WO2006083016A1 - リン酸化−脱リン酸化反応検出用基質群およびそれを用いた検出方法 - Google Patents

リン酸化−脱リン酸化反応検出用基質群およびそれを用いた検出方法 Download PDF

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Osamu Okitsu
Takeyuki Nagashima
Masakazu Muramoto
Takuya Wada
Shintaro Nishimura
Yoshiki Katayama
Tatsuhiko Sonoda
Yasuhiro Kita
Kiyoko Takahashi
Akiko Tsuchida
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    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase

Definitions

  • the present invention relates to a substrate group for detecting phosphorylation-dephosphorylation reaction and a detection method using the same. Specifically, the present invention relates to a peptide substrate group that detects phosphorylated monodephosphorylation with high sensitivity by the Non-RI method and a method for detecting phosphorylated monodephosphorylation using the same.
  • microarray technology for immobilizing proteins or peptides on a substrate is known (WO 0 2/0 8 3 9 3 3 A 2, WO 0 2/0 8 3 8 4 A 2, M Bettencourt-Dias, R. Giet, R. Sinka, A. Mazumdar, WG Lock, F. Balloux, PJ Zaf iropoulos, S. Yaraaguchi, S. Winter, RW Carthew, M. Cooper, D. Jones, L. Frenz , DM Glover Nature 2004, 432, 980-7, G. Manning, DB Whyte, R. Martnez, T. Hunter, S.
  • Protein kinases have the function of phosphorylating specific parts of proteins to change their functions, and phosphorylate the serine or threonine residues of the protein, which is a serine / threonine kinase. And “tyrosine kinases” that phosphorylate thiocin residues.
  • tyrosine kinase exists in or near the cell membrane and is located at the most upstream of information transmission and often directly detects changes in the environment outside the cell.
  • Serine threonine kinase receives signals from upstream and sequentially detects them. In many cases, it is involved in direct regulation of cell function.
  • Protein kinases transmit stimuli from outside the cell to the inside of the cell and are involved in the cellular response to these stimuli. In this way, protein kinases regulate various cell functions such as metabolism, proliferation, differentiation, signal transduction, and movement through phosphorylation. Intracellular protein kinases recognize specific proteins as substrates and promote highly specific phosphorylation reactions. As a combination of sequential reactions of these phosphorylation reactions, extracellular environment changes and responses to drugs It transmits signals and regulates cell function. From the analysis of the gene sequence, approximately 800 protein kinases are expected to be involved in intracellular signal transduction. Abnormal protein phosphorylation is thought to be the cause or result of various diseases such as cancer, diabetes, and arthritis.
  • protein phosphatase is an enzyme that catalyzes dephosphorylation using phosphorylated protein as a substrate, and guarantees reversibility of protein phosphorylation.
  • Protein key ⁇ is also a substrate for kinases, threonine, seri Protein kinases that are phosphorylated on any of the residues such as protein (phosphorylase, etc.) and tyrosine (an example of protein related to oncogenes such as src) are returned to the original enzyme by protein phosphatase.
  • tyrosine an example of protein related to oncogenes such as src
  • a common feature of signal transduction pathways is their transient response. This transient is a transient reflection of the amount of signaling molecules and the activation state. Protein phosphorylation causes activation in some cases and inactivation in other cases. In fact, it is also known that protein dephosphorylation plays an active role as a switch.
  • Protein kinases are characterized by their high substrate specificity, but peptides extracted from a peptide moiety consisting of an amino acid sequence containing the phosphorylated site of the substrate protein are also phosphorylated as a substrate. It is widely known. Therefore, when examining the reactivity of protein kinase, it is possible to investigate using a peptide substrate.
  • protein kinase reactivity is a method of increasing the phosphorylated substrate and ADP as a product, or decreasing the starting substrate and ATP by using a suitable substrate for phosphorylation. Judgment is possible by measuring with.
  • protein phosphorylation is commonly performed by direct measurement of radionuclide 32 P incorporation or by using anti-phosphorylated protein antibodies.
  • an antibody that specifically recognizes a specific phosphorylated protein or phosphorylated peptide must be prepared and used each time.
  • An object of the present invention is to provide a means capable of easily measuring the reactivity of protein kinase or protein phosphatase.
  • the present inventors have found that an artificial peptide as shown below is used as a substrate for protein kinase or protein phosphatase, thereby completing the present invention. It came. That is, the present invention is as follows.
  • a protein kinase substrate group comprising at least one artificial peptide substrate obtained by substituting a threonine residue for a serine residue in an amino acid sequence contained in a naturally occurring substrate of protein kinase.
  • the serine Z threoene kinase is protein kinase C
  • a method for detecting phosphorylation and dephosphorylation reaction comprising using the peptide array according to [9] and an anti-phosphorylated threonine antibody.
  • the detection result is compared with the detection result in the control to determine the protein kinase and / or protein phosphatase activity that changes depending on the presence or absence of the disease.
  • a method for diagnosing a disease based on activation and / or inactivation of protein kinase and / or protein phosphatase.
  • the disease is cancer, malignant tumor, diabetes, diabetic complication, metabolic disease, autoimmune disease, immune disorder, immunodeficiency, neurodegenerative disease, ischemic disease, endocrine disease, liver disease or
  • a method for screening a test substance which comprises changing protein kinase or protein phosphatase activity.
  • the protein kinase substrate group of the present invention includes an artificial substrate synthesized based on an appropriately designed amino acid sequence, so that phosphorylation or dephosphorylation of proteins can be measured with high sensitivity using the Non-RI method.
  • a series of substrates, and by applying combinatorial chemistry technology, a peptide substrate library can be created. It can be used for high-throughput analysis of oral tin phosphatase.
  • peptide array of the present invention and the phosphorylation and Z or dephosphorylation detection method using the peptide array, as a means of proteome analysis, high-throughput analysis is possible, and phosphorylation and dephosphorylation can be performed simultaneously in one array. It is also possible to detect.
  • phosphorylation and / or dephosphorylation by serine nothreonine kinase and / or dephosphorylation by protein phosphatase can be detected with high sensitivity. It is possible to quickly determine the presence or absence of a disease that is involved.
  • the screening method of the present invention it is possible to detect phosphorylation by serine Z threonine kinase or dephosphorylation by protein phosphatase with high sensitivity and speed, so that protein kinase or protein phosphatase activity is promoted. Or the substance to inhibit can be selected efficiently.
  • Antibody 1 to Antibody 16 refer to the antibodies in [Table 1-1], respectively. .
  • Antibody 11 to Antibody 16 refer to the respective antibodies in [Table 1-2].
  • Figure 3-1 shows the detection of serine residue phosphorylation by PKA using antibody 16.
  • Fig. 3-2 shows detection of threonine residue phosphorylation by antibody 16 using PKA.
  • FIG. 4 is a diagram showing detection of threonine residue phosphorylation by AMP K using antibody 16.
  • FIG. 5 shows the detection of phosphorylation of threonine residues by PKC using antibody 16.
  • FIG. 6 is a diagram showing detection of phosphorylation in a cell extract in which ⁇ and GF ⁇ genes are expressed in ⁇ 293 cells.
  • FIG. 7 is a diagram showing detection of phosphorylation in metformin and AI CAR-stimulated cell extract in L 6 cells.
  • FIG. 8 is a fluorescence imaging image showing a phosphorylation reaction using a peptide array immobilized on the surface of a slide glass.
  • protein kinase is a concept that roughly includes serine / threonine kinase and thiocin synkinase, but hereinafter, serine Z threonine kinase, for which no useful method for measuring kinase activity has been developed.
  • serine / threonine kinase is not particularly limited as long as it is an enzyme that phosphorylates serine or threonine in the amino acid sequence.
  • c A MP-dependent protein ⁇ 1 ze PKA
  • c GMP-dependent protein kinase P KG
  • calcium-dependent protein kinase AMP-activated protein kinase
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • double-stranded RNA-dependent protein kinase casein kinase
  • ribosomal protein S 6 key R
  • the calcium-dependent protein kinase include phosphorylase kinase, myosin light chain kinase, calmodulin-dependent protein kinase, phospholipid-dependent protein kinase (protein).
  • Kinase C PK C
  • protein phosphatase in the present invention is a phosphorylated serine nothreonine residue, a phosphorylated tyrosine residue, or An enzyme that hydrolyzes the phosphate ester bond of phosphorylated serine Z threonine tyrosine residue, preferably an enzyme that hydrolyzes the phosphate ester bond of phosphorylated serine Z threonine residue.
  • Specific phosphatases for the serine Z threonine residues produced include phosphatases such as PP l, PP 2A, PP 2 B and PP 2 C.
  • PP 2 C is a monomeric enzyme, but PP 1, PP 2A and PP 2 B are It is said that it forms a complex composed of nodal and active subunits, and its intracellular localization is regulated by interaction with its regulatory subunits.
  • phosphatases that specifically dephosphorylate phosphorylated tyrosine residues: a receptor type with a transmembrane domain and a cytoplasmic type without them. Each contains various molecular species with different molecular structures and activity regulation mechanisms. There are also multiple molecular species with different substrate specificities as phosphatases that dephosphorylate phosphorylated serine / threonine / tyrosine residues. Is known.
  • the substrate refers to a peptide or protein containing an amino acid sequence recognized by protein kinase.
  • the amino acids constituting the peptide or protein include ⁇ -amino acids known as natural amino acids,] 3 amino acids or ⁇ -amino acids, and chemically modified amino acids or hydroxyl groups of amino acids.
  • a partial chemical structure having a chemical structure with a molecular weight of about 800 or less capable of performing a peptide-like chemical bond via a carboxyl group, a sulfonyl group, a phosphoryl group, or the like is also included in the scope.
  • a peptide substrate that can artificially design and synthesize an appropriate amino acid sequence and that is excellent in storage and operativity is preferable.
  • a naturally occurring substrate refers to a substance composed of all or part of an amino acid sequence constituting a protein known as a protein kinase substrate, and is a serine / threonine residue, preferably a serine / threonine kinase. Consists of an amino acid sequence containing one or more serine-threonine residues that can be recognized and phosphorylated.
  • the number of amino acid residues in the naturally occurring substrate is 5 to the number of amino acid residues of the full length of the protein, preferably 5 to 30 and more preferably 10 to 20.
  • the human peptide substrate refers to a substrate in which the serine residue in the amino acid sequence contained in the naturally occurring substrate is replaced with a threonine residue, and preferably serine ⁇ threonine kinase is recognized and phosphorylated. Possible serine residues are substituted with threonine residues or phosphorylated threonine residues.
  • the human peptide substrate is a site where serine residues that can be recognized by serine / threonine kinases are replaced with threonine residues (or phosphorylated threonine residues). It is preferable that one is included.
  • the number of amino acid residues in the artificial peptide substrate is not particularly limited as long as the peptide length is such that serine-threonine kinase can be recognized, but usually 5 to 500, preferably 5 to 30. Preferably it is 10-20. Since the artificial peptide substrate is designed from the naturally occurring substrate, it contains a peptide portion consisting of an amino acid residue to the extent that serine and threonine kinase in the naturally occurring substrate can be recognized. And the number of amino acid residues of the human peptide substrate and the naturally occurring substrate need not match each other.
  • the protein kinase substrate group of the present invention is characterized by containing at least one artificial peptide substrate.
  • “Serine nothreonine kinase” is a force that phosphorylates serine opino or threonine residues of proteinaceous or peptidic substrates. Both serine and threonine residues have slight differences in their reactivity. It is thought to undergo phosphorylation. Therefore, in the present invention, an artificial peptide substrate in which the phosphorylated serine residue is substituted with a threonine residue is used as the substrate of serine nothreonine kinase for the purpose of examining the phosphorylation ability of serine threonine kinase. Alternatively, for the purpose of examining the dephosphorylation ability of protein phosphatase, an artificial peptide substrate in which the phosphorylated serine residue is replaced with a phosphorylated threonine residue may be used.
  • the number of substrates included in the substrate group of the present invention is not particularly limited as long as it contains at least one kind of the artificial peptide substrate, but preferably 1 to 100, more preferably 2 to 5 0 0 0 0 0, and even more preferably 1 0 to 5 0 0 0.
  • Substrate groups within such a range can be immobilized on a single carrier as a peptide array or peptide chip.
  • the substrate group of the present invention may be all of the artificial peptide substrate, may include the human peptide substrate and a naturally occurring substrate, and when used in the detection method of the present invention, It may contain human peptide substrates or natural substrates that serve as positive and / or negative controls.
  • human peptide substrates that serve as positive and negative controls serine residues are phosphorylated threonine residues.
  • human epeptide substrates substituted with alanine residues are also included.
  • the specific sequence of the artificial peptide substrate is preferably an amino acid sequence selected from the amino acid sequence group set forth in SEQ ID NOs: 1 to 2 99. Using all such amino acid sequences Or you can use it in combination as appropriate depending on the target protein kinase.
  • the human peptide substrate of the present invention can be prepared by replacing a phosphorylated serine residue in an amino acid sequence contained in a naturally occurring substrate with a threonine residue or a phosphorylated threonine residue.
  • a phosphorylated serine residue in an amino acid sequence contained in a naturally occurring substrate with a threonine residue or a phosphorylated threonine residue.
  • a peptide fragment containing a phosphorylated site of a protein serving as a substrate of serine / threonine kinase is predicted and extracted from genomic information or protein information.
  • the extracted peptide fragments including those already known as peptide substrate sequences of serine threonine kinases, are used as defined as “basic sequence of peptide substrate”.
  • all of the phosphorylated sites (serine residues) in the basic sequence of the peptide substrate may be replaced with threonine residues, and the other amino acid residues may be the same as those in the basic sequence. Some amino acid residues may be further substituted with other amino acid residues. Further substitution is performed in order to introduce an advantageous substituent for the production, immobilization, etc. of the artificial peptide substrate of serine Z threonine kinase.
  • the peptides artificially designed in this way are provided as substrate groups (aggregates or peptide substrate libraries).
  • the peptide sequence to be designed is preferably 40 amino acid residues or less in order to ensure the efficiency of chemical synthesis and expression of activity.
  • the library may contain at least one substrate in which a phosphorylated site is substituted with phosphorylated threonine.
  • a phosphorylated threonine-substituted substrate is preferable because it not only serves as a positive control for phosphorylation but also serves as a protein phosphatase substrate and can simultaneously detect phosphorylation / dephosphorylation.
  • a collection of peptide substrates with sequence design is chemically synthesized by a general chemical peptide synthesis method (for example, solid phase synthesis by the Fraoc method). Is done. The important point here is that the serine residue as a naturally-occurring phosphorylated site is replaced with a threonine residue, and the sequence is designed and chemically synthesized. It is.
  • a group of substrates containing human epeptide substrates designed and chemically synthesized by the above-mentioned method is used as a substrate for phosphorylation by serine / threonine kinase in a solution state or “solid phase state”.
  • a peptide phosphorylated substrate which is a product of the kinase reaction
  • an anti-phosphorylated threonine antibody the reactivity of serine Z threonine kinase can be detected and measured.
  • the dephosphorylation substrate that is the product of the phosphatase reaction is no longer detected by the antibody, thereby detecting the reactivity of the protein phosphatase under various conditions, preferably the competition with serine_serum kinase. Can be measured.
  • Solid phase state refers to a state in which a peptidic substrate is bound to various solid phase carriers directly or via an appropriate chemical structure called a linker.
  • Solid phase carriers include organic polymers or inorganic polymer materials (plastics, etc.), flat plates made of glass, metals, etc., test tubes (including those generally called plates in the biochemical field) ), Thin film, fine particles, etc.
  • the “linker” is not particularly limited, and examples thereof include a hydrocarbon group containing a chain or cyclic structure containing an oxygen, nitrogen, sulfur or phosphorus atom.
  • Examples of the “bonding between the solid phase carrier and the peptide substrate directly or via a linker” include covalent bond, electrostatic bond, hydrogen bond, hydrophobic bond, adsorption, adhesion and the like.
  • a slide glass or a thin gold film can be obtained by binding a peptide substrate to experimental equipment commonly called 9 6-well plate, 3 8 4-hole plate, 1 5 3 6-well plate.
  • Peptide arrays in which peptide substrates are bound in a fine lattice form are also included in the category of “solid state” in the present invention.
  • a peptide array formed by immobilizing the substrate group of the present invention is preferably used.
  • the method for detecting phosphorylation and / or dephosphorylation reaction of the present invention is characterized by using the peptide array and the anti-phosphorylated threonine antibody. Concrete In this method, various serine / threonine kinases and / or protein phosphatases are reacted by using the peptide array, and various serine / threonine kinases and / or protein phosphatases are obtained by using an anti-phosphorylated threonine antibody. To detect a wide range of reactivity simultaneously.
  • the anti-phosphorylated threonine antibody is not particularly limited as long as it recognizes a phosphorylated threonine residue, and may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is not limited to the sequence of the substrate.
  • Polyclonal antibodies are preferred from the viewpoint of the high possibility of recognizing.
  • Such antibodies can be prepared by known methods Current-Protocol in Molecular Biology, Chapter 11. 12-11. 13 (2000); Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11. 4-11. 11).
  • commercially available antibodies that meet the purpose of the present invention can be appropriately selected. Suitable commercially available antibodies include polyclonal anti-phosphorylated threonine antibodies (Zymed) and the like.
  • a polyclonal anti-phosphorylated threonine antibody it is possible to detect not only a peptide substrate sequence containing a phosphorylated threonine residue but also a peptide sequence containing a phosphorylated serine residue. It is.
  • the affinity of anti-phospho serine antibodies for peptide sequences containing phosphorylated serine residues tends to be lower than the affinity of anti-phospho threonine antibodies.
  • Protein kinase for detecting reactivity includes: kinases contained in fractions extracted from biological samples; kinases expressed and purified by genetic recombination; and protein kinases expressed as proteins from protein kinase genes.
  • Kinase that has been solubilized in a suitable buffer solution as a cell extract or cell disruption solution chemical substances (including pharmaceuticals and bioactive compounds) having a molecular weight of about 100 or less during cell culture, Kinases contained in cell extracts or cell disruptions obtained by cultivating cells by changing the cell state by adding peptides, nucleic acids, sugar chains, etc. to the medium to stimulate them; or various known or unknown genes Introduce By doing so, the “ki” ⁇ ”, etc. contained in the cell extract or cell lysate obtained by culturing by changing the cell state can be raised.
  • Protein phosphatase to detect reactivity includes phosphatase contained in fractions extracted from biological samples; phosphatase expressed and purified by genetic recombination; protein phosphatase expressed as protein from protein phosphatase gene and purified Phosphatase solubilized in a suitable buffer solution as a cell extract or cell disruption solution; chemical substances (including pharmaceuticals and bioactive compounds) having a molecular weight of about 100 or less at the time of cell culture, A phosphatase contained in a cell extract or cell lysate obtained by culturing by changing the cell state by adding a peptide, nucleic acid, sugar chain or the like to the medium to give a stimulus; It can be obtained by culturing by changing the cell state by introducing the non-gene.
  • serine Z threonine kinase was found to be a substrate peptide.
  • a solution containing “serine Z threonine kinase” and / or “protein phosphatase” to be detected is added to the peptide array of the present invention, and the kinase reaction and / or phosphatase reaction proceeds. Incubate with.
  • this process is also referred to as a contact process.
  • the above conditions can be appropriately set according to the kinase or phosphatase to be detected, but usually in the presence of 0.05 to 0.5 mM ATP, pH 6.5 to 7.5, temperature 3 0 to 40 ° C, 5 minutes to 24 hours.
  • protein kinase and protein phosphatase molecular species are both very diverse, they can be used as single inhibitors. 'There is no general-purpose product that exhibits a sufficiently effective inhibitory effect on all of each molecular species. Therefore, when only the kinase reaction proceeds, it is preferable that a plurality of known protein phosphatase inhibitors having different specificities coexist in the solution, and when only the phosphatase reaction proceeds. For this, it is preferable that a plurality of known types of kinase inhibitors having different specificities coexist in the solution. In any of the reactions, it is preferable that a known protease inhibitor coexist in the solution.
  • Examples of the phosphatase inhibitor include okadaic acid, caliculin A, totomycin and the like, and examples of the kinase inhibitor include Calphostin C, Hypericin, Phloretin N H-7, etc., which are relatively highly specific to PKC; KT5720, etc., which is relatively specific to PKA; Curcumin, AG1024, etc., which are highly specific to PTK; HA 1077, Lavendustin C, etc., which are highly specific to the enzyme.
  • protease inhibitors examples include PMSF (phenylraethanesulfonyl fluoride), oral peptin (leupeptin), aprotinin, pepstatin, E-6-4, AEBSF (4- (2-Arainoethyl) -bezenesulf onylf luoride) DFP
  • the presence or absence of phosphorylated threonine on the peptide array is detected using an anti-phosphorylated threonine antibody.
  • the detection means means for converting the recognition ability of the anti-phosphothreonine antibody to phosphorylated threonine on the peptide array into an appropriate detectable physical stoichiometry is employed.
  • antibodies are converted to fluorescence intensity by fluorescent labeling, chemiluminescent color
  • secondary antibody recognizing non-variable site of anti-phosphorylated threonine antibody
  • it is converted to luminescence intensity and absorbance intensity, and surface plasmon resonance due to molecular weight increase due to antibody binding For example, conversion to strength.
