JP4999677B2 - ハムスターｉｇｆ−１を用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規なハムスターIGF-1ポリペプチドに関する。本発明はさらに、上記新規なIGF-1ポリペプチドを利用して、効率よく安価に所望の組換えタンパク質を製造する方法に関する。

遺伝子組換え技術を用いて、医薬として有用なタンパク質を生産する際に、動物細胞を用いると、細菌細胞が行い得ないような複雑な翻訳後修飾やフォールディングが可能となるため、動物細胞は組換えタンパク質生産のための宿主細胞として多用されてきている。

従来、動物細胞を培養して該動物細胞の産生する天然型タンパク質を得ようとする場合、あるいは所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞を培養して所望のタンパク質等を製造する場合には、塩類、糖類、アミノ酸類、およびビタミン類等の基礎栄養物のほかに、該動物細胞の増殖のために、通常哺乳動物由来の抽出物、具体的には牛胎児血清などの血清を５〜２０％の範囲で培地に添加しなければならなかった。しかしながら、１）かかる哺乳動物由来の血清は高価であること、２）品質にロット間差があるため安定した増殖が得られないこと、３）ウイルス又はマイコプラズマ汚染される可能性があること、及び４）培養培地からの細胞産物である所望のタンパク質の単離、精製を複雑化することなどの欠点があった。したがって、血清を含まない培地で動物細胞を培養し、安価に組換えタンパク質を生産しうる技術が求められていた。

タンパク質製造を無血清培地でおこなうためには、血清に含まれる増殖因子を加える必要があり、例えば、ＣＨＯ細胞の培養の際には通常、ヒトIGF-1（インスリン様成長因子１：insulin-like growth factor 1）を添加することにより、細胞増殖および生存率を改善し、長期培養あるいは大量培養を可能にしている。

IGF-1は、インスリンと類似の活性を持つポリペプチドとして発見された70アミノ酸の単鎖ポリペプチドであり、プロインスリンと類似した構造を持っている。IGF-1は細胞増殖作用とともにインスリン様の代謝活性を有し、個体の成長に最も重要な成長因子のひとつである。IGF-1は脳下垂体から分泌される成長ホルモン（Growth Hormone ; GH）の作用を受けて肝臓で産生され、遠隔の標的である骨組織の成長を促進するとともに、筋肉や脂肪細胞において代謝活性を示すものと考えられている。

近年、上述のような内分泌的作用に加えて、様々な細胞培養系においてIGF-1が産生され、またIGF-1がこれらの細胞に対して増殖作用のみならず種々の生理活性を持つことが報告されている。また、IGF-1のもつ細胞増殖促進作用に着目して、組換えタンパク質を生産する動物細胞培養系にヒトIGF-1などの増殖促進作用を有するポリペプチドをコードするDNAを導入する組換えタンパク質の製造方法が提案されている（US 2002/0102650 A1）。

IGF-1のような各種増殖因子はヒト由来の組換え体が使用されるが、非常に高価であり、製造コストの観点から、IGF-1の添加量を減少させることが望まれていた。

本発明は、製造コストが低く、かつ強力な細胞増殖促進作用を有する新規なIGF-1ポリペプチドを得ることを目的とする。本発明はさらに、上記新規なIGF-1ポリペプチドをコードするDNAを利用して、効率よく安価に組換えタンパク質を生産できる宿主動物細胞を作製することを目的とする。本発明はさらに、かかる宿主動物細胞を用いて組換えタンパク質を製造する方法の提供を目的とする。

上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らはハムスター由来の新規なインスリン様成長因子1（IGF-1）ポリペプチドを発見し、該新規IGF-1ポリペプチドが動物細胞の培養において顕著な細胞増殖促進作用を有することを発見して本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下のものを提供する。
１．（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつインスリン様成長因子１（IGF-1）活性を有するポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチド。
２．3番目のアミノ酸がセリンに置換されている前記1記載のポリペプチド。
３．3番目のアミノ酸がリジンに置換されている前記1記載のポリペプチド。
４．前記１記載のポリペプチドをコードするDNA。
５．前記４記載のDNAを含むベクター。
６．前記５記載のベクターを含む宿主細胞。
７．CHO細胞である前記６記載の宿主細胞。
８．前記６または７記載の宿主細胞を用いて、前記１記載のポリペプチドを製造する方法。
９．前記１記載のポリペプチドと結合する抗体。
１０．前記１記載のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAが導入された、所望のタンパク質を生産するための細胞。
１１．前記１記載のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAが単一のベクターにより同時に導入されている前記１０記載の細胞。
１２．前記１記載のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAが複数のベクターにより別々に導入されている前記１０記載の細胞。
１３．CHO細胞である前記１０〜１２のいずれかに記載の細胞。
１４．前記１０〜１３のいずれかに記載の細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法。
１５．前記１記載のポリペプチドを含有する培地。
１６．前記１記載のポリペプチドが培地に添加することにより培地に含有される前記１５記載の培地。
１７．前記１記載のポリペプチドが宿主細胞から分泌されることにより培地に含有される前記１５記載の培地。
１８．無血清培地、もしくは前記1記載のポリペプチド以外に哺乳動物由来の成分を含まない培地である前記１５〜１７のいずれかに記載の培地。
１９．前記１５〜１８のいずれかに記載の培地を用いてCHO細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法。
２０．以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞に、IGF-1をコードするDNAを導入する工程。
２１．以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程、
(c) (b)で選択した細胞に、IGF-1をコードするDNAを導入する工程。
２２．以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAとIGF-1をコードするDNAを同時に導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程。
２３．所望のタンパク質をコードするDNAとIGF-1をコードするDNAを含む単一のベクターを用いて、CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAとIGF-1をコードするDNAを同時に導入する前記２２記載の方法。
２４．以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
(a) CHO細胞にIGF-1をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞に、所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程。
２５．以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
(a) CHO細胞にIGF-1をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞に、所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程。
(c) (b)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程。
２６．IGF-1が請求項1記載のポリペプチドである、前記２０〜２５のいずれかに記載の作製方法。
２７．以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞のスクリーニング方法：
(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程、
(c) (b)で選択した細胞にIGF-1をコードするDNAを導入する工程、
(d) (c)で作製した細胞から所望のタンパク質およびIGF-1を発現する細胞を選択する工程。
２８．IGF-1が請求項1記載のポリペプチドである、請求項２７記載のスクリーニング方法。

