WO2006106839A1 - インターフェロン－α及び／又はβ（ＩＦＮ－α／β）の発現誘導を促進する補助剤をスクリーニングする方法 - Google Patents

インターフェロン－α及び／又はβ（ＩＦＮ－α／β）の発現誘導を促進する補助剤をスクリーニングする方法 Download PDF

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adjuvant
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Tadatsugu Taniguchi
Kenya Honda
Yusuke Ohba
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Definitions

  • Interferon a method for screening for adjuvants that promote the induction of ex and Z or 0 (IFN- ⁇ / ⁇ ) expression
  • the present invention relates to a method for screening an adjuvant that promotes the induction of expression of interferon ⁇ and ⁇ or j8 (IFN a Z jS), and a novel adjuvant obtained by the screening method.
  • IFN a Z jS interferon ⁇ and ⁇ or j8
  • Toll-like receptor 9 (TLR9) is present! / ⁇ is the result of activation of Toll-like receptors 7, 8 (TLR7, TLR8), resulting in plasmacytoid dendritic cells (pDC) Type I interferon (IFN—a Z J8) is expressed at a high level (Non-patent Documents 1-6). This induction of expression is thought to depend on the MyD88—IRF7 signaling pathway; however, how and why this pathway is activated in pDC has not been elucidated. Furthermore, it has been elucidated why it is not active in other cells such as conventional DC (conventional DC (cDC)).
  • conventional DC conventional DC
  • the TLR7, 8, 9-dependent IFN— ⁇ / ⁇ induction pathway in pDC constitutes an important aspect in the CD8 + T cell response induced by DNA adjuvants. This induction is caused by activation of the transcription factor IRF-7, which interacts with ⁇ yD88 (Non-patent Documents 11 and 12). This finding raises an interesting and unexplained question as to why pDC produces large amounts of IFN, but not other cell types, such as normal DC (cDC), in response to the same TLR9 ligand. The answer is that a hypothesis has been proposed that pDC expresses higher levels of IRF-7 compared to other cells (Non-Patent Documents 6, 13, and 14). However, little experimental evidence is available to support this model.
  • cDC does not induce IFN-a Z J8 production when stimulated with either CpG-A or CpG-B.
  • CpG-A CpG-A
  • CpG-B CpG-B
  • Non-patent literature 1 Kadowaki, N. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll— like receptors and respond to different microbial antigens. J. Exp. Med. 194, 833— 839 (2001)
  • Non-patent literature 2 Lund, J., Sato, A., Akira, S., Medzhitov, R. an d IwasaKi, A. Toll— like receptor 9— mediated recognition of Herp es simplex virus ⁇ 2 by plasmacytoid dendritic cells. J. Exp. Med.
  • Non-Patent Document 3 Hemmi, H., Kaisho, T., Takeda, K. and Akira, S. The roles of Toll— like receptor 9, MyD88, and DNA— depend ent protein kinase catalytic subunit in the effects of two distinct CpG DNAs on dendritic cell subsets. J. Immunol. 170, 3059— 3064 (2003)
  • Non-Patent Document 4 Krug, A. et al. Herpes simplex virus type 1 activate s murine natural interferon producing cells through toll— like recept or 9. Blood 103, 1433— 1437 (2004)
  • Non-Patent Document 5 Krug, A. et al. TLR9—dependent recognition of MC MV by IPC and DC generates coordinated cytokine responses that activate antiviral NK cell function. Immunity 21, 107—119 (2 Non-Patent Document 6: Colonna, M., Trinchieri, G. and Liu, YJ Plasma cytoid dendritic cells in immunity. Nat. Immunol. 5, 1219—122 6 (2004)
  • Non-Patent Document 7 Verthelyi, D., Ishii, KJ, Gursel, M., Takeshita, F. and Klinman, DM Human peripheral Dlood cells differ en tially recognize and respond to two distinct CPG motifs. J. Imm unol. 166, 2372-2377 (2001)
  • Non-Patent Document 8 Krug, A. et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN— / ⁇ ⁇ ⁇ plasmacytoid de ndritic cells. Eur. J. Immunol. 31, 2154-2163 (2001)
  • Non-patent document 9 Krieg, AM CpG motifs in bacterial DNA and the immune immune effects. Annu. Rev. Immunol. 20, 709—760 (2002) Patent document 10: Verthelyi, D. and Zeuner, RA Differential signal by ng by CpG DNA in DCs and B cells: not just TLR9. Trends Im munol. 24, 519— 522 (2003)
  • Non-Patent Document 11 Honda, K. et al. Role of a transductional ⁇ transcrip tional processor complex involving MyD88 and IRF— 7 in Toll— lik e receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. US A 101, 15416-15421 (2004)
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  • Non-Patent Document 13 Izaguirre, A. et al. Comparative analysis of IRF and IFN— a ⁇ expression in human plasmacytoid and monocyte— derived dendritic cells. J. Leukoc. Biol. 74, 1125— 1138 (2003)
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  • Non-patent literature 16 Latz, E. et al. TLR9 signals after translocating fro m the ER to CpG DNA in the lysosome. Nat. Immunol. 5, 19 0-198 (2004)
  • Non-Patent Document 17 H. et al. CpG-DNA-specific activation of antigen ⁇ presenting cells requires stress kinase activity and is pr eceded by non-specific endocytosis and endosomal maturation.E MBO J. 17, 6230-6240 ( 1998)
  • Non-Patent Document 18 Heil, F. et al. Species ⁇ specific recognition of singl e ⁇ stranded RNA via toll— like receptor 7 and 8. Science 303, 1 526-1529 (2004)
  • Non-Patent Document 19 Hata, N. et al. Constitutive IFN— a Z jS signal for efficient IFN— / ⁇ gene induction by virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285, 518-525 (2001)
  • Non-Patent Document 20 Gruenberg, J. and Stenmark, H. The biogenesis of multivesicular endosomes. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 5, 317—323 (2004)
  • Non-patent document 21 Maxfield, FR and McGraw, TE Endocytic rec y cling. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 5, 121—132 (2004)
  • Non-patent document 22 Wagner, H., Heit, A., Schmitz, F. and Bauer,
  • Non-Patent Document 23 Asselin—Paturel, C., Brizard, G., Pin, JJ, Briere, F. and Trincnieri, G. Mouse strain differences in plasmacy toid dendritic cell frequency and function revealed by a novel mo noclonal antibody. J. Immunol. 171, 6466— 6477 (2003) 24: Sato, M. et al. Distinct and essential roles of trans cription factors IRF— 3 and IRF— 7 in response to viruses for IFN
  • Non-Patent Document 25 Honda, K. et al. Selective contribution of IFN- a
  • Non-Patent Document 26 Nagai, T. et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell— biological applicati ons. Nat. Biotechnol. 20, 87— 90 (2002)
  • Patent Document 27 Diebold, S. S. et al. Viral infection switches non—plasmacytoid dendritic cells into high interferon producers. Nature
  • Non-Patent Document 28 Matsuyama, T. et al. Targeted disruption of IRF— 1 or IRF— 2 results in abnormal type I IFN gene induction and ab errant lymphocyte development. Cell 75, 83— 97 (1993)
  • Non-patent document 29 Kinman, Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxyn ucleotides.Nature Reviews Immunology 4, 249-259 (2004)
  • Non-patent document 30 Nature Immunology, vol. 2, pp. 1144-1150, 2001
  • Non-Patent Document 32 Science, vol. 284, pp. 1835-1837, 1999
  • Non-Patent Document 33 Nature, vol. 408, pp. 740-745, 2000
  • Non-Patent Document 34 Genomics, vol. 45, pp. 332-339, 1997
  • Non-Patent Document 35 Mol. Cell. Biol., Vol. 17, pp. 5748-5757, 1997 Disclosure of the Invention
  • the present invention promotes expression induction of interferon ⁇ and Z or j8 (IFN—a ZJ8) Method for screening auxiliary agents to be used and means for solving the problems aimed at providing the auxiliary agents
  • the method of the present invention comprises:
  • step b-1) or b-2)! / transfer of nucleic acid adjuvant to endosomal vesicles or induction of IFN- ⁇ / ⁇ expression is confirmed.
  • the cells in the system that do not induce the expression of IFN- ⁇ / ⁇ in the absence of an auxiliary agent are preferably conventional rod-shaped cells (cDC), plasma cytoids. Selected from the group consisting of rod-shaped cells (pDC), RAW cells, macrophages, human peripheral blood-derived cells, and fibroblasts.
  • the nucleic acid adjuvant in a system that does not induce the expression of IFN- ⁇ / ⁇ in the absence of an adjuvant is preferably a nucleic acid that is recognized as non-self.
  • step b-1 In one embodiment of the present invention, in step b-1), Toll-like receptor 9 (TLR9), MyD 88, interferon regulatory factor 7 (IRF-7) or dextran and a nucleic acid adjuvant are colocalized in cells. May be confirmed that the nucleic acid adjuvant has migrated to the endosomal vesicles.
  • step b-2 expression of IFN- ⁇ / ⁇ is induced by the amount of IFN- ⁇ / ⁇ mRNA in the cell or IFN-a Z in the cell culture supernatant. It may be confirmed by measuring the protein concentration of j8.
  • the present invention also provides an interferon gene obtained by the screening method of the present invention. And an auxiliary agent that promotes induction of expression of Z or ⁇ (IFN— ⁇ / ⁇ ).
  • CpG-A was also rapidly transported to lysosomal vesicles in cDC and RAW264.7 macrophages (Examples 1 and 2).
  • the elaborate spatiotemporal intracellular transport control of such nucleic acid adjuvants may induce different responses to various pathogen-associated nucleic acids, depending on the cell or nucleic acid type.
  • CpG-A is complexed with an auxiliary agent, specifically 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propane (DOTAP), a kind of cationic lipid, Even in cDC, it was confirmed that CpG-A stays in the endonome for a long time and a large amount of IFN is produced.
  • auxiliary agent specifically 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propane (DOTAP), a kind of cationic lipid
  • the present invention has the same function as DOTAP, using a cell and nucleic acid adjuvant system that does not induce IFN- ⁇ / ⁇ expression in the absence of the above-mentioned adjuvant.
  • An auxiliary agent i.e., an auxiliary agent that regulates intracellular transport of a nucleic acid adjuvant containing CpG-A and CpG-B and promotes induction of expression of interferon ⁇ and / or ⁇ (IFN- ⁇ / ⁇ ).
  • IFN- ⁇ / ⁇ interferon ⁇ and / or ⁇
  • Interferon a method of screening an auxiliary agent that promotes the induction of expression of ⁇ and ⁇ or ⁇ (IFN- ⁇ / ⁇ )
  • the present invention provides a method for screening an auxiliary agent that promotes expression induction of interferon ⁇ and ⁇ or j8 (IFN-aZjS).
  • IFN-aZjS interferon ⁇ and ⁇ or j8
  • step b-1) or b-2)! / transfer of nucleic acid adjuvant to endosomal vesicles or induction of expression of IFN- ⁇ / ⁇ is confirmed as an effective aid.
  • the present invention is based on the discovery of the importance of spatiotemporal control of nucleic acid adjuvants, by using a cell-nucleic acid adjuvant system that does not induce IFN aZjS expression in the absence of adjuvants.
  • the present invention provides a method for screening for an auxiliary agent that regulates intracellular transport of cells and promotes induction of expression of interferon ⁇ and Z or ⁇ (IFN- ⁇ / ⁇ ).
  • the cell that can be used in the screening method of the present invention may be a cell that does not induce IFN aZjS expression in the absence of an auxiliary agent in a combination system with a nucleic acid adjuvant.
  • the type and origin of the cell are not particularly limited, and known cultured cells and animals In vivo cells and the like can be used.
  • cultured cells are used.
  • the cultured cells are incubated with a complex of a nucleic acid adjuvant and an adjuvant candidate compound, and the IFN production response of cellular force is observed.
  • the same cell may or may not induce IFN-aZjS expression in the absence of an adjuvant.
  • the “cell-nucleic acid adjuvant system” refers to the screening method of the present invention in any combination of cells and nucleic acid adjuvants that do not induce IFN- ⁇ / ⁇ expression in the absence of an adjuvant. It means that it can be used.
  • pDC plasmacytoid rod cells
  • the ability to induce the expression of IFN—a Z jS by CpG—A even in the absence of adjuvant, depending on CpG—B the expression of IFN—a Z jS Not induced.
  • the pDC and CpG-B system can be used in the method of the present invention.
  • the cDC and CpG-A system can be used in the method of the present invention.
  • the cells that can be used in the method of the present invention are not particularly limited, and any cells can be used as long as the condition that “the expression of IFN-a /
  • the cells of the present invention are preferably conventional rod cells (cDC), plasmacytoid rod cells (pDC), RAW cells (eg, RAW264. 7 cells), macrophages, human peripheral blood-derived cells, and fibroblasts Selected from the group consisting of These cells are known, for example, the methods described in the Examples herein, or Nature Immunology, vol.
  • the nucleic acid adjuvant that can be used in the screening method of the present invention does not induce the expression of IFN a Z jS in the cells in the absence of an auxiliary agent in the combination system with cells, but in the presence of an auxiliary agent.
  • Any nucleic acid capable of inducing expression may be used.
  • CpG—A when used in conventional rodent cells (cDC), does not induce IFN—a Z jS expression in the absence of adjuvant, but supplement (1, 2-dioleoyluro).
  • DOTAP xy-3-trimethylammonium propane
  • Plasmacytoid rod cells when combined with CpG-B, do not induce IFN-a Z jS expression in the absence of adjuvant, but for the first time in the presence of adjuvant. It was found to induce.
  • the pDC and CpG-B system can also be used in the method of the present invention.
  • nucleic acid is recognized as non-self by the cell.
  • nucleic acid recognized as non-self more specifically means a synthetic DNA, synthetic RNA, or nucleic acid derived from the genome of an organism lower than a mammal that can be recognized as non-self in a mammalian cell. .
  • Nucleic acid adjuvants that can be used in the method of the present invention include, for example, non-methyl CpG oligonucleotide (CpG ODN), single-stranded (ss) RNA, and nucleic acid extracts from inactive viruses or bacteria. Etc. Preferably, it is non-methyl CpG oligonucleotide (CpG ODN) or single-stranded (ss) RNA, more preferably CpG ODN.
  • CpG ODN non-methyl CpG oligonucleotide
  • ss single-stranded
  • Nucleic acid adjuvants can be easily prepared using, for example, the methods described in the examples of the present specification or known nucleic acid synthesis methods.
  • a non-methyl CpG oligodeoxynucleotide is an oligodeoxynucleotide having a single or multiple non-methyl CpG motif in a nucleic acid molecule (5 'end or 3, not at the end). It is an oxynucleotide.
  • CpG ODN that can be used in the method of the present invention does not induce the expression of IFN-a / ⁇ in the cells in the absence of the adjuvant in the combination with the cells to be used, but induces the expression in the presence of the adjuvant. It is desirable to have the property of being able to.
  • Cp G ODN that can be used retains the above properties in combination with any cell as long as it retains the above properties in combination with the cells to be used. That means you don't have to. Therefore, the CpG ODN that can be used may have an activity of promoting the induction of IFN a Z jS expression even in the absence of an auxiliary agent in combination with another cell.
  • CpG-A described below induces the expression of IFN a Z jS in the absence of an adjuvant when combined with pDC, but for the first time in the presence of an adjuvant when combined with cDC, IFN a Z jS Induces the expression of Therefore, CpG-A can be suitably used in the method of the present invention in combination with cDC or the like.
  • the CpG ODN that can be used in the method of the present invention is preferably a dioxynucleotide having 18 to 25 bases, more preferably 20 to 22, and preferably a phosphodiester Z phosphorothioate. It has an ate mixed skeleton or a phosphorothioate skeleton. Examples of CpG ODN that can be used in the method of the present invention are described in documents such as Non-Patent Documents 7, 29, 3, 8, 9, 10, 15 and the like.
  • CpG ODN unmethylated CpG oligodeoxynucleotides
  • CpG-A referred to as “D-type oligodeoxynucleotides” described in Non-Patent Document 29 and the like.
  • CpG-B sometimes called "K-type oligodeoxynucleotide"
  • CpG-C has the following base sequence.
  • CpG-B anti-mouse CpG-B and anti-human CpG-B are known.
  • mouse CpG-B is used when mouse cells are used
  • human CpG-B is used when human cells are used.
  • Structural features of CpG-A are as follows. In particular, i) does not induce the expression of IFN-a Z jS in cells in the absence of supplements, but can induce expression in the presence of supplements in the combination system with cells. Is important for the nature of This feature induces the expression of IFN-aZj8 in plasma cytoid rod cells (pDC) and the like in the absence of adjuvant.
  • Bases 3-15 of SEQ ID NO: 1 have a phosphodiester Z phosphorothioate mixed skeleton in which phosphodiester bonds and other bases are phosphoroate bonds.
  • Structural features of CpG-B are as follows. In particular, i) does not induce the expression of IFN-a Z jS in cells in the absence of supplements, but can induce expression in the presence of supplements in the combination system with cells. Is important for the nature of This feature can trigger B cell proliferation and IgM and IL-6 production.
