WO2006088198A1

WO2006088198A1 - ハムスターigf-1を用いたタンパク質の製造方法

Info

Publication number: WO2006088198A1
Application number: PCT/JP2006/303045
Authority: WO
Inventors: Hisahiro Tabuchi; Saeko Tanaka
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2005-02-21
Filing date: 2006-02-21
Publication date: 2006-08-24
Also published as: JP4999677B2; EP2172480A2; AU2006215012B2; HK1112254A1; TWI406870B; EP2172480B1; JPWO2006088198A1; SG174827A1; CA2598570C; AU2006215012A1; US20090011453A1; EP2172480A3; AU2006215012B8; CA2598570A1; KR20070115945A; TW200640946A; CN101151276B; CN101151276A; EP1857465A4; KR101273001B1

Abstract

　（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつインスリン様成長因子１（IGF-1）活性を有するポリペプチド、からなる群より選択されるポリペプチド；前記ポリペプチドをコードするDNA；前記DNAを含むベクター；前記ベクターを含む宿主細胞、ならびに前記ポリペプチドを用いて組換えタンパク質を製造する方法。

Description

明細書

ハムスター IGF-1を用いたタンパク質の製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、新規なハムスター IGF-1ポリペプチドに関する。本発明はさらに、上記新規な IGF-1ポリペプチドを利用して、効率よく安価に所望の組換えタンパク質を製造する方法に関する。

背景技術

[0002] 遺伝子組換え技術を用いて、医薬として有用なタンパク質を生産する際に、動物細胞を用いると、細菌細胞が行、得な、ような複雑な翻訳後修飾やフォールデイングが可能となるため、動物細胞は組換えタンパク質生産のための宿主細胞として多用されてきている。

[0003] 従来、動物細胞を培養して該動物細胞の産生する天然型タンパク質を得ようとする場合、あるいは所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞を培養して所望のタンパク質等を製造する場合には、塩類、糖類、アミノ酸類、およびビタミン類等の基礎栄養物のほかに、該動物細胞の増殖のために、通常哺乳動物由来の抽出物、具体的には牛胎児血清などの血清を 5〜20%の範囲で培地に添加しなければならなかった。しかしながら、 1)かかる哺乳動物由来の血清は高価であること、 2)品質にロット間差があるため安定した増殖が得られないこと、 3)ウィルス又はマイコプラズマ汚染される可能性があること、及び 4)培養培地からの細胞産物である所望のタンパク質の単離、精製を複雑ィ匕することなどの欠点があった。したがって、血清を含まない培地で動物細胞を培養し、安価に組換えタンパク質を生産しうる技術が求められていた。

[0004] タンパク質製造を無血清培地でおこなうためには、血清に含まれる増殖因子を加える必要があり、例えば、 CHO細胞の培養の際には通常、ヒ HGF-1 (インスリン様成長因子 1 : insulin-like growth factor 1)を添カ卩することにより、細胞増殖および生存率を改善し、長期培養あるいは大量培養を可能にして、る。

[0005] IGF-1は、インスリンと類似の活性を持つポリペプチドとして発見された 70アミノ酸の単鎖ポリペプチドであり、プロインスリンと類似した構造を持っている。 IGF-1は細胞増殖作用とともにインスリン様の代謝活性を有し、個体の成長に最も重要な成長因子のひとつである。 IGF-1は脳下垂体から分泌される成長ホルモン（Growth Hormone； G H)の作用を受けて肝臓で産生され、遠隔の標的である骨糸且織の成長を促進するとともに、筋肉や脂肪細胞において代謝活性を示すものと考えられている。

[0006] 近年、上述のような内分泌的作用にカ卩えて、様々な細胞培養系にお、て IGF-1が産生され、また IGF-1がこれらの細胞に対して増殖作用のみならず種々の生理活性を持つことが報告されている。また、 IGF-1のもつ細胞増殖促進作用に着目して、組換えタンパク質を生産する動物細胞培養系にヒト IGF-1などの増殖促進作用を有するポリペプチドをコードする DNAを導入する組換えタンパク質の製造方法が提案されて!、る (US 2002/0102650 A1)。

[0007] IGF-1のような各種増殖因子はヒト由来の組換え体が使用される力非常に高価であり、製造コストの観点から、 IGF-1の添加量を減少させることが望まれていた。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、製造コストが低ぐかつ強力な細胞増殖促進作用を有する新規な IGF-1 ポリペプチドを得ることを目的とする。本発明はさらに、上記新規な IGF-1ポリべプチドをコードする DNAを利用して、効率よく安価に組換えタンパク質を生産できる宿主動物細胞を作製することを目的とする。本発明はさらに、かかる宿主動物細胞を用いて組換えタンパク質を製造する方法の提供を目的とする。

課題を解決するための手段

[0009] 上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らはハムスター由来の新規なインスリン様成長因子 1 (IGF-1)ポリペプチドを発見し、該新規 IGF-1ポリべプチドが動物細胞の培養において顕著な細胞増殖促進作用を有することを発見して本発明を完成した。

[0010] すなわち、本発明は以下のものを提供する。

1. (1)配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び

(2)配列番号 1に記載のアミノ酸配列において、 3番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつインスリン様成長因子 1 (IGF-1)活性を有するポリペプチド、

からなる群より選択されるポリペプチド。

2. 3番目のアミノ酸がセリンに置換されている前記 1記載のポリペプチド。

3. 3番目のアミノ酸がリジンに置換されている前記 1記載のポリペプチド。

4.前記 1記載のポリペプチドをコードする DNA。

5.前記 4記載の DNAを含むベクター。

6.前記 5記載のベクターを含む宿主細胞。

7. CHO細胞である前記 6記載の宿主細胞。

8.前記 6または 7記載の宿主細胞を用いて、前記 1記載のポリペプチドを製造する方法。

9.前記 1記載のポリペプチドと結合する抗体。

10.前記 1記載のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする DNAが導入された、所望のタンパク質を生産するための細胞。

11.前記 1記載のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする DNAが単一のベクターにより同時に導入されて、る前記 10記載の細胞。

12.前記 1記載のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする DNAが複数のベクターにより別々に導入されて、る前記 10記載の細胞。