本発明のCHO細胞由来ハムスター IGF-1遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。 本発明のCHO細胞由来ハムスター IGF-1とヒトIGF-1間のアミノ酸配列を比較した図である。 ハムスター IGF-1 の７０アミノ酸のN末から３番目のマイナス電荷を有するEをR、KおよびSに変換し、電荷をプラス側にシフトさせた活性型のハムスター IGF-1を示す図である。（＋）は正電荷をもつアミノ酸、（−）は負電荷をもつアミノ酸、（±）は電荷をもたないアミノ酸を示す。 変異を導入したハムスター IGF-１を発現させるためのプラスミドを示す図である。 天然型及び改変型ハムスターIGF-1の増殖能に及ぼす効果を示すグラフである。 天然型及び改変型ハムスターIGF-1の生存率に及ぼす効果を示すグラフである。 ハムスターおよびヒト IGF-1(E3S)導入抗IL6Ｒ抗体産生細胞のFed-Batch培養における抗体産生量比較を示すグラフである。 ハムスター、マウスおよびヒト IGF-1(E3S)導入抗IL6Ｒ抗体産生細胞のFed-Batch培養での抗体産生量を示すグラフである。 ハムスター、マウスおよびヒト IGF-1(E3S)導入抗IL6Ｒ抗体産生細胞の３株中で産生量がもっとも高かった最上位株の抗体産生量比較を示すグラフである。 ハムスター、マウスおよびヒト IGF-1(E3E)導入抗IL6Ｒ抗体産生細胞のFed-Batch培養での抗体産生量を示すグラフである。

本発明のポリペプチドは、図１及び配列番号１に示すアミノ酸配列を有する分泌型の成熟ハムスターIGF-1が好ましいが、前駆型ハムスターIGF-1であってもよい。

また、本発明のポリペプチドは、配列番号１に示すハムスターIGF-1のアミノ酸配列において、３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつインスリン様成長因子１（IGF-1）活性を有するポリペプチドも含む。置換されるアミノ酸は特に限定されず、如何なるアミノ酸に置換されてもよいが、セリン、リジン、又はアスパラギン酸に置換されることが好ましく、特にセリンまたはリジンに置換されることが好ましい。

本発明において、インスリン様成長因子１（IGF-1）活性を有するという用語は、動物細胞に対する増殖促進活性及び／又は生存率上昇活性を有することをいう。

本発明では、「ポリペプチド」を「タンパク質」と同義に用いることがある。

本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法により、組換えポリペプチドとして、また天然のポリペプチドとして調製することが可能である。組換えポリペプチドであれば、本発明のポリペプチドをコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。

また、本発明のポリペプチドをグルタチオンSトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。

融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。

天然のポリペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のポリペプチドを発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述するハムスターIGF-1ポリペプチドに結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。

また、本発明は、本発明のハムスターIGF-1をコードするDNAを提供する。本発明のDNAは、上述したような本発明のポリペプチドの in vivo や in vitroにおける生産に利用することが可能である。本発明のDNAは、本発明のポリペプチドをコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、本発明のポリペプチドをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。

本発明のDNAは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、本発明のDNAの配列（例えば、配列番号２）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。cDNAライブラリーは、例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法により調製してもよいし、市販の DNAライブラリーを用いてもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりRNAを調製し、本発明のDNAの配列に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。

具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のポリペプチドを発現する細胞、組織、臓器などから、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、AGPC法(Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia) 等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。

得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ; PCR）を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) にしたがい、cDNAの合成および増幅を行うことができる。

後述する本発明の実施例においては、ハムスターIGF-1ポリペプチドをコードするｃDNAを、PCRクローニングにより得た。PCRプライマーの設計は、既知のラット/マウス/ヒト IGF-1間で遺伝子配列が保存されている領域を用いておこなった。