  • CpG—C The characteristics of CpG—C are as follows.
  • i) does not induce the expression of IFN-a Z jS in the cells in the absence of an auxiliary agent, but can induce the expression in the presence of an auxiliary agent in the system of combination with cells. It is important for the nature. This feature Force Induces the expression of IFN-a ⁇ 8 in the absence of adjuvants in plasmacytoid rod cells (pDC) and the like.
  • Bases 2-17 of SEQ ID NO: 4 have palindrome 8 8 8 & 8 && 8 & 8 (palindrome 1) and bases 11-19 have another palindrome aacgacgtt (palindrome 2) .
  • Palindrome 1 contains two unmethylated CpG motifs, bases 9 10 and 16-17.
  • Node 2 contains the unmethylated CpG motif of bases 16-17.
  • single-stranded RNA can also promote the induction of IFN a Z jS expression in certain cells, like CpG-A.
  • ssRNA single-stranded RNA
  • human peripheral blood mononuclear cells do not produce IFN- ⁇ when stimulated with ssRNA, polyuridylic acid alone, but produce high levels of IFN- ⁇ when stimulated with a complex of polyuridylic acid and DOTAP.
  • Non-Patent Document 11 has been reported (Non-Patent Document 11). Therefore, such ssRNA can also be used in the method of the present invention.
  • the sequence of ssRNA is not particularly limited, but preferably includes a single base repetitive sequence such as polyuridic acid.
  • the length of the ssRNA sequence is not particularly limited.
  • the nucleic acid adjuvant of the present invention may be a nucleic acid extract from an inactive virus or bacterium.
  • the inactivated virus is, for example, a virus such as a simple herpes virus, influenza virus, cytomegalovirus, or vesicular stomatitis virus that has been inactivated by treatment with ultraviolet rays or heat treatment.
  • Bacteria include, for example, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis and the like. Extraction of nucleic acid of inactive virus or bacterial power is well known, J. Exp. Med. Vol. 198, pp. 513-520, 2003 JNC I vil. 72, pp. 955-962, 198 4 etc. Can be used.
  • step a in the cell and nucleic acid adjuvant system, the expression of IFN a Z jS is not induced in the absence of the auxiliary agent.
  • Cells are incubated with or without a nucleic acid adjuvant and an adjuvant candidate compound.
  • the “adjunct candidate candidate” is not limited, but for example, it is possible to select a substance force that may form a complex with a nucleic acid adjuvant. Since the nucleic acid constituting the nucleic acid adjuvant is negatively charged, the cationic substance is more likely to form a complex with the nucleic acid.
  • Various cationic lipids are commercially available, and such known cationic lipids can be used for the screening method of the present invention as a candidate compound for adjuvant.
  • the candidate compound as a whole need not have an affinity for a nucleic acid as long as it has an affinity at a part of the candidate compound and can form a complex. Therefore, compounds that partially have a cationic charge and can form a complex with a nucleic acid can be selected as candidate compounds.
  • the complex formation with the nucleic acid is not limited to electrical affinity, and may be affinity due to antigen-antibody reaction, covalent bond, or other interaction. Therefore, anti-nucleic acid antibodies and the like can also be selected as adjuvant candidate compounds.
  • the adjuvant candidate compound may be pre-complexed with the nucleic acid adjuvant and administered to the cell, or may be administered to the cell simultaneously.
  • the adjunct candidate compound nucleic acid adjuvant is used in a molar ratio, preferably 1: 1.
  • concentration of the nucleic acid adjuvant and auxiliary candidate compound can be appropriately applied by those skilled in the art depending on the conditions such as the type of cell and incubation time. Incubation conditions (temperature and time) can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of cells used, the type of adjuvant candidate compounds, and the like. For example, although not limited, incubation may be performed at room temperature for about 10-15 minutes. Then, b-l) confirms that the presence of the adjuvant candidate compound has transferred the nucleic acid adjuvant into the endosome vesicles.
  • step b-l confirmation that the nucleic acid adjuvant has moved into the endosomal vesicle is confirmed, for example, by confirming that the position of the nucleic acid adjuvant and the position of the endosomal vesicle match within the cell using a known method. This can be done by observing.
  • a nucleic acid adjuvant is first labeled with any fluorescent molecule, radioactive substance, luminescent substance, etc.
  • fluorescent molecules include nucleic acids such as cyanine dyes such as cyanine 5 (Cy5), fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein, 6-carboxyfluorescein, tetramethyl-6-carboxyrhodamine and derivatives thereof.
  • Cy5 labeled CpG—ODNs were purchased from Sigma Genosis and used.
  • FITC-labeled CpG-ODNs were purchased from Hokkaido System Science and used.
  • the nucleic acid adjuvant (position) of the present invention can be detected. Since each substance has a different fluorescent color, it can be used for multiple staining. Nucleic acids can be detected using confocal microscopy (eg, Olympus FV-1000 confocal microscope), fluorescence microscopy (eg, Olympus IX-71 inverted microscope, etc.).
  • confocal microscopy eg, Olympus FV-1000 confocal microscope
  • fluorescence microscopy eg, Olympus IX-71 inverted microscope, etc.
  • the radioactive substance a known substance capable of labeling a nucleic acid such as 35 S, 32 P, or 3 H can be used. Detection of the radioactive substance can be performed using a known method. Alternatively, the labeling of the nucleic acid adjuvant may be performed by modifying the nucleobase with piotin or avidin and using a known piotin-avidin bond.
  • the luminescent substance a known luminescent substance capable of labeling a nucleic acid can be used. Detection of the luminescent substance can be performed using a known method.
  • the position of the endosomal vesicle can be confirmed, for example, using labeled dextran, transferrin, or the like that can visualize the endosomal vesicle.
  • labeled dextran for example, FITC or Alexa Fluor647-labeled dextran (Molecular Probes) can be used.
  • an identification method by attaching a tag such as a fluorescent protein, for example, a GFP derivative, to a protein localized in the endonom, or an identification method by an immunohistochemical method using a specific antibody can be used.
  • the nucleic acid adjuvant is a complex of Toll-like receptor 9 (TLR9), MyD 88, and interferon regulatory factor 7 (IRF-7) (TLR9-MyD88-IRF7 complex).
  • TLR9—MyD88—IRF7 complex is stably present in the endonome, interferon and Z or j8 ( IFN—a Z jS) I found it important as a force.
  • MyD88 and IRF7 are proteins localized in the endonome that are always detected in the endonome even in the absence of a nucleic acid adjuvant.
  • “dextran” is a sticky dulcan mainly composed of al ⁇ 6 bonds, and is known to localize to endonomes in cells. The inventors have found that when a nucleic acid adjuvant moves intracellularly into an endonome in the presence of a suitable adjuvant, it colocalizes with dextran.
  • the intracellular movement of the nucleic acid adjuvant into the endosomal vesicle is any of TLR9, MyD88 or IRF-7 (TLR9-MyD88-IRF7 complex). Body or its constituents), or the intracellular co-localization of dextran and nucleic acid adjuvant is confirmed that the nucleic acid adjuvant has migrated to the endosomal vesicles.
  • TLR9-MyD88-IRF7 complex or a component thereof can be examined, for example, using a known genetic engineering technique.
  • a transformation vector containing a fusion gene of any gene of TLR9, MyD88 or IRF-7 and a gene encoding a fluorescent protein is used to transform a cell used in the screening method of the present invention as a host cell.
  • Fluorescently labeled TLR9, MyD88 or IRF-7 protein is expressed in the transformed cells.
  • the genes of TLR9, MyD88 and IRF-7 are all known, for example, literature Nature, vol. 408, pp. 740-745, 2000; Genomics, vol. 45, pp. 332-339, 1997; Mol Cell. Biol., Vol. 17, pp. 5748—5757, 1997 [each listed!
  • a TLR9, 1 ⁇ 088 or 1! ⁇ ⁇ 7 protein is expressed as a complex protein with a fluorescent protein
  • fluorescence is measured in cells, embryos, organs, tissues or non-human individuals into which the vector has been introduced. Can be detected.
  • the fluorescent protein green fluorescent protein (GFP) or a mutant thereof is preferably used.
  • GFP is a general term for green fluorescent proteins possessed by luminescent jellyfish. The jellyfish GFP is excited by visible light at about 395 nm and 470 nm and emits green fluorescence at about 509 nm. This fluorescence requires no special factors other than oxygen.
  • GFP enhanced green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • CFP CFP
  • RFP red fluorescent proteins
  • the position of TLR9, MyD88 or IRF-7 (TLR9-MyD88-IRF7 complex or a component thereof) in the cell can be determined using an antibody that reacts with TLR9, MyD88 or IRF-7 protein. It may be detected. Antibodies that react with TLR9, MyD88 or IRF-7 protein can be prepared using known methods and used for detection.
  • nucleic acid adjuvant is present in the lysosomal vesicle in the absence of the adjuvant candidate compound, but the nucleic acid adjuvant is present in the endosomal vesicle due to the presence of the adjuvant candidate compound.
  • Migration to the endosomal vesicle can be performed by the method described above.
  • the position of the lysosomal vesicle can be confirmed by using a substance capable of visualizing the lysosomal vesicle, for example, a labeling substance such as LysoTracker Blue (Molecular Probes).
  • a labeling substance such as LysoTracker Blue (Molecular Probes).
  • an identification method by tagging a protein localized in a lysosomal vesicle with a fluorescent protein, for example, a GFP derivative, or an identification method by an immunohistochemical method using a specific antibody can be used.
  • step b-1 it may be confirmed that the expression of IFN-j8 is induced in step b-2).
  • the expression of IFN—a Z jS This is thought to be due to the intracellular movement. That is, in step b-2), the effect of inducing the expression of IFN- ⁇ / ⁇ by the adjuvant candidate compound is directly observed. Induction of IFN- ⁇ Z j8 expression should be confirmed, for example, by measuring the amount of IFN-a Z jS mRNA in the cell or the concentration of IF ⁇ - ⁇ / ⁇ protein in the cell culture supernatant. Can do.
  • the expression level of IFN- ⁇ / ⁇ mRNA can be determined using known quantitative PCR such as quantitative real-time RT-PCR.
  • quantitative real-time RT-PCR Preparation of RNA of cellular force, etc. that does not induce the expression of IFN-a Z jS in the absence of an auxiliary agent, and real-time quantitative RT-PCR can be performed, for example, according to the method described in Non-Patent Document 24. it can.
  • Real-time quantitative RT-PCR can be performed using, for example, an apparatus such as LightCycler and SYBR Green system (Roche).
  • the expression level of IFN-aZ jS mRNA is based on the level of standard mRNA expression such as j8-actin and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). By standardization, the relative amount can be obtained. In the examples described later in this specification, the expression level of mRNA of j8-actin was set to 1, and the expression level of mRNA of IFN- ⁇ / ⁇ was shown as the relative amount. Primers for IFN-a1, IFN- ⁇ , ⁇ -actin, and IRF-7 can be appropriately selected from known nucleotide sequences of these genes. For example, those described in Non-Patent Document 25 can be used. When the expression level of IFN—a Z jS mRNA is significantly increased due to the presence of an adjuvant candidate compound, preferably when it is increased by 10 times or more, the candidate compound is judged to be effective as an adjuvant. To do.
  • GPDH glyceraldehyde
  • the expression level of IFN-aZ jS protein may be measured.
  • the expression level of IFN-a Z jS protein can be determined using a known method for protein quantification.
  • the production concentration of IFN-a Z jS protein can be measured using a known immunochemical method such as ELISA using an antibody that reacts with IFN- ⁇ or ⁇ protein, or intracellular staining.
  • Antibodies that react with IFN- ⁇ or ⁇ protein are described in, for example, non-patent documents 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 11, 12, and the like. Or you may produce using a well-known method.
  • the candidate compound When the expression level of the protein of IFN— ⁇ 8 ⁇ is significantly increased due to the presence of the adjuvant candidate compound, the candidate compound is judged to be effective as an adjuvant.
  • cells were seeded in 96 well plates at a concentration of 2 x 10 5 cells Zml and stimulated with various reagents for 24 hours.
  • 8 protein concentration in the supernatant was measured by ELISA.
  • ELISA kits for mouse IFN- ⁇ and IL-12 ⁇ 40 were purchased from PBL Biomedical Laboratories and TECHNE Corp., respectively.
  • the screening method of the present invention was performed using cDC cells under the above conditions, the expression level of IFN- ⁇ protein was significantly increased due to the presence of the adjuvant candidate compound. In some cases, it is judged that the candidate compound is effective as an adjuvant.
  • Interferon prosthesis that promotes the induction of ⁇ and ⁇ or ⁇ (IFN- ⁇ / ⁇ ) expression
  • the present invention also provides an auxiliary agent that promotes the induction of expression of interferon-a and Z or ⁇ (IFN- ⁇ / ⁇ ) obtained by the screening method of the present invention.
  • the adjuvant of the present invention can promote the induction of IFN-aZ jS expression by using it together with the nucleic acid adjuvant even in cells where the expression of IFN-aZ jS is not induced by the nucleic acid adjuvant alone.
  • IFN a Z jS is a useful substance used as a therapeutic agent for viral infections or cancer.
  • the adjuvant of the present invention is not only a research reagent for inducing the expression of IFN a Z jS in cells in which the expression of I FN a Z jS expression is not usually observed only with a nucleic acid adjuvant. May be used as a medicine for the treatment of viral infections or cancer.
  • the adjuvant of the present invention can promote the induction of IFN ⁇ Z
  • the auxiliary agent that promotes the induction of expression of interferon a and Z or ⁇ is produced when mixed with a nucleic acid adjuvant.
  • the adjuvant of the present invention is basically used together with a nucleic acid adjuvant, but may be used alone in some cases.
  • the adjuvant of the present invention can be used alone. Therefore, the adjuvant of the present invention can be used together with a nucleic acid adjuvant or alone as a therapeutic agent for viral infection or cancer, or as an immune promoter.
  • the adjuvant of the present invention is not limited, but is preferably selected from the group consisting of positively charged polymers (such as cationic lipids and cationic peptides) and anti-nucleic acid antibodies. More preferably, 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propane (DOTAP), 1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxy-spermyl) -proviramide (DOSPER) ), Polyethyleneimine (PEI) and anti-DNA antibodies.
  • DOTAP 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propane
  • DOSPER 1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxy-spermyl) -proviramide
  • PEI Polyethyleneimine
  • Figures la and b are confocal of Fp3L-cultured bone marrow-derived pDC (120G8 + cells) incubated with CpG—A ey5 (a, red) or CpG—B ey5 (b, red) for 90 minutes. And differential interference contrast (DIC) images.
  • CpG—A ey5 a, red
  • CpG—B ey5 b, red
  • DIC differential interference contrast
  • FIG. 2 is incubated with both the CpG-A Fite and CpG- B ey5 the pDC, then shows the results of incubation and LysoTracker.
  • Figure 3 shows that bone marrow-derived cDCs (120G8—cells) were incubated with CpG—A Cy5 or CpG—B Cy5 (red) and incubated with LysoTracker (green) as in the case of pDC in FIG. Results are shown.
  • Fig. 4 shows the results of incubation of pDC (upper panel) and cDC (lower panel) into which IRF-7 YFP (green) was transfected by lentivirus with 3 M CpG- Aey5 for 90 minutes. .
  • FIG. 5 shows the results of examining the expression of YFP in bone marrow cells transfected with a lentivirus encoding IRF-7 YFP and the colocalization with CpG-A or CpG-B. Show.
  • FIG. 6 shows the isolation of pDC cells from bone marrow cells and the induction of I RF-7 mRNA and IFN-mRNA by CpG stimulation in pDC.
  • Fig. 7 shows that MyD88 CFP (red) and IRF-7 YFP (green; upper panel) or IRF-3 (green; lower panel) were generated by transfection with lentivirus in RAW264. 7 cells. The results are shown and analyzed by a fluorescence microscope.
  • Figure 8 collects CFP, YFP and FRET images of RAW264. 7 cells prepared as in Figure 7, and calculates FRET efficiency ("corrected" FRET [FRET C ]) (corrected FRET) The results are shown. Average FRET e ZCFP values for 20 cells are shown with standard deviation.
  • Figure 9 shows that RAW264. 7 cells expressing MyD88 eFP (blue) and IRF- 7 YFP (green) were incubated with Alexa Fluor647-labeled dextran (red) for 10 minutes. It is the result analyzed by the confocal microscope. The high-magnification image of the part indicated by the white box is shown in the lower right panel. White arrows indicate the colocalization of dextra exa647 , MyD88 CFP and IRF- 7 YFP .
  • Figure 10 shows the results of incubating RAW264. 7 cells expressing MyD88 eFP (blue) and IRF-7 YFP (green) for 90 minutes with: M LysoTracker (red) and analyzed by confocal microscopy. Show.
  • FIG. 11 shows the result of fixing RAW264.7 cells expressing MyD88 eFP and IRF- 7 YFP with paraformaldehyde, staining with anti-transferrin receptor (TfR) antibody, and analyzing by confocal microscopy. Indicates. White arrows indicate the colocalization of IRF-7 (green), MyD88 (blue), and TfR (red).
