細胞培養における直接的 な細胞増殖阻害活性の測定は一般的方法により測定できる（Miyamoto T et al. Avia n Dis. Vol 46(1), 10-16)。また、アポトーシス誘導能はフローサイトメトリー（Annexin V I PI staining)を用いた試験により測定が可能である。
[0017] 第 1の態様の抗体の事例には、 H鎖可変領域アミノ酸配列と L鎖可変領域アミノ酸 配列の組み合わせがそれぞれ配列番号 1及び 7、配列番号 2及び 8、又は配列番号 15及び 17で規定されるマウス抗 CD20モノクローナル抗体、さらにはこれらをキメラ化 又はヒトイ匕した抗 CD20モノクローナル抗体が含まれる。これらの抗体は、エフェクター 細胞の助けを借りることなく in vitroヒト CD20抗原発現細胞培養において該 CD20抗 原発現細胞に対してアポトーシスを含む直接的な増殖阻害活性を有する。これらは 又補体依存性及び/又は抗体依存性の細胞障害性をも有する。本発明には、マウ ス由来抗体を産生するハイプリドーマ、及びキメラ抗体又はヒト化抗体のアミノ酸配列 に対応する塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞、（実施例では CHO細胞)も含まれ る。
[0018] キメラ化は、マウス由来モノクローナル抗体の H鎖可変領域アミノ酸配列とヒトイムノ グロブリン H鎖定常領域アミノ酸配列、 L鎖可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン L鎖定常領域アミノ酸配列を融合させることにより行われ（Ishida T et al. Nippon Rins ho Vol 60, No 3, 439-444)、ヒト化は、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域 CD Rアミノ酸配列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いてデザインされる。治療薬と して好ましいヒ H匕抗 CD20モノクローナル抗体はさまざまにデザインされた抗体の特 性を比較することにより選択される（Padlan EA, Mol Immunol Vol 28， No 4/5, 489-49 8 ;Wu TT and Kabat EA, Mol Immunol Vol 29, No 9, 1141-1146 ; Padlan EA et al. , FASEB J Vol 9， 133-139)。
[0019] キメラ化又はヒト化した抗 CD20モノクローナル抗体は、さらに補体依存性細胞障害 性 (CDC)及びエフェクター細胞存在下で抗体依存性細胞障害性 (ADCC)を有する。 これらの CDC及び ADCCに関する試験方法については一般的に使用されている方 法を参照することができる（Manches〇 et al., Blood 2003; 101(3):949- 54; Idusogie E E et al.. J Immunol 2000; 164: 4178—4184)。 [0020] 具体的なヒト化抗 CD20モノクローナル抗体の事例は、 H鎖可変領域アミノ酸配列と L鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配列番号 19及び 23、配列番号 19及び 24、配列番号 19及び 25、配列番号 19及び 26、配列番号 20及び 23、配列 番号 20及び 24、配列番号 20及び 25、配列番号 20及び 26、配列番号 21及び 23、 配列番号 21及び 24、配列番号 21及び 25、配列番号 21及び 26、配列番号 22及び 23、配列番号 22及び 24、配列番号 22及び 25、又は配列番号 22及び 26で示され る。
[0021] 本発明の第 2の態様の抗体は、細胞膜上のヒト CD20抗原に対して特異的に結合す るマウス由来のモノクローナル抗体である力 アポトーシスを含む増殖阻害活性を示 さない力もしくはその活性がそれほど高くないものである。し力 ながら、これらのマウ ス由来抗体は、キメラ化又はヒト化することによって CDC又は ADCC活性を獲得するこ とが可能である。これらの細胞障害性活性も重要な生物学的活性であり、それ故に 第 2の態様の抗 CD20モノクローナル抗体も治療薬としての有望な候補になり得る。
[0022] 第 2の態様の抗体の事例には、 H鎖可変領域アミノ酸配列と L鎖可変領域アミノ酸 配列の組み合わせがそれぞれ配列番号 3及び 9、配列番号 4及び 10、配列番号 5及 び 11、配列番号 6及び 12、又は配列番号 16及び 18であるマウス由来抗 CD20モノク ローナル抗体、さらにはこれらをキメラ化又はヒトイ匕した抗 CD20モノクローナル抗体が 含まれる。本発明には、該マウス由来抗体を産生するハイブリドーマ、及び該キメラ 抗体及び該ヒト化抗体のアミノ酸配列に対応する塩基配列を組み込んだ哺乳動物細 胞、（実施例では CHO細胞)も含まれる。