  • Enzyme Linked Immunosorbent Assay is a means for measuring the reactivity of serine noreoyun kinase with a plate array prepared using a microtiter plate.
  • the detection method of the present invention using this E L I S A will be described in more detail.
  • An amino coat plate (Sumitomo Bakelite, manufactured by Coung) is used as a microtiter plate, and the peptide substrate of the present invention is immobilized through a dartal aldehyde as a linker structure.
  • phosphorylation opiate Z or dephosphorylation with serine / threonine kinase and / or protein phosphatase is performed on the solid phase.
  • the washing operation is repeated, and the phosphorylated threonine residue is recognized by a polyclonal anti-phosphorylated threonine antibody (Zymed) or the like as the primary antibody.
  • the primary antibody is recognized by a secondary antibody such as horseradish peroxidase (H R P) binding, and the color developed by the peroxidase reaction is measured.
  • H R P horseradish peroxidase
  • the means for measuring the reactivity of serine Z threonine kinase in a peptide array prepared using a glass slide is the same as in the above ELISA.
  • a glass microarray slide glass whose surface is amino-modified is used as a basic substrate (for example, Matsunami glass high-density amino-modified slide glass).
  • a linear linker having carboxylic acid at both ends is used as an active ester and is used on a basic substrate. As a result, a glass slide having an active ester group on the glass surface is produced.
  • a peptide substrate with a cysteine residue introduced at the N-terminus is synthesized and prepared. Dissolve the peptidic substrate in phosphate buffer (pH 7.4) and dispense a small amount (about 1 nL / s) in a fine grid with an arrayer for DNA microarray production. (Pot).
  • the active ester on the glass surface and the N-terminal cystine residue of the peptidic substrate react selectively, and the peptidic substrate is immobilized on the glass slide in a fine grid. After the excess solution is washed away, the active ester occupying most of the glass surface is chemically blocked.
  • a chemical structure having a primary amino group with moderately controlled hydrophilicity and lipophilicity as a blocking agent was prepared, and the entire slide glass surface on which a peptide substrate was solid-phased in a fine lattice shape Act on.
  • a peptide microarray capable of smoothly performing phosphorylation / dephosphorylation reaction and antibody reaction by kinase or phosphatase is produced.
  • the prepared microarray is plotted with bovine serum albumin or the like in the same manner as the plate array, and the target serine threonine kinase and phosphorylation Z or protein phosphatase are performed on the microarray.
  • the washing operation is repeated, and the phosphorylated threonine residue is recognized by a fluorescently labeled polyclonal anti-phosphorylated threonine antibody (Zymed) or the like.
  • a fluorescently labeled polyclonal anti-phosphorylated threonine antibody Zymed or the like.
  • the reactivity of the target serine / threonine kinase or protein phosphatase can be examined by measuring the fluorescence intensity with a fluorescent scanner for DNA microarray analysis. Become.
  • the reactivity of protein phosphatase is determined by comparatively quantifying the amount of peptide substrate substituted with a phosphorylated threonine residue that can be recognized by an anti-phosphate threonine antibody before and after the addition of phosphatase.
  • protein kinase and protein phosphatase may coexist in the reaction solution, but in this case, it is also possible to measure the competitive reaction between the enzymes under conditions where both enzymes can react together. .
  • by comparing the reactivity of each substrate having a specific sequence with or without the appropriate addition of the specific kinase inhibitor or phosphatase inhibitor described above It is possible to analyze the relationship of
  • Serine threonine kinase is expressed from a gene in an appropriate cell and used as the cell extract without isolation and purification to find a peptide substrate.
  • a number of peptide substrates on the peptide array are phosphorylated under conditions such as isolated and purified serine Z threonine kinase, cell extracts of transgenic cells, and cell extracts of drug-stimulated cells. It exhibits phosphorylation reactivity in response to, giving a pattern.
  • the phosphorylation pattern thus obtained makes it possible to define the function of the original isolated and purified serine nothreonine kinase, the function of the gene used for gene transfer, and the function of the stimulating drug subjected to drug stimulation.
  • this definition of function is called “Phosphorylation Profiling”.
  • the method for diagnosing a disease based on the activation and / or inactivation of a protein kinase ⁇ "and / or protein phosphatase of the present invention comprises the following steps:
  • diseases to be diagnosed include cancer, malignant tumors, diabetes, diabetic complications, metabolic diseases, autoimmune diseases such as rheumatism and arthritis, immune deficiencies and atopic diseases.
  • Various immune abnormalities such as Alzheimer's disease, Huntington's disease, neurodegenerative disease such as prion disease, major heart disease, cerebral infarction, myocardial infarction, ischemic disease such as cirrhosis, endocrine disease, liver disease, bone disease, etc. Include but are not limited to diseases.
  • the biological sample derived from the subject is not particularly limited, and examples thereof include blood, urine, mucous membrane, and various tissues.
  • the fraction containing protein kinase and / or protein phosphatase can be prepared from the biological sample by a known protein purification method.
  • the biological sample is cells, cell extracts, cell membrane fractions, cytoplasmic fractions, cell nuclear fractions, etc. can be prepared. -.
  • the step of contacting the fraction with the peptide array is as described in the detection method of the present invention.
  • the step of detecting the phosphorylated peptide and / or the dephosphorylated peptide using the anti-phosphorylated threonine antibody is as described above.
  • the result obtained in the detection step is compared with a control.
  • a control a result obtained by subjecting a biological sample derived from a normal subject to the detection step in the same manner as in the case of a biological sample derived from a subject; The standard that has been determined for phosphorylation.
  • the comparison result is obtained as the presence or absence of phosphorylation or dephosphorylation of a specific substrate.
  • the homologous search of the existing sequence database using those sequences as queries makes it possible to identify proteins containing partial sequences corresponding to those sequences and elucidate their actual conditions.
  • These disease-related proteins function as targets on which specific protein kinases and protein or protein phosphatases act, and may be used, for example, as screening systems in therapeutic drug development.
  • the determination step based on the result of the comparison, the protein kinase and / or protein phosphatase activity that changes depending on the presence or absence of a disease is determined.
  • the method for screening a test substance that varies the protein key or protein phosphatase activity of the present invention includes the following steps:
  • a step of contacting a sample containing a protein kinase or protein phosphatase and a test substance with the peptide array 'About a peptide array before and after the contacting step, a phosphorylated peptide and / or dephosphorylated using an anti-phosphorylated threonine antibody; Detecting oxidized peptide, and comparing the detection result with a detection result in a sample not containing a test substance;
  • a process for determining protein kinase or protein phosphatase activity that changes depending on the presence or absence of a test substance
  • the test substance may be any known substance or new substance, for example, a nucleic acid, a carbohydrate, a lipid, a protein, a peptide, a low-molecular-weight organic compound, or a compound prepared using a combinatorial chemistry technique.
  • Examples include natural libraries derived from libraries, random peptide libraries prepared by solid phase synthesis and phage display methods, or microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
  • Samples containing protein kinase or protein phosphatase and a test substance are those in which a test substance is added to a kinase or phosphatase contained in a fraction extracted from a biological sample; expressed and purified by gene recombination Sample with test substance added to kinase or phosphatase; kinase or phosphatase expressed as protein from protein kinase or protein phosphatase gene and suitable buffer solution as cell extract or cell lysate without purification Sample obtained by adding the test substance to the kinase or phosphatase solubilized in the cell; adding the test substance to the medium at the time of cell culture and applying stimulation to the cell extract obtained by culturing by changing the cell state Or kinase contained in the cell or cell disruption fluid Or phosphatase; or by introducing various known or unknown genes, the test substance was added to the cell extract or the cell lysate obtained by culturing by changing the cell state. Samples.
  • the step of contacting the sample containing protein kinase or protein phosphatase and a test substance with the peptide array is as described in the detection method of the present invention.
  • a peptide substrate containing a threonine residue is immobilized on the peptide array, and a peptide substrate containing a phosphorylated threonine residue is immobilized as a positive control. It is preferable to use the same.
  • the detection step the phosphorylated peptide is detected qualitatively or quantitatively using an anti-phosphorylated threonine antibody in the peptide array before and after the contact step, and in the comparison step, the detection result and the sample not containing the test substance are detected. Inspection Compare with Izukaku.
  • a peptide substrate containing a phosphorylated threonine residue is fixed to the peptide array, and a peptide substrate containing a threonine residue is fixed as a positive control. It is preferable to use those prepared.
  • the detection step peptide substrates that are no longer detected by dephosphorylation are detected qualitatively or quantitatively through detection of phosphorylated peptides using anti-phosphorylated threonine antibodies in the peptide arrays before and after the contacting step.
  • the detection result is compared with the detection result in the sample not containing the test substance.
  • Protein kinase activity can be indicated by the number of peptide substrates detected by the anti-phosphorylated threonine antibody and the detection intensity. Protein phosphatase activity can be indicated by the number of peptide substrates that were not detected by the anti-phosphorylated threonine antibody and the detected intensity.
  • the test substance When the protein kinase activity is promoted in the determination step, the test substance can be selected as a candidate for a therapeutic agent for a disease mediated by protein kinase activation. When protein kinase activity is inhibited, the test substance can be selected as a candidate for a therapeutic agent for a disease through suppression of protein kinase activity.
  • the test substance is also useful as a protein kinase modulator or research reagent.
  • the test substance when the protein phosphatase activity is promoted in the determination step, the test substance can be selected as a candidate for a therapeutic agent for a disease through the activation of protein phosphatase.
  • test substance When protein phosphatase activity is inhibited, the test substance can be selected as a candidate for a therapeutic agent for a disease through suppression of protein phosphatase activity.
  • the test substance is also useful as a protein phosphatase modulator or a research reagent.
  • a peptide sequence consisting of 10 to 18 amino acids containing a threonine or serine residue as a phosphorylated site and a cysteine residue at the N-terminus was chemically synthesized by the usual Fmoc method and used.
  • pS * represents a phosphorylated serine residue
  • pT * represents a phosphorylated threonine residue
  • SAMT CGGHMRSAMTGLHLVKRR- NH 2 (SEQ ID NO: 7)
  • IQAA CGGAAKIQAAFRGHMARKK-NH 2 (SEQ ID NO: 8)
  • IQA (pT *): CGGAAKIQA (pT *) FRGHMARKK-NH 2 (SEQ ID NO: 10)
  • P T represents a threonine residue which may be phosphorylated.
  • PT001 CGGHMRSAM (pT) GLHLVKRR (SEQ ID NO: 1 1)
  • ⁇ 002 CGGAMARAA (pT) AAALARRR (SEQ ID NO: 1 2)
  • PT003 CGGHQGKFLQ (pT) FAGSPLY (SEQ ID NO: 1 3
  • PT004 CGGKSGELLA (pT) WAGSPPY (SEQ ID NO: 1 4
  • PT005 CGGKSGEPLS (pT) WAGSPPY (SEQ ID NO: 1 5
  • PT006 CGGQKDKFLQ (pT) FAGSPLY (SEQ ID NO: 1 6
  • PT007 CGGSDGEFLR (pT) SAGSPNY (SEQ ID NO: 1 7
  • PT008 CGGTFGNKLD (pT) FAGSPPY (SEQ ID NO: 1 8
  • PT009 CGGTLGSKLD (pT) FAGSPPY (SEQ ID NO: 1 9
  • PT012 CGGVGDSLLE (pT) SAGSPHY (SEQ ID NO: 2 2
  • PT013 CGGKSAEPLS (pT) WAGSPPY (SEQ ID NO: 2 3
  • PT014 CGGVGDSLFE (pT) SAGSPHY (SEQ ID NO: 24
  • PT015 CGGTVGGKID (pT) FAGSPPY (SEQ ID NO: 2 5
  • PT016 CGGKSGEPLS (pT) WAGSPPH (SEQ ID NO: 2 6
  • PT017 CGGTLGSKLD (pT) FAGNPPY (SEQ ID NO: 2 7
  • PT018 CGGTVAGKLD (pT) FAGSPPY (SEQ ID NO: 2 8
  • PT019 CGGVGDSLLE (pT) SAGSPHH (SEQ ID NO: 2 9
  • PT020 CGGVGDSLLE (pT) SAASPHY (SEQ ID NO: 3 0
  • PT021 CGGYQGKFLQ (pT) FAGSPLY (SEQ ID NO: 3 1
  • PT022 CGGKSGELLA (pT) WSGSPPY (SEQ ID NO: 3 2
  • PT023 CGGSDGEFLR (pT) TAGSPNY (SEQ ID NO: 3 3
  • PT024 CGGKSGDPLS (pT) WAGSPPY (SEQ ID NO: 3 4
  • PT025 CGGTFGNKLD (pT) FAGSPPF (SEQ ID NO: 3 5
  • PT026 CGGTVANKLD (pT) FAGSPPY (SEQ ID NO: 3 6
  • PT027 CGGKSGEPLS (pT) AGTPPY (SEQ ID NO: 3 7
  • PT028 CGGKSGEPLS (pT) LAGSPPY (SEQ ID NO: 3 8
  • 9 9 houses deer dddS (Id) Sld39SM993: 9 Old
  • PT085 CGGVGDSLLE (pT) SAGSPRY (SEQ ID NO: 9 5)
  • PT086 CGGSDGEFLR (pT) SAGSPNH (SEQ ID NO: 9 6)
  • PT087 CGGHQGKILQ (pT) FAGSPLY (SEQ ID NO: 9 7)
  • PT088 CGGSEGEFLR (pT) SAGSPNY (SEQ ID NO: 9 8)
  • PT089 CGGKSGELVA (pT) AGSPPY (SEQ ID NO: 9 9)
  • PT090 CGGHQGKFLQ (pT) FAGSPLF (SEQ ID NO: 100
  • PT091 CGGQKDKFVQ (pT) FAGSPLY (SEQ ID NO: 1 0 1
  • PT092 CGGKSGDLLA (pT) .WAGSPPY (SEQ ID NO: 1 0 2
  • PT093 CGGSDAEFLR (pT) SAGSPNY (SEQ ID NO: 1 0 3
  • PT094 CGGVGDSLLD (pT) SAGSPHY (SEQ ID NO: 04
  • PT095 CGGSDGEFLR (pT) SAASPNY (SEQ ID NO: 1 0 5
  • PT096 CGGTFGNKLE (pT) FAGSPPY (SEQ ID NO: 1 0 6
  • PT100 CGGQKDKFLQ (pT) FAGTPLY (SEQ ID NO: 1 1 0
  • PT102 CGGHQGKFLQ (pT) FAGNPLY (SEQ ID NO: 1 1 2
  • PT103 CGGSDGEFVR (pT) SAGSPNY (SEQ ID NO: 1 1 3
  • PT104 CGGHQGKFVQ (pT) FAGSPLY (SEQ ID NO: 1 1 4
  • PT105 CGGKSGEPLS (pT) WAGSPAY (SEQ ID NO: 1 1 5
  • PT106 CGGVGDNLLE (pT) SAGSPHY (SEQ ID NO: 1 1 6
  • PT107 CGGKSGEPVS (pT) WAGSPPY (SEQ ID NO: 1 1 7
  • PT108 CGGVADSLLE (pT) SAGSPHY (SEQ ID NO: 1 1 8
  • PT109 CGGVGDSLLE (pT) SAGTPHY (SEQ ID NO: 1 1 9
  • PT110 CGGKSGELLV (pT) AGSPPY (SEQ ID NO: 1 2 0 PTlli: CGGVGDSVLE (pT) SAGSPHY (SEQ ID NO: 1 2 1
  • PT112 CGGHQGKFLQ (pT) FAGSALY (SEQ ID NO: 1 2 2
  • PT114 CGGQKDKFLQ (pT) lAGSPLY (SEQ ID NO: 1 24
  • PT118 CGGKNGELLA (pT) WAGSPPY (SEQ ID NO: 1 2 8
  • PTl 20 CGGKSGEPLS (pT) WSGSPPY (SEQ ID NO: 1 3 0
  • PT121 CGGKSGEPLS (pT) WAGSAPY (SEQ ID NO: 1 3 1
  • PT122 CGGKSGELLA (pT) WAGSPPF (SEQ ID NO: 1 3 2
  • PT123 CGGQKDKLLQ (pT) FAGSPLY (SEQ ID NO: 1 3 3
  • PT124 CGGQKDKFLQ (pT) FAGSPLF (SEQ ID NO: 1 3 4
  • PT125 CGGHQGRFLQ (pT) FAGSPLY (SEQ ID NO: 1 3 5
  • PT126 CGGHQGKFLQ (pT) FAASPLY (SEQ ID NO: 1 3 6
  • PT127 CGGQKDKFLQ (pT) FAGSPIY (SEQ ID NO: 1 3 7
  • PT128 CGGKSGELLA (pT) WAGSPAY (SEQ ID NO: 1 3 8
  • PT129 CGGVGDSLLE (pT) SSGSPHY (SEQ ID NO: 1 3 9
  • PT130 CGGKSGELLA (pT) WAGSAPY (SEQ ID NO: 1 40
  • PT132 CGGKSGELLA (pT) FAGSPLY (SEQ ID NO: 1 4 2
  • PT133 CGGTVGNKLD (pT) SAGSPHY (SEQ ID NO: 1 4 3
  • PT135 CGGVGDSLLE (pT) SAGSPNY (SEQ ID NO: 1 4 5
  • PT136 CGGLALHIRS (pT) WSGLHLV (SEQ ID NO: 1 4 6
  • PT137 CGGLHIRSSW (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 1 4 7 L ⁇
  • PT166 CGGSGDYMPM (pT) PKSVSAP (SEQ ID NO: 1 76
  • PT167 CGGQHLRLST (pT) SGRLLYA (SEQ ID NO: 1 77
  • PT168 CGGPLGSGES (pT) STRRSSE (SEQ ID NO: 1 78
  • PT170 CGGTSRIRTQ (pT) ISLQERQ (SEQ ID NO: 1 80
  • PT171 CGGNKRSRTR (pT) DTYSAGQ (SEQ ID NO: 1 8 1
  • PT172 CGGDSLPSSP (pT) TATPHSQ (SEQ ID NO: 1 82
  • PT173 CGGSHMVHNR (pT) -KINLQDL (SEQ ID NO: 1 83
  • PT174 CGGRSRTRTD (pT) YSAGQSI (SEQ ID NO: 1 84
  • PT175 CGGPTMRPSM (pT) GLHLVRR (SEQ ID NO: 1 85
  • PT176 CGGLHIRSSW (pT) GLHLLKQ (SEQ ID NO: 1 86
  • PT177 CGGLHIRSSW (pT) GLYLVKQ (SEQ ID NO: 1 87
  • PT178 CGGQHLRVST (pT) SGRLLYA (SEQ ID NO: 1 88
  • PT179 CGGDTLPSSP (pT) SATPHSQ (SEQ ID NO: 1 89
  • PT180 CGGTSRIRTQ (pT) FSFQERQ (SEQ ID NO: 1 90
  • PT181 CGGNPLMRRN (pT) VTPLANP (SEQ ID NO: 1 9 1
  • PT182 CGGSHMFHNR (pT) KINLQDL (SEQ ID NO: 1 92
  • PT183 CGGLHIRSS (pT) GLHVVKQ (SEQ ID NO: 1 93
  • PT184 CGGRSRTRTD (pT) YTAGQSV (SEQ ID NO: 1 94
  • PT186 CGGQHLRLST (pT) SGRLLYG (SEQ ID NO: 1 96
  • PT187 CGGPTMRPSM (pT) GLHLVKR (SEQ ID NO: 1 97
  • PT188 CGGTSHIRTQ (pT) FSLQERQ (SEQ ID NO: 1 98
  • PT189 CGGLHIRSSW (pT) GLHLVRQ (SEQ ID NO: 1 99
  • PT190 CGGESLPSSP (pT) SATPHSQ (SEQ ID NO: 200
  • PT191 CGGTSRIRTQ (pT) FTLQERQ (SEQ ID NO: 201 PT192 ': CGGSHMIHNR (pT) KINIQDL (SEQ ID NO: 2 0 2
  • PT193 CGGNPLMRRN (pT) VTPLGSP (SEQ ID NO: 2 0 3
  • PT195 CGGNPFMRRN (pT) VTPLASP (SEQ ID NO: 2 0 5
  • PT196 CGGDSIPSSP (pT) SATPHSQ (SEQ ID NO: 2 0 6
  • PT197 CGGSHMIHNR (pT) KVNLQDL (SEQ ID NO: 2 0 7
  • PT199 CGGLHIRSSW (pT) ALHLVKQ (SEQ ID NO: 2 0 9
  • PT200 CGGQRLRLST (pT) -SGRLLYA (SEQ ID NO: 2 1 0
  • PT201 CGGNPVMRRN (pT) VTPLASP (SEQ ID NO: 2 1 1
  • PT202 CGGNPLMRRN (pT) VNPLASP (SEQ ID NO: 2 1 2
  • PT204 CGGQHLRLST (pT) SGRVLYA (SEQ ID NO: 2 1 4
  • PT205 CGGNPLMRRN (pT) VTPIASP (SEQ ID NO: 2 1 5