  • FIG. 12 shows a confocal image of RAW264. 7 cells incubated with LysoTracker (green) and CpG— Aey5 (red) for 90 minutes.
  • FIG. 13 shows that RAW264.7 cells are complexed with 1 M LysoTracker (green) and 1 ⁇ MC pG—A Cy5 , l, u M CpG—B Cy5 , or DOTAP.
  • FIG. 14 shows the result of incubating RAW264. 7 cells expressing MyD88 eFP (blue) and IRF-7 YFP (green) with CpG— Aey5 (red) for 90 minutes and analyzing by confocal microscopy. Indicates.
  • FIG. 15 shows the fluorescence of cDC derived from bone marrow cells, incubated with CpG—A Cy5 ZDOTAP (red) and LysoTracker (blue) for 80 minutes, washed, and incubated with dextran FITe (green) for 10 minutes.
  • a DIC image is shown.
  • FIG. 16 shows representative fluorescence and DIC images when cDC expressing IRF-7 YFP (green) was incubated with CpG— Aey5 ZDOTAP (red) for 90 minutes.
  • N represents a nucleus. The percentage of cells with nuclear translocation of IRF 7 was measured and the average of three independent experiments was shown with standard deviation (lower right panel).
  • FIG. 17 shows the expression concentration (pgZml) of IFN- ⁇ protein in cDC or pDC stimulated with CpG-A.
  • FIG. 18 shows relative expression levels of IRF-7 mRNA and IFN-a mRNA in cDC stimulated with pG-AZDOTAP.
  • Fig. 19 shows typical results when RAW264. 7 cells expressing MyD88 eFP (blue) / and IRF-7 YFP (green) were incubated with CpG— Aey5 ZDOTAP (red) for 90 minutes. The results of analysis of a simple cell using a confocal microscope are shown.
  • Figure 20 shows the results of quantitative real-time RT-PCR analysis of total RNA prepared from RAW264. 7 cells 12 hours after incubation with 3 M CpG-A or 3 M CpG / DOTAP. Indicates. The vertical axis shows the relative expression of mRNA of the left graph forces IFN- ⁇ , IFN- ⁇ and IRF-7, respectively.
  • Fig.21 shows the same 0-0-8 00-8? Shows the results of intracellular IFN ⁇ staining of 1 ⁇ 264.7 cells stimulated with.
  • FIG. 22 shows the results of purification of wild-type bone marrow-derived CDl lb + B220-cells by FACS, stimulation with C pG-A or CpG-AZDOTAP, and measurement of IFN- ⁇ levels by ELISA.
  • FIG. 23 shows the dose dependency of the expression level (pg / ml) of IFN- ⁇ protein in cDC or pDC cells stimulated with CpG- ⁇ complexed with DOTAP.
  • FIG. 24 shows the results of examining the concentration-dependent behavior of CpG-B transport in pDC. Bone marrow-derived pDCs were stimulated with 1 M (upper panel) or 3 M (lower panel) CpG—Bey5 complexed with DOTAP. It was then incubated with dextran FITC or LysoTracker to visualize endosomes or lysosomes. Representative cells are shown with confocal and DIC images analyzed by confocal microscopy.
  • Synthetic oligonucleotides were purchased from Hokkaido System Science (Sapporo, Japan).
  • Control GpC ODN Control D, Non-Patent Document 7
  • Uppercase letters and lowercase letters each represent a base with a phosphodiester-modified skeleton and a phosphorothioate-modified skeleton.
  • Cy5-labeled CpG—ODNs were purchased from Sigma Genosis.
  • FITC-labeled CpG—ODNs were imported from Hokkaido System Science republic.
  • a complex of CpG—A and DOTAP was prepared according to the manufacturer's recommendations. Typically, 5 ⁇ g CpG ODNs were mixed with 30 ⁇ l DOT AP in 120 ⁇ l PBS.
  • FITC and Alexa Fluor647—labeled dextran and LysoTracker B1ue were purchased from Molecular Probes and used at final concentrations of 100 ⁇ g Zml and 1 ⁇ M, respectively.
  • Black mouth quinn, paphiromycin and cycloheximide were purchased from Sigma and used at final concentrations of 5 g / ml, 30 nM and 100 ⁇ g Zml, respectively.
  • Bone marrow cells were cultured with lOOngZml human Flt3L (PeproTech) for 6 days in RP MI1640 supplemented with 10% FBS. The collected cells were incubated with pDC-specific rat monoclonal antibody (120G8; Non-patent Document 23; provided by G. Trinchirei) and anti-Rh Hg G microbeads (Miltenyi Biotec). Was used to separate pDC (positively selected cell group) and cDC (passed cell group).
  • pDC-specific rat monoclonal antibody 120G8; Non-patent Document 23; provided by G. Trinchirei
  • anti-Rh Hg G microbeads Miltenyi Biotec
  • the recovered cells were cultured with anti-B220 and anti-CDl lc antibodies (BD Bioscience), and B220—ZCDl lc + cDC and BSSO + ZCDl lc ⁇ pDC were used with FACS Diva (BD Bioscience). Sorted.
  • ELISA ELISA kits for mouse IFN-spleen and IL-12p40 were purchased from PBL Biomedical Laboratories and TE CHNE Corp., respectively.
  • RNA analysis total RNA was prepared as previously described (Non-patent Document 24), and quantitative real-time RT-PCR analysis was performed using LightCycler and SYBR Green system (Roche). . Data were normalized by the level of j8-actin expression in each individual sample.
  • the lentiviral vector was introduced into 293T cells along with pMDLgZpRRE (package plasmid) and pCMV—VSV—G—RS V-Rev (Rev and VS V—G expression plasmids).
  • RAW264. 7 cells American Type Culture Collection (ATCC) -TIB71
  • bone marrow cells were cultured with lentivirus for 24 hours and 72 hours, respectively.
  • the transduced bone marrow cells were then differentiated to DC by further culturing in the presence of human Flt3L for 3 days.
  • SuperFect Transfection Reagent QIAGEN
  • pCAGGS—YFP—IRF—3, pCAGGS—YFP—IRF—7, or pCAGGS—CFP—MyD88 Non-Patent Document 11
  • Example 1 COG A and COG B) in ODC and cDC derived from bone marrow fine cells We first examined by Cyfoscopy, pDC and cDC obtained by culturing bone marrow cells. Intracellular trafficking of 5—labeled CpG—A (CpG— Aey5 ) and Cy -5—labeled CpG-B (CpG-B Cy5 ) was investigated. D19 (Non-patent document 7) and ODN1668 (Non-patent document 15) were selected as representatives of CpG-A and CpG-B, respectively. The results are shown in Figure 16.
  • Figures la and b show the confocal of Fp3L-cultured bone marrow-derived pDC (120G8 + cells) incubated for 90 minutes with CpG—A ey5 (m, red) or CpG—B ey5 (m, b) And the image of fine interference contrast (DIC) is shown.
  • Cells were incubated with dextran FITC or LysoTracker (green) for the last 10 minutes to visualize endosomes or lysosomes. Representative cells are shown in Figures la and b and the following Figures 2-4.
  • red indicates the position of CpG-A Cy5 (FIG. 1a) or CpG-B Cy5 (FIG.
  • CpG ODN CpG-A or CpG-B
  • dextran encodedonome marker
  • LysoTracker Lysonome marker
  • FIG. 2 is incubated with both the CpG-A Fite and CpG- B ey5 the pDC, then shows the results of incubation at Ly soTracker.
  • the positions of CpG—A FITC , CpG Bey5 and LysoTracker are indicated in red, blue and green, respectively.
  • Fig. 3 shows the result of incubation of bone marrow-derived cDC (120G8-cell) with CpG- Aey5 or CpG-B Cy5 (red) and LysoTracker (green) as in the case of pDC in Fig. 1. Show fruit.
  • Figure 4 shows the results of incubation of pDC (upper panel) and cDC (lower panel) into which IRF-7 YFP (green) was transfected by lentivirus with 3 M CpG-A Cy5 for 90 minutes.
  • FIG. 5 shows the results of examining the presence or absence of co-localization of YFP expression and CpG-A or CpG-B in bone marrow cells transfected with a lentivirus encoding IRF-7 YFP .
  • bone marrow cells were infected with a lentivirus encoding IRF-7 YFP .
  • Transduced bone marrow cells can be separated into DC cells by further 3 days of culture in the presence of human Flt3L.
  • the collected cells were stained with anti-CDl lc antibody conjugated with phycoerythrin and analyzed by FACS Calibar. Typically, 10-25% DC were positive for YFP (upper panel).
  • Cells obtained by removing pDC from cultured bone marrow cells using a MACS column with pDC-specific 120G8 antibody and anti-rat IgG-binding microbeads were used as cDC.
  • FIG. 5 A representative image of cDC infected with a lentivirus encoding IRF-7 YFP or a negative control virus is shown (middle panel).
  • the lower panel of FIG. 5 shows the intracellular localization of IRF-7 and C pG ODNs in cDC.
  • cDC was stimulated with CpG—A Cy5 or CpG—B Cy5 (red) and observed on a confocal microscope (lower panel). Neither CpG—A ey5 nor CpG—B ey5 was observed to coexist with IRF-7 YFP .
  • FIG. 6 shows the isolation of pDC cells and the induction of IRF-7 mRNA and IFN- mRNA expression by CpG stimulation in pDC cells.
  • IRF-7 mRNA and IFN-a mRNA were examined by quantitative real-time RT-PCR (left panel). As shown in the right panel of FIG. 6, the expression of IRF-7 mRNA and IFN-a mRNA in pDC continuously increased until 12 hours after CpG-stab stimulation. The induction of IRF-7 and IFN-a mRNA expression was significantly suppressed by the presence of CHX, a protein synthesis inhibitor.
  • CpG-A ey5 is a fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled dexene, which is a marker of endonome even after 90 minutes.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Fig. La The force at which co-localization with stran was observed
  • Fig. La The force at which co-localization with stran was observed
  • Fig. La The force at which co-localization with stran was observed
  • LysoTracker did not co-localize even 5 hours after administration
  • CpG-B Cy5 had a force that was already colocalized with LysoTracker after 90 minutes, but had no colocalization with dextran (Fig. Lb).
  • CpG- B ey5 and FITC- was added labeled CpG-A in pDC culture simultaneously, in most cells CpG- B ey5 is CpG-A dominantly and LysoTracker co-localized compared to Fite ( Figure 2 ).
  • CpG- Aey5 and CpG- Bey5 showed co-localization with LysoTracker after 90 minutes (Fig. 3). This observation is consistent with previous reports (16).
  • CpG—A Cy5 is also used for gene transfer using lentivirus in pDC.
  • the expressed yellow fluorescent protein (YFP) -IRF-7 fusion protein (sometimes referred to herein as “IRF-7 YFP ”) also co-localized.
  • YFP yellow fluorescent protein
  • IRF-7 YFP co-localization similar to that of IRF-7 YFP expressed in cDC was not observed (Figs. 4 and 5).
  • R AW264.7 cells which are macrophage cells that are easier to introduce various genes.
  • IRF-7 or IRF-3 was expressed together with MyD88 (My D88 CFP ) labeled with cyan fluorescent protein. The results are shown in FIGS.
  • FIG. 7 shows that MyD88 CFP (red) and IRF-7 YFP (green; upper panel) or IRF-3 (green; lower panel) were expressed in RAW264. 7 cells by gene transfer with lentivirus. The results of analysis by a fluorescence microscope are shown. The left panel is a photograph of the confocal microscope, and the left force and right are YFP and CFP, respectively, and an image (merged image) of them superimposed. The fluorescence intensity of CFP and YFP along the line shown in the merged image was measured and graphed. 0 and 1 in the right graph correspond to 0 and 1 shown in the merged image. IRF-7 YFP fluorescence intensity vertex overlaps with MyD88 eFP vertex IRF- 3 YFP vertex does not overlap.
  • Figure 8 shows the results of collecting CFP, YFP, and FERT images of RAW264. 7 cells prepared in the same manner as in Figure 7, and calculating the FRET efficiency ("corrected" FRET [FRET e ]) (corrected FRET). Show fruit. Average FRET e ZCFP values for 20 cells are shown with standard deviation.
  • IRF- 7 YFP is expressed in the cytoplasm and forms a granular structure with MyD88 eFP , but not IRF- 3 YFP . In fact, FRET is predominantly observed between IRF-7 YFP and MyD 88 CFP ( Figure 8), suggesting direct binding of IRF-7 to MyD88 in this structure.
  • Figure 10 shows RAW264. 7 cells expressing MyD88 eFP (blue) and IRF-7 YFP (green) incubated with 1 ⁇ M LysoTracker (red) for 90 minutes and analyzed by confocal microscopy. Indicates.
  • FIG 11 shows RAW264. 7 cells expressing MyD88 eFP and IRF- 7 YFP fixed with paraformaldehyde, stained with anti-transferrin receptor (TfR) antibody, and observed with a confocal microscope. . White arrows indicate the co-localization of IRF-7 (green), MyD88 (blue) and TfR (red).
  • FIG. 12 shows a confocal image of RAW264. 7 cells incubated with LysoTracker (green) and CpG- Aey5 (red) for 90 minutes.
  • FIG. 13 is RAW264. 7 Cells, 1 M LysoTracker (green), and 1 ⁇ M CpG- A Cy5, 1 M CpG- B Cy5 1 ⁇ M CpG- A Cy5 to or DOTAP and complexed, ( C pG-A / DOTAP) (red) is incubated for the time indicated in the figure, and after fixation, the results of observing cells under an epi-illumination fluorescence microscope are shown!
  • Figure 14 shows RAW264. 7 cells expressing MyD88 CFP (blue) and IRF-7 YFP (green) incubated with Cp G—A ey5 (red) for 90 minutes and analyzed by confocal microscopy. Indicates. In RAW264.7 cells, co-localization of CpG—A Cy5 and MyD88 CFP ZlRF—7 YFP was not observed.
  • the sustained TLR9 signal and activation of the My D88—IRF-7 pathway in endosomal vesicles is important for the activity of the IFN gene induction pathway.
  • the present inventors have found that lipid 1,2-dioleoyloxy 3 trimethylammonium propane (DOTAP) alters the intracellular transport system of CpG-ODN.
  • DOTAP lipid 1,2-dioleoyloxy 3 trimethylammonium propane
  • FIG. 15-18 shows intracellular transport in cDC and production of IFN and the like by treating CpG-A with DOTAP.
  • bone marrow cell-derived cDCs were incubated with CpG— Aey5 ZDOTAP (red) and LysoTracker (blue) for 80 minutes. After washing, the cells were then incubated with dextran FITC (green) for 10 minutes.
  • a representative fluorescence image and differential interference contrast (DIC) image are shown in FIG.
  • IRF—7 YFP (green) CDCs expressing CpG—A Cy5 ZDOTAP (red) were incubated for 90 minutes.
  • Representative fluorescence and DIC images are shown in FIG. N represents a nucleus. The percentage of cells with nuclear translocation of IRF-7 was measured and the average of three independent experiments was shown along with the standard deviation (lower right panel).
  • nucleic acid stays in the endonome and the TLR9-MyD88—IRF-7 pathway is activated in endosomal vesicles even in cDC.
  • FIG. 17 shows the expression concentration (pgZml) of IFN- ⁇ protein in cDC or pDC stimulated with CpG-A.
  • pDC or cDC were stimulated with various concentrations of CpG-A or control GpC ODN for 24 hours in the presence or absence of complexes with DOTAP.
  • the IFN- ⁇ concentration in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • the results of the average + ⁇ —standard deviation of three samples adjusted in the same way are shown.
  • Stimulation with CpG—AZDOTAP also produced IFN— ⁇ protein in cDC (left panel).
  • ODN control GpC
  • FIG. 18 shows the relative expression levels of IRF-7 mRNA and IF ⁇ - ⁇ mRNA in cDC stimulated with pG-AZDOTAP.
  • CDl lc + B220—cDC was purified from F6D bone marrow cells on day 6 of Flt3L by FACS Diva, and 3 M CpG—AZDOTAP in the presence or absence of cyclohexamide (CHX) as indicated. Stimulated with. IRF-73 ⁇ 4mFN-a mRNA expression level was determined by real-time RT-PCR
  • Figure 19 shows representative RAW264. 7 cells expressing MyD88 eFP (blue) Z and IRF-7 YFP (green) when incubated with CpG-A Cy5 / DOTAP (red) for 90 minutes. The results of analyzing the cells with a confocal microscope are shown.
  • Figure 20 shows the results of quantitative real-time RT-PCR analysis after preparing RNA with RAW264. 7 cell strength after 12 hours of incubation with 3 M CpG-A or 3 M CpG / DOTAP.
  • the vertical axis shows the relative expression of IFN- ⁇ , IFN- ⁇ and IRF-7 mRNA from the left graph, respectively.
  • IFN ⁇ ⁇ / ⁇ and IRF-7mRNA levels in splenic pDC stimulated with vesicular stomatitis virus (VSV) are also shown.