13. CHO細胞である前記 10〜 12の!、ずれかに記載の細胞。

14.前記 10〜13のいずれかに記載の細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法。

15.前記 1記載のポリペプチドを含有する培地。

16.前記 1記載のポリペプチドが培地に添加することにより培地に含有される前記 15 記載の培地。

17.前記 1記載のポリペプチドが宿主細胞力分泌されることにより培地に含有される前記 15記載の培地。

18.無血清培地、もしくは前記 1記載のポリペプチド以外に哺乳動物由来の成分を含まな!/ヽ培地である前記 15〜 17の!ヽずれかに記載の培地。 19.前記 15〜 18のいずれかに記載の培地を用いて CHO細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法。

20.以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードする DNAを導入する工程、

(b) (a)で作製した細胞に、 IGF- 1をコードする DNAを導入する工程。

21.以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

(b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程、

(c) (b)で選択した細胞に、 IGF- 1をコードする DNAを導入する工程。

22.以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードする DNAと IGF-1をコードする DNAを同時に導入する工程、

(b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程。

23.所望のタンパク質をコードする DNAと IGF-1をコードする DNAを含む単一のベタターを用いて、 CHO細胞に所望のタンパク質をコードする DNAと IGF-1をコードする D NAを同時に導入する前記 22記載の方法。

24.以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

(a) CHO細胞に IGF-1をコードする DNAを導入する工程、

(b) (a)で作製した細胞に、所望のタンパク質をコードする DNAを導入する工程。

25.以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

(a) CHO細胞に IGF-1をコードする DNAを導入する工程、

(c) (b)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程。

26. IGF-1が請求項 1記載のポリペプチドである、前記 20〜25のいずれかに記載の作製方法。

27.以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞のスクリーニング方法：

(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードする DNAを導入する工程、 (b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程、

(c) (b)で選択した細胞に IGF-1をコードする DNAを導入する工程、

(d) (c)で作製した細胞から所望のタンパク質および IGF-1を発現する細胞を選択する工程。

28. IGF-1が請求項 1記載のポリペプチドである、請求項 27記載のスクリーニング方法。

図面の簡単な説明

[図 1]本発明の CHO細胞由来ハムスター IGF-1遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。

[図 2]本発明の CHO細胞由来ハムスター IGF-1とヒ HGF-1間のアミノ酸配列を比較した図である。

[図 3]ハムスター IGF-1の 70アミノ酸の N末から 3番目のマイナス電荷を有する Eを R、 Kおよび Sに変換し、電荷をプラス側にシフトさせた活性型のハムスター IGF-1を示す図である。（+ )は正電荷をもつアミノ酸、（-)は負電荷をもつアミノ酸、（士）は電荷をもたないアミノ酸を示す。

[図 4]変異を導入したハムスター IGF-1を発現させるためのプラスミドを示す図である

[図 5]天然型及び改変型ハムスター IGF-1の増殖能に及ぼす効果を示すグラフである。

[図 6]天然型及び改変型ハムスター IGF-1の生存率に及ぼす効果を示すグラフである。

[図 7]ハムスターおよびヒト IGF- E3S)導入抗 IL6R抗体産生細胞の Fed-Batch培養における抗体産生量比較を示すグラフである。

[図 8]ハムスター、マウスおよびヒト IGF- E3S)導入抗 IL6R抗体産生細胞の Fed-Bat ch培養での抗体産生量を示すグラフである。

[図 9]ハムスター、マウスおよびヒト IGF- E3S)導入抗 IL6R抗体産生細胞の 3株中で産生量力 Sもっとも高力つた最上位株の抗体産生量比較を示すグラフである。

[図 10]ハムスター、マウスおよびヒト IGF- E3E)導入抗 IL6R抗体産生細胞の Fed-Ba tch培養での抗体産生量を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明のポリペプチドは、図 1及び配列番号 1に示すアミノ酸配列を有する分泌型の成熟ハムスター IGF-1が好ましいが、前駆型ハムスター IGF-1であってもよい。

[0013] また、本発明のポリペプチドは、配列番号 1に示すハムスター IGF-1のアミノ酸配列において、 3番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつィンスリン様成長因子 1 (IGF-1)活性を有するポリペプチドも含む。置換されるアミノ酸は特に限定されず、如何なるアミノ酸に置換されてもよいが、セリン、リジン、又はァスノラギン酸に置換されることが好ましぐ特にセリンまたはリジンに置換されることが好ましい。

[0014] 本発明において、インスリン様成長因子 1 (IGF-1)活性を有するという用語は、動物細胞に対する増殖促進活性及び Z又は生存率上昇活性を有することをいう。

[0015] 本発明では、「ポリペプチド」を「タンパク質」と同義に用いることがある。

[0016] 本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法により、組換えポリペプチドとして、また天然のポリペプチドとして調製することが可能である。組換えポリペプチドであれば、本発明のポリペプチドをコードする DNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したァフィユティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。

[0017] また、本発明のポリペプチドをダルタチオン Sトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組換えタンパク質として宿主細胞 (例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組換えタンパク質はダルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。

[0018] 融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクター Xaなどにより切断し、除去することも可能である。

[0019] 天然のポリペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のポリべプチドを発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述するハムスター IGF-1ポリべプチドに結合する抗体が結合したァフィユティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であつてもよい。

[0020] また、本発明は、本発明のハムスター IGF- 1をコードする DNAを提供する。本発明の DNAは、上述したような本発明のポリペプチドの in vivoや in vitroにおける生産に利用することが可能である。本発明の DNAは、本発明のポリペプチドをコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、 mRNA力も合成された cDNAである力、ゲノム DNAである力化学合成 DNAであるかなどを問わない。また、本発明のポリぺプチドをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有する DNAが含まれる。

[0021] 本発明の DNAは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドを発現してヽる細胞より cDNAライブラリーを作製し、本発明の DNA の配列（例えば、配列番号 2)の一部をプローブにしてハイブリダィゼーシヨンを行うことにより調製できる。 cDNAライブラリ一は、例えば Sambrook, J. et al.， Molecular Clon ing、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法により調製してもよいし、市販の DNAライブラリーを用いてもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞より RNAを調製し、本発明の DNAの配列に基づいてオリゴ DNAを合成し、これをプライマーとして用いて PCR反応を行い、本発明のポリペプチドをコードする cDN Aを増幅させることにより調製することも可會である。

