WO2006093150A1

WO2006093150A1 - シグナル増幅方法

Info

Publication number: WO2006093150A1
Application number: PCT/JP2006/303756
Authority: WO
Inventors: Mitsugu Usui; Motohito Kanashima
Original assignee: Eisai R & D Management Co., Ltd.
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2006-09-08
Also published as: US20080318226A1; AU2006219332B2; CA2599542A1; CN101128603A; KR20070110490A; EP1854895A4; JPWO2006093150A1; AU2006219332A1; EP1854895A1

Abstract

　パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル感度、定量性及び操作性を向上させることができるシグナル増幅方法、該方法を用いたターゲット遺伝子の検出方法、及び該方法に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブを提供する。　互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つをアクリジニウムエステルで標識することにより検出するようにした。

Description

明細書

シグナル増幅方法

技術分野

[0001] 本発明は、オリゴヌクレオチド 'プローブの自己集合反応により形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法、該方法を用いた遺伝子の検出方法、及び該方法に用いられるオリゴヌクレオチド 'プローブに関する。背景技術

[0002] 酵素を使用しな、シグナル増幅方法として、互ヽにハイブリダィズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド ·プローブを反応させて、該プローブ同士の自己集合体 (ポリマー）を形成させるシグナル増幅方法 (以下、パルサー法 (PALSAR法）と称す）、並びにパルサー法を利用して、該ポリマーを測定することにより試料中のターゲット遺伝子を検出するターゲット遺伝子の検出方法が報告されている（特許文献 1〜5等)。

[0003] ポリマーを測定する方法としては、従来、ポリマー形成後、臭化工チジゥム等のインターカレーターを添加し、蛍光測定により検出する方法や、 Cy3等の蛍光物質で標識したプローブを用いてポリマーを形成させ、蛍光測定により測定する方法が用いられてきた。

特許文献 1：特許第 3267576号

特許文献 2：特許第 3310662号

特許文献 3 :国際公開第 02Z31192号明細書

特許文献 4:特開 2002— 355081号公報

特許文献 5：国際公開第 2003Z029441号明細書

特許文献 6：特表平² - 503268号

非特許文献 1 : CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 35, No. 8, 1588-1594, 1989 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明は、パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル感度、定量性及び操作性を向上させることができるシグナル増幅方法、該方法を用いたタ一ゲット遺伝子の検出方法、及び該方法に用いられるオリゴヌクレオチド 'プローブを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、ポリマーの検出におけるシグナル感度をさらに向上させるベく鋭意研究を重ねた結果、アタリジ-ゥムエステルで標識したオリゴヌクレオチド ·プローブを用いることにより、シグナルの感度、定量性及び操作性を著しく向上させることができることを見出した。

即ち、本発明のシグナル増幅方法は、互いにハイブリダィズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブを用いて形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド.プローブの少なくとも 1つをアタリジ-ゥムエステルで標識することにより検出することを特徴とする。

[0006] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも総計 2箇所をアタリジ-ゥムエステルで標識することが好まし、。

[0007] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブとして、 5'端部力順に少なくとも核酸領域 X、核酸領域 Y及び核酸領域 Zが設けられ、下記化学式 (1)の構造を有する、 3 箇所以上の核酸領域からなる第 1プローブと、 5'端部から順に少なくとも核酸領域 X '、核酸領域 Y'及び核酸領域 Z'が設けられ、下記化学式 (2)の構造を有する、 3箇所以上の核酸領域力もなる第 2プローブと、力なる一対のオリゴヌクレオチド 'プローブを用いることが好まし、。

[化 1]

X Y z _¾

5， ^!iliih^: n^i^::n^:^'¹"f^,T^!,f"r^,i^,,i"r^{> b}rrrvr ^ 3， ( 1 )

[化 2]

3'

5' ( 2 )

Z， Y' X， (前記化学式（1)及び（2)において、 Xと X，、 Yと Y，、 Ζと Z'はそれぞれハイブリダィズ可能な相補的核酸領域である。 )

[0008] 本発明のターゲット遺伝子の検出方法は、本発明のシグナル増幅方法を用いてタ一ゲット遺伝子を検出することを特徴とする。

[0009] 本発明方法において、前記オリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも 1つ力前記タ一ゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有することが好ましい。また、前記ターゲット遺伝子と前記ポリマーを繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と前記オリゴヌタレォチド ·プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシスト ·プローブを用いることが好まし、。