  • FIG. 21 shows the result of intracellular IFN- ⁇ staining of RAW264.7 cells stimulated with CpG-AZDOTAP as described previously (Non-patent Document 1). Specifically, RA W264.7 cells were stimulated with DOTAP alone, CpG— ⁇ (3 M), or CpG— ⁇ (3 M) ZDOT AP for 14 hours. Brefeldin A (Sigma; 5 ⁇ g / ml) was added for the last 4 hours of culture. Rat anti-mouse IFN- ⁇ antibody group (RMMA-1, PBL Biomedical LaDoratories and clonal F18 in PBS containing 4% paraformaldehyde and containing 1% FCS and 0.1% saponin (Sigma).
  • RMMA-1 Rat anti-mouse IFN- ⁇ antibody group
  • FIG. 22 shows the results of purification of wild-type bone marrow-derived CDl lb + B220-cells by FACS, stimulation with CpG-A or CpG-AZDOTAP, and measurement of IFN- ⁇ levels by ELISA.
  • Figure 19 21 As shown in, CpG-colocalization between A Cy5 / DOTAP and MyD88- IRF- 7 complex, Ji 0 eight 5 700 chome eight? 90 minutes after the start of the incubation! ⁇ In AW264.7 cells ( Figure 19), induction of IFN-a Z jS mRNAs was also observed in these cells ( Figure 20). No IFN- ⁇ secretion was observed in RAW264.7 cells. Force S (data not shown), IFN- ⁇ protein was detected by intracellular staining with anti-IFN- ⁇ antibody (Fig. 21). This suggests that the secretory function of IFN- ⁇ in this cell line is not as developed as that of pDC.
  • Example 5 CPG—B feeding extreme work in DOTAP processing
  • the inventors studied the response of pDC and cDC to CpG-B complexed with DOTAP (CpG-BZ DOTAP).
  • FIG. 23 shows the expression concentration (pg / ml) of IFN- ⁇ protein in cDC or pDC stimulated with CpG-B complexed with DOTAP. Stimulation with CpG-B was performed as described for FIG. 17 for CpG-A.
  • Figure 24 shows the results of examining the dose-dependent behavior of CpG-B transport in pDC.
  • Bone marrow-derived pDC were stimulated with 1 ⁇ ⁇ (upper panel) or 3 ⁇ (lower panel) of CpG—B Cy5 ZDOT AP. It was then incubated with dextran FITC or LysoTracker. Shown are confocal and DIC images of representative cells analyzed by confocal microscopy.

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Abstract

　本発明はインターフェロン－α及び／又はβ（ＩＦＮ－α／β）の発現誘導を促進する補助剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。 　本発明の方法は、 　ａ）上記補助剤の非存在下ではＩＦＮ－α／βの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、当該細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に又は無しでインキュベートし；そして 　ｂ－１）補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動したことを確認する、あるいは 　ｂ－２）補助剤候補化合物の存在により、ＩＦＮ－α／βの発現が誘導されたことを確認する 　ｃ）工程ｂ－１）又はｂ－２）において、核酸アジュバントのエンドソーム小胞への移動またはＩＦＮ－α／βの発現誘導が確認された場合に、上記化合物を有効な補助剤と判断する ことを含む。                                                                               

Description

明 細 書
インターフェロン— ex及び Z又は 0 (IFN - α / β )の発現誘導を促進 する補助剤をスクリーニングする方法
技術分野
[0001] 本出願は、 2005年 3月 31日に出願された特願 2005— 101706に基づく優先権を 主張し、同出願の内容は本明細書中に援用される。
[0002] 本発明は、インターフ ロン α及び Ζ又は j8 (IFN a Z jS )の発現誘導を促進 する補助剤をスクリーニングする方法、並びに当該スクリーニング方法によって得られ た新規補助剤に関する。
背景技術
[0003] Toll様受容体 9 (TLR9)ある!/ヽは Toll様受容体 7、 8 (TLR7、 TLR8)の活性化の 結果、プラズマサイトイド榭状細胞（plasmacytoid dendric cell (pDC) )において 、 I型インターフェロン (IFN— a Z J8 )が高レベルで発現される（非特許文献 1— 6)。 この発現誘導は、 MyD88— IRF7シグナル伝達経路に依存すると考えられる；しか しながら、 pDC中では、どのように、そしてなぜこの経路が活性ィ匕されるの力解明され ていない。さらに、なぜ通常の榭状細胞（conventional DC (cDC)のような他の細 胞中では活性ィ匕されな 、のか、につ ヽても解明されて 、な 、。
[0004] pDCにおける TLR7、 8、 9 依存性 IFN— α / β誘導経路は、 DNAアジュバント により誘導される CD8 +T細胞応答において重要な側面を構成する。この誘導は Μ yD88と相互作用する転写因子 IRF— 7が活性化されることによって生じる（非特許 文献 11、 12)。この発見から、同じ TLR9リガンドに対する応答として、 pDCは大量の IFNを産生するが、なぜ他の細胞型、例えば通常の DC (cDC)は産生しないのか、 という興味深い、解明されていない疑問が生じる。その答えとして pDCは他の細胞と 比較して高レベルの IRF— 7を発現すると ヽぅ仮説が提案されて ヽる（非特許文献 6、 13、 14)。しかし、このモデルをサポートする実験証拠はほとんど得られていない。
[0005] 一方、 TLR9を活性化するリガンドとして、 2つのクラスの非メチル化 CpGモチーフ を含む合成 ODN、即ち、 CpG— A(「D型 ODN」）及び CpG— B (「K型 ODN」）が知 られている。両者は、 pDC及び cDC中において、各々異なる応答を導く。具体的に は、 pDCを CpG— Aで刺激した場合は、効率的に高レベルの IFN a Z jS産生が 誘導される（非特許文献 7— 10, 15)。一方、じ 0— で 0じを刺激しても ?^ー a Z j8はほとんど産生されない。また、 cDCでは pDCと異なり、 CpG— A及び CpG— B のいずれで刺激した場合も IFN— a Z J8産生は誘導されない。しかし、これらの現 象が知られているにもかかわらず、 pDCにおいて CpG— Aで刺激した場合に高レべ ルの IFN— α / β産生が誘導されるメカニズムは解明されていない。
このため、インターフェロン a及び Ζ又は β (IFN a Z J8 )の発現誘導のメカ- ズムの解明、さらには、 IFN— a Z J8の発現を制御できるような補助剤の開発が希求 されている。
非特干文献 1 :Kadowaki, N. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll— like receptors and respond to di fferent microbial antigens. J. Exp. Med. 194, 833— 839 (2001) 非特許文献 2 :Lund, J. , Sato, A. , Akira, S. , Medzhitov, R. an d IwasaKi, A. Toll— like receptor 9— mediated recognition of Herp es simplex virus― 2 by plasmacytoid dendritic cells. J. Exp. Med.
198, 513— 520 (2003)
非特許文献 3 :Hemmi, H. , Kaisho, T. , Takeda, K. and Akira, S . The roles of Toll— like receptor 9, MyD88, and DNA— depend ent protein kinase catalytic subunit in the effects of two distinct CpG DNAs on dendritic cell subsets. J. Immunol. 170, 3059— 3064 (2003)
非特許文献 4:Krug, A. et al. Herpes simplex virus type 1 activate s murine natural interferonproducing cells through toll— like recept or 9. Blood 103, 1433— 1437 (2004)
非特許文献 5 :Krug, A. et al. TLR9— dependent recognition of MC MV by IPC and DC generates coordinated cytokine responses tha t activate antiviral NK cell function. Immunity 21, 107—119 (2 非特許文献 6 : Colonna, M. , Trinchieri, G. and Liu, Y. J. Plasma cytoid dendritic cells in immunity. Nat. Immunol. 5, 1219— 122 6 (2004)
非特許文献 7 : Verthelyi, D. , Ishii, K. J. , Gursel, M. , Takeshita , F. and Klinman, D. M. Human peripheral Dlood cells differ en tially recognize and respond to two distinct CPG motifs. J. Imm unol. 166, 2372- 2377 (2001)
非特許文献 8 :Krug, A. et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN— / β ·ίη plasmacytoid de ndritic cells. Eur. J. Immunol. 31, 2154- 2163 (2001)
非特許文献 9 :Krieg, A. M. CpG motifs in bacterial DNA and thei r immune effects. Annu. Rev. Immunol. 20, 709— 760 (2002) 特許文献 10 : Verthelyi, D. and Zeuner, R. A. Differential signali ng by CpG DNA in DCs and B cells： not just TLR9. Trends Im munol. 24, 519— 522 (2003)
非特許文献 11 : Honda, K. et al. Role of a transductional― transcrip tional processor complex involving MyD88 and IRF— 7 in Toll— lik e receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 15416 - 15421 (2004)
非特許文献 12 :Kawai, T. et al. Interferon― alpha induction through Toll— like receptors involves a direct interaction of IRF 7 with M yD88 and TRAF6. Nat. Immunol. 5, 1061 - 1068 (2004) 非特許文献 13 : Izaguirre, A. et al. Comparative analysis of IRF and IFN— a · expression in human plasmacytoid and monocyte― derived dendritic cells. J. Leukoc. Biol. 74, 1125— 1138 (2003) 非特許文献 14 : Kerkmann, M. et al. Activation with CpG— A and CpG— B oligonucleotides reveals two distinct regulatory pathways o f type I IFN synthesis in human plasmacytoid dendritic cells. J. Immunol. 170, 4465—4474 (2003)
非特許文献 15 : Krieg, A. M. et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B— cell activation. Nature 374, 546— 549 ( 1995) 非特許文献 16 : Latz, E. et al. TLR9 signals after translocating fro m the ER to CpG DNA in the lysosome. Nat. Immunol. 5, 19 0 - 198 (2004)
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非特許文献 18 : Heil, F. et al. Species― specific recognition of singl e― stranded RNA via toll— like receptor 7 and 8. Science 303, 1 526 - 1529 (2004)
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非特許文献 23 : Asselin—Paturel, C. , Brizard, G. , Pin, J. J. , Bri ere, F. and Trincnieri, G. Mouse strain differences in plasmacy toid dendritic cell frequency and function revealed by a novel mo noclonal antibody. J. Immunol. 171, 6466— 6477 (2003) 非特許文献 24: Sato, M. et al. Distinct and essential roles of trans cription factors IRF— 3 and IRF— 7 in response to viruses for IFN
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/ β · signaling to the maturation of dendritic cells induced by dou ble― stranded RNA or viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.
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非特許文献 26:Nagai, T. et al. A variant of yellow fluorescent pro tein with fast and efficient maturation for cell— biological applicati ons. Nat. Biotechnol. 20, 87— 90 (2002)
特許文献 27:Diebold, S. S. et al. Viral infection switches non— plasmacytoid dendritic cells into high interferon producers. Nature
424, 324-328 (2003).
非特許文献 28:Matsuyama, T. et al. Targeted disruption of IRF— 1 or IRF— 2 results in abnormal type I IFN gene induction and ab errant lymphocyte development. Cell 75, 83— 97 (1993)
非特許文献 29:Kinman, Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxyn ucleotides. Nature Reviews Immunology 4, 249— 259 (2004) 非特許文献 30: Nature Immunology, vol. 2, pp. 1144-1150, 2001 非特許文献 31 Exp. Med. vol. 194, pp. 1171-1178, 2001
非特許文献 32: Science, vol. 284, pp. 1835-1837, 1999
非特許文献 33: Nature, vol. 408, pp. 740-745, 2000
非特許文献 34: Genomics, vol. 45, pp. 332-339, 1997
非特許文献 35:Mol. Cell. Biol. , vol. 17, pp. 5748-5757, 1997 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明は、インターフェロン α及び Z又は j8 (IFN— a ZJ8)の発現誘導を促進 する補助剤をスクリーニングする方法およびその補助剤を提供することを目的とする 課題を解決するための手段
[0008] 本発明の方法は、
a)上記補助剤の非存在下では IFN— α / βの発現を誘導しない、細胞と核酸ァ ジュバントの系において、当該細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に 又は無しでインキュベートし；そして
b— 1)補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細 胞内移動したことを確認する、あるいは
b— 2)補助剤候補ィ匕合物の存在により、 IFN α Z ι8の発現が誘導されたことを 確認する
c)工程 b— 1)又は b— 2)にお!/、て、核酸アジュバントのエンドソーム小胞への移動 または IFN— α / βの発現誘導が確認された場合に、上記化合物を有効な補助剤 と判断する
ことを含む。
[0009] 本発明の方法にぉ 、て、補助剤の非存在下では IFN— α / βの発現を誘導しな い系における細胞は、好ましくは、コンベンショナル榭状細胞（cDC)、プラズマサイト イド榭状細胞 (pDC)、 RAW細胞、マクロファージ、ヒト末梢血由来細胞、及び線維 芽細胞からなる群から選択される。
[0010] 本発明の方法において、補助剤の非存在下では IFN— α / βの発現を誘導しな い系における核酸アジュバントは、好ましくは、非自己と認識される核酸である。
[0011] 本発明の一態様において、工程 b— 1)において、 Toll様受容体 9 (TLR9)、 MyD 88、インターフェロン制御因子 7 (IRF— 7)又はデキストランと核酸アジュバントの細 胞内共局在が観察される場合に、核酸アジュバントがエンドソーム小胞へ移動したと 確認してもよい。あるいは、本発明の一態様において、工程 b— 2)において、 IFN - α / βの発現誘導を、細胞中の IFN— α / βの mRNAの量、あるいは細胞培養上 清中の IFN— a Z j8のタンパク質の濃度を測定することによって確認してもよい。 本発明はまた、本発明のスクリーニング方法によって得られた、インターフェロン ひ 及び Z又は β (IFN— α / β )の発現誘導を促進する、補助剤を提供することを目 的とする。
[0012] 本発明者らは、上記問題の解決のために鋭意研究に努めた結果、 pDCにおいて I FN - α / βを強く誘導することが知られている、 TLR9リガンドである AZD型 CpG オリゴデォキシヌクレオチド（ODN) (CpG -A) (非特許文献 7— 10)力 pDCのェン ドソーム小胞に長時間留まることを見出した。さらに ODNが、 MyD88と相互作用す る IRF— 7とエンドソーム小胞内で共在することを発見した。これに対し、 cDC及び R AW264. 7マクロファージでは、 CpG— Aは迅速にリソソーム小胞に輸送されること も明らかとなった (実施例 1、 2)。こうした核酸アジュバントの精巧な時間的空間的細 胞内輸送制御によって、様々な病原体関連核酸に対し、細胞又は核酸の種類によつ て、異なる応答が誘導されると考えられる。
[0013] 本発明者らは上記核酸アジュバントの時空間制御の重要性の発見に基づき、 cDC においても pDCの場合と同様に、 CpG— Aがエンドノームに長時間留まるように Cp G— Aを制御すれば、 cDCにおいても大量の IFNを産生できるのではないか、と考え た。実際に、 CpG— Aを、補助剤、具体的には陽イオン脂質の一種である 1 , 2—ジ ォレオイルォキシ— 3—トリメチルアンモ -ゥム―プロパン（DOTAP)と複合体を形成 させることにより、 cDCにおいても、 CpG— Aはエンドノームに長時間留まり、かつ大 量の IFNが産生されることが確認された。これにより、エンドソームにおいて MyD88 — IRF— 7シグナルが持続すること力 大量の IFN— a Z jSを産生するという PDCの 特有の能力を決定づけることが明らかにされた（実施例 3)。同様に、 RAW264. 7細 胞でも DOTAPZCpG—Aにより大量の IFN— α / βの産生が観察された (実施例 4)。
[0014] また、 pDCについても、 CpG— B (「K型 ODN」）で刺激した場合は、 CpG— Aの場 合と異なり、 IFN— a Z jSはほとんど産生されないことが知られていた。本発明者ら は、 pDCにおいても CpG— Bに DOTAPを混合させた場合は、 IFN— αの発現の上 昇が観察されることを見出した (実施例 5)。
[0015] 本発明は上記発見に基づき、上記補助剤の非存在下では IFN— α / βの発現を 誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系を用いて、 DOTAPと同様の機能を有する 補助剤、即ち、 CpG— A、 CpG— Bを含む核酸アジュバントの細胞内輸送を制御し て、インターフェロン α及び/又は β (IFN- α/ β)の発現誘導を促進するよう な補助剤、をスクリーニングする方法を見出し、本発明を想到した。
[0016] 1.インターフェロン— α及び Ζ又は β (IFN- α/ β)の発現誘導を促進する補 助剤をスクリーユングする方法
よって、本発明はインターフェロン α及び Ζ又は j8 (IFN— aZjS)の発現誘導 を促進する補助剤をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、 a)上記補助剤の非存在下では IFN— α/βの発現を誘導しない、細胞と核酸ァ ジュバントの系において、当該細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に 又は無しでインキュベートし；そして
b— 1)補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細 胞内移動したことを確認する、あるいは
b— 2)補助剤候補ィ匕合物の存在により、 IFN α Z ι8の発現が誘導されたことを 確認する
c)工程 b— 1)又は b— 2)にお!/、て、核酸アジュバントのエンドソーム小胞への移動 または IFN— α/βの発現誘導が確認された場合に、上記化合物を有効な補助剤 と判断する
ことを含む。
[0017] 本発明は、核酸アジュバントの時空間制御の重要性の発見に基づき、補助剤の非 存在下では IFN aZjSの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系を用い ることにより、核酸アジュバントの細胞内輸送を制御し、インターフェロン α及び Z 又は β (IFN- α/β)の発現誘導を促進するような補助剤、をスクリーニングする方 法を提供するものである。
[0018] I)補助剤の非存在下では IFN— α/βの発現を誘導しない、細胞 核酸アジュバ ントの系における細胞
本発明のスクリーニング方法において使用しうる細胞は、核酸アジュバントとの組み 合わせの系において、補助剤の非存在下では IFN aZjSの発現を誘導しない細 胞であればよい。細胞の種類および由来は特に限定されず、公知の培養細胞、動物 生体内の細胞等を使用することができる。好ましくは培養細胞を使用する。培養細胞 を用いる場合には、例えば、培養細胞を核酸アジュバントと補助剤候補ィ匕合物との 複合体とともにインキュベートし、細胞力 の IFN産生応答を観察する。動物生体内 の細胞を用いる場合には、核酸アジュバントと補助剤候補ィ匕合物とを、例えば静脈 注射などにより動物生体内に投与し、細胞からの IFN産生応答を観察することも可能 である。
[0019] 同じ細胞でも、使用する核酸アジュバントの種類によって、補助剤の非存在下では I FN— a Z jSの発現を誘導しない場合と、する場合とがある。「細胞と核酸アジュバン トの系」とは、補助剤の非存在下では IFN— α / βの発現を誘導しない、細胞と核酸 アジュバントの系であれば、その任意の組み合わせにおいて本発明のスクリーニング 方法に使用しうることを意味する。例えば、プラズマサイトイド榭状細胞 (pDC)では、 補助剤の非存在下でも CpG— Aにより、 IFN— a Z jSの発現を誘導する力 CpG— Bによっては、 IFN— a Z jSの発現は誘導されない。よって、 pDCと CpG— Bの系は 、本発明の方法に使用し得る。同様に cDCと CpG— Aの系は本発明の方法に使用 し得る。
[0020] 免疫系に関わる細胞に限らず、他の体細胞などでも、補助剤の存在により、 IFN - a Z jSの発現の誘導が可能となる。よって、本発明の方法に使用しうる細胞は特に 限定されず、「補助剤の非存在下において、核酸アジュバントにより、 IFN- a / |8 の発現を誘導しない」という条件を満たす限り、あらゆる細胞を使用し得る。本発明の 細胞は、好ましくは、コンベンショナル榭状細胞 (cDC)、プラズマサイトイド榭状細胞 (pDC)、 RAW細胞（例えば、 RAW264. 7細胞）、マクロファージ、ヒト末梢血由来 細胞、及び線維芽細胞からなる群から選択される。これらの細胞は公知であり、例え ば、本明細書中の実施例に記載の方法、あるいは、 Nature Immunology, vol.