得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。

また、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNA ライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。

また、本発明のDNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al., Nucleic Acids Research (1981) 9, r43-74 ）。また、本発明のDNAは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ATG）及び／又は終止コドン（TAA、TGA、又はTAG）の挿入等が挙げられる。

また、本発明は、本発明のDNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のDNAを保持させるためや、さらに本発明のポリペプチドを発現させるために有用である。

ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、DH10α、HB101、XL1-blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、DH10α、HB101、XL1-blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（Qiagen社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。

また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 ）を使用すれことが可能である。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。

大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するために用いられるベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (Invitrogen社製）や、pEF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18,p5322)、pEF 、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「BAC-to-BAC^TM baculovairus expression system」（Invitrogen社製、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）などが挙げられる。

CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、RSVプロモーター、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418、ハイグロマイシン、ピューロマイシンなど）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。

さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pCDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来の配列を用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェレース（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。

一方、動物の生体内で本発明のDNAを発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばpAdexlcw）やレトロウイルスベクター(例えばpZIPneo）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning ,5.61-5.63）。生体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。

また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌やCHO細胞などの種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS 、3T3、ミエローマ、BHK （baby hamster kidney ）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340 ）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9 、Sf21、Tn5が知られている。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO 細胞であるCHO dhfr−（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220 ）やCHO K-1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。

植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。また水草による培養(Biolex社)も有効である。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）が知られている。

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli ）、例えば、JM109、DH5α、DH10α、HB101 等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。

これらの細胞を目的とするDNAにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM 、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜240時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

一方、in vivo でポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするDNAを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。

動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993 ）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。

例えば、目的とするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ）。

また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリペプチドをコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Susumu, M. et al., Nature(1985) 315, 592-594）。

さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするポリペプチドをコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur.J.Immunol. (1994) 24, 131-138）。

これにより得られた本発明のポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。

クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたポリペプチドも包含する。

なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当なポリペプチド修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えて部分的にペプチドを除去することもできる。ポリペプチド修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。

また、本発明は、本発明のポリペプチドと結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明のポリペプチドを免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組換えによるヒト化抗体も含まれる。

抗体取得の感作抗原として使用される本発明のポリペプチドは、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。

本発明において、感作抗原として使用されるポリペプチドは、完全なポリペプチドであってもよいし、また、ポリペプチドの部分ペプチドであってもよい。

本発明のポリペプチド又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターにより本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的のポリペプチド又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、ポリペプチドを発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のポリペプチドを感作抗原として使用してもよい。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。

げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をPBS (Phosphate-Buffered Saline) や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、4〜21日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。

ここで、本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のポリペプチドをカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のポリペプチドのみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインAあるいはプロテインGカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンGあるいはMを調製することができる。

モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。

前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法(Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。

細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日・数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウイルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでポリペプチド、ポリペプチド発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、ポリペプチドへの結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭63-17688号公報）。

次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインAカラム、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの精製、検出に用いられる他、本発明のポリペプチドのアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明のポリペプチドが関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。

例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるポリペプチド、ポリペプチド発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてポリペプチドに対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735およびWO96-34096参照）。

ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子(oncogene)により不死化させた細胞を用いてもよい。

このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照)。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。

さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Fab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv(scFv)(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989)178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。

抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のCDR（相補性決定領域）とヒト抗体由来のFR（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト化抗体として得ることができる。

前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）等により行うことができる。

アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる。

アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる(Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーはHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。

また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ELISAを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のポリペプチドを添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。ポリペプチドとしてポリペプチドの断片、例えばその C末端からなる断片あるいは N末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、BIAcore(Pharmacia製) を使用することができる。

本発明は、本発明のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAが導入された、所望のタンパク質を生産するための細胞を提供する。この細胞は所望のタンパク質の製造に有用である。

本発明において所望のタンパク質は特に限定されず、抗体（天然抗体、低分子化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、など）や生理活性タンパク質（顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、エリスロポエチン、インターフェロン、IL-1やIL-6等のインターロイキン、t-PA、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固因子、など）等、如何なるタンパク質でもよいが、特に抗体が好ましい。

本発明のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAの導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入されてもよい。

本発明のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAが導入される細胞は、特に限定されず、いかなる細胞でもよいが、CHO細胞、特にCHO dhfr−細胞が好ましい。

本発明はさらに、本発明のポリペプチドを含有する培地を提供する。培地中における本発明のポリペプチドの含有量は、使用する培地、培養する細胞及び製造しようとする所望のタンパク質の種類などにより適宜決定することができるが、通常、０．１mg/L〜５mg/L、好ましくは０．２mg/L〜１mg/L、さらに好ましくは０．５mg/Lである。

