WO2006088229A1 - 改変されたウイルスカプシドタンパク質及びその使用 - Google Patents

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Akira Nakanishi
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a modified SV40 protein and its use. According to the present invention, gene therapy, drug delivery, etc.
  • virus capsid protein which is expected to be applied, by biotechnological methods.
  • the virus capsid protein thus modified can form virus-like particles, encapsulating specific gene nucleic acids and pharmaceutically active ingredients in these virus-like particles and introducing them into specific cell tissue organs. I can do things.
  • the amino acid sequence is modified by introducing a foreign peptide into the amino acid sequence of the viral capsid protein in order to modify the cell orientation of the viral power protein, most of the modified viral capsid protein forms particles. There is a risk that the expected properties of the foreign peptide may not be expressed because the introduced foreign peptide is not displayed on the surface of the virus particle. Therefore, the present invention has found an appropriate insertion site of an exogenous peptide in the SV40 virus power psid protein that can be expected to have high safety and high structural stability to papovaviruses, particularly chicks, that infect primates. By introducing an exogenous peptide to the site, the cell orientation of particles formed from the modified cabside protein is controlled, and the specificity and efficiency of introduction of genes or drugs into cells are controlled. It is something to try.
  • the present inventors inserted foreign peptides into various regions of the capsid protein (see FIGS. 1 and 2) to produce capsid protein variants, and the peptides We searched for insertion sites that could form particles while presenting chains.
  • about 40 variants (partially shown in Fig. 2) were analyzed, and two of them, namely, the SV40 capsid protein M-loop or The HI-loop is modified by inserting a foreign peptide sandwiched by a spacer consisting of one to several glycine residues, and the particles are normally formed and the peptide chain is presented.
  • the present invention was completed by finding the insertion site (FIGS. 2 and 3) and considering the range of viruses and spacer amino acids to which this specific modification can be applied.
  • a foreign gene sandwiched between 1 to several spacer amino acid residues is inserted into the amino acid residue forming the capsid particle surface of the papovavirus force psid protein that infects primates.
  • a modified force psid protein examples include SV40, JCB, and BKV.
  • the spacer amino acid residue examples include glycine, serine, and alanine.
  • an exogenous peptide sandwiched between 1 to several glycine residues is inserted into at least one of the SV40 capsid protein]) E loop and HI loop.
  • a modified SV40 force psid protein is provided.
  • the SV40 capsid protein is preferably SV40 VP 1 capsid protein (SEQ ID NO: 13).
  • the foreign peptide insertion site in the DE loop is preferably between the amino acid at position 127 and the amino acid at position 146, counted from the N-terminal end of the SV40 VP1 capsid protein, and the HI loop.
  • the foreign peptide insertion site in is located between the amino acid at position 268 and amino acid at position 277, counting from the N-terminus of the SV40 VP 1 capsid protein.
  • capsid proteins used in the present invention include J CV (its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 13), BKV (its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14) and the like.
  • the possible foreign peptide insertion site of TCV is N — 1 19 position from position 138 — 138 position Between amino acids, or between amino acids 260-269.
  • the predicted site where foreign peptide can be inserted into BKV is between amino acids 127 to 146 or between amino acids 268 to 277, counting from the N-terminus.
  • the number of glycine residues is preferably 1-6 per one end of the exogenous peptide, for example 3-6.
  • the exogenous peptide includes, for example, Flag sequence (Asp_Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (Tatsumi (J number: 1)), Myc sequence (Glu-Asn-Lys-Leu-Leu) -Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu) (SEQ ID NO: 4), HA sequence (Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) (SEQ ID NO: 5), Tat -PTD sequence (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) (SEQ ID NO: 6), Polylysine sequence (3) (Lys-Lys-Lys) (SEQ ID NO: 7), Polylysine sequence (6) (Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) (SEQ ID NO: 8), Polyly
  • the present invention also provides virus-like particles formed from the modified SV40 capsid protein described above.
  • the present invention further provides the above virus-like particles encapsulating a physiologically active substance.
  • This physiologically active substance is, for example, a pharmaceutically active ingredient or a nucleic acid for gene therapy.
  • the present invention further provides a pharmaceutical composition comprising the above virus particle.
  • Figure 1 shows the structure of the SV40 VI force protein.
  • Figure 2 shows the SV40 VI capsid protein DE loop, HI loop and C
  • part which inserted Flag sequence in D loop is shown.
  • the insertion site is indicated by white letters.
  • FIG. 3 shows whether virus-like particles are formed from a modified VI force pseudoprotein in which a Flag sequence is inserted at the site shown in FIG. Bands at positions 8-10 indicate the formation of virus-like particles.
  • Figure 4 shows the wild type VI force psid protein (wt), and the modified VI force psid protein (DE2) with the Flog sequence inserted at positions 136-139 of the DE loop and Flags at positions 272-275 of the HI loop.
  • wt wild type VI force psid protein
  • DE2 modified VI force psid protein
  • FIG. 5 schematically shows the structure of a VI force psid protein in which a Flag sequence sandwiched between n glycines is inserted at positions 272 to 275 of the cocoon loop.
  • Figure 6 shows the relationship between the number of glycines and the formation of virus-like particles. Bands at 8 or 9 indicate the formation of virus-like particles.
  • FIG. 7 is an electron micrograph showing the relationship between the number of glycines and the formation of virus-like particles. Particle formation is clearly observed in the range of G3 (3 glycines) to G6 (6 glycines).
  • FIG. 8 shows the results of immunoprecipitation with anti-Flag antibody of particles composed of wild-type particles (On) and flag-tagged viral force psid proteins (HI1, DE2).
  • Figure 9 shows particles composed of viral capsid proteins with flag-tags inserted into anti-Flag antibody (top panel) or anti-His antibody (bottom Panel) and fractionated after sucrose density gradient centrifugation, and the results of detecting proteins present in each fraction are shown.
  • A is an electron micrograph of particles composed of viral capsid proteins presenting TAT-PTD (TAT-PTD-HI1) (left) or 3xRG D (3xRGD-HIl) (right).
  • B shows the introduction of Wt particles or Flag-tag inserted particles (Flag-HI1) into CV-1 cells. With the introduction of Flag-1 ag, the ability to introduce particles into cells has disappeared.
  • c shows the introduction of Wt particles or 3xRGD, TAT-PTD-introduced particles into CV-1 cells. Particles displaying 3xRGD can adhere to the cells, but no invasion could be detected when trypsinized. For this reason, observation with a confocal microscope was performed. Particles with Tat-PTD have the same or better introduction capacity than wild type.
  • Fig. 11 shows changes in cell orientation of Wt particles or particles introduced with Flag (Flag-DE2) or TAT-PTD (TAT-PTD-DE2) into HeLa cells into the DE loop.
  • the introduction of the flag-tag prevents the introduction of VP-tungs into the cells.
  • the introduction ability of TAT-PTD in the DE loop has been acquired.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of Example 10.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of Example 11. Specific embodiments for carrying out the invention
  • a virus When using a virus to introduce a pharmaceutically active ingredient or a nucleic acid for gene therapy, its safety is a problem.
  • Many viruses used as introduction vectors themselves have pathogenicity, and some structural proteins have cytotoxicity.
  • many papovaviruses such as SV40 show almost no pathological changes even when they infect the host.
