WO2006082303A1 - Motif de la proteine beclin interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de proteines bcl-2 et utilisations - Google Patents

Motif de la proteine beclin interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de proteines bcl-2 et utilisations Download PDF

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protein
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beclin
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Oliver Geneste
John Hickman
Jean-Christophe Rain
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Les Laboratoires Servier
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    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Definitions

  • the present invention is part of the research and development of new agents useful for regulating apoptotic and / or autophagy programmed cell death in the treatment of cancer patients.
  • the present invention relates to a novel method of identifying modulators of programmed cell death comprising the interaction between a motif of the Beclin protein and an anti-apoptotic member of the protein family.
  • Modulators identified using the method described above are administered to cancer patients in order to induce apoptotic and / or autophagic programmed cell death in the latter.
  • the invention relates to a motif of the Beclin protein capable of interacting with an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins and its use for inducing programmed cell death in cancer patients.
  • the programmed cell death is composed, on the one hand, of apoptosis and, on the other hand, of autophagic death.
  • Apoptosis is the best known phenomenon. This type of cell death involves morphological changes, such as core condensation, DNA fragmentation, as well as biochemical phenomena, such as the activation of caspases that will degrade key structural components of the cell to induce it. his disassembly and his death.
  • Process regulation Apoptosis is complex and involves the activation or repression of several intracellular signaling pathways.
  • Autophagic death is a second less known mechanism of programmed cell death. At the cellular level, autophagy can be summed up in three stages: the formation of an initial autophagic vacuole
  • Autophagosome and the maturation of the autophagosome into a degradative vacuole and its fusion with the lysosome.
  • Autophagic death therefore involves processes of lysosomal degradation, characterized by the accumulation of autophagic vacuoles, independent of a caspase-type regulatory pathway.
  • cancer is defined by two main characteristics: growth and cell proliferation unregulated by external signals and the ability to invade tissues, and, where appropriate, appropriate, the ability to form metastases by colonizing remote sites. These characteristics are the consequence of the intrinsic properties of the cancer cells, that is to say their karyotypic and genomic instability, their uncontrolled proliferation, their metastatic power accompanied by the acquisition of new phenotypes as well as the activation and derepression of oncogenes in said cancer cells.
  • cancer is understood to mean any phase of cell growth or proliferation having the above characteristics, evolving notably towards the development of primary tumors and / or metastatic tumors (secondary tumors). Maintaining a cell alive or programming its death requires the regulation of a major signaling pathway involving in particular proteins of the Bcl-2 family.
  • Proteins of the Bcl-2 family are divided into three main classes. Anti-apoptotic proteins, such as Bcl-2, BCI-XL and BcI-W, show strong homology in their four BH domains.
  • pro-apoptotic proteins are divided into two categories: on the one hand, multidomain proteins such as BAX and BAK and, on the other hand, pro-apoptotic proteins such as BID, NOXA, PUMA, BlK, BIM and BAD. characterized by the presence of a single domain of homology, the motive
  • the BH3 motif is an amphiphilic helical ⁇ region whose sequence homology is relatively low in the Bcl-2 family of proteins.
  • the presence of the BH3 motif in a protein is required to allow interaction with the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins.
  • the activity of an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins is regulated by the product of the pro-apoptotic genes of said family, the two proteins assembling into heterodimers. Under this state the anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins is inactive and therefore no longer has its anti-apoptotic activity.
  • the specific interaction of the BH3 motif with the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins can be modified by modulators so as to specifically induce apoptotic programmed cell death.
  • apoptotic signaling pathway can also be modulated by viral infection strategies. Indeed, a large number of viral proteins interfere with the pathway of apoptosis by structural homology, functional mimicry or at the level of the transduction of pro and anti-apoptotic signals. Thus, some viruses encode anti-apoptotic Bcl-2 analogs that inhibit the mitochondrial pathway or effector phase blocking caspase inhibitors. Early apoptosis of the infected cell is a host defense mechanism limiting the abundance of virus particles; on the other hand, delayed apoptosis of the host cell allows the virus to replicate and spread.
  • Autophagy is involved in the survival mechanism of the cell and is also associated in the course of programmed cell death. Many studies have established that autophagy is under the control of tumor suppressor gene products such as Beclin, PTEN, TSC1. Inactivation of these genes and reduction of autophagic abilities are early events of tumor progression in cancer patients. Beclin plays a central and early role in the phenomenon of autophagy, particularly in the formation of autophagic vacuoles or autophagosomes (Edinger et al., Detective autophagy leads to cancer, Cancer CeII December 2003).
  • Tumor resistance to chemotherapy agents is a central problem in medical oncology. There is the appearance of acquired resistance manifesting itself at the level of tumors which initially responded to chemotherapy and then develop, in the more or less short term, resistance to treatment. These resistances present at the level of tumor cells are generally associated with an inhibition of the caspase-dependent pathway or apoptotic pathway of programmed cell death at which the main current anticancer treatments (cytotoxic agents) act. To be more effective, anticancer treatments must therefore propose an alternative and / or complementary strategy to treatments acting on the apoptotic pathway of programmed cell death with a view, at least in part, to disadvantages of known treatments acting exclusively on apoptosis.
  • the invention proposes to act, via dual modulators, on the autophagic and / or apoptotic pathway. Therefore, the modulation of the caspase-independent or autophagic pathway implemented in the context of the invention provides an alternative to the treatments acting specifically at the level of the apoptotic pathway.
  • the inventors have developed a strategy consisting, on the one hand, in verifying the structural interaction between the anti-apoptotic members of the Bcl-2 protein family and the Beclin protein, and on the other hand, to look for modulators of this interaction that will inherently be able to act on both the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins as well as on the Beclin protein. Consequently, these dual modulators thus selected would be ideal for obtaining drug candidates for combating pathologies that deregulate programmed apoptotic and / or autophagic cell death.
  • the selection and identification of modulators of the protein interaction between Beclin protein or a specific motif thereof and an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins was studied on the basis of the double hybrid system. .
  • Fields et al. (US 5,283,173, US 5,468,614, US 5,667,973) initially described and developed this dual hybrid system.
  • the dual hybrid system initially consists of a yeast test between two recombinant proteins.
  • the first protein, called “bait” is a fusion protein containing a DNA binding domain (BD) linked upstream of a protein A.
  • the second protein is also a fusion protein, commonly called “prey”, containing an activation domain (activation domain or AD) bound to a protein B.
  • the binding and activation domains commonly used are those of Gal4 or E. CoIi Lex A.
  • the proteins A and B are respectively an anti-apoptotic member of the Bcl-2 protein family and a specific Beclin motif.
  • a and B by protein interaction allows the formation, by complementation, of a functional domain (BD-AD) capable of binding to the binding site (BS or BS) present upstream of a reporter gene and ensuring the transcription of said reporter gene.
  • BD-AD functional domain capable of binding to the binding site (BS or BS) present upstream of a reporter gene and ensuring the transcription of said reporter gene.
  • This motif of the Beclin protein has, in particular, been demonstrated in the context of the invention.
  • This motif of the Beclin protein is able to interact very specifically with the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins for use in selecting specific modulators of apoptosis and / or autophagy. .
  • This interaction specificity is related to the sequence, three-dimensional structure, and / or helicity of the original motif of the Beclin protein.
  • this original motif of the 26 amino acid Beclin protein corresponds to the precise domain of interaction with Bcl-2, BCI-XL and / or BcI-W and has the typical structural criteria allowing the formation of homo- or heterodimers.