[0023] 細胞膜上の CD20抗原への結合性の判定法、増殖阻害、アポトーシス、 ADCC, CD Cなど各種試験法、及びキメラ又はヒト化抗体の作製法は第 1の態様の抗体の場合と 同様の方法による。
[0024] 第 1の態様及び第 2の態様の抗体として記載するキメラ抗 CD20モノクローナル抗体 又はヒトイヒ抗 CD20モノクローナル抗体は、共に B細胞性悪性腫瘍および B細胞又は B 細胞が産生する抗体が関与する免疫疾患に対する治療薬として優れた効果をもつこ とが期待でき、本発明はキメラ又はヒトイ匕した抗 CD20モノクローナル抗体のいずれか 、望ましくはヒト化抗 CD20モノクローナル抗体を有効成分とする治療薬の開発に供す ることを目的とする。対象疾患としては、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性 リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性関節リウマチ、 自己免疫溶血性貧血症、 特発性血小板減少症紫斑病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、シェ 一ダレン症候群、クローン病、強皮症、多発性硬化症、 I型糖尿病などが挙げられる。
[0025] 本発明のマウス由来モノクローナル抗体は以下の方法で作製することができる。
[0026] 感作免疫抗原として、ヒト CD20抗原を発現する細胞株である SB細胞、 Raji細胞又は ヒト CD20抗原を発現させた CHO細胞を組み合わせて用いることができる。また、 GST を融合させたヒト CD20タンパク（GST-CD20)を補完的な感作抗原として用いることも ある。
[0027] モノクローナル抗体産生ハイプリドーマの作製は、（1)被免疫動物である動物（マウ ス）への免疫、（2)免疫された動物からのリンパ球の調製、（3)親細胞の調製、（4)リ ンパ球と親細胞の細胞融合、（5)スクリーニング、及び（6)クローニングという一連の 手続きにより行うことができる (Ailsa M. Campbell (著)，大沢利昭（訳）生化学実験法 ；モノクローナル抗体、東京化学同人、 1989年）。細胞表面の CD20抗原に特異的に 結合する抗 CD20モノクローナル抗体のクローニングは、 CD20/CHO細胞をプレート に固定した Cell ELISAに被検体であるモノクローナル抗体を反応させることにより行う ことができる。発現ベクターは市販のものでも可である力 S、 CHO細胞上に CD20抗原 を高密度に発現させる必要があることから哺乳動物細胞高発現ベクター pNOW (特 許第 3582965号公報)を使用してもよい。モノクローナル抗体の選択基準は、陽性コン トロールとの比較において同程度以上の反応性を示すものとする。
[0028] キメラ化及びヒト化抗体の作製は通常の遺伝子組換法に拠ればよい。例えば、発 現ベクターは抗体産生用に 2セットのマルチクローニングサイトをタンデムに並べ、且 つヒトの H鎖及び L鎖の定常域遺伝子が予め組み込まれた pNOW-Abを用いることが できる（図 1)。
実施例 1
[0029] CD20抗原に対するモノクローナル抗体の作製、キメラ化及びヒト化、さらに得られた 抗体の特性に関する試験を、実施例に基づいて説明する。
[0030] (1)マウス感作用免疫抗原の作製 ヒト CD20全分子をコードする遺伝子に特異的な配列番号 13に記載の 5 'プライマ 一及び配列番号 14に記載の 3'プライマーを用いて cDNAライブラリ一力もヒト CD20 遺 十 切り出した (Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, In c. 6 Taft Court, Suite 100， Rockville, MD 20850)。具体的には図 3に記載のプライ マーを用いた。 CD20遺伝子は哺乳動物細胞用高発現ベクターである pNOW-Ag (図 2)に組み込まれた後、宿主細胞である CHO細胞にトランスフエタトされた。 FACS分 析により、細胞表面に CD20分子を高発現している組換 CHO細胞（CD20/CHO細胞） を樹立した。なお、 FITC標識抗 CD20モノクローナル抗体で染色した場合に SB細胞 に比べて蛍光強度力 ¾倍以上のものを高発現しているものとした。補完的な免疫原の GST-CD20は、 pGEX-4T2ベクターを用いて CD20細胞外ドメインの 43アミノ酸の N末 に GSTを融合させることにより作製した（G et al. AM , Electrophoresis Vol 20(2):344 -348)