  • PT206 CGGNPLLRR (pT) VTPLASP (SEQ ID NO: 2 1 6
  • PT207 CGGPSMRPSM (pT) GLHLVKR (SEQ ID NO: 2 1 7
  • PT208 CGGPTMRPSM (pT) GFHLVKR (SEQ ID NO: 2 1 8
  • PT209 CGGLHIRTS (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 2 1 9
  • PT210 CGGDSVPSSP (pT) SATPHSQ (SEQ ID NO: 2 20
  • PT211 CGGNPLMRRN (pT) ATPLASP (SEQ ID NO: 2 2 1
  • PT212 CGGQHLRLST (pT) TGRLLYA (SEQ ID NO: 2 2 2
  • PT213 CGGDSLPSSP (pT) SATAHSQ (SEQ ID NO: 2 2 3
  • PT214 CGGPTMRPSL (pT) GLHLVKR (SEQ ID NO: 2 24
  • PT215 CGGPTMRASM (pT) GLHLVKR (SEQ ID NO: 2 2 5
  • PT216 CGGQHFRLST (pT) SGRLLYA (SEQ ID NO: 2 2 6
  • PT217 CGGDSLPSSP (pT) SATPHNQ (SEQ ID NO: 2 2 7
  • PT218 CGGLHIRSSW (pT) GLHLAKQ (SEQ ID NO: 2 2 8
  • PT219 CGGLHIRSNW (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 2 9)
  • PT220 CGGQYLRLST (pT) SGRLLYA (SEQ ID NO: 2 3 0)
  • PT221 CGGQHLHLST (pT) SGRLLYA (SEQ ID NO: 2 3 1)
  • PT222 CGGTSRIRTQ (pT) FSLQDRQ (SEQ ID NO: 2 3 2)
  • PT223 CGGSHMIHNK (pT) KINLQDL (SEQ ID NO: 2 3 3)
  • PT224 CGGLRIRSSW (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 2 34)
  • PT225 CGGSHMIHNR (pT) RINLQDL (SEQ ID NO: 2 3 5)
  • PT226 CGGVHIRSSW (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 2 3 6)
  • PT227 CGGLHIRSSW (pT) -GLRLVKQ (SEQ ID NO: 2 3 7)
  • PT228 CGGNPLMRRN (pT) VSPLASP (SEQ ID NO: 2 3 8)
  • PT229 CGGQHLRLST (pT) SGRLLHA (SEQ ID NO: 2 3 9)
  • PT230 CGGQHLRLSS (pT) SGRLLYA (SEQ ID NO: 240)
  • PT231 CGGNKRSRTK (pT) DSYSAGQ (SEQ ID NO: 24 1)
  • PT233 CGGNPIMRRN (pT) VTPLASP (SEQ ID NO: 24 3)
  • PT234 CGGQHLRLST (pT) SGRFLYA (SEQ ID NO: 244)
  • PT235 CGGSHMIHNR (pT) KINVQDL (SEQ ID NO: 24 5)
  • PT236 CGGDSLPSSP (pT) SATPYSQ (SEQ ID NO: 24 6)
  • PT237 CGGSYMIHNR (pT) KINLQDL (SEQ ID NO: 24 7)
  • PT238 CGGQHLRFST (pT) SGRLLYA (SEQ ID NO: 248)
  • PT239 CGGTSRIRTQ (pT) FSLQEHQ (SEQ ID NO: 24 9)
  • PT240 CGGNKRSRTR (pT) DSYSGGQ (SEQ ID NO: 2 5 0)
  • PT241 CGGEAMRRSV (pT) EAALAQP (SEQ ID NO: 2 5 1)
  • PT242 CGGPTMRPSM (pT) GLRLVKR (SEQ ID NO: 2 5 2)
  • PT243 CGGQHLRLST (pT) SGRLLFA (SEQ ID NO: 2 5 3)
  • PT244 CGGDSLPTSP (pT) SATPHSQ (SEQ ID NO: 2 54)
  • PT245 CGGTHMIHNR (pT) KINLQDL (SEQ ID NO: 2 5 5)
  • PT246 ' CGGRSRTRTD (pT) YSAGQSL (SEQ ID NO: 2 5 6
  • PT247 CGGQHLRLST (pT) SGHLLYA (SEQ ID NO: 2 5 7
  • PT248 CGGLHVRSSW (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 2 5 8
  • PT249 CGGLHIRSSW (pT) GLHLIKQ (SEQ ID NO: 2 5 9
  • PT250 CGGLHIRSSW (pT) GFHLVKQ (SEQ ID NO: 2 6 0
  • PT251 CGGSHMIHNR (pT) KINFQDL (SEQ ID NO: 2 6 1
  • PT252 CGGPTMRPSM (pT) GLHLVKK (SEQ ID NO: 2 6 2
  • PT253 CGGPTMRPSM (pT) GVHLVKR (SEQ ID NO: 2 6 3
  • PT254 CGGTNRLRSE (pT) -IAFIEEN (SEQ ID NO: 2 64
  • PT255 CGGPTLRPSM (pT) GLHLVKR (SEQ ID NO: 2 6 5
  • PT256 CGGPTMRP (pT) GLHLVKR (SEQ ID NO: 2 6 6
  • PT258 CGGLHIRSSW (pT) GLHLVKQ '(SEQ ID NO: 2 6 8
  • PT259 CGGLHIRSSW (pT) GVHLVKQ (SEQ ID NO: 2 6 9
  • PT260 CGGDSLPSSP (pT) SATPHTQ (SEQ ID NO: 2 7 0
  • PT261 CGGDSLPSSA (pT) SATPHSQ (SEQ ID NO: 2 7 1
  • PT262 CGGLHIRSSL (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 2 7 2
  • PT263 CGGNPLMRRN (pT) VTPLVSP (SEQ ID NO: 2 7 3
  • PT264 CGGLHIRSS (pT) GLHIVKQ (SEQ ID NO: 2 74
  • PT265 CGGLHIRST (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 2 7 5
  • PT266 CGGPTMRPSM (pT) GIHLVKR (SEQ ID NO: 2 7 6
  • PT267 CGGPTMRPSM (pT) GLHVVKR (SEQ ID NO: 2 7 7
  • PT268 CGGQHLRIST (pT) SGRLLYA (SEQ ID NO: 2 7 8
  • PT269 CGGQHLRLST (pT) SARLLYA (SEQ ID NO: 2 7 9
  • PT270 CGGPTMRPSM (pT) GLHLAKR (SEQ ID NO: 2 8 0
  • PT271 CGGDSFPSSP (pT) SATPHSQ (SEQ ID NO: 2 8 1
  • PT272 CGGPTMRPSM (pT) GLHLLKR (SEQ ID NO: 2 8 2
  • PT273 CGGLYIRSSW (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 2 8 3
  • PT274 CGGPNMRPSM (pT) GLHLVKR (SEQ ID NO: 2 8 4
  • PT275 CGGQHLRLST (pT) SGRLFYA (SEQ ID NO: 2 8 5
  • PT276 CGGFHIRSSW (pT) GLHLVKQ (SEQ ID NO: 2 8 6
  • PT278 CGGRPRAA (pT) F (SEQ ID NO: 2 8 8
  • PT279 CGGFKK (pT) FKL (SEQ ID NO: 2 8 9
  • PT280 CGGTIYRRG (pT) RRWRKL (SEQ ID NO: 2 9 0
  • PT281 CGGQKRPRRKD (pT) P (SEQ ID NO: 2 9 1
  • PT282 CGGRKR (pT) RAE (SEQ ID NO: 2 9 2
  • PT283 CGGAPGLI (pT) PGGPP (SEQ ID NO: 2 9 3
  • PT284 CGGKKALHRQE (pT) VDAL (SEQ ID NO: 2 9 4
  • PT285 CGGMHRQE (pT) VDCLK (SEQ ID NO: 2 9 5
  • PT286 CGGHA (pT) PPKKKRK (SEQ ID NO: 2 9 6
  • PT287 CGGPK (pT) PKKAKKL (SEQ ID NO: 2 9 7
  • PT288 CGGRRADD (pT) DDDDD (SEQ ID NO: 2 9 8
  • PT289 CGGRRRDDD (pT) DDD (SEQ ID NO: 2 9 9
  • amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 2 99 are substrates that may optionally be phosphorylated.
  • Tris-HCl buffered saline (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 was used.
  • Tris-HCl buffered saline (pH 7.5) containing Tween 20 was used.
  • Anti-phosphorylated serine antibody buffer solution Commercially available products' (described later) were used after diluting 500 times with Procking buffer solution.
  • a commercial product (described later) was used after diluting 500 times with a blocking buffer solution.
  • HRP Horseradish peroxidase
  • HRP Horseradish peroxidase
  • PKA enzyme 3 ⁇ 43 ⁇ 4 product (Promega, Madison, WI, or Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) was used. -.
  • PKC enzyme A commercially available product (Upstate) was used.
  • AM P K enzyme A commercially available product (Upstate) was used.
  • PKA reaction buffer solution A buffer solution having the following composition was used.
  • AM PK reaction buffer solution A buffer solution having the following composition was used.
  • PKC reaction buffer solution (common to all subtypes): A buffer solution having the following composition was used.
  • Phosphate buffered saline without calcium and magnesium 80 g sodium chloride, 2 g potassium chloride, 1 1.5 g sodium hydrogen phosphate, 2 g potassium dihydrogen phosphate 1 L purified water What was dissolved in the solution was diluted 10 times and sterilized by auto-tarbing.
  • HEK 293 cell growth medium Trypsin-EDTA solution (GIBC0) was diluted 1-fold with sterile P B S _ and used.
  • HEK 293 cell extraction buffer A buffer solution having the following composition was used.
  • L 6 cell extraction buffer A buffer solution having the following composition was used.
  • Example 1 Antibody recognition reaction in a microtiter plate (1) Pour 50 L of 1% glutaraldehyde 50 mM sodium carbonate buffer (pH 9.5) into 96-well alumino plates (manufactured by Sumitomo Bakelite or Coung) and react at 37 ° C for 2 hours. The surface was activated. The reaction solution was removed and washed with purified water. Peptide substrate was dissolved in 5 OmM sodium carbonate buffer (pH 9.5) (peptide concentration 1 / ⁇ ⁇ 20 ⁇ ), and 50 ⁇ L was poured into each well of the activated 96-well microtiter plate. . 37. After reacting with C for 2 hours, the reaction solution was removed.
  • the peptide substrate was immobilized by sequential washing with TB S_T buffer solution and purified water.
  • the microtiter plate on which the peptide substrate was immobilized was subjected to a blocking treatment at 30 ° C. for 1 hour using a blocking buffer solution.
  • antibody recognition reaction is performed at 30 ° C for 1-2 hours using 50 L per well of anti-phosphorylated serine antibody buffer solution or anti-phosphorylated threonine antibody buffer solution It was. After removing the reaction solution, it was washed 3 times with TBS-T buffer solution. Subsequently, a recognition reaction was performed with an HRP-labeled anti-mouse buffer solution or an anti-rabbit antibody buffer solution.
  • the recognition reaction was carried out at 30 ° C for 1 hour using 50 ⁇ L per well. After removing the reaction solution, the plate was washed 4 times with TB S-T buffer solution. 100 ⁇ L of TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) solution was added and reacted at 30 ° C for about 10 minutes. After stopping the reaction with 2N aqueous sulfuric acid, the absorbance at 450 nm was quantified with an absorptiometer (Fig. 1 and Table? _). As a result, it was found that the following antibody 16 recognizes both phosphorylated serine and phosphorylated threonine.
  • Antibody 1 Mouse monoclonal anti-phosphorylated serine antibody:
  • Antibody 2 Mouse monoclonal anti-phosphorylated serine antibody:
  • Antibody 3 Mouse monoclonal anti-phosphorylated serine antibody:
  • Antibody 5 Mouse monoclonal anti-phosphorylated serine antibody: Clone PSR-45, Sigma (St. Lois, MO)
  • Antibody 6 Mouse monoclonal anti-phospho serine antibody: Clone 608 Zymed (South San Francisco, CA)
  • Antibody 7 Mouse monoclonal anti-phospho serine antibody: Clone IC8 Calbiochera (San Diego, CA)
  • Antibody 8 Mouse monoclonal anti-phospho serine antibody: Clone 4A3 Calbiochem (San Diego, CA)
  • Antibody 9 Mouse monoclonal anti-phosphorylated serine antibody: Clone 4A9 Calbiochem (San Diego, CA)
  • Antibody 10 Rabbit polyclonal anti-phospho serine antibody:
  • Antibodies 1 Mouse monoclonal anti-phosphorylated threonine antibody: clone PTHR-1E11 nanoTools (Germany)
  • Antibody 1 Mouse monoclonal anti-phosphorylated threonine antibody: clone PTHR_4D11, nanoTools (Germany)
  • Antibody 1 Mouse monoclonal anti-phosphorylated threonine antibody: clone PTHR_14B3 nanoTools (Germany)
  • Antibody 14 Mouse monoclonal anti-phosphorylated threonine antibody: Clone Q7 Qiagen (Valencia, CA)
  • Antibody 1 Usagi Polyclonal Anti-Phosphorylated Threonine Antibody: CHEMIC0N (Temecula, CA)
  • Antibody 1 Rabbit polyclonal anti-phosphorylated threonine antibody: Zymed (South San Francisco, A) [Table 1 1]
  • Example 1 antibody recognition ability was examined by combining an anti-phosphorylated threonine antibody (antibody 16) as a primary antibody and an anti-rabbit antibody as a secondary antibody.
  • antibody 16 anti-phosphorylated threonine antibody
  • antibody 16 anti-rabbit antibody
  • the function of the anti-phosphorylated threonine antibody (antibody 16) as the primary antibody is more detailed.
  • the antibody recognition reaction was compared under the following two conditions for the entire 289 peptide sequence. Furthermore, each plate used in the experiment was used in Example 1.
  • a 9 6-well microtiter plate on which a peptide substrate was immobilized in the same manner as in Example 1 was subjected to blocking treatment at 30 ° C. for 1 hour using a blocking buffer solution. After washing 3 times with TB S-T buffer solution, recognition reaction was performed with HRP-labeled anti-rabbit antibody buffer solution. The recognition reaction was performed at 30 ° C for 1 hour, and after removing the reaction solution, it was washed 4 times with a TB S-T buffer solution. TMB dissolved! 100 L of night was added and reacted at 30 ° C for about 10 minutes. After stopping the reaction with 2N aqueous sulfuric acid, the absorbance at 450 ⁇ m was quantified with an absorptiometer.
  • Peptide substrates were immobilized in the same manner as in Example 1, and 9 6-well microtiter plates were subjected to a proking treatment at 30 ° C for 1 hour using a blocking buffer solution. After washing three times with a TB S-T buffer solution, the reaction was carried out at 30 ° C. for 1-2 hours with an anti-phosphorylated threonine antibody buffer solution of antibody 16. After removing the reaction solution, it was washed 3 times with TBS-T buffer solution. Subsequently, a recognition reaction was performed with an HRP-labeled anti-rabbit antibody buffer solution. The recognition reaction was performed at 30 ° C for 1 hour, and after removing the reaction solution, it was washed 4 times with a TB S-T buffer solution.
  • PKA substrate peptide was immobilized on 9 6-well microtiter plate in the same manner as in Example 1 and 1 U or 1550 mU of P KA (Pr omega, Madison, WI or Upstate) per well. Phosphorylation reaction was carried out at 30 ° C. using 50 L of PKA reaction buffer solution containing aliquots per well, and the change with time was followed. After removing the reaction solution, the reaction solution was washed with a TBS-T buffer solution and purified water. By the method shown in Example 1, the product phosphorylated peptide was measured using antibody 16 (FIGS. 3-1, 3-2).
  • PKA phosphorylates serine and threonine residues in the substrate peptide (SEQ ID NOs: 2 and 3) over time.
  • Antibody 16 is phosphorylated serine and phosphorylated. It was found that threonine is recognized to the same extent.
  • the substrate peptide for AMP K was immobilized on 9 6-well microtiter plate by the method shown in Example 1, and AMP K reaction buffer solution containing 10 mU of AMP K (Upstate) per well. Using 0 ⁇ L each, phosphorylation was performed at 30 ° C., and the change with time was measured. After removing the reaction solution, it was washed with TBS-T buffer solution and purified water. Further, the product phosphorylated peptide was measured by the method shown in Example 1. When ATP and AMP were removed from the AMPK reaction buffer solution, the phosphorylation reaction was also measured when only AMP was removed ( Figure 4).
  • AMP K phosphorylated the substrate peptide SAM T (SEQ ID NO: 7) over time and detected the phosphorylation using antibody 16 to detect AMP K rather than in the presence of ATP. It was found that phosphorylation was stronger in the presence of ATP and ATP.
  • the substrate peptide for PKC was immobilized on a 9-well microtiter plate in the same manner as in Example 1, and a PKC reaction buffer solution containing 6.3 mU PKC (Upstate) per well was added to each well. Phosphorylation reaction was performed at 30 ° C for 1 hour using 0 ⁇ L each.
  • the P KCs used were P KC o;, P KC] 3 II, P KC ⁇ s P KC ⁇ n PKC ⁇ , PKC ⁇ , P KC 6 and PKC ⁇ .
  • Example 6 Detection of phosphorylation in cell extract of PKA and GFP gene expressed in HEK 293 cells
  • HE K 293 cells were placed in a 5 OmL sterilized test tube, and 2 OmL of HEK 293 cell growth medium warmed to 37 ° C was added and suspended. The cells were precipitated by centrifugation at 1 000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded. HEK293 cell growth medium 15 mL was added to resuspend the cells. The obtained suspension was transferred to a cell culture F 75 flask (coining) and cultured at 37 ° C in a carbon dioxide culture apparatus. When cells reached approximately 80% confluence, they were passaged as follows. The medium in the flask was discarded and washed twice with 1 OmL of PBS—.
  • HEK 293 cells were removed with approximately 10 mL of cell detachment solution. Cells were collected with HEK 293 cell growth medium and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes to precipitate the cells and discard the supernatant. HEK 293 cell growth medium was added to resuspend the cells. A portion of the resulting cell suspension was used and grown in the same way in a new cell culture F75 flask. Passaging was repeated to obtain the required number of cells. HE K 293 cells obtained by repeated passages are seeded at a density of 300,000 / m 1 in a 6-well plate for cell culture (SUMILON MS-8496F5) and approximately HEK 29 3 cell growth medium per well.
  • the resulting cell extract is 0.03 ⁇ g protein per well.
  • phosphorylation was performed at 30 ° C for 1 hour in a 96-well microtiter plate on which a substrate peptide for PKA was immobilized.
  • phosphorylated peptide was detected with antibody 16 (FIG. 6).
  • FIG. 6 shows that the PKA activity contained in the cell extract can be measured using the peptide array of the present invention.
  • Example 7 Detection of phosphorylation reaction in cell extract of L6 cultured cells
  • L 6 cells were placed in a 5 OmL sterilized test tube, and 2 OmL of L 6 cell growth medium warmed to 37 ° C was slowly added and suspended. The cells were precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded. The cells were resuspended by adding 15 mL of L 6 cell growth medium. The obtained suspension was transferred to a cell culture F75 flask (Coueng) and cultured at 37 ° C in a carbon dioxide culture apparatus. At about 80% confluence, subculture was performed as follows. Discard the medium in the flask, 1 01111 ⁇ ? Washed twice with 83—. The cells were removed by treatment with about 1 OmL of cell detachment solution at room temperature.
  • Example 4 In the same manner as in Example 4, using a solution obtained by mixing the prepared cell extract into 50 ⁇ L of AlViP K reaction buffer so that the amount of protein was 0.1 / zg per well, the substrate peptide for AM ⁇ Phosphorylation reaction was carried out for 1 hour at 30 ° C in a 96-well microtiter plate with immobilized phospholipid, and phosphorylated peptide was detected with antibody 16 in the same manner as in Example 1 (Fig. 7).
  • Antibody 16 diluted 2-fold with 50 mM sodium carbonate buffer (pH 9.5) is labeled with Cy 3 using the Cy 3 labeling kit (Amersham Biosciences: code number PA33001) according to the attached procedure. did.
  • the obtained Cy 3 labeled antibody 16 was diluted 1000 times with a blocking buffer solution to obtain a buffer solution of Cy 3 labeled antibody 16.
  • Example 9 Phosphorylation detection using a peptide substrate immobilized on the surface of a slide glass
  • a phosphate buffered saline solution (pH 7.2) was dispensed and immobilized.
  • the immobilized slide glass was allowed to stand at room temperature for 3 hours, then washed twice with water, DMF, water, and ethanol in that order, and dried under reduced pressure at room temperature.
  • the dried slide glass was blocked with a blocking buffer solution at room temperature for 1 hour, and then phosphorylated on the slide glass in the same manner as in Example 3 and Example 6.
  • PKA the amount of enzyme of 15 OmU per slide glass, and when using PKA and GFP expressing cell extract, A protein amount of 0.1 ⁇ g per slice of glass was used. After reacting at 30 ° C.
  • the slide glass was washed twice with TBS-T buffer solution and purified water, and again subjected to blocking with blocking buffer solution for 1 hour at room temperature.
  • the buffer solution of Cy3 labeled antibody 16 prepared in Example 8 was allowed to act on a slide glass at 30 ° C for 1 hour.
  • the plate was washed twice with TBS-T buffer solution and five times with purified water, and then dried by centrifugation at 500 rpm.