2, pp. 1144 - 1150, 2001 ; J. Exp. Med. vol. 194, pp. 1 171— 1178, 2001 ; Science, vol. 284, pp. 1835— 1837, 1999等の文献 に記載の公知の方法に従って、当業者が容易に入手することが可能である。
[0021] これらの細胞のうち、 CpG— Aのような核酸アジュバントの存在のみで IFN— a / βの発現誘導が生じるプラズマサイトイド榭状細胞 (pDC)との比較が明確かつ容易 であることから、コンベンショナル榭状細胞（cDC)が好ましい。あるいは、入手及び取 扱いの容易性から RAW細胞、特〖こ RAW264. 7細胞も好ましい。また、 CpG— Bの ような核酸アジュバント単独では IFN— a Z jSの発現が誘導されない PDCも、陽性コ ントロールの CpG— Aと pDCとを組み合せた陽性コントロールの系と対比解析しやす V、こと力ら、該 CpG— Bのような核酸アジュバントとの組み合わせにお!/、ては好まし!/ヽ 細胞である。
[0022] II)核酸アジュバント
本発明のスクリーニング方法において使用しうる核酸アジュバントは、細胞との組み 合わせの系において、補助剤の非存在下では当該細胞における IFN a Z jSの発 現を誘導しないが、補助剤の存在下では発現を誘導しうる核酸であればよい。例え ば、 CpG— Aはコンベンショナル榭状細胞 (cDC)に使用した場合、補助剤の非存在 下では IFN— a Z jSの発現を誘導しないが、補助剤（1, 2—ジォレオィルォキシ 3 -トリメチルアンモ -ゥム プロパン（DOTAP) )の存在下では発現を誘導すること 力 本発明において明らかにされた。よって、 CpG— Aは、例えば cDCとの組み合わ せにおいて本発明の方法に使用し得る。また、プラズマサイトイド榭状細胞 (pDC)は 、 CpG— Bと組み合わせた場合には、補助剤の非存在下では IFN— a Z jSの発現 を誘導しないが、補助剤が存在した場合に初めて誘導することが見出された。よって 、 pDCと CpG— Bの系も、本発明の方法に使用し得る。
[0023] 核酸の種類、配列等は特に限定されない。好ましくは、細胞によって非自己と認識 される核酸である。「非自己として認識される核酸」とは、より具体的には、哺乳動物 の細胞において非自己と認識され得る、合成 DNA、合成 RNA、或いは哺乳類より 下等な生物のゲノム由来核酸を意味する。
[0024] 本発明の方法に使用しうる核酸アジュバントは、例えば、非メチルイ匕 CpG オリゴデ ォキシヌクレオチド（CpG ODN)、一本鎖（ss) RNA、並びに不活性ウィルス又は細 菌からの核酸抽出物等を含む。好ましくは、非メチルイ匕 CpG オリゴデォキシヌクレオ チド（CpG ODN)又は一本鎖（ss)RNA、より好ましくは、 CpG ODNである。これ らの核酸アジュバントは、例えば、本明細書中の実施例に記載の方法、あるいは、公 知の核酸合成方法を用いて容易に作製することが可能である。 [0025] 非メチルイ匕 CpG オリゴデォキシヌクレオチド（CpG ODN)とは、単一又は複数の 非メチルイ匕 CpGモチーフを核酸分子内（5 '末端又は 3，末端でな 、）に有する、オリ ゴデォキシヌクレオチドである。本発明の方法に使用し得る CpG ODNは、用いる 細胞との組み合わせにおいて、補助剤の非存在下では当該細胞における IFN— a / βの発現を誘導しないが、補助剤の存在下では発現を誘導し得る、という性質を 有することが望ましい。ここで「用いる細胞との組合せにおいて」とは、使用し得る Cp G ODNは、用いる細胞との組合せにおいて上記性質を保持していればよぐあらゆ る細胞との組合せで上記性質を保持している必要はないことを意味する。従って、使 用し得る CpG ODNが別の細胞との組み合わせにおいては、補助剤の非存在下で も、 IFN a Z jSの発現誘導を促進する活性を有するものであってもよい。例えば、 後述する CpG— Aは、 pDCとの組み合わせにおいては補助剤の非存在下でも IFN a Z jSの発現を誘導するが、 cDCとの組み合わせにおいては補助剤の存在下で 初めて IFN a Z jSの発現を誘導する。よって、 CpG— Aは cDC等のとの組み合わ せにおいて、本発明の方法に好適に使用し得る。
[0026] 本発明の方法に使用可能な CpG ODNは、好ましくは、塩基数 18— 25のデォキ シヌクレオチド、より好ましくは 20— 22のデォキシヌクレオチド力 なり、好ましくはホ スホジエステル Zホスホロチォエート混合骨格、あるいはホスホロチォエートの骨格を 有する。本発明の方法に使用可能な CpG ODNの例は、例えば、非特許文献 7、 2 9、 3、 8、 9、 10、 15等の文献に記載されている。
[0027] 非メチル化 CpG オリゴデォキシヌクレオチド（CpG ODN)の好ましい例は、例え ば、非特許文献 29等に記載された CpG— A (「D型オリゴデォキシヌクレオチド」と呼 称されることもある）、 CpG - B (「K型オリゴデォキシヌクレオチド」と呼称されることも ある）、 CpG— Cである。これらの CpG ODNは各々下記の塩基配列を有する。
[0028] CpG - A (非特許文献 7、 29)
ggtgcatcgatgcagggggg (目 il歹 U番 1)
対マウス CpG— B (非特許文献 15) (配列番号 2)
tccatgacgttcctgatgct
対ヒト CpG B tccatggacgttcctgagcgtt (酉己歹幡号 3)
CpG-C (非特許文献 29)
tcgtcgttcgaacgacgttgat (酉 [i列番 4)
CpG— Bには、対マウス CpG— Bと対ヒト CpG— Bが知られている。本発明の方法 において好ましくは、マウス細胞を使用する場合は対マウス CpG— Bを、ヒト細胞を使 用する場合には対ヒト CpG— Bを使用する。
[0029] CpG— Aの構造上の特徴は以下の通りである。特に、 i)の特徴が細胞との組み合 わせの系において、補助剤の非存在下では当該細胞における IFN— a Z jSの発現 を誘導しないが、補助剤の存在下では発現を誘導しうる、という性質に重要である。 当該特徴が、プラズマサイトイド榭状細胞 (pDC)等において、補助剤の非存在下で I FN— a Z j8の発現を誘導する。
[0030] i)配列番号 1の塩基 8— 9に非メチル化 CpGモチーフを 1つ有する。
[0031] ii)配列番号 1の塩基 3— 14にパリンドローム tgcatcgatgcaを有する。上記塩基 8 —9に非メチル化 CpGモチーフは、パリンドローム中に含まれる。
[0032] iii)配列番号 1の塩基 3— 15はホスホジエステル結合、その他の塩基はホスホロチ ォエート結合である、ホスホジエステル Zホスホロチォエート混合骨格を有する。
[0033] iv) 3，末端に 5塩基の G力もなる polyGティルを有する。
[0034] CpG— Bの構造上の特徴は以下の通りである。特に、 i)の特徴が細胞との組み合 わせの系において、補助剤の非存在下では当該細胞における IFN— a Z jSの発現 を誘導しないが、補助剤の存在下では発現を誘導しうる、という性質に重要である。 当該特徴が B細胞増殖、並びに IgM及び IL— 6産生の誘因となりうる。
[0035] i)対マウス CpG— Bの場合は配列番号 2の塩基 8— 9に非メチル化 CpGモチーフを 1つ、対ヒト CpG— Bの場合は配列番号 3の塩基 9— 10及び塩基 19— 20の 2箇所に 非メチル化 CpGモチーフを有する。
[0036] ii)ホスホロチォエートの骨格を有する。
[0037] CpG— Cの特徴は以下の通りである。特に、 i)の特徴が細胞との組み合わせの系 において、補助剤の非存在下では当該細胞における IFN— a Z jSの発現を誘導し ないが、補助剤の存在下では発現を誘導しうる、という性質に重要である。当該特徴 力 プラズマサイトイド榭状細胞 (pDC)等において、補助剤の非存在下で IFN— a Ζ ι8の発現を誘導する。
[0038] i)配列番号 4の塩基 9 10及び塩基 16— 17の 2箇所に非メチル化 CpGモチーフ を有する。
[0039] ii)配列番号 4の塩基 2— 17にパリンドロームじ8 8 じ8&&じ8&じ8 (パリンドローム1) 、塩基 11— 19に別のパリンドローム aacgacgtt (パリンドローム 2)を有する。パリンド ローム 1は、上記塩基 9 10及び塩基 16— 17の 2箇所の非メチル化 CpGモチーフ を含む。ノ《リンドローム 2は、塩基 16— 17の非メチル化 CpGモチーフを含む。
[0040] iii)ホスホロチォエートの骨格を有する。
[0041] iv) 5 '末端に TCGダイマーを有する。
[0042] あるいは、単一鎖 RNA (ssRNA)もある種の細胞において、 CpG— A等と同様に、 IFN a Z jSの発現誘導を促進しうることが知られている。例えば、ヒト末梢血単核 細胞は ssRNAであるポリゥリジル酸単独での刺激では IFN— αを産生しないが、ポ リウリジル酸と DOTAPとの複合体により刺激すると、高レベルの IFN— αを産生する ことが報告されている（非特許文献 11)。よって、このような ssRNAも本発明の方法に 使用することが可能である。 ssRNAの配列は特に限定されないが、好ましくは単一 の塩基の繰り返し配列、例えばポリゥリジル酸、を含む。 ssRNAの配列の長さは特に 限定されない。
[0043] あるいは、本発明の核酸アジュバントは、不活性ィ匕ウィルス又は細菌からの核酸抽 出物であってもよい。不活性化ウィルスとは、例えば、単純へルぺスウィルス、インフ ルェンザウィルス、サイトメガロウィルス、水泡性口炎ウィルス等のウィルスを、紫外線 や熱処理等の処理により不活性ィ匕したものである。細菌は、例えば、大腸菌、結核菌 等を含む。不活性ィ匕ウィルス又は細菌力もの核酸の抽出は公知であり、 J. Exp. Me d. vol. 198, pp. 513 - 520, 2003 J. N. C. I vil. 72, pp. 955— 962, 198 4等の文献に記載の方法を使用することができる。
[0044] III)工程 a)について
本発明のスクリーニング方法は、先ず工程 a)において、上記補助剤の非存在下で は IFN a Z jSの発現を誘導しない、細胞と核酸アジュバントの系において、当該 細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に又は無しでインキュベートする 。「補助剤候補ィ匕合物」は限定されないが、例えば、核酸アジュバントと複合体を形 成する可能性のある物質力も選択することが可能である。核酸アジュバントを構成し て 、る核酸は負の電荷を帯びて 、るので、陽イオン性の物質は核酸と複合体を形成 しゃすい性質をもっと考えられる。陽イオン脂質は様々なものが市販されており、この ような、公知の陽イオン脂質を補助剤候補化合物として、本発明のスクリーニング方 法に供することが可能である。また、候補化合物全体として核酸との親和性を有する 必要はなぐその一部位でも親和性を有し複合体を形成し得るものであればよい。し たがって、一部に陽イオン電荷を帯び、核酸と複合体を形成し得るものも候補化合物 として選択し得る。さらに、核酸との複合体形成は、電気的な親和力によるものに限ら ず、抗原 抗体反応、共有結合、その他の相互作用による親和力であってもよい。し たがって、抗核酸抗体なども補助剤候補ィ匕合物として選択することが可能である。
[0045] 補助剤候補化合物は核酸アジュバントと、予め複合体化させて細胞に投与してもよ ぐあるいは、同時に細胞に投与するだけでもよい。補助剤候補化合物の核酸アジュ バントの使用割合はモル比で、好ましくは 1： 1で使用する。核酸アジュバント及び補 助剤候補化合物の濃度は細胞の種類、インキュベーション時間等の条件に応じて当 業者が適宜適用できる。インキュベーションの条件 (温度及び時間）は、使用する細 胞の種類、補助剤候補化合物の種類等に応じて当業者が適宜選択可能である。限 定されるわけではないが、例えば、室温で 10— 15分程度のインキュベーションを行 つてもよい。 次いで、 b— l)補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがェ ンドソーム小胞に細胞内移動したことを確認する、ある ヽは
b— 2)補助剤候補ィ匕合物の存在により、 IFN α Z ι8の発現が誘導されたことを 確認する。
[0046] IV)工程 b— 1)について
工程 b—l)において、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動したことの 確認は、例えば、公知の方法を用いて核酸アジュバントの位置とエンドソーム小胞の 位置とが細胞内で一致することを観察することによって行うことができる。
[0047] 例えば、核酸アジュバントを先ず任意の蛍光分子、放射性物質、発光物質等で標 識する。蛍光分子としては、例えば、シァニン 5 (Cy5)等のシァニン色素、フルォロセ インイソチオシァネート（FITC)、フルォレセイン、 6—カルボキシフルォレセイン、テト ラメチルー 6—カルボキシローダミン及びそれらの誘導体などの核酸分子を標識でき る公知の蛍光分子を使用することができる。本明細書中の実施例では、 Cy5標識さ れた CpG— ODNsを Sigma Genosisから購入して使用した。また、 FITC標識され た CpG— ODNsを Hokkaido System Scienceから購入して使用した。
[0048] 蛍光分子の種類に応じた適切な手段 (装置、波長等)を採用することにより、本発明 の核酸アジュバント（の位置）を検出することが可能である。それぞれの物質によって 蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。核酸の検出は共焦点 顕微鏡分析 (例えば、 Olympus FV— 1000共焦点顕微鏡）、蛍光顕微鏡検査 (例 えば、 Olympus IX— 71倒立顕微鏡、等を用いて行うことが可能である。
[0049] 放射性物質は、 35S、 32P、 3H等の核酸を標識できる公知の物質を使用することがで きる。放射性物質の検出は公知の方法を用いて行うことができる。あるいは、核酸ァ ジュバントの標識は核酸塩基をピオチン又はアビジンで修飾し、公知のピオチン—ァ ビジン結合を用いて行ってもょ 、。
[0050] 発光物質は、核酸を標識できる公知の発光物質を使用することができる。発光物質 の検出は公知の方法を用いて行うことができる。
[0051] エンドソーム小胞の位置は、例えば、エンドソーム小胞を可視化できる標識された デキストラン、トランスフェリン等を用いて確認することができる。標識デキストランは、 例えば、 FITC 又は Alexa Fluor647 標識されたデキストラン（Molecular Pr obes社)を使用できる。あるいは、エンドノームに局在する蛋白質に蛍光蛋白質、例 えば GFP誘導体等のタグを付けることによる同定法、特異的抗体を用いた免疫組織 化学法による同定法なども使用可能である。
[0052] 具体的には、本発明者らは、核酸アジュバントが、 Toll様受容体 9 (TLR9)、 MyD 88、及びインターフェロン制御因子 7 (IRF— 7)の複合体 (TLR9— MyD88— IRF7 複合体）と結合しあるいは挙動を共にし、エンドソーム小胞へと細胞内移動すること、 そして、 TLR9— MyD88— IRF7複合体がエンドノームに安定して存在することが、 インターフェロン ひ及び Z又は j8 (IFN— a Z jS )の発現誘導を促進するためのメ 力-ズムとして重要であることを見出した。 MyD88、 IRF7は核酸アジュバントの非存 在下でもエンドノームで常時検出される、エンドノームに局在するタンパク質である。 さらに、「デキストラン」は、 a l→6結合を主体とする粘質性のダルカンであり、細胞内 においてエンドノームに局在することが知られている。本発明者らは、核酸アジュバン トが適切な補助剤の存在によりエンドノームに細胞内移動すると、デキストランと細胞 内共局在することを見出した。
[0053] よって、本発明の一態様において、工程 b— l)において、核酸アジュバントのエンド ソーム小胞への細胞内移動は、 TLR9、 MyD88又は IRF— 7のいずれ力 （TLR9— MyD88— IRF7複合体又はその構成部分）、あるいはデキストランと核酸アジュバン トの細胞内共局在が観察された場合に、核酸アジュバントがエンドソーム小胞へ移動 したと確認することができる。