  • SV40 as a polio vaccine mixed virus
  • these viruses are considered to be harmless or very low in pathogenicity for humans, and if the cell-directivity of the capsid protein of the virus can be controlled, gene transfer, High safety can be expected at first-class deli delivery. Therefore, in the present invention, SV40 force psid protein is used, and preferably SV 40 VP 1 force psid protein is used.
  • the site where the foreign peptide is inserted is within the DE-loop or HI-loop of the SV40 force psid protein.
  • the loop is the N-terminal of the protein.
  • the HI-Loop is in the 268th-277th position.
  • the exogenous peptide is inserted into the SV40 VI capsid protein between positions 137 and 138 in the DE-loop or between positions 272 and 275 in the HI-loop.
  • spacer amino acids such as glycine, alanine, and serine must be present at each end of the inserted foreign peptide, preferably 1 to 9, more preferably 1 to 6. There are 3 to 6 amino acids, for example. In the absence of the above spacer amino acids, virus-like particles are difficult to form.
  • the exogenous peptide is preferably one that changes the cell directivity of the virus-like particle by inserting it into the above-mentioned site.
  • Flag sequence As P-Tyr-Lys- Asp- Asp- ASP-ASP- Lys
  • SEQ ID NO: 1 or TAT-PTD sequence of human immunodeficiency syndrome (HIV)
  • an anti-epitopic Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)
  • amino acid sequence 3xRGD Arg-containing integrin recognition sequence (RGD)
  • Myc sequence (Glu-Gln-Lys-Leu-lie-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu) (SEQ ID NO: 4), HA sequence (Tyr-Pro-Tyr-As P- Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) (SEQ ID NO: 5), 6xHis sequence (His-His-His-His-His-His) (SEQ ID NO: 11), Polylysine sequence (Lys- Lys-Lys-) Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) (SEQ ID NO: 12), Tat-PTD sequence (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) (SEQ ID NO: 6), Polylysine Sequence (3) (Lys-Lys-Lys) (SEQ ID NO: 7), Polylysine sequence (6) (Lys-Lys-Lys-Lys) (SEQ ID NO
  • the present invention also relates to virus-like particles formed from the modified capsid proteins described above.
  • the virus-like particle encapsulates a physiologically active substance, typically a pharmaceutically active substance or a nucleic acid for gene therapy.
  • the pharmaceutically active substance may be a low molecular compound, particularly a low molecular organic compound, or a high molecular compound such as a polypeptide, protein, or polysaccharide. Examples of such substances include anticancer agents such as adriamycin and cyclophosphamide, and proteins with anticancer activity such as TNF and Granzyme B.
  • the gene (nucleic acid) for gene therapy is not particularly limited.
  • a human normal gene such as adenosine deamidase gene, p53 gene, or siRNA is expressed, and a specific gene is transferred by RNA interference. MA that can suppress the expression and siRNA itself.
  • a modified SV40-VP 1 gene was inserted and inserted.
  • a modified SV40-VP1 gene in which a specific amino acid residue on a loop partially exposed to the SV40-VP1 protein is replaced with a Flag sequence having 3 glycines on both sides is prepared.
  • each modified SV40 viral protein (VP) was placed in a tissue culture dish (IWAKI) with 1x10 7 Sf9 cells.
  • Recombinant baculovirus expressing 1 was infected at a moi (Multiplicity of Infection; multiple infectivity) of 5-10.
  • Recombinant baculovirus expressing each modified VP1 protein was recovered 72 hours after infection with recombinant paculovirus prepared using Bac to-Bac Baculovirus Express ion Systems manufactured by Invitrogen, and Sf-9 cells were recovered. Washed twice with chilled phosphate buffer (PBS).
  • Ice-cooled sonication buffer (20 mM Tris-HC1 (pH 7.9), (w / v) sodium deoxycholate (D0C), 2 mM PMSF 1 ⁇ g / mL chymos tat in, Aprotinin (aprot inin), leupeptin (leupe pt in), antipain (antipain), pepsutin (pepstatin)) 200 cells are suspended and sonicated for 20 seconds with ice cooling, Then put on ice for 20 seconds. After repeating this operation three times, the cell lysate was centrifuged at 15,000 g for 10 minutes at 4 ° C, and the supernatant was recovered. Collect recovered VP 1 protein 21 using anti-VP 1 antibody. Estan blotting was performed to confirm its expression (Fig. 3).
  • Example 2 Analysis of Sf-9 intracellular virus-like particle formation in modified VP protein
  • a modified VP 1 gene in which glycine residues 0 to 6 residues are added to both sides of the Flag sequence for the HI-loop.
  • FIG. 5 was prepared in the same manner as the method described in Example 1 and Example 2.
  • Figures 6 and 7 and Table 2 below show the results.
  • the modified VP1 inserted with the Flag sequence requires glycine residues as spacers on both sides in order to form virus-like particles, and at least 3 residues are preferred. It was done.
  • Example 4 Functional analysis of Flag sequence in modified VP 1 protein
  • an anti-flag antibody is used.
  • Recovered modified virus-like particles (modified VLP) 2 OL in the same manner as described above, add phosphate buffer (PBS) to 100 liters, and rub them in a total volume of 100. Then add 50 X anti-Flag M2 affinity gel. (Si gma) and gently stirred at 4 ° C for 1 hour.
  • PBS phosphate buffer
  • Si gma 50 X anti-Flag M2 affinity gel.
  • modified VLP the following experiment was conducted to examine whether the inserted Flag sequence has a function as an epitope even during VLP formation.
  • 60 ng of modified VLPs were prepared in the same manner as described in Example 1 and Example 2, and each was prepared at 4 ° C. with 9 xg of anti-Flag antibody (Sigma) and anti-His antibody (Sigma). Gently stirred for 1 hour. After stirring, fractionation was performed by 20-40% (w / v) sucrose density gradient centrifugation, and Western blotting was performed. When anti-Flag antibody was used, both VPI and anti-Flag antibody were detected in peak fractions 9 and 10, whereas when anti-His antibody was used, only VPI was found in the peak fraction. ( Figure 9 Example 7. Mass purification of modified VP protein)
  • each modified SV40 virus protein was divided into 10 15cm tissue culture dishes (IWAKI) containing 3X10 7 Sf9 cells.
  • Recombinant baculovirus expressing (VP1) was infected at 5 to 10 m.0. I. (Multiplicity of Infection).
  • Sf-9 cells were collected and washed twice with chilled phosphate buffer (PBS).
  • Ice-cold buffer for soy cation (20 mM Tris-HC1 (pH7.9), l% (w / v) sodium deoxycholate (DOC), 2 mM PMSF, 1 g / mL chymosin, buffer
  • the collected cells were suspended in 10 mL of protinin, leupeptin, antipine, and pepsin, and sonicated for 10 minutes while cooling with ice. After repeating this operation twice, the cell lysate was centrifuged at 15,000 g and 4 ° C for 10 minutes, and the supernatant was recovered.
  • HeLa cells human cervical cancer cells
  • the wild-type virus-like particles and the modified virus-like particles prepared in Example 7 were mixed with a phosphate buffer (PBS) so that the concentration was 4 ⁇ 10 4 , 4 ⁇ 10 5 , and 4 ⁇ 10 6 per cell.