本発明のポリペプチドを含有する培地は動物細胞、特にCHO細胞を用いてタンパク質を製造する際に有用である。

本発明の培地は、本発明のポリペプチドを含有していればよく、本発明のポリペプチドを添加してもよいし、宿主細胞から分泌してもよい。

本発明で用いる培地の他の成分としては、通常、細胞（好ましくは、動物細胞）培養培地で使用されている各成分が適宜使用できるが、これらには通常、アミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、pH緩衝剤を含む。これらの成分の含量は、通常、アミノ酸は0.05−1500mg/L、ビタミン類は0.001−10mg/L、脂質因子は0−200mg/L、エネルギー源は1−20g/L、浸透圧調節剤は0.1−10000mg/L、鉄源は0.1−500mg/L、pH緩衝剤は1−10000mg/L、微量金属元素は0.00001−200mg/L、界面活性剤は0−5000mg/L、増殖補助因子は0.05−10000μg/Lおよびヌクレオシドは0.001−50mg/Lの範囲が適当であるが、これらに限定されず、培養する細胞の種類、所望のタンパク質の種類などにより適宜決定できる。

上記成分のほか、例えば、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子、ヌクレオシドなどを添加しても良い。

具体的には、例えば、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン等、好ましくはL-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン等のアミノ酸類；ｉ−イノシトール、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、p-アミノ安息香酸、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等、好ましくはビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等のビタミン類；塩化コリン、酒石酸コリン、リノール酸、オレイン酸、コレステロール等、好ましくは塩化コリン等の脂質因子；グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース等、好ましくはグルコース等のエネルギー源；塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム等、好ましくは塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤；EDTA鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、好ましくは塩化第二鉄、EDTA鉄、クエン酸鉄等の鉄源類；炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、HEPES、MOPS等、好ましくは炭酸水素ナトリウム等のpH緩衝剤を含む培地を例示できる。

上記成分のほか、例えば、硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、塩化スズ、塩化マグネシウム、亜ケイ酸ナトリウム等、好ましくは硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム等の微量金属元素；Tween80、プルロニックF68等の界面活性剤；および組換え型インスリン、組換え型IGF-1、組換え型EGF、組換え型FGF、組換え型PDGF、組換え型TGF-α、塩酸エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、レチノイン酸、塩酸プトレッシン等、好ましくは亜セレン酸ナトリウム、塩酸エタノールアミン、組換え型IGF-1、塩酸プトレッシン等の増殖補助因子；デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン等のヌクレオシドなどを添加してもよい。なお上記本発明の好適例においては、ストレプトマイシン、ペニシリンGカリウム及びゲンタマイシン等の抗生物質や、フェノールレッド等のpH指示薬を含んでいても良い。

又、培地に魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を添加してもよい。

培地のｐＨは培養する細胞により異なるが、一般的にはｐＨ６．８〜７．６、多くの場合ｐＨ７.０〜７.４が適当である。

培地は、市販の動物細胞培養用培地、例えば、D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)、D-MEM/F-12 1:1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12)、RPMI1640、CHO-S-SFMII(Invitrogen社)、 CHO-SF (Sigma-Aldrich社)、EX-CELL 301 (JRH biosciences社)、CD-CHO (Invitrogen社)、IS CHO-V (Irvine Scientific社)、PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich社)などの培地から調製することが可能である。

又、本発明の培地は無血清培地、もしくは本発明のポリペプチド以外に哺乳動物由来の成分を含んでいない培地であることが好ましい。

本発明は、本発明のポリペプチドを含有する培地を用いてCHO細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法を提供する。

本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAが導入されたCHO細胞を培養することにより、所望のタンパク質を製造する方法を提供する。

CHO細胞の培養は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、通常、気相のCO₂濃度が0−40%、好ましくは、2−10%の雰囲気下、30−39℃、好ましくは、37℃程度で、1−28日間培養することが可能である。

また、動物細胞培養用の各種の培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いて培養することができる。

本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：
(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞に、IGF-1をコードするDNAを導入する工程。

本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：
(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程、
(c) (b)で選択した細胞に、IGF-1をコードするDNAを導入する工程。

本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：
(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAとIGF-1をコードするDNAを同時に導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程。

前記の方法において、CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAとIGF-1をコードするDNAを同時に導入するときには、所望のタンパク質をコードするDNAとIGF-1をコードするDNAを別々のベクターにより同時に導入してもよいし、あるいは所望のタンパク質をコードするDNAとIGF-1をコードするDNAを含む単一のベクターを用いて同時に導入してもよい。単一のベクターを用いて同時に導入する方が好ましい。

本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：
(a) CHO細胞にIGF-1をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞に、所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程。

本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法を提供する：
(a) CHO細胞にIGF-1をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞に、所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程。
(c) (b)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程。

すなわち、CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAとIGF-1をコードするDNAを導入するときには、これらをいずれの順序で導入してもよいが、所望のタンパク質の発現量をコントロールしやすいという点からは、IGF-1をコードするDNAを所望のタンパク質をコードするDNAと同時に導入するか、あるいは所望のタンパク質をコードするDNAを導入した後にIGF-1をコードするDNAを導入するのが好ましい。

前記の種々の所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法においては、IGF-1が本発明のポリペプチドであることが好ましい。