[0054] TLR9、 MyD88又は IRF— 7のいずれ力 （TLR9— MyD88— IRF7複合体又は その構成部分)の位置は、例えば、公知の遺伝子工学的手法を用いて調べることが できる。例えば、 TLR9、 MyD88又は IRF— 7のいずれかの遺伝子と蛍光タンパク 質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む形質転換ベクターで、本発明のスクリー ニング方法に使用する細胞を宿主細胞として形質転換する。形質転換細胞内で、蛍 光標識された TLR9、 MyD88又は IRF— 7のいずれかのタンパク質が発現する。 T LR9、 MyD88、 IRF— 7の遺伝子はいずれも公知であり、例えば、文献 Nature, v ol. 408, pp. 740- 745, 2000 ; Genomics, vol. 45, pp. 332— 339, 1997 ; Mol. Cell. Biol. , vol. 17, pp. 5748— 5757, 1997【こ各々記載されて!ヽる。
[0055] TLR9、 1^ 088又は1!^< 7タンパク質を、蛍光タンパク質との複合タンパク質とし て発現させると、ベクターを導入した細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体におい て蛍光を測定して検出することが可能である。蛍光蛋白質の例としては、好ましくは 緑色蛍光蛋白質 (GFP)若しくはその変異体が用いられる。 GFPは発光クラゲ類の 有する緑色蛍光蛋白質の総称である。ォワンクラゲの GFPは、約 395nmと 470nm の可視光より励起され約 509nmの緑色蛍光を発する。この蛍光には酸素以外に特 別の因子を必要としない。外来遺伝子として GFP遺伝子を導入すると、蛍光を有す る培養細胞、植物、線虫、ハエ、魚、マウスなどが得られ、生きている細胞中で、発現 を直接観察できる。さらに、 GFPの変異体でより強い蛍光を発する EGFP (enhance d green fluorescent protein)、あるいは蛍光特性の異なる YFP (yellow fluo rescent protein)、 CFP、cyan fluorescent protein)、 RFP (red fluorescen t protein)等が開発されており、市販されている（例えば、 Clontech社より入手可 能)。本発明の方法では、蛍光の検出により、目的とする蛋白質の、細胞内局在、組 織局在、又は時間的局在に関する情報を得ることが可能である。すなわち標識物質 として蛍光タンパク質を用いることにより、補助剤候補ィ匕合物の存在の有無における 、上記 TLR9、 MyD88又は IRF— 7タンパク質の位置を蛍光を指標として検出する ことが可能である。
[0056] または、 TLR9、 MyD88又は IRF— 7のいずれ力 （TLR9— MyD88— IRF7複合 体又はその構成部分）の細胞内の位置は、 TLR9、 MyD88又は IRF— 7タンパク質 と反応する抗体を用いて検出してもよい。 TLR9、 MyD88又は IRF— 7タンパク質と 反応する抗体は公知の方法を用いて作製し、検出に使用することができる。
[0057] 細胞と核酸アジュバントの系として、 cDCと CpG—Aを用いた場合には、補助剤の 非存在下では IFN— a Z jSの発現誘導しないが、一方、補助剤の非存在下では核 酸アジュバントがリソノームに細胞内移動されることが、本発明によって明らかにされ た。よって、本発明の方法の好ましい他の態様としては、補助剤候補化合物の非存 在下では核酸アジュバントがリソソーム小胞に存在するが、補助剤候補化合物の存 在により核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細胞内移動することを確認することに より、補助剤をスクリーニングすることができる。エンドソーム小胞への移動は上述した 方法で実施し得る。一方、リソソーム小胞の位置は、リソソーム小胞を可視化し得る物 質、例えば LysoTracker Blue (Molecular Probes社）等の標識物質を用いて確 認することができる。あるいは、リソソーム小胞に局在する蛋白質に蛍光蛋白質、例え ば GFP誘導体等のタグを付けることによる同定法、特異的抗体を用いた免疫組織化 学法による同定法なども使用可能である。
[0058] V)工程 b— 2)について
工程 b— 1)の代わりに、工程 b— 2)において、 IFN— j8の発現が誘導されたこ とを確認してもよい。 IFN— a Z jSの発現は、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に 細胞内移動したことに因ると考えられる。即ち、工程 b— 2)では、補助剤候補化合物 による IFN— α / βの発現誘導の効果を直接観察する。 IFN— α Z j8の発現誘導 は、例えば、細胞中の IFN— a Z jSの mRNAの量、あるいは細胞培養上清中の IF Ν - α / βのタンパク質の濃度を測定することによって確認することができる。
[0059] IFN - α / βの mRNAの発現量は、例えば、定量リアルタイム RT— PCR等の公 知の定量 PCRを用いて行うことができる。補助剤の非存在下では IFN— a Z jSの発 現を誘導しない細胞力ゝらの RNAの調製、並びにリアルタイム定量 RT—PCRは、例 えば非特許文献 24に記載された方法に従って行うことができる。リアルタイム定量 R T—PCRは、例えば、 LightCycler等の装置及び SYBR Green system (Roche )等を用いて行うことができる。 IFN— a Z jSの mRNAの発現量は、各個別試料中 の RNA量を j8—ァクチン、グリセルアルデヒドー3—ホスフェート デヒドロゲナーゼ（ GAPDH)等の標準的な mRNAの発現のレベルを基にデータを標準化することによ つて、相対量を求めることができる。本明細書中の後述の実施例では、 j8—ァクチン の mRNAの発現量を 1とし、その相対量として IFN— α / βの mRNAの発現量を示 した。 IFN— a 1、 IFN- β、 β 了クチン、及び IRF— 7のためのプライマーは、こ れらの遺伝子の公知の塩基配列から適宜選択することができる。例えば、非特許文 献 25に記載されたものを使用することができる。 IFN— a Z jSの mRNAの発現量が 、補助剤候補化合物の存在により有意に増加したとき、好ましくは、 10倍以上増加し たとき、候補ィ匕合物が補助剤として有効であると判断する。
[0060] あるいは、 IFN— a Z jSタンパク質の発現濃度を測定してもよい。 IFN— a Z jSタ ンパク質の発現濃度は、タンパク質の定量のための公知の方法を用いて行うことがで きる。例えば、 IFN— α又は βタンパク質と反応する抗体を用いた ELISA、細胞内 染色法等の公知の免疫化学的法を用いて、 IFN— a Z jSタンパク質の産生濃度を 測定することができる。 IFN— α又は βタンパク質と反応する抗体は、例えば、非特 許文献 1、 2、 3、 4、 5、 7、 8、 11、 12等の文献に記載されている。あるいは、公知の 方法を用いて作製してもよい。 IFN— « Ζ ι8のタンパク質の発現濃度が、補助剤候 補ィ匕合物の存在により有意に増カロしたとき、候補ィ匕合物が補助剤として有効であると 判断する。 [0061] 後述の実施例では特に記載しない限り、細胞を 2 X 105細胞 Zmlの濃度で 96ゥェ ルプレートに播き、種々の試薬で 24時間刺激した。上清中の IFN— α又は |8タンパ ク質濃度を ELISAで測定した。マウス IFN— α及び IL— 12ρ40のための ELISAキ ットは、各々 PBL Biomedical Laboratories及び TECHNE Corp .力ら購入し たものを使用した。限定するわけではないが、例えば、上記条件で cDC細胞を用い て本発明のスクリーニング方法を実施した場合に、 IFN— αのタンパク質の発現濃 度が、補助剤候補化合物の存在により有意に増加したとき、候補化合物が補助剤と して有効であると判断する。
[0062] 2.インターフェロン— α及び Ζ又は β (IFN - α / β )の発現誘導を促進する補 腿
本発明はまた、本発明のスクリーニング方法によって得られた、インターフェロン一 a及び Z又は β (IFN - α / β )の発現誘導を促進する補助剤を提供する。本発明 の補助剤は、核酸アジュバントのみでは IFN— a Z jSの発現誘導しない細胞におい ても、核酸アジュバントと共に使用することにより IFN— a Z jSの発現誘導を促進し 得る。 IFN a Z jSはウィルス感染症または癌の治療剤に利用されている使用され る有用な物質である。よって、本発明の補助剤は、通常、核酸アジュバントのみでは I FN a Z jSの発現誘導がみられない細胞において、 IFN a Z jSの発現を誘導さ せるための研究用試薬としてだけではなぐさらには、ウィルス感染症または癌の治 療剤の医薬品として利用してもよい。また、本発明の補助剤は、上記補助剤の非存 在下では IFN a Z jSの発現を誘導しない細胞と核酸アジュバントの系において、 I FN α Z |8の発現の誘導を促進させ得ることから免疫促進剤として利用してもよい
[0063] なお、上述した本発明のスクリーニング方法では、インターフェロン a及び Z又は β (IFN - α / β )の発現誘導を促進する補助剤は、核酸アジュバントとともに混合 して用したときにインターフェロンの産生を促進し得るものとして選択された。したがつ て、本発明の補助剤は、基本的には核酸アジュバントと共に使用されるが、場合によ つては、単独で使用してもよい。例えば、核酸アジュバントとして機能し得る核酸を保 持した微生物（細菌、ウィルス等）〖こ感染している細胞、個体においては、微生物由 来の核酸と本発明の補助剤が生体内で相互作用することにより、インターフェロン産 生を促進し得るような場合には本発明の補助剤は単独で使用し得る。よって、本発明 の補助剤は、、核酸アジュバントと共に、あるいは単独でウィルス感染症もしくは癌の 治療剤、又は免疫促進剤として利用し得る。
本発明の補助剤は、限定されるわけではないが、好ましくは、正電荷性高分子（陽ィ オン性脂質及び陽イオン性ペプチド等)、並びに抗核酸抗体からなる群から選択さ れる。より好ましくは、 1, 2—ジォレオイルォキシ—3—トリメチルアンモ-ゥム—プロ パン（DOTAP)、 1, 3—ジ―ォレオイロキシ— 2— (6—カルボキシ—スペルミル）— プロビラミド（DOSPER)、ポリエチレンィミン（PEI)及び抗 DNA抗体からなる群から 選択される。
図面の簡単な説明
[図 1]図 la及び bは、 CpG—Aey5 (a中、赤）、又は CpG— Bey5 (b中、赤）と 90 分間インキュベートした Flt3L—培養 骨髄由来 pDC (120G8+細胞）の共焦点及び 微分干渉コントラスト (DIC)像を示す。
[図 2]図 2は、 pDCを CpG—AFITe及び CpG— Bey5の両方とインキュベートし、次いで 、 LysoTrackerとインキュベートした結果を示す。
[図 3]図 3は、図 1の pDCの場合と同様に骨髄由来 cDC (120G8—細胞）を、 CpG— A Cy5又は CpG— BCy5 (赤）とインキュベートし、 LysoTracker (緑）とインキュベートした 結果を示す。
[図 4]図 4は、レンチウィルスによって IRF— 7YFP (緑)を遺伝子導入した pDC (上パネ ル）及び cDC (下パネル）を、 3 M CpG— Aey5と 90分間インキュベートした結果を 示す。
[図 5]図 5は、 IRF— 7YFPをコードするレンチウィルスで遺伝子導入した骨髄細胞にお ける YFPの発現と、 CpG— A又は CpG— Bとの共局在の有無を調べた結果を示す。
[図 6]図 6は、骨髄細胞からの pDC細胞の単離、及び pDCにおける CpG刺激による I RF- 7 mRNA及び IFN—ひ mRN Aの発現誘導を示す。
[図 7]図 7は、 RAW264. 7細胞において、レンチウィルスによる遺伝子導入によって 、 MyD88CFP (赤）及び IRF— 7YFP (緑；上パネル）又は IRF— 3 (緑；下パネル）を発 現させ、蛍光顕微鏡によって分析した結果を示す。
[図 8]図 8は、図 7と同様に調製された RAW264. 7細胞の CFP、 YFP、 FRETィメー ジを収集し、 FRET効率（「補正」 FRET [FRETC] ) (corrected FRET)を計算した 結果を示す。 20細胞の平均 FRETeZCFP値を標準偏差と共に示した。
[図 9]図 9は、 MyD88eFP (青）及び IRF— 7YFP (緑）を発現する RAW264. 7細胞を、 Alexa Fluor647標識デキストラン (赤）と 10分間インキュベートし、代表的な細胞に ついて、共焦点顕微鏡によって分析した結果である。白いボックスで示された部分の 高倍率像は右下のパネルに示されている。白い矢は、デキストラ exa647、 MyD88CFP 及び IRF— 7YFPの共局在を示す。
[図 10]図 10は、 MyD88eFP (青）及び IRF—7YFP (緑）を発現する RAW264. 7細胞を 、： M LysoTracker (赤）と 90分間インキュベートし、共焦点顕微鏡によって分析 した結果を示す。
[図 11]図 11は、 MyD88eFP及び IRF— 7YFPを発現する RAW264. 7細胞をパラホル ムアルデヒトで固定し、抗—トランスフェリン受容体 (TfR)抗体で染色し、共焦点顕微 鏡によって分析した結果を示す。白い矢は、 IRF— 7 (緑)、 MyD88 (青)及び TfR( 赤)の共局在を示す。
[図 12]図 12は、 LysoTracker (緑)及び CpG—Aey5 (赤）と 90分間インキュベートし た RAW264. 7細胞の共焦点像を示す。
[図 13]図 13は、 RAW264. 7細胞を、 1 M LysoTracker (緑）、並びに 1 ^ M C pG— ACy5、 l ,u M CpG— BCy5、あるいは又は DOTAPと複合体化した 1 μ M CpG -ACy5 (CpG-A/DOTAP) (赤）と共に図中に示した時間インキュベートし、固定 化後、落射型蛍光顕微鏡下で細胞を観察した結果を示す。
[図 14]図 14は、 MyD88eFP (青）及び IRF—7YFP (緑）を発現する RAW264. 7細胞を 、 CpG— Aey5 (赤)と 90分間インキュベートし、共焦点顕微鏡によって分析した結果を 示す。
[図 15]図 15は、 CpG— ACy5ZDOTAP (赤）及び LysoTracker (青）と 80分間インキ ュペートし、洗浄後、デキストラン FITe (緑)と 10分間インキュベートした、骨髄細胞由来 の cDCの蛍光及び DIC像を示す。 [図 16]図 16は、 IRF— 7YFP (緑）を発現する cDCを、 CpG— Aey5ZDOTAP (赤）と 90 分間インキュベートした場合の、代表的な蛍光及び DIC像示す。 Nは核を表す。 IRF 7の核移行を伴う細胞の割合を計測し、 3回の独立した実験の平均値を標準偏差 とともに示した (右下パネル)。
[図 17]図 17は、 CpG— Aで刺激した cDC又は pDCにおける、 IFN— αタンパク質の 発現濃度 (pgZml)を示す。
[図 18]図 18は、 pG— AZDOTAPで刺激された cDCにおける IRF— 7 mRNA及 び IFN— a mRNAの相対的な発現量を示す。
[図 19]図 19は、 MyD88eFP (青）/及び IRF—7YFP (緑）を発現する RAW264. 7細 胞を、 CpG— Aey5ZDOTAP (赤)で 90分間インキュベートした場合の、代表的な細 胞を共焦点顕微鏡によって分析した結果を示す。
[図 20]図 20は、 3 M CpG— A又は 3 M CpG/DOTAPとのインキュベーショ ンの 12時間後、 RAW264. 7細胞から全 RNAを調製し、定量リアルタイム RT— PC R分析を行った結果を示す。縦軸は、各々左のグラフ力 IFN— β、 IFN- α及び I RF— 7の mRNAの相対的な発現を示す。
[図 21]図 21は、じ 0—八 00丁八？で刺激された1^^^264. 7細胞の細胞内 IFN α染色を行った結果を示す。
[図 22]図 22は、野生型骨髄由来の CDl lb+B220—細胞を FACSによって精製し、 C pG— A又は CpG— AZDOTAPで刺激し、 ELISAによって IFN— αレベルを測定 した結果を示す。
[図 23]図 23は、 DOTAPに複合体化させた CpG— Βで刺激した cDC又は pDC細胞 における、 IFN— αタンパク質の発現濃度 (pg/ml)の用量依存性を示す。
[図 24]図 24は、 pDCにおける CpG— B輸送の濃度依存性の挙動を調べた結果であ る。骨髄由来の pDCを 1 M (上パネル）又は 3 M (下パネル）の、 DOTAPと複合 体ィ匕した CpG— Bey5で刺激した。次いで、デキストラン FITC又は LysoTrackerとともに インキュベートし、エンドソーム又はリソソームを可視化した。代表的な細胞について 、共焦点顕微鏡によって分析した共焦点及び DIC像を示す。
