FR2881429A1 - Motif de la proteine beclin interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de proteines bcl-2 et utilisations - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet une méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée comprenant l'interaction entre un motif de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 et la détection de cette interaction par polarisation de fluorescence. Les modulateurs identifiés sur la base de ladite méthode sont administrés aux patients atteints de cancers afin d'induire de la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique chez ces derniers.L'invention concerne également un motif de la protéine Beclin capable d'interagir avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 et son utilisation pour induire, chez le patient atteint d'un cancer, de la mort cellulaire programmée.
Description
La présente invention s'inscrit dans le cadre de la recherche et de la
mise au point de nouveaux agents utiles pour réguler la mort cellulaire programmée de type apoptose et/ou autophagie lors du traitement de patients atteints de cancers.
L'invention concerne une nouvelle méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée comprenant l'interaction entre un motif de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 ainsi que la détection de cette interaction par polarisation de fluorescence. Les modulateurs identifiés à partir de la méthode décrite io supra sont administrés aux patients atteints de cancers afin d'induire de la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique chez ces derniers.
L'invention concerne en particulier un motif de la protéine Beclin capable d'interagir avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 is et son utilisation pour induire de la mort cellulaire programmée chez les patients atteints de cancers.
La mort cellulaire programmée est composée, d'une part de l'apoptose et, d'autre part de la mort autophagique. L'apoptose est le phénomène le mieux connu. Ce type de mort cellulaire fait intervenir des changements morphologiques, tels que la condensation du noyau, la fragmentation de l'ADN, ainsi que des phénomènes biochimiques, tels que l'activation des caspases qui vont dégrader des composants structuraux clés de la cellule pour induire son désassemblage et sa mort. La régulation du processus d'apoptose est complexe et implique l'activation ou la répression de plusieurs voies de signalisation intracellulaire.
La mort autophagique est un deuxième mécanisme moins connu de la mort cellulaire programmée. Sur le plan cellulaire, l'autophagie peut se résumer en trois étapes: la formation d'une vacuole autophagique initiale (autophagosome) et la maturation de l'autophagosome en vacuole dégradative puis sa fusion avec le lysosome. La mort autophagique fait donc intervenir des processus de dégradation lysosomale, caractérisés par l'accumulation de vacuoles autophagiques, indépendants d'une voie de régulation de type caspase.
La dérégulation de l'équilibre cellulaire existant entre la croissance, la survie et la mort cellulaire programmée est à l'origine de nombreuses pathologies, telles que les cancers. i0
Conformément à l'acception usuelle dans le cadre de l'invention, le cancer se définit par deux caractéristiques principales: la croissance et la prolifération cellulaire non régulées par des signaux externes et la capacité d'envahir les tissus ainsi que, le cas échéant, la capacité de is former des métastases en colonisant des sites à distance.
Ces caractéristiques sont la conséquence des propriétés intrinsèques des cellules cancéreuses, c'est-à-dire de leur instabilité caryotypique et génomique, de leur prolifération incontrôlée, de leur pouvoir métastasique s'accompagnant de l'acquisition de nouveaux phénotypes ainsi que de l'activation et de la dérépression d'oncogènes dans lesdites cellules cancéreuses. On entend donc par cancer dans le cadre de la présente invention toute phase de la croissance ou de la prolifération cellulaire ayant les caractéristiques ci-dessus, évoluant notamment vers le développement de tumeurs primaires et/ou de tumeurs métastasiques (tumeurs secondaires).
Maintenir une cellule en vie ou prograrnmer sa mort nécessite la régulation d'une voie de signalisation majeure impliquant en particulier les protéines de la famille Bd-2.
Les protéines de la famille Bd-2 sont divisées en trois classes principales. Les protéines anti-apoptotiques, telles que Bd-2, Bcl-XL et Bcl-W, présentent une forte homologie au niveau de leurs quatre domaines BH. Les protéines pro-apoptotiques sont divisées en deux catégories: d'une part, les protéines multidomaines telles que BAX et BAK et, d'autre part, les protéines pro-apoptotiques telles que E3ID, NOXA, PUMA, BIK, BIM et BAD se caractérisant par la présence d'un seul domaine d'homologie, le motif BH3 (Cory and Adams, The Bcl-2 farnily: regulators of the cellular life-ordeath switch Nature reviews vol.2 september 2002).