[0022] 具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のポリペプチドを発現する細胞、組織、臓器などから、 mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァ二ジン超遠心法 (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294—5299)、 AGPC 法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N.， Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)等により全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia)等を使用して全 RNAから mRNA を精製する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia)を用いることにより mRNAを直接調製することちでさる。

[0023] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV

Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、 5'-Ampli FIN DER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reactio n； PCR)を用いた 5'-1¾\じ5法( 01^1&^ M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002； Belyavsky, A. et al" Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-29 32)にしたがい、 cDNAの合成および増幅を行うことができる。

[0024] 後述する本発明の実施例においては、ハムスター IGF-1ポリペプチドをコードする c DNAを、 PCRクローユングにより得た。 PCRプライマーの設計は、既知のラット /マウス /ヒト IGF-1間で遺伝子配列が保存されて、る領域を用いておこなった。

[0025] 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、ベクター DNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とする DNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法により確認することができる。

[0026] また、得られた cDNAをプローブとしてゲノム DNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノム DNAを単離することができる。

[0027] また、本発明の DNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al, Nucle ic Acids Research (1981) 9, r43— 74 )。また、本発明の DNAは、巿販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当な DNAフラグメントの挿入、リンカ一の付加、開始コドン (ATG)及び Z又は終止コドン (TAA、 TGA、又は TAG)の挿入等が挙げられる。

[0028] また、本発明は、本発明の DNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクタ一としては、宿主細胞内において本発明の DNAを保持させるためや、さらに本発明のポリペプチドを発現させるために有用である。

[0029] ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、 JM109、 DH5 a、 DH10 a、 HB101、 XLl-blue)などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子 (例えば、なんらかの薬剤 (アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフエ-コール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescri pt、 pCR- Scriptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクロー-ング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7などが挙げられる。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 a、 DH10 a、 HB101、 XLl-blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター (Wardら, Nature (1989) 341, 544- 546； FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427)、 araBプロモーター（B etterら， Science (1988) 240, 1041- 1043 )、または T7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他に pGEX-5X-l (Ph armacia社製）、「QIAexpress system」（Qiagen社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現して、る BL21が好まし、；)などが挙げられる。

[0030] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/ヽ。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 )を使用すれことが可能である。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩ィ匕カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法を用いて行うことができる。

[0031] 大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するために用いられるベタターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (Invitrogen社製）や、 pEF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18,p5322)、 pEF、 pCDM8)、昆虫細胞由来の発現べクタ ~~ (f列えば「BAC— to— BAC baculovairus expression system」 (Invitrogen 社製、 pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、 pZIpneo)、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression KitJ (Invitrogen社製）、 pNVll、 SP- Q01)、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、 pP L608、 pKTH50)などが挙げられる。

[0032] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（Mulliga nら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモーター（Mizu shimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 RSVプロモーター、 CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、 G418、ノヽィグロマイシン、ピューロマイシンなど）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すればさらに好ま、。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK- RSV、 pBK- CMV、 pOPRSV、 pOPl 3などが挙げられる。

[0033] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート (MTX)により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、 S V40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点を持つベクター (pCDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由来の配列を用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフエレース (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。

[0034] 一方、動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、本発明の DNAを適当なベクターに組み込み、レトロウイルス法、リボソーム法、カチォニックリボソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えば pAdexlcw)やレトロウィルスベクター (例えば pZIPneo)などが挙げられる力これらに制限されない。ベクターへの本発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning ,5.61-5.63)。生体内への投与は、 ex vivo法であっても、 in vivo法であってもよい。

[0035] また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ例えば、大腸菌や CHO細胞などの種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vi troの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

[0036] 真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CHO (j. Exp. Med. (1995) 108, 945)、 COS、 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney )、 HeLa、 Vero、両生類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle, et al.， Nature (1981) 291, 358 - 340 )、あるいは昆虫細胞、例えば、 S19、 S121、 Tn5が知られている。 CHO細胞としては、特に、 DHFR遺伝子を欠損した CHO細胞である CHO dhfr— (Proc. Natl. Acad . Sci. USA (1980) 77, 4216-4220 )や CHO K- 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特に CHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガ一マンハイム社製）を用いた方法、エレクト口ポレーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能である。

[0037] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タパカム（Nicotiana tabacum )由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。また水草による培養 (Biolex社)も有効である。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス (S accharomyces )禺、 f列？ Jま、サッカロセス'セレヒンェ (Saccharomyces cerevisiae ) 、糸状菌、例えば、ァスペルギルス（Aspergillus )属、例えば、ァスペルギルス' -ガ一 (Aspergillus niger )が知られている。

[0038] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌 (E. coli )、例えば、 JM109、 DH5 a、 DH10 a、 HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。

[0039] これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、形質転換された細胞を in vitroで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、 DMEM、 MEM、 RPMI1640, IMDM を使用することができる。その際、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時の pHは、約 6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約 30〜40°Cで約 15〜240時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

[0040] 一方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とする D NAを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。

[0041] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993 )。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェ- ック動物を用いることができる。

[0042] 例えば、目的とする DNAを、ャギ /3カゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジニックャギカも産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 )。

[0043] また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリペプチドをコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Susumu, M. et a 1" Nature(1985) 315, 592-594)。 [0044] さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするポリペプチドをコードする DNAを植物発現用ベクター、例えば pMON 5 30に挿入し、このベクターをァグロバタテリゥム 'ッメファシエンス（Agrobacterium tume faciens )のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ' タパカム（Nicotiana tabacum )に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur.J.Immunol. (1994) 24, 131-138)。

[0045] これにより得られた本発明のポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外 (培地など）力も単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリべプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアタリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。

[0046] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグフスィ ~~等; 0 けられる (Strategies for Protein Purification andし haractenzat ion: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたポリペプチドも包含する。

[0047] なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当なポリペプチド修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾をカ卩えて部分的にペプチドを除去することもできる。ポリべプチド修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダーゼ、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。

[0048] また、本発明は、本発明のポリペプチドと結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなぐポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ゥサギなどの免疫動物に本発明のポリペプチドを免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組換えによるヒト化抗体も含まれる。

[0049] 抗体取得の感作抗原として使用される本発明のポリペプチドは、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。

[0050] 本発明にお、て、感作抗原として使用されるポリペプチドは、完全なポリペプチドであってもよいし、また、ポリペプチドの部分ペプチドであってもよい。

[0051] 本発明のポリペプチド又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターにより本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的のポリペプチド又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、ポリペプチドを発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のポリペプチドを感作抗原として使用してもよい。