  • Diluted with Medium added to wild-type virus-like particles and modified virus-like particles (4 ⁇ 10 4 , 4xl0 5 , 4xl0 6 VLPs / cell) prepared as described above to obtain lm L (MEM medium, 10% FBS) was inoculated into the aforementioned HeLa cells and rocked every 15 minutes at room temperature. After rocking 4 times, 9 mL of medium was added and incubated at 37 ° C for 1 hour. Next, the sample was collected and washed twice with phosphate buffer (PBS).
  • PBS phosphate buffer
  • the cells collected by the above method were washed twice with a cooled phosphate buffer solution (PBS), and the collected cells were suspended in ice-cooled sonication buffer solution 200 / L and ultrasonicated for 60 seconds. It was crushed. This was subjected to Western plotting, and VP1 protein adsorbed on HeLa cells and incorporated VP1 protein were detected using an anti-VP1 antibody. Table 3 shows the results.
  • PBS phosphate buffer solution
  • A shows an electron micrograph of a particle composed of a viral capsid protein in which a TAT-PTD or 3xRGD amino acid sequence is inserted into an HI-loop.
  • Each particle is approximately spherical with a diameter of approximately 50 nm, and there is no apparent difference from wild-type particles (not shown here).
  • the lower black line shows lOOnm.
  • B and C infect CV-1 cells with each particle consisting of a viral capsid protein inserted with the amino acid sequences of wild-type particles (Wt), Flag, 3 xRGD, and TAT-PTD. The amount of particles invading the cells (the amount of VP1) was detected by Western blot.
  • Wt can adhere to cells as seen in B and C (see cell associated) and invade (see trypsinized), but the particles with flag introduced are inhibited at the stage of cell adhesion (B) .
  • 3XRGD can adhere to cells like Wt, but invasion was very inefficient (C).
  • TAT-PTD-introduced particles were able to enter cells as well as Wt (C).
  • Wild type particles (Wt) or Flag (Flag-DE2) or TAT-PTD (Tat-PTD-DE2) amino acids are infected with HeLa cells using viral proteins inserted in the DE loop. Two hours later, the cells were collected, and the amount of particles invading the cells (the amount of VP1) was detected by Western Blot. When collecting cells, trypsin decomposes particles attached to the cell surface Only particles that had entered the cells were detected. As shown in Input, almost the same amount of particles was used for cell introduction, but as shown in Internalized, the amount of VP1 detected in the cell was almost impossible to detect Flag-DE2, compared to Wt, and TAT-PTD-DE2 was slightly lower than Wt, but VP1 could be detected intracellularly.
  • Example 8 The experiment described in Example 8 was repeated. However, instead of using trypsin, observation was performed using a confocal microscope. Flag with HI loop inserted in HI loop—HI1, 3 XRGD array inserted into HI loop (RGD-RGD-RGD) 3XRGD— ⁇ , FFlag array inserted into DE loop Flag—DE2 and 3XRGD array into DE loop (RGD-RGD-RGD) inserted 3XRGD-DE2 and wild type VLP (Wt) were tested. The results of detection with anti-Vpl antibody are shown in FIG. 12, and the results of observation using a confocal microscope are shown in FIG.
  • the white spheres represent the cell nuclei, and the grayish white areas distributed in a cloud form around it represent the collection of VLPs taken into the cells.
  • HIV Human immunodeficiency syndrome virus
  • TAT-PTD sequence TAT-PTD sequence
  • RGD integrin recognition sequence
  • Amino acid sequence 3xRGD Amino acid sequence 3xRGD (Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp) (SEQ ID NO: 3) or Flag sequence
  • the inserted amino acid sequence could be recognized by an antibody without modifying the modified VP1, and was presented on the particle surface.