本発明はさらに、以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞のスクリーニング方法を提供する：
(a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程、
(b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程、
(c) (b)で選択した細胞にIGF-1をコードするDNAを導入する工程、
(d) (c)で作製した細胞から所望のタンパク質およびIGF-1を発現する細胞を選択する工程。

上記のスクリーニング方法においては、IGF-1が本発明のポリペプチドであることが好ましい。

本発明の所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法又は所望のタンパク質の製造に用いる細胞のスクリーニング方法で用いられるIGF-1をコードする遺伝子は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ハムスターなど如何なる動物由来のIGF-1でもよいが、ハムスターIGF-1が好ましい。なお、ハムスターIGF-1以外のIGF-1配列は、Nucleic Acids Res. 14 (20), 7873-7882 (1986)及びJ. Biol. Chem. 262 (16), 7894-7900 (1987)に記載されている。

本発明者らは、後述する実施例に示すように、抗体を産生させるために確立した細胞に、本発明のポリペプチドをコードするDNAを導入し、活性型IGF-1を発現させることにより、IGF-１無添加培養において理想的な培養挙動をもつ抗体産生用細胞を確立できることを確認した。本発明のポリペプチドを導入した抗体産生細胞は、増殖能、生存率に優れており、かつ抗体産生量においても極めて優れた効果を示した。本発明は、あらゆる所望のタンパク質の産生細胞、特に抗体産生細胞への応用が可能であり、産業上の利用価値は極めて大きい。

本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。

実施例１：ハムスターIGF-1をコードするｃDNAのクローニング
（１）ｃDNAの合成
CHO-DXB11細胞に抗インターロイキン６レセプター（IL-6R）抗体遺伝子を導入した抗IL-6R抗体産生細胞（特開平8-99902号公報、参考例２）からtotal RNA抽出を行った。得られたｍRNAからcＤＮＡを合成した。

具体的には以下の方法で行った。継代後７２時間経過した細胞増殖期にある約５ｘ１０⁶ 個のＣＨＯ細胞を、４℃、１，０００ｒｐｍで５分間遠心により、培養液を含まない遠心管の底にパックされた状態で得たのち、あらかじめ６５℃に暖めておいたセパゾールRNA Iを４ｍｌ加えて、ピペッティングによりすばやく溶かし、室温で5分間放置した。さらに０．８mlのクロロホルムを加え、Ｖｏｌｔｅｘでよく攪拌したのち、室温で３分間放置した。冷却遠心機Ａｖａｎｔｉ^TM Ｊ２５ (ＢＥＣＫＭＡＮ製)により４℃、７，０００ｒｐｍで５分間遠心ののち、上層を慎重に採取し、新しい１５ｍｌチューブに移した。４ｍｌの２−プロパノールを加え、Ｖｏｌｔｅｘでよく攪拌したのち、室温で１０分間放置した。４℃、７，０００ｒｐｍで１０分間遠心ののち、上清を完全に除き、RNAペレットを得た。４ｍｌの７５%エタノールで遠心管の壁面をよくリンスし、４℃、７，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を完全に除いたのち、４ｍｌの１００%エタノールを加えてさらにリンスした。４℃、７，０００ｒｐｍで５分間遠心によりＲＮＡペレットを得たのち、室温で３０分間放置した。空気乾燥させたRNAペレットは、１００μｌのＤＥＰＣ−Ｗａｔｅｒを加え、ピペッティングにより完全に溶解した。さらに、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔのプロトコールに従いｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。得られる３０μｌのｔｏｔａｌ ＲＮＡの濃度測定は、分光光度計ＤＵ６４０を用いておこない、波長２６０ｎｍの吸光度１ＯＤ＝４０μｇ／ｍｌとしてＲＮＡ濃度を算出した。高純度ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ５μｇをcDNA合成に用した。 高純度のｔｏｔａｌ ＲＮＡ ５μｇはＤＥＰＣ−Ｗａｔｅｒで１０μｌに調製したのち、１μｌのＨＰＬＣグレード １００ ｐｍｏｌ／μｌ Ｔ７−（Ｔ）₂₄ プライマーをピペッティングにより加え、完全に混合したのちスピンダウンした。プライマーをアニールさせるため７０℃で１０分間 熱したのち、すばやくスピンダウンし氷上に置いた。氷上で２分以上経過後、４μｌの５ｘ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄバッファー、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘをピペッティングにより加え、４℃でスピンダウンし、氷上に置いた。４２℃のヒートブロック上でインキュベーションを開始し、２分経過したところで２μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍｉｘ をピペッティングにより加え、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ合成反応を開始した。６０分経過したら、すばやくスピンダウンし、氷上に置いた。つづけてＳｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ合成反応をおこなうため、９１μｌのＤＥＰＣ−Ｗａｔｅｒ、３０μｌの５ｘＳｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄバッファー、３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、 ４μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 １μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈをピペッティングにより順番に加えたのち、４℃でスピンダウンし、氷上に置いた。１６℃で１２０分間 インキュベーションし、Ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ合成をおこなった。２時間後、２μｌのＴ４ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、さらに５分間のインキュベーションしたのち、すばやくスピンダウンし、氷上に置いた。１５２μｌの２５：２４：１ フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを加え、３０秒間ボルテックスののち、スピンダウンし、さらにピペッティングにより混合し、あらかじめ１分間遠心してゲルをパックしておいたフェイズロックゲルチューブにアプライした。４℃で１５，０００ｒｐｍ ２分間遠心後、水層を新しい１．５ｍｌ エッペンドルフチューブに移し、０．５μｌのペレットペイント、７６μｌの酢酸アンモニウム ７．５Ｍ溶液の順に加え、よくボルテックスした。６００μｌの９９．５％エタノールを加え、３０秒間ボルテックスののち、室温で５分放置した。４℃で１５，０００ｒｐｍ １０分間遠心し、未反応ｄＮＴＰを除いたｃＤＮＡ沈殿を得た。ｃＤＮＡは５００μｌの７５％エタノールを加え、４℃で１５，０００ｒｐｍ ３分間遠心した。洗浄を２回繰り返すことで脱塩し,さらに１００μｌの９９．５％エタノールを加えて４℃で１５，０００ｒｐｍ ５分間遠心したのち、エタノールを完全に除いた。約５分間の空気乾燥ののち、１．５μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒに溶かし、ｃＤＮＡとして−２０℃で保存した。５０分の１量をＰＣＲのテンプレートとして使用した。