  • the obtained glass slide was scanned using a fluorescence microscope for DNA microarrays (ScanArray 5000: GSI Luraonics), and fluorescence imaging images were acquired at an excitation wavelength (5 43 nm) and a detection wavelength (5700 nm) ( Figure 8).
  • the photographs in Fig. 8 show the controls from which the kinase is not added (Kinase (-)), when using the PKA enzyme [PKA (+)], when using the PKA-expressing cell extract [PKA Lysat e ( +)], When using a GFP-expressing cell extract [: GFP Lysate (+)].
  • the purified PKA enzyme was also applied to the microarray prepared on the slide glass by the action of the unpurified cell extract expressing the PKA gene. As in the case of the action of PKA, the state in which the phosphorylation reaction by PKA was proceeding smoothly was detected.
  • the present invention provides a new phosphorylation detection method that replaces the phosphorylation detection method using radioactively labeled ATP, which has been used as a standard, and also provides a substrate group and a peptide array used for the implementation thereof. Furthermore, by producing a superior polyclonal anti-phosphorylated threonine antibody, it is possible to provide a more sensitive phosphorylation detection method, and a diagnostic method and screening method based on this method.

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Abstract

プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼの反応性を簡便に測定可能な手段の提供。プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも１種含有するプロテインキナーゼの基質群、前記基質群を固定してなるペプチドアレイ、前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、リン酸化および／または脱リン酸化反応を検出する方法、前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、プロテインキナーゼおよび／またはプロテインホスファターゼの活性化および／または不活化に基づく疾患の診断方法、ならびに前記ペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法。

Description

明細書
リン酸化ー脱リン酸化反応検出用基質群およびそれを用いた検出方法 技術分野
本発明は、 リン酸化ー脱リン酸化反応検出用基質群およびそれを用いた検出方 法に関する。 詳しくは、 本発明は、 Non- RI法でリン酸化一脱リン酸化反応を高感 度に検出するペプチド性基質群およびそれを用いたリン酸化一脱リン酸化反応の 検出方法に関する。
背景技術
生体内のタンパク質は、—.様々な生理的条件下で生化学的修飾を受けることによ つてその性質を変化させている。 リン酸化は、 タンパク質の主要な翻訳後修飾反 応の 1つであり、 その反応は瞬時かつ可逆的におこるため、 タンパク質の活性 Z 不活性をコント口ールする基本的な素過程の 1つとして、 生体内で重要な役割を 担っていることが推測される。 実際、 真核細胞においては細胞内タンパク質の多 くはリン酸化されており、 多くのシグナル伝達系において、 タンパク質リン酸化 が情報伝達の方法として広く用いられていることが知られている。
一般に、 タンパク質がリン酸化反応、 あるいは脱リン酸化反応を受けると、 タ ンパク質を構成するアミノ酸残基の局所的な極性に変化が生じることにより、 結 果としてタンパク質の高次構造に基づく機能や活性度に変化を生じることにより、 タンパク質の活性/不活性がコントロールされていると考えられている。 このよ うに、 細胞内情報伝達に深く関わっているタンパク質リン酸化酵素の働きを調べ ることは、 細胞機能を解析する上で大変重要である。 さらに、 医薬品探索研究や ボストゲノム研究として注目されているプロテオームの研究にも関連し大変興味 深い。 プロテオーム解析のツールとして、 タンパク質またはペプチドを基盤上に 固定するマイクロアレイ技術が知られている（WO 0 2 / 0 8 3 9 3 3 A 2、 WO 0 2 / 0 8 3 8 8 4 A 2、 M. Bettencourt-Dias, R. Giet, R. Sinka, A. Mazumdar, W. G. Lock, F. Balloux, P. J. Zaf iropoulos, S. Yaraaguchi, S. Winter, R. W. Carthew, M. Cooper, D. Jones, L. Frenz, D. M. Glover Nature 2004， 432, 980 - 7、 G. Manning, D. B. Whyte, R. Martnez, T. Hunter, S. Sudarsanam Science 2002， 298, 1912-1934s S. J. Lee, S. Y. Lee Anal. Biochera. 2004, 330, 31ト 316、 R. C. Panicker, X. Huang, S. Q. Yao. Comb. Chem. High Throughput Screen. 2004, 7, 547—56、 D. S. Y. Yeo, R. C. Panicker, L. P. Tan, S. Q. Yao Comb. Chem. High Throughput Screen. 2004, 7, 213—221、 B. T. Houseman, J. H. Huh, S. J. Kron, M. Mrksich Nature Biotech. 2002. 20. 270—274)。
タンパク質リン酸化酵素 （プロテインキナーゼ） は、 タンパク質の特定の部位 をリン酸化してその機能を変える働きをもち、 その基質であるタンパク質のセリ ンまたはスレオェン残基をリン酸化する 「セリン/スレオニンキナーゼ」 と、 チ 口シン残基をリン酸化する 「チロシンキナーゼ」 の 2つに大別される。 ここで、 「チロシンキナーゼ」 は細胞膜内あるいは近傍に存在し情報伝達の最上流に位置 し細胞外の環境変化を直接検知する場合が多く、 「セリン スレオニンキナーゼ」 は上流からの信号を受けて逐次的に情報伝達を行い、 細胞機能の直接的な調節に 関与する場合が多い。
プロテインキナーゼは、 細胞外部からの刺激を細胞内部に伝達し、 これらの刺 激に対する細胞の応答に関与する。 このように、 プロテインキナーゼはリン酸化 を通して、 代謝、 増殖、 分化、 情報伝達、 運動などの多彩な細胞機能の調節を担 つている。 細胞内でのプロテインキナーゼは特定のタンパク質を基質として認識 することで特異性の高いリン酸化反応を進行させ、 これらリン酸化反応の逐次的 反応の組み合わせとして、 細胞外の環境変化や薬剤に対する応答として信号を伝 達し細胞機能を調節している。 遺伝子配列の解析から、 約 8 0 0種類のプロティ ンキナーゼが存在して細胞内のシグナル伝達に関与していると予想されている。 タンパク質リン酸化の異常は、 癌、 糖尿病、 関節炎などの様々な疾患の原因また は結果と考えられている。
一方、 プロテインホスファターゼは、 リン酸化されたタンパク質を基質として 脱リン酸化を触媒する酵素であり、タンパク質リン酸化の可逆性を保障している。 プロテインキ^ "一ゼは、 それ自体がキナーゼの基質でもあり、 スレオニン、 セリ ン （ホスホリラーゼなど）、 チロシン （srcなどガン遺伝子関連のタンパク質に例 が多い） などのいずれかの残基がリン酸化されたプロテインキナーゼは、 プロテ インホスファターゼによって再ぴ元の酵素に戻り、 次の情報による活性化に備え る。 シグナル伝達経路の共通の特徴として、 その反応の一過性がある。 この一過 性は、 シグナル伝達分子の量や活性化状態の一過性の反映である。 タンパク質の リン酸化は、ある場合には活性化を、ある場合には不活性化を引き起こす。実際、 タンパク質の脱リン酸化反応が積極的なスィツチオンの役割を担っている場合も 知られている。
プロテインキナーゼは、—.その基質特異性が高いことが特徴であるが、 基質タン パク質の被リン酸化部位を含むアミノ酸配列からなるぺプチド性部分を抽出した ペプチドもまた基質としてリン酸化を受けることが広く知られている。そのため、 プロテインキナーゼの反応性を調べる際には、 ぺプチド性基質を用いて調べるこ とが可能である。
前記 「プロテインキナーゼの反応性」 は、 その適当な基質を用いてリン酸化反 応を行わせ、 生成物であるリン酸化基質や A D Pの増加、 あるいは出発物である 基質や A T Pの減少を何らかの方法で計測することで判定が可能である。 今日で は、 タンパク質リン酸化は、 放射性核種 32 Pの取り込みを直接測定する方法か、 または抗リン酸化タンパク質抗体を用いる方法が一般的である。
最近では、 基質に含まれるリン酸化セリン残基、 リン酸化スレオニン残基また はリン酸化チロシン残基を、 抗体おょぴ表面プラズモン共鳴によって検出する方 法 （特開 2 0 0 4— 2 8 3 1 1 4号公報） や、 適当なキレート性検出試薬および 表面プラズモン共鳴によって検出する方法（特開 2 0 0 4— 3 0 9 3 0 3号公報） が注目されている。 これらの方法では、 放射性物質を取り扱う必要がなく操作性 にも優れているが、 抗体や検出試薬の認識能力に強く依存し、 これらの認識能力 を基とした間接的な検出と測定を行うことになる。 そのため、 認識能力の優れた 抗体や検出試薬の開発が重要かつ不可欠となる。
チロシン残基のリン酸化の検出に関しては、 タンパク質またはべプチド配列内 のリン酸化チロシン残基を幅広く認識する多くの優れた抗リン酸化チロシン抗体 が知られており、 市販されている。 そのため、 それらの抗体を用いることでチロ シンキナーゼの反応性は比較的容易に測定可能である。 一方、 セリン スレオニ ンキナーゼの場合は、 幅広くかつ一般的にリン酸化セリンあるいはリン酸化スレ ォニン残基を認識可能な優れた抗体は知られていない。 そのため、 抗体を使って セリン スレオニンキナーゼの反応性を調べる場合、 特定のリン酸化タンパク質 あるいはリン酸化ペプチドを特異的に認識する抗体をその都度作製して用いなけ ればならず、 セリン/スレオエンキナーゼの反応性を抗体により一般的かつ簡便 に検出し測定する方法は-ほとんど知られていない。
発明の開示
上述の理由から、 現在においては、 セリン Zスレオニンキ^ "一ゼのアツセィに 関しては、 放射性核種の32 Pの取り込みを直接測定する方法が一般的となってい るが、 実験施設や作業環境に制約があり、 また実験者の放射能被爆の問題もある 為、 あまり大規模なハイスループット （high throughput) 解析には適さないとい う問題がある。 したがって、 大規模なプロテオーム解析を実施して疾患とタンパ ク質リン酸化カスケ一ドの関連を調べる上で、 放射化標識された A T P等を用い ない Non- RI法で、 タンパク質のリン酸化 脱リン酸化を高感度に検出するアツセ ィを可能にすることが重要な課題となっている。
本発明の目的は、 プロテインキナーゼまたはプロティンホスファターゼの反応 性を簡便に測定可能な手段の提供である。
本発明者らは、 上記問題点に鑑み、 鋭意検討した結果、 プロテインキナーゼま たはプロテインホスファタ一ゼの基質として以下に示すような人工ペプチドを用 いることを見出し、 本発明を完成するに至った。 即ち、 本願発明は、 以下に示す 通りである。
〔1〕 プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中の セリン残基をスレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも 1種 含有するプロテインキナーゼの基質群。 〔2〕 プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中の セリン残基 リン酸化スレオェン残基に置換してなる人エペプチド基質を少なく とも 1種さらに含有する、 前記 〔1〕 に記載の基質群。
〔3〕 前記人工ペプチド基質が 5〜3 0のアミノ酸残基を有するものである、 前記 〔1〕 または 〔2〕 に記載の基質群。
〔4〕 前記プロテインキナーゼがセリン Zスレオニンキナーゼである前記 〔1 〕 ~ 〔3〕 いずれかに記載の基質群。
〔5〕 前記セリンノスレオニンキナーゼが c AM P依存性プロティンキナーゼ Aである、 前記 〔4〕 に記載の基質群。
〔6〕 前記セリン Zスレオエンキナーゼがプロテインキナーゼ Cである、 前記
〔4〕 に記載の基質群。
〔7〕 前記セリン Zスレオエンキ^ "一ゼが AM P活性化プロティンキナーゼで ある、 前記 〔4〕 に記載の基質群。
〔 8〕 前記人エペプチド基質が配列番号 1 1〜 2 9 9に記載のァミノ酸配列群 から選択されるアミノ酸配列を有するものである前記 〔1〕 〜 〔7〕 いずれかに 記載の基質群。
〔9〕 前記 〔1〕 〜 〔8〕 いずれかに記載の基質群を固定してなるペプチドァ レイ。
〔1 0〕 前記 〔9〕 に記載のペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体 を用いることを特徴とする、 リン酸化およびノまたは脱リン酸化反応を検出する 方法。
〔1 1〕 前記抗リン酸化スレオニン抗体がポリクローナル抗体である、前記〔1 0〕 に記載の方法。
〔1 2〕 下記工程：
被験者由来の生体試料からプロティンキナーゼおよび/またはプロティンホスフ ァターゼを含む画分を調製する工程；
前記画分と前記 〔9〕 に記載のペプチドアレイとを接触させる工程； 前記接触工程前後のぺプチドアレイについて、 抗リン酸化スレオニン抗体を用い てリン酸化ペプチドおよび/または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならび に
前記検出結果を、 対照における検出結果と比較し、 疾患の有無に応じて変化する プロティンキナーゼおよび/またはプロテインホスファターゼ活性を判定するェ 程
を含むプロティンキナーゼおよび/またはプロティンホスファターゼの活性化お よびノまたは不活化に基づく疾患の診断方法。
〔1 3〕 前記疾患が癌-、 悪性腫瘍、 糖尿病、 糖尿病性合併症、 代謝性疾患、 自 己免疫疾患、免疫異常疾患、免疫不全、神経変性疾患、虚血性疾患、内分泌疾患、 肝疾患または骨疾患である前記 〔1 2〕 に記載の診断方法。
〔1 4〕 下記工程：
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料 と、 前記 〔9〕 に記載のペプチドアレイとを接触させる工程； ' 前記接触工程前後のペプチドアレイについて、 抗リン酸化スレオニン抗体を用い てリン酸化ペプチドおよび/または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならび に
前記検出結果を被検物質を含まない試料における検出結果と比較し、 被検物質の 有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を 判定する工程
を含む、 プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる 被検物質のスク リーニング方法。
本発明のプロテインキナーゼの基質群によると、 適切に設計されたアミノ酸配 列に基づいて合成した人工基質を含むことから、 Non - RI法で高感度にタンパク質 のリン酸化または脱リン酸化を測定可能な一連の基質を提供することが可能とな り、 さらにコンビナトリアルケミス トリーの技術を応用すれば、 ペプチド基質ラ ィブラリ一を作製することができるため、 プロテインキナーゼおよび またはプ 口ティンホスファターゼのハイスループット解析に供することができる。
本発明の プチドアレイおよびそれを用いたリン酸化および Zまたは脱リン酸 化の検出方法によると、 プロテオーム解析の手段として、 ハイスループット解析 が可能であるとともにリン酸化と脱リン酸化を 1つのアレイで同時に検出するこ とも可能である。
本発明の診断方法によると、 セリンノスレオニンキナーゼによるリン酸化およ び/またはプロテインホスファターゼによる脱リン酸化を高感度かつ迅速に検出 することが可能であるので、 かかるリン酸化および/または脱リン酸化が関与す る疾患の有無を迅速に判定することできる。
本発明のスクリーニング方法によると、 セリン Zスレオニンキナーゼによるリ ン酸化またはプロティンホスファターゼによる脱リン酸化を高感度かつ迅速に検 出することが可能であるので、 プロテインキナーゼまたはプロティンホスファタ ーゼ活性を促進または阻害する物質を効率よく選択することができる。
図面の簡単な説明
図 1は、 リン酸化セリン残基の抗体認識反応を 450 nmでの吸光度により定 量 （n= l)した図である。抗体 1〜抗体 16は、 それぞれ、 [表 1— 1]の各抗体 を意味する。 。
図 2は、 リン酸化スレオニン残基の抗体認識反応を 450 nmでの吸光度によ り定量 （n= l)した図である。 抗体 1 1〜抗体 16は、 それぞれ、 [表 1— 2] の各抗体を意味する。
図 3— 1は、 PK Aによるセリン残基のリン酸化の抗体 16を使った検出を示 す図である。
PKA 1 U/w e l l , 30°Cで反応
A450 nm (n=3)*、 * 平均値土標準誤差 （ n = 3 )
図 3— 2は、 PKAによるスレオニン残基のリン酸化の抗体 16を使った検出 を示す図である。
PKA 1 U/w e 1 K 30°Cで反応 A450 nm (n = 3)*、 * 平均値土標準偏差 （ n = 3 )
図 4は、 AMP Kによるスレオニン残基のリン酸化の抗体 1 6を使った検出を 示す図である。
ΑΜΡΚ 10 mU/w e 1 1、 30°Cで反応
A450 nm (n = 3)*, * 平均値土標準偏差 （ n = 3 )
図 5は、 PKCによるスレオニン残基のリン酸化の抗体 1 6を使った検出を示 す図である。
PKC 6. 3 mU/w e 1 1、 30°〇で1時間反応
A450 nm (η = 3)*Γ * 平均値士標準偏差 （ η = 3 )
図 6は、 ΗΕΚ 293細胞で ΡΚΑと GF Ρ遺伝子を発現させた細胞抽出液で のリン酸化反応の検出を示す図である。
タンパク量 0. 03 /x gZw e l l、 30°〇で1時間反応
A450 nm (n= 3)*, * 平均値土標準偏差 （ n = 3 )
図 7は、 L 6細胞でのメ トフオルミンと A I CAR刺激細胞抽出液でのリン酸 化反応の検出を示す図である。
タンパク量 0. l /z gZwe l l 30°(で1時間反応
A450 nm (n= 3)*， * 平均値土標準偏差 （ n = 3 )
図 8は、 スライドガラス表面に固定化したペプチドアレイを用いて、 リン酸化 反応を蛍光ィメージング画像で示した図である。
写真は、 左からそれぞれ、 キぅ "一ゼを加えないコントロール [Kinase (-)〕、 PKA 酵素を使った場合〔PKA(+)〕、 PKA発現細胞抽出液を使った場合 [： PKA Lysate (+)〕、
GFP発現細胞抽出液を使った場合 〔GFP Lysate (+)] の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明においてプロティンキナーゼとは、 大別してセリン /スレオニンキナー ゼとチ口シンキナーゼとを含む概念であるが、 以下、 これまで有用なキナーゼ活 性の測定方法が開発されていなかったセリン Zスレオニンキナーゼを中心に述べ る。 セリン /スレオニンキナーゼとしては、 アミノ酸配列中のセリンまたはスレオ ニンをリン^化する酵素であれば特に限定されるものではないが、 例えば、 c A MP依存性プロティンキ^ "一ゼ（PKA)、 c GMP依存性プロティンキナーゼ（P KG)、カルシウム依存性プロテインキナーゼ、 AMP活性化プロテインキナーゼ (AMPK：)、二本鎖 RNA依存性プロテインキナーゼ、 カゼインキナーゼ、 リボ ソームタンパク質 S 6キ ^一ゼ、 R a f キナーゼ、サイタリン依存性キナーゼ（C DK) などがあげられ、 前記カルシウム依存性プロテインキナーゼとしては、 ホ スホリラーゼキナーゼ、 ミオシン軽鎖キナーゼ、 カルモデュリン依存性プロティ ンキナーゼ、 リン脂質依存性プロテインキナーゼ （プロテインキナーゼ C： PK C) などがあげられる。 これらの中でも、 細胞内における役割が解明されつつあ り、 疾患との関連が示唆されている PKA、 AMPK：、 PKCなどが好ましい。 本発明においてプロティンホスファターゼとは、 リン酸化セリンノスレオニン 残基、 リン酸化チロシン残基またはリン酸化セリン Zスレオニン チロシン残基 のリン酸エステル結合を加水分解する酵素をいい、 好ましくはリン酸化セリン Z スレオニン残基のリン酸エステル結合を加水分解する酵素である。 具体的には、 リン酸化されたセリン Zスレオニン残基に特異的なホスファターゼとしては、 P P l、 P P 2A、 P P 2 Bおよび P P 2 Cなどのホスファターゼがあげられる。 これらは、 それぞれ基質特異性や阻害剤に対する感受性、 金属イオン要求性の違 いによって分類されている。 P P 2 Cは単量体酵素であるが、 P P 1、 P P 2A および P P 2 Bは、 調節サブュニットと活性サブュニットで構成される複合体を 形成し、 細胞内での局在性は、 その調節サブユニットとの相互作用により調節さ れていると言われている。 タイプ 2 Bは、 一般に、 カルシニューリンともよばれ ている。 一方、 リン酸化されたチロシン残基を特異的に脱リン酸化するホスファ ターゼとしては、 細胞膜貫通ドメインを持つ受容体型と、 それらをもたない細胞 質型が存在し、 それぞれに分子構造や活性調節機構を異にする多様な分子種を含 んでいる。 またリン酸化されたセリン /スレオニン/チロシン残基を脱リン酸化 するホスファターゼとしても、 基質特異性を異にする複数の分子種が存在するこ とが知られている。