[0031] (2)免疫原の調製
SB細胞または Raji細胞は 10%FCS添力 PRPMI1640培地を用いて培養を行った。 CD2 0/CHO細胞は、 G418を 800 /i g/ml添加した CHO-S-SFM II培地（GIBCO、 Cat. No. 12052-098)を用いて培養を行った。これらの培養液を遠心分離（1100rpm、 5分）した 後、細胞に Dulbecco's PBS (-)をカ卩えて懸濁させ再度遠心分離した。この洗浄操作を もう一度繰り返し、細胞に生理食塩水を加えて調製した懸濁液（1ml当たりの細胞数 は 1〜3 X 107である）を免疫に用いた。 GST- CD20が組み込まれた pGEX-4T2は E. co liコンペテントセルに導入された。該コンペテントセルは培養の後溶解され、 GST-CD 20は溶解細胞から粗精製した後 0.1 N苛性ソーダを加えて可溶化された。
[0032] (3)免疫及び細胞融合
被免疫動物には 7〜11週令の Balbん系雌性マウスを使用した。 SB細胞、 Raji細胞及 び CD20/CHO細胞のうちいずれかの細胞をさまざまな日数間隔で 2〜3回繰り返して 投与した後、それとは異なった細胞抗原 (SB細胞、 Raji細胞又は CD20/CHO細胞）を 選び最終免疫に使用した。投与した細胞数はいずれもマウス 1匹当たり 1〜3 X 107個 であった。また、一部のマウスの事例では GST-CD20を用いて補完的な免疫を行った 。最終免疫の 3日後にマウスの脾臓細胞を取り出し、 RPMI培地中で懸濁した後、 PEG -1500の存在下でマウスミエローマ (NS-1)との融合反応を行なった（Oi,V.T. et. Herz enberg, 1980, m:Selected Methods m Cellular Immunology； Misnell B et al (Freeman and Co. San Francisco, CA) p.351·)。
[0033] (4) CD20/CHO Cell ELISAスクリーニング法の確立
SB細胞、 Raji細胞、 CD20/CHO細胞及び CD20の CHO親株をそれぞれ付着させた 96ゥエルプレートを用いて、幾つかのマウス由来抗 CD20モノクローナル抗体と 2B8を 反応させた。これらの Cell ELISAは抗体濃度に対して同様の傾向を示すことが確認さ れ、抗体間及びコントロールとの相対比較も可能であることが判明した。 CD20 CHO 細胞 ELISAはプレートに付着させた細胞表面の抗原密度が高いことから、被検抗体 サンプノレが比較的低濃度であっても充分に検出可能なレベルの吸光度を示し、鋭敏 な測定系であることが判明した。具体的な測定結果を表 1に示す。
[0034] [表 1]
Figure imgf000013_0001
(5) Cell ELISAによるスクリーニング
CD20/CHO細胞または CHO細胞（CD20親株）を付着させた 96ゥエルプレートを用 いて Cell ELISAを行レ、、 CD20に特異的に反応する抗体を産生しているゥエルを選択 した。陽性コントロールには 2B8を用レ、、陰性コントロールにはヒト CD3抗原に対する マウスモノクローナル抗体 (BD PharMingen社)を用いた。具体的には、 Poly-L-Lysine コート 96ゥエルプレート（旭テクノグラス、 Cat. No.11-023-018)に付着させた CD20/C HO細胞または CHO細胞（親株）を Cell ELISAに用いた。その各ゥエルにブロッキング 液（0.2%-Gelatine， 0.5%-BSAの PBS溶液）を 150 μ 1入れて 37°Cで 1時間静置した。 150 mM-NaCl, 0.05%_Tween20水溶液を用いてプレートを 5回洗浄した後、サンプル（培 養上清の希釈液）を各ゥエルに 100 μ 1入れて 1次反応を 37°Cで 1時間行なった。洗浄 後、標識抗体の希釈液〔HRP標識抗マウス IgG(H+L)ゥサギ抗体 (Jackson Lab. Code No. 315-035-003)、または HRP標識抗マウス IgG(Fc y )ゥサギ抗体（Jackson Lab. C ode No. 315-035-008)〕を各ゥヱルに 100 μ ΐ入れて 2次反応を 37°Cで 1時間行なった 。 1次、 2次の反応液の調製には、ブロッキング液と同じものを用いた。洗浄後、発色 液（〇PD)を各ゥヱルに ΙΟΟ μ Ι入れ 30分後に 4N-H SOを 50 μ 1カ卩えて反応を停止し、
2 4
Α492を測定した。結果、 2Β8と同程度ないし有意に高い反応性を示したゥエルを選択 した。