  • the modified particles introduced with Flag could hardly adhere to the cells.
  • 3xRGD-introduced particles were able to adhere to the cells, but the invasion efficiency was lower than that of the wild type.
  • particles with the TAT-PTD sequence were able to adhere to and invade cells, and their efficiency was slightly higher than particles composed of wild-type VP1.
  • the cell tropism originally possessed by the wild-type viral power psid protein was inactivated by peptide chain insertion, but new cell tropism was given by the function of the inserted peptide chain.

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Abstract

SV40のカプシドタンパク質のDEループ及びHIループの少なくとも一方に、１～数個ずつのグリシン残基により挟まれた外来性ペプチドが挿入されている、改変されたSV40のカプシドタンパク質、及びこのタンパク質から形成されるウイルス様粒子。

Description

改変されたウィルス力プシドタンパク質及びその使用
技術分野
本発明は、 改変された SV40の力プシド夕ンパク質及びその使用に 関する。 本発明によれば、 遺伝子治療、 ドラッグデリバリ一などの 明
応用が期待されるウィルスカブシドタンパク質の細胞指向性を生物 工学的な手法により改変することが出来る。 こう して改変されたゥ ィルスカプシドタンパク質はウィルス書様粒子を形成することが出来 、 このウィルス様粒子に特定の遺伝子核酸や医薬活性成分を封入し て、 それらを特定の細胞組織臓器に導入する事ができる。
背景技術
従来のウィルスベクタ一及びウィルス様粒子による遺伝子導入ま たはドラッグデリバリーは、 ウィルス粒子が本来持つ標的細胞への 効率的な指向性に依存していた。 従ってこれらの方法で各生理活性 物質の導入できる細胞種はウィルス粒子自身の細胞指向性又は組織 指向性により限定されるものであった。 このため、 一般に安定で、 長期保存に耐える、 主に蛋白質と核酸のみで構成されるノンェンべ ロープウィルスにっき、 このウィルス自身のもつ細胞指向性を変え ようという技術開発は以前から行われている。 この方法の一つとし て、 細胞指向性の高い外来性べプチドをウィルスカプシドタンパク 質に挿入することが考えられる。
なお、 マウスポリオ一マウィルス （Stubenrauch K, et al. Bioc hem J. 356:867-873； Shin YC, et al. J Virol. , 77 : 11491-11498 ) 、 及びヒ トパピローマウィルス （Slupetzky K, et al. J Gen Vi ro l . 82 : 2799-804； S ad eyen JR, e t a l . V i ro l ogy. 309 : 32-40) において、 類似した方法を用いておのおののウィルスカプシドタン パク質にペプチド鎖を挿入し、 一部の挿入体では粒子を形成するも のがあった。 しかしながら挿入されたペプチド鎖の提示、 改変カブ シドタンパク質の粒子形成能、 細胞指向性などについて同時に確認 したものはなく、 また SV40ではこの研究が初めてである。 発明の開示
しかしながら、 ウィルス力プシド夕ンパク質の細胞指向性を改変 するために、 ウィルスカプシドタンパク質のアミノ酸配列への外来 ペプチドの導入によるアミノ酸配列の改変を行なえば、 改変された ウィルスカプシドタンパク質の殆どが粒子形成能を喪失する、 導入 した外来性べプチドがウィルス粒子の表面に提示されないために外 来べプチドの期待される性質が表現されない、 などのおそれがあつ た。 そこで、 本発明は、 霊長類に感染するパポバウィルス、 特にヒ 卜への高い安全性及び高い構造安定性が期待できる SV40ウィルス力 プシドタンパク質中の、 外来性べプチドの適切な挿入部位を見出し 、 その部位に外来性ペプチドを走注することにより、 その改変カブ シドタンパク質から形成される粒子の細胞指向性を制御して、 細胞 への遺伝子または薬剤などの導入の特異性と効率の制御を行おうと するものである。
本発明者らは、 上記の課題を解決すべく、 カプシドタンパク質の 様々な領域 （図 1及び図 2を参照のこと） に外来性ペプチドを挿入 してカプシドタンパク質の改変体を作製し、 そのペプチド鎖を提示 しつつ粒子を形成しうる挿入部位を探索した。 その結果、 約 4 0の 改変体 （その一部を図 2に示す） を解析したところ、 そのうちの 2 種類の改変体、 即ち、 SV40のカプシドタンパク質の M—ループ又は H I—ループに、 1〜数個のグリシン残基から成るスぺーサ一により 挟まれた外来性べプチドを揷入した改変体が、 粒子を正常に形成し 、 かつペプチド鎖が提示されている挿入部位を見出し （図 2及び図 3 ) 、 この具体的な改変を適用することができるウィルスやスぺー サーアミノ酸の範囲を考慮しながら、 本件発明を完成した。
従って、 本発明は、 霊長類に感染するパポバウィルスの力プシド タンパク質のカプシド粒子表面を形成するアミノ酸残基に、 1〜数 個のスぺ一サーアミノ酸残基により挟まれた外来遺伝子が挿入され ている、 改変された力プシドタンパク質を提供する。 前記霊長類に 感染するパポバウィルスとしては、 例えば SV40、 J CB、 BKVなどが挙 げられる。 また。 前記スぺ一サーアミノ酸残基としては、 例えばグ リシン、 セリン、 ァラニンなどが挙げられる。
より具体的には、 本発明は、 SV40のカプシドタンパク質の]) Eル一 プ及び H Iループの少なく とも一方に、 1〜数個ずつのグリシン残基 により挟まれた外来性ペプチドが挿入されている、 改変された SV40 の力プシドタンパク質を提供する。
前記 SV40カプシドタンパク質は、 好ましくは SV40 VP 1カプシド夕 ンパク質 （配列番号 ： 13 ) である。 前記 DEループにおける外来ぺプ チド挿入部位は、 好ましくは、 SV40 VP 1カプシドタンパク質の N -末 端から数えて 127位のァミノ酸と 146位のアミノ酸との間であり、 そ して前記 HIループにおける外来ペプチド挿入部位が、 SV40 VP 1カブ シドタンパク質の N-末端から数えて 268位のアミノ酸と 277位のアミ ノ酸との間である。
更に、 本発明で使用でとる他のカプシドタンパク質として、 J CV (そのアミノ酸配列を配列番号 ： 13に示す） 、 BKV (そのアミノ酸 配列を配列番号 ： 14に示す） などが挙げられる。 ； T CVの予想される 外来ペプチド挿入可能部位は、 N —末端から数えて 1 19位— 138位の アミノ酸間、 又は 260位— 269位のアミノ酸間である。 また、 BKVの 予想される外来ペプチド挿入可能部位は、 N—末端から数えて 127 位— 146位のアミノ酸間、 又は 268位— 277位のアミノ酸間である。
前記グリシン残基の数は、 好ましくは、 前記外来性ペプチドの一 方の端につき 1〜 6個であり、 例えば 3〜 6個である。