[0052] 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的には、げっ歯目、ゥサギ目、霊長目の動物が使用される。

[0053] げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ゥサギ目の動物としては、例えば、ゥサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、力二クイザル、ァカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。

[0054] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate- Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、 4〜21日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。

[0055] ここで、本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液力も公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清力ポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のポリペプチドをカップリングさせたァフィユティーカラムを用いて、本発明のポリぺプチドのみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテイン Aあるいはプロテイン G カラムを利用して精製することにより、免疫グロブリン Gあるいは Mを調製することができる。

[0056] モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。

[0057] 前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルスティンらの方法 (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。

[0058] 細胞融合により得られたハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養液 (ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択される。当該 HAT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日'数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリー- ングおよびクロー-ングを行う。

[0059] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroでポリペプチド、ポリペプチド発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えば U266と融合させ、ポリペプチドへの結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイプリドーマを得ることもできる（特開昭 63-17688号公報)。

[0060] 次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン Aカラム、プロティン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたァフィユティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの精製、検出に用いられる他、本発明のポリべプチドのァゴ-ストやアンタゴ-ストの候補になる。また、この抗体を本発明のポリペプチドが関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的 (抗体治療)で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。

[0061] 例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗原となるポリペプチド、ポリペプチド発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたノ、イブリドーマを用いてポリペプチドに対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号 WO92-03918、 W093-2227, W094 -02602、 W094- 25585、 W096- 33735および W096- 34096参照）。

[0062] ハイプリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子 (oncogene)により不死化させた細胞を用いてもよ!ヽ。

[0063] このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick , J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Ki ngdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照)。組換え型抗体は、それをコードする DNAをノ、イブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクロー-ングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。

[0064] さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、 Fab、 F(ab')2、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv(scFv)(Huston, J . S. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M. S. et al.， J. Immunol. (1994) 1 52, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H.， Methods Enzymol. (1989)178, 476— 496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515；し amoy i, E., Methods Enzymol. (198b; 121, 652- 6t>3； Rousseaux, J. et al., Methods Enzym ol. (1986) 121, 663-669； Bird, R. E. and Walker, B. W" Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。

[0065] 抗体修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野にぉ、て既に確立されて、る。

[0066] また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域力もなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来の CDR湘補性決定領域）とヒト抗体由来の FR (フレームワーク領域)及び定常領域力もなるヒト化抗体として得ることがでさる。

[0067] 前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、ァフィユティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる (Antibod ies： A Laboratory Manual. ti,d Harlow and David Lane, Cola Spring Harbor Laborat ory, 1988)力これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法 (Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)等により行うことができる。

[0068] ァフィユティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。例えば、プロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。

[0069] ァフィユティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる (Strategies for Protein Purification and Char acterization： A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Sprin g Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。

[0070] また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免役吸着検定法 (Enzyme- linked immunosorbent assay； tuJ A)、 EIA ( 酵素免疫測定法)、 RIA (放射免疫測定法)あるいは蛍光抗体法を用いることができる。 ELISAを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のポリペプチドを添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添カ卩し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、トロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。ポリペプチドとしてポリペプチドの断片、例えばその C末端カゝらなる断片あるいは N末端カゝらなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、 BIAcore(Pharmacia製）を使用することができる。

[0071] 本発明は、本発明のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする DNAが導入された、所望のタンパク質を生産するための細胞を提供する。この細胞は所望のタンパク質の製造に有用である。

[0072] 本発明において所望のタンパク質は特に限定されず、抗体 (天然抗体、低分子化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、など)や生理活性タンパク質 (顆粒球コロニー刺激因子（G- CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM- CSF)、エリスロポエチン、インターフェロン、 IL-1や IL-6等のインターロイキン、 t-PA、ゥロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固因子、など)等、如何なるタンパク質でもよいが、特に抗体が好ましい。

[0073] 本発明のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする DNA の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよ、し、複数のベクターを用いて別々に導入されてもよい。

[0074] 本発明のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする DNA が導入される細胞は、特に限定されず、いかなる細胞でもよいが、 CHO細胞、特に C HO dhfr 細胞が好ましい。

[0075] 本発明はさらに、本発明のポリペプチドを含有する培地を提供する。培地中における本発明のポリペプチドの含有量は、使用する培地、培養する細胞及び製造しようとする所望のタンパク質の種類などにより適宜決定することができるが、通常、 0. Img/ L〜5mg/L、好ましくは 0. 2mg/L〜lmg/L、さらに好ましくは 0. 5mg/Lである。

[0076] 本発明のポリペプチドを含有する培地は動物細胞、特に CHO細胞を用いてタンパク質を製造する際に有用である。

[0077] 本発明の培地は、本発明のポリペプチドを含有していればよぐ本発明のポリぺプチドを添加してもよ、し、宿主細胞カゝら分泌してもよヽ。

[0078] 本発明で用いる培地の他の成分としては、通常、細胞 (好ましくは、動物細胞)培養培地で使用されている各成分が適宜使用できるが、これらには通常、アミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、 pH緩衝剤を含む。これらの成分の含量は、通常、アミノ酸は 0.05— 1500mg/L、ビタミン類は 0.001— 10mg/L、脂質因子は 0— 200mg/L、エネルギー源は 1 20g/L、浸透圧調節剤は 0.1— lOOOOmg/ L、鉄源は 0.1— 500mg/L、 pH緩衝剤は 1 10000mg/L、微量金属元素は 0.00001— 2 00mg/L、界面活性剤は 0— 5000mg/L、増殖補助因子は 0.05— 10000 g/Lおよびヌクレオシドは 0.001— 50mg/Lの範囲が適当である力これらに限定されず、培養する細胞の種類、所望のタンパク質の種類などにより適宜決定できる。

[0079] 上記成分のほか、例えば、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子、ヌクレオシドなどを添カ卩しても良い。