本発明において基質とは、 プロテインキナーゼが認識するアミノ酸配列を含有 するぺプチドまたはタンパク質をいう。 前記べプチドまたはタンパク質を構成す るアミノ酸としては、 天然アミノ酸として知られる αアミノ酸、 ]3アミノ酸もし くは γアミノ酸に加えて、 それらを化学的に修飾したもの、 さらにはアミノ酸の アミノ基または水酸基とカルボキシル基やスルフォニル基やフォスフォリル基等 を介してぺプチド様化学結合を行うことが可能な分子量約 8 0 0以下の化学構造 を有する部分化学構造体もその範囲に含まれる。
前記基質としては、 人工的に適切なアミノ酸配列を設計、 合成可能で、 かつ、 保存性おょぴ操作性に優れているぺプチド基質が好ましい。
本発明において天然に存在する基質とは、 プロテインキナーゼの基質として知 られているタンパク質を構成するァミノ酸配列の全部または一部からなるものを いい、 セリン/スレオニン残基、 好ましくはセリン/スレオニンキナーゼが認識 してリン酸化可能なセリン Ζスレオニン残基を 1つまたは複数含むァミノ酸配列 からなるものである。 天然に存在する基質におけるアミノ酸残基の数としては、 5〜タンパク質の全長のアミノ酸残基の数であり、 好ましくは 5〜 3 0、 より好 ましくは 1 0〜2 0である。
本発明において人エペプチド基質とは、 前記天然に存在する基質に含まれるァ ミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基に置換したものをいい、 好ましくは セリン Ζスレオニンキナーゼが認識してリン酸化可能なセリン残基をスレオニン 残基またはリン酸化スレオニン残基で置換したものである。人エペプチド基質は、 酵素の特異性や検出の容易性を担保するためには、 セリン/スレオニンキナーゼ が認識可能なセリン残基をスレオニン残基 （またはリン酸化されたスレオニン残 基） に置換した部位を 1つ含むものであることが好ましい。 人工ペプチド基質中 のアミノ酸残基の数としては、 セリン スレオニンキナーゼが認識できる程度の ペプチド長となれば特に限定されるものではないが、 通常 5〜5 0 0、 好ましく は 5〜3 0、 より好ましくは 1 0〜2 0である。 なお、 前記人工ペプチド基質は、 前記天然に存在する基質から設計されたもの であるから、 '天然に存在する基質中のセリン スレオニンキナーゼが認識できる 程度のァミノ酸残基からなるぺプチド部分を含有していればよく、 人エペプチド 基質および天然に存在する基質のアミノ酸残基の数が互いに一致する必要はない。 本発明のプロテインキナーゼの基質群は、 前記人工ペプチド基質を少なくとも 1種含有することを特徴とする。 「セリンノスレオニンキナーゼ」 は、 タンパク質 性またはペプチド性基質のセリンおょぴノまたはスレオニン残基をリン酸化する 力 セリン残基とスレオニン残基ではそれらの反応性に若干の差はあるものの共 にリン酸化を受けるものと考えられる。 そこで、 本発明では、 セリン スレオ- ンキナーゼのリン酸化能を調べる目的のためにセリンノスレオニンキナーゼの基 質として被リン酸化セリン残 £をスレオニン残基に置換した人工ペプチド基質を 用いる。 あるいは、 プロテインホスファタ一ゼの脱リン酸化能を調べる目的のた めに、 前記被リン酸化セリン残基をリン酸化スレオニン残基に置換した人工ぺプ チド基質を用いてもよい。
本発明の基質群に含まれる基質の数は、 前記人工ペプチド基質を少なくとも 1 種含有していれば特に限定されるものではないが、 好ましくは、 1〜1 0 0 0 0 0、 より好ましくは 2〜 5 0 0 0 0、 さらにより好ましくは 1 0〜 5 0 0 0であ る。 かかる範囲内の基質群は、 ペプチドアレイまたはペプチドチップとして、 1 個の担体上に固定化することが可能である。
本発明の基質群は、 そのすべてが前記人工ペプチド基質であってもよく、 前記 人エペプチド基質と天然に存在する基質とを含んでいてもよく、 本発明の検出方 法等に用いる場合に、 陽性対照および/"または陰性対照となる人エペプチド基質 または天然の基質を含んでいてもよい。 陽性対照おょぴ陰性対照となる人工ぺプ チド基質には、 セリン残基をリン酸化スレオニン残基またはァラニン残基に置換 した人エペプチド基質も含まれる。
人工ペプチド基質の具体的な配列は、 配列番号 1 1〜2 9 9に記載のアミノ酸 配列群から選択されるアミノ酸配列が好ましい。 かかるアミノ酸配列を全部用い てもよ'く、 あるいは、 対象とするプロテインキナーゼに応じて適宜組み合わせて 用いてもよ ヽ。
本発明の人エペプチド基質は、 天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中 の被リン酸化セリン残基をスレオニン残基またはリ ン酸化スレオニン残基に置換 することによって調製することができる。 以下、 かかる人工ペプチド基質配列の 設計と調製方法について説明する。
基質配列設計の方法としては、 ゲノム情報またはタンパク質情報からセリン/ スレオニンキナーゼの基質となるタンパク質の被リン酸化部位を含むぺプチド断 片を予測し抽出する。 抽出したペプチド断片を、 セリン スレオニンキナーゼの ぺプチド性基質配列として既に知られているものをも含め、「ぺプチド基質の基本 配列」 と定義して用いる。
次に、 前記ペプチド基質の基本配列の被リン酸化部位 （セリン残基） を全てス レオニン残基に置換し、その他のァミノ酸残基は基本配列と同様にしてもよいし、 適当な方法で一部のァミノ酸残基をさらに他のァミノ酸残基に置換してもよい。 さらなる置換は、 セリン Zスレオニンキナーゼの人工ペプチド基質の製造、 固定 化等に有利な置換基を導入するために行われる。 このように人工的に配列設計さ れたペプチドを、 基質群 （集合体あるいはペプチド基質ライブラリー） として供 する。 配列設計するペプチド配列は、 化学合成の効率と活性発現を担保するため に、 4 0アミノ酸残基以下とすることが好ましい。
前記ライブラリーには、 被リン酸化部位をリン酸化スレオニンに置換した基質 を少なくとも 1種含有してもよい。 リン酸化スレオニン置換した基質は、 リン酸 化の陽性対照となるばかりでなく、 プロテインホスファタ一ゼの基質とも¾'り、 リン酸化/脱リン酸化を同時に検出することができるので好ましい。
「配列設計されたぺプチド性基質の集合体（ぺプチド性基質ライブラリ一）」は、 一般的な化学的べプチド合成方法 （例えば、 Fraoc法での固相合成等） により化学 合成されて供与される。 ここで重要な点は、 天然に存在する被リン酸化部位とし てのセリン残基を敢えてスレオニン残基に置換して配列設計し、 化学合成するこ とである。
上記の方法'によって設計し化学合成した人エペプチド基質を含有する基質群を、 溶液状態または 「固相状態」 でセリン/スレオニンキナーゼによるリン酸化反応 の基質として用いる。 キナーゼ反応の生成物であるべプチド性リン酸化基質を抗 リン酸化スレオニン抗体で認識させ検出することで、 セリン Zスレオニンキナー ゼの種々の条件下での反応性を検出し測定することができる。 逆に、 ホスファタ ーゼ反応の生成物である脱リン酸化基質が抗体で検出されなくなることで、 プロ ティンホスファターゼの種々の条件下での反応性、 好ましくはセリン _ セレオュ ンキナーゼとの競合性を検出し測定することができる。
ここでいう 「固相状態」 とは、 ペプチド性基質を種々の固相担体に直接または リンカーと呼ばれる適当な化学構造体を介して結合した状態をいう。 固相担体と しては、有機高分子もしくは無機高分子材料（プラスチック等）、.ガラス、金属等 で作製された平板、 試験管 （生化学分野で一般的にプレートと呼称されるものを 含む）、 薄膜、 微粒子等を指す。
「リンカ一」 としては、特に限定されるものではないが、例えば、酸素、窒素、 硫黄またはリン原子を含む鎖状または環状構造を含む炭化水素基などがあげられ る。
「固相担体とペプチド性基質との直接またはリンカーを介した結合」としては、 共有結合、 静電的結合、 水素結合、 疎水結合、 吸着、 接着等が含まれる。 当然な がら、 生化学分野で 9 6穴プレート、 3 8 4穴プレート、 1 5 3 6穴プレートと 一般的に呼ばれている実験器材にペプチド性基質を結合させたものゃスライドガ ラスや金薄膜上に微細格子状にぺプチド性基質を結合させたぺプチドアレイも本 発明における 「固相状態」 の範疇に含まれる。
本発明においては、 本発明の基質群を固定してなるぺプチドアレイが好ましく 用いられる。
本発明のリン酸化および/または脱リン酸化反応を検出する方法は、 前記ぺプ チドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用いることを特徴とする。 具体的 には、 前記ペプチドアレイを用いることで多様なセリンノスレオニンキナーゼぉ よび/またほプロティンホスファターゼの反応を行い、 抗リン酸化スレオニン抗 体を用いることで、 多様なセリン /スレオニンキナーゼおよび またはプロティ ンホスファターゼの反応性を幅広くかつ同時に検出する。
前記抗リン酸化スレオニン抗体は、 リン酸化スレオニン残基を認識するもので あれば特に限定されるものではなく、 モノクローナル抗体またはポリクローナル 抗体でもよいが、 基質の配列に限定されずにリン酸化スレオニン残基を認識する 可能性が高いという観点から、 ポリクローナル抗体が好ましい。 かかる抗体は、 公知の方法 Current - Protocol in Molecular Biology, Chapter 11. 12〜 11. 13 (2000) ； Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11. 4〜11. 11) により製造する ことができる。 あるいは、 市販の抗体の中から本発明の目的に適うものを適宜選 択することもできる。 好適な市販品の抗体としては、 ポリクローナル抗リン酸化 スレオニン抗体 （Zymed) などがあげられる。
さらに、 ポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体を用いれば、 リン酸化スレ ォニン残基を含むペプチド性基質配列のみならずリン酸化セリン残基を含むぺプ チド性配列をも幅広く一般的に検出することが可能である。 リン酸化セリン残基 を含むペプチド配列に対する抗リン酸化セリン抗体の親和力は、 抗リン酸化スレ ォニン抗体の親和力よりも低い傾向がある。
反応性を検出する 「プロテインキナーゼ」 としては、 生体試料から抽出した画 分中に含まれるキナーゼ；遺伝子組み換えにより発現精製されたキナーゼ；プロ ティンキナーゼ遺伝子からタンパク質として発現されたプロティンキナーゼであ つて精製されることなく細胞抽出液もしくは細胞破砕液として適当な緩衝溶液に 可溶化された状態のキナーゼ；細胞培養時に分子量約 1 0 0 0以下の化学物質（医 薬品、 生理活性化合物を含む）、 ぺプチド、核酸、 糖鎖等を培地に添加して刺激を 与えることで細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破 砕液中に含まれるキナーゼ；または種々の機能既知もしくは未知遺伝子を導入す ることで、 細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕 液に含まれる'キ"^ "一ゼなどがあげられる。
反応性を検出する 「プロテインホスファターゼ」 としては、 生体試料から抽出 した画分中に含まれるホスファターゼ；遺伝子組み換えにより発現精製されたホ スファターゼ；プロテインホスファターゼ遺伝子からタンパク質として発現され たプロテインホスファターゼであって精製されることなく細胞抽出液もしくは細 胞破砕液として適当な緩衝溶液に可溶化された状態のホスファターゼ；細胞培養 時に分子量約 1 0 0 0以下の化学物質（医薬品、生理活性化合物を含む）、ぺプチ ド、 核酸、 糖鎖等を培地に添加して刺激を与えることで細胞状態を変化させて培 養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるホスファターゼ；また は種々の機能既知もしくは未^遺伝子を導入することで、 細胞状態を変化させて 培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液に含まれるホスファターゼなど があげられる。
本発明において、 セリン スレオニンキナーゼの基質配列内のセリン残基とス レオニン残基を互いに置換しあった配列を準備し、 それらの反応性の違いを比較 検討した結果、 セリン Zスレオニンキナーゼが基質ぺプチド配列を認識する場合 には、 被リン酸化部位を含むある一定の周辺配列を認識し局所的な被リン酸化部 位としてのセリンあるいはスレオニン残基の構造の違いを厳密に区別してはいな いものと考えられる。
本発明の検出方法は、 本発明のペプチドアレイに前記検出対象の 「セリン Zス レオニンキナーゼ」 および/または 「プロテインホスファターゼ」 を含む溶液を 加えて、 キナーゼ反応および/またはホスファターゼ反応が進行する条件下でィ ンキュペートする。 かかる工程を、 以下、 接触工程とも称する。 前記条件は、 検 出対象のキナーゼまたはホスファターゼに応じて適宜設定することができるが、 通常、 0 . 0 5〜0 . 5 mMの A T P存在下、 p H 6 . 5〜7 . 5、 温度 3 0〜 4 0 °Cで、 5分〜 2 4時間である。 なお、 プロテインキナーゼおよびプロテイン フォスファターゼの分子種は、 いずれも大変多岐に渡るため、 単独の阻害剤とし ては、 'それぞれの全ての分子種に対して十分に効果的な阻害効果を示す汎用的な ものは見当 こらない。 したがって、 キナーゼ反応のみを進行させる場合は、 それ ぞれ特異性を異にする公知の複数の種類のプロテインホスファターゼ阻害剤を溶 液中に共存させることが好ましく、 また、 ホスファターゼ反応のみを進行させる 場合には、 それぞれ特異性を異にする公知の複数の種類のキナーゼ阻害剤を溶液 中に共存させることが好ましい。 また、 いずれの反応を行う場合でも、 さらに公 知のプロテアーゼ阻害剤を溶液中に共存させることが好ましい。
前記ホスファターゼ阻害剤としては、 例えば、 オカダ酸、 カリキュリン A、 ト ゥトマイシンなどがあげ-られ、 前記キナーゼ阻害剤としては、 P K Cに比較的特 異性の高い Calphostin C、 Hypericin, PhloretinN H- 7 等； P K Aに比較的 特異性の高い KT5720 等； P T Kに特異性の高い Curcumin、 AG1024 等；カル モジュリンキ^ "一ゼに特異性の高い HA1077、 Lavendustin C などがあげられる。 前記プロテアーゼ阻害剤としては、 P M S F (phenylraethanesulfonyl fluoride)、 口ィぺプチン (leupeptin)、ァプロチュン (aprotinin)、ぺプスタチン (pepstatin)、 E—6 4、 A E B S F (4- (2-Arainoethyl) -bezenesulf onylf luoride) D F P
(diisopropyl f luorophosphate)、 Z P C K (N-carbobenzoxy - L - phenylalanine chloromethyl ketone) などがあげられる。 以上は例示的に挙げたにすぎず、 今日 では、 数多くのホスファターゼ阻害剤、 キナーゼ阻害剤、 プロテアーゼ阻害剤が 市販されているので、 通常の知識を有する当業者であれば、 それらの市販された 特異性の異なる複数の試薬を適宜組み合わせてカクテルとして使用することによ り、 容易に目的を達成することができる。
次に、 前記キナーゼおよび/またはホスファターゼ反応が終了した後、 抗リン 酸化スレオニン抗体を用いて、 ペプチドアレイ上のリン酸化スレオニンの有無を 検出する。
検出手段としては、 ペプチドアレイ上のリン酸化スレオニンに対する抗リン酸 化スレオニン抗体の認識能を検出可能な適当な物理化学量に変換する手段をとる。 具体的には、 抗体を蛍光標識化することで蛍光強度に変換すること、 化学発光色 素を発する酵素を結合させた 2次抗体 （抗リン酸化スレオニン抗体の非可変部位 を認識する） 'を用いて発光強度や吸光強度に変換すること、 抗体結合による分子 量増加分による表面ブラズモン共鳴強度に変換すること等があげられる。
例えば、 マイクロタイタープレートを用いて作製したプレートアレイでセリン ノスレオユンキナーゼの反応性を測定する手段は、 「酵素結合抗体法 （Enzyme Linked Immunosorbent Assay： E L I S A)」 である。 この E L I S Aを応用した 本発明の検出方法を、 より詳細に説明する。 マイクロタイタープレートとしてァ ミノコートプレート （住友ベークライト、 コーユング製） を用い、 リンカ一構造 としてダルタルアルデヒ -ドを介して本発明のぺプチド基質 を固定化する。 牛血 清アルブミン等でブロッキング操作を行った後、 対'象とするセリン /スレオニン キナーゼおよび//またはプロテインホスファターゼによるリン酸化おょぴ Zまた は脱リン酸化反応を固相上で行う。 反応液を除いた後、 洗浄操作を繰り返し、 1 次抗体としてポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体（Zymed)等でリン酸化ス レオニン残基を認識させる。 続いてホースラディッシュペルォキシダ ゼ （H R P ) 結合性 2次抗体等で 1次抗体を認識させ、 ペルォキシダーゼ反応による発色 を測定する。
別の態様として、 スライドガラスを用いて作製したペプチドアレイでのセリン Zスレオニンキナーゼの反応性を測定する手段は、前記 E L I S Aと同様である。 ただし、 酵素による発色反応を測定するのではなく、 蛍光標識化された抗体を用 いて蛍光強度を測定することが好ましい。 より詳細に説明すると、 ガラス表面が ァミノ修飾された D N Aマイクロアレイ用スライドガラスを基本基板 （例えば、 松浪ガラス製高密度ァミノ修飾スライドガラス） として用いる。 これに対して、 両末端にカルボン酸を有する直鎖型リンカ一を活性エステルとし、 基本基板に作 用させる。 その結果、 ガラス表面に活性エステル基を有するスライドガラスが作 製される。 一方、 ペプチド性基質の N末端にはシスティン残基を導入したものを 合成し準備しておく。ペプチド性基質をリン酸緩衝液（p H 7 . 4 )に溶解させ、 D N Aマイクロアレイ作製用アレイヤーで微細格子状に微量分注 （約 1 n L /ス ポット） する。 ガラス表面の活性エステルとペプチド性基質の N末端のシスティ ン残基が位麿選択的に反応し、 ペプチド性基質が微細格子状にスライドガラスに 固定化される。 過剰の溶液を洗い流した後、 大部分のガラス表面を占める活性ェ ステルを化学的にブロッキングする。 即ち、 ブロッキング剤として適度に親水性 と親油性とが制御された性質を持ち 1級アミノ基を有する化学構造体を作製し、 ペプチド性基質が微細格子状に固相化されたスライドガラス表面全体に作用させ る。 このことで、 キナーゼまたはホスファターゼによるリン酸化/脱リン酸化反 応と抗体反応が円滑に行われ得るペプチドマイクロアレイが作製される。 作製さ れたマイクロアレイを、 プレートアレイと同様に牛血清アルブミン等でプロツキ ングし、 対象とするセリン スレオニンキナーゼおよび Zまたはプロテインホス ファターゼによるリン酸化 Z脱リン酸化反応をマイクロアレイ上で行う。 反応液 を除いた後、 洗浄操作を繰り返し、 蛍光標識化されたポリクローナル抗リン酸化 スレオニン抗体（Zymed) 等でリン酸化スレオニン残基を認識させる。 過剰の抗体 溶液を洗い流し乾燥させた後、 D N Aマイクロアレイ解析用蛍光スキャナーで蛍 光強度を測定することで、 対象とするセリン/スレオニンキナーゼおよぴ また はプロテインホスファターゼの反応性を調べることが可能となる。
本発明の検出方法において、 プロテインホスファターゼの反応性は、 抗リン酸 化スレオニン抗体によつて認識され得るリン酸化スレオニン残基に置換したぺプ チド基質の量を、 ホスファターゼの添加前後において比較定量することにより可 能である。 さらに、 例えば、 反応液にプロテインキナーゼとプロテインホスファ ターゼが共存することもあり得るが、 この場合は両酵素が共に反応しうる条件下 で、 酵素間の競合反応を測定することも可能である。 その際、 それぞれの特異的 な配列を有する基質について、 前述の特定のキナーゼ阻害剤やホスファターゼ阻 害剤を適宜添加した場合と無添加の場合の反応性を比較することによって、 それ らの酵素間の関係を詳細に解析できる可能性がある。
本発明の検出方法により、
( 1 ) 単離精製されたセリン /スレオニンキナーゼのぺプチド性基質を見いだ すこと'
( 2 ) セリン スレオニンキナーゼを適当な細胞で遺伝子から発現させ、単離精 製することなく細胞抽出液のまま使用しべプチド性基質を見いだすこと
( 3 ) 細胞培養の際に薬剤刺激、 対象遺伝子の導入に対する細胞の応答や細胞 機能変化をリン酸化反応変化として検出可能なペプチド性基質を見いだすこと が可能である。
上記のぺプチド性基質を見いだす際に、 ぺプチドアレイ上の多数のぺプチド性 基質は、 単離精製セリン Zスレオニンキナーゼ、 遺伝子導入細胞の細胞抽出液、 薬剤刺激細胞の細胞抽出液といったリン酸化条件に応答す 形でリン酸化反応性 を示し、 あるパターンを与える。 この得られたリン酸化パターンにより元の単離 精製セリンノスレオニンキナーゼの機能、 遺伝子導入に用いた遺伝子の機能、 薬 剤刺激をかけた刺激薬剤の機能を定義づけることが可能となる。.ここでは、 この ような機能の定義づけを 「リ ン酸化プロフアイ リ ング （Phosphorylation Profiling)」 と称する。
本発明のプロティンキ^ "一ゼおよび/またはプロティンホスファタ一ゼの活 性化および/または不活化に基づく疾患の診断方法は、 下記工程：
被験者由来の生体試料からプロテインキナーゼおよびノまたはプロティンホスフ ァターゼを含む画分を調製する工程；
前記画分と前記ぺプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、 抗リン酸化スレオニン抗体を用い てリン酸化ペプチドおよび または脱リン酸化ペプチドを検出し、 対照と比較す る工程；ならびに
前記比較結果に基づき、 疾患の有無に応じて変化するプロテインキナーゼおよび /またはプロテインホスファターゼ活性を判定する工程
を含むことを特徴とする。
前記診断対象となる疾患としては、 癌、 悪性腫瘍、 糖尿病、 糖尿病性合併症、 代謝性疾患、 リウマチや関節炎等の自己免疫疾患、 免疫不全やアトピー性疾患な どの免疫異常疾患、 アルツハイマー病、 ハンチントン病、 プリオン病などの神経 変性疾患、 大性心疾患、 脳梗塞、 心筋梗塞、 肝硬変等の虚血性疾患、 内分泌疾 患、 肝疾患、 骨疾患等の様々な疾患があげられるが、 これらに限定されない。 被験者由来の生体試料としては、 特に限定されるものではないが、 血液、 尿、 粘膜、 各種組織などがあげられる。
前記生体試料からプロテインキナーゼおよび/またはプロテインホスファタ一 ゼを含む画分の調製は、 自体公知のタンパク質の精製方法により行うことができ る。 生体試料が細胞の場合、 細胞抽出液、 細胞膜画分、 細胞質画分、 細胞核画分 などの調製が可能である。-.