  • This motif makes it an ideal candidate for the development of a test for highly efficient screening of molecules capable of modulating the interactions between this Beclin peptide and an anti-apoptotic protein.
  • Numerous screening assays for protein-protein interaction modulators are found in the literature, but often have limitations on their sensitivity and high-throughput feasibility.
  • the commonly used methods require the implementation of complex tools (fusion proteins, recombinant proteins, etc.) that are not very compatible with high throughput screening. They generate most often a significant background noise and are unreliable from a quantitative point of view: they have a reduced reading window that does not allow optimal screening of the molecules tested.
  • the peptide corresponding to the Beclin motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV may advantageously be used for the screening of compounds modulating the protein interaction between the Beclin motif and an anti-apoptotic member of the Bcl-2 proteins either by activating or inhibiting this interaction.
  • the subject of the invention is a method for identifying modulators of programmed cell death comprising a step of interaction between the motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV of the Beclin protein and an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins and a step of detection of the interaction in the presence or absence of the test compound.
  • the method for identifying modulators of programmed cell death comprises the following steps: a) Fluorescence probe labeling of the motif
  • modulator is meant any compound capable of increasing, preventing or at least limiting a specific activity such as a protein-protein interaction, an enzymatic activity, an attachment to cellular receptors.
  • the modulators are inhibitors or activators of the protein interaction between the Beclin partners and the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins.
  • the invention also relates to a method of identifying an inhibitor of the interaction between the motif of the Beclin protein and an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins capable of decreasing the fluorescence polarization with respect to a control consisting of this interaction in the absence of modulator.
  • the invention also relates to a method for identifying an activator of the interaction between the motif of the Beclin protein and an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins capable of increasing the fluorescence polarization relative to to a control consisting of this interaction in the absence of a modulator.
  • the fluorescent ligand ie the fluorescent Beclin peptide
  • after binding with the anti-apoptotic partner of the Bcl-2 protein family has a lower rotation constant than the corresponding free ligand and thus the fluorescence emitted by the bound ligand becomes polarized.
  • the fluorescence probe used in the screening method according to the invention is bodipy, Oregon Green and preferably fluorescein.
  • the anti-apoptotic member of the protein family More particularly, the anti-apoptotic member of the protein family
  • Bcl-2 acting as a partner of the interaction in the screening and identification process according to the invention, may be the Bcl-2 protein, BCI-XL or BcI-W.
  • the anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins is a fusion protein.
  • fusion protein is meant the fusion between a domain of the Bcl-2 protein, BCI-XL OR BCI-W and a domain of a protein such as GST (Glutathione-S-transferase).
  • amino acid sequence is to be understood a peptide sequence isolated from the natural context. These include isolated sequences, synthesized chemically and / or purified and possibly modified by genetic engineering.
  • the term "functional variants” means the amino acid sequences of the Beclin motif comprising conservative substitutions or conservative point mutations and having essentially the same properties that this motif encoded by the sequence SEQ ID NO.1, is the ability to interact with an anti-apoptotic member of the family of Bcl-2 proteins.
  • the conservative substitutions or mutations of the amino acid sequence SEQ ID NO.1 are, for example, the following: glycine by alanine (GA), valine by leucine (V-L); aspartic acid by glutamic acid (D-
  • the inventors observed that the peptide sequence Beclin motif SEQ ID NO.1 interacted with an anti-apoptotic member of the family of Blc-2 proteins, such as Bcl-2, BCI-XL or BCI-W.
  • the invention also relates to the nucleic acid sequence 5'ggcaccatggagaacctcagccgaagactgaaggtcactggggacctttttgacatcatgtcgggcc agacagatgtg 3 '(SEQ ID NO.2) encoding the original motif of the Beclin protein.
  • This nucleic acid sequence according to the invention can be obtained according to the genetic code from the amino acid sequence of the Beclin motif and its variants. "Variants" of this nucleic acid sequence include:
  • sequences of a mammalian species homologous to the sequence SEQ ID No. 2 isolated in humans.
  • stringent conditions the conditions which allow the specific hybridization of two single-stranded DNA sequences at about 65 ° C., for example in a solution of 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardt's solution and 100 ⁇ ⁇ g of nonspecific carrier DNA or any other equivalent ionic strength solution and after washing at 65 ° C, for example in a solution of not more than 0.2 x SSC and 0.1% SDS or any other solution of equivalent ionic strength.
  • the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm). For sequences with more than
  • Tm 81, 5 + 0.41 (% G + C) + 16.6Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - (600 / number of bases) .
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T).
  • sequences of a species of mammals homologous to the sequence SEQ ID No. 2 a sequence of structure similar to the sequence SEQ ID No. 2 and coding a polypeptide having essentially the same properties in non-mammalian species -humans, especially primates, rats or mice.
  • the percentage identity between two homologous sequences in the functional regions is generally greater than 80%, preferably greater than 90%.
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence as claimed according to the invention.
  • vector it is necessary to understand any type of vector allowing the introduction of the nucleic acid sequence into a host cell and possibly the expression of the polypeptide encoded by the nucleic acid sequence in the host cell.
  • a vector is for example a plasmid, a cosmid, an artificial bacterial chromosome or a bacteriophage comprising the sequences necessary for the expression of the motif of the Beclin protein.
  • the recombinant vector according to the invention comprises the sequences necessary for the expression of the claimed motif of the protein.
  • Beclin in the host cell include sequences promoting transcription and translation in the host cell as well as terminator sequences.
  • the recombinant vector may also include sequences encoding secretion signals allowing the release of translated proteins into the extracellular environment.
  • the invention also relates to the host cells transformed with a recombinant vector according to the invention.
  • these host cells are bacterial cells such as Escherichia coli, for example streptococci or eukaryotic cells such as yeast cells, filamentous fungi, insect cells and preferably mammalian cells.
  • This amino acid sequence peptide SEQ ID NO.1 can also be chemically synthesized by Neosystem.
  • Synthesis SEQ ID NO.1 and its functional variants are synthesized on a solid support according to the Boc / benzyl strategy using an "Applied Biosystems 430A" peptide synthesizer. The synthesis is based on the development of the desired sequence on the resin, followed by deprotection of the N- and C-terminal amino functions. In Boc / benzyl strategy, it is necessary to introduce the amino acid Boc-L-Lys (Fmoc) -OH during the synthesis of the peptide. After developing the entire sequence, the amino function is deprotected and the peptide cut off from the resin in the presence of a strong acid.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a peptide, corresponding to the SEQ ID NO.1 motif of Beclin according to the invention as active principle in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • excipients of a pharmaceutical composition any agent ensuring the transport of the active ingredient in the internal routes in the patient treated.
  • active principle is meant any substance responsible for the pharmacodynamic or therapeutic properties of the pharmaceutical composition.
  • non-toxic, pharmaceutically acceptable excipients mention may be made, by way of indication and without limitation, of diluents, solvents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersing agents, binders, blowing agents, disintegrating agents, retardants, lubricants, absorbents, suspending agents, dyes or flavoring agents.
  • the present invention concerns not only the pharmaceutical composition considered as such and defined above, but also the use of this composition in an induction method programmed cell death of the apoptotic and / or autophagic type according to the invention.
  • the present invention thus relates to a method for inducing apoptotic programmed cell death, Le. programmed caspase-dependent cell death pathway, and / or autophagic-type, ie programmed independent caspase cell death pathway comprising administering to the cancer patient an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a Beclin peptide of sequence SEQ ID NO.1.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one modulator, activator or inhibitor, identified from the modulator identification method according to the invention, as the active principle of said composition in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients. acceptable.