[0010] 本発明のオリゴヌクレオチド 'プローブは、前記本発明方法に用いられるプローブであって、アタリジ-ゥムエステルで標識されてなることを特徴とする。

発明の効果

[0011] 本発明によれば、ポリマーの形成を、立体障害を受けることなく直接的に捕えることができるため、パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル感度及び定量性を著しく向上させることができる。また、本発明によれば、ターゲット遺伝子を簡便に検出することができる。

図面の簡単な説明

[0012] [図 1]実施例 1、実施例 2及び比較例 1の結果を示すグラフである。

[図 2]実施例 3、実施例 4及び比較例 2の結果を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0013] 以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想力逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。

[0014] 本発明のシグナル増幅方法は、互いにハイブリダィズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブを用いて形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも 1つをアタリジ-ゥムエステルで標識することを特徴とする。前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブを用いたポリマーの形成方法としては、特許文献 1〜5に記載されているようなノルサ一法を使用することができる。

ポリマー形成の第 1の例として、 5'端部力も順に少なくとも核酸領域 X、核酸領域 Y 及び核酸領域 Zが設けられ、下記化学式（1)の構造を有する、 3箇所以上の核酸領域からなる第 1プローブと、 5'端部から順に少なくとも核酸領域 X'、核酸領域 Y'及び核酸領域 Z'が設けられ、下記化学式 (2)の構造を有する、 3箇所以上の核酸領域からなる第 2プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ（以下、 HCPとも称する）の複数対を用いて、互、違、に交差するようにハイブリダィゼーシヨンさせることにより、オリゴヌクレオチド 'プローブが自己集合し、二本鎖の自己集合体 (ポリマ一）を形成させる方法が挙げられる (特許文献 1及び 2)。

[化 3]

X Y Z ^

( 1 )

[化 4]

( 2 )

Z' Y' X，前記式（1)及び (2)において、領域 Xと領域 X'、領域 Yと領域 Y'、領域 Zと領域 Z' はそれぞれハイブリダィズ可能な相補的核酸領域であり、複数対の HCPの結合により下記化学式 (3)で示される自己集合体が形成される。

[化 5]

( 3 )

[0016] ポリマー形成の第 2の例として、 No. 1及び No. 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3'側領域、中央領域、及び 5'側領域の 3つの領域に分け、各ォリゴヌクレオチドの中央領域を互、に相補的な塩基配列とし、 3 '側領域及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第 1 番目の系から第（2n— 1)番目（n≥ 1)の系まで順番に n個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、

No. 1及び No. 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3，側領域及び 5 '側領域の 2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの 3 '側領域及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第 2番目の系から第 2n番目の系まで順番に n個形成された架橋プローブ含有系とを有し、該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、

該プローブをノヽイブリダィゼーシヨンさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる方法が挙げられる (特許文献 4)。

[0017] 上記第 2の例において、 n= lの場合、第 1の系のダイマープローブと第 2の系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、 2通り存在する。 n= lの場合の 1 例として、前記プローブの塩基配列を、

第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の No. 1—オリゴヌタレォチドの 3'側領域、

第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の No. 2—オリゴヌタレォチドの 5'側領域、

第 2の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の No. 2—オリゴヌタレォチドの 3'側領域、

第 2の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の No. 1—オリゴヌタレォチドの 5 '側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。

[0018] n= lの場合の別の例として、前記プローブの塩基配列を、

第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の No. 1—オリゴヌタレォチドの 3'側領域、第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の No. 1—オリゴヌタレォチドの 5'側領域、

第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の No. 2—オリゴヌタレォチドの 3'側領域、

第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の No. 2—オリゴヌタレォチドの 5 '側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。

[0019] 上記第 2の例において、 n≥2の場合、第 1、第 3、 · ·、第（2n— 1)の系のダイマー形成用プローブと第 2、第 4、 · ·、第 2nの系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、 2通り存在する。 n≥ 2の場合の 1例として、上記プローブの塩基配列を、

第（2n— 3)番目の系の No . 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（ 2n— 2)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

第（2n— 3)番目の系の No . 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（ 2n— 2)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

第（2n— 2)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（2n— 1)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

第（2n— 2)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第（2n— 1)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と架橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と架橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

架橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1番目の系の

No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

架橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5'側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用!/、ることができる。

[0020] n≥ 2の場合の別の例として、前記プローブの塩基配列を、第（2n— 3)番目の系の No . 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第（ 2n— 2)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

ダイマー形成用プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と架橋プローブの最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

架橋プローブの最後の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1番目の系の

No. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。

ポリマー形成の第 3の例として、 No. 1及び No. 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3 '側領域、中央領域、及び 5 '側領域の 3つの領域に分け、各ォリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、 3 '側領域、及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第 1番目の系から第 k番目（k≥ 2)の系まで順番に複数個形成し、