（２）ハムスターIGF-1をコードするｃDNAのクローニング
ハムスターIGF-1遺伝子は、PCRクローニングにより得た。PCRプライマーの設計は 既知であるラット/マウス/ヒト IGF1間で遺伝子配列が保存されている領域を用いておこなった。

具体的には以下の方法により行った。成熟型ラットIGF-1のN末端１３番目のAlaから１９番目のGlyをコードする遺伝子配列：5'-gctcttcagttcgtgtgtgg（配列番号３）をフォワードプライマーに、N末端５０番目のArgから５６番目のArgをコードする遺伝子の相補鎖配列：5'-ctcctcagatcacagctccg（配列番号４）をリヴァースプライマーに用いて、上記ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応をおこなった。９５℃、５分間の前処理後、９８℃、５秒間のディネーチャー、５３℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、３０秒間の伸長反応を３５回繰り返し、目的の遺伝子を増幅後に、７２℃、１０分間の伸長反応を加えて、１３１ｂｐのハムスター IGF-1 PCR フラグメントを得た。

得られたＰＣＲ断片の塩基配列を調べることでハムスター IGF-1を増幅したＤＮＡであることを確認し、その配列情報を用いてさらにＰＣＲ反応を続けた。N末端２９番目のThrから３５番目のIleをコードする遺伝子配列：5'-acaggctatggctccagcatt（配列番号５）をフォワードプライマーに、N末端８５番目のGlnから７７番目のArgをコードする遺伝子の相補鎖配列：tgagtcttgggcatgtcagtg（配列番号６）をリヴァースプライマーに用いて、上記ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応をおこなった。９５℃、５分間の前処理後、９８℃、５秒間のディネーチャー、５３℃、４０秒間のアニーリング、７２℃、９０秒間の伸長反応を３５回繰り返し、目的の遺伝子を増幅後に、７２℃、１０分間の伸長反応を加えて、１７０ｂｐのハムスター IGF-1 PCR フラグメントを得た。以上の結果、熟型ハムスターIGF-1のN末端１３番目のAlaからＣ末端の７０番目Alaまでの塩基配列を得た。

さらにＮ末端側の配列を得るために、成熟型ラットIGF-1のN末端の５’に相当する塩基であるｇからさらに５‘側マイナス３３塩基のｔから１４番目のｇを含む配列：5'-tgcttgctcacctttaccag（配列番号７）をフォワードプライマーに、N末端５０番目のArgから５６番目のArgをコードする遺伝子の相補鎖配列：5'-ctcctcagatcacagctccg（配列番号８）をリヴァースプライマーに用いて、上記ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応をおこなった。９５℃、５分間の前処理後、９５℃、３０秒間のディネーチャー、４４℃、６０秒間のアニーリング、７２℃、９０秒間の伸長反応を３５回繰り返し、目的の遺伝子を増幅後に、７２℃、１０分間の伸長反応を加えて、１８５ｂｐのハムスターIGF-1 のＮ末端領域を含むフラグメントを得た。

実施例２：ハムスターIGF-1をコードするｃDNAの塩基配列及びアミノ酸配列の決定
クローニングした遺伝子はDNAシ-ケンサーにて塩基配列を決定し、さらにこれからアミノ酸配列を決定し、ハムスターIGF-1をコードしていることを確認した。得られたアミノ酸配列を図1及び配列番号１に、DNA配列を配列番号２に示す。

成熟分泌型IGF-１は種を超えて７０アミノ酸からなるが、ハムスターIGF-1遺伝子は特異的な配列を有しており、ヒトIGF-１との比較では２０番目のP (Human：D ), ３５番目のI (Human：S ), ６７番目のT (Human：A )の３アミノ酸がヒト配列と異なっている（図2）。

