JP5045992B2

JP5045992B2 - 腸管ｍ細胞マーカーとしてのｇｐ２の使用

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Publication number: JP5045992B2
Application number: JP2006331950A
Authority: JP
Inventors: 博司大野; 和也河野; 耕二長谷
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2026-12-08
Also published as: JP2008141995A

Description

本発明は、Ｍ細胞の検出又は同定方法、Ｍ細胞の検出又は同定用試薬又はキット、ＧＰ２ターゲティング分子を含む薬物送達媒体及び医薬などを提供する。

パイエル板（ＰＰ）は、腸関連リンパ組織（gut-associated lymphoid tissue：ＧＡＬＴ）の一つであり、粘膜免疫の重要な開始部位である。粘膜リンパ濾胞は、管腔抗原の取り込み及び経上皮輸送を媒介するＭ細胞を含む特殊な濾胞関連上皮（follicle-associated ephithelium：ＦＡＥ）により覆われている。Ｍ細胞は、管腔抗原の取り込み及び経上皮輸送を媒介することにより粘膜免疫において重要な役割を果たすと考えられているが、抗原の取り込み及び輸送の分子機構は、依然として明らかではない。特に、Ｍ細胞の頂端膜上のエンドサイトーシスレセプターの同定は、この問題の興味深い主題である。

Ｍ細胞のマーカー分子としては、マウスＰＰのＭ細胞に発現するα−Ｌ−フコースを認識する種類のレクチンであるＵｌｅｘｅｕｒｏｐａｅｕｓアグルチニン−Ｉ（ＵＥＡ−１）が知られているものの、ＵＥＡ−１は、盲腸リンパ濾胞、大腸リンパ濾胞等の他のＧＡＬＴ及びヒトのＭ細胞を認識し得ないという問題がある。

ところで、糖タンパク質２（glycoprotein 2：ＧＰ２）は、１）脂質マイクロドメインに局在しているＧＰＩアンカー型タンパク質であること、２）外分泌膵臓の腺房細胞の分泌顆粒膜に発現すること、３）自己オリゴマー化の分子特性を有すること、４）腺房細胞から消化管管腔内に分泌されることが知られている（非特許文献１〜４）。また、ＧＰ２のノックアウト動物も報告されているが、特に表現型の異常は認められず、その機能は全く不明のままである（非特許文献２及び５）。

また、哺乳動物の尿における最も豊富なタンパク質であり、かつＧＰ２と高い相同性（アミノ酸レベルで約５１％の相同性）を有する、腎上皮細胞から分泌されるＴａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌタンパク質（ＴＨＰ）が、大腸菌に対する結合能を有することが報告されている（非特許文献６）。

本発明者らはまた、マウス由来の濾胞関連上皮（ＦＡＥ）及び腸上皮細胞（ＩＥＣ）を用いてトランスクリプトーム解析を行っている（非特許文献７）。

しかしながら、上記先行文献には、ＧＰ２がＭ細胞に特異的に発現している分子であること、特に、ＧＰ２がヒトＭ細胞についての特異的なマーカー分子として使用可能なこと、並びにＧＰ２が任意の種類の組織中のＭ細胞で共通して発現し得ることは記載も示唆もされていない。
Schmidt, K. et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 14315-23. Yu, S. et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 50274-9. Fukuoka, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1992, 89,1189-93. Beaudoin, A. R. et al., J. Histochem. Cytochem., 1991, 39, 575-88. Kobayashi, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 322, 659-64. Pak, J. et a., J. Biol. Chem., 2001, 276, 9924-30. Hase, K. et al., DNA Res., 2005, 12, 127-37.

本発明の一つの目的は、従来のＭ細胞マーカーであるＵＥＡ−１よりも汎用性に優れた、汎Ｍ細胞マーカーとして使用できる分子を提供することである。本発明の別の目的は、Ｍ細胞における管腔抗原の取り込み及び経上皮輸送の機構を解明することにより得られた知見に基づき、医薬及び医薬の開発に有用な手段などを提供することである。

本発明者らは、鋭意検討した結果、１）ＧＰ２がヒト及びマウスの双方のＭ細胞において特異的に発現していること、２）ＧＰ２が、パイエル板におけるＭ細胞のみならず、盲腸リンパ濾胞、大腸リンパ濾胞等の他の組織におけるＭ細胞でも共通して発現していること、３）ＧＰ２が、Ｍ細胞の頂端原形質膜に局在していること、４）ＧＰ２が微生物に結合し得ること、５）ＧＰ２が、Ｍ細胞における微生物抗原の経上皮輸送に関与し得ることなどを見出した。即ち、本発明者らは、種（例、ヒト、マウス）及び組織を超える汎Ｍ細胞マーカーとして使用できる分子（ＧＰ２）を初めて同定することに成功した。本発明者らはまた、ＧＰ２がエンドサイトーシスレセプターとして腸内微生物を取り込むことにより粘膜免疫に関与し得ることなどを明らかにした。
以上に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕ＧＰ２の発現を測定することを含む、Ｍ細胞の検出方法。
〔２〕ヒトＭ細胞の検出方法である、上記〔１〕の検出方法。
〔３〕マウスＭ細胞の検出方法である、上記〔１〕の検出方法。
〔４〕Ｍ細胞を含む腸粘膜由来サンプルにおいてＧＰ２の発現を測定することを含む、Ｍ細胞の同定方法。
〔５〕該腸粘膜由来サンプルが、パイエル板、孤立リンパ小節、あるいは盲腸又は大腸のリンパ濾胞を少なくとも含む、上記〔４〕の同定方法。
〔６〕プライマー、核酸プローブ及び抗体からなる群より選ばれる１以上のＧＰ２測定用手段を含む、Ｍ細胞の検出又は同定用試薬又はキット。
〔７〕ＧＰ２ターゲティング分子を含む薬物送達媒体。
〔８〕ＧＰ２ターゲティング分子が抗体である、上記〔７〕の薬物送達媒体。
〔９〕ＧＰ２ターゲティング分子及び医薬としての有効成分を含む医薬。
〔１０〕該有効成分が抗原である、上記〔９〕の医薬。
〔１１〕ＧＰ２の発現又は機能を調節し得る物質を含む、粘膜免疫の調節剤。
〔１２〕ＧＰ２の発現が調節されたＭ細胞又はそれを含む組織。
〔１３〕Ｍ細胞又はそれを含む組織においてＧＰ２の発現又は機能を測定することを含む、Ｍ細胞におけるエンドサイトーシスの評価方法。
〔１４〕分泌形態のＧＰ２を含む、微生物に対する結合剤。
〔１５〕ＧＰ２及び微生物又はその成分を含む複合体。
〔１６〕以下（ａ）又は（ｂ）のいずれかを含む、哺乳動物における粘膜免疫の評価方法：
（ａ）ＧＰ２の発現が調節された哺乳動物を粘膜免疫の測定に供すること；あるいは
（ｂ）哺乳動物をＧＰ２の発現又は機能の測定に供すること。