  • the invention also relates to a method of inducing programmed apoptotic (caspase-dependent) and / or autophagic (independent caspase) programmed cell death from the administration of an effective amount of composition defined above to a patient suffering from Cancer.
  • compositions as described above can be used in the treatment of cancers by action on programmed apoptotic and / or autophagic cell death.
  • compositions according to the invention are in a form suitable for oral, parenteral, nasal, percutaneous, rectal, perlingual, ocular or respiratory administration and in particular simple or coated tablets, sublingual tablets, sachets, packets, the capsules, glossettes, lozenges, suppositories, creams, ointments, dermal gels, and ampoules drinkable or injectable.
  • FIG. 2 nucleic acid sequence SEQ ID NO.2 coding for the Beclin motif interacting with an anti-apoptotic member of the Bcl-2 protein family.
  • FIG. 3 determination of Ki in fluorescence polarization of the Beclin competitor peptide, mutated or otherwise, on the interaction between the pro-apoptotic peptide Bak and the anti-apoptotic members Bcl-2, BCI-XL and BcI-W.
  • FIG. 4 co-immunoprecipitation results between the BcI-protein
  • FIG. 5 determination of the K 0 of the interaction between BCI-XL and the Beclin peptide.
  • BCI-XL (accession number Z23115) deleted from its C-terminus (1-209) and fused to the DNA binding domain LexA-Bcl-2 (accession number XM_008738) deleted from its C-terminus terminally (1-211) and fused to the LexA DNA binding domain.
  • URA3 UASGAL1-LacZ, Met
  • UASGAL1-LacZ Met
  • Met a culture medium lacking in leucine
  • the conjugation is carried out with a ratio "bait” / "prey” equal to 2.
  • a quantity of yeast cells "baits” obtained in stage 1) a) corresponding to 50 units DOeoonm is mixed with yeasts "prey” obtained in stage 1 ) b). After centrifugation, the pellet is resuspended in YPGIu medium, spread on YPGIu culture dishes and incubated for 4 hours at 30 ° C.
  • the selection of the conjugated yeasts containing a "bait” and a “prey” capable of interacting together is carried out on a DO-Leu-Trp-His medium: the absence of leucine and tryptophan makes it possible to maintain a selection pressure that only allows the yeasts containing the two types of plasmids ( "Bait” / "prey") to grow; the absence of histidine in the medium makes it possible to select the conjugated yeasts containing a "bait" plasmid and a "prey” plasmid capable of interacting together: this complementation makes it possible to activate the HIS3 gene, as a reporter gene coding for an enzyme involved in the biosynthesis of histidine.
  • the "prey” fragments of a colony of yeasts selected according to the conjugation method described in paragraph 2) are amplified by PCR from a crude lysate of this colony, using primers specific for the "prey” vector: ABS1 '-GCTTTGGAATCACTACAGG-3' (SEQ ID NO.3)
  • the PCR products are then sequenced and the sequences obtained are identified by comparison with databases.
  • the determination of Ki in fluorescence polarization consists in measuring the competitive effect of the Beclin peptide on the interaction between the pro-apoptotic peptide Bak and the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins such as Bcl-X L , Bcl -2 or BcI-W.
  • the following reagents are mixed in the specified order: a) of the competitor peptide to a final concentration of 1 nM to 100 ⁇ M; b) Fluorescent ligand peptide (Bak BH3 carboxyfluorescein) at a final concentration of 15 nM; c) the anti-apoptotic member of the Bcl-2 protein family to a final concentration of 100 nM for BCI-XL, 1 MM for Bcl-2 and BcI-W.
  • the mixture is then incubated for 30 minutes at room temperature and the fluorescence polarization determined on the device (Packard) Fusion (excitation at 485 nm and reading at 530 nm). The values are given in mP (fluorescence polarization unit).
  • Determination of Ki in fluorescence polarization consists of measuring the competitive effect of the mutated Beclin peptide, from leucine to alanine at position 116 of the complete sequence of the Beclin protein (L116A), on the interaction between the pro-apoptotic peptide BAK anti-apoptotic members of the Bcl-2 protein family such as BCI-XL, Bcl-2 OR BCI-W.
  • the sequence of the mutated peptide (L116A) is as follows:
  • the protocol for determining Ki in fluorescence polarization is identical to the protocol described above.
  • HeLa cells are co-transfected (Effectene kit, Qiagen) with an expression vector encoding the Bcl-X L protein carrying a flag epitope and an expression vector encoding the wild-type or mutated Beclin protein (L116A). Twenty-four hours after transfection, the cells are taken up in the lysis buffer (10 mM Hepes pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 0.4% Triton, antiproteases and antiphosphatases), incubated in ice and centrifuged at room temperature. 10000 rpm. The supernatant (cell lysate) is then incubated in the presence of agarose beads conjugated to anti-Flag antibodies (Flag M2 agarose, sigma) for 2 hours.
  • lysis buffer 10 mM Hepes pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 0.4% Trit
  • the agarose beads are then centrifuged and washed in lysis buffer and then taken up in Laemli buffer and analyzed by Western blots with anti-Beclin antibodies.
  • Example 2 Fluorescent (fluorescein-coupled) dissolved in buffer containing Na 2 HPO 4 20 mM pH 7.4, 1 I of 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, acid pluronic F- 0.05% at a concentration of 15 nM is incubated in the presence of increasing concentrations of the GFT-BcI-XL fusion protein (10 -9 to 10 -5 M) and the fluorescence polarization is then measured by the apparatus. In Vision (Packard Perkin-Elmer). A KD of 0.2 ⁇ M for this interaction could thus be determined. 2) Identification of Bcl-XL-peptide Interaction Inhibitor
  • the products to be tested are distributed in 384-well plates (Corning Fiat Bottom) at a final concentration of 10 ⁇ g / ml.
  • a well is filled with an equivalent amount of buffer / solvent without test compound and will constitute the control.
  • the peptide obtained in Example 1 labeled with fluorescein is added to each well so as to obtain a final concentration ranging from 1 to 100 nM.
  • the GST-BcI-XL or GST-Bcl-2 or GST-BcI-W fusion protein is then added so as to obtain a final concentration of 0.1 to 1 ⁇ M in a buffer containing 20 mM Na 2 HPO 4 pH. 7.4, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.05% pluronic acid F-68.

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Abstract

L'invention a pour objet une méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée comprenant l'interaction entre un motif de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 et la détection de cette interaction par polarisation de fluorescence. Les modulateurs identifiés sur la base de ladite méthode sont administrés aux patients atteints de cancers afin d'induire de la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique chez ces derniers. L'invention concerne également un motif de la protéine Beclin capable d'interagir avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 et son utilisation pour induire, chez le patient atteint d'un cancer, de la mort cellulaire programmée.

Description

MOTIF DE LA PROTEINE BECLIN
INTERAGISSANT AVEC LES MEMBRES ANTI-APOPTOT1QUES DE LA FAMILLE DE PROTEINES BCL-2 ET UTILISATIONS
La présente invention s'inscrit dans le cadre de la recherche et de la mise au point de nouveaux agents utiles pour réguler la mort cellulaire programmée de type apoptose et/ou autophagie lors du traitement de patients atteints de cancers.
L'invention concerne une nouvelle méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée comprenant l'interaction entre un motif de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines
Bcl-2 ainsi que la détection de cette interaction par polarisation de fluorescence. Les modulateurs identifiés à partir de la méthode décrite supra sont administrés aux patients atteints de cancers afin d'induire de la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique chez ces derniers.