(a)第 (k— 1)番目の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 k番目の系の N o. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

(b)第 (k— 1)番目の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 k番目の系の N o. 1 オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

(c)最後の系の No. 1 オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の No. 2 オリゴヌクレオチドの 3，側領域、 (d)最後の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第 1番目の系から第 k番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをノヽイブリダィゼーシヨンさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる方法が挙げられる（特許文献 3)。

[0022] ポリマー形成の第 4の例として、 No. 1及び No. 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3 '側領域、中央領域、及び 5 '側領域の 3つの領域に分け、各ォリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、 3 '側領域、及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第 1番目の系から第 k番目（k≥ 2)の系まで順番に複数個形成し、

(a)第 (k— 1)番目の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 k番目の系の N o. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

(b)第 (k— 1)番目の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 k番目の系の N o. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

(c)最後の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

(d)最後の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

[0023] 本発明のオリゴヌクレオチド 'プローブにおいて、アタリジ-ゥムエステルの標識部位及び数は特に限定されず、ポリマー形成に用いられる複数種のオリゴヌクレオチド •プローブ中、少なくとも 1つのオリゴヌクレオチド ·プローブの 1箇所以上がアタリジ- ゥムエステルで標識されていればよいが、複数種のオリゴヌクレオチド.プローブ中、 2箇所以上が標識されていることが好ましい。 2箇所以上を標識する場合、 1種のオリゴヌクレオチド ·プローブを 2箇所以上標識してもよぐ 2種以上のオリゴヌクレオチド · プローブをそれぞれ 1箇所以上標識してもよヽ。 [0024] 例えば、オリゴヌクレオチド 'プローブとして前記 HCPを用いる場合、一対の HCPの一方のみアタリジ-ゥムエステルで標識した一対の HCP、及び一対の HCPの両方をアタリジ-ゥムエステルで標識した一対の HCPの、ずれも使用可能である力一対の HCPを共に標識することが好ま、。この場合の標識部位も特に限定されな!、が、 HCPがハイブリダィズする際に対称になる部位が好ましぐ例えば、各 HCPの 5' 末端、又は 3'末端を標識部位とすることが好ましい。

[0025] オリゴヌクレオチド 'プローブにアタリジニゥムエステルを標識する方法は特に限定されず、公知の方法、例えば、特許文献 6や非特許文献 1記載の方法等を用いることができる。また、アタリジ-ゥムエステルにより標識されたオリゴヌクレオチド 'プローブ力なるポリマーを測定する方法も特に限定されず、特許文献 6及び非特許文献 1等に記載されているような公知の方法により測定することができる。

[0026] 前記ターゲット遺伝子に一本鎖の DNA及び Z又は RNA、並びに二本鎖の DNA 及び Z又は RNAを用いることができる。また、前記ターゲット遺伝子に SNPs (—塩基多形)を用いることができる。

[0027] ターゲット遺伝子の検出方法としては、具体的には、ターゲット遺伝子とポリマーの複合体を形成させ、アタリジ-ゥムエステル標識されたポリマーの検出により、ターゲット遺伝子を検出する方法や、ターゲット遺伝子が存在する場合にのみポリマーが形成されるような方法を用いて、アタリジ-ゥムエステル標識されたポリマーの検出によりターゲット遺伝子を検出する方法が挙げられる。

[0028] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブを、前記ターゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有するように構成することが好ましい。また、前記ターゲット遺伝子と前記ポリマーを繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列とオリゴヌクレオチド ·プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシスト ·プローブを用いることが好ま Uヽ

[0029] 上記オリゴヌクレオチド 'プローブは、通常 DNA又は RNAで構成される力核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸 (PNA)や Locked Nu cleic Acid (LNA)が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド 'プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成される力たとえば DNAプローブと RNAプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類は DNA、 RNAまたは核酸類似体（たとえば PNAや LNA等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえば DNAのみカゝら構成される必要はなぐ必要に応じて、たとえば、 DNAと RNA力構成されるオリゴヌクレオチド 'プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。

[0030] 上記オリゴヌクレオチド 'プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも 5塩基であり、好ましくは 10〜： LOO塩基、さらに好ましくは 13〜30塩基である。これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえば DNA プローブの場合、アプライドバイオシステムズ社 (Applied Biosystem In ）の DNAシンセサイザ一 394型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、チォホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。