本発明の検出又は同定方法は、Ｍ細胞の検出又は同定は勿論のこと、Ｍ細胞の定量、Ｍ細胞が関連し得る疾患の診断、粘膜免疫の調節薬、粘膜免疫の調節作用を有しない所定の医薬の開発に利用することもできる。本発明の検出又は同定方法は、例えば、ＧＰ２をヒトＭ細胞マーカーとして利用することによりヒトＭ細胞の特異的な検出又は同定を初めて実現し得る点において、並びに／あるいはＧＰ２をＭ細胞マーカーとして利用することにより任意の組織中のＭ細胞の特異的な検出又は同定を初めて実現し得る点において、格別顕著な効果を奏する。
本発明の試薬又はキットは、例えば、本発明の検出又は同定方法の簡便な実施に有用であり得る。
本発明の薬物送達媒体又は医薬は、例えば、Ｍ細胞への特異的なターゲティングによる、Ｍ細胞を介した粘膜免疫の調節に有用であり得る。
本発明の調節剤は、例えば、粘膜免疫の調節に有用であり得る。
本発明の細胞又は組織は、例えば、粘膜免疫の調節薬の開発、Ｍ細胞における抗原の取り込み及び輸送の解析、エンドサイトーシス関連遺伝子の探索などに有用であり得る。本発明はまた、本発明の細胞又は組織の利用方法（エンドサイトーシス評価方法）を提供する。
本発明の結合剤は、例えば、微生物の標識、微生物の体外排出の促進、自然免疫に有用であり得る。本発明はまた、これにより形成され得るＧＰ２及び微生物又はその成分を含む複合体を提供する。
本発明による、動物を用いた粘膜免疫の評価方法は、インビボ及びエキソビボにおいて、粘膜免疫の調節薬の開発を可能にするため有用であり得る。

本発明は、Ｍ細胞の検出又は同定方法を提供する。

本発明の検出又は同定方法は、例えば、ＧＰ２の発現を測定することを含み得る。Ｍ細胞は、腸粘膜由来であり得る。従って、本発明の検出又は同定方法は、Ｍ細胞を含む腸粘膜由来サンプルを用いて行われてもよい。Ｍ細胞を含む腸粘膜由来サンプルとしては、例えば、動物から採取されたＭ細胞含有組織（例、小腸、十二指腸、結腸、空腸、回腸、大腸、盲腸の粘膜）、Ｍ細胞又はそれを含む組織の培養物に由来するサンプルが挙げられる。本発明で用いられるサンプルはまた、Ｍ細胞を含むＧＡＬＴ又はその構成組織であり得る。Ｍ細胞を含むＧＡＬＴ又はその構成組織としては、例えば、パイエル板、孤立リンパ小節、大腸、盲腸等のリンパ濾胞、が挙げられる。上記サンプル又はそれに含まれるＭ細胞が由来する動物は、霊長類、齧歯動物等の哺乳動物や鳥類であり得、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリが挙げられる。

ＧＰ２の発現の測定は、ＧＰ２遺伝子の転写産物またはＧＰ２タンパク質を対象として自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＧＰ２遺伝子の転写産物の発現量は、生体サンプルからのtotal ＲＮＡの調製後、ＰＣＲ（例、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）（例えば、WO00/28082参照）、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）（例えば、WO00/56877参照）等の遺伝子増幅法、あるいはノザンブロッティング、マイクロアレイなどにより測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、生体サンプルからの抽出液又は組織切片の調製後、免疫学的手法により測定され得る。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法が挙げられる。ＧＰ２の発現の測定を可能とする上記以外の方法としては、例えば、質量分析法が挙げられる。

本発明の検出又は同定方法は、Ｍ細胞の検出又は同定は勿論のこと、Ｍ細胞の定量にも利用することができる。本発明の検出又は同定方法はまた、Ｍ細胞が関連する疾患の診断に利用することができる。例えば、Ｍ細胞は、炎症性腸疾患（例、クローン病、潰瘍性大腸炎）等の疾患に関与する可能性がある。

本発明の検出又は同定方法はまた、Ｍ細胞数を調節（例、増加、減少）し得る、又はＭ細胞数を変化させ得ない被験物のスクリーニングに利用することができ、Ｍ細胞数を調節し得る、又はＭ細胞数を変化させ得ない被験物の開発、あるいは粘膜免疫を調節し得る被験物の同定を可能とする。従って、本発明の検出又は同定方法は、例えば、（ａ）Ｍ細胞又はそれを含む組織等に被験物を接触させる工程、（ｂ）Ｍ細胞又はそれを含む組織等におけるＧＰ２の発現を測定する工程、（ｃ）Ｍ細胞数を調節し得る、又は変化させ得ない物質を選択する工程を含み得る。Ｍ細胞数を調節し得る物質は、例えば、細菌（例、サルモネラ菌、エルシニア菌）の感染予防（例、Clark, M.A. et al., Infect Immun 1996, 64, 4363-4368; Clark, M. A. et al., Infect. Immun., 1998, 66, 1237-1243.）、粘膜免疫の調節に有用であり得、Ｍ細胞数を変化させ得ない物質は、薬理作用として他の作用を有し、かつ上記作用を有しない所定の医薬の開発に有用であり得る。

スクリーニング方法に供される被験物は、いかなる化合物または組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖および／または環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品、飲料水等が挙げられる。

本発明はまた、Ｍ細胞の検出又は同定用試薬又はキットを提供する。本発明の試薬又はキットは、１以上のＧＰ２測定用手段を含み得る。ＧＰ２測定用手段は、ＧＰ２の発現の測定が可能である限り特に限定されないが、例えば、プライマー、核酸プローブ、抗体が挙げられる。