Le motif BH3 est une région a hélicoïdale amphiphile dont l'homologie de séquences est relativement faible dans la famille de protéines Bd-2. En outre, la présence du motif BH3 chez une protéine est requise pour permettre une interaction avec les mernbres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bd-2. En effet, l'activité d'un membre antiapoptotique de la famille de protéines Bd-2 est régulée par le produit des gènes proapoptotiques de ladite famille, les deux protéines s'assemblant en hétérodimères. Sous cet état le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 est inactif et n'a donc plus son activité anti-apoptotique. En outre l'interaction spécifique du motif BH3 avec les membres antiapoptotiques de la famille de protéines Bd-2 peut être modifiée par des modulateurs de façon à induire de manière spécifique la mort cellulaire programmée de type apoptotique.
Par ailleurs, notons que la voie de signalisation apoptotique peut également être modulée par des stratégies d'infection virales. En effet, un grand nombre de protéines virales interfèrent avec la voie de l'apoptose par homologie structurale, mimétisme fonctionnel ou au niveau de la transduction des signaux pro- et anti-apoptotiques. Ainsi certains virus codent des analogues anti-apoptotiques de Bd-2 inhibant la voie mitochondriale ou des inhibiteurs de caspases bloquant la phase effectrice. L'apoptose précoce de la cellule infectée représente un mécanisme de défense de l'hôte limitant l'abondance des particules virales; au contraire l'apoptose retardée de la cellule hôte permet au virus de se répliquer et de se disséminer.
L'autophagie est impliquée dans le mécanisme de survie de la cellule et est aussi associée dans le déroulement de la mort cellulaire programmée. De nombreux travaux ont établi que l'autophagie est sous le contrôle de produits de gènes suppresseurs de tumeur tels que Beclin, PTEN, TSC1. L'inactivation de ces gènes et la réduction des capacités autophagiques i0 sont des événements précoces de la progression tumorale chez les patients atteints de cancers. Beclin joue un rôle central et précoce dans le phénomène d'autophagie en particulier dans la formation des vacuoles autophagiques ou autophagosomes (Edinger et al. Defective autophagy leads to cancer, Cancer Cell December 2003).
La résistance des tumeurs aux agents de chimiothérapie constitue un problème central en cancérologie médicale. On constate l'apparition de résistances acquises se manifestant au niveau de tumeurs qui, au départ, ont répondu à la chimiothérapie et qui développent ensuite, à plus ou moins court terme, une résistance aux traitements. Ces résistances présentes au niveau des cellules tumorales sont généralement associées à une inhibition de la voie caspase dépendante ou voie apoptotique de la mort cellulaire programmée au niveau de laquelle agissent les principaux traitements anticancéreux actuels (agents cytotoxiques). Pour être plus efficaces les traitements anticancéreux doivent donc proposer une stratégie alternative et/ou complémentaire aux traitements agissant sur la voie apoptotique de la mort cellulaire programmée en vue de remédier, au moins en partie, aux inconvénients de traitements connus agissant exclusivement sur l'apoptose. L'invention propose à ce titre d'agir, par l'intermédiaire de modulateurs duals, sur la voie autophagique et/ou apoptotique.
Dès lors, la modulation de la voie caspase-indépendante ou autophagique mise en oeuvre dans le cadre de l'invention propose une alternative aux traitements agissant spécifiquement au niveau de la voie apoptotique.
Considérant d'une part, le rôle des membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bd-2 dans le processus d'apoptose et d'autre part, le rôle de la protéine Beclin dans le phénomène d'autophagie ainsi que l'importance des résistances acquises dans le développement tumoral, on comprend l'intérêt d'agir simultanément sur les voies autophagique et apoptotique de io la mort cellulaire programmée dans le cadre des traitements anticancéreux. Dès lors, il est essentiel de pouvoir identifier des modulateurs pouvant agir tant sur les membres antiapoptotiques de la famille Bd-2 qu'au niveau de la protéine Beclin. Afin de faciliter et accélérer le criblage de ces modulateurs duals, les inventeurs ont élaboré une stratégie consistant, is d'une part, à vérifier l'interaction structurelle entre les membres antiapoptotiques de la famille de protéines Bd-2 et la protéine Beclin, et d'autre part, à rechercher les modulateurs de cette interaction qui seront de façon inhérente capables d'agir à la fois sur Des membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bd-2 ainsi que sur la protéine Beclin. En conséquence, ces modulateurs duals ainsi sélectionnés seraient idéaux afin d'obtenir des candidats médicaments pour lutter contre les pathologies dérégulant la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique.