[0031] 本発明において、使用するオリゴヌクレオチド 'プローブの本数は特に限定されないが、 ιο²〜ιο¹⁵本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。 pHも常用の範囲で好適であり、好ましくは pH7. 0〜9. 0の範囲のものが使用できる。ハイブリダィゼーシヨン反応の温度条件も特に限定されず、通常の温度条件でよいが、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成させ、当該反応温度領域において自己集合反応を行わせるようにすることが好ましい。部分的な反応温度領域に適用される反応温度は 4 0〜80。C、好ましくは 55〜65。Cである。

[0032] 本発明は、遺伝子検出用の反応機材で捕捉したターゲット遺伝子に対して、自己集合可能なオリゴヌクレオチド ·プローブで集合体を形成させ、ターゲット遺伝子を検出することが好ましい。前記反応機材としては、特に限定されないが、マイクロプレート、 DNAマイクロアレイ又は磁性体粒子等が好適である。

[0033] 本発明におけるターゲット遺伝子 (DNAまたは RNA)測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよぐ特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウィルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で増幅した DNAまたは RNA等の核酸も使用できる。

実施例

[0034] 以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する力これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでな、ことは、うまでもな!/、。

[0035] (実施例 1)

ポリマー形成に用いられるオリゴヌクレオチド 'プローブとして、 5，末端をアタリジニゥムエステルで標識した HCP— 1 (配列番号 4記載の塩基配列)及び標識されて!ヽな V、HCP— 2 (配列番号 5記載の塩基配列）力なる一対の HCPを用いた。アタリジ- ゥムエステル標識は 200201 Acridinium Protein Labeling Kit (Cayman社製）を用いて行った。 5，末端をアタリジ-ゥムエステルで標識した場合の構造式を下記化学式 (X) に示す。

[化 6]

3'末端へ続く黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureu)の rRNAに相補的な配列を有する捕捉用プローブ (配列番号 1記載の塩基配列）をマイクロプレートに固相化した。

前記マイクロプレー卜に、各濃度（25， 50, 100, 200, 400, 800又は 1600fmol /mL)にトリス緩衝液で希釈した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureu)の rRNAと同じ配列を有するオリゴヌクレオチド (ターゲット；配列番号 2記載の塩基配列） 50 L と、アシスト 'プローブ（配列番号 3記載の塩基配列） 24pmolZmLを含む第 1ハイブリダィゼーシヨン溶液 [4XSSC、 0. 2%SDS、 l%Blocking reagent (Roche製）、 20% ホルムアミド、 Salmon sperm DNA (10 μ g/mL) ] 50 μ Lを順次加え、マイクロプレートの下部を 45°C、上部を 20°Cに設定した条件下で、 2時間インキュベートした。

[0037] その後、ゥエル中の反応液を捨て、洗浄液 [50mM Tris、 0. 3M NaCl、 0. 01 % Triton X—100、pH7. 6]で 3回洗った後、アタリジ-ゥムエステルで標識した一対の HCPを 200pmoLZmL含む第 2ハイブリダィゼーシヨン溶液 [4XSSC、 0. 2 %SDS、 l%Blocking reagent (Roche製）] 100 μ Lをカ卩えた。マイクロプレートの下部を 55°C、上部を 20°Cに設定した条件下で、 30分インキュベートした。

[0038] ゥエル中の反応液を捨て、洗浄液で 3回洗ったあと、発光試薬 A[0. 1%H O、 0.

2 2

001N HNO ] 50 と発光試薬 B[1N NaOH^O /z Lを加える。直ちにルミノメ

3

ータ（Berthold社製、 Centra LB— 960)で発光強度 (RLU)を測定した。結果を図 1及び表 1に示す。

[0039] [表 1]

[0040] (実施例 2)

ポリマー形成に用いられるオリゴヌクレオチド 'プローブとして、 5，末端をアタリジニゥムエステルで標識した HCP— 1 (配列番号 4記載の塩基配列）及び 5'末端をアタリジ -ゥムエステルで標識した HCP— 2 (配列番号 6記載の塩基配列）力なる一対の HCPを用いた以外は実施例 1と同様の方法により実験を行った。結果を図 1及び表 2に示す。

[0041] [表 2] ターゲット濃度実施例 2 比較例 1 比率

(fmol/mLノ (RLU) (RLU) (実施例 2 比較例 1 )

1600 179395 10515 17.1

800 77194 4414 17.5

400 37533 2339 16.0

200 17127 1135 15.1

100 9210 564 16.3

50 4883 302 16.2

25 2521 152 16.6

平均 16.4

[0042] (比較例 1)

オリゴヌクレオチド ·プローブとして、 5'末端をアタリジニゥムエステルで標識した HC P- 1 (配列番号 4記載の塩基配列）のみを用いた以外は実施例 1と同様の方法により実験を行った。結果を図 1、表 1及び表 2に示す。