本発明の試薬又はキットに含まれ得るプライマーは、ＧＰ２遺伝子の増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。例えば、プライマーのサイズは、約１２ｂｐ以上、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１６〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約１８〜３５ｂｐであり得る。また、遺伝子増幅法の種類に応じて必要とされるプライマー数が異なるため、本発明の試薬に含まれ得るプライマー数は特に限定されないが、例えば、本発明の試薬は、２以上のプライマーを含み得る。２以上のプライマーは、予め混合されていても、混合されていなくてもよい。このようなプライマーは、自体公知の方法により作製できる。

本発明の試薬又はキットに含まれ得る核酸プローブは、ＧＰ２遺伝子の検出を可能とする限り特に限定されない。核酸プローブはＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。核酸プローブはまた、１本鎖又は２本鎖のいずれでもよい。核酸プローブのサイズは、ＧＰ２遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば約１５または１６以上、好ましくは約１５〜１０００ｂｐ、より好ましくは約５０〜５００ｂｐである。核酸プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。このような核酸プローブは、自体公知の方法により作製できる。

本発明の試薬又はキットに含まれ得る抗体は、ＧＰ２タンパク質に特異的に結合し得る抗体である限り特に限定されない。例えば、ＧＰ２タンパク質に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態で提供されてもよい。抗体は、自体公知の方法により作製できる。

例えば、ポリクローナル抗体は、ＧＰ２タンパク質あるいはその部分ペプチド（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアタンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。

また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作製できる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。

さらに、本発明で用いられる抗体は、キメラ抗体（chimeric antibody）、ヒト化抗体（humanized antibody）、ヒト型抗体（human antibody）であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4-506458号公報、特開昭62-296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平4-504365号公報、国際出願公開WO94/25585号公報、「日経サイエンス、6月号、第40〜第50頁、1995年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平6-500233号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。例えば、以下のように、本発明で用いられる抗体を医薬として利用する場合、ヒト化抗体およびヒト型抗体が好ましい。

ＧＰ２測定用手段は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供され得る。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。

本発明の試薬又はキットは、ＧＰ２測定用手段に加え、さらなる構成要素を含む形態で提供されてもよい。この場合、試薬又はキットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器に格納された形態で提供され得る。例えば、ＧＰ２測定用手段が標識用物質で標識されていない場合、本発明の試薬又はキットは、標識用物質をさらに含み得る。本発明の試薬又はキットはさらに、ポジティブコントロール（例、ＧＰ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその部分ヌクレオチド、ＧＰ２タンパク質またはその部分ペプチド）を含んでいてもよい。

本発明はまた、ＧＰ２ターゲティング分子を含む薬物送達媒体を提供する。

ＧＰ２ターゲティング分子としては、ＧＰ２を標的とすることができる物質である限り特に限定されないが、例えば、抗体、アプタマーが挙げられる。抗体としては、上述したものが挙げられるが、臨床応用の観点からは、ヒト化又はヒト抗体が好ましい。

本発明で用いられる薬物送達媒体は、ＧＰ２ターゲティング分子と結合可能であり、かつ有効成分を送達できるものである限り特に限定されないが、例えば、リポソーム、ミクロスフェアが挙げられる。ＧＰ２ターゲティング分子は、薬物送達媒体に共有結合又は非共有結合したものであり得る。薬物送達媒体に結合されるべきＧＰ２ターゲティング分子の量は適宜調節できる。

本発明はまた、ＧＰ２ターゲティング分子及び有効成分を含む医薬を提供する。

本発明の医薬は、例えば、有効成分に共有結合又は非共有結合したＧＰ２ターゲティング分子を含み得る。ＧＰ２ターゲティング分子及び有効成分が互いに共有結合している場合、リンカーを介さずに、又は適切なリンカーを介して結合し得る。本発明の医薬はまた、互いに結合していない、ＧＰ２ターゲティング分子及び有効成分を含み得る。この場合、本発明の医薬は、上述したような薬物送達媒体の形態で提供されてもよい。

医薬に含まれ得る有効成分としては、例えば、抗原（例、ワクチンとして用いられ得る、ウイルス、細菌及び寄生虫の抗原）、後述するＧＰ２の発現又は機能を調節し得る物質、薬物が挙げられる。

本発明の医薬はまた、抗原を含む場合、アジュバントをさらに含んでいてもよい。アジュバントとしては、免疫原性を増強し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＢＣＧ、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、Ｍｅｒｃｋ６５、ＡＳ−２、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、デキストラン、ＴＬＲリガンド（例、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＣｐＧ）が挙げられる。

本発明の医薬は、後述する本発明の剤と同様に用いられ得る。例えば、本発明の医薬は、後述する医薬上許容され得る担体を含み得る。

本発明はまた、粘膜免疫の調節剤を提供する。本発明の剤は、ＧＰ２の発現又は機能を調節し得る物質を含み得る。

ＧＰ２は、ヒトＧＰ２（例、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NP_001493参照）又はそのオルソログ（例、マウスＧＰ２については、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：NP_080265参照）、あるいはそれらの変異体であり得る。ＧＰ２のオルソログは特に限定されず、例えば非ヒト哺乳動物（例、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス）に由来するものであり得る。ＧＰ２はそれぞれ、エンドサイトーシス活性を有し得る限り、そのコードするアミノ酸配列において１以上(例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１、２又は３個)のアミノ酸の変異（例、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい（このようなタンパク質が、上記の「変異体」に該当する）。

一実施形態では、本発明の剤は、粘膜免疫の増強剤であり得る。この場合、本発明の剤は、ＧＰ２の発現又は機能を促進し得る物質を含み得る。

ＧＰ２の発現とは、ＧＰ２をコードする遺伝子から翻訳産物（即ち、タンパク質）が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。従って、ＧＰ２の発現を促進する物質は、ＧＰ２の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化およびタンパク質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。なお、本明細書中で使用される場合、ＧＰ２の発現の促進としては、ＧＰ２（タンパク質）自体の補充をも含むものとする。

ＧＰ２の発現又は機能を促進する物質としては、例えば、ＧＰ２及びその発現ベクターが挙げられる。

ＧＰ２は、天然タンパク質又は組換えタンパク質であり得る。ＧＰ２は、自体公知の方法により調製でき、例えば、ａ）ＧＰ２を含む生体試料からＧＰ２を回収してもよく、ｂ）宿主細胞（例、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）にＧＰ２発現ベクターを導入することにより形質転換体を作製し、該形質転換体により産生される構成因子を回収してもよく、ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系によりＧＰ２を合成してもよい。ＧＰ２は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、ＧＰ２抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。