[0036] (6)クローニング
限界希釈法で行った。細胞を 96ゥヱルプレートに撒いて培養後、 1コロニーのゥヱル の培養上清について CD20/CHO細胞 Cell ELISAを行い、特異抗体の産生クローン を選択した。
[0037] (7)精製抗体の調製
特異抗体の産生クローンを 10%FCS添加 RPMI1640培地で培養し、細胞密度が 5 X 1 05/ml前後になった時点で無血清培地 ASF-104N (味の素）に培地を交換して培養を 行った。その 2〜4日後に培養液を遠心分離して培養上清を回収したあと、プロテイン Gカラムを用いて精製を行い、溶出されたモノクローナル抗体溶液を 150mM- NaClに 対して透析した。 0.2 μ ΐηのフィルターでろ過滅菌を行ない、試験抗体（抗ヒト CD20 マウスモノクローナル抗体）とした。
[0038] CD20/CHO Cell ELISA法を用いて陽性コントロールに匹敵する結合親和性を有す るモノクローナル抗体クローンを選別した。それらの抗体の可変領域について遺伝子 配列の決定を行い、その結果としてアミノ酸配列を決定した。代表的な抗体の H鎖 V 領域及び L鎖 V領域の配列を、配列番号 1及び 7、配列番号 2及び 8、配列番号 3及 び 9、配列番号 4及び 10、配列番号 5及び 11、配列番号 6及び 12、配列番号 15及 び 17、配列番号 16及び 18に示す（図 4)。さらにそれらのクローンについて生物学的 特性が調べられた。
[0039] 生物学的特性試験（1)アポトーシス誘導試験
フローサイトメトリー（Annexin V/ PI staining)を用いて試験抗体のアポトーシス誘導 能を測定した。陽性コントロールには 2B8、陰性コントロールにはヒト CD3に対するマウ スモノクローナル抗体 (BD PharMingen社)]を用いた。操作手順は次のとおりである。
[0040] MEBCYTOApoptosis Kit (MBL, Cat. No.4700, Lot.20)を用いて行った。
Raji細胞を遠心後、 10% FCS (非動化済）（ICN， Cat.No.2916754, Lot.8005C)を含む 新鮮な RPMI1640培地 (Sigma, Cat.No.R8758, Lot.44K2416)で懸濁し、 12ゥエルプレ 一トの各ゥヱルに 5 X 105細胞/ mlの密度で lmlを入れた。各抗体あたり 12ゥエルを用い 、各抗体を終濃度 2 μ g/ml又は 4 μ g/mlになるよう添加した。 （3ゥエル X 2種濃度 X 2 時点、計 12ゥエル）
[0041] 培養開始 1日後及び 2日後に、 2 X 105個程度分の細胞を含む培養液を回収し、遠 心後 PBSで 1回洗浄した。次に 85 μ 1 Binding bufferを加え懸濁した。さらに、 Annexin V-FITC 10 /i lと PI 5 /i lをカ卩えてよく混和した後、遮光、室温で 15分間反応させた。フ ローサイトメトリー (FACS Calibur, Becton Dickinson)を用いて測定し、 CellQuest (Bee ton Dickinson)で解析を行つァこ。
[0042] 代表的な 8種類のマウス由来抗 CD20モノクローナル抗体と陽性コントロール (2B8)、 陰性コントロール (抗 CD3抗体)の測定結果を図 5に示した。一般に 2B8のアポトーシス の誘導能は高いとされるが、 H鎖可変領域アミノ酸配列と L鎖可変領域がそれぞれ配 列番号 2及び 8のアミノ酸配列を有するクローン (1K1791)はそれとの比較においても 際立って高いアポトーシス誘導が観察された。 H鎖可変領域アミノ酸配列と L鎖可変 領域がそれぞれ配列番号 1及び 7(1K1422)、又は配列番号 15及び 17(1Κ0924)のク ローンにおいても明らかなアポトーシスによる細胞死が観察された。
[0043] 生物学的特性試験 (2)細胞増殖阻害試験
5 X 104個/ mlの Raji細胞懸濁液を 10%FCS添力 DRPMI1640培地で調製して 96ゥエルプ レートに 100 μ ΐ/ゥエルずつ入れて培養した。 24時間後、抗体濃度がそれぞれ 0.01 μ g/ml, Ο. ΐ μ g/ml及び 1 μ g/mlになるように各抗体溶液を 50 μ 1/ゥヱル添カ卩して培養を 継続した。抗体添加 72時間後に発色色素 Cell Counting Kit_8(同仁化学 Cat.No.34 3-07623, Lot. SG076)を 10 /i 1/ゥヱル加え、さらに 4時間培養した後で波長 492nmに おける吸光度を測定した。図 6に代表的な 8つのマウス由来抗 CD20モノクローナル 抗体と陽性コントロール (2B8)の生細胞数測定値を、陰性コントロール（100%)に対す る割合として示す。細胞増殖阻害効果は、陰性コントロールとの比較において減少し た生細胞数の割合により推定することが可能である。 1K0924, 1K1422, 1K1791及び 陽性コントロールである 2B8において明らかな細胞増殖阻害が観察され、特に 1K179 1において顕著であった。この傾向は、アポトーシス誘導試験の結果とも一致する。