前記画分と前記ペプチドアレイとの接触工程は、 前記本発明の検出方法で記載 したとおりである。
前記接触工程前後のぺプチドアレイについて、 抗リン酸化スレオニン抗体を用 いてリン酸化ペプチドおよぴ または脱リン酸化ぺプチドを検出する工程は、 前 記したとおりである。
次に、 比較工程において、 前記検出工程で得られた結果を対照と比較する。 こ こで、 対照としては、 正常者由来の生体試料を被験者由来の生体試料の場合と同 様にして前記検出工程に供して得られた結果；予め正常範囲となる基準のリン酸 化または脱リン酸化を決定しておいた基準などがあげられる。 比較結果は、 特定 の基質のリン酸化または脱リン酸化の有無として得られる。 それぞれの基質のリ ン酸化または脱リン酸化の有無と疾患との関連を調べることにより、 疾患の有無 で反応性の異なっている特定の基質のアミノ酸配列を同定することが可能となる。 そして、 タンパク質配列データベースが整備されてきた今 3では、 それらの配列 をクエリーとして既存の配列データベースをホモロジ一サーチすることによって、 当該配列に相当する部分配列を含むタンパク質を同定し、 その実態を解明できる 可能性がある。 それらの疾患関連タンパク質は、 特定のプロテインキナーゼおよ ぴノまたはプロテインホスファターゼが作用する標的として機能しており、 例え ば、 治療薬開発におけるスクリー-ング系に利用できる可能性がある。 最後に、 判定工程において、 前記比較結果に基づき、 疾患の有無に応じて変化 するプロティンキ^ ~一ゼぉよび/またはプロテインホスファターゼ活性を判定す る。 ここで、 あらかじめ精製されたプロテインキナーゼまたはフォスファターゼ による同一基質群の反応性を確認しておくことで、 疾患の有無で反応性が変化し ているプロティンキナーゼまたはフォスファターゼを同定することが可能となる 場合も有り得る。
これまでに特定の疾患と特定のタンパク質のリン酸化との関連については、 多 くの研究がなされているが、 それらを制御するキナーゼゃフォスファタ一ゼの実 態については、 必ずしも明確になっていない場合が多い。 例えば、 アルッハイマ 一病においては、 tau タンパク質の過剰かつ異常なリン酸化が神経変性の引き金 となることを示唆する報告が多いが、 実際にどのような制御因子が tau タンパク 質のリン酸化に関与しているかについては、諸説あって未だに解明されていない。 また、 Pin 1タンパク質のリン酸化と神経変性疾患との関連や、 p53 や Myc、 EGFR のリン酸化と癌、 悪性腫瘍との関連を示唆する報告も多いが、 リン酸化の生理的 意味については、 必ずしもよく理解されてはいない。 本発明の方法は、 プロテオ ーム技術の網羅的方法として利用されることにより、 これらの疾患特異的な重要 な分子メカニズムを解明する上での有力な手段を提供することができる。
本発明のプロテインキ^ "一ゼまたはプロティンホスファターゼ活性を変動させ る被検物質のスクリ一ユング方法は、 下記工程：
プロティンキナーゼまたはプロティンホスファターゼおよび被検物質を含む試料 と、 前記ペプチドアレイとを接触させる工程； ' 前記接触工程前後のぺプチドアレイについて、 抗リン酸化スレオニン抗体を用い てリン酸化ぺプチドおよび/または脱リン酸化ぺプチドを検出し、 前記検出結果 と被検物質を含まない試料における検出結果とを比較する工程；
被検物質の有無により変化するプロテインキナーゼまたはプロテインホスファタ ーゼ活性を判定する工程
を含むことを特徴とする。 前記被検物質としては、 いかなる公知物質および新規物質であってもよく、 例 えば、 核酸、 '糖質、 脂質、 タンパク質、 ペプチド、 有機低分子化合物、 コンビナ トリアルケミス トリー技術を用いて作製された化合物ライプラリー、 固相合成や ファージディスプレイ法により作製されたランダムぺプチドライブラリー、 ある いは微生物、 動植物、 海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
プロティンキナーゼまたはプロティンホスファターゼおよぴ被検物質を含む試 料としては、 生体試料から抽出した画分中に含まれるキナーゼまたはホスファタ ーゼに被検物質を添加したもの；遺伝子組み換えにより発現精製されたキナーゼ またはホスファターゼに被検物質を添加した試料；プロテインキナーゼまたはプ 口ティンホスファターゼ遺伝子からタンパク質として発現されたキナーゼまたは ホスファターゼであって精製されることなく細胞抽出液もしくは細胞破砕液とし て適当な緩衝溶液に可溶化された状態のキナーゼまたはホスファターゼに被検物 質を添加した試料；細胞培養時に被検物質を培地に添加して刺激を与えることで 細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしくは細胞破砕液中に含ま れるキナーゼまたはホスファターゼ；または種々の機能既知もしくは未知遺伝子 を導入することで、 細胞状態を変化させて培養して得られる細胞抽出液もしく 細胞破碎液に含まれるキナーゼまたはホスファターゼに被検物質を添加した試料 などがあげられる。
プロティンキナーゼまたはプロティンホスファターゼおよぴ被検物質を含む試 料と、 ペプチドアレイとの接触工程は、 前記本発明の検出方法で記載したとおり である。
プロティンキナーゼ活性を変動させる被検物質のスクリーユング方法の場合、 ぺプチドアレイにはスレオニン残基を含むぺプチド基質を固定させ、 陽性対照と してリン酸化スレオニン残基を含むぺプチド基質を固定させたものを用いること が好ましい。 次いで、 検出工程において、 接触工程前後のペプチドアレイについ て抗リン酸化スレオニン抗体を用いてリン酸化ペプチドを定性的または定量的に 検出し、 比較工程において、 前記検出結果と被検物質を含まない試料における検 出結學とを比較する。
プロテインホスファタ一ゼ活性を変動させる被検物質のスクリーニング方法の 場合、 ぺプチドアレイにはリン酸化スレオニン残基を含むぺプチド基質を固定さ せ、 陽性対照としてスレオニン残基を含むぺプチド基質を固定させたものを用い ることが好ましい。 次いで、 検出工程において、 接触工程前後のペプチドアレイ について抗リン酸化スレオニン抗体を用いたリン酸化ぺプチドの検出を介して、 脱リン酸化により検出されなくなったペプチド基質を定性的または定量的に検出 し、 比較工程において、 前記検出結果と被検物質を含まない試料における検出結 果とを比較する。
最後に、 判定工程において、 被検物質の有無により変化するプロテインキナー ゼまたはプロテインホスファターゼ活性を判定する。プロテインキナーゼ活性は、 抗リン酸化スレオニン抗体により検出されるぺプチド基質の数および検出強度で 示すことができる。 プロテインホスファターゼ活性は、 抗リン酸化スレオニン抗 体により検出されなくなつたぺプチド基質の数および検出強度で示すことができ る。
前記判定工程において、 プロテインキナーゼ活性が促進されている場合、 被検 物質は、 プロテインキナーゼの活性化を介した疾患の治療剤の候補として選択す ることができる。 プロテインキナーゼ活性が阻害されている場合、 被検物質は、 プロティンキナーゼ活性の抑制化を介した疾患の治療剤の候補として選択するこ とができる。 被検物質は、 プロテインキナーゼ調節剤または研究用試薬としても 有用である。 あるいは、 前記判定工程において、 プロテインホスファターゼ活性 が促進されている場合、 被検物質は、 プロテインホスファターゼの活性化を介し た疾患の治療剤の候補として選択することができる。 プロティンホスファターゼ 活性が阻害されている場合、 被検物質は、 プロテインホスファターゼ活性の抑制 化を介した疾患の治療剤の候補として選択することができる。 被検物質は、 プロ ティンホスファターゼ調節剤または研究用試薬としても有用である。
実施例 次に、 実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれら実施例 に何ら限定きれるものではない。 なお、 本実施例において市販のキットあるいは 試薬を用いた部分については、 特に断りのない限り添付のプロトコールに従って 実験を行った。本実施例で汎用的に使用した試薬、培地、緩衝溶液を以下に記す。 ぺプチド基質
被リン酸化部位としてスレオニンまたはセリン残基を含み N末端にシスティン 残基を含む 1 0から 1 8アミノ酸からなるペプチド配列を通常の Fmoc 法により 化学合成し、 使用した。
以下の 1 0配列は、 合成した粗精製品を逆相クロマトグラフにより精製を行い 使用した。 pS*はリン酸化セリン残基、 pT*はリン酸化スレオニン残基を示す。
Ρ ΚΑ用基質ペプチド
Keraptide (A)： CGGLRRAALG- NH2 (配列番号 1 )
Kempt ide (S)： CGGLRRASLG- NH2 (酉己列番号 2 )
Keraptide (T) ： CGGLRRATLG- NH2 (配列番号 3 ) .
Kempt ide (pS*)： CGGLRRA (pS*) LG- N (配列番号 4 )
Keraptide (pT*) ： CGGLRRA (pT*) LG- ΝΗ2 (配列番号 5 )
AM Ρ Κ用基質ぺプチド
SAMA: CGGHMRSAMAGLHLVKRR-NH2 (配列番号 6 )
SAMT: CGGHMRSAMTGLHLVKRR- NH2 (配列番号 7 )
P K C用基質ペプチド
IQAA: CGGAAKIQAAFRGHMARKK-NH2 (配列番号 8 )
IQAT : CGGAAKIQATFRGHMARKK-NH2 (配列番号 9 )
IQA (pT*)： CGGAAKIQA (pT*) FRGHMARKK-NH2 (配列番号 1 0 )
以下に示す 2 8 9配列は、 合成した粗精製品を精製することなく使用した。 PT はリン酸化されていてもよいスレオニン残基を示す。
PT001 : CGGHMRSAM (pT) GLHLVKRR (配列番号 1 1 )
ΡΤ002 : CGGAMARAA (pT) AAALARRR (配列番号 1 2 ) PT003: CGGHQGKFLQ (pT) FAGSPLY (配列番号 1 3
PT004: CGGKSGELLA (pT) WAGSPPY (配列番号 1 4
PT005: CGGKSGEPLS (pT) WAGSPPY (配列番号 1 5
PT006: CGGQKDKFLQ (pT) FAGSPLY (配列番号 1 6
PT007: CGGSDGEFLR (pT) SAGSPNY (配列番号 1 7
PT008： CGGTFGNKLD (pT) FAGSPPY (配列番号 1 8
PT009： CGGTLGSKLD (pT) FAGSPPY (配列番号 1 9
PTOIO: CGGTVGGKLD (pT) FAGSPPY (配列番号 2 0
PTOll: CGGTVGNKLD (pT).FAGSPPY (配列番号 2 1
PT012: CGGVGDSLLE (pT) SAGSPHY (配列番号 2 2
PT013: CGGKSAEPLS (pT) WAGSPPY (配列番号 2 3
PT014: CGGVGDSLFE (pT) SAGSPHY (配列番号 24
PT015: CGGTVGGKID (pT) FAGSPPY (配列番号 2 5
PT016: CGGKSGEPLS (pT) WAGSPPH (配列番号 2 6
PT017: CGGTLGSKLD (pT) FAGNPPY (配列番号 2 7
PT018: CGGTVAGKLD (pT) FAGSPPY (配列番号 2 8
PT019: CGGVGDSLLE (pT) SAGSPHH (配列番号 2 9
PT020: CGGVGDSLLE (pT) SAASPHY (配列番号 3 0
PT021: CGGYQGKFLQ (pT) FAGSPLY (配列番号 3 1
PT022: CGGKSGELLA (pT) WSGSPPY (配列番号 3 2
PT023： CGGSDGEFLR (pT) TAGSPNY (配列番号 3 3
PT024: CGGKSGDPLS (pT) WAGSPPY (配列番号 3 4
PT025: CGGTFGNKLD (pT) FAGSPPF (配列番号 3 5
PT026: CGGTVANKLD (pT) FAGSPPY (配列番号 3 6
PT027: CGGKSGEPLS (pT) AGTPPY (配列番号 3 7
PT028: CGGKSGEPLS (pT) LAGSPPY (配列番号 3 8
PT029: CGGTIGNKLD (pT) FAGSPPY (配列番号 3 9 9 AddSVVAi (Id) Slda9S¾093 :9S0Id
S 9 #r^2I) AHdSOVS (J^) HAlSaOADOO :9901d
AdVSOVd (Id) ai¾9DAIOO0 :½01d ε AddSOVd (Id) ai OASOOO :890Id z 9 入 ddS£)V (丄 d) QUMDbHOOD :290Id τ 9舍銎！ AVdSOVd (丄 d) aiMODAXODO :T90Xd
0 JHdSOVS (Id) HHSaDADOO :090Id
6 S告暴 ½S鹿） AldSDVH (Id) QldHaMQOOO oz
8 AAdSOVS (I^) HllSaOADOO ： 8 0丄 d
L AddSOVl (Id) aiMNDHIOOD ： ^Old
9 9舎暴 鹿） dddS (Id) Sld39SM993 :9 Old
9 AldSOVd (Id) QIDIOQHDOO ： SKXLd
告暴 M通） AddSOVtt (Id) ai¾991ID0D ： ( d 9T
£ 蓥 AddNOVH (丄 d) ai¾DDAI993 ： S^OXd
Z 暴 AldSDVd (Id) Dld¾a3D090
\ s> "暴 ½2握） A1VS0VH (Id) 腿 033。 :1 Old
0 AddsovAi (id) viiaoisooo :0TK d
6 暴！ 入 ddS通 (Id) vnavs¾99o :6S0Id Οΐ
8 各銎½^) AldSOVKld) Qld¾9QH9D0 :8εο丄 d
L AddSVVd (丄 αΐ¾Ο9ΛΙΟΟ0 ： εοω
9 各暴 HldSOVd (Id) Old¾OQH003 :9S0Id
9 AddSOV (Id) IldaOSMODD ： SSO工 d
AddSOVl (Id) αΐ¾Ν0ΛΙ003 ： OId s ε AddSVVM (Id) vn39S)li)f)3 ： εεου z 舍銎 - dNdSOVS (Id) Hidaoasooo
τ AVdSDVd (丄 d) ai¾S01X 03 ： τεου
0 舍暴 ANdSOVS (Id) ¾lH3DaS£)03 ： ρεοω
9Z
UZ0C/900Zdf/X3d 9T0C80/900Z: ΟΛΧ ε 6 HldSOVd (Id) bld)ia¾Q903 ： S80丄 d
ζ AAdSOVd (Id) QldMOQHOOO :Z80Id τ 6 AldSVVH (Id) QldMaMDOOO ： Ϊ80丄 d 2Z
0 AldSOVl (Id)り¾ ½3。 :080丄 d
6 AHdsovs (丄 ） ansaoiooo :6Z0Id
8 :8 0Id
L AHdSOVS (Id) 31IsaOA990 ： ZOId
9 AidSOVd (丄 d) CHd還り :9Z0Xd OZ
9 8告 ¾½s鹿） AHdsovs (id) aiisaovooo :9Z0Id
AdVSOVd (Id) aiSSOlXDDO
ε 8舍銎 ½SM) AHVS9VS (丄 a) ansaoAODO ••S OId ζ 8 銎 ί S AVdSOVd (Id) ai¾N0iI090 ： SZOId τ AHdSOVX (Id) ansaoAOOo ： TZOId ST
0 8告銎 AldSOVd (丄 d) QiM¾a¾Q000 :0 0Id
6 AHdsovs (id) ansaoiooo :690丄 d
8 l ^暴 ¾) AldSDSH (丄 d) CHd雇り。 f)。 :890Id
L ANdlOVS (Id) mHHOaSDDO ： 90Id
9 L ^ AddlOVd (Id) ai¾09AIf)93 :990ェ d 01
9 入 ddSf)VAl (丄 SldaOI¾903 ： S90ェ d
AddSOVl (Id) V1139S)1093 ： 丄 d ε AAdSOVd (丄 Q¾¾a¾Q990 ： S90Xd ζ AdVSOVd (Id) ai¾N9dI000 :Z90丄 d τ AldSOVd (Id) QldMOQHDOD :I90Id S
0 AddSOVM SldHDSHOOO :090丄 d
6 9 ANdSOVS (Id) miHOaSDOO :6S0Id
8 9 AMVSOVS (Id) mdaoasoDo :890丄 d
L 9 銎 AddSOVd (Id) 31¾S011990 ： 90Id
LZUZ0C/900idf/X3d 9lOC80/900∑: OAV PT084: CGGVGESLLE (pT) SAGSPHY (配列番号 9 4)
PT085: CGGVGDSLLE (pT) SAGSPRY (配列番号 9 5)
PT086: CGGSDGEFLR (pT) SAGSPNH (配列番号 9 6 )
PT087: CGGHQGKILQ (pT) FAGSPLY (配列番号 9 7 )
PT088: CGGSEGEFLR (pT) SAGSPNY (配列番号 9 8 )
PT089: CGGKSGELVA (pT) AGSPPY (配列番号 9 9 )
PT090: CGGHQGKFLQ (pT) FAGSPLF (配列番号 1 00
PT091: CGGQKDKFVQ (pT) FAGSPLY (配列番号 1 0 1
PT092: CGGKSGDLLA (pT).WAGSPPY (配列番号 1 0 2
PT093: CGGSDAEFLR (pT) SAGSPNY (配列番号 1 0 3
PT094: CGGVGDSLLD (pT) SAGSPHY (配列番号 1 04
PT095: CGGSDGEFLR (pT) SAASPNY (配列番号 1 0 5
PT096: CGGTFGNKLE (pT) FAGSPPY (配列番号 1 0 6
PT097: CGGQRDKFLQ (pT) FAGSPLY (配列番号 1 0 7
PT098: CGGHQAKFLQ (pT) FAGSPLY (配列番号 1 0 8
PT099: CGGQKDKFLQ (pT) FAGNPLY (配列番号 1 0 9
PT100: CGGQKDKFLQ (pT) FAGTPLY (配列番号 1 1 0
CGGQKEKFLQ (pT) FAGSPLY (配列番号 1 1 1
PT102: CGGHQGKFLQ (pT) FAGNPLY (配列番号 1 1 2
PT103: CGGSDGEFVR (pT) SAGSPNY (配列番号 1 1 3
PT104: CGGHQGKFVQ (pT) FAGSPLY (配列番号 1 1 4
PT105: CGGKSGEPLS (pT) WAGSPAY (配列番号 1 1 5
PT106: CGGVGDNLLE (pT) SAGSPHY (配列番号 1 1 6
PT107: CGGKSGEPVS (pT) WAGSPPY (配列番号 1 1 7
PT108: CGGVADSLLE(pT) SAGSPHY (配列番号 1 1 8
PT109: CGGVGDSLLE (pT) SAGTPHY (配列番号 1 1 9
PT110: CGGKSGELLV (pT) AGSPPY (配列番号 1 2 0 PTlli: CGGVGDSVLE (pT) SAGSPHY (配列番号 1 2 1
PT112: CGGHQGKFLQ (pT) FAGSALY (配列番号 1 2 2
PT113: CGGHQGKFLQ (pT) LAGSPLY (配列番号 1 2 3
PT114: CGGQKDKFLQ (pT) lAGSPLY (配列番号 1 24
PT115: CGGHQGKFLQ (pT) FAGTPLY (配列番号 1 2 5
PT116: CGGHQGKFLQ (pT) FSGSPLY (配列番号 1 2 6
PT117: CGGKSGELLA (pT) WAGTPPY (配列番号 1 2 7
PT118: CGGKNGELLA (pT) WAGSPPY (配列番号 1 2 8
PT119: CGGTVGGKLE (pT)FAGSPPY (配列番号 1 2 9
PTl 20： CGGKSGEPLS (pT) WSGSPPY (配列番号 1 3 0
PT121: CGGKSGEPLS (pT) WAGSAPY (配列番号 1 3 1
PT122: CGGKSGELLA (pT) WAGSPPF (配列番号 1 3 2
PT123: CGGQKDKLLQ (pT) FAGSPLY (配列番号 1 3 3
PT124: CGGQKDKFLQ (pT) FAGSPLF (配列番号 1 3 4
PT125: CGGHQGRFLQ (pT) FAGSPLY (配列番号 1 3 5
PT126: CGGHQGKFLQ (pT) FAASPLY (配列番号 1 3 6
PT127: CGGQKDKFLQ (pT) FAGSPIY (配列番号 1 3 7
PT128: CGGKSGELLA (pT) WAGSPAY (配列番号 1 3 8
PT129: CGGVGDSLLE (pT) SSGSPHY (配列番号 1 3 9
PT130: CGGKSGELLA (pT) WAGSAPY (配列番号 1 40
PT131: CGGHQGKFLQ (pT) SAGSPHY (配列番号 1 4 1
PT132: CGGKSGELLA (pT) FAGSPLY (配列番号 1 4 2
PT133: CGGTVGNKLD (pT) SAGSPHY (配列番号 1 4 3
PT134: CGGKSGEPLS (pT) SAGSPHY (配列番号 1 44
PT135: CGGVGDSLLE (pT) SAGSPNY (配列番号 1 4 5
PT136: CGGLALHIRS (pT) WSGLHLV (配列番号 1 4 6
PT137: CGGLHIRSSW (pT) GLHLVKQ (配列番号 1 4 7 L τ
Figure imgf000032_0001
ε ζ τ畚銎 ½2鹿） ： S9Ud ζ ί τ ^ m) QaAVAda (ェ a) dVddaaAooo :Z9TId
T L X ^暴 ½2 OVSaiMS (Id) 3¾Η¾Η 003 ： 9TId
ο L τ ^m^ Q3HV5S0 (Id) H¾ISSAA990 :09Ud
6 9 Τ告暴 ½2Μ) advdcm (id) vdVHsaaooo :6SUd
89 τ 暴½31) SNIHdM(ld) dHdSVldDOO :8STld l 9 X舍暴 Μ¾) dSVldIA (Id) MHHRldNOOO ： 9TId oz
99 Τ aasaaM (id) VASSANIOOO :99IId
9 9 Τ -^- η^ΒΙ) aaSHHHH (Id) SAS3AN1900 ： SSUd
9 Τ告蓥 V SSM3 (Id) lNdI¾000 :½TId ε 9 τ舍銎 ½3厘） MAi O (id) Sd慰 d。。3 ： S9Tid ζ 9 τ告銎 ^a) AIHIOSW (Id) da編 M3f)。 ： SSIエ d 91 τ 9 τ ^mm) DasadAi (id) iHaaidaDoo ： T9TId ο 9 τ畚銎½¾) d39lDM (id) Q¾51iaij¾£)00 :0S d
6 9 τ
Figure imgf000032_0002
dQVlVVa (Id) ASHHHdSOOO :6 Ud
89 τ告 !ASdVAA (Id) dDldAQNOOO :8flld
L 9 τ畚銎½¾) SaAdlOH (Id) JMSadQSOOO ■■L lld 01
99 τ畚蓥 ½s鹿） 3dV腸 1( ） OVHIHIAODO :9ULd.