別の実施形態では、本発明の剤は、粘膜免疫の抑制剤であり得る。この場合、本発明の剤は、ＧＰ２の発現又は機能を抑制し得る物質を含み得る。ＧＰ２の発現を抑制する物質は、ＧＰ２の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化およびタンパク質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。

ＧＰ２の発現を抑制する物質としては、例えば、アンチセンス核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、あるいはそれらのキメラ分子）、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸（細胞内に導入されることによりＲＮＡｉ効果を誘導し得るポリヌクレオチド、好ましくはＲＮＡ：例、ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、並びにこれらをコードする核酸を含む発現ベクターが挙げられる。

ＧＰ２の機能を抑制する物質としては、例えば、上述したような抗体若しくはドミナントネガティブ変異体又はそれらの発現ベクター、あるいは低分子化合物が挙げられる。

ＧＰ２のドミナントネガティブ変異体は、ＧＰ２に対する変異の導入によりその活性が低減したものである。該ドミナントネガティブ変異体は、天然のＧＰ２と競合することで間接的にその機能を阻害することができる。変異としては、例えば、機能性部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。

ＧＰ２の発現又は機能を調節する物質が、核酸分子又はタンパク質分子である場合、本発明の剤は、核酸分子又はタンパク質分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。本発明の発現ベクターが含み得るプロモーターは、その制御下にある因子の発現を可能とする限り特に限定されず、因子の種類により適宜選択され得るが、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）が挙げられる。また、使用されるプロモーターとしては、Ｍ細胞に特異的なプロモーター（例、ＧＰ２の天然プロモーター）を用いてもよい。

発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含むこともできる。

発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは、プラスミド又はウイルスベクターであり得るが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。

本発明の剤は、ＧＰ２の発現又は機能を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。

非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。

本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約５．０ｇである。本発明の剤は、上述した本発明の医薬と同様に用いられ得る。例えば、本発明の医薬は、上述したアジュバントを含み得る。

本発明の剤は、例えば、医薬として有用である。本発明の剤が医薬として使用される場合、例えば、粘膜免疫の異常を伴う疾患の予防・治療、あるいは粘膜免疫の増強が所望される疾患又は状態に使用し得る。粘膜免疫の異常を伴う疾患としては、炎症性腸疾患（例、クローン病、潰瘍性大腸炎）、食物アレルギーが挙げられる。粘膜免疫の増強が所望される疾患又は状態としては、例えば、癌、感染症（例、細菌等の微生物、ウイルス又は寄生虫による感染症）が挙げられる。本発明の剤が適用され得る被験体は、上記疾患又は状態の２以上を併発している、又は併発する危険性がある被験体であってもよい。

本発明はまた、ＧＰ２の発現が調節されたＭ細胞又はそれを含む組織を提供する。本発明の細胞又は組織は、上述した哺乳動物に由来し得る。本発明の細胞は、上述した組織に由来し得る。本発明の組織は、上述した組織と同様であり得る。

本発明の細胞又は組織は、例えば、ＧＰ２の発現が増強された、換言すれば、ＧＰ２遺伝子が導入された細胞又は組織であり得る。導入されるべきＧＰ２遺伝子は特に限定されない。例えば、ＧＰ２遺伝子と、それが導入される細胞又は組織は、同種又は異種の哺乳動物にそれぞれ由来し得る。ＧＰ２はまた、非変異体又は変異体であり得る。ＧＰ２の変異体としては、上述したようなものが挙げられるが、例えば、別のタンパク質（例、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質）との融合物、ＧＰ２タンパク質に対するプロテアーゼによる切断に耐性を有するように変異が導入された改変タンパク質、所定のドメインを欠く欠失体（例、実施例参照）もまた含まれる。本発明の細胞又は組織はまた、ＧＰ２の発現が抑制された、例えば、ＧＰ２遺伝子が破壊された、又はＧＰ２遺伝子の発現がトランス作用性因子により抑制された、細胞又は組織であり得る。

本発明の細胞は、単離及び／又は精製されたものであり得る。本発明の細胞は、ＧＰ２の発現の調節（例、促進、抑制）により、エンドサイトーシス能が調節された細胞であり得る。本発明の細胞は、ＧＰ２の発現が一過的に調節された細胞、又は当該発現が恒常的に調節された細胞（例、ホモ接合性又はヘテロ接合性欠損細胞、あるいはゲノムに遺伝子が導入された細胞等のゲノム改変細胞）であり得る。本発明の細胞は形質転換体又は非形質転換体であり得る。本発明の細胞はまた、細菌等の微生物又はその成分で処理された、又は処理されていない細胞であり得る。

本発明の細胞は、例えば、ＧＰ２の発現又は機能を調節し得る物質でＭ細胞を処理することにより作製できる。本発明の細胞はまた、遺伝子導入動物、遺伝子欠損（いわゆるノックアウト）動物からＭ細胞を単離及び／又は精製することにより作製できる。例えば、ＧＰ２ノックアウト動物（例、Yu, S. et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 50274-9.; Kobayashi, K. et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 322, 659-64.参照）が公知であるので、本発明では、このような動物から本発明の細胞及び組織を調製できる。

本発明の細胞は、例えば、ａ）上述の疾患又は状態の予防、治療及び／又は改善薬の開発（例、本発明のスクリーニング方法での使用）、ｂ）Ｍ細胞における抗原の取り込み及び輸送（即ち、エンドサイトーシス）の解析、ｃ）エンドサイトーシス関連遺伝子の探索などに有用であり得る。

本発明はまた、Ｍ細胞又はそれを含む組織においてＧＰ２の発現又は機能を測定することを含む、Ｍ細胞におけるエンドサイトーシスの評価方法を提供する。ＧＰ２の発現の測定は、上述のように行うことができる。ＧＰ２の機能の測定は、例えば、後述する実施例に記載されるように、蛍光標識等された抗原又は抗原模倣物（例、ＧＰ２に対する抗体）を用いて蛍光顕微鏡下で行うことができる。勿論、当該技術分野で公知のエンドサイトーシス評価方法（例、Ｆｃレセプター、Ｃ型レクチンレセプター、及びＴｏｌｌ様レセプター等のレセプターによる抗原取り込み及び輸送の評価方法と同様の方法）を利用して、ＧＰ２の機能を測定することもできる。本評価方法は、例えば、Ｍ細胞におけるエンドサイトーシスを調節し得る、又は調節し得ない物質のスクリーニングに有用であり得る。従って、本方法は、例えば、被験物がＭ細胞におけるＧＰ２の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む方法であり得る。より詳細には、本方法は、（ａ）Ｍ細胞又はそれを含む組織等に被験物を接触させる工程、（ｂ）Ｍ細胞におけるＧＰ２の発現又は機能を測定する工程、（ｃ）Ｍ細胞におけるエンドサイトーシスを調節し得る、又は調節し得ない物質を選択する工程を含んでいてもよい。例えば、Ｍ細胞におけるエンドサイトーシスを調節し得る物質は、粘膜免疫の調節に有用であり得、Ｍ細胞におけるエンドサイトーシスを変化させ得ない物質は、薬理作用として他の作用を有し、かつ粘膜免疫調節作用を有しない所定の医薬の開発に有用であり得る。