La sélection et l'identification de modulateurs de l'interaction protéique entre la protéine Beclin ou un motif spécifique de celle-ci et un membre antiapoptotique de la famille de protéines Bd-2 a été étudiée sur la base du système du double hybride. Fields et al. (US 5,283,173; US 5,468,614; US 5,667,973) ont initialement décrit et développé ce système du double hybride.
Le système du double hybride consiste initialement en un test en levure entre deux protéines recombinées. La première protéine, appelée appât , est une protéine de fusion contenant un domaine de liaison à l'ADN (DNA binding domain ou BD) lié en amont d'une protéine A. La seconde protéine est également une protéine de fusion, communément appelée proie , contenant un domaine d'activation (activation domain ou AD) lié à une protéine B. Les domaines de liaison et d'activation couramment utilisés sont ceux de Gal4 ou E. Coli Lex A. Les protéines A et B sont respectivement un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 et un motif spécifique de Beclin. L'association des protéines A et B par interaction protéique permet la formation, par complémentation, d'un domaine fonctionnel (BD-AD) capable de se lier au site de liaison (binding site ou BS) présent en amont d'un gène rapporteur et d'assurer la transcription dudit gène rapporteur.
Cependant, cette méthode conventionnelle du double hybride a ses limites. II est par exemple bien connu que de tels criblages peuvent conduire à des faux positifs et/ou faux négatifs et des confirmations biochimiques des résultats obtenus sont nécessaires. Les faux positifs obtenus via le système du double hybride sont particulièrement fréquents et sont à l'origine de mise en évidence d'interactions fonctionnelles et non structurelles.
Une technique plus performante, permettant de minimiser les faux positifs et/ou négatifs, est décrite dans la demande de brevet international WO 99/42612 ou le brevet US 6,187,535 et utilise des levures haploïdes recombinantes contenant les polypeptides appât et proie . Ce système permet la détection d'un plus grand nombre de proies à partir d'un seul appât , de façon plus précise, plus reproductible et plus sensible que les autres méthodes conventionnelles utilisées dans le domaine.
Les inventeurs ont établi, sur la base du système du double hybride, l'existence d'une interaction structurelle entre les membres antiapoptotiques de la famille de protéines Bd-2 et la protéine Beclin. Cette interaction protéique entre ces partenaires, similaire à celle existant dans la régulation du phénomène apoptotique entre les partenaires anti- et proapoptotiques de la famille de protéines Bd-2, est impliquée dans l'équilibre du processus de mort cellulaire prograrnmée.
Un motif original de la protéine Beclin a été, en particulier, mis en évidence dans le cadre de l'invention. Ce motif de la protéine Beclin est capable d'interagir de manière très spécifique avec les membres antiapoptotiques de la famille des protéines Bd-2 en vue de son utilisation pour sélectionner des modulateurs spécifiques de l'apoptose et/ou de l'autophagie. Cette spécificité d'interaction est liée à la séquence, la structure tridimensionnelle et/ou l'hélicité du motif original de la protéine Beclin.
En effet, ce motif original de la protéine Beclin de 26 acides aminés correspond au domaine précis d'interaction avec Bd-2, Bcl-XL et/ou Bcl-W et possède les critères structuraux typiques permettant la formation d'homo- ou d'hétérodimères.
La taille de ce motif en fait un candidat idéal pour l'élaboration d'un test permettant le criblage hautement efficace de molécules capables de moduler les interactions entre ce peptide de Beclin et une protéine antiapoptotique. On trouve dans la littérature de nombreux tests de criblage de modulateurs d'interactions protéines-protéines mais ils présentent souvent des limites quant à leur sensibilité et leur faisabilité à haut débit. Les méthodes couramment utilisées nécessitent la mise en oeuvre d'outils complexes (protéines de fusion, protéines recombinantes...) peu compatibles avec un criblage à haut débit. Elles génèrent le plus souvent un bruit de fond important et sont peu fiables d'un point de vue quantitatif: elles présentent une fenêtre de lecture réduite ne permettant pas un criblage optimal des molécules testées.