9 τ告暴 ½a) 3d環 A3I (Id) OSdXHIAOOO ： S 丄 d Q τ告銎 ½s垣） aimno (id) inaiRiNooo ： ェ d ε τ告銎 nddHSO (Id) HHAHdSODO
ζ τ舍 丽 M (Id) NVdSOSSOOO •.ζηΐά s τ τ 暴 aaasQHd (丄 d) sHHsisaooo ： Ϊ 丄 d ο 9 τ
6 τ iinida(id) saawH oo :6s
8 τ :δειω
OS
l∑J0£/900Zdf/X3d 9T0C80/900Z OAV PT165': CGGHFAIAAD (pT) EAEQDSW (配列番号 1 75
PT166: CGGSGDYMPM (pT) PKSVSAP (配列番号 1 76
PT167: CGGQHLRLST (pT) SGRLLYA (配列番号 1 77
PT168: CGGPLGSGES (pT) STRRSSE (配列番号 1 78
PT169: CGGQHLRLST (pT) SGRILYA (配列番号 1 79
PT170: CGGTSRIRTQ (pT) ISLQERQ (配列番号 1 80
PT171: CGGNKRSRTR(pT)DTYSAGQ (配列番号 1 8 1
PT172: CGGDSLPSSP (pT) TATPHSQ (配列番号 1 82
PT173: CGGSHMVHNR (pT)-KINLQDL (配列番号 1 83
PT174: CGGRSRTRTD (pT) YSAGQSI (配列番号 1 84
PT175: CGGPTMRPSM (pT) GLHLVRR (配列番号 1 85
PT176: CGGLHIRSSW (pT) GLHLLKQ (配列番号 1 86
PT177: CGGLHIRSSW (pT) GLYLVKQ (配列番号 1 87
PT178: CGGQHLRVST (pT) SGRLLYA (配列番号 1 88
PT179: CGGDTLPSSP (pT) SATPHSQ (配列番号 1 89
PT180: CGGTSRIRTQ (pT) FSFQERQ (配列番号 1 90
PT181: CGGNPLMRRN (pT) VTPLANP (配列番号 1 9 1
PT182: CGGSHMFHNR (pT) KINLQDL (配列番号 1 92
PT183: CGGLHIRSS (pT) GLHVVKQ (配列番号 1 93
PT184: CGGRSRTRTD (pT) YTAGQSV (配列番号 1 94
PT185: CGGQHLRLST (pT) SGRLIYA (配列番号 1 95
PT186: CGGQHLRLST (pT) SGRLLYG (配列番号 1 96
PT187: CGGPTMRPSM (pT) GLHLVKR (配列番号 1 97
PT188: CGGTSHIRTQ (pT)FSLQERQ (配列番号 1 98
PT189: CGGLHIRSSW (pT)GLHLVRQ (配列番号 1 99
PT190: CGGESLPSSP (pT) SATPHSQ (配列番号 200
PT191: CGGTSRIRTQ (pT)FTLQERQ (配列番号 201 PT192': CGGSHMIHNR (pT) KINIQDL (配列番号 2 0 2
PT193: CGGNPLMRRN (pT) VTPLGSP (配列番号 2 0 3
PT194: CGGQHLRLTT (pT) SGRLLYA (配列番号 2 04
PT195: CGGNPFMRRN (pT) VTPLASP (配列番号 2 0 5
PT196: CGGDSIPSSP (pT) SATPHSQ (配列番号 2 0 6
PT197: CGGSHMIHNR (pT) KVNLQDL (配列番号 2 0 7
PT198: CGGATMRPSM (pT) GLHLVKR (配列番号 2 0 8
PT199: CGGLHIRSSW(pT)ALHLVKQ (配列番号 2 0 9
PT200: CGGQRLRLST (pT)-SGRLLYA (配列番号 2 1 0
PT201: CGGNPVMRRN (pT) VTPLASP (配列番号 2 1 1
PT202: CGGNPLMRRN (pT) VNPLASP (配列番号 2 1 2
PT203: CGGQHLRLST (pT) SGRLVYA (配列番号 2 1 3
PT204: CGGQHLRLST (pT) SGRVLYA (配列番号 2 1 4
PT205: CGGNPLMRRN (pT) VTPIASP (配列番号 2 1 5
PT206: CGGNPLLRR (pT) VTPLASP (配列番号 2 1 6
PT207: CGGPSMRPSM (pT) GLHLVKR (配列番号 2 1 7
PT208: CGGPTMRPSM (pT) GFHLVKR (配列番号 2 1 8
PT209: CGGLHIRTS (pT) GLHLVKQ (配列番号 2 1 9
PT210: CGGDSVPSSP (pT) SATPHSQ (配列番号 2 20
PT211: CGGNPLMRRN (pT) ATPLASP (配列番号 2 2 1
PT212: CGGQHLRLST (pT) TGRLLYA (配列番号 2 2 2
PT213: CGGDSLPSSP (pT) SATAHSQ (配列番号 2 2 3
PT214: CGGPTMRPSL (pT) GLHLVKR (配列番号 2 24
PT215: CGGPTMRASM (pT) GLHLVKR (配列番号 2 2 5
PT216: CGGQHFRLST (pT) SGRLLYA (配列番号 2 2 6
PT217: CGGDSLPSSP (pT) SATPHNQ (配列番号 2 2 7
PT218: CGGLHIRSSW(pT)GLHLAKQ (配列番号 2 2 8 PT219: CGGLHIRSNW (pT) GLHLVKQ (配列番号 2 2 9)
PT220: CGGQYLRLST (pT) SGRLLYA (配列番号 2 3 0)
PT221: CGGQHLHLST (pT) SGRLLYA (配列番号 2 3 1)
PT222: CGGTSRIRTQ (pT) FSLQDRQ (配列番号 2 3 2)
PT223: CGGSHMIHNK (pT) KINLQDL (配列番号 2 3 3)
PT224: CGGLRIRSSW(pT) GLHLVKQ (配列番号 2 34)
PT225: CGGSHMIHNR (pT) RINLQDL (配列番号 2 3 5)
PT226: CGGVHIRSSW (pT) GLHLVKQ (配列番号 2 3 6)
PT227: CGGLHIRSSW (pT)-GLRLVKQ (配列番号 2 3 7)
PT228: CGGNPLMRRN (pT) VSPLASP (配列番号 2 3 8)
PT229: CGGQHLRLST (pT) SGRLLHA (配列番号 2 3 9)
PT230: CGGQHLRLSS (pT) SGRLLYA (配列番号 240)
PT231: CGGNKRSRTK (pT) DSYSAGQ (配列番号 24 1)
PT232: CGGQHIRLST (pT) SGRLLYA (配列番号 24 2)
PT233: CGGNPIMRRN (pT) VTPLASP (配列番号 24 3)
PT234: CGGQHLRLST (pT) SGRFLYA (配列番号 244)
PT235: CGGSHMIHNR (pT)KINVQDL (配列番号 24 5)
PT236: CGGDSLPSSP (pT) SATPYSQ (配列番号 24 6)
PT237: CGGSYMIHNR (pT) KINLQDL (配列番号 24 7)
PT238: CGGQHLRFST (pT) SGRLLYA (配列番号 248)
PT239: CGGTSRIRTQ (pT)FSLQEHQ (配列番号 24 9)
PT240: CGGNKRSRTR (pT) DSYSGGQ (配列番号 2 5 0)
PT241: CGGEAMRRSV (pT) EAALAQP (配列番号 2 5 1)
PT242: CGGPTMRPSM (pT) GLRLVKR (配列番号 2 5 2)
PT243: CGGQHLRLST (pT) SGRLLFA (配列番号 2 5 3)
PT244: CGGDSLPTSP (pT) SATPHSQ (配列番号 2 54)
PT245： CGGTHMIHNR (pT) KINLQDL (配列番号 2 5 5) PT246': CGGRSRTRTD (pT) YSAGQSL (配列番号 2 5 6
PT247: CGGQHLRLST (pT) SGHLLYA (配列番号 2 5 7
PT248: CGGLHVRSSW (pT) GLHLVKQ (配列番号 2 5 8
PT249: CGGLHIRSSW (pT) GLHLIKQ (配列番号 2 5 9
PT250: CGGLHIRSSW (pT) GFHLVKQ (配列番号 2 6 0
PT251: CGGSHMIHNR (pT) KINFQDL (配列番号 2 6 1
PT252: CGGPTMRPSM (pT) GLHLVKK (配列番号 2 6 2
PT253: CGGPTMRPSM (pT) GVHLVKR (配列番号 2 6 3
PT254: CGGTNRLRSE (pT)-IAFIEEN (配列番号 2 64
PT255: CGGPTLRPSM (pT) GLHLVKR (配列番号 2 6 5
PT256: CGGPTMRP應（pT) GLHLVKR (配列番号 2 6 6
PT257: CGGQHVRLST (pT) SGRLLYA (配列番号 2 6 7
PT258: CGGLHIRSSW (pT) GLHLVKQ ' (配列番号 2 6 8
PT259: CGGLHIRSSW (pT) GVHLVKQ (配列番号 2 6 9
PT260: CGGDSLPSSP (pT) SATPHTQ (配列番号 2 7 0
PT261: CGGDSLPSSA (pT) SATPHSQ (配列番号 2 7 1
PT262: CGGLHIRSSL (pT) GLHLVKQ (配列番号 2 7 2
PT263: CGGNPLMRRN (pT) VTPLVSP (配列番号 2 7 3
PT264: CGGLHIRSS (pT)GLHIVKQ (配列番号 2 74
PT265: CGGLHIRST (pT) GLHLVKQ (配列番号 2 7 5
PT266: CGGPTMRPSM (pT) GIHLVKR (配列番号 2 7 6
PT267: CGGPTMRPSM (pT) GLHVVKR (配列番号 2 7 7
PT268: CGGQHLRIST (pT) SGRLLYA (配列番号 2 7 8
PT269: CGGQHLRLST (pT) SARLLYA (配列番号 2 7 9
PT270: CGGPTMRPSM (pT) GLHLAKR (配列番号 2 8 0
PT271: CGGDSFPSSP (pT) SATPHSQ (配列番号 2 8 1
PT272: CGGPTMRPSM (pT) GLHLLKR (配列番号 2 8 2 PT273: CGGLYIRSSW (pT) GLHLVKQ (配列番号 2 8 3
PT274: CGGPNMRPSM (pT) GLHLVKR (配列番号 2 8 4
PT275: CGGQHLRLST(pT) SGRLFYA (配列番号 2 8 5
PT276: CGGFHIRSSW(pT) GLHLVKQ (配列番号 2 8 6
PT277: CGGLRRA (pT) LG (配列番号 2 8 7
PT278: CGGRPRAA (pT)F (配列番号 2 8 8
PT279: CGGFKK(pT)FKL (配列番号 2 8 9
PT280: CGGTIYRRG(pT) RRWRKL (配列番号 2 9 0
PT281: CGGQKRPRRKD (pT) P (配列番号 2 9 1
PT282: CGGRKR(pT)RAE (配列番号 2 9 2
PT283: CGGAPGLI(pT)PGGPP (配列番号 2 9 3
PT284: CGGKKALHRQE (pT)VDAL (配列番号 2 9 4
PT285: CGGMHRQE(pT)VDCLK (配列番号 2 9 5
PT286: CGGHA(pT)PPKKKRK (配列番号 2 9 6
PT287: CGGPK(pT)PKKAKKL (配列番号 2 9 7
PT288: CGGRRADD (pT)DDDDD (配列番号 2 9 8
PT289: CGGRRRDDD (pT) DDD (配列番号 2 9 9
配列表のフリ一テキス ト
配列番号 1 1〜2 9 9に記載のアミノ酸配列は、 任意にリン酸化されていても よい基質である。
TB S— T緩衝溶液：
0. 0 5 %の Tw e e n 20を含むトリス塩酸緩衝生理食塩水 （ p H 7. 5) を 使用した。
プロッキング緩衝溶液：
3 %牛血清アルプミンと 0. 0 5°/。の Tw e e n 2 0を含むトリス塩酸緩衝生理 食塩水 （p H7. 5) を使用した。
抗リン酸化セリン抗体緩衝溶液： 市販品 '（後述） をプロッキング緩衝溶液で 5 0 0倍希釈して使用した。
抗リン酸化ス 'レオニン抗体緩衝溶液：
市販品 （後述） をブロッキング緩衝溶液で 5 0 0倍希釈して使用した。
ホースラディッシュペルォキシダーゼ （HRP) 標識抗マウス抗体緩衝溶液： 市販品 （Zymed) をプロッキング緩衝溶液で 5 0 0 0倍希釈して使用した。
ホースラディッシュペルォキシダーゼ （HRP) 標識抗ゥサギ抗体緩衝溶液： 市販品 （Zymed) をプロッキング緩衝溶液で 1 0 0 0倍希釈して使用した。
P K A酵素：巿 ¾品 (Promega, Madison, WI、または Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) を用いた。 -.
P K C酵素：市販品 （Upstate) を用いた。
AM P K酵素：市販品 （Upstate) を用いた。
P K A反応緩衝溶液 ：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
40 mM Tris/HCl (pH 7. 2)
15 mM MgCl2
0. 2 mM ATP
AM P K反応緩衝溶液：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
40 mM HEPES (pH 7. 4)
80 mM NaCl
5 mM Mg (OAc) 2
1 mM DTT
0. 2 mM 5' - AMP
0. 2 mM ATP
P K C反応緩衝溶液 (全亜型共通） ：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
20 mM MOPS (pH 7. 2)
25 mM β -glycerophosphate
5 mM EGTA
0. 2 mM DTT 1 mM CaCl2
20 mM MgCl2
1/5 Lipid Activator (Upstate)
0.2 mM ATP
カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 （PB S—） ： 塩化ナトリウム 80 g、塩化カリウム 2 g、 リン酸水素ナトリウム 1 1. 5 g、 リ ン酸ニ水素カリゥム 2 gを精製水 1L に溶解したものを 1 0倍希釈しオートタレ ーブで滅菌したものを用いた。
細胞剥離液： -.