本発明はまた、被験物（例、上述したもの、及び微生物由来の試験抗原）がＧＰ２に結合するか否かを測定することを含む、ＧＰ２ターゲティング分子のスクリーニング方法を提供する。被験物のＧＰ２への結合の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、免疫学的手法（例、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴を利用する相互作用解析法、ツーハイブリッドシステムが挙げられる。

本発明はまた、分泌形態のＧＰ２を含む、微生物に対する結合剤を提供する。ＧＰ２は、プロテアーゼにより切断されて分泌形態となり得ることが知られている（例、Fritz, B. A. et al., Am. J. Physiol., 1996, 270, G176-83参照）。従って、本発明の結合剤は、このような切断されたＧＰ２を含むものであり得る。微生物は、ＧＰ２が結合し得るものである限り特に限定されないが、例えば、大腸菌等の細菌、真菌、酵母が挙げられる。また、ＧＰ２が結合し得る限り、微生物のみならず、ウイルス、寄生虫等の外来異物に対しても同様に応用することができる。本発明の結合剤は、例えば、微生物の標識、微生物の体外排出の促進、自然免疫に有用であり得る。

本発明はまた、ＧＰ２及び微生物又はその成分を含む複合体を提供する。本発明の複合体が含み得る微生物の成分は、ＧＰ２に対する結合能を有するもの（即ち、抗原）であり得る。ＧＰ２は自己オリゴマー能を有するので、本発明の複合体は、ＧＰ２がオリゴマー化して、高次複合体を形成していてもよい。本発明の複合体は、例えば、ＧＰ２を微生物又はその成分と接触させて、ＧＰ２及び微生物又はその成分を含む複合体を得ることにより作製できる。本発明はまた、このような複合体の製造方法を提供する。

本発明はまた、動物を用いた粘膜免疫の評価方法を提供する。本方法は、インビボ及びエキソビボで行うことができる。本方法は、例えば、（ａ）ＧＰ２の発現が調節された動物を粘膜免疫の測定に供すること、あるいは（ｂ）動物を、ＧＰ２の発現又は機能の測定に供することを含み得る。動物は上述したものと同様であり得るが、粘膜免疫に異常をきたす動物（例、粘膜免疫能が低下した動物）であってもよい。例えば、本方法は、動物に被験物を投与し、被験物が投与された動物を粘膜免疫の測定に供し、被験物が粘膜免疫を調節し得るか否かを評価することを含み得る。本方法はまた、動物に外部刺激を与え、外部刺激が与えられた動物を粘膜免疫の測定に供し、外部刺激が粘膜免疫を調節し得るか否かを評価することを含み得る。外部刺激は被験物投与以外の任意の刺激（例、触覚、聴覚、視覚等に関連する刺激）であり得る。粘膜免疫の測定は、例えば、粘膜組織におけるＩｇＡ量、ムチンや抗菌ペプチド量等の測定に基づき行われ得る。本方法は、例えば、粘膜免疫を調節し得る、又は調節し得ない被験物又は外部刺激のスクリーニングに有用であり得る。

本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。

（方法）
１）動物
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＬＥＡＪａｐａｎから購入し、６〜１０週齢にて実験で使用するまで、理研動物施設において、病原体フリーの特定条件下で維持した。全ての動物実験は、理研横浜研究所の動物研究委員会により認可された。

２）ｃＤＮＡクローン及びプラスミド構築
マウス及びヒトＧＰ２の組換えタンパク質を産生するため、Ｃ末端膜貫通領域又はＺＰドメイン欠失ＧＰ２（それぞれ、ＧＰ２（ΔＴＭ）又はＧＰ２（ΔＺＰ））に対応するｃＤＮＡを、ＲＩＫＥＮＦＡＮＴＯＭクローン又はヒトＦＡＥからそれぞれ増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、各遺伝子に対する特異的なプライマーを用いて行った。プライマーの配列は以下の通りである。
マウスＧＰ２（ΔＴＭ）（ｍＧＰ２（ΔＴＭ））
5’- GAAGATCTACCATGAAAAGGATGGTGGGTT-3’（フォワード：配列番号１）
5’- CCGCTCGAGTGTAGTGTGGGGAGTCCCC-3’ （リバース：配列番号２）
ヒトＧＰ２（ΔＴＭ）（ｈＧＰ２（ΔＴＭ））
5’- CGCGGATCCACCATGGAAAGGATGGTGGGC-3’（フォワード：配列番号３）
5’- CCGCTCGAGTCCATTCATGACACCGGGAGA-3’（リバース：配列番号４）
ｍＧＰ２（ΔＺＰ）
5’- GAAGATCTACCATGAAAAGGATGGTGGGTT-3’（フォワード：配列番号５）
5’- CCGCTCGAGCAGAAGAGGCTGCAAACTCTG-3’（リバース：配列番号６）
得られたｃＤＮＡフラグメントを、ヒトＩｇＧ_１のＦｃセグメントをコードするフラグメントを含有する、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の改変物（ｐｃＤＮＡ３−Ｆｃ）のＢａｍＨ１／ＸｈｏＩクローニング部位に挿入した。マウス及びヒトＧＰ２（ＧＰ２−Ｎ）のＮ末端配列を、各遺伝子についての特異的なプライマーを用いて、ＧＰ２（ΔＴＭ）と同様に調製した。プライマーの配列は以下の通りである。
ｍＧＰ２
5’-GAAGATCTCGATTCATCAGTTGCATGGTG-3’ （フォワード：配列番号７）
5’- CCGCTCGAGGAAACCCATACCTCCCAGCA-3’（リバース：配列番号８）
ｈＧＰ２
5’- CGCGGATCCGCGATAAAAACATGAGCGGC-3’（フォワード：配列番号９）
5’- CCGCTCGAGCTCTCCAGAATGTTCCTGCAG-3 （リバース：配列番号１０）
得られたｃＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩクローニング部位に挿入した。