実施例 [0065] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力 これらは本発明の技術的範 囲を限定するためのものではな 、。当業者は本明細書の記載に基づ 、て容易に本 発明に修飾 ·変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
[0066] 材料及び方法
本明細書中の実施例においては、特に言及しない限り、下記の材料及び方法を用 いた。
[0067] 1)試薬
合成オリゴヌクレオチドは Hokkaido System Science (札幌、 日本）から購入し た。
[0068] ODNの配列は下記の通りである；
CpG-A (ODN 19 非特許文献 7)：
ggTGCATCGATGCAgggggG ; (配列番号 1)
対マウス CpG— B (ODN1668、 非特許文献 15)：
tccatgacgttcctgatgct (目 S列番号 2)
及び
コントロール GpC ODN (コントロール D、 非特許文献 7)
ggTGCATGCATGCAgggggg (配列番号 5)。
[0069] なお、大文字及び小文字は各々、ホスホジエステル修飾された骨格、ホスホロチォ エート修飾された骨格を伴う塩基を示す。 Cy5標識された CpG— ODNsは Sigma Genosisから購入した。 FITC標識された CpG— ODNsは Hokkaido System Sc ience»ら fo入した。
[0070] CpG— Aと DOTAPの複合体 (Roche Diagnostics)は、製造者の推奨に従って 調製した。典型的には、 5 μ gの CpG ODNsを、 120 μ 1の PBS中の 30 μ 1の DOT APと混合した。
[0071] FITC—及び Alexa Fluor647—標識されたデキストラン、及び LysoTracker B1 ueは、 Molecular Probesから購入し、各々 100 μ gZml及び 1 μ Μの最終濃度で 使用した。クロ口キン、パフイロマイシン及びシクロへキシミドは Sigmaから購入し、各 々 5 g/ml, 30nM及び 100 μ gZmlの最終濃度で使用した。 [0072] 2) DCの調製
骨髄細胞を lOOngZmlヒト Flt3L (PeproTech)と共に、 10%FBSを補充した RP MI1640中で 6日間培養した。回収された細胞を、 pDC特異的なラットモノクローナ ル抗体（120G8 ;非特許文献 23 ; G. Trinchirei氏より提供された）、及び抗ラッ Hg Gマイクロビーズ（Miltenyi Biotec)とともにインキュベートし、 MACSカラムを用い て pDC (陽性に選択された細胞群）と cDC (通り抜けた細胞群）に分離した。 、くつか の実験において、回収された細胞を抗 B220及び抗 CDl lc抗体（BD Bioscience )と共に培養し、 B220— ZCDl lc+ cDC及び BSSO+ZCDl lc^ pDCを FACS D iva (BD Bioscience)を用いて選別した。
[0073] 3)サイト力イン産生量の測定
細胞を 2 X 105細胞 Zmlの濃度で 96ゥエルプレートに播き、種々の試薬で 24時間 刺激した。上清中のサイト力イン濃度を ELISAで測定した。マウス IFN—ひ及び IL — 12p40のための ELISAキットは、各々 PBL Biomedical Laboratories及び TE CHNE Corp.力 購入した。
[0074] RNA分析のために、先に記載されたように (非特許文献 24)全 RNAを調製し、 Lig htCycler及び SYBR Green system (Roche)を用いて定量リアルタイム RT—P CR分析を行った。各個別試料中の j8—ァクチン発現のレベルによってデータを標 準化した。 β—ァクチン、 IFN- a 1、 IFN— j8及び IRF— 7のためのプライマーは、 先行技術文献に記載されて 、るものを使用した (非特許文献 25)。
[0075] 4)遺伝子導入
レンチウィルスベクター pCSII (独立行政法人理化学研究所筑波研究所バイオリ ソースセンター 三好浩之氏より入手）を用いて、 pCSII— YFP— IRF— 7、 pCSII — YFP— IRF— 3及び pCSII— ECFP— MyD88を作成した。 IRF— 7、 IRF— 3及 び MyD88をコードする核酸断片は公知の文献に基づき、各々調製した。実施例に おいて、 Venus (非特許文献 26)と呼ばれる YFP変異体を使用した。レンチウィルス ベクターを、 pMDLgZpRRE (パッケージプラスミド）及び pCMV— VSV—G—RS V - Rev (Rev及び VS V - G発現プラスミド）とともに 293T細胞に導入した。
[0076] トランスフエクシヨンの 48時間後、培養上清中の感染性レンチウィルスを回収した。 RAW264. 7細胞（American Type Culture Collection (ATCC) -TIB71) 又は骨髄細胞をレンチウィルスと共に、各々 24時間及び 72時間培養した。次いで、 形質導入された骨髄細胞をヒト Flt3Lの存在下でさらに 3日間培養することにより、 D Cへ分化させた。いくつかの実験において、 SuperFect Transfection Reagent ( QIAGEN)を用いて、 pCAGGS— YFP— IRF— 3、 pCAGGS— YFP— IRF— 7、 又は pCAGGS— CFP— MyD88 (非特許文献 11)を、 RAW264. 7細胞に導入し た。
[0077] 5)免疫細胞化学
細胞を 4%パラホルムアルデヒドで 15分間固定し、 0. 2% Triton X— 100を浸 透させた。そして、 1%ゥシ血清アルブミンを含む PBS中で抗ーマウス トランスフェリ ン受容体抗体（BD biosciences)とインキュベートした。次いで、 Alexa Fluor 64 7—結合 抗 Rat IgG抗体（Molecular Probes)とさらにインキュベートした。
[0078] 6)イメージング
細胞をガラス底 35—mm組織培養皿（MATSUNAMI GLASS)上で培養した。 Olympus FV— 1000共焦点顕微鏡を用いて共焦点顕微鏡分析を行った。交差励 起を避けるために、逐次走査モードにて二重又は三重カラーイメージを獲得した。 M icroMax512 BFT冷却 CCDカメラ（Roper Scientific)及び Ludl MAC5000 フィルターホイールを装備した Olympus IX— 71倒立顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡 検査を行った。 MetaMorph ソフトウェア（Universal Imaging)を用いて、 CCD力 メラとフィルターホイールの制御、並びに細胞画像データの分析を行った。
[0079] FRET効率の算出は、先に記載されたように（非特許文献 11)行った。
[0080] 実施例 1 骨髄細朐由来の ODC及び cDCにおける COG A及び COG B)の細 本発明者らは先ず、共焦点顕微鏡によって、骨髄細胞の培養によって得られた pD C及び cDCにおける、 Cy— 5—標識 CpG— A(CpG— Aey5)及び Cy— 5—標識 CpG-B (CpG-BCy5)の細胞内輸送 (trafficking)につ!/、て調べた。 D19 (非特許 文献 7)及び ODN1668 (非特許文献 15)を各々 CpG— A及び CpG— Bの代表とし て選択した。結果を図 1 6に示す。 [0081] 図 la及び bは、 CpG— Aey5 (a中、赤）、又は CpG— Bey5 (b中、赤）と 90分 間インキュベートした Flt3L—培養 骨髄由来 pDC (120G8+細胞）の共焦点及び微 分干渉コントラスト（DIC)のイメージを示す。エンドソーム又はリソソームを可視化する ために、細胞を dextranFITC又は LysoTracker (緑）で最後の 10分間インキュベート した。代表的な細胞を図 la、 b及び続く図 2—4に示した。図 la及び b中、赤色は Cp G - ACy5 (図 1 a)又は CpG— BCy5 (図 1 b)の位置、緑色は dextranFITC又は Ly soTrac kerで染色された位置を示す。 CpG ODN (CpG— A又は CpG— B)とデキストラン（ エンドノームのマーカー）又は LysoTracker (リソノームのマーカー）の位置が一致 すると黄色が観察される。
[0082] 図 2は、 pDCを CpG—AFITe及び CpG— Bey5の両方とインキュベートし、次いで、 Ly soTrackerでインキュベートした結果を示す。図 2の左パネル中、 CpG— AFITC、 CpG Bey5及び LysoTrackerの位置は、各々赤色、青色、及び緑色で示されている。
[0083] 図 2の右パネルにおいて、 CpGが LysoTrackerと共局在した細胞の数の平均値を 標準偏差（SD)とともに示した。図 2の右パネルの縦軸は、 LysoTrackerと共局在し た各じ 0の％割合を示す。
[0084] 図 3は、図 1の pDCの場合と同様に骨髄由来 cDC (120G8—細胞）を、 CpG— Aey5 又は CpG— BCy5 (赤）とインキュベートし、 LysoTracker (緑）とインキュベートした結 果を示す。
[0085] 図 4は、レンチウィルスによって IRF— 7YFP (緑）を遺伝子導入した pDC (上パネル） 及び cDC (下パネル）を、 3 M CpG— ACy5と 90分間インキュベートした結果を示 す。
[0086] 図 5は、 IRF— 7YFPをコードするレンチウィルスで遺伝子導入した骨髄細胞における YFPの発現と、 CpG— A又は CpG— Bとの共局在の有無を調べた結果を示す。
[0087] 先ず、骨髄細胞を IRF— 7YFPをコードするレンチウィルスで感染させた。形質導入さ れた骨髄細胞は、ヒト Flt3L存在下でのさらなる 3日間の培養によって、 DC細胞へ分 ィ匕できる。回収された細胞をフィコエリスリンと結合させた抗ー CDl lc抗体で染色し、 FACS Calibarによって分析した。典型的には、 10— 25%の DCが YFPについて 陽性であった（上パネル)。 [0088] 培養骨髄細胞より、 pDC特異的な 120G8抗体及び抗ラット IgG結合マイクロビーズ によって MACSカラムを用いて pDCを除去した細胞を cDCとして用いた。 IRF— 7YFP をコードするレンチウィルス又は陰性コントロールウィルスで感染させた cDCの代表 的なイメージを示す（中パネル）。図 5の下パネルは、 cDC中における IRF— 7及び C pG ODNsの細胞内局在を示す。 cDCを CpG—ACy5又は CpG— BCy5 (赤）で刺激し 、共焦点顕微鏡上で観察した (下パネル)。 CpG— Aey5と CpG— Bey5のいずれも IRF - 7YFPとの共在は観察されな力つた。
[0089] 図 6は、骨髄細胞力も pDC細胞の単離、及び pDC細胞における CpG刺激による IR F- 7 mRNA及び IFN—ひ mRNAの発現誘導を示す。
[0090] Flt3L培養した 6日目の骨髄細胞を抗— Cdl lc及び抗— B220抗体で染色した。
CDl lctotB220+ pDC FACS Divaで精製し、（> 95%純度；右パネル）、 100 gZmlのシクロへキシミド (CHX)の存在下、又は非存在下、図に示した時間 3 M CpG— Aで刺激した。 IRF— 7 mRNA及び IFN— a mRNAの発現レベルを定量 リアルタイム RT—PCRによって検討した（左パネル）。図 6の右パネルに示されたよう に、 pDCにおける IRF— 7 mRNA及び IFN— a mRNAの発現は、 CpG— Α刺 激後 12時間に至るまで持続的に増加した。 IRF— 7、 IFN- a mRNAの発現誘導 はタンパク質合成阻害剤である CHXの存在によって、有意に抑えられた。
[0091] 図 1—6に示した本実施例の結果、 pDC中では、 CpG— Aey5は 90分後においても エンドノームのマーカーであるフルォレセインイソチオシァネート（FITC)—標識デキ ストランとの共局在が観察された力 （図 la)、リソソームマーカーである LysoTracke rとは投与後 5時間後においても共局在を認めなかった (図 la)。反対に、 CpG-BCy5 は 90分後には既に LysoTrackerとの共局在を認めた力 デキストランとの共局在は 認めな力つた（図 lb)。
[0092] CpG— Bey5及び FITC—標識 CpG— Aを pDC培養中に同時に加えたところ、殆ど の細胞において CpG— Bey5が CpG— AFITeと比べ優位に LysoTrackerと共局在した (図 2)。し力しながら、 cDC中では、 90分後には CpG— Aey5及び CpG— Bey5の双方 が LysoTrackerとの共局在を示した（図 3)。この観察は以前の報告と一致する（非 特許文献 16)。 CpG— ACy5はまた、 pDC中のレンチウィルスを用いた遺伝子導入に よって発現された黄色蛍光タンパク質 (YFP)—IRF— 7融合タンパク質 (本明細書 中、「IRF— 7YFP」と呼称することもある）とも共局在を示した。一方、 cDC中で発現さ れた IRF— 7YFPとは同様の共局在は認められなかった（図 4及び図 5)。
[0093] 本実施例の結果から、 TLR9シグナル伝達の時空間制御モデルが考えられる。即 ち、 TLR9に結合した CpG— Aは pDCのエンドソーム小胞に留まり、持続的に MyD 88— IRF— 7— IFN遺伝子誘導経路を活性化するが、 CpG— Bは素早くリソソーム 内へ輸送され、このようなシグナル伝達経路を活性ィ匕することができな 、と 、うモデ ルである。実際、 pDCにおける CpG— A刺激時の IRF— 7と IFN— a mRNAの双 方の誘導は 12時間後でも継続し、そして、これは新規タンパク質合成に依存してい る（図 6)。
[0094] 実施例 2 RAW264. 7細朐における MvD88及び IRF—7の細朐内局在 COG ODNsの蝓送
本実施例では、種々の遺伝子導入がより容易であるマクロファージ系細胞である R AW264. 7細胞を使用して、 CpG ODNs、MyD88及びIRF—7の空間的制御の モデルを検討した。
[0095] まず、 IRF— 7 又は IRF— 3 をシアン蛍光タンパク質で標識した MyD88 (My D88CFP)とともに発現させた。結果を図 7及び 8に示す。
[0096] 図 7は、 RAW264. 7細胞において、レンチウィルスによる遺伝子導入によって、 M yD88CFP (赤)及び IRF - 7YFP (緑；上パネル)又は IRF - 3 (緑；下パネル)を発現さ せ、蛍光顕微鏡によって分析した結果を示す。左パネルは共焦点顕微鏡の写真図 であり、左力 右に各々 YFP、 CFP及びそれらを重ねた像 (マージ像）を示したもの である。マージ像中に示した線に沿った CFP及び YFPの蛍光強度を測定し、グラフ 化した。右のグラフにおける 0及び 1はマージ像において示した 0及び 1に相当する。 IRF— 7YFPの蛍光強度の頂点は MyD88eFPの頂点と重なる力 IRF— 3YFPの頂点は 重ならなかった。
[0097] 図 8は、図 7と同様に調製された RAW264. 7細胞の CFP、 YFP、 FERTイメージ を収集し、 FRET効率（「補正」 FRET[FRETe] ) (corrected FRET)を計算した結 果を示す。 20細胞の平均 FRETeZCFP値を標準偏差と共に示した。 [0098] 図 7に示されたように、 IRF— 7YFPは細胞質中に発現し、 MyD88eFPとともに顆粒状 構造を形成するが、 IRF— 3YFPは形成しない。カロえて、 FRETは、 IRF— 7YFPと MyD 88CFPとの間に優位に観察され（図 8)、このことは、この構造中の IRF— 7と MyD88と の直接結合を示唆する。
[0099] IRF— 7と MyD88との複合体の細胞内局在についてさらに調べた。結果を図 9 1 1に示す。
[0100] 先ず、 MyD88eFP (青）及び IRF— 7YFP (緑）を発現する RAW264. 7細胞を、 Alex a Fluor647標識デキストラン (赤）と 10分間インキュベートした。共焦点顕微鏡によ つて観察した代表的な細胞の結果を図 9に示す。白いボックス内の高倍率像は右下 のパネルに示されている。白い矢は、デキストラン ^647、 MyD88eFP及び IRF— 7YFP の共局在を示している。
[0101] 図 10は、 MyD88eFP (青）及び IRF—7YFP (緑）を発現する RAW264. 7細胞を、 1 μ M LysoTracker (赤）と 90分間インキュベートし、共焦点顕微鏡によって分析し た結果を示す。