[0080] 具体的には、例えば、 L-ァラニン、 L-アルギニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-システィン、 L-シスチン、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-オル-チン、 L-フエ-ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-卜リプ卜ファン、 L-チロシン、 L-ノリン等、好ましくは L-ァラニン、 L-アルギニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-シスチン、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-口イシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-フエ二ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-トリプトファン、 L-チロシン、 L -パリン等のアミノ酸類； i—イノシトール、ビォチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、 P-ァミノ安息香酸、パントテン酸カルシゥム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミン B12 、ァスコルビン酸等、好ましくはピオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミン B12、ァスコルビン酸等のビタミン類；塩化コリン、酒石酸コリン、リノール酸、ォレイン酸、コレステロール等、好ましくは塩ィ匕コリン等の脂質因子；グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース等、好ましくはグルコース等のエネルギー源;塩ィ匕ナトリウム、塩化カリゥム、硝酸カリウム等、好ましくは塩ィ匕ナトリウム等の浸透圧調節剤； EDTA鉄、クェン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、好ましくは塩ィ匕第二鉄、 EDTA鉄、クェン酸鉄等の鉄源類;炭酸水素ナトリウム、塩化カルシゥム、リン酸二水素ナトリウム、 HEPES、 MOPS等、好ましくは炭酸水素ナトリウム等の p H緩衝剤を含む培地を例示できる。

[0081] 上記成分のほか、例えば、硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、塩化スズ、塩化マグネシウム、亜ケィ酸ナトリウム等、好ましくは硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム等の微量金属元素； Tween80、プル口ニック F68等の界面活性剤；および組換え型インスリン、組換え型 IGF- 1、組換え型 EGF、組換え型 F GF、組換え型 PDGF、組換え型 TGF- α、塩酸エタノールァミン、亜セレン酸ナトリウム、レチノイン酸、塩酸プトレツシン等、好ましくは亜セレン酸ナトリウム、塩酸エタノールァミン、組換え型 IGF-1、塩酸プトレツシン等の増殖補助因子；デォキシアデノシン、デォキシシチジン、デォキシグアノシン、アデノシン、シチジン、グアノシン、ゥリジン等のヌクレオシドなどを添加してもよい。なお上記本発明の好適例においては、ストレプトマイシン、ペニシリン Gカリウム及びゲンタマイシン等の抗生物質や、フエノールレッド等の pH指示薬を含んでヽても良、。

[0082] 又、培地に魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を添加してもよい。

[0083] 培地の pHは培養する細胞により異なる力一般的には pH6. 8〜7. 6、多くの場合 pH7.0〜7.4が適当である。

[0084] 培地は、市販の動物細胞培養用培地、例えば、 D-MEM (Dulbecco's Modified Eagl e Medium)^ D— MEM/F— 12 1:1 Mixture (Dulbecco s Modified Eagle Medium： Nutrie nt Mixture F— 12)、 RPMI1640, CHO— S— SFMlKlnvitrogen社)、 CHO-SF (Sigma— Aldri ch社)、 EX-CELL 301 <JRH biosciences社)、 CD- CHO (Invitrogen社)、 IS CHO- V (I rvine Scientific社)、 PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich社)などの培地から調製することが可能である。

[0085] 又、本発明の培地は無血清培地、もしくは本発明のポリペプチド以外に哺乳動物由来の成分を含んでヽな、培地であることが好まし、。

[0086] 本発明は、本発明のポリペプチドを含有する培地を用いて CHO細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法を提供する。

[0087] 本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする DNAが導入された CHO細胞を培養することにより、所望のタンパク質を製造する方法を提供する。

[0088] CHO細胞の培養は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、通常、気相の CO濃度が 0— 40%、好ましくは、 2— 10%の雰囲気下、 30— 39°C、好ましくは、 3

2

7°C程度で、 1 -28日間培養することが可能である。

[0089] また、動物細胞培養用の各種の培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いて培養することができる。

[0090] 本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：

[0091] 本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：

(c) (b)で選択した細胞に、 IGF- 1をコードする DNAを導入する工程。 [0092] 本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：

[0093] 前記の方法において、 CHO細胞に所望のタンパク質をコードする DNAと IGF-1をコードする DNAを同時に導入するときには、所望のタンパク質をコードする DNAと IGF- 1をコードする DNAを別々のベクターにより同時に導入してもよ、し、あるいは所望のタンパク質をコードする DNAと IGF-1をコードする DNAを含む単一のベクターを用いて同時に導入してもよ、。単一のベクターを用いて同時に導入する方が好まし、。

[0094] 本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：

(a) CHO細胞に IGF-1をコードする DNAを導入する工程、

[0095] 本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：

(a) CHO細胞に IGF-1をコードする DNAを導入する工程、

[0096] すなわち、 CHO細胞に所望のタンパク質をコードする DNAと IGF-1をコードする DN

Aを導入するときには、これらをいずれの順序で導入してもよいが、所望のタンパク質の発現量をコントロールしゃす、と、う点からは、 IGF-1をコードする DNAを所望のタンパク質をコードする DNAと同時に導入する力ある、は所望のタンパク質をコードする DNAを導入した後に IGF-1をコードする DNAを導入するのが好ましい。

[0097] 前記の種々の所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法にぉ、ては、 IGF -1が本発明のポリペプチドであることが好ましい。

[0098] 本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞のスクリーニング方法を提供する： (a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードする DNAを導入する工程、

[0099] 上記のスクリーニング方法においては、 IGF-1が本発明のポリペプチドであることが好ましい。

[0100] 本発明の所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法又は所望のタンパク質の製造に用いる細胞のスクリーニング方法で用いられる IGF-1をコードする遺伝子は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ハムスターなど如何なる動物由来の IGF-1でもよいが、ハムスター IGF-1が好ましい。なお、ハムスター IGF-1以外の IGF-1配列は、 Nucleic Acids Res. 14 (20), 7873-7882 (1986)及び J. Biol. Chem. 262 (16), 7894-79 00 (1987)に記載されている。

[0101] 本発明者らは、後述する実施例に示すように、抗体を産生させるために確立した細胞に、本発明のポリペプチドをコードする DNAを導入し、活性型 IGF-1を発現させることにより、 IGF-1無添加培養において理想的な培養挙動をもつ抗体産生用細胞を確立できることを確認した。本発明のポリペプチドを導入した抗体産生細胞は、増殖能、生存率に優れており、かつ抗体産生量においても極めて優れた効果を示した。本発明は、あらゆる所望のタンパク質の産生細胞、特に抗体産生細胞への応用が可能であり、産業上の利用価値は極めて大きい。