３）組換えヒト又はマウスＧＰ２タンパク質の調製
ヒト胎児性腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞にＧＰ２（ΔＴＭ）又はＧＰ２（ΔＺＰ）／ｐｃＤＮＡ３−Ｆｃプラスミドベクターで一過的にトランスフェクトし、５％ＣＯ_２インキュベータ中で３７℃にて約１０日間培養した。培養培地中の分泌組換えタンパク質を、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）プロテインＡアフィニティーカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。

４）ＦＡＥ及びＩＥＣの単離
ＦＡＥ及びＩＥＣを、既報（Hase, K. et al., DNA Res., 2005, 12, 127-37）に記載されるように単離した。簡潔には、ＰＰを小腸から剥離し、３０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を含有するＨＢＳＳ中に浸した。室温での２０分間のインキュベーション後、実体顕微鏡（ＭＺ１２．５；ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）下で細針を用いた操作によりＦＡＥを単離した。ＩＥＣもまた、ＰＰ除去後の小腸の小片から同様の様式で単離した。

５）定量的ＰＣＲ解析
マウス及びヒトＧＰ２遺伝子発現を、ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（登録商標）（ＴａＫａＲａ）及び既報（Hase, K. et al., DNA Res., 2005, 12, 127-37）に記載されるような特異的なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲにより調べた：
ｍＧＰ２
5’-GATACTGCACAGACCCCTCCA-3’ （フォワード：配列番号１１）
5’-GCAGTTCCGGTCATTGAGGTA-3’ （リバース：配列番号１２）
ｈＧＰ２
5’-GTTGAGTCCGTGCTGTATGTGG-3’（フォワード：配列番号１３）
5’-TCTGAACTGAGAACCGGCTTTC-3’（リバース：配列番号１４）
ＧＰ２遺伝子の発現レベルを、各組織におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現によりノーマライズし、データをＩＥＣに対するＦＡＥの倍の変化として表した。

６）インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）
ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを、ＸｈｏＩ又はＢａｍＨＩにより消化されたマウス及びヒトＧＰ２−Ｎ／ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターをそれぞれ鋳型として用いて、Ｔ７又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でのインビトロ転写により調製した。ＩＳＨを、既報（Hase, K. et al., DNA Res., 2005, 12, 127-37）により記載されるように、製造業者の使用説明書（ＶｅｎｔａｎａＪａｐａｎ）に従って、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）自動化ＩＳＨシステム及びＲｉｂｏＭａｐキットで行った。簡潔には、ＰＰの４％の緩衝化ホルマリン固定切片を、脱パラフィン処理し、プロテアーゼで処理し、５０ｎｇのｍＧＰ２特異的アンチセンスプローブ又はコントロールセンスプローブと６５℃で６時間ハイブリダイズさせた。次いで、切片を、ビオチン標識抗ジゴキシゲニンＡｂ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と３７℃で２０分間インキュベートし、続いてアルカリホスファターゼ・コンジュゲート・ストレプトアビジンと３７℃で１６分間インキュベートした。シグナルを、ＢｌｕｅＭａｐＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質キット（ＶｅｎｔａｎａＪａｐａｎ）で検出し、切片を、Nuclear Fast Redで対比染色した。
ヒトＧＰ２（ｈＧＰ２）のＩＳＨ解析については、内視鏡生検又は外科切片から得たヒト被験体のリンパ濾胞を含有する回腸末端の非炎症部位を使用した。生検サンプルを、４％緩衝化ホルマリンで固定し、マウスサンプルについて上述したようなｈＧＰ２特異的アンチセンスプローブ又はコントロールセンスプローブを用いてハイブリダイズさせた。

７）抗体作製
ａ）ウサギ抗ＧＰ２ポリクローナル抗体
合成ペプチド（マウスＧＰ２アミノ酸配列中の１５４〜１６９番目：CSEELGEYHVYKLQGT（配列番号１５）をウサギに免疫し、得られた血清からプロテインＡカラムを用いて精製を行った。
ｂ）ラット抗マウスＧＰ２モノクローナル抗体
マウスＧＰ２のアミノ酸末端側２２４アミノ酸（配列番号１６）とヒトＩｇＧＦｃ領域との融合タンパク質を培養細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）に発現させ、プロテインＡカラムを用いてタンパク質を精製することにより抗原タンパク質の大量調製を行った。この抗原をラットに免疫した後、脾臓由来のＢリンパ球とミエローマ細胞を融合させることでマウスＧＰ２特異的な抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。モノクローナル抗体の大量調製は、ハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に注射した後、得られた腹水をプロテインＧカラムで精製することにより行った。

８）免疫蛍光染色
ＰＰの凍結切片の免疫蛍光染色については、切片を、パラホルムアルデヒド（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で固定し、５％正常ヤギ血清／ホスフェート緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と共に室温で３０分間インキュベートした。ＧＰ２発現を、４℃での一晩の２．５μｇ／ｍｌラット抗マウスＧＰ２ｍＡｂ（クローン２Ｆ１１−Ｃ３）、続いて室温で１時間の０．５μｇ／ｍｌＡｌｅｘａ４８８・コンジュゲート・抗ラットＩｇＧＡｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出した。Ｍ細胞を、１０μｇ／ｍｌローダミン標識Ｕｌｅｘｅｕｒｏｐａｅｕｓアグルチニン−１（ＵＥＡ―１）（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色し、最終的にＤＡＰＩで対比染色した。パラフィン切片の免疫蛍光染色については、孤立リンパ小節、盲腸リンパ濾胞、大腸リンパ濾胞の１％硫酸亜鉛／４％ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−ＡｌｌａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）固定切片（５μｍ）を脱パラフィン処理し、再水和させ、ＰＢＳ中３％Ｈ_２Ｏ_２で室温にて２０分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を、ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清及び０．５％ブロッキング緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）と共に室温で３０分間、次いで抗マウスＧＰ２ｍＡｂと共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体の結合を、チラミド−フルオレセインイソチオシナネート（ＦＩＴＣ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で可視化した。試料を、蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳＢＸ５１）で解析した。ホールマウント染色については、ＰＰを腸から切り出し、パラホルムアルデヒド（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に４℃で１時間固定し、４℃で１時間０．１％サポニン／０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳを用いて透過処理した。ＧＰ２発現を、凍結切片の染色と同じ様式において検出した。