L'invention concerne en particulier un motif de la protéine Beclin capable d'interagir avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 et son utilisation pour induire de la mort cellulaire programmée chez les patients atteints de cancers.
La mort cellulaire programmée est composée, d'une part de l'apoptose et, d'autre part de la mort autophagique. L'apoptose est le phénomène le mieux connu. Ce type de mort cellulaire fait intervenir des changements morphologiques, tels que la condensation du noyau, la fragmentation de l'ADN, ainsi que des phénomènes biochimiques, tels que l'activation des caspases qui vont dégrader des composants structuraux clés de la cellule pour induire son désassemblage et sa mort. La régulation du processus d'apoptose est complexe et implique l'activation ou la répression de plusieurs voies de signalisation intracellulaire.
La mort autophagique est un deuxième mécanisme moins connu de la mort cellulaire programmée. Sur le plan cellulaire, l'autophagie peut se résumer en trois étapes : la formation d'une vacuole autophagique initiale
(autophagosome) et la maturation de l'autophagosome en vacuole dégradative puis sa fusion avec le lysosome. La mort autophagique fait donc intervenir des processus de dégradation lysosomale, caractérisés par l'accumulation de vacuoles autophagiques, indépendants d'une voie de régulation de type caspase.
La dérégulation de l'équilibre cellulaire existant entre la croissance, la survie et la mort cellulaire programmée est à l'origine de nombreuses pathologies, telles que les cancers.
Conformément à l'acception usuelle dans le cadre de l'invention, le « cancer » se définit par deux caractéristiques principales : la croissance et la prolifération cellulaire non régulées par des signaux externes et la capacité d'envahir les tissus ainsi que, le cas échéant, la capacité de former des métastases en colonisant des sites à distance. Ces caractéristiques sont la conséquence des propriétés intrinsèques des cellules cancéreuses, c'est-à-dire de leur instabilité caryotypique et génomique, de leur prolifération incontrôlée, de leur pouvoir métastasique s'accompagnant de l'acquisition de nouveaux phénotypes ainsi que de l'activation et de la dérépression d'oncogènes dans lesdites cellules cancéreuses. On entend donc par « cancer » dans le cadre de la présente invention toute phase de la croissance ou de la prolifération cellulaire ayant les caractéristiques ci-dessus, évoluant notamment vers le développement de tumeurs primaires et/ou de tumeurs métastasiques (tumeurs secondaires). Maintenir une cellule en vie ou programmer sa mort nécessite la régulation d'une voie de signalisation majeure impliquant en particulier les protéines de la famille Bcl-2.
Les protéines de la famille Bcl-2 sont divisées en trois classes principales. Les protéines anti-apoptotiques, telles que Bcl-2, BCI-XL et BcI-W, présentent une forte homologie au niveau de leurs quatre domaines BH.
Les protéines pro-apoptotiques sont divisées en deux catégories : d'une part, les protéines multidomaines telles que BAX et BAK et, d'autre part, les protéines pro-apoptotiques telles que BID, NOXA, PUMA, BlK, BIM et BAD se caractérisant par la présence d'un seul domaine d'homologie, le motif
BH3 (Cory and Adams, The Bcl-2 family : regulators of the cellυlar life-or- death switch Nature reviews vol.2 september 2002).
Le motif BH3 est une région α hélicoïdale amphiphile dont l'homologie de séquences est relativement faible dans la famille de protéines Bcl-2. En outre, la présence du motif BH3 chez une protéine est requise pour permettre une interaction avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. En effet, l'activité d'un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est régulée par le produit des gènes pro- apoptotiques de ladite famille, les deux protéines s'assemblant en hétérodimères. Sous cet état le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est inactif et n'a donc plus son activité anti-apoptotique. En outre l'interaction spécifique du motif BH3 avec les membres anti- apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 peut être modifiée par des modulateurs de façon à induire de manière spécifique la mort cellulaire programmée de type apoptotique.
Par ailleurs, notons que la voie de signalisation apoptotique peut également être modulée par des stratégies d'infection virales. En effet, un grand nombre de protéines virales interfèrent avec la voie de l'apoptose par homologie structurale, mimétisme fonctionnel ou au niveau de la transduction des signaux pro- et anti-apoptotiques. Ainsi certains virus codent des analogues anti-apoptotiques de Bcl-2 inhibant la voie mitochondriale ou des inhibiteurs de caspases bloquant la phase effectrice. L'apoptose précoce de la cellule infectée représente un mécanisme de défense de l'hôte limitant l'abondance des particules virales ; au contraire l'apoptose retardée de la cellule hôte permet au virus de se répliquer et de se disséminer.
L'autophagie est impliquée dans le mécanisme de survie de la cellule et est aussi associée dans le déroulement de la mort cellulaire programmée. De nombreux travaux ont établi que l'autophagie est sous le contrôle de produits de gènes suppresseurs de tumeur tels que Beclin, PTEN, TSC1. L'inactivation de ces gènes et la réduction des capacités autophagiques sont des événements précoces de la progression tumorale chez les patients atteints de cancers. Beclin joue un rôle central et précoce dans le phénomène d'autophagie en particulier dans Ia formation des vacuoles autophagiques ou autophagosomes (Edinger et al. Détective autophagy leads to cancer, Cancer CeII December 2003).
La résistance des tumeurs aux agents de chimiothérapie constitue un problème central en cancérologie médicale. On constate l'apparition de résistances acquises se manifestant au niveau de tumeurs qui, au départ, ont répondu à la chimiothérapie et qui développent ensuite, à plus ou moins court terme, une résistance aux traitements. Ces résistances présentes au niveau des cellules tumorales sont généralement associées à une inhibition de la voie caspase dépendante ou voie apoptotique de la mort cellulaire programmée au niveau de laquelle agissent les principaux traitements anticancéreux actuels (agents cytotoxiques). Pour être plus efficaces les traitements anticancéreux doivent donc proposer une stratégie alternative et/ou complémentaire aux traitements agissant sur la voie apoptotique de la mort cellulaire programmée en vue de remédier, au moins en partie, aux inconvénients de traitements connus agissant exclusivement sur l'apoptose. L'invention propose à ce titre d'agir, par l'intermédiaire de modulateurs duals, sur la voie autophagique et/ou apoptotique. Dès lors, Ia modulation de la voie caspase-indépendante ou autophagique mise en œuvre dans le cadre de l'invention propose une alternative aux traitements agissant spécifiquement au niveau de la voie apoptotique.
Considérant d'une part, le rôle des membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 dans le processus d'apoptose et d'autre part, le rôle de la protéine Beclin dans le phénomène d'autophagie ainsi que l'importance des résistances acquises dans le développement tumoral, on comprend l'intérêt d'agir simultanément sur les voies autophagique et apoptotique de la mort cellulaire programmée dans le cadre des traitements anticancéreux. Dès lors, il est essentiel de pouvoir identifier des modulateurs pouvant agir tant sur les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 qu'au niveau de la protéine Beclin. Afin de faciliter et accélérer le criblage de ces modulateurs duals, les inventeurs ont élaboré une stratégie consistant, d'une part, à vérifier l'interaction structurelle entre les membres anti- apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 et la protéine Beclin, et d'autre part, à rechercher les modulateurs de cette interaction qui seront de façon inhérente capables d'agir à la fois sur les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 ainsi que sur la protéine Beclin. En conséquence, ces modulateurs duals ainsi sélectionnés seraient idéaux afin d'obtenir des candidats médicaments pour lutter contre les pathologies dérégulant la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique.