[0102] 本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。実施例

[0103] 実施例 1：ハムスター IGF-1をコードする cDNAのクローニング

(l) cDNAの合成

CHO- DXB11細胞に抗インターロイキン 6レセプター（IL-6R)抗体遺伝子を導入した抗 IL-6R抗体産生細胞 (特開平 8-99902号公報、参考例 2)から total RNA抽出を行つた。得られた mRNAから cDNAを合成した。具体的には以下の方法で行った。継代後 72時間経過した細胞増殖期にある約 5x 10⁶個の CHO細胞を、 4°C、 1 , OOOrpmで 5分間遠心により、培養液を含まない遠心管の底にパックされた状態で得たのち、あら力じめ 65°Cに暖めておいたセパゾ一ル RNA Iを 4mlカ卩えて、ピペッティングによりすばやく溶かし、室温で 5分間放置した。さらに 0. 8mlのクロ口ホルムをカ卩え、 Voltexでよく攪拌したのち、室温で 3分間放置した。冷却遠心機 Avanti™J25 (BECKMAN製)により 4°C、 7, OOOrpmで 5分間遠心ののち、上層を慎重に採取し、新しい 15mlチューブに移した。 4mlの 2—プロパノールをカ卩え、 Voltexでよく攪拌したのち、室温で 10分間放置した。 4°C、 7, OOOrp mで 10分間遠心ののち、上清を完全に除き、 RNAペレットを得た。 4mlの 75%ェタノールで遠心管の壁面をよくリンスし、 4°C、 7, OOOrpmで 5分間遠心した。上清を完全に除いたのち、 4mlの 100%エタノールをカ卩えてさらにリンスした。 4°C、 7, OOOrpmで 5分間遠心により RNAペレットを得たのち、室温で 30分間放置した。空気乾燥させた RNAペレットは、 100 /z lの DEPC— Waterをカ卩え、ピペッティングにより完全に溶解した。さらに、 RNeasy Mini Kitのプロトコールに従い total RNAを精製した。得られる 30 1の total RNAの濃度測定は、分光光度計 DU640を用いておこない、波長 260nmの吸光度 lOD =40 /z gZmlとして RNA濃度を算出した。高純度 total RNA 5 μ gを cDNA合成に用した。高純度の total RNA 5 μ gは DEPC— Water で 10 μ 1に調製したのち、 1 μ 1の HPLCグレード 100 pmolZ μ \ Τ7 - (Τ) プライ

24 マーをピペッティングにより加え、完全に混合したのちスピンダウンした。プライマーをァニールさせるため 70°Cで 10分間熱したのち、すばやくスピンダウンし氷上に置いた。氷上で 2分以上経過後、 4 μ 1の 5x First— strandバッファー、 2 μ 1の 0. 1M D ΤΤ、 1 μ 1の 10mM dNTP Mixをピペッティングにより加え、 4°Cでスピンダウンし、氷上に置いた。 42°Cのヒートブロック上でインキュベーションを開始し、 2分経過したところで 2 μ 1の SuperScriptll Reverse Transcriptase Mixをピペッティングにより加え、 First— strand合成反応を開始した。 60分経過したら、すばやくスピンダウンし、氷上に置いた。つづけて Second— strand合成反応をおこなうため、 91 1の DEP C -Water, 30 μ 1の 5xSecond— strandバッファー、 3 μ 1の 10mM dNTP Mix、 1 μ 1の E. coli DNA ligase、 4 μ 1の E. coli DNA polymerase, 1 μ 1の E. coli R Nase Hをピペッティングにより順番に加えたのち、 4°Cでスピンダウンし、氷上に置いた。 16°Cで 120分間インキュベーションし、 Second— strand合成をおこなった。 2 時間後、 2 1の丁4 DNApolymeraseを加え、さらに 5分間のインキュベーションしたのち、すばやくスピンダウンし、氷上に置いた。 152 1の 25 : 24 : 1フエノーノレ：クロ口ホルム：イソアミルアルコールを加え、 30秒間ボルテックスののち、スピンダウンし、さらにピペッティングにより混合し、あらかじめ 1分間遠心してゲルをパックしておヽたフエイズロックゲルチューブにアプライした。 4°Cで 15, OOOrpm 2分間遠心後、水層を新しい 1. 5mlエツペンドルフチューブに移し、 0. 5 1のペレットペイント、 76 μ 1の酢酸アンモ-ゥム 7. 5Μ溶液の順に加え、よくボルテックスした。 600 1の 99. 5%ェタノールを加え、 30秒間ボルテックスののち、室温で 5分放置した。 4°Cで 15, 000rp m 10分間遠心し、未反応 dNTPを除いた cDNA沈殿を得た。 cDNAは 500 1の 7 5%エタノールをカ卩え、 4°Cで 15, OOOrpm 3分間遠心した。洗浄を 2回繰り返すことで脱塩し,さらに 100 1の 99. 5%エタノールを加えて 4。Cで 15, OOOrpm 5分間遠心したのち、エタノールを完全に除いた。約 5分間の空気乾燥ののち、 1. 5 /z l RN ase free Waterに溶かし、 cDNAとして— 20°Cで保存した。 50分の 1量を PCRのテンプレートとして使用した。

(2)ハムスター IGF- 1をコードする cDNAのクロー-ング

ハムスター IGF-1遺伝子は、 PCRクローユングにより得た。 PCRプライマーの設計は既知であるラット /マウス/ヒト IGF1間で遺伝子配列が保存されてヽる領域を用いておこなった。