De manière alternative aux méthodes déjà disponibles, un test de criblage hautement efficace basé sur la polarisation de fluorescence a été mis en oeuvre dans la présente invention (Owicki et al., Journal of Biomolecular Screening, 5, 2000, 297-306). Cette technique permet par exemple de mesurer l'interaction entre un ligand marqué avec un fluorophore et un récepteur. Le principe consiste à mesurer une augmentation de la polarisation de fluorescence émise par le ligand fixé à son récepteur comparée à celle émise par le ligand libre. La polarisation de fluorescence du ligand libre est dépendante de son poids moléculaire et sera d'autant plus importante que le poids moléculaire sera élevé. Ainsi lorsque ce test est réalisé avec un ligand de haut poids moléculaire, ayant une forte polarisation de fluorescence intrinsèque, il sera difficile d'apprécier de façon fiable la différence de polarisation de fluorescence entre le ligand libre et le ligand fixé. L'utilisation d'un ligand au poids moléculaire minimal permettra au contraire d'exacerber cette différence, et par conséquent d'augmenter la précision de la méthode. II sera ainsi possible de mieux évaluer la réelle activité d'une molécule, et d'effectuer des criblages à haut débit.
Le peptide correspondant au motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV (SEQ ID NO.1) de Beclin selon l'invention peut, avantageusement, être utilisé pour le criblage de composés modulant l'interaction protéique entre le motif de Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 soit en activant soit en inhibant cette interaction.
L'invention a pour objet une méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée comportant une étape d'interaction entre le motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de la protéine Beclin et un membre antiapoptotique de la famille de protéines Bd-2 puis une étape de détection de l'interaction en présence ou non du composé à tester.
Avantageusement, la méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée comprend les étapes suivantes: a) le marquage par sonde de fluorescence du motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de la protéine Beclin; b) l'addition d'un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 audit motif; c) l'incubation des partenaires décrits en a) et b) en présence ou non du composé à tester; d) la mesure de la polarisation de fluorescence; et Io e) la comparaison de la mesure avec et sans composé à tester.
On entend par modulateur tout composé capable d'accroître, d'empêcher ou au moins de limiter une activité spécifique telles qu'une interaction protéine-protéine, une activité enzymatique, une fixation à des récepteurs cellulaires. Selon la présente invention, les modulateurs sont des inhibiteurs ou bien des activateurs de l'interaction protéique entre les partenaires Beclin et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bd-2.
L'invention concerne aussi une méthode d'identification d'un inhibiteur de l'interaction entre le motif de la protéine Beclin et un membre antiapoptotique de la famille de protéines Bd-2 capable de diminuer la polarisation de fluorescence par rapport à un témoin consistant en cette interaction en l'absence de modulateur.
L'invention porte également sur une méthode d'identification d'un activateur de l'interaction entre le motif de la protéine Beclin et un membre antiapoptotique de la famille de protéines Bd-2 capable d'augmenter la polarisation de fluorescence par rapport à un témoin consistant en cette interaction en l'absence de modulateur. io
Le ligand fluorescent, i.e. le peptide Beclin fluorescent, après liaison avec le partenaire anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 a une constante de rotation plus faible que le ligand libre correspondant et de ce fait la fluorescence émise par le ligand lié devient polarisée. En conséquence, on observe une augmentation de la polarisation de la fluorescence émise par le ligand lié versus ligand libre.
Dans un mode de réalisation préférée, la sonde de fluorescence utilisée dans le procédé de criblage selon l'invention est le bodipy, l'Oregon Green io et de manière préférée la fluorescéine.
Plus particulièrement, le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2, intervenant comme partenaire de l'interaction dans le processus de criblage et d'identification selon l'invention, peut être la protéine Bd-2, Bcl-XL ou Bcl-W.
Avantageusement, le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd2 est une protéine de fusion. Par protéine de fusion , on entend la fusion entre un domaine de la protéine Bd-2, Bcl-XL ou Bcl-W et un domaine d'une protéine telle que GST (Glutathion-S-transferase).
La présente invention a pour objet un motif de Beclin de séquence d'acides aminés GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV et ses variants fonctionnels.
Par séquence d'acides aminés , il doit être compris une séquence peptidique isolée du contexte naturel. Il s'agit notamment de séquences isolées, synthétisées chimiquement et/ou purifiées et éventuellement modifiées par génie génétique.