実施例３：改変型ハムスターIGF-1遺伝子の作製及びそのIGF-1活性
（１）改変型ハムスターIGF-1遺伝子の作製
分泌型ハムスターIGF-1遺伝子はN末から３番目にマイナス電荷をもつE(グルタミン酸)を有する。この部位のアミノ酸をプラス電荷側にシフトするアミノ酸に変換した改変型ハムスターIGF-1遺伝子を作製した。IGF-１遺伝子への変異導入はSite-directed Mutagenesis法によりおこなった。

天然型ハムスターIGF-1遺伝子及び得られた改変型ハムスターIGF-1遺伝子をそれぞれ、E3E（天然型）、E3K（３番目のグルタミン酸をリジンに変換）、E3S（３番目のグルタミン酸をセリンに変換）と称する（図３参照）。
（２）天然型及び改変型ハムスターIGF-1の増殖能及び生存率に及ぼす効果
改変型ハムスターIGF-1遺伝子を発現させるプラスミド（図４）を構築し、親株である抗IL-6R抗体産生CHO細胞に導入し、ハイグロマイシンによる薬剤耐性株を選択、Stableに発現する細胞株を得た。得られた細胞株はさらにLimiting Dilutionによりシングルセルクローニングをおこない、IGF-１無添加の無血清培地で増殖能の高いクローン細胞を得た。

それぞれの異なる電荷をもつE3E、E3K、E3Sから得られたクローン細胞の中からME45(E3E)、MK44(E3K)、MS19(E3S)を選択し、IGF-１無添加の無血清培地における、100mlスピンナーフラスコでの細胞の増殖能及び生存率を比較した。親株である抗IL-6R抗体産生細胞についても、ＪＲＨ社より購入したヒトIGF-１（Long^TMR³IGF-1）添加培地と無添加培地で培養して比較した。Ｓ１００スピンナーフラスコに１００ｍｌのＭＲＡ継代用無血清培地を加え、３７℃のＣＯ₂インキュベーター内で１時間コンディショニングしたのち、おのおの３ｘ１０⁶個の細胞を遠心して加えた。１ｍＬの培養液を分取して初発の細胞数および生存率を測定した。３日目以降、７日目までの細胞数および生存率は定時に１ｍＬずつ分取して測定した。

得られた結果を図５（増殖能）と図６（生存率）に示す。MS19(E3S)は増殖能、生存率、ともに最も優れていることが判明した。MS19(E3S)は、培養７日目においても８０％以上の生存率を示した。次いで、MK44(E3K)が良好な結果を示した。また親株である抗IL-6R抗体産生細胞はIGF-１無添加培養では増殖不能であった。MS19の増殖能は、培養３日目から６日目にかけて顕著であり、特に４日目から５日目の倍加時間（MS19; 26.5 hr, MK44 33.0 hr, ME45; 47.0 hr, 抗IL-6R親株; 86.7 hr）、および最高到達細胞数（MS19; 25.8 x 10⁵ cells/ml, MK44; 20.3 x 10⁵ cells/ml, ME45; 7.98 x 10⁵ cells/ml, 抗IL-6親株; 21.7 x 10⁵ cells/ml）からMS19の優位性は明らかであった。細胞増殖の立ち上がりがゆるやかであり、その後は培養後期まで一気に伸びるというMS1９の培養挙動は、抗体産生用細胞として理想的であった。また、生存率の比較において培養７日目で顕著であるように（MS19; 86.2 %, MK44 66.4 %, ME45; 58.1 %, 抗IL-6親株; 76.0 hr％）、MS19は培養後期までもっとも安定な細胞であった。

実施例４：ハムスター IGF-1(E3S) 導入細胞の抗体産生量
ハムスター IGF-1がヒト IGF-1以上の抗体産生量ポテンシャルをもつことを示すために、ハムスター IGF-1(E3S)とヒト IGF-1(E3S)を親株に導入した細胞中でもっとも培養挙動のよいシングルクローンの抗IL-6Ｒ抗体産生量を比較した。ヒト IGF-1(E3S)発現プラスミドはハムスター IGF-1(E3S)を鋳型にしてP20D, I35S, T67A変換のための変異導入を順におこなうことで構築した。実施例１と同様に親株抗IL6-Ｒ抗体産生CHO細胞に導入し、Hygromycin耐性細胞を選択したのち、IGF-1(E3S)を安定的発現にすることでIHF-1無添加培地中における増殖能を獲得した細胞株を選抜した。細胞株を限界希釈することでシングルクローンを得て、さらに増殖に優れたIGF-1(E3S)導入細胞を用いたFed-Batch培養をおこなって抗体産生量を比較した.
得られた結果を図７に示す。ハムスター IGF-1(E3S) 導入細胞の抗体産生量は培養８日目で９７３ｍｇ/Lであり、親株（８４３ｍｇ/L）、ヒト IGF-1(E3S)導入細胞（８２１ｍｇ/L）よりも優位であった。親株に対して最適化された培養方法にもかかわらずハムスター導入細胞の抗体産生量が最も高いことが確認された。