トリプシン— EDTA液 （GIBC0) を滅菌 P B S _で 1◦倍希釈して用いた。 HEK 293細胞生育培地：
50 OmLの Dulbecco' s 培地 （Sigma) に 5 OraLの牛胎児血清 .（ 56 °Cで 30分 間加熱し非働化したもの） と 5 mLのぺニシリン /ストレプトマイシン （1000 0 units/mls 1 0000 μ g/ml) を力 [Iえたものを用いた。
PKAプラスミ ド ：
市販品 (Stratagene) を使用した。
GF Pプラスミ ド ：
市販品 （CloneTech) を使用した。
プラスミ ド溶液：
プラス ミ ド 4 を 2 5 0 yu L の OptiMem I (Invitrogen)と 2 5 0 μ L の Lipofectamine 2000 (Invitrogen)の混合液に溶解させたものを細胞培養用 6穴プ レートの 1穴あたり用いた。
HEK 293細胞抽出用緩衝液：以下の組成の緩衝溶液を用いた。
20 mM Tris/HCl (pH 7.2)
0.5 % TritonX-100
150 mM NaCl
20 mM β -glycerophosphate 2 mM EGTA
5 mM ' EDTA
1 mM Na3V04 (sodium orthovanadate)
0. 2 mM PMSF
5 mg/ml Aprotinin
3 rag/ml Pepstatin A
L 6細胞生育培地：
5 0 0 mLの a MEM (Sigma) に 5 0 mLの牛胎児血清（ 5 6 °Cで 3 0分間加熱し非働 化したもの）、 5 mL のぺ-シリン/ス トレトマイシン （ 1 0 0 0 O units/ral、 1 0 0 0 0 mg/ml) と 1 0 mLの 2 0 0 mMグノレタミンをカ [Iえたものを用いた。
L 6細胞分化培地：
5 0 O mLの a MEM (Sigma) に 1 0 mLの牛胎児血清、 5 mLのぺニシリン Zス トレ プトマイシン （ 1 0 0 0 O units/ml、 1 0 0 0 0 mg/ml) 混合液と 1 O tnL の 2 0 O raMグルタミンを加えたものを用いた。
L 6細胞抽出用緩衝液： 以下の組成の緩衝溶液を用いた。
30 raM HEPES (pH 7. 4)
2. 5 mM EGTA
3. 0 raM EDTA
70 mM KC1
0. 1 % Nonident P - 40
20 mM β -glycerophosphate
20 mM NaF
2 mM NaPPi (sodium pyrophosphate)
1 mM Na3V04 (sodium orthovanadate)
0. 2 mM PMSF
0. 01 mM Pepstatin A
実施例 1 ：マイクロタイタープレートでの抗体認識反応 （1 ) 1 %グルタルアルデヒ ドの 50 mM炭酸ナトリゥム緩衝液 （ p H 9. 5) を 9 6穴ァミノプレート （住友ベークライトまたはコーユング製） に 50 Lずつ注 ぎ入れ、 3 7°Cで 2時間反応させ、 プレート表面を活性化させた。 反応液を取り 除き、 精製水で洗浄した。 ペプチド基質を 5 OmM炭酸ナトリウム緩衝液 （pH 9. 5) に溶解させ （ペプチド濃度 1 /ζΜ〜20 μΜ)、活性化させた 96穴マイ クロタイタープレートの各穴に 50 μ Lずつ注ぎ入れた。 37。Cで 2時間反応さ せた後、 反応液を除いた。 TB S_T緩衝溶液と精製水で順次洗浄することでぺ プチド基質を固定化した。 ペプチド基質を固定化させたマイクロタイタープレー トを、 プロッキング緩衝溶液を用いて 30°Cで 1時間プロッキング処理した。 T B S— T緩衝溶液で 3回洗浄した後、 抗リン酸化セリン抗体緩衝溶液または抗リ ン酸化スレオニン抗体緩衝溶液を 1穴あたり 50 Lずつ用いて 30°Cで 1〜 2 時間抗体認識反応を行った。 反応液を除いた後、 TB S— T緩衝溶液で 3回洗浄 した。 続いて、 HRP標識抗マウス緩衝溶液あるいは抗ゥサギ抗体緩衝溶液で認 識反応させた。 認識反応は 1穴あたり 50 μ Lずつ用いて 30°Cで 1時間行い、 反応液を除いた後、 TB S— T緩衝溶液で 4回洗浄した。 TMB (3, 3 ' ， 5, 5 ' ーテトラメチルベンジジン） 溶液を 1 00 μ L加え入れ 30 °Cで約 10分間 反応させた。 2 N硫酸水溶液で反応を停止した後、 吸光光度計で 450 nmでの 吸光度を定量した （図 1およぴ 、表？_)。 その結果、 下記抗体 1 6がリン酸化セ リンおよびリン酸化スレオニンの両方を認識することがわかった。
評価した抗リン酸化セリン抗体 1 0種類と抗リン酸化スレオニン抗体 6種類を 以下に示す。
抗体 1. マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン 7F12、 Alexis Biocheraicals (San Diego, CA)
抗体 2. マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン 16B4、 Alexis Biochemicals (San Diego, CA)
抗体 3. マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体：
クローン Q5、 Qiagen (Valencia, CA) 抗体 4 .' マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体： クローン ab6639、 Abeam (Cambridge, UK)
抗体 5 . マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体： クローン PSR - 45、 Sigma (St. Lois, MO)
抗体 6 . マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体： クローン 608 Zymed (South San Francisco, CA)
抗体 7 . マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体： クローン IC8 Calbiochera (San Diego, CA)
抗体 8 . マウスモノクロ ナル抗リン酸化セリン抗体： クローン 4A3 Calbiochem (San Diego, CA)
抗体 9 . マウスモノクローナル抗リン酸化セリン抗体： クローン 4A9 Calbiochem (San Diego, CA)
抗体 1 0 . ゥサギポリクローナル抗リン酸化セリン抗体：
Zymed (South San Francisco, CA
抗体 1 1 . マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体： クローン PTHR-1E11 nanoTools (Germany)
抗体 1 2 . マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体： クローン PTHR_4D11、 nanoTools (Germany)
抗体 1 3 . マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体： クローン PTHR_14B3 nanoTools (Germany)
抗体 1 4 . マウスモノクローナル抗リン酸化スレオニン抗体： クローン Q7 Qiagen (Valencia, CA)
抗体 1 5 . ゥサギポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体： CHEMIC0N (Temecula, CA)
抗体 1 6 . ゥサギポリクローナル抗リン酸化スレオニン抗体： Zymed (South San Francisco, し A) [表 1一 1]
Figure imgf000043_0001
[表 1— 2]
Figure imgf000043_0002
Figure imgf000043_0003
実施例 2 ：マイクロタイタープレートでの抗体認識反応 （2)
実施例 1で見出した抗体 1 6について、 N末端にシスティン残基を有しリン酸 化スレオニン残基を含む 10から 1 8アミノ酸からなる 289種類のぺプチド配 列 （PT001〜PT289) に対する認識能を調べた。
抗体認識能は、 実施例 1に示すように 1次抗体としての抗リン酸化スレオニン 抗体 （抗体 1 6) と 2次抗体としての抗ゥサギ抗体とを組み合わせて調べた。 し かし、 1次抗体としての抗リン酸化スレオニン抗体 （抗体 1 6) の機能をより詳 細に調 る目的で 28 9ペプチドの全配列について以下の 2つの条件で抗体認識 反応を比較した。 さらに実験に用いる各プレートには実施例 1で用いた
Kemptide (A) Kemptide (T) , Kemptide (ρΤ*)を標準サンプルとして常に固相化させ 比較検討した （表 2)。
条件 1 ： 1次抗体 （一）、 2次抗体 （+ )
ぺプチド性基質を実施例 1と同様の方法で固定化させた 9 6穴マイクロタイタ 一プレートをブ口ッキング緩衝溶液を用いて 30°Cで 1時間ブロッキング処理を 行った。 TB S— T緩衝溶液で 3回洗浄した後、 HRP標識抗ゥサギ抗体緩衝溶 液で認識反応させた。 認識反応は 30°Cで 1時間行い、 反応液を除いた後、 TB S—T緩衝溶液で 4回洗浄した。 TMB溶!夜を 100 L加え入れ 30°Cで約 1 0分間反応させた。 2 N硫酸水溶液で反応を停止した後、 吸光光度計で 450 η mでの吸光度を定量した。
条件 2 ： 1次抗体 （十）、 2次抗体 （+ )
ペプチド性基質を実施例 1と同様の方法で固定化させた 9 6穴マイクロタイタ —プレートをブロッキング緩衝溶液を用いて 30°Cで 1時間プロッキング処理を 行った。 TB S— T緩衝溶液で 3回洗浄した後、 抗体 1 6の抗リン酸化スレオニ ン抗体緩衝溶液により 30°Cで 1〜 2時間反応させた。 反応液を除いた後、 T B S— T緩衝溶液で 3回洗浄した。 続いて、 HRP標識抗ゥサギ抗体緩衝溶液で認 識反応させた。 認識反応は 30°Cで 1時間行い、 反応液を除いた後、 TB S— T 緩衝溶液で 4回洗浄した。 TMB溶液を 1 00 μ L加え入れ 30°Cで約 10分間 反応させた。 2 N硫酸水溶液で反応を停止した後、 吸光光度計で 450 nmでの 吸光度を定量した。 2— 1]
Figure imgf000045_0001
[表 2 - 2 ]
Figure imgf000046_0001
2 - 3 ]
Figure imgf000047_0001
[表 2— 4 ]
Figure imgf000048_0001
[表 2— 5 ]
Figure imgf000049_0001
[表 2— 6 ]
Figure imgf000050_0001
[表 2— 7 ]
Figure imgf000051_0001
実施例 3 ： プレートでの精製 P KAでのリン酸化検出
P K A用基'質ペプチドを実施例 1と同様の方法で 9 6穴マイクロタイタープレ 一トに固定化し、 1穴あたり 1 Uまたは 1 5 0 mUの P KA (Pr omega, Madison, WIまたは Upstate)を含む P KA反応緩衝溶液を 1穴あたり 5 0 Lずつ用いて 3 0°Cでリン酸化反応を行い経時変化を追った。 反応溶液を除いた後、 T B S— T 緩衝溶液と精製水で洗浄した。 実施例 1に示す方法で、 生成物であるリン酸化べ プチドを抗体 1 6を用いて測定した （図 3— 1、 3— 2)。
図 3— 1、 3— 2より、 P K Aは基質ペプチド （配列番号 2および 3) 中のセ リンおょぴスレオニン残基を経時的にリン酸化し、 抗体 1 6は、 リン酸化セリン およびリン酸化スレオニンを同程度に認識することがわかった。
実施例 4 ： プレートでの精製 AMP Kでのリン酸化検出
AMP K用基質ぺプチドを実施例 1に示した方法で 9 6穴マイクロタイタープ レートに固定化し、 1穴あたり 1 0 mUの AMP K (Upstate) を含む AMP K 反応緩衝溶液を 1穴あたり 5 0 μ Lずつ用いて 3 0°Cでリン酸化反応を行い経時 変化を測定した。反応溶液を除いた後、 T B S— T緩衝溶液と精製水で洗浄した。 さらに、 実施例 1に示す方法で、 生成物であるリン酸化ペプチドを測定した。 A MP K反応緩衝溶液から AT Pと AMPを除いた場合、 AMPだけ除いた場合の リン酸化反応も同時に測定した （図 4)。
図 4より、 AMP Kは基質ペプチド SAM T (配列番号 7 ) を経時的にリン酸 ィヒし、 抗体 1 6を用いて当該リン酸化を検出することにより、 AT Pの存在下よ りも AMPと AT Pの共存下の方がリン酸化の程度が強いことがわかった。
実施例 5 ：プレートでの精製 P KCでのリン酸化検出
P KC用基質ペプチドを実施例 1と同様の方法で 9 6穴マイクロタイタープレ ートに固定化し、 各穴あたり 6. 3 mUの PKC (Upstate) を含む P KC反応 緩衝溶液を 1穴あたり 5 0 μ Lずつ用いて 3 0°Cで 1時間リン酸化反応を行った。 用いた P KCは、 P KC o;、 P KC ]3 II、 P KC γ s P KC δ n PKC ε , P K C η、 P KC 6および PKC ζであった。 反応溶液を除いた後、 TB S— Τ緩衝 溶液と精製水で洗浄した。 実施例 1に示す方法により、 生成物であるリン酸化ぺ プチドを抗体 1 6を用いて測定した （図 5)。
図 5より、 用いた PKCはすべて基質ペプチド I QAT (配列番号 9) を AT P存在下でリン酸化することがわかった。
実施例 6 ： HEK 29 3細胞で PKAと GF P遺伝子を発現させた細胞抽出液で のリン酸化反応の検出
5 OmLの滅菌済み試験管に HE K 293細胞を入れ、 3 7°Cに温めた HEK 293細胞生育培地 2 OmLをゆつくりと加え懸濁した。 毎分 1 000回転で 5 分間遠心分離して細胞を沈殿させ上清を捨てた。 HEK293細胞生育培地 1 5 mLを加えて細胞を再懸濁した。得られた懸濁液を細胞培養用 F 75フラスコ（コ 一二ング） に移し、 二酸化炭素培養装置内で 37°Cで培養した。 細胞が約 80% コンフルェント状態に達したら、 次のように継代を行った。 フラスコ内の培地を 捨て、 1 OmLの PB S—で 2回洗浄した。 約 10 m Lの細胞剥離液で細胞をは がした。 H E K 293細胞生育培地で細胞を回収し、 毎分 1000回転で 5分間 遠心分離し、 細胞を沈殿させ上清を捨てた。 HEK 293細胞生育培地を加えて 細胞を再懸濁した。 得られた細胞懸濁液の一部を使い、 新しい細胞培養用 F 7 5 フラスコで同じように増殖させた。 必要量の細胞数を得るために継代を繰り返し た。 継代を繰り返して得た HE K 2 93細胞を 300， 000 /m 1の密度で細 胞培養用 6穴プレート （SUMILON MS- 8496F5) に播き、 1穴あたり HEK 29 3細 胞生育培地で約 2mLにし、 PKAもしくは GFP遺伝子のプラスミ ド溶液を加え 入れ、 3 7 °Cで約 4時間遺伝子導入処理を行った。 4時間後、 継代作業と同じよ うに新しい HE K 29 3細胞生育培地に交換し、 コンフルェント状態に達するま で細胞を増殖させた。 培地を取り除き、 冷やした PB S—で 2回洗浄した。 P B S-EDT A緩衝液で細胞を回収した。 毎分 3000回転で 5分間遠心分離した 後上清を除き、 HEK 293細胞抽出用緩衝液を加え、 4 °Cで細胞成分を溶解さ せた。 得られた溶解液を毎分 1 5, 000回転で遠心分離し、 上清を細胞抽出液 として得た。 得られた細胞抽出液を各穴あたり 0. 03 μ gのタンパク量になる ように A反応緩衝液 50 μ Lに混合した溶液を用いて、 実施例 3と同様に、 PKA用基質ペプチドを固定化した 96穴マイクロタイタープレートでリン酸化 反応を 30°Cで 1時間行い、 実施例 1と同様にして、 リン酸化ペプチドを抗体 1 6により検出した （図 6)。
図 6より、 本発明のペプチドアレイを用いて、 細胞抽出液中に含まれる PKA 活性を測定できることがわかった。
実施例 7 ： L 6培養細胞の細胞抽出液でのリン酸化反応の検出
5 OmLの滅菌済み試験管に L 6細胞を入れ、 3 7 °Cに温めた L 6細胞生育培 地 2 OmLをゆっく りと加え、 懸濁した。 毎分 1000回転で 5分間遠心分離し て細胞を沈殿させ、 上清を捨てた。 L 6細胞生育培地 1 5 mLを加えて細胞を再 懸濁した。 得られた懸濁液を細胞培養用 F 75フラスコ （コーユング） に移し、 二酸化炭素培養装置内で 37 °Cで培養した。 約 80%コンフルェント状態で、 以 下のように継代を行った。 フラスコ内の培地を捨て、 1 01111^の？83—で2回 洗浄した。 約 1 OmLの細胞剥離液で室温下処理し細胞をはがした。 L 6細胞生 育培地で細胞を回収し、毎分 1000回転で 5分間遠心分離して細胞を沈殿させ、 上清を捨てた。 L 6細胞生育培地を加えて細胞を再懸濁した。 得られた細胞懸濁 液の一部を使い、 新しい細胞培養用 F 75フラスコで同じように増殖させた。 継 代を繰り返し、 必要量の細胞数に達したら分化を行った。 継代の際と同じように して得た所定の密度の L 6細胞生育培地で懸濁した細胞を細胞培養用 6穴プレー ト （SUMILON MS-8496F5) に 100 μ Lずつ分注して培養した。 コンフルェント状 態にして培地を完全に除き、 L 6細胞分化培地 100 μ Lに置換した。 そのまま 1~3日間培養し、 筋芽が筋管に分化したのを確認した後、 90
Figure imgf000054_0001
の 6細胞 分ィ匕培地に交換した。 A I C AR (5 - amino - 4 - imidazole carboxamide)とメ 卜フォ ルミンを所定の 1 0倍濃度に L 6細胞分化培地で希釈し、 各ゥエルに 1 0 μ Lず つ添加し 2時間インキュベートした。 2時間後、 培地を取り除き、 冷やした ΡΒ S—で 2回洗浄した。 各ゥエルあたり 50 μ Lの L 6細胞抽出用緩衝液を加え、 4°Cで攪拌しながら細胞成分を抽出した。 抽出物を毎分 5000回転で遠心分離 し、 上清を得た。 作製した細胞抽出液を各穴あたり 0. 1 /z gのタンパク量にな るように AlViP K反応緩衝液 50 μ Lに混合した溶液を用いて、 実施例 4と同様 に、 AM ΡΚ用基質ペプチドを固定化した 96穴マイクロタイタープレートでリ ン酸化反応を 30°Cで 1時間行い、 実施例 1と同様にしてリン酸化ペプチドを抗 体 1 6により検出した （図 7)。
図 7より、 本発明のぺプチドアレイを用いて、 A I CARまたはメ トフオルミ ンで誘導した AMPK活性を測定できることがわかった。
実施例 8 ： Cy 3標識化抗体 16の緩衝溶液の調製
50 mM炭酸ナトリウム緩衝液 （ p H 9. 5) で 2倍に希釈した抗体 1 6を C y 3標識キット （アマシャムバイオサイエンス ： コード番号 PA33001) を用いて添 付手順書に従って C y 3標識化した。 得られた Cy 3標識化抗体 1 6をブロッキ ング緩衝溶液で 1000倍に希釈し C y 3標識化抗体 1 6の緩衝溶液とした。 実施例 9 ： スライドガラス表面に固定化したぺプチド基質を用いてのリン酸化検 出
高密度化ァミノ基導入コート DNAマイクロアレイ用スライ ドガラス （松浪ガ ラス：品番 SDM0011)に 4一マレイミ ドブチル酸の N—スクシイミ ドエステル（CAS No. 80307-12-6： Fluka) の 1 00 mMの DMF溶液を室温下 1 2時間反応させた 後、 反応液を DMFで洗い流した。 さらに、 DMF、 精製水、 エタノールを用い て順に 2回ずつ洗浄し、 減圧室温下乾燥した。 得られたスライ ドガラスに DNA マイクロアレイ作製用アレイヤー (Genetic Microsystems： GMS417 Arrayer) を 用いて 0. 38 111間隔で？ 用基質ぺプチドの 100 ！^リン酸緩衝生理食 塩水溶液 （pH7. 2) を分注し固定化した。 固定化したスライ ドガラスを室温 下 3時間静置した後、 水、 DMF、 水、 エタノールで順に 2回ずつ洗浄し、 減圧 室温下乾燥した。 乾燥したスライドガラスをブロッキング緩衝溶液で室温下 1時 間ブロッキング処理した後、 実施例 3および実施例 6と同様の方法でスライドガ ラス上でリン酸化反応を行った。 PKAを使った場合は、 スライドガラス 1枚あ たり 1 5 OmUの酵素量を、 PKAおよび GF P発現細胞抽出液を使った場合は、 スライ ガラス 1枚あたり 0 . 1 μ gのタンパク質量を用いた。 3 0でで1時間 反応させた後'、 スライドガラスを T B S—T緩衝溶液および精製水で 2回ずつ洗 浄し、 再度ブロッキング緩衝溶液で室温下 1時間プロッキング処理した。 実施例 8で作製した C y 3標識化抗体 1 6の緩衝溶液をスライドガラスに 3 0 °Cで 1時 間作用させた。 T B S— T緩衝溶液で 2回と精製水で 5回洗浄を行った後、 毎分 5 0 0回転の遠心操作を行い乾燥させた。 得られたスライドガラスは D N Aマイ クロアレイ用蛍光スキャ^ "一 (ScanArray 5000： GSI Luraonics) を用いて、 励起 波長 （5 4 3 n m) 検出波長 （5 7 0 n m) で蛍光イメージング画像を取得した (図 8 )。
図 8の写真は、左からそれぞれ、キナーゼを加えないコントロール [Kinase (-）〕、 P KA酵素を使った場合 〔PKA (+)〕、 P K A発現細胞抽出液を使った場合 〔PKA Lysate (+)〕、 G F P発現細胞抽出液を使った場合 [： GFP Lysate (+)〕の結果を示す。 マイクロタイタープレートを用いて作製したプレートアレイでの結果と同様に、 スライドガラス上に作製したマイクロアレイ上でも、 P K A遺伝子を発現させた 未精製の細胞抽出液を作用させることによって、 精製された P K A酵素を作用さ せた場合と同様に、 P K Aによるリン酸化反応が円滑に進行している状態が検出 できた。
産業上の利用可能性
本発明は、 これまで標準とされてきた放射化標識された A T Pを用いたリン酸 化検出方法に置き換わる新しいリン酸化検出方法ならぴにその実施に使用される 基質群およびペプチドアレイを提供する。 さらに、 より優れたポリクローナル抗 リン酸化スレオニン抗体を作製することで、 より高感度なリン酸化検出方法、 な らびにこれに基づく診断方法やスクリーニング方法をも提供することが可能とな る。
本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 5— 2 9 6 9 0 (出願日 ： 2 0 0 5年 2月 4日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
1 . プロテインキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセ リン残基をスレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくとも 1種含 有するプロテインキナーゼの基質群。
2 . プロティンキナーゼの天然に存在する基質に含まれるアミノ酸配列中のセ リン残基をリン酸化スレオニン残基に置換してなる人工ペプチド基質を少なくと も 1種さらに含有する、 請求項 1に記載の基質群。
3 . 前記人工ペプチド基質が 5〜3 0のアミノ酸残基を有するものである、 請 求項 1または 2に記載の基質群。
4 . 前記プロティンキナーゼがセリン Zスレオニンキナーゼである請求項 1〜 3いずれかに記載の基質群。 .
5 . 前記セリン Zスレオニンキナーゼが c AM P依存性プロティンキ "一ゼ A である、 請求項 4に記載の基質群。
6 . 前記セリン/スレオニンキナーゼがプロテインキ^ "一ゼ Cである、 請求項 4に記載の基質群。
7 . 前記セリン /スレオニンキナーゼが AM P活性化プロティンキナーゼであ る、 請求項 4に記載の基質群。
8 . 前記人工ペプチド基質が配列番号 1 1〜2 9 9に記載のアミノ酸配列群か ら選択されるアミノ酸配列を有するものである請求項 1〜 7いずれかに記載の基 質群。
9 . 請求項 1〜 8いずれかに記載の基質群を固定してなるぺプチドアレイ。
1 0 . 請求項 9に記載のペプチドアレイおよび抗リン酸化スレオニン抗体を用 いることを特徴とする、リン酸化および Zまたは脱リン酸化反応を検出する方法。
1 1 . 前記抗リン酸化スレオニン抗体がポリクローナル抗体である、 請求項 1 0に記載の方法。
1 2 . 下記工程： 被験者由来の生体試料からプロテインキナーゼおよび/またはプロテインホスフ ァターゼを含 'む画分を調製する工程；
前記画分と請求項 9に記載のぺプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、 抗リン酸化スレオニン抗体を用い てリン酸化ペプチドおよび または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならび 前記検出結果を、 対照における検出結果と比較し、 疾患の有無に応じて変化する プロティンキナーゼおよび zまたはプロテインホスファターゼ活性を判定するェ 程
を含むプロティンキナーゼおよび Zまたはプロティンホスファターゼの活性化お よび/または不活化に基づく疾患の診断方法。
1 3 . 前記疾患が癌、 悪性腫瘍、 糖尿病、 糖尿病性合併症、 代謝性疾患、 自己 免疫疾患、 免疫異常疾患、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性疾患、 内分泌疾患、 肝疾患または骨疾患である請求項 1 2に記載の診断方法。
1 4 . 下記工程：
プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼおよび被検物質を含む試料 と、 請求項 9に記載のペプチドアレイとを接触させる工程；
前記接触工程前後のペプチドアレイについて、 抗リン酸化スレオニン抗体を用い てリン酸化ペプチドおよび または脱リン酸化ペプチドを検出する工程；ならび に
前記検出結果を被検物質を含まない試料における検出結果と比較し、 被検物質の 有無により変化するプロティンキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を 判定する工程
を含む、 プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ活性を変動させる 被検物質のスクリーニング方法。
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