９）細菌結合アッセイ
細菌結合アッセイについては、０．０６５−２００μｇ／ｍｌの組換えマウス及びヒトＧＰ２（ΔＴＭ）―Ｆｃタンパク質を添加し、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート（ＮＡＧＥＬ）中で４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間ブロッキングし、次いで固定した組換えタンパク質を、ＰＢＳ中０．１％ＮａＮ_３中において、１×１０^６の大腸菌株Ｃ２５又と共に室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳでの５回の洗浄後、ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐＤＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、結合ＤＮＡから抽出した。１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）のコピー数を、ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（登録商標）（ＴａＫａＲａ）及びユニバーサル１６ＳｒＤＮＡについての特異的プライマー（Greisen K. et al., J Clin. Microbiol., 1994, 32, 335-351）を用いたリアルタイムＰＣＲにより定量した。
ユニバーサル１６ＳｒＤＮＡ
5’-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3’（フォワード：配列番号１７）
5’-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3’ （リバース：配列番号１８）

１０）結紮腸ループアッセイ
マウスを、アバチン（２．５ｍｌのｔ−アミルアルコール中５ｇトリブロモエタノール；２００ｍｇ／ｋｇ動物重量）で麻酔し、アッセイの間、３７℃の温パッド上で暖め続けた。１×１０^６のＦＩＴＣ標識大腸菌株Ｃ２５を、結紮腸ループに注入した。注入１時間後、ＰＰを腸から切り出し、ホールマウント染色の方法において記載されるように免疫染色した。試料を、ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎデコンボリューション顕微鏡（ＳＥＫＩＴｅｃｈｎｏｔｒｏｎＣｏｒｐ）により観察した。

実施例１：Ｍ細胞におけるＧＰ２遺伝子の発現
腸では、Ｍ細胞、及びマウス小腸の固有層に在留し、管腔抗原を直接採取する経上皮樹状突起を形成するＣＸ３ＣＲ１発現樹状細胞（ＤＣ）は、管腔抗原の重要なサンプリング部位である（Niess, J. H. et al., Science, 2005, 307, 254-8）。ＤＣにおけるレセプター（例、Ｆｃレセプター、Ｃ型レクチンレセプター、及びＴｏｌｌ様レセプター）媒介抗原取り込みの機構は、以前の研究において十分に解析されているが、Ｍ細胞のものは依然として不明なままである。本発明者らは、Ｍ細胞に特異的に発現しているこのような遺伝子として、外分泌膵臓の腺房細胞の分泌顆粒膜に発現することが知られ、膵液で腸管に分泌されているＧＰＩアンカー型膜タンパク質である糖タンパク質２（ＧＰ２）遺伝子（Beaudoin, A. R. et al., J. Histochem. Cytochem., 1991, 39, 575-88）を同定した。Ｍ細胞におけるＧＰ２遺伝子の特異的な発現を確認するため、本発明者らは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）及びインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を調べた。ＧＰ２遺伝子は、ＦＡＥに専ら発現しており（図１）、マウスＰＰのＭ細胞に発現するα−Ｌ−フコースを認識する種類のレクチンであるＵｌｅｘｅｕｒｏｐａｅｕｓアグルチニン−Ｉ（ＵＥＡ−１）と共染色された（図２）。マウスと同様に、Ｍ細胞におけるＧＰ２遺伝子の限定的な発現がヒトＰＰでも確認された（図３）。さらに、脳、舌、肝臓、肺、唾液腺、腎臓、心臓、精巣、胸腺、脾臓、胃、ＦＡＥ等の組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを、リアルタイムＰＣＲにより確認したところ、これらの組織ではＧＰ２ｍＲＮＡは発現していないか、又は殆ど発現しておらず、ＦＡＥでのＧＰ２ｍＲＮＡ発現は、他の組織での発現に比し顕著なものであった。

実施例２：Ｍ細胞におけるＧＰ２タンパク質の発現及び細胞内局在
ＧＰ２タンパク質の発現を確認するため、本発明者らは、マウスＧＰ２（ｍＧＰ２）に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体を作製した。イムノブロッティング及び免疫蛍光染色では、約７５ｋＤａのｍＧＰ２が、ＦＡＥにのみ発現しており（図４）、ＩＳＨの結果と同様に、ＵＥＡ−１陽性Ｍ細胞において最も免疫染色された（図５、左側の一連のパネル）。さらに、ＧＰ２は、腺房細胞の結果から予期されたように、Ｍ細胞の頂端原形質膜に局在していた。これらの知見は、ＧＰ２がヒト及びマウスの双方のＰＰにおけるＭ細胞特異的マーカー分子であることを初めて実証する。ＰＰは、腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）であるが、孤立リンパ小節、盲腸リンパ濾胞、大腸リンパ濾胞等の他のＧＡＬＴもまた存在する。しかしながら、これらのＧＡＬＴでは、Ｍ細胞の存在及び管腔抗原の経上皮輸送は既に示されている（Gebert, A. et a., Anat. Rec., 1995, 241, 487-95.; Liebler, E. M. et al., Am. J. Vet. Res., 1995, 56, 725-30.）ものの、異なるＧＡＬＴにおいてＭ細胞が共通分子を発現するか否かは未知である。さらに、ＵＥＡ−１は、以前からＭ細胞マーカーとして使用されているが、ＵＥＡ−１は、盲腸リンパ濾胞、大腸リンパ濾胞及びヒトＰＰ上の正常な腸細胞からＭ細胞を区別し得なかった。この問題は、マウスＰＰにおける膜の異なるグリコシル化により引き起こされる。これらの疑問に取り組むため、抗ＧＰ２抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡により観察した。ＧＰ２は、孤立リンパ小節、大腸リンパ濾胞、盲腸リンパ濾胞のＦＡＥでも発現しており（図５、右側の一連のパネル）、孤立リンパ小節ではＵＥＡ−１との共染色が確認された。大腸および盲腸リンパ濾胞では、ＧＰ２のような特異性はないもののパイエル板のＭ細胞に発現が確認されているケモカインのＣＣＬ９（未発表データ）がＧＰ２陽性細胞に発現することを確認した。これらの結果は、ＧＰ２が組織及び種を超える汎Ｍ細胞マーカー分子であることを示す。