実施例５：ハムスター IGF-1(E3S) 導入細胞の抗体産生量
実施例４でハムスター IGF-1がヒト IGF-1以上の抗体産生量ポテンシャルをもつことを示したことから、さらにマウス IGF-1を加えた３種のIGF-1の抗体産生量ポテンシャルを比較した。マウス IGF-1(E3S)発現プラスミドはハムスター IGF-1(E3S)を鋳型にしてS69A変換のための変異を導入することで構築した。今回は変異体IGF-1(E3S)に加えて天然型IGF-1(E3E)の３種間比較も併せておこなうために、ハムスター、ヒト、マウス IGF-1(E3S)を鋳型にE3Eへの変異を導入して、それぞれの天然型IGF-1(E3E)発現プラスミドを構築した。

得られた６種のIGF-1発現プラスミドは同時調製した親株にエレクトロポレーション法で導入され、Hygromycin耐性細胞を選択したのち、IGF-1を安定的発現にすることでIGF-1無添加培地中における増殖能を獲得した細胞株中でもっとも増殖の良かった細胞を３株ずつ選抜した(n=3)。拡大過程でヒト IGF-1(E3E)の１株は増殖不良になったのでヒト IGF-1(E3E)のみn=２で実験を続けることにして、合計１７細胞株は１００ｍｌスピンナー培養で拡大ののちFed-Batch培養による抗体産生量比較をおこなった。

図８は、ハムスター、マウスおよびヒト IGF-1(E3S)導入細胞のFed-Batch培養における抗体産生量を示す。増殖のよかった各種３株(n=3)の平均産生量はハムスター＞マウス＞ヒトの順で優位であった。図９は、ハムスター、マウスおよびヒト IGF-1(E3S)導入細胞の３株中で最上位の抗体産生量をもつ株の比較である。平均産生量に加えて、最上位株の産生量においてもハムスターIGF-1(E3S)導入株が優位であった。図１０は、ハムスター、マウスおよびヒト IGF-1(E3E)導入細胞のFed-Batch培養における抗体産生量を示す。増殖のよかった各種平均産生量は天然型IGF-1(E3E)導入株においてもハムスター＞マウス＞ヒトの順で優位であった。

Claims (25)

1. 配列番号１に記載のアミノ酸配列において、３番目のアミノ酸がセリンまたはリジンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン様成長因子１（IGF-1）活性を有するポリペプチド。
2. 3番目のアミノ酸がセリンに置換されている請求項1記載のポリペプチド。
3. 3番目のアミノ酸がリジンに置換されている請求項1記載のポリペプチド。
4. 請求項１記載のポリペプチドをコードするDNA。
5. 請求項４記載のDNAを含むベクター。
6. 請求項５記載のベクターを含む宿主細胞。
7. CHO細胞である請求項６記載の宿主細胞。
8. 請求項６または７記載の宿主細胞を用いて、請求項１記載のポリペプチドを製造する方法。
9. 請求項１記載のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAが導入された、所望のタンパク質を生産するための細胞。
10. 請求項１記載のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAが単一のベクターにより同時に導入されている請求項９記載の細胞。
11. 請求項１記載のポリペプチドをコードするDNA、及び所望のタンパク質をコードするDNAが複数のベクターにより別々に導入されている請求項９記載の細胞。
12. CHO細胞である請求項９〜１１のいずれかに記載の細胞。
13. 請求項９〜１２のいずれかに記載の細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法。
14. 請求項１記載のポリペプチドを含有する培地。
15. 請求項１記載のポリペプチドが培地に添加することにより培地に含有される請求項１４記載の培地。
16. 請求項１記載のポリペプチドが宿主細胞から分泌されることにより培地に含有される請求項１４記載の培地。
17. 培地が、無血清培地、もしくは請求項1記載のポリペプチド以外に哺乳動物由来の成分を含まない培地である請求項１４〜１６のいずれかに記載の培地。
18. 請求項１４〜１７のいずれかに記載の培地を用いてCHO細胞を培養することを含む、所望のタンパク質の製造方法。
19. 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
    (a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程、
    (b) (a)で作製した細胞に、請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAを導入する工程。
20. 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
    (a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程、
    (b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程、
    (c) (b)で選択した細胞に、請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAを導入する工程。
21. 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
    (a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAと請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAを同時に導入する工程、
    (b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程。
22. 所望のタンパク質をコードするDNAと請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAを含む単一のベクターを用いて、CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAと請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAを同時に導入する請求項２１記載の方法。
23. 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
    (a) CHO細胞に請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAを導入する工程、
    (b) (a)で作製した細胞に、所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程。
24. 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞の作製方法：
    (a) CHO細胞に請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAを導入する工程、
    (b) (a)で作製した細胞に、所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程。
    (c) (b)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程。
25. 以下の工程を含む、所望のタンパク質の製造に用いる細胞のスクリーニング方法：
    (a) CHO細胞に所望のタンパク質をコードするDNAを導入する工程、
    (b) (a)で作製した細胞から、所望のタンパク質を発現する細胞を選択する工程、
    (c) (b)で選択した細胞に請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAを導入する工程、
    (d) (c)で作製した細胞から所望のタンパク質および請求項1記載のポリペプチドを発現する細胞を選択する工程。