[0044] キメラ抗体の作製
それぞれのマウス由来抗体の H鎖および L鎖の可変領域遺伝子を、ヒトイムノグロブ リン H鎖および L鎖（ κ: )定常域遺伝子をカセットとして予め有する CHO細胞用高発現 ベクター pNOW_Abに組み込んだ。該発現ベクターを CHO細胞にトランスフエタトし、 それぞれクローンにつレ、て生産性の高レ、ものを選別した。
[0045] キメラ抗体の CD20抗原に対する結合性試験
作製された 8つのキメラ抗 CD20モノクローナル抗体は CD20/CHO Cell ELISA法に よりヒト CD20抗原に対する反応性が調べられた。陽性コントロールには rituximab (c2 B8)を使用した。試験結果を表 2に示す。 Cell ELISA測定値 (A492)は結合性の強さを 反映する。 C1K0924及び C1K1422の親和性がコントロールと較べてやや低い傾向に あった以外はほぼ同等またはそれ以上の親和性を示した。
[0046] [表 2] 抗 CD20キメラ抗体の CD20/GHO Cell ELISA試験
CD20/CHO Cell ELISA (A492)
抗体 ΐπ体辰度 (ng/ml)
100 32 10 3 1 0
C1 K0924 1 .423 0.724 0.391 0.186 0.094 0.032
C1 K1228 2.226 1 .580 0.701 0.289 0.120 0.032
C1 K1402 2.449 1 .621 0.737 0.349 0.1 16 0.032
C1 K1422 1 .919 0.912 0.357 0.151 0.077
C1 K1 71 2 2.292 1 .683 0.793 0.359 0.145
C1 K1 736 2.428 1 .548 0.748 0.320 0.122
C1 K1 782 2.101 1 .01 7 0.505 0.1 69 0.074
C1 K1 791 2.231 1 .458 0.745 0.276 0.108
c2B8 2.147 1 .143 0.536 0.226 0.088 [0047] キメラ抗体の CDC試験
作製された 8つのキメラ抗 CD20モノクローナル抗体について CDC活性が調べられ た。陽性コントロールには rituximab (c2B8)を使用した。 標的細胞には RC-K8 (高知 大医学部より入手)を用いた。使用培地として RHB (基礎培地： RPMI-1640,添加物： 0.1% BSA、 20mM HEPES (pH 7.2), 2mMグノレタミン、ペニシリン G 100unit/ml、ストレ プトマイシン 100 z g/ml)を調製し用いた。標的細胞は、 RHBで洗浄後、 106 cells/mlに なるように再懸濁した。被験キメラ抗体及び rituximabのそれぞれにつレ、て濃度の異 なる溶液 50 μ 1、市販のヒト補体（Quidel, San Diego, CA、 Cat. A113)の 4倍希釈溶液 50 μ 1、及び 106 cells/mlの細胞懸濁液 50 μ 1を平底の 96穴組織培養用プレート（ブラ ック）の各ゥヱルに加えた。その 150 μ ΐ/ゥヱル中の抗体濃度の設定は、 0.1 z g/ml、 1 μ g/ml、 10 μ g/mlとした。補体介在性細胞溶解を促進するために 37°C、 5% COの条
2 件で 2時間インキュベートした。 50 μ 1の Alamer blue (未希釈， Accumed International の処方、 Biosource、 Cat. DAL 1100 )を添加し、さらに同条件でー晚反応させた。プレ ートを室温下 10分置いて冷却させたあと、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、 530nm励起， 590nm測定で蛍光を読み取り、結果は蛍光強度（RFU)で表示された。 C DC活性の割合は次の式で計算された。
%CDC activity = 100 X {RFU (抗体無添加） - RFU (抗体添加)）/ {RFU (抗体無添 カロ） - RFU (Triton X—100添加） }
[0048] 結果を図 7に示す。 C1K1712以外は陽性コントロールである C2B2とほぼ同等または それ以上の CDC活性を示した。
[0049] ヒト化抗体の作製