[0043] 表 1, 2及び図 1に示した如ぐポリマーが形成される実施例 1及び 2はポリマーが形成されない比較例 1に比べて、ターゲット遺伝子の検出感度が向上しており、 2箇所標識されたオリゴヌクレオチド 'プローブを用いた実施例 2は特に検出感度が向上しており、定量性も優れていた。

[0044] (実施例 3、 4及び比較例 2)

実施例 3として、第 2ハイブリダィゼーシヨン溶液中の HCP濃度を lOOOpmolZmL に変更した以外は実施例 1と同様に実験を行った。実施例 4として、第 2ハイブリダィゼーシヨン溶液中の HCP濃度を lOOOpmolZmLに変更した以外は実施例 2と同様に実験を行った。比較例 2として、第 2ハイブリダィゼーシヨン溶液中の HCP濃度を 1 OOOpmol/mLに変更した以外は比較例 1と同様に実験を行った。結果を表 3, 4及び図 2に示す。表 3, 4及び図 2に示した如ぐ実施例 3及び 4は比較例 2に比べ、検出感度が向上しており、実施例 4は特に著しく感度及び定量性が向上していた。

[0045] [表 3] ターゲット濃度実施例 3 比較例 1 比率

(fmol/mL) (RLU) (RLU) (実施例 3 Z比較例 2 )

1600 19970 10028 2.0

800 7263 3789 1.9

400 4153 2058 2.0

200 1816 1135 1.6

100 1045 588 1.8

50 522 298 1.8

25 450 159 2.8

平均 2.0

[0046] [表 4]

[0047] (実施例 5、実施例 6及び比較例 3)

実施例 5として、マイクロプレートのインキュベートの条件を上部を下部の温度条件に合わせて変更し、 45°Cの恒温条件とした以外は実施例 3と同様の方法により実験を行った。実施例 6として、マイクロプレートのインキュベートの条件を上部を下部の温度条件に合わせて変更し、 45°Cの恒温条件とした以外は実施例 4と同様の方法により実験を行った。比較例 3として、マイクロプレートのインキュベートの条件を上部を下部の温度条件に合わせて変更し、 45°Cの恒温条件とした以外は比較例 2と同様の方法により実験を行った。結果を表 5, 6に示す。

[0048] [表 5] ターゲット濃度実施例 5 比較例 3 比率

(fmol/mL) (RLU) (RLU) (実施例 5 Z比較例 3 )

1600 12547 3824 3.3

800 4977 1375 3.6

400 3519 688 5.1

200 1834 289 6.3

平均 4.6

[0049] [表 6]

[0050] 表 5及び表 6に示した如ぐ実施例 5及び 6は比較例 3に比べ、検出感度が向上しており、実施例 6は特に著しく感度及び定量性が向上していた。

Claims

請求の範囲

[1] 互いにハイブリダィズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブを用いて形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも 1つをアタリジ-ゥムエステルで標識することにより検出することを特徴とするシグナル増幅方法。

[2] 前記複数種のオリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも総計 2箇所をアタリジ-ゥムエステルで標識することを特徴とする請求項 1記載のシグナル増幅方法。

[3] 前記複数種のオリゴヌクレオチド ·プローブが、 5 '端部力順に少なくとも核酸領域 X、核酸領域 Y及び核酸領域 Zが設けられ、下記化学式 (1)の構造を有する、 3箇所以上の核酸領域力なる第 1プローブと、 5'端部から順に少なくとも核酸領域 X'、核酸領域 Y'及び核酸領域 Z'が設けられ、下記化学式 (2)の構造を有する、 3箇所以上の核酸領域力なる第 2プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド 'プローブであることを特徴とする請求項 1又は 2記載のシグナル増幅方法。

[化 1]

[化 2]

5， ( 2 )

Z' Υ， X，

(前記化学式（1)及び（2)において、 Xと X，、 Υと Υ，、 Ζと Z'はそれぞれハイブリダィズ可能な相補的核酸領域である。 )

[4] 請求項 1〜3のいずれか 1項記載の方法を用いたターゲット遺伝子の検出方法。

[5] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも 1つが前記ターゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有することを特徴とする請求項 4記載のターゲット遺伝子の検出方法

[6] 前記ターゲット遺伝子と前記ポリマーを繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と前記オリゴヌクレオチド 'プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシスト 'プローブを用いることを特徴とする請求項 4記載のターゲット遺伝子の検出方法。

請求項 1〜3のいずれか 1項記載の方法に用いられるアタリジ-ゥムエステルで標識されたオリゴヌクレオチド 'プローブ。