具体的には以下の方法により行った。成熟型ラッ HGF-1の N末端 13番目の Alaから 19番目の Glyをコードする遺伝子配列： 5'-gctcttcagttcgtgtgtgg (配列番号 3)をフォヮ一ドプライマ一に、 N末端 50番目の Argから 56番目の Argをコードする遺伝子の相補鎖配列： 5'-ctcctcagatcacagctccg (配列番号 4)をリヴアースプライマーに用いて、上記 cDNAを铸型に PCR反応をおこなった。 95°C、 5分間の前処理後、 98°C、 5秒間のディネ一チヤ一、 53°C、 30秒間のアニーリング、 72°C、 30秒間の伸長反応を 35 回繰り返し、目的の遺伝子を増幅後に、 72°C、 10分間の伸長反応を加えて、 131bp のハムスター IGF— 1 PCRフラグメントを得た。 [0106] 得られた PCR断片の塩基配列を調べることでハムスター IGF-1を増幅した DNAであることを確認し、その配列情報を用いてさらに PCR反応を続けた。 N末端 29番目の Thrから 35番目の lieをコードする遺伝子配列： 5'-acaggctatggctccagcatt (配列番号 5 )をフォワードプライマーに、 N末端 85番目の Ginから 77番目の Argをコードする遺伝子の相補鎖配列： tgagtcttgggcatgtcagtg (配列番号 6)をリヴアースプライマーに用いて、上記 cDNAを铸型に PCR反応をおこなった。 95°C、 5分間の前処理後、 98°C、 5秒間のディネ一チヤ一、 53°C、 40秒間のアニーリング、 72°C、 90秒間の伸長反応を 35回繰り返し、目的の遺伝子を増幅後に、 72°C、 10分間の伸長反応を加えて、 1 70bpのハムスター IGF-1 PCRフラグメントを得た。以上の結果、熟型ハムスター IGF -1の N末端 13番目の Alaから C末端の 70番目 Alaまでの塩基配列を得た。

[0107] さらに N末端側の配列を得るために、成熟型ラット IGF-1の N末端の 5'に相当する塩基である gからさらに 5 '側マイナス 33塩基の tから 14番目の gを含む配列： 5'-tgctt gctcacctttaccag (配列番号 7)をフォワードプライマーに、 N末端 50番目の Argから 56 番目の Argをコードする遺伝子の相補鎖配列： 5'-ctcctcagatcacagctccg (配列番号 8) をリヴアースプライマーに用いて、上記 cDNAを铸型に PCR反応をおこなった。 95°C 、 5分間の前処理後、 95°C、 30秒間のディネ一チヤ一、 44°C、 60秒間のァニーリング、 72°C、 90秒間の伸長反応を 35回繰り返し、目的の遺伝子を増幅後に、 72°C、 1 0分間の伸長反応をカ卩えて、 185bpのハムスター IGF-1の N末端領域を含むフラグメントを得た。

実施例 2 :ハムスター IGF-1をコードする cDNAの塩基配列及びアミノ酸配列の決定クロー-ングした遺伝子は DNAシ-ケンサ一にて塩基配列を決定し、さらにこれからアミノ酸配列を決定し、ハムスター IGF-1をコードしていることを確認した。得られたァミノ酸配列を図 1及び配列番号 1に、 DNA配列を配列番号 2に示す。

[0108] 成熟分泌型 IGF-1は種を超えて 70アミノ酸力もなる力ハムスター IGF-1遺伝子は特異的な配列を有しており、ヒト IGF-1との比較では 20番目の P (Human : D ), 35番目の I (Human: S ), 67番目の T (Human: A )の 3アミノ酸力ヒト配列と異なっている（図 2)。

実施例 3：改変型ハムスター IGF-1遺伝子の作製及びその IGF-1活性 (1)改変型ハムスター IGF-1遺伝子の作製

分泌型ハムスター IGF-1遺伝子は N末から 3番目にマイナス電荷をもつ E (グルタミン酸)を有する。この部位のアミノ酸をプラス電荷側にシフトするアミノ酸に変換した改変型ハムスター IGF-1遺伝子を作製した。 IGF-1遺伝子への変異導入は Site-directed Mutagenesis^によりおこなつ 7こ。

[0109] 天然型ハムスター IGF-1遺伝子及び得られた改変型ハムスター IGF-1遺伝子をそれぞれ、 E3E (天然型）、 E3K (3番目のグルタミン酸をリジンに変換）、 E3S (3番目のグルタミン酸をセリンに変換)と称する（図 3参照)。

(2)天然型及び改変型ハムスター IGF-1の増殖能及び生存率に及ぼす効果改変型ハムスター IGF-1遺伝子を発現させるプラスミド（図 4)を構築し、親株である抗 IL-6R抗体産生 CHO細胞に導入し、ハイグロマイシンによる薬剤耐性株を選択、 St ableに発現する細胞株を得た。得られた細胞株はさらに Limiting Dilutionによりシンダルセルクローユングをおこな、、 IGF-1無添加の無血清培地で増殖能の高!、クローン細胞を得た。

[0110] それぞれの異なる電荷をもつ E3E、 E3K、 E3Sから得られたクローン細胞の中力 M E45(E3E)、 MK44(E3K)、 MS19(E3S)を選択し、 IGF-1無添カ卩の無血清培地における、 100mlスピンナーフラスコでの細胞の増殖能及び生存率を比較した。親株である抗 IL -6R抗体産生細胞にっ、ても、 JRH社より購入したヒ HGF- 1 (Long™R³IGF-l)添カロ培地と無添加培地で培養して比較した。 S100スピンナーフラスコに 100mlの MRA 継代用無血清培地を加え、 37°Cの COインキュベーター内で 1時間コンディショニン

2

グしたのち、おのおの 3xl0⁶個の細胞を遠心して加えた。 lmLの培養液を分取して初発の細胞数および生存率を測定した。 3日目以降、 7日目までの細胞数および生存率は定時に lmLずつ分取して測定した。

[0111] 得られた結果を図 5 (増殖能）と図 6 (生存率）に示す。 MS19(E3S)は増殖能、生存率、ともに最も優れていることが判明した。 MS19(E3S)は、培養 7日目においても 80%以上の生存率を示した。次いで、 MK44(E3K)が良好な結果を示した。また親株である抗 IL-6R抗体産生細胞は IGF-1無添加培養では増殖不能であった。 MS19の増殖能は、培養 3日目力も 6日目にかけて顕著であり、特に 4日目から 5日目の倍加時間（MS1 9; 26.5 hr, MK44 33.0 hr, ME45; 47.0 hr,抗 IL- 6R親株； 86.7 hr)、および最高到達細胞数（MS19; 25.8 X 10⁵ cells/ml, MK44; 20.3 x 10⁵ cells/ml, ME45; 7.98 x 10⁵ eel ls/ml,抗 IL-6親株； 21.7 x 10⁵ cells/ml)から MS19の優位性は明らかであった。細胞増殖の立ち上がりがゆるやかであり、その後は培養後期まで一気に伸びるという MS1 9の培養挙動は、抗体産生用細胞として理想的であった。また、生存率の比較において培養 7日目で顕著であるように（MS19; 86.2 %, MK44 66.4 %, ME45; 58.1 %,抗 I L-6親株； 76.0 hr%)、 MS19は培養後期までもっとも安定な細胞であった。