La sélection et l'identification de modulateurs de l'interaction protéique entre la protéine Beclin ou un motif spécifique de celle-ci et un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 a été étudiée sur la base du système du double hybride. Fields et al. (US 5,283,173 ; US 5,468,614 ; US 5,667,973) ont initialement décrit et développé ce système du double hybride. Le système du double hybride consiste initialement en un test en levure entre deux protéines recombinées. La première protéine, appelée « appât », est une protéine de fusion contenant un domaine de liaison à l'ADN (DNA binding domain ou BD) lié en amont d'une protéine A. La seconde protéine est également une protéine de fusion, communément appelée « proie », contenant un domaine d'activation (activation domain ou AD) lié à une protéine B. Les domaines de liaison et d'activation couramment utilisés sont ceux de Gal4 ou E. CoIi Lex A. Les protéines A et B sont respectivement un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 et un motif spécifique de Beclin. L'association des protéines
A et B par interaction protéique permet la formation, par complémentation, d'un domaine fonctionnel (BD-AD) capable de se lier au site de liaison (binding site ou BS) présent en amont d'un gène rapporteur et d'assurer la transcription dudit gène rapporteur.
Cependant, cette méthode conventionnelle du double hybride a ses limites.
Il est par exemple bien connu que de tels criblages peuvent conduire à des faux positifs et/ou faux négatifs et des confirmations biochimiques des résultats obtenus sont nécessaires. Les faux positifs obtenus via le système du double hybride sont particulièrement fréquents et sont à l'origine de mise en évidence d'interactions fonctionnelles et non structurelles.
Une technique plus performante, permettant de minimiser les faux positifs et/ou négatifs, est décrite dans la demande de brevet international WO 99/42612 ou le brevet US 6,187,535 et utilise des levures haploïdes recombinantes contenant les polypeptides «appât» et «proie». Ce système permet la détection d'un plus grand nombre de «proies» à partir d'un seul «appât», de façon plus précise, plus reproductible et plus sensible que les autres méthodes conventionnelles utilisées dans le domaine. Les inventeurs ont établi, sur Ia base du système du double hybride, l'existence d'une interaction structurelle entre les membres anti- apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 et la protéine Beclin. Cette interaction protéique entre ces partenaires, similaire à celle existant dans la régulation du phénomène apoptotique entre les partenaires anti- et pro- apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2, est impliquée dans l'équilibre du processus de mort cellulaire programmée.
Un motif original de la protéine Beclin a été, en particulier, mis en évidence dans le cadre de l'invention. Ce motif de la protéine Beclin est capable d'interagir de manière très spécifique avec les membres anti-apoptotiques de la famille des protéines Bcl-2 en vue de son utilisation pour sélectionner des modulateurs spécifiques de l'apoptose et/ou de l'autophagie. Cette spécificité d'interaction est liée à la séquence, la structure tridimensionnelle et/ou l'hélicité du motif original de la protéine Beclin. En effet, ce motif original de la protéine Beclin de 26 acides aminés correspond au domaine précis d'interaction avec Bcl-2, BCI-XL et/ou BcI-W et possède les critères structuraux typiques permettant la formation d'homo- ou d'hétérodimères.
La taille de ce motif en fait un candidat idéal pour l'élaboration d'un test permettant le criblage hautement efficace de molécules capables de moduler les interactions entre ce peptide de Beclin et une protéine anti- apoptotique. On trouve dans la littérature de nombreux tests de criblage de modulateurs d'interactions protéines-protéines mais ils présentent souvent des limites quant à leur sensibilité et leur faisabilité à haut débit. Les méthodes couramment utilisées nécessitent la mise en œuvre d'outils complexes (protéines de fusion, protéines recombinantes...) peu compatibles avec un criblage à haut débit. Elles génèrent le plus souvent un bruit de fond important et sont peu fiables d'un point de vue quantitatif : elles présentent une fenêtre de lecture réduite ne permettant pas un criblage optimal des molécules testées. De manière alternative aux méthodes déjà disponibles, un test de criblage hautement efficace basé sur la polarisation de fluorescence a été mis en œuvre dans la présente invention (Owicki et al., Journal of Biomolecular Screening, 5, 2000, 297-306). Cette technique permet par exemple de mesurer l'interaction entre un ligand marqué avec un fluorophore et un récepteur. Le principe consiste à mesurer une augmentation de la polarisation de fluorescence émise par le ligand fixé à son récepteur comparée à celle émise par le ligand libre. La polarisation de fluorescence du ligand libre est dépendante de son poids moléculaire et sera d'autant plus importante que le poids moléculaire sera élevé. Ainsi lorsque ce test est réalisé avec un ligand de haut poids moléculaire, ayant une forte polarisation de fluorescence intrinsèque, il sera difficile d'apprécier de façon fiable la différence de polarisation de fluorescence entre le ligand libre et le ligand fixé. L'utilisation d'un ligand au poids moléculaire minimal permettra au contraire d'exacerber cette différence, et par conséquent d'augmenter la précision de la méthode. Il sera ainsi possible de mieux évaluer la réelle activité d'une molécule, et d'effectuer des criblages à haut débit.
Le peptide correspondant au motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV (SEQ ID NO.1) de Beclin selon l'invention peut, avantageusement, être utilisé pour le criblage de composés modulant l'interaction protéique entre le motif de Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 soit en activant soit en inhibant cette interaction.
L'invention a pour objet une méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée comportant une étape d'interaction entre le motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 puis une étape de détection de l'interaction en présence ou non du composé à tester. Avantageusement, la méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée comprend les étapes suivantes : a) le marquage par sonde de fluorescence du motif
GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de la protéine Beclin ; b) l'addition d'un membre anti-apoptotique de la famille de protéines
Bcl-2 audit motif ; c) l'incubation des partenaires décrits en a) et b) en présence ou non du composé à tester ; d) la mesure de la polarisation de fluorescence ; et e) la comparaison de la mesure avec et sans composé à tester.
On entend par « modulateur » tout composé capable d'accroître, d'empêcher ou au moins de limiter une activité spécifique telles qu'une interaction protéine-protéine, une activité enzymatique, une fixation à des récepteurs cellulaires. Selon la présente invention, les modulateurs sont des inhibiteurs ou bien des activateurs de l'interaction protéique entre les partenaires Beclin et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
L'invention concerne aussi une méthode d'identification d'un inhibiteur de l'interaction entre le motif de la protéine Beclin et un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 capable de diminuer la polarisation de fluorescence par rapport à un témoin consistant en cette interaction en l'absence de modulateur.
L'invention porte également sur une méthode d'identification d'un activateur de l'interaction entre le motif de la protéine Beclin et un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 capable d'augmenter la polarisation de fluorescence par rapport à un témoin consistant en cette interaction en l'absence de modulateur. Le ligand fluorescent, i.e. le peptide Beclin fluorescent, après liaison avec le partenaire anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 a une constante de rotation plus faible que le ligand libre correspondant et de ce fait la fluorescence émise par le ligand lié devient polarisée. En conséquence, on observe une augmentation de la polarisation de la fluorescence émise par le ligand lié versus ligand libre.
Dans un mode de réalisation préférée, la sonde de fluorescence utilisée dans le procédé de criblage selon l'invention est le bodipy, l'Oregon Green et de manière préférée la fluorescéine.