実施例３：ＧＰ２は細菌に対する結合能を有する
Ｍ細胞の管腔表面におけるＧＰ２発現は、幾つかの物質に対する抗原レセプターの潜在的役割を示唆する。そこで、本発明者らは、腸内微生物がＧＰ２に対するリガンドとしての潜在的な候補であると推測した。この仮説を支持するものとして、哺乳動物の尿における最も豊富なタンパク質であり、かつＧＰ２と高い相同性（アミノ酸レベルで約５１％の相同性）を有する、腎上皮細胞から分泌されるＴａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌタンパク質（ＴＨＰ）が、大腸菌に対する結合能を有することが既に示されている（Pak, J. et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 9924-30）。この特性に基づいて、ＴＨＰは、尿管を介して侵入した細菌の除去に対する役割を有することが示唆されている。ＧＰ２及び細菌の相互作用を調べるため、マイクロタイタープレートに固相化された０．０６５−２００μｇ／ｍｌの濃度の組換えＧＰ２を、大腸菌Ｃ２５とインキュベートし、細菌１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）量に基づいたｑＰＣＲにより細菌数を定量した。その結果、大腸菌の結合数は、６．５μｇ／ｍｌのｍＧＰ２まで用量依存的に増加したが、大腸菌は、全ての濃度のコントロールヒトＩｇＧ−Ｆｃタンパク質に結合し得なかった（図６）。これらの結果は、Ｍ細胞の管腔表面上のＧＰ２が細菌に結合することを示唆する。

実施例４：ＧＰ２は、Ｍ細胞における細菌成分のエンドサイトーシスレセプターである
エンドサイトーシスレセプターについてのＧＰ２の役割を調べるため、細菌取り込みを、腸管ループアッセイにより調べた。大腸菌Ｃ２５を蛍光イソチオシナネート（ＦＩＴＣ）で標識し、パイエル板を含む結紮腸管ループの管腔に注入し、続いてホールマウント染色によりＭ細胞を可視化した。その結果、大腸菌Ｃ２５の細胞膜画分と考えられる物質が取り込まれ、Ｍ細胞の基底側にトランスサイトーシスされた。それは、Ｍ細胞ポケットの空間にさらに輸送された。細胞質領域では、Ｃ２５の細胞膜画分は、小胞中のＧＰ２と共局在していた。ＧＰ２を介したエンドサイトーシスは、抗ＧＰ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いたループアッセイとその取り込みにより確認された。管腔内に注入したｍＡｂは、ＧＰ２の管腔表面に結合し、一部はエンドサイトーシスを受け大腸菌Ｃ２５と同様に、細胞質領域中の小胞として観察された。抗体処理の際に起こるＧＰ２のクロスリンクは、細菌がＧＰ２と結合した場合も同様に引き起こされると考えられる。これらの結果は、ＧＰ２がＭ細胞における細菌成分の新たなエンドサイトーシスレセプターであることを示唆する。

ＦＡＥにおけるマウスＧＰ２ｍＲＮＡの特異的発現を示す図である。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。ＦＡＥ：濾胞関連上皮（follicle-associated ephithelium）ＩＥＣ：腸上皮細胞（intestinal epithelial cell）マウス腸粘膜由来サンプルにおけるＧＰ２ｍＲＮＡ及びＵＥＡ−１（既知のＭ細胞マーカー）のインサイチュハイブリダイゼーションによる共染色を示す図である。ヒトパイエル板（ＰＰ）におけるＧＰ２ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションによる染色を示す図である。ＦＡＥにおけるマウスＧＰ２タンパク質の発現を確認するイムノブロッティングを示す図である。マウスＧＰ２タンパク質の免疫染色を示す図である。左上：マウスパイエル板におけるＧＰ２の染色左上から２番目：上記と同一切片でのＵＥＡ−１による染色左上から３番目：上記と同一切片での核の染色左下：上記３つを重ね合わせた画像右上：マウス孤立リンパ小節におけるＧＰ２およびＵＥＡ−１の染色右上から２番目：大腸リンパ濾胞におけるＧＰ２の染色右下：盲腸リンパ濾胞におけるＧＰ２の染色マウスＧＰ２タンパク質の大腸菌に対する結合を示す図である。■：マウスＧＰ２タンパク質◆：コントロールヒトＩｇＧ−Ｆｃタンパク質

Claims

Ｍ細胞を含む腸粘膜由来サンプルにおいてＧＰ２の発現を測定することを含む、Ｍ細胞の検出方法。
ヒトＭ細胞の検出方法である、請求項１記載の検出方法。
マウスＭ細胞の検出方法である、請求項１記載の検出方法。
Ｍ細胞を含む腸粘膜由来サンプルにおいてＧＰ２の発現を測定することを含む、Ｍ細胞の同定方法。
該腸粘膜由来サンプルが、パイエル板、孤立リンパ小節、あるいは盲腸又は大腸のリンパ濾胞を少なくとも含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
ＧＰ２遺伝子に特異的に結合し得るプライマー又は核酸プローブ及びＧＰ２タンパク質に特異的に結合し得る抗体からなる群より選ばれる１以上のＧＰ２測定用手段を含む、Ｍ細胞の検出又は同定用試薬又はキット。
Ｍ細胞で発現するＧＰ２に対するＧＰ２ターゲティング分子を含む薬物送達媒体。
ＧＰ２ターゲティング分子が抗体である、請求項７記載の薬物送達媒体。
Ｍ細胞で発現するＧＰ２に対するＧＰ２ターゲティング分子及び医薬としての有効成分を含む医薬。
該有効成分が抗原である、請求項９記載の医薬。
Ｍ細胞でのＧＰ２の発現又は機能を調節し得る物質を含む、粘膜免疫の調節剤。
ＧＰ２の発現が調節された組換えＭ細胞又はそれを含む組織。
エンドサイトーシスを調節し得る物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）Ｍ細胞又はそれを含む組織等に被験物を接触させる工程、
（ｂ）Ｍ細胞におけるＧＰ２の発現又は機能を測定する工程、及び
（ｃ）Ｍ細胞におけるエンドサイトーシスを調節し得る物質を選択する工程を含む、前記方法。
Ｍ細胞で発現するＧＰ２の分泌形態のＧＰ２を含む、微生物に対する結合剤。
Ｍ細胞で発現するＧＰ２及び微生物又はその成分を含む複合体。
以下（ａ）又は（ｂ）のいずれかを含む、哺乳動物における粘膜免疫の評価方法：
（ａ）Ｍ細胞でのＧＰ２の発現が調節された哺乳動物を粘膜免疫の測定に供すること；あるいは
（ｂ）哺乳動物をＭ細胞でのＧＰ２の発現又は機能の測定に供すること。