マウス由来抗 CD20モノクローナル抗体 1K1791の可変領域 CDRをもとにヒト化のデ ザインを行った。アミノ酸配列から構造解析を行い更にデザイン手法を変えることによ り、 H鎖及び L鎖それぞれ 4種類のヒト化配列が作製された（Padlan EA, Mol Immunol Vol 28, No 4/5, 489- 498 ; Wu TT and Kabat EA, Mol Immunol Vol 29, No 9, 1141-1 146 ; Padlan EA et al.， FASEB J Vol 9， 133-139)。 H鎖と L鎖各 4種類の全ての組み 合わせで抗体が作製された。これらのアミノ酸配列を配列番号 19及び 23、配列番号 19及び 24、配列番号 19及び 25、配列番号 19及び 26、配列番号 20及び 23、配列 番号 20及び 24、配列番号 20及び 25、配列番号 20及び 26、配列番号 21及び 23、 配列番号 21及び 24、配列番号 21及び 25、配列番号 21及び 26、配列番号 22及び 23、配列番号 22及び 24、配列番号 22及び 25、配列番号 22及び 26に示す（図 8A 及び図 8B)。
[0050] これら H鎖可変領域 4種類と L鎖可変領域 4種類のアミノ酸配列は、ヒト遺伝子配列 において最も使用頻度の高い DNA (塩基)配列に置換され、さらにこの塩基のレ、くつ かは宿主の CHO細胞への適性を考慮して元のアミノ酸を変えることなく変更された（ Kim CH et al. Gene 1997; 15; 199 (1-2): 293-301)。具体的にアミノ酸配列に対応 する塩基配列として、それぞれ配列番号 19に対応して配列番号 27、酸配列番号 20 に対応して配列番号 28、配列番号 21に対応して配列番号 29、配列番号 22に対応 して配列番号 30、配列番号 23に対応して配列番号 31、配列番号 24に対応して配 列番号 32、配列番号 25に対応して配列番号 33、配列番号 26に対応して配列番号 34を用いた（図 8A及び図 8B)。なお、この塩基配列は、それに対応するアミノ酸配列 を変更しなレ、かぎり他の塩基を用いて置換しても良レ、。
[0051] H鎖可変領域 (塩基配列番号 27〜30)及び L鎖可変領域 (塩基配列番号 31〜34 )の合計 8種類の塩基配列は合成された後（宝酒造株式会社）、マルチクローニング サイトをもつ哺乳動物細胞用発現ベクター pNOW-Abに組み込んだ。これらのヒトイ匕さ れた抗体遺伝子が組み込まれた該発現ベクターを CHO細胞にトランスフエタトし、そ れぞれクローンにつレ、て生産性の高レ、ものを選別した。
[0052] ヒト化抗体の生物学的特性試験 細胞増殖阻害試験
5 X 104個/ mlの Raji細胞懸濁液を 10%FCS添力 QRPMI1640培地で調製して 96ゥエルプ レートに 100 μ ΐ/ゥヱルずつ入れて培養した。 24時間後、抗体濃度が 0.5 z g/mlになる ように各抗体溶液を 50 μ 1/ゥエル添加して培養を継続した。抗体添加 72時間後に発 色色素 Cell Counting Kit_8(同仁化学 Cat. Νο·343- 07623， Lot. SG076)を 10 μ 1/ゥヱ ノレ加え、さらに 4時間培養した後で波長 492nmにおける吸光度を測定した。図 9に 1K 1791由来の 16種類のヒト化抗体のうちの 15種類（27クローン）と陽性コントロールであ る c2B8(rituximabの別称）の生細胞数測定値を、陰性コントロール（100%)に対する割 合として示す。細胞増殖阻害効果は陰性コントロールとの比較において減少した生 細胞数の割合により推定することが可能である力 本試験では全てのクローンにつレヽ て増殖阻害効果が観察された。
[0053] なお、本発明の明細書及び図表に記載されるモノクローナル抗体名と配列番号は 次のように参照できる。
[0054] [表 3] 表 3
Figure imgf000019_0001
[0055] これらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、産生する抗体の名称によ り命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (あて名：郵 便番号 305-8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番地 1中央第 6)に 2006年 3月 28 日にブタペスト条約に基づく国際寄託がなされ、受託番号が次の通り付与されている 。 1K1422: FERM BP- 10587、 1K1791 : FERM BP- 10591、 1K1712: FERM BP- 10588 、 1K1402: FERM BP_10586、 1K1736: FERM BP_10589、 1K1782: FERM BP-10590 、 1K0924: FERM BP_10584、 1K1228: FERM BP_10585。