Plus particulièrement, le membre anti-apoptotique de la famille de protéines
Bcl-2, intervenant comme partenaire de l'interaction dans le processus de criblage et d'identification selon l'invention, peut être la protéine Bcl-2, BCI-XL ou BcI-W.
Avantageusement, le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est une protéine de fusion. Par «protéine de fusion», on entend la fusion entre un domaine de la protéine Bcl-2, BCI-XL OU BCI-W et un domaine d'une protéine telle que GST (Glutathion-S-transferase).
La présente invention a pour objet un motif de Beclin de séquence d'acides aminés GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV et ses variants fonctionnels. Par « séquence d'acides aminés », il doit être compris une séquence peptidique isolée du contexte naturel. Il s'agit notamment de séquences isolées, synthétisées chimiquement et/ou purifiées et éventuellement modifiées par génie génétique.
On entend par « variants fonctionnels » les séquences d'acides aminés du motif de Beclin comprenant des substitutions conservatrices ou des mutations ponctuelles conservatrices et ayant essentiellement les mêmes propriétés que ce motif codé par la séquence SEQ ID NO.1 , soit la capacité d'interagir avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2. Les substitutions ou mutations conservatrices de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 sont, par exemple, les suivantes : glycine par alanine (G-A), valine par leucine (V--L) ; acide aspartique par acide glutamique (D-
-E), asparagine par glutamine (N-Q), leucine par isoleucine (L-I), arginine par lysine (R-K).
Les inventeurs ont observé que le motif de Beclin de séquence peptidique SEQ ID NO.1 interagissait avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Blc-2, tel que Bcl-2, BCI-XL OU BCI-W.
L'invention concerne aussi Ia séquence d'acides nucléiques 5'ggcaccatggagaacctcagccgaagactgaaggtcactggggacctttttgacatcatgtcgggcc agacagatgtg 3' (SEQ ID NO.2) codant pour le motif original de la protéine Beclin. Cette séquence d'acides nucléiques selon l'invention peut être obtenue d'après le code génétique à partir de la séquence d'acides aminés du motif de Beclin et ses variants. Les «variants» de cette séquence d'acides nucléiques sont notamment :
- des séquences capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec Ia séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO.2 ou une séquence complémentaire de celle-ci, et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés que le motif de Beclin codé par la séquence SEQ ID NO.1 , ou,
- des séquences d'une espèce de mammifère homologues à la séquence SEQ ID NO.2 isolée chez l'Homme.
Par «conditions stringentes», on entend les conditions qui permettent l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin à environ 650C par exemple dans une solution de 6 x SSC, 0,5 % SDS, 5X Denhardt's solution et 100 μg d'ADN carrier non spécifique ou toute autre solution de force ionique équivalente et après un lavage à 65°C, par exemple dans une solution d'au plus 0,2 x SSC et 0,1 % SDS ou toute autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de
30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81 ,5 + 0,41 (%G+C) + 16,6Log (concentration en cations) - 0,63 (% formamide) - (600 / nombre de bases). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 4 (G+C) + 2(A+T). Les conditions de stringence peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille de la séquence, la teneur en GC et tout autre paramètre, selon notamment les protocoles décrits dans Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., CoId Spring Harbor, laboratory press, CoId Spring Harbor, New York).
On entend par « séquences d'une espèce de mammifères homologues à la séquence SEQ ID NO.2 », une séquence de structure similaire à la séquence SEQ ID NO.2 et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés chez des espèces de mammifères non-humains, notamment les primates, le rat ou la souris. Le pourcentage d'identité entre deux séquences homologues dans les régions fonctionnelles est en général supérieur à 80 %, de préférence supérieur à 90 %.
L'invention concerne également un vecteur recombinant comprenant une séquence d'acides nucléiques telle que revendiquée selon l'invention. Par vecteur, il faut comprendre tout type de vecteur permettant l'introduction de la séquence d'acides nucléiques dans une cellule hôte et éventuellement l'expression du polypeptide codé par la séquence d'acides nucléiques dans la cellule hôte. Un tel vecteur est par exemple un plasmide, un cosmide, un chromosome bactérien artificiel ou un bactériophage comprenant les séquences nécessaires à l'expression du motif de la protéine Beclin.
De façon préférée, le vecteur recombinant selon l'invention comprend les séquences nécessaires à l'expression du motif revendiqué de la protéine
Beclin dans la cellule hôte. Ces séquences sont notamment des séquences promotrices de la transcription et de la traduction dans la cellule hôte ainsi que des séquences terminatrices. Le vecteur recombinant peut également comprendre des séquences codant pour des signaux de sécrétions permettant la libération des protéines traduites dans l'environnement extracellulaire.
L'invention porte aussi sur les cellules hôtes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, ces cellules hôtes sont des cellules bactériennes telles que Escherichia coli, les streptococci par exemple ou des cellules eucaryotes telles que des cellules de levures, de champignons filamenteux, cellules d'insectes et de préférence des cellules de mammifères.
La transformation de cellules hôtes appropriées par un vecteur recombinant comprenant les séquences d'acides nucléiques selon l'invention permet d'exprimer le motif revendiqué de la protéine Beclin. Dans un second temps, il est possible de purifier les protéines exprimées dans ces cellules hôtes à partir de différentes méthodes connues de l'homme du métier et abondamment décrites dans l'état de Ia technique. Citons par exemple les purifications par précipitation au sulfate d'ammonium, par chromatographie d'exclusion par la taille et de préférence par chromatographie d'affinité.
Ce peptide de séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 peut également être synthétisé chimiquement à façon par Néosystem. La synthèse chimique de SEQ ID NO.1 et de ses variants fonctionnels est réalisée par synthèse sur support solide selon la stratégie Boc/benzyle à l'aide d'un synthétiseur de peptides « Applied Biosystems 430A ». La synthèse repose sur l'élaboration sur résine de la séquence voulue, puis la déprotection des fonctions aminés N et C-terminales. En stratégie Boc/benzyle, il est nécessaire d'introduire l'acide aminé Boc-L-Lys(Fmoc)-OH lors de la synthèse du peptide. Après avoir élaboré toute la séquence, la fonction amino est déprotégée et Ie peptide coupé de la résine en présence d'un acide fort.
L'invention porte également sur une composition pharmaceutique comprenant un peptide, correspondant au motif SEQ ID NO.1 de Beclin selon l'invention en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. Dans le contexte de l'invention, on entend par « excipients » d'une composition pharmaceutique tout agent assurant le transport du principe actif dans les voies internes chez le patient traité. Par « principe actif », on entend toute substance responsable des propriétés pharmacodynamiques ou thérapeutiques de la composition pharmaceutique.
Parmi les excipients, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables, on peut citer à titre indicatif et non limitatif les diluants, les solvants, les conservateurs, les agents mouillants, les émulsifiants, les agents dispersants, les liants, les agents gonflants, les agents désintégrants, les retardants, les lubrifiants, les absorbants, les agents de suspension, les colorants ou les aromatisants.
La présente invention concerne non seulement la composition pharmaceutique considérée en tant que telle et définie supra, mais également l'utilisation de cette composition dans une méthode d'induction de mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique selon l'invention.
La présente invention porte donc sur une méthode d'induction de mort cellulaire programmée de type apoptotique, Le. voie de mort cellulaire programmée caspase dépendante, et/ou de type autophagique, i.e. voie de mort cellulaire programmée caspase indépendante, comprenant l'administration au patient atteint notamment de cancer d'une quantité efficace de composition pharmaceutique comprenant un peptide de Beclin de séquence SEQ ID NO.1.