前記外来性ペプチドは、 例えば、 Flag配列 （Asp_Tyr- Lys- Asp-As p-Asp-Asp-Lys) (酉己歹 (J番号 ： 1 ) 、 Myc配列 ( Glu-Asn-Lys-Leu-Le u-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu) (配列番号 ： 4 ) 、 HA配列 (Tyr-Pr o-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) (配列番号 ： 5 ) 、 Tat- PTD配列 (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) (配列番号 ： 6 ) 、 ポ リ リジン配列（3) (Lys-Lys-Lys) (配列番号 ： 7 ) 、 ポリ リジン配 列（6) (Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) (配列番号 ： 8 ) 、 ポリ リジン (12) (Lys-Lys-Lys -Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys -Lys-Lys-Lys) (酉己 列番号 ： 9 ) 、 NGR配列 （Gin- Gly- Arg) (配列番号 ： 10) 、 6xHis 配列 （His- His- His- His- His- His) (配列番号 ： 11) 又はポリ リジ ン配列（8) (Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) (配列番号 ： 12) あるいは抗原ェピ卜一プである。 前記抗原ェピトープの例としては 、 ヒ ト免疫不全症候群 （HIV) の TAT- PTD配列 （Tyr- Gly_Arg_Lys_Ly s-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) (配列番号 ： 2 ) 及びインテグリン 認識配列 （RGD) を含むアミノ酸配列 3xRGD ( Arg-Gly-Asp-Arg-Gly- Asp-Arg-Gly-Asp) (配列番号 ： 3 ) が挙げられる。
本発明はまた、 上に記載の改変された SV40のカプシドタンパク質 から形成されるウィルス様粒子を提供する。
本発明は更に、 生理活性物質を封入している、 上記のウィルス様 粒子を提供する。 この生理活性物質は、 例えば、 医薬活性成分、 又 は遺伝子治療用核酸である。
本発明は更に、 上記のウィルス粒子を含んで成る医薬組成物を提 供する 図面の簡単な説明
図 1は、 SV40 VI力プシド夕ンパク質の構造を示す。
図 2は、 SV40 VIカプシドタンパク質の DEループ、 HIループ及び C
Dループ中の、 Flag配列を挿入した部位を示す。 挿入部位を、 白抜 き文字で示す。
図 3は、 図 2に示す部位に Flag配列が挿入された改変型 VI力プシ ドタンパク質からウィルス様粒子が形成されるか否かを示す。 8〜 10の位置のバンドがウィルス様粒子の形成を示す。
図 4は、 野生型 VI力プシドタンパク質 （wt) 、 並びに DEループの 136 - 139位に Flog配列が挿入された改変型 VI力プシドタンパク質 （ DE2) 及び HIループの 272— 275位に Flag配列が挿入された改変型 VI 力プシドタンパク質 （ΗΠ) から形成されたウィルス様粒子の顕微 鏡写真を示す。
図 5は、 ΗΠループの 272— 275位に n個のグリシンに挟まれた F la g配列が挿入された VI力プシドタンパク質の構造を模式的に示す。
図 6は、 グリシンの数とウィルス様粒子の形成との関係を示す。 8又は 9の位置のバンドがウィルス様粒子の形成を示す。
図 7は、 グリシンの数とウィルス様粒子の形成との関係を示す電 子顕微鏡写真である。 G3 (グリシン 3個） 〜G6 (グリシン 6個） の 範囲で粒子の形成が明瞭に観察される。
図 8は、 野生型粒子 On) および Flag- tagを挿入されたウィルス 力プシドタンパク質 （HI1、 DE2) から構成される粒子の抗 Flag抗体 での免疫沈降の結果を示す。
図 9は、 Flag- tagを挿入されたウィルスカプシドタンパク質で構 成される粒子を抗 Flag抗体 （上のパネル） または抗 His抗体 （下の パネル） と混合し、 ショ糖密度勾配遠沈後に分画し各フラクショ ン について存在するタンパク質を検出した結果を示す。
図 1 0において、 Aは TAT- PTD (TAT-PTD-HI1) (左） または 3xRG D (3xRGD-HIl) (右） を提示するウィルスカプシドタンパク質から なる粒子の電子顕微鏡写真である。 Bは Wt粒子、 あるいは Flag- tag を挿入された粒子 （Flag- HI1) の CV-1細胞への導入を示す。 Flag - 1 agの導入により粒子の細胞への導入能力は消失している。 cは、 Wt 粒子、 あるいは 3xRGD、 TAT- PTDを導入された粒子の CV-1細胞への導 入を示す。 3xRGDを提示する粒子は細胞に接着はできるが、 トリプ シン処理した場合には侵入は検出できなかった。 このため共焦点顕 微鏡による観察を行った。 Tat-PTDをもつ粒子は野生型とほぼ同じ かそれ以上の導入能を持つ。
図 1 1は、 Wt粒子、 あるいは Flag (Flag- DE2) または TAT-PTD (T AT-PTD-DE2) を導入された粒子の、 HeLa細胞への導入による細胞指 向性の変化を DEループへの Flag- Tagの導入により VP 立子の細胞内 への導入が阻害されている。 TAT-PTDを DEループに導入された粒子 では導入能力が獲得されている。
図 1 2は、 実施例 1 0の結果を示す図である。
図 1 3は、 実施例 1 1 の結果を示す図である。 発明を実施するための具体的な形態
ウィルスを用いて医薬活性成分や遺伝子治療用核酸を導入する場 合に問題となるのはその安全性である。 導入べクタ一として用いら れているウィルス自身が病原性を持つものが多く、 またその構造夕 ンパク質に細胞障害性を持つものもある。 一方、 SV40などのパポバ ウィルスの多くは宿主に感染しても殆ど病理的変化が見られること はない。 特に SV40に関してはポリオワクチンの混入ウィルスとして 発見された経緯から、 大規模にヒ トに接種された例があるが、 SV40 の接種が原因での病理疾患発生に関しては否定的な報告がなされて いる。
現在ではこれらのウィルスはヒ 卜には無害あるいは非常に病原性 が低いと考えられており、 そのウィルスのカプシドタンパク質の細 胞指向性を制御することが出来れば、 ヒ トへの遺伝子導入、 ドラッ グデリバリ一等において、 高い安全性が期待できる。 従って、 本発 明のおいては、 SV40の力プシドタンパク質を用い、 好ましくは、 SV 40 VP 1力プシドタンパク質を用いる。
本発明において、 外来性ペプチドが挿入される部位は、 SV40の力 プシドタンパク質の DE—ループ内又は HI—ループ内であり、 SV40 V Iカプシドタンパク質の場合、 —ループは当該タンパク質の N-末 端から数えて 127— 146位にあり、 HI—ループは 268— 277位にある。 好ましくは、 外来性ペプチドは、 SV40 VIカプシドタンパク質の、 D E—ループ内の 137位と 138位の間、 あるいは HI—ループ内の 272位と 275位との間に挿入される。
挿入される外来性ペプチドのそれぞれの端には 1〜数個のスぺー サーアミノ酸、 例えばグリシン、 ァラニン、 セリ ンなどが存在する 必要があり、 好ましくは 1〜 9個、 更に好ましくは 1 〜 6個、 例え ば 3〜 6個のアミノ酸が存在する。 上記のスぺーサーアミノ酸が存 在しない場合、 ウィルス様粒子の形成は困難である。
外来性ペプチドとしては、 上記の部位に挿入することによりウイ ルス様粒子の細胞指向性を変更するものが好ましく、 Flag配列 （As P - Tyr-Lys- Asp- Asp- ASP-ASP- Lys) (配列番号 ： 1 ) 、 あるいは抗 原ェピトープであるヒ ト免疫不全症候群 （HIV) の TAT- PTD配列 （Ty r-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) (配列番号 ： 2 ) 又はインテグリン認識配列 （RGD) を含むアミノ酸配列 3xRGD (Arg - Gly-Asp-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp) (配列番号 ： 3 ) が挙げられ る。