実施例 4 :ハムスター IGF-KE3S)導入細胞の抗体産生量

ノ、ムスター IGF-1がヒト IGF-1以上の抗体産生量ポテンシャルをもつことを示すために、ノ、ムスター IGF- E3S)とヒト IGF- E3S)を親株に導入した細胞中でもっとも培養挙動のよいシングルクローンの抗 IL-6R抗体産生量を比較した。ヒト IGF-KE3S)発現プラスミドはハムスター IGF-1(E3S)を铸型にして P20D, I35S, T67A変換のための変異導入を順におこなうことで構築した。実施例 1と同様に親株抗 IL6-R抗体産生 C HO細胞に導入し、 Hygromycin耐性細胞を選択したのち、 IGF-1(E3S)を安定的発現にすることで IHF-1無添加培地中における増殖能を獲得した細胞株を選抜した。細胞株を限界希釈することでシングルクローンを得て、さらに増殖に優れた IGF- E3S) 導入細胞を用いた Fed-Batch培養をおこなって抗体産生量を比較した.

得られた結果を図 7に示す。ハムスター IGF-KE3S)導入細胞の抗体産生量は培養 8日目で 973mg/Lであり、親株（843mg/L)、ヒト IGF- 1(E3S)導入細胞（821mg/ L)よりも優位であった。親株に対して最適化された培養方法にもかかわらずノヽムスタ一導入細胞の抗体産生量が最も高ヽことが確認された。

実施例 5 :ハムスター IGF-KE3S)導入細胞の抗体産生量

実施例 4でハムスター IGF-1がヒト IGF-1以上の抗体産生量ポテンシャルをもつことを示したこと力ら、さらにマウス IGF-1をカ卩えた 3種の IGF-1の抗体産生量ポテンシャルを比較した。マウス IGF- E3S)発現プラスミドはハムスター IGF- E3S)を铸型にして S69A変換のための変異を導入することで構築した。今回は変異体 IGF-KE3S)に加えて天然型 IGF- E3E)の 3種間比較も併せておこなうために、ノ、ムスター、ヒト、マウス IGF- E3S)を铸型に E3Eへの変異を導入して、それぞれの天然型 IGF-1(E3E) 発現プラスミドを構築した。

[0112] 得られた 6種の IGF-1発現プラスミドは同時調製した親株にエレクト口ポレーシヨン法で導入され、 Hygromydn耐性細胞を選択したのち、 IGF-1を安定的発現にすることで IGF-1無添加培地中における増殖能を獲得した細胞株中でもっとも増殖の良力つた細胞を 3株ずつ選抜した (n=3)。拡大過程でヒト IGF-KE3E)の 1株は増殖不良になつたのでヒト IGF- E3E)のみ n=2で実験を続けることにして、合計 17細胞株は 100ml スピンナー培養で拡大ののち Fed-Batch培養による抗体産生量比較をおこなった。

[0113] 図 8は、ノ、ムスター、マウスおよびヒト IGF- E3S)導入細胞の Fed-Batch培養における抗体産生量を示す。増殖のよかった各種 3株 (n=3)の平均産生量はハムスター > マウス〉ヒトの順で優位であった。図 9は、ノ、ムスター、マウスおよびヒト IGF- 1(E3S) 導入細胞の 3株中で最上位の抗体産生量をもつ株の比較である。平均産生量にカロえて、最上位株の産生量にぉ、てもハムスター IGF- E3S)導入株が優位であった。図 10は、ノ、ムスター、マウスおよびヒト IGF- E3E)導入細胞の Fed-Batch培養における抗体産生量を示す。増殖のよかった各種平均産生量は天然型 IGF-KE3E)導入株にお、てもハムスター >マウス >ヒトの順で優位であった。

Claims

請求の範囲

[I] (1)配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び

力なる群より選択されるポリペプチド。

[2] 3番目のアミノ酸がセリンに置換されている請求項 1記載のポリペプチド。

[3] 3番目のアミノ酸がリジンに置換されて、る請求項 1記載のポリペプチド。

[4] 請求項 1記載のポリペプチドをコードする DNA。

[5] 請求項 4記載の DNAを含むベクター。

[6] 請求項 5記載のベクターを含む宿主細胞。

[7] CHO細胞である請求項 6記載の宿主細胞。

[8] 請求項 6または 7記載の宿主細胞を用いて、請求項 1記載のポリペプチドを製造する方法。

[9] 請求項 1記載のポリペプチドと結合する抗体。

[10] 請求項 1記載のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする DNAが導入された、所望のタンパク質を生産するための細胞。

[II] 請求項 1記載のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする DNAが単一のベクターにより同時に導入されている請求項 10記載の細胞。

[12] 請求項 1記載のポリペプチドをコードする DNA、及び所望のタンパク質をコードする

DNAが複数のベクターにより別々に導入されて、る請求項 10記載の細胞。

[13] CHO細胞である請求項 10〜12のいずれかに記載の細胞。

[14] 請求項 10〜 13のいずれかに記載の細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法。

[15] 請求項 1記載のポリペプチドを含有する培地。

[16] 請求項 1記載のポリペプチドが培地に添加することにより培地に含有される請求項 15記載の培地。

[17] 請求項 1記載のポリペプチドが宿主細胞力分泌されることにより培地に含有される請求項 15記載の培地。

[18] 培地が、無血清培地、もしくは請求項 1記載のポリペプチド以外に哺乳動物由来の成分を含まな、培地である請求項 15〜 17の、ずれかに記載の培地。

[19] 請求項 15〜18のいずれかに記載の培地を用いて CHO細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法。

[20] 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

[21] 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

[22] 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

[23] 所望のタンパク質をコードする DNAと IGF-1をコードする DNAを含む単一のベクターを用いて、 CHO細胞に所望のタンパク質をコードする DNAと IGF-1をコードする DNA を同時に導入する請求項 22記載の方法。

[24] 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

(a) CHO細胞に IGF-1をコードする DNAを導入する工程、

[25] 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：

(a) CHO細胞に IGF-1をコードする DNAを導入する工程、

[26] IGF-1が請求項 1記載のポリペプチドである、請求項 20〜25のいずれかに記載の作製方法。

[27] 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞のスクリーニング方法：

[28] IGF-1が請求項 1記載のポリペプチドである、請求項 27記載のスクリーニング方法。