On entend par variants fonctionnels les séquences d'acides aminés du motif de Beclin comprenant des substitutions conservatrices ou des 2881429 Il mutations ponctuelles conservatrices et ayant essentiellement les mêmes propriétés que ce motif codé par la séquence SEQ ID NO.1, soit la capacité d'interagir avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2. Les substitutions ou mutations conservatrices de Va séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 sont, par exemple, les suivantes: glycine par alanine (G--A), valine par leucine (V--L) ; acide aspartique par acide glutamique (D--E), asparagine par glutamine (N--Q), leucine par isoleucine (L--I), arginine par lysine (R--K).
Les inventeurs ont observé que le motif de Beclin de séquence peptidique SEQ ID NO.1 interagissait avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Blc-2, tel que Bel-2, BcI-XL ou Bcl-W.
L'invention concerne aussi la séquence d'acides nucléiques 5'ggcaccatggagaacctcagccgaagactgaaggtcactggggacctttttgacatcatgtcgggcc agacagatgtg 3' (SEQ ID NO.2) codant pour le motif original de la protéine Beclin. Cette séquence d'acides nucléiques selon l'invention peut être obtenue d'après le code génétique à partir de la séquence d'acides aminés du motif de Beclin et ses variants.
Les variants de cette séquence d'acides nucléiques sont notamment: des séquences capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO.2 ou une séquence complémentaire de celle-ci, et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés que le motif de Beclin codé par la séquence SEQ ID NO.1, ou, des séquences d'une espèce de mammifère homologues à la séquence SEQ ID NO.2 isolée chez l'Homme.
Par conditions stringentes , on entend les conditions qui permettent 30 l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin à environ 65 C par exemple dans une solution de 6 x SSC, 0,5 % SDS, 5X Denhardt's solution et 100 pg d'ADN carrier non spécifique ou toute autre solution de force ionique équivalente et après un lavage à 65 C, par exemple dans une solution d'au plus 0,2 x SSC et 0,1 % SDS ou toute autre solution de force ionique équivalente. Les pararnètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm = 81,5 + 0,41 (%G+C) + 16, 6Log (concentration en cations) 0,63 (% formamide) (600 / nombre de bases). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm = 4 (G+C) + 2(A+T). Les conditions de stringence peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille de la séquence, la teneur en GC et tout autre paramètre, selon notamment les protocoles décrits dans Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York).
On entend par séquences d'une espèce de mammifères homologues à la séquence SEQ ID NO.2 , une séquence de structure similaire à la séquence SEQ ID NO.2 et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés chez des espèces de mammifères non-humains, notamment les primates, le rat ou la souris. Le pourcentage d'identité entre deux séquences homologues dans les régions fonctionnelles est en général supérieur à 80 %, de préférence supérieur à 90 %.
L'invention concerne également un vecteur recombinant comprenant une séquence d'acides nucléiques telle que revendiquée selon l'invention. Par vecteur, il faut comprendre tout type de vecteur permettant l'introduction de la séquence d'acides nucléiques dans une cellule hôte et éventuellement l'expression du polypeptide codé par la séquence d'acides nucléiques dans la cellule hôte.
Un tel vecteur est par exemple un plasmide, un cosmide, un chromosome bactérien artificiel ou un bactériophage comprenant les séquences nécessaires à l'expression du motif de la protéine Becllin.
De façon préférée, le vecteur recombinant selon l'invention comprend les séquences nécessaires à l'expression du motif revendiqué de la protéine Beclin dans la cellule hôte. Ces séquences sont notamment des séquences promotrices de la transcription et de la traduction dans la cellule hôte ainsi que des séquences terminatrices. Le vecteur recombinant peut également comprendre des séquences codant pour des signaux de sécrétions permettant la libération des protéines traduites dans l'environnement extracellulaire.
L'invention porte aussi sur les cellules hôtes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, ces cellules hôtes sont des cellules bactériennes telles que Escherichia coli, les streptococci par exemple ou des cellules eucaryotes telles que des cellules de levures, de champignons filamenteux, cellules d'insectes et de préférence des cellules de mammifères.
La transformation de cellules hôtes appropriées par un vecteur recombinant comprenant les séquences d'acides nucléiques selon l'invention permet d'exprimer le motif revendiqué de la protéine Beclin. Dans un second temps, il est possible de purifier les protéines exprimées dans ces cellules hôtes à partir de différentes méthodes connues de l'homme du métier et abondamment décrites dans l'état de la technique. Citons par exemple les purifications par précipitation au sulfate d'ammonium, par chromatographie d'exclusion par la taille et de préférence par chromatographie d'affinité.