更に、 外来性ペプチドとして、 Myc配列 （Glu-Gln-Lys- Leu - lie- S er-Glu-Glu-Asp-Leu) (配列番号 ： 4) 、 HA配列 （Tyr- Pro- Tyr - As P-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) (配列番号 ： 5 ) 、 6xHis配列 （His- His - His- His- His-His) (配列番号 ： 11) 、 ポリ リジン配列 （Lys- Lys- L ys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) (配列番号 ： 12) 、 Tat- PTD配列 （Arg - L ys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) (配列番号 ： 6 ) 、 ポリ リジン 配列（3) (Lys-Lys-Lys) (配列番号 ： 7 ) 、 ポリ リジン配列（6) (L ys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) (配列番号 ： 8 ) 、 ポリ リジン（12) (Ly s-Lys -Lys -Lys-Lys-Lys -Lys -Lys -Lys -Lys -Lys -Lys) (配歹 !J番号 ： 9 ) 、 NGR配列 （Gin- Gly- Arg) (配列番号 ： 10) 等があげられる。 本発明はまた、 上記の改変されたカプシドタンパク質から形成さ れるウィルス様粒子に関する。 実用的には、 このウィルス様粒子に は、 生理活性物質、 典型的には医薬活性物質又は遺伝子治療のため の核酸を封入させる。 医薬活性物質としては、 低分子化合物、 特に 低分子有機化合物、 又はポリペプチド、 タンパク質、 多糖類などの 高分子化合物であっても良い。 このような物質の例として、 ァドリ アマイシン、 シクロフォスフアミ ドなどの抗がん剤、 TNF 、 Granz yme Bなどの抗がん作用のあるタンパク質などがあげられる。
また、 遺伝子治療用の遺伝子 （核酸） としては、 特に限定されず 、 例えばアデノシンデアミダーゼ遺伝子、 p53遺伝子、 等のヒ トの 正常遺伝子、 または siRNAを発現して特定の遺伝子を RNA干渉によつ て発現抑制することができる MA、 そして siRNA自身などがあげられ る。 実施例 次に、 本発明を実施例により更に具体的に説明する。
実施例 1. 改変型 VP1タンパク質の調製
本実施例では、 SV40の外部に提示される ドメインの中で BC-ルー プ、 HI-ループ、 及び DE-ループの 3つのドメイン （図 1 を参照のこ と） を対象にして、 外来のェピトープを揷入した改変型 SV40-VP 1 遺伝子の作製を行った。 SV40— VP1夕ンパク質においてその一部が 外部に提示されるループ上の特定のアミノ酸残基を、 両側に 3残基 ずつグリシンを有する Flag配列に置換した改変型 SV40- VP 1遺伝子 を作製し、 pFastBaclベクタ一に組込み、 大腸菌 DH5 a株に導入した 次に、 Sf9細胞を 1X107個づっ蒔いた 10cm径の組織培養用ディ ッ シュ （IWAKI) に、 それぞれの改変型 SV40のウィルスタンパク質（VP 1)を発現する組換えバキュロウィルスを、 m. o. i. (Multiplicity o f Infection ； 重複感染度） 5〜 10で感染させた。 各々の改変型 VP1 タンパク質を発現する組み換えバキュロウィルスは Invitrogen社製 の Bac to - Bac Baculovirus Express ion Sys temsを用 て作製した 組み換えパキュロウィルスによる感染の 72時間後に、 Sf- 9細胞を 回収し、 冷却したリン酸緩衝液（PBS)により 2回洗浄した。 氷冷した ソニケ一シヨン用緩衝液（20mM Tris- HC1 (pH7.9), (w/v)デォキ シコール酸ナトリウム（D0C)、 2mM PMSF 1 ^ g/mL キモス夕チン （c hymos tat in) 、 ァプロチニン (aprot inin) 、 ロイぺプチン ( leupe pt in) 、 アンチパイン （antipain) 、 ぺプス夕チン （pepstatin) ) 200 こ回収した細胞を懸濁させ、 氷冷しながら 20秒間超音波破砕 し、 その後 20秒氷上に置いた。 この操作を三回繰り返した後に、 そ の細胞破砕液を 15, 000g、 4°Cにて 10分間の遠心分離を行い、 その上 清を回収した。 回収した V P 1タンパク質 2 1を抗 V P 1抗体を用いてゥ エスタンブロッテイ ングを行い、 その発現を確認した （図 3 ) 。 実施例 2. 改変型 VP 1夕ンパク質の Sf- 9細胞内ウィルス様粒子形 成の解析
発現を確認した後、 SW51Ti用 Open Top Ultraclear Tube (Beckma n)を用いて、 上記の細胞破砕液 2 Lを 20mM Tr i s- HC 1 (pH7.9)で 10倍 希釈し 20 Lとし 20— 40 % (w/v) ショ糖密度勾配遠心 （ 55, 000 rpm 、 4°Cにて 1時間） で分画した。
20 - 40 % (w/v) ショ糖密度勾配遠心により分画したサンプルを 抗 VP 1抗体を用いてウエスタンプロッティ ングを行い、 改変型 VP 1の VLP形成能を解析した。 野生型 VP1夕ンパク質により形成された VP卜 VLP (以下 Wt- VLP) は 8番目から 10番目にそのピークが検出された （ 図 3 ) 。 同様のピークが DE—ル一プ及び HI—ループに Flag配列を揷 入した改変型でも確認できた。
SW51Ti用 Open Top Ultraclear Tube (Beckman)を用いて、 200 /iL とし 20— 50 % (w/v) 塩化セシウム密度勾配遠心 （ 35, 000 rpm, 4°C にて 3時間） で分画した。 超遠心後のサンプルのうち を力一ポ ン-コロジオン膜を張った銅メッシュを上に吸着させた後、 メッシ ュを純水で洗浄し 2— 6%酢酸ウラン溶液で染色し乾燥させた。 観察 は日立社製 H- 7500電子顕微鏡を用いて行った。 前述の DE—ル一プ又 は HI—ループに FLAG配列を挿入した改変型 VP1が Wt_VLPとほぼ同じ 形状と大きさのウィルス様粒子を形成することを確認した。 下の表 1 に改変型- VP1のウィルス様粒子の形成能を解析した結果を示す （ 図 4 ) 。
表 1
Figure imgf000011_0001
実施例 3. ウィルス様粒子の形成におけるグリシン残基の機能 的役割の解析
さらに、 本実施例では改変型 VP1によるウィルス様粒子の形成に 、 ループドメインに挿入した F 1 ag配列の両側に付加するグリシン残 基の数がどのような影響を与えるかを検討した。
前述したループドメインの内、 HI—ループを対象として Flag配列 の両側にグリシン残基 0〜 6残基まで付加させた改変型 VP 1遺伝子
(図 5 ) を、 実施例 1及び実施例 2に記載した方法とと同様にして 作製した。 図 6及び図 7並びに以下の表 2にその結果を示す。
表 2
Figure imgf000012_0001
また、 ショ糖密度勾配遠心により分画したサンプルを抗 VP1抗体 を用いてウエスタンプロッティ ングした結果から、 グリシンを 3残 基付加したものの方が 1残基または 2残基付加した場合よりウィル ス様粒子の形成効率が良いこともわかった。 以上のことから Flag配 列を挿入した改変型 VP1がウィルス様粒子を形成するには両側にス ぺーサ一としてグリシン残基が必要であり、 その数は少なく とも 3 残基が好ましいことが示された。
実施例 4. 改変型 VP 1夕ンパク質における Flag配列の機能解析 Flag配列を挿入した改変型 VP1上でェピトープとして挿入した Fla g配列がェピトープとして作用するかを検討するために、 抗 Flag抗 体を用いて免疫沈降を行った。 実施例 2の最終パラグラフに記載し た方法と同様にして回収した改変型ウィルス様粒子 （改変型 VLP) 2 O Lにリ ン酸緩衝液（PBS)を加えて全量 100 こし、 それを 50 X の 抗ー Flag M2ァフィ二ティ一ゲル（Si gma)と共に 4°Cで 1時間穏やかに 攪拌した。 攪拌後、 250iiLのリン酸緩衝液（PBS)で二回洗浄し l^ g/ Lの Flagぺプチドで溶出した。 溶出したサンプルを抗 VP 1抗体を用 いてウエスタンプロッティ ングを行った。 この実験より DEループに Flag配列を挿入した改変型 VP1及び HI—ループに Flag配列を挿入し た改変型 VLPだけが、 抗 Flag抗体に結合することが確認された （図 8 ) 。