L'invention vise également une composition pharmaceutique comprenant au moins un modulateur, activateur ou inhibiteur, identifié à partir de la méthode d'identification de modulateurs selon l'invention, en tant que principe actif de ladite composition en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables .
L'invention porte aussi sur une méthode d'induction de mort cellulaire programmée de type apoptotique (caspase dépendante) et/ou autophagique (caspase indépendante) à partir de l'administration d'une quantité efficace de composition définie supra à un patient atteint de cancer.
Les compositions pharmaceutiques telles que décrites supra sont utilisables dans le traitement des cancers par action sur la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique.
Les compositions selon l'invention sont sous une forme convenant à l'administration orale, parentérale, nasale, per ou transcutanée, rectale, perlinguale, oculaire ou respiratoire et notamment les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les sachets, les paquets, les gélules, les glossettes, les tablettes, les suppositoires, les crèmes, les pommades, les gels dermiques, et les ampoules buvables ou injectables.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les figures et exemples suivants :
- Figure 1 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 du motif de
Beclin interagissant avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2.
- Figure 2 : séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO.2 codant pour le motif de Beclin interagissant avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2.
- Figure 3 : détermination de Ki en polarisation de fluorescence du peptide compétiteur Beclin muté ou non sur l'interaction entre le peptide pro-apoptotique Bak et les membres anti-apoptotiques Bcl-2, BCI-XL et BcI-W. - Figure 4 : résultats de co-immunoprécipitation entre la protéine BcI-
XL et la protéine Beclin.
- Figure 5 : détermination du K0 de l'interaction entre BCI-XL et le peptide Beclin.
- Figure 6 : détermination de I1IC50 d'un antagoniste de BCI-XL de référence.
EXEMPLE 1 : Identification, par le système du double hybride, du peptide décrit dans la figure 1
Trois banques de cDNA humains ont été criblées (placenta, cerveau, lignée cellulaire CEMC7) par la technique du double hybride (Fields et al.) chez la levure en utilisant le protocole de conjugaison décrit par Legrain et al. dans
Nature Genetics, 1997, vol.16, 277-282 (US 6,187,535). 1 ) Préparation des « appâts » et « proies »
a) Les « appâts » utilisés sont :
- BCI-XL (numéro d'accession Z23115) délétée de son extrémité C- terminale (1-209) et fusionnée au domaine de liaison à l'ADN LexA - Bcl-2 (numéro d'accession XM_008738) délétée de son extrémité C- terminale (1-211 ) et fusionnée au domaine de liaison à l'ADN LexA. Ces appâts sont exprimés dans les levures Saccharomyces cerevisiae souche L40Δgal4 (MATa ade2, trp1-901 , leu2-3, 112, Iys2-8O1 , his3Δ200, LYS2 (lexAop)4-HIS3, ura3-52 ::URA3 (lexAop)8-LacZ, GAL4 ::KanR) et mis en préculture à 300C dans un milieu synthétique dépourvu de tryptophane (DO-Trp) jusqu'à obtention d'une densité optique DOβoonm comprise entre 0,1 et 0,5. Cinquante ml d'une dilution de cette préculture (D06oonm =0,006) sont incubés à 300C pendant une nuit.
b) Une collection de levures Saccharomyces cerevisiae, souche YHGX13 (MATα Gal4Δ GalδOΔ ade2-101 ::KanR, his3, leu2-3-112, trp1 -901 , ura3-
52 URA3 ::UASGAL1-LacZ, Met) contenant les plasmides exprimant les banques de cDNA fusionnés au domaine d'activation de la transcription Gal4 est obtenue par transformation après sélection sur un milieu de culture dépourvu en leucine (DO-Leu). Ces levures sont aliquotées et conservées à -800C.
2) Conjugaison
La conjugaison est réalisée avec un ratio « appât »/ « proie » égal à 2. Une quantité de cellules de levures «appâts» obtenues au stade 1 )a) correspondant à 50 unités DOeoonm est mélangée aux levures «proies» obtenues au stade 1 )b). Après centrifugation, le culot est resuspendu dans un milieu YPGIu, étalé sur des boîtes de culture YPGIu et incubé 4 heures 30 à 300C. La sélection des levures conjuguées contenant un « appât » et une « proie » capables d'interagir ensembles est réalisée sur un milieu DO- Leu-Trp-His : l'absence de leucine et de tryptophane permet de maintenir une pression de sélection ne permettant qu'aux levures contenant les deux types de plasmides (« appâts »/« proies ») de pousser ; l'absence d'histidine dans le milieu permet de sélectionner les levures conjuguées contenant un plasmide « appât » et un plasmide « proie » capables d'interagir ensembles : cette complémentation permet d'activer le gène HIS3, en tant que gène rapporteur codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'histidine.
3) Identification des clones positifs
Les fragments «proies» d'une colonie de levures sélectionnées selon la méthode de conjugaison décrite au paragraphe 2) sont amplifiés par PCR à partir d'un lysat brut de cette colonie, en utilisant des amorces spécifiques du vecteur « proie » : ABS1 5'-GCTTTGGAATCACTACAGG-3' (SEQ ID NO.3)
ABS2 δ'-CACGATGCACGTTGAAGTG-S' (SEQ ID NO.4). Les produits de PCR sont ensuite séquences et les séquences obtenues sont identifiées par comparaison avec des banques de données.
4) Identification du peptide décrit Figure 1
Pour chaque fragment «appât» testé, le système du double hybride permet d'identifier plusieurs fragments «proies». Cette identification se fait par comparaison de séquences des « proies » sélectionnées à partir d'un programme informatique tel que Blastwun disponible sur le site internet de l'Université de Washington : http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/blastwu.html. EXEMPLE 2 : Validation de l'interaction entre le peptide décrit dans l'Exemple 1 et Bcl-2, BcI-X, et/ou BcI-W
1 ) Détermination de Ki en polarisation de fluorescence (Figure 3)
La détermination de Ki en polarisation de fluorescence consiste à mesurer l'effet compétitif du peptide Beclin sur l'interaction entre le peptide pro- apoptotique Bak les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 tels que Bcl-XL, Bcl-2 ou BcI-W.
Les réactifs suivants sont mélangés dans l'ordre précisé : a) du peptide compétiteur à une concentration finale de 1nM à 100 μM ; b) du peptide ligand fluorescent (Bak BH3 carboxyfluoresceine) à une concentration finale de 15 nM ; c) du membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 à une concentration finale de 100 nM pour BCI-XL, 1 MM pour Bcl-2 et BcI-W.
Ces réactifs sont en solution dans le tampon d'interaction (Na2HPO4 20 mM pH 7.4, EDTA 1 mM, NaCI 50 mM et acide pluronique F-68 0.05%).
Le mélange est ensuite incubé 30 minutes à température ambiante et la polarisation de fluorescence déterminée sur l'appareil (Packard) Fusion (excitation à 485 nm et lecture à 530 nm). Les valeurs sont données en mP (unité de polarisation de fluorescence).