Ce peptide de séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 peut également être synthétisé chimiquement à façon par Néosystem. La synthèse chimique de SEQ ID NO.1 et de ses variants fonctionnels est réalisée par synthèse sur support solide selon la stratégie Boc/benzyle à l'aide d'un synthétiseur de peptides Applied Biosystems 430A . La synthèse repose sur l'élaboration sur résine de la séquence voulue, puis la déprotection des fonctions amines N et C-terminales. En stratégie Boc/benzyle, il est nécessaire d'introduire l'acide aminé Boc-L-Lys(Frnoc)-OH lors de la synthèse du peptide. Après avoir élaboré toute la séquence, la fonction amino est déprotégée et le peptide coupé de la résine en présence d'un acide fort. Io
L'invention porte également sur une composition pharmaceutique comprenant un peptide, correspondant au motif SEQ ID NO.1 de Beclin selon l'invention en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Dans le contexte de l'invention, on entend par excipients d'une composition pharmaceutique tout agent assurant le transport du principe actif dans les voies internes chez le patient traité. Par principe actif , on entend toute substance responsable des propriétés pharmacodynamiques ou thérapeutiques de la composition pharmaceutique.
Parmi les excipients, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables, on peut citer à titre indicatif et non limitatif les diluants, les solvants, les conservateurs, les agents mouillants, les émulsifiants, les agents dispersants, les liants, les agents gonflants, les agents désintégrants, les retardants, les lubrifiants, les absorbants, les agents de suspension, les colorants ou les aromatisants.
La présente invention concerne non seulement la composition pharmaceutique considérée en tant que telle et définie supra, mais 30 également l'utilisation de cette composition dans une méthode d'induction de mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique selon l'invention.
La présente invention porte donc sur une méthode d'induction de mort cellulaire programmée de type apoptotique, i.e. voue de mort cellulaire programmée caspase dépendante, et/ou de type autophagique, i.e. voie de mort cellulaire programmée caspase indépendante, comprenant l'administration au patient atteint notamment de cancer d'une quantité efficace de composition pharmaceutique comprenant un peptide de Beclin Io de séquence SEQ ID NO.1.
L'invention vise également une composition pharmaceutique comprenant au moins un modulateur, activateur ou inhibiteur, identifié à partir de la méthode d'identification de modulateurs selon l'invention, en tant que principe actif de ladite composition en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
L'invention porte aussi sur une méthode d'induction de mort cellulaire programmée de type apoptotique (caspase dépendante) et/ou autophagique (caspase indépendante) à partir de l'administration d'une quantité efficace de composition définie supra à un patient atteint de cancer.
Les compositions pharmaceutiques telles que décrites supra sont utilisables dans le traitement des cancers par action sur la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique.
Les compositions selon l'invention sont sous une forme convenant à l'administration orale, parentérale, nasale, per ou transcutanée, rectale, perlinguale, oculaire ou respiratoire et notamment les comprimés simplesou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les sachets, les paquets, les gélules, les glossettes, les tablettes, les suppositoires, les crèmes, les pommades, les gels dermiques, et les ampoules buvables ou injectables.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les 5 figures et exemples suivants: - Figure 1: séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 du motif de Beclin interagissant avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2.
- Figure 2: séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO.2 codant pour lo le motif de Beclin interagissant avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2.
- Figure 3: détermination de Ki en polarisation de fluorescence du peptide compétiteur Beclin muté ou non sur l'interaction entre le peptide pro-apoptotique Bak et les membres anti-apoptotiques Bd-2, Bcl-XL et BclW.
- Figure 4: résultats de co-immunoprécipitation entre la protéine Bcl-XL et la protéine Beclin.
EXEMPLE 1: Identification, par le système du double hybride, du peptide décrit dans la fiqure 1 Trois banques de cDNA humains ont été criblées (placenta, cerveau, lignée cellulaire CEMC7) par la technique du double hybride (Fields et al.) chez la levure en utilisant le protocole de conjugaison décrit par Legrain et al. dans Nature Genetics, 1997, vol. 16, 277-282 (US 6,187,535).
1) Préparation des appâts et proies a) Les appâts utilisés sont: - Bcl-XL (numéro d'accession Z23115) délétée de son extrémité Cterminale (1-209) et fusionnée au domaine de liaison à l'ADN LexA - Bd-2 (numéro d'accession XM_008738) délétée de son extrémité C