実施例 5. 改変型 VP1からのウィルス様粒子における Flag配列の 機能解析
改変型 VLPにおいて、 VLP形成時でも挿入した Flag配列がェピト一 プとしての機能を有するかを検討するために以下のような実験を行 つた。 実施例 1及び実施例 2 に記載した方法と同様にして改変型 VL Pを 60ngずつ調製し、 それぞれを抗- Flag抗体（S igma)および抗 Hi s抗 体（Sigma) 9 xgと共に 4°Cで 1時間穏やかに攪拌した。 攪拌後、 20— 40% (w/v) ショ糖密度勾配遠心により分画しウエスタンブロッテ イ ングを行った。 抗 Flag抗体を用いた場合は、 ピーク画分である 9 及び 10画分に VPIおよび抗 Flag抗体の両方が検出されたのに対し、 抗 His抗体を用いた場合はピーク画分に VPIのみが検出された （図 9 実施例 7. 改変型 VP 1夕ンパク質の大量精製
改変型のウィルス様粒子を大量調製するため、 Sf9細胞を 3X 107 個づっ蒔いた 15cm径の組織培養用ディ ッシュ （IWAKI) 10枚に、 そ れぞれの改変型 SV40のウィルス夕ンパク質（VP1)を発現する組換え バキュロウィルスを、 m.0. i. (Multiplicity of Infection ； 重複 感染度） 5〜10で感染させた。 組み換えバキュロウィルスによる感染 72時間後に、 Sf- 9細胞を回 収し、 冷却したリン酸緩衝液（PBS)により 2回洗浄した。 氷冷したソ 二ケ一シヨ ン用緩衝液（20mM Tris- HC1 (pH7.9), l% (w/v)デォキシ コール酸ナトリウム （DOC), 2mM PMSF, 1 g/mL キモス夕チン、 ァ プロチニン、 ロイぺプチン、 アンチパイン、 ぺプス夕チン） 10mLに 、 回収した細胞を懸濁させ、 氷冷しながら 10分間超音波破砕した。 この操作を 2回繰り返した後に、 その細胞破砕液を 15, 000g、 4°Cに て 10分間の遠心分離にかけ、 その上清を回収した。
SW41Ti用 Open Top Ultraclear Tube (Beckman)に密度の異なる塩 化セシウム溶液（50%, 40¾, 30%, 20% (w/v))を密度の高いほうから 順番に 1.5mlづっ重層し、 その上に、 上記の細胞破砕液 5mLを重層し 、 SW41Tiロータ一を用いて 30, 000 rpm、 4°Cにて 3時間の遠心分離を 行った。 この操作の後に、 密度勾配の中程に白く形成される SV40ゥ ィルスのウィルス様粒子の層を回収し 37% (w/v)塩化セシウム溶液で 希釈した後、 SW55Ti用 Open Top Ultralear Tubeに移し、 これを SW5 5Ti口一夕一で 50， 000 rpm、 4°Cにて 20時間遠心分離を行い、 再度形 成されたウィルス様粒子の層を回収した。
実施例 8. 改変型ウィルス様粒子の機能解析
挿入した各々の mot ifが改変型ウィルス様粒子 （Flag—ウィルス 様粒子、 3xRGD—ウィルス様粒子、 TAT- PTD—ウィルス様粒子） の細 胞に対する吸着と侵入過程にどのような影響を及ぼすのかを検討す る目的で以下のような実験を行った。
10cm径の組織培養用ディ ッシュ （IWAKI) に HeLa細胞 （ヒ ト子宮 頸癌細胞） を lxlO6個になるように蒔いた。 また、 野生型ウィルス 様粒子及び実施例 7において調製した改変型ウィルス様粒子を、 そ の濃度が 1細胞あたり 4χ104、 4χ105、 及び 4χ106個になるようにリ ン酸緩衝液（PBS)で希釈した。 上記のようにして調製した野生型ウィルス様粒子及び改変型ウイ ルス様粒子 （4χ104、 4xl05、 4xl06 VLPs/細胞） に培地を加えて l m L (MEM培地、 10%FBS) としたものを前述した HeLa細胞に接種し、 室温で 15分おきにロッキングした。 ロッキングを 4回行った後、 9 m Lの培地を加え 37°Cで 1時間インキュベートした。 次に、 サンプルを 回収し、 リン酸緩衝液（PBS)で二回洗浄した。 以下、 目的に応じて 2 種類の方法で HeLa細胞を回収した。
( 1 ) スクレーパーによる回収
HeLa細胞表面に付着したウイルス様粒子及び細胞内に取り込まれ たウィルス様粒子の両方を検出するためにスクレーパー （IWAKI) を用いて回収した。
( 2 ) トリプシンによる回収
HeLa細胞内に取り込まれたウィルス様粒子のみを検出する目的で 10cm径の組織培養用ディ ッシュ （IWAKI) 1枚につき 0.25% Trypsi n-EDTA(Gibco) を lmL加え、 37°Cで 5分間インキュベートしディ ッシ ュから剥がれた細胞を回収した。
前述の方法で回収した細胞を冷却したリ ン酸緩衝液（PBS)により 2回洗浄し、 回収した細胞を氷冷しておいたソニケーシヨ ン用緩衝 液 200 / Lに懸濁し、 60秒間超音波破砕した。 これをウエスタンプロ ッティ ング法にかけ、 抗 VP1抗体を用いて、 HeLa細胞に吸着した VP1 タンパク質及び取り込まれた VP 1タンパク質の検出を行った。 表 3 にその結果を示す。
更に、 結果を図 10に示す。 図 10において ：
Aは、 TAT- PTDまたは 3xRGDアミノ酸配列を HI- Loopに挿入されたゥ ィルスカプシド夕ンパク質からなる粒子の電子顕微鏡写真を示す。 各粒子は直径約 50nmの約ほぼ球形で、 野生型の粒子 （ここでは示さ ず） と見かけ上差は認められない。 下の黒い線は lOOnmを示す。 B及び Cは、 野生型粒子 （Wt) 、 Flag, 3 xRGD, TAT- PTDの各アミ ノ酸配列を挿入されたウィルスカプシドタンパク質からなる各粒子 を CV- 1細胞に感染させ、 1時間後に細胞を回収し、 細胞に侵入し た粒子量 （VP1の量） を Western blotで検出した。 Inputで示される ように感染させる粒子量を変え、 細胞内で検出される VP1量の比較 を試みた。 Cell associatedとは感染させた細胞を トリプシンなど のタンパク質分解酵素を用いずに回収したもので、 細胞表面に接着 あるいは細胞内に侵入した粒子の検出を試みた。 Trypsinizedとは 感染させた細胞を トリプシン処理で回収する事により、 細胞表面に 結合した粒子を消化し、 細胞内に残る粒子 （VP 1 ) のみの定量を目 的とした。
Wtは Bおよび Cでみられるように細胞に接着 （cell associated参 照） 、 そして侵入（trypsinized参照）できるが、 Flagを導入した粒 子は細胞への接着の段階で阻害がみられる （B) 。 また 3XRGDは Wtと 同様に細胞に接着できるが、 侵入は非常に効率が悪かった （C) 。 一方、 TAT- PTDを導入した粒子は Wtと同様に細胞内に侵入できる事 が明らかであった （C) 。
このことは、 ペプチド鎖の導入自体が元々の力プシドタンパク質 の細胞指向性を失わせる結果になること、 そして TAT- PTDのような ペプチド鎖の導入により、 新たな細胞指向性を獲得できる事を示し ている。
実施例 9. アミノ酸の導入による細胞指向性の変更
野生型粒子 （Wt) 、 あるいは Flag (Flag- DE2) 又は TAT- PTD (Ta t-PTD-DE2) の各アミノ酸を DEループに挿入されたウィルスタンパ ク質からなる各粒子を、 HeLa細胞に感染させ、 2時間後に細胞を回 収し、 細胞に侵入した粒子量 （VP1の量） を Western Blotで検出し た。 細胞の回収の際にトリプシンで細胞表面に付着する粒子を分解 し、 細胞内に侵入した粒子のみを検出した。 Inputで示されるよう にほぼ同量の粒子を細胞導入に用いたが、 Internalizedで示される ように細胞内に検出された VP1の量は Wtに比べ、 Flag- DE2は殆ど検 出できず、 また TAT- PTD- DE2は Wtよりわずかに低いが、 VP1を細胞内 に検出できた。 この結果は、 HIループへのペプチド鎖導入の場合と 同様に、 DEループにペプチド鎖を導入すること自体が元々のカプシ ド夕ンパク質の細胞指向性を失わせ、 そして TAT- PTDのようなぺプ チド鎖の導入により新たな細胞指向性が獲得できる事を示している (図 11) 。
実施例 10. 改変型ウィルス様粒子の機能解析（2)