Ces analyses en polarisation de fluorescence ont mis en évidence l'effet compétitif du peptide Beclin sur l'interaction peptidique entre Bak et BCI-XL, Bcl-2 ou BcI-W. Les Ki obtenus au cours de ces tests en polarisation de fluorescence sont les suivants :
BCI-XL/ Bak / Beclin Ki = 1 ,15μM Bcl-2 / Bak / Beclin Ki = 1 ,8μM
BcI-W / Bak / Beclin Ki = 7,4μM Ces analyses démontrent l'affinité élevée du peptide Beclin vis à vis des membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
2) Détermination de Ki en polarisation de fluorescence avec le peptide Beclin muté 0.116A)
La détermination de Ki en polarisation de fluorescence consiste à mesurer l'effet compétitif du peptide Beclin muté, de leucine en alanine en position 116 de la séquence complète de la protéine Beclin (L116A), sur l'interaction entre le peptide pro-apoptotique BAK les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 tels que BCI-XL, Bcl-2 OU BCI-W. La séquence du peptide muté (L116A) est la suivante :
GTMENLSRRAKVTGDLFDIMSGQTDV (SEQ ID NO.5).
Le protocole de détermination de Ki en polarisation de fluorescence est identique au protocole décrit supra.
On observe, par comparaison des résultats d'analyses en polarisation de fluorescence, une perte d'effet compétitif du peptide Beclin muté (L116A) par rapport au peptide Beclin selon l'invention dans l'interaction peptidique entre le peptide pro-apoptotique Bak et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 tels que BCI-XL, Bcl-2 OU BCI-W.
3) Co-immunoprécipitation (Figure 4)
Des cellules HeLa sont co-transfectées (kit Effectene, Qiagen) par un vecteur d'expression codant pour la protéine Bcl-XL portant un épitope flag et un vecteur d'expression codant pour la protéine Beclin sauvage ou muté (L116A). Vingt-quatre heures après transfection les cellules sont reprises dans le tampon de lyse (Hepes 10 mM pH 7.5, KCI 150 mM, MgCI2 5 mM, EDTA 1 mM, Triton 0.4%, antiprotéases et antiphosphatases), incubées dans la glace et centrifugées à 10000 rpm. Le surnageant (lysat cellulaire) est ensuite incubé en présence de billes d'agarose conjuguées à des anticorps anti-Flag (Flag M2 agarose, sigma) pendant 2 heures.
Les billes d'agarose sont ensuite centrifugées et lavées dans le tampon de lyse puis reprises dans du tampon de Laemli et analysées par western- blots avec des anticorps anti-Beclin
La co-immunoprécipitation de la protéine anti-apoptotique BCI-XL avec la protéine entière Beclin par interaction protéine/protéine a confirmé l'interaction structurelle existant réellement entre la protéine BCI-XL et la protéine Beclin.
EXEMPLE 3 : Test de criblage de molécules capables d'inhiber l'interaction entre Bcl-2 et/ou BcI-XL et le peptide obtenu dans l'Exemple 1
1) Détermination du Kp entre le peptide obtenu dans l'Exemple 1 et BcI-XL (Figure 5)
Le peptide obtenu dans l'Exemple 1 fluorescent (couplé à la fluorescéine) en solution dans le tampon contenant Na2HPO4 20 mM pH 7,4, de I1EDTA 1 mM, NaCI 50 mM, de l'acide pluronique F-68 0,05% à une concentration de 15 nM est incubé en présence de concentrations croissantes de la protéine de fusion GFT-BcI-XL (10"9 à 10"5 M) et la polarisation de fluorescence est ensuite mesurée par l'appareil En Vision (Packard Perkin-Elmer). Un KD de 0,2 μM pour cette interaction a ainsi pu être déterminé. 2) Identification d'inhibiteur de l'interaction Bcl-XL-peptide
Les produits à tester sont distribués dans des plaques 384 puits (Corning Fiat Bottom) à une concentration finale de 10 μg/ml. Un puits est rempli avec une quantité équivalente de tampon/solvant sans composé à tester et constituera le témoin. Le peptide obtenu dans l'Exemple 1 marqué à la fluorescéine est ajouté dans chaque puits de manière à obtenir une concentration finale allant de 1 à 100 nM. La protéine de fusion GST-BcI-XL ou GST-Bcl-2 ou encore GST-BcI-W est ensuite ajoutée de façon à obtenir une concentration finale de 0,1 à 1 μM dans un tampon contenant Na2HPO4 20 mM pH 7,4, de l'EDTA 1 mM, NaCI 50 mM, de l'acide pluronique F-68 0,05%. La polarisation de fluorescence est ensuite mesurée par l'appareil En Vision (Packard Perkin-Elmer). Une diminution significative de la polarisation de fluorescence enregistrée dans l'essai réalisé avec le composé à tester comparée à celle obtenue sans le composé à tester (puits témoin) permet de conclure à une activité inhibitrice de la molécule. A l'inverse, une augmentation significative de la polarisation de fluorescence dans l'essai avec le produit à tester comparée au témoin permet de conclure à une activité activatrice de la molécule. La Figure 6 montre le résultat obtenu avec un composé de référence antagoniste de BcI-XL (Ref 1 ) : composé 4 de A.D. Hamilton et al., J. Am.
Chem. Soc, 2002, 124, 11838-11839. Une IC5Q de 3,4 μM a pu être déterminée pour ce composé.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'interaction entre le motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de
5 protéines Bcl-2 ; b) Ia détection de l'interaction en présence ou non du composé à tester.
2. Méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : îo a) le marquage par sonde de fluorescence du motif
GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de la protéine Beclin ; b) l'addition d'un membre anti-apoptotique de la famille des protéines Bcl-2 audit motif; c) l'incubation de ce système en présence ou non du composé à tester ; 15 d) la mesure de la polarisation de fluorescence ; et e) la comparaison de la mesure avec et sans Ie composé à tester.
3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le modulateur de l'interaction entre le motif de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est un
20. inhibiteur diminuant la polarisation de fluorescence.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le modulateur de l'interaction entre le motif de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est un activateur augmentant la polarisation de fluorescence.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la sonde de fluorescence est la fluorescéine.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est la protéine Bcl-2, Bcl-XL ou BcI-W.
7. Séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 du motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de la protéine Beclin et de ses variants fonctionnels.
8. Séquence d'acides aminés selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite séquence d'acides aminés interagit avec la famille de protéines anti-apoptotiques Bcl-2.
9. Séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO.2 5'ggcaccatggagaacctcagccgaagactgaaggtcactggggacctttttgacatcatgtcg ggccagacagatgtg3' codant pour le motif de la protéine Beclin selon la revendication 7 ou 8.
10. Séquence d'acides nucléiques déduite selon le code génétique de Ia séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 selon la revendication 7.
11. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 9 et 10.
12. Vecteur recombinant selon la revendication 11 , caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide, un cosmide, un chromosome bactérien artificiel ou un bactériophage comprenant les séquences nécessaires à l'expression du motif de la protéine Beclin.
13. Vecteur recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce que les séquences nécessaires à l'expression du motif de la protéine Beclin comprennent une séquence promotrice de la transcription et de la traduction.
14. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 11 à 13.
15. Cellule hôte selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une cellule bactérienne ou eucaryote.
16. Peptide caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés selon l'une des revendications 7 ou 8.
17. Peptide selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'il est codé par la séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 9 ou 10.
18. Composition pharmaceutique comprenant un peptide selon l'une des revendications 16 ou 17, en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
19. Méthode d'induction de la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique comprenant l'administration au patient atteint de cancer d'une quantité efficace de composition pharmaceutique selon la revendication 18.
20. Composition pharmaceutique comprenant un modulateur obtenu à partir de la méthode d'identification selon l'une des revendications 1 à 6, en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
21. Méthode d'induction de la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique comprenant l'administration au patient atteint de cancer d'une quantité efficace de composition pharmaceutique selon la revendication 20.
22. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 18 ou 20 utilisables dans le traitement des cancers.
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