産業上の利用可能性
[0056] 本発明により治療薬として使用するのに適した生物学的活性を有するモノクローナ ル抗体が提供される。

Claims

請求の範囲
[I] エフェクター細胞非存在下でのヒト CD20抗原発現細胞培養において該ヒト CD20抗 原発現細胞に対してアポトーシスを含む増殖阻害活性を有するマウス由来抗 CD20 モノクローナル抗体。
[2] H鎖可変領域アミノ酸配列と L鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号 1及び 7 、配列番号 2及び 8、又は配列番号 15及び 17である請求項 1記載の抗 CD20モノクロ ーナノレ抗体。
[3] 請求項 1又は 2に記載の抗 CD20モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ。
[4] 請求項 2記載の抗 CD20モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロ ブリン定常域アミノ酸配列を融合させたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体。
[5] 請求項 2記載の抗 CD20モノクローナル抗体の可変領域 CDRのアミノ酸配列とヒトイム ノグロブリンのアミノ酸配列を用いてヒトイ匕された抗 CD20モノクローナル抗体。
[6] H鎖可変領域アミノ酸配列の L鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配 列番号 19及び 23、配列番号 19及び 24、配列番号 19及び 25、配列番号 19及び 26 、配列番号 20及び 23、配列番号 20及び 24、配列番号 20及び 25、配列番号 20及 び 26、配列番号 21及び 23、配列番号 21及び 24、配列番号 21及び 25、配列番号 21及び 26、配列番号 22及び 23、配列番号 22及び 24、配列番号 22及び 25、又は 配列番号 22及び 26である請求項 5のヒト化抗 CD20モノクローナル抗体。
[7] ヒト補体存在下で CD20抗原発現細胞に対して細胞障害性を有する請求項 4〜6の いずれ力 4項に記載の抗 CD20モノクローナル抗体。
[8] 請求項 4〜7のいずれ力 4項に記載の抗 CD20モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコ ードする塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞。
[9] CHO細胞である請求項 8記載の哺乳動物細胞。
[10] H鎖可変領域アミノ酸配列と L鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配 列番号 3及び 9、配列番号 4及び 10、配列番号 5及び 11、配列番号 6及び 12、又は 配列番号 16及び 18であるマウス由来抗 CD20モノクローナル抗体。
[II] 請求項 10記載の抗 CD20モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ。
[12] 請求項 10記載の抗 CD20モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロ ブリン定常域アミノ酸配列を融合させたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体。
請求項 10記載の抗 CD20モノクローナル抗体の可変領域 CDRのアミノ酸配列とヒトイ ムノグロブリンのアミノ酸配列を用いてヒトイ匕された抗 CD20モノクローナル抗体。 ヒト補体存在下で CD20抗原発現細胞に対して細胞障害性を有する請求項 12または 13記載の抗 CD20モノクローナル抗体。
請求項 12〜14のいずれ力 4項に記載の抗 CD20モノクローナル抗体のアミノ酸をコ ードする塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞。
CH〇細胞である請求項 15記載の哺乳動物細胞。
請求項 2、 4〜7、 10及び 12〜14のいずれ力、 1項に記載の抗 CD20モノクローナル抗 体を有効成分とする診断薬。
請求項 4〜7及び 12〜14のいずれ力 4項に記載の抗 CD20モノクローナル抗体を有 効成分とする治療薬。
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