実施例 8に記載の実験を反復した。 但し、 トリプシンを用いる方 法に代えて、 共焦点顕微鏡を用いて観察を行なった。 HIループに F1 ag配列を挿入した Flag— HI1、 HIループに 3 XRGD配列 (RGD-RGD-RGD ) を挿入した 3XRGD— ΗΠ、 DEループに FFlag配列を挿入した Flag— DE2及び DEループに 3XRGD配列 （RGD- RGD-RGD) を挿入した 3XRGD— DE2、 並びに野生型 VLP (Wt) を試験した。 抗— Vpl抗体により検出 した結果を図 12に示し、 共焦点顕微鏡を用いて観察した結果を図 13 に示す。
図 13において、 白い球状体は細胞核を示し、 その周囲に雲状に分 布する灰白色領域は細胞に取り込まれた VLPの集合を示す。
上記の結果、 HIループ又は DEループに 3XRGD配列 （RGD-RGD- RGD ) を挿入した 3XRGD— DE2は、 野生型 VLPと同等に細胞に取り込まれ た。 結果を表 3にまとめる。 表 3
Figure imgf000018_0001
実施例の結果のまとめ
ヒ ト免疫不全症候群ウィルス （HIV) の TAT- PTD 配列 （Tyr- Gly_A rg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) (配列番号 ： 2 ) 又はイン テグリン認識配列 （RGD) を含むアミノ酸配列 3xRGD ( Arg-Gly-Asp- Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp) (配列番号 ： 3 ) 、 あるいは Flag配列
(Asp- Tyr- Lys- Asp-Asp- Asp- Asp- Lys) (配列番号 ： 1 ) などを SV4 0 VPlカプシドタンパク質の表面ループ、 具体的には VP1アミノ酸 13 6番目から 139番目の間、 あるいは 272番目から 275番目の間に導入し 、 そしてその改変型 VP1で粒子を形成させた。 導入したアミノ酸配 列の如何に関わらず、 改変型 VP1は粒子を形成することができた。
また挿入されたアミノ酸配列は、 改変型 VP1を変性しなくても抗 体などで認識させる事ができ、 粒子表面に提示されていた。 この粒 子を用いて CV-1あるいは HeLa細胞などに導入させたところ、 Flagを 導入した改変型粒子は細胞に接着する事が殆どできなかつた。 一方 3 xRGDを導入した粒子は細胞に接着はできたが、 野生型に比べて侵 入の効率は低かった。 ところが、 TAT- PTD配列を導入した粒子は細 胞に接着、 そして侵入できその効率は野生型 VP1で構成された粒子 より少しであるが上回っていた。 つまり野生型のウィルス力プシド タンパク質がもともと持つ細胞指向性がぺプチド鎖揷入によって不 活化されていたが、 挿入したペプチド鎖の機能によって新しい細胞 指向性が与えられた事を示している。 産業上の利用可能性
外来性ぺプチド鎖をウイルスカプシド夕ンパク質の適所に挿入す る事により、 そのカプシドタンパク質の粒子形成を阻害することな く効率的なペプチド鎖の提示を行う ことができた。 このペプチド鎖 の挿入により、 ウィルスカプシドタンパク質がもつ元々の細胞指向 性が阻害され、 そして導入したぺプチド鎖で粒子の細胞指向性を制 御することができた。

Claims

1 . 霊長類に感染するパポバウィルスのカプシ ドタンパク質の力 プシ ド粒子表面を形成するアミ ノ酸残基に、 1 〜数個のスぺーサ一 アミ ノ酸残基により挟まれた外来性ペプチドが挿入されている、 改 変されたカプシドタンパク質。
請
2 . 前記霊長類に感染するパポバウィルスが SV40、 J CV又は BKVで ある、 請求項 1 に記載の改変されたカプシ ドタンパク質。
3 . 前記スぺ一サーアミ ノ酸残基が、 グリ シン、 セリ ン又はァラ ニンである、 請求項 1 又は 2 に記載の改変されたカプシドタンパク 質。 囲
4 . SV40のカプシド夕ンパク質の DEループ及び HIループの少なく とも一方に、 1〜数個ずつのグリ シン残基により挟まれた外来性べ プチドが揷入されている、 改変された SV40のカプシドタンパク質。
5 . 前記 SV40力プシド夕ンパク質が SV40 VP 1力プシ ドタンパク質 である、 請求項 4に記載の改変された SV40のカプシドタンパク質。
6 . 前記 DEループにおける外来ペプチド挿入部位が、 SV40 VP 1力 プシ ドタンパク質の N -末端から数えて 127位のアミ ノ酸と 146位のァ ミノ酸との間であり、 そして前記 HIループにおける外来ペプチド揷 入部位が、 SV40 VP 1カプシドタンパク質の N-末端から数えて 268位 のアミ ノ酸と 277位のアミ ノ酸との間である、 請求項 5 に記載の改 変された SV40のカプシドタンパク質。
7 . 前記グリ シン残基の数が、 前記外来性ペプチドの一方の端に つき 1 〜 6個である、 請求項 4〜 6 のいずれか 1項に記載の改変さ れた SV40のカプシドタンパク質。
8 . 前記グリ シン残基の数が、 前記外来性ペプチドの一方の端に つき 3 〜 6個である、 請求項 7 に記載の改変された SV40のカプシド タンパク質。
9. 前記外来性ペプチドが、 Flag配列 （Asp- Tyr-Lys- Asp-Asp- As P-Asp-Lys) (配列番号 ： 1 ) 、 Myc配列 （Glu- Asn_Lys- Leu- Leu-I 1 e-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu) (配列番号 ： 4 ) 、 HA配列 （Tyr- Pro - Ty r-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) (配列番号 ： 5 ) 、 Tat_PTD配列 (Ar g-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) (配列番号 ： 6 ) 、 ポリ リ ジン配列（3) (Lys-Lys-Lys) (配列番号 ： 7 ) 、 ポリ リジン配列（6 ) (Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) (配列番号 ： 8 ) 、 ポリ リジン（12)
(Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) (配歹 U番 号 ： 9 ) 、 NGR配列 （Gln-Gly-Arg) (配列番号 ： 10) 、 6xHis配列
(His- His- His- His-His- His) (配列番号 ： 11) 又はポリ リジン配 列（8) (Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) (配列番号 ： 12) であ る、 請求項 4〜 8のいずれか 1項に記載の改変された SD40のカプシ ドタンパク質。
10. 前記外来性ペプチドが、 抗原ェピトープを含んで成る、 請求 項 4〜 8のいずれか 1項に記載の改変された SV40の力プシドタンパ ク質。 .
11. 前記抗原ェピトープが、 ヒ ト免疫不全症候群 （HIV) の TAT-P TD配列 (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) (配列 番号 ： 2 ) 又はインテグリン認識配列 （RGD) を含むアミノ酸配列 3 xRGD (Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp) (配列番号 ： 3 ) である、 請求項 4〜 8及び 1 0のいずれか 1項に記載の改変された SV40のカプシドタンパク質。
12. 請求項 4〜 1 1のいずれか 1項に記載の改変された SV40の力 プシド夕ンパク質から形成されるウィルス様粒子。
13. 生'理活性物質を封入している請求項 1 2 に記載のウィルス様 粒子。
14. 前記生理活性物質が医薬活性成分である、 請求項 1 3 に記載 のウィルス様粒子。
15. 前記生理活性物質が遺伝子治療用核酸である、 請求項 1 3 に 記載のウィルス様粒子。
16. 請求項 1 4に記載のウィルス粒子を含んで成る医薬組成物。
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