[0102] 図 11は、 MyD88eFP及び IRF— 7YFPを発現する RAW264. 7細胞をパラホルムァ ルデヒドで固定し、抗—トランスフェリン受容体 (TfR)抗体で染色し、共焦点顕微鏡 によって観察した結果を示す。白い矢は、 IRF— 7 (緑)、 MyD88 (青)及び TfR (赤） の共局在を示す。
[0103] 図 9— 11の結果で示されたように、 IRF— 7と MyD88の複合体構造は、蛍光標識 されたデキストランと全てではないとしても一部共局在を認める（図 9)。しかし、 Lyso Trackerとは共局在を認めな!/、（図 10)。 IRF— 7と MyD88の複合体構造はまた抗 -トランスフェリン受容体抗体でも染色される（図 11)。これらの結果は MyD88— IR F— 7複合体はエンドソーム小胞に存在することを示唆する。
[0104] 本発明者らはさらに、 RAW264. 7細胞内の CpG— A又は CpG— B輸送を調べた 。先ず、図 12は、 LysoTracker (緑)及び CpG— Aey5 (赤）と 90分間インキュベートし た RAW264. 7細胞の共焦点画像を示す。
[0105] 図 13は RAW264. 7細胞を、 1 M LysoTracker (緑）、並びに 1 μ M CpG— ACy5、 1 M CpG— BCy5、あるいは DOTAPと複合体化した 1 μ M CpG— ACy5 (C pG-A/DOTAP) (赤）と共に図中に示した時間インキュベートし、固定後、落射型 蛍光顕微鏡下で細胞を観察した結果を示して!/、る。
[0106] 図 14は、 MyD88CFP (青）及び IRF—7YFP (緑）を発現する RAW264. 7細胞を、 Cp G— Aey5 (赤)と 90分間インキュベートし、共焦点顕微鏡によって分析した結果を示す 。 RAW264. 7細胞において、 CpG— ACy5と MyD88CFPZlRF— 7YFPとの共局在は 観察されなかった。
[0107] 図 12— 14の結果で示されたよう〖こ、 RAW264. 7細胞内での場合、インキュベー シヨン後 15分ほどから CpG— Aey5と LysoTrackerとの共局在が観察された（図 12及 び図 13参照）。同様の現象が CpG— Bey5でも観察された（図 13)。よって、 RAW264 . 7細胞におけるこれらの ODNの輸送のパターンは、 cDCで観察されるのと同様で ある。 CpG— Aey5は、 MyD88— IRF— 7複合体とは共局在せず（図 14)、そして、 C pG— Aによる IFN— a / j8 mRNAの誘導は RAW264. 7細胞では生じなかった（ 後述参照）。これらの結果は、持続的な TLR9シグナル及びエンドソーム小胞におけ る MyD88— IRF— 7経路の活性化が IFN遺伝子誘導経路の活性ィ匕に重要である、 という上記モデルを更に支持して 、る。
[0108] 実施例 3 DOTAP処理による cDCにおける COG—A蝓送の極作
実施例 2で言及した、持続的な TLR9シグナル及びエンドソーム小胞における My D88— IRF— 7経路の活性化が IFN遺伝子誘導経路の活性ィ匕に重要である、という モデルをさらに裏付けるアプローチとして、本実施例では、 pDCにおける CpG— Aの エンドノームへの輸送に類似するように CpG— A輸送を操作することによって、 cDC においても高レベルの IFN誘導を達成しうるカゝ否かを調べた。本発明者らは脂質 1, 2 -ジォレオイルォキシ 3 トリメチルアンモ -ゥム プロパン（DOTAP)が CpG - ODNの細胞内輸送システムを変化させることを見出した。
[0109] 図 15— 18は、 CpG— Aを DOTAPで処理することによる cDCにおける細胞内輸送 と IFN等の産生を示す。先ず、骨髄細胞由来の cDCを、 CpG— Aey5ZDOTAP (赤 )及び LysoTracker (青）と 80分間インキュベートした。洗浄後、次いで細胞をデキス トラン FITC (緑)と 10分間インキュベートした。代表的な蛍光像及び微分干渉 (Differe ntial interference contrast ;DIC)像を図 15に示した。次いで、 IRF— 7YFP (緑） を発現する cDCを、 CpG— ACy5ZDOTAP (赤）と 90分間インキュベートした。代表 的な蛍光及び DIC像を図 16に示した。 Nは核を示す。 IRF— 7の核移行を伴う細胞 の割合を計測し、 3回の独立した実験の平均値を標準偏差とともに示した (右下パネ ル)。
[0110] DOTAPと複合体化した CpG—Aey5 (CpG-A/DOTAP)で cDCを刺激すると、 LysoTrackerとの共局在は認められず、インキュベーション開始から 90分後であつ てもデキストランとの共局在が認められた（図 15)。さらに、 CpG— Aey5ZDOTAPは cDCにお!/、てレンチウィルスによって発現された IRF— 7YFPとの共局在し、 IRF- 7YF Pの有意な画分が cDCの核中に見出された（図 16)。このことは、この核酸と DOTAP という補助剤の存在により、核酸がエンドノームに留まり cDCにおいても、 TLR9 -M yD88— IRF— 7経路がエンドソーム小胞において活性ィ匕されたことを示唆する。
[0111] 図 17は、 CpG— Aで刺激した cDC又は pDCにおける、 IFN— αタンパク質の発現 濃度 (pgZml)を示す。先ず、 pDC又は cDCを、 DOTAPと複合体を形成した又は 形成していない、種々の濃度の CpG— A又はコントロール GpC ODNで 24時間刺 激した。 ELISAによって培養上清中の IFN— α濃度を測定した。同様に調整した 3 サンプルの平均 + Ζ—標準偏差の結果を示す。 CpG— AZDOTAPでの刺激によ り cDCでも IFN— αタンパク質が産生された (左パネル)。 TLR9を活性化することの できない、 CpG— Α配列中に逆向きの CGダイマーを有する ODN (コントロール GpC
ODN)で刺激した場合は、 V、ずれの細胞でも誘導は観察されなカゝつた（図 17；非 特許文献 3, 7)。また、 pDCにおける CpG— Aによる IFN— α誘導は、 DOTPAによ る増強効果を全く受けな力つた (右パネル)。
[0112] 図 18は、 pG— AZDOTAPで刺激された cDCにおける IRF— 7 mRNA及び IF Ν- α mRNAの相対的な発現量を示す。 Flt3L培養した 6日目の骨髄細胞から F ACS Divaによって CDl lc+B220— cDCを精製し、図に示した時間シクロへキサミ ド（CHX)の存在下又は不存在下で、 3 M CpG— AZDOTAPで刺激した。 IRF - 7¾mFN- a mRNAの発現レベルをリアルタイム RT—PCRによって決定した
[0113] 図 17及び 18に示されたように、 pDCにおいて見られるのと同様に、 CpG— AZD OTAPで刺激された cDCにおいても、高レベルの IFN— α誘導が観察された（図 17 )。併せて、 IRF— 7及び IFN— a mRNAs双方の誘導が認められた（図 18)。 IRF 7及び IFN— a mRNAs双方の誘導は、タンパク質合成阻害剤である CHXの存 在によって、有意に抑えられた。さらに、 DOTAPは、 pDCにおける CpG— Aによる I FN- α誘導に増強効果を全く示さな力つた（図 17)。このことはさらに、核酸刺激に 対し、通常は IFNを産生しない細胞においても、核酸を効率的にエンドノームに留ま るようにする補助剤の存在により、 IFN誘導経路が活性ィ匕されることを示唆する。
[0114] 実施例 4 DOTAPを用いた RAW264. 7細朐中における COG— A輸送の換作
本実施例では、 RAW264. 7細胞において、 DOTAPを用いて ODN輸送の操作 を行った場合の I型 IFNの産生等を調べた。結果を図 19— 22に示す。
[0115] 図 19は、 MyD88eFP (青） Z及び IRF—7YFP (緑）を発現する RAW264. 7細胞を、 CpG-ACy5/DOTAP (赤)と 90分間インキュベートした場合の、代表的な細胞を共 焦点顕微鏡によって分析した結果を示す。
[0116] 図 20は、 3 M CpG— A又は 3 M CpG/DOTAPとのインキュベーションの 1 2時間後、 RAW264. 7細胞力も RNAを調製し、定量リアルタイム RT— PCR分析を 行った結果を示す。縦軸は、各々左のグラフから IFN— β、 IFN- α及び IRF— 7の mRNAの相対的な発現を示す。比較のために、水疱口炎ウィルス（vesicular sto matitis virus； VSV)で刺激した脾臓 pDC中の IFN ~ α / β及び IRF— 7 mRN Aレべノレも示す。
[0117] 図 21は、 CpG—AZDOTAPで刺激された RAW264. 7細胞の細胞内 IFN— α 染色を、先に記載されたように (非特許文献 1)行った結果を示す。具体的には、 RA W264. 7細胞を DOTAPのみ、 CpG— Α (3 M)、又は CpG— Α (3 M) ZDOT APとで 14時間刺激した。ブレフェルディン A (Brefeldin A) (Sigma； 5 μ g/ml)を 培養の最後の 4時間加えた。 4%パラホルムアルデヒドで固定し、 1% FCS及び 0. 1%サポニン（Sigma)を含む PBS中で、ラット抗—マウス IFN— α抗体群（RMMA — 1、PBL Biomedical LaDoratories及ぴクロ ~~ン F18、 hycult Biotechnolog y)の混合物、次いで、 Alexa Fluor488 結合二次抗体（Molecular Probes)に よって染色した。 FACS分析によって発現レベルを測定し、ヒストグラムで示した。 [0118] 図 22は、野生型骨髄由来の CDl lb+B220—細胞を FACSによって精製し、 CpG— A又は CpG— AZDOTAPで刺激し、 ELISAによって IFN— αレベルを測定した結 果を示す。
[0119] 図 19— 21に示したように、 CpG— ACy5/DOTAPと MyD88— IRF— 7複合体との 間の共局在が、じ 0—八 5700丁八？とのィンキュべーション開始から90分後に！^ AW264. 7細胞中で観察され（図 19)、 IFN— a Z jS mRNAsの誘導もこれらの細 胞中で観察された（図 20)。 RAW264. 7細胞中 IFN— α分泌は観察されなかった 力 S (データ示さず）、抗ー IFN— α抗体での細胞内染色によって IFN— αタンパク質 が検出された（図 21)。これはこの細胞系での IFN— αの分泌機能が pDCそれと比 ベ発達していないことを示唆する。いずれにしても、これらの RAW264. 7細胞を用 いた実験結果はさらに、エンドソームにおける TLR9— MyD88— IRF— 7活性ィ匕経 路を介した IFN遺伝子誘導モデルを支持する。さらにこのモデルと合致して、骨髄由 来の CDl lb+B220—細胞でも（pDCを除く骨髄系列細胞）、 CpG— A/DOTAPの 刺激に対し、有意なレベルの IFN— α分泌が観察された（図 22)。
[0120] 実施例 5 DOTAP処理における CPG— B蝓送の極作
本実施例では本発明者らは、 DOTAPと複合体を形成した CpG— B (CpG— BZ DOTAP)に対する pDC及び cDCの応答を研究した。
[0121] 図 23は、 DOTAPに複合体化させた CpG— Bで刺激した cDC又は pDCにおける 、 IFN— αタンパク質の発現濃度 (pg/ml)を示す。 CpG— Bによる刺激は CpG— Aに関する図 17に関して記載したのと同様に行った。
[0122] 図 24は、 pDCにおける CpG— B輸送の用量依存性の挙動を調べた結果である。
骨髄由来の pDCを 1 μ Μ (上パネル）又は 3 Μ (下パネル）の、 CpG— BCy5ZDOT APで刺激した。次いで、デキストラン FITC又は LysoTrackerとともにインキュベートし た。代表的な細胞について、共焦点顕微鏡によって分析した共焦点及び DIC像を示 す。
[0123] じ 0— 700丁八？で刺激された 0 こぉぃて、 CpG— B濃度依存的で強力な I FN— α産生が認められた。また、先に報告されたように高濃度による抑制効果も観 察された（図 23、非特許文献 3)。さらにまた、 CpG— Bey5は最適のリガンド濃度（1 M)においてのみ、 LysoTrackerよりもデキストランに優位に共局在することが観察さ れた（図 24)。
図 24の観察に基づいて本発明者らは、リガンドが DOTAPとともに輸送される際に 、 TLR9に結合した CpG— Bを保持することによって MyD88— IRF7経路の活性ィ匕 に関与することのできる、さらなる因子 (群）が pDC中に存在すると推論する。この推 定因子（群）は、 pDC中で DOTAPなしで、そして cDC中で DOTAPとともに、エンド ソーム中で TLR9と結合した状態の CpG— Aによるシグナル伝達に関与しうる。即ち 、 DOTAPはエンドノームへのリガンド輸送の運命を決定しうる力 さらに未知の因子 (群)もまた、 MyD - 88経路の CpG— TLR— 9媒介エンドソーム活性ィ匕に決定的に 関与する。

Claims

請求の範囲
[1] インターフェロン a及び/又は β (IFN - α / β )の発現誘導を促進する補助剤 をスクリーニングする方法であって、
a)上記補助剤の非存在下では IFN— α / の発現を誘導しない、細胞と核酸ァ ジュバントの系において、当該細胞を核酸アジュバントと、補助剤候補化合物を共に 又は無しでインキュベートし；そして
b— 1)補助剤候補化合物の存在により、核酸アジュバントがエンドソーム小胞に細 胞内移動したことを確認する、あるいは
b— 2)補助剤候補ィ匕合物の存在により、 IFN α Z ι8の発現が誘導されたことを 確認する
c)工程 b— 1)又は b— 2)にお!/、て、核酸アジュバントのエンドソーム小胞への移動 または IFN— α / βの発現誘導が確認された場合に、上記化合物を有効な補助剤 と判断する
ことを含む、上記スクリーニング方法。
[2] 補助剤の非存在下では IFN— α / βの発現を誘導しな!、系における細胞力 コン ベンショナル榭状細胞（cDC)、プラズマサイトイド榭状細胞（pDC)、 RAW細胞、マ クロファージ、ヒト末梢血由来細胞、及び線維芽細胞からなる群から選択される、請求 項 1に記載のスクリーニング方法。
[3] 補助剤の非存在下では IFN— α / βの発現を誘導しな!、系における核酸アジュバ ントが、非自己と認識される核酸である、請求項 1又は 2に記載の方法。
[4] 核酸アジュバントが、非メチル化 CpG オリゴデォキシヌクレオチド（CpG ODN)、 一本鎖 RNA、並びに不活性ィ匕ウィルス又は細菌力ゝらの核酸抽出物カゝらなる群から 選択される、請求項 3に記載の方法。
[5] 核酸アジュバントが、塩基配列 ggtgcatcgatgcaggggggを有する CpG— A、ポリゥリ ジル酸、塩基配列 tcgtcgttcgaacgacgttgatを有する CpG— C、及び塩基配列 tcca tgacgttcctgatgct若しくは tccatggacgttcctgagcgttを す じ ― B; ^らな 群 から選択される、請求項 4に記載の方法。
[6] 工程 b— 1)において、 Toll様受容体 9 (TLR9)、 MyD88、インターフェロン制御因 子 7 (IRF-7)又はデキストランと核酸アジュバントの細胞内共局在が観察される場 合に、核酸アジュバントがエンドソーム小胞へ移動したと確認する、請求項 1ないし 5 の!、ずれか 1項に記載の方法。
[7] 工程 b 2)において、 IFN— aZjSの発現誘導を、細胞中の IFN— a Z j8の mRN
Aの量、あるいは細胞培養上清中の IFN— a ZJ8のタンパク質の濃度を測定するこ とによって確認する、請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の方法。
[8] 請求項 1ないし 7のいずれ力 1項に記載のスクリーニング方法によって得られた、イン ターフェロン a及び/又は β (IFN- α/β)の発現誘導を促進する補助剤。
[9] インターフェロン— a及び/又は β (IFN- α/β)の発現誘導を促進する補助剤 を含む、上記補助剤の非存在下では IFN— a Zj8の発現を誘導しない、細胞と核 酸アジュバントの系において、 IFN- α/ の発現誘導を促進する、免疫促進剤。
[10] インターフェロン α及び/又は β (IFN- α/β)の発現誘導を促進する補助剤 力 陽イオン性脂質である、請求項 9に記載の免疫促進剤。
[11] インターフェロン oc及び/又は β (IFN- α/β)の発現誘導を促進する補助剤 力 1, 2 ジォレオイルォキシ 3 トリメチルアンモ-ゥム一プロパン（DOTAP)で ある、請求項 9又は 10に記載の免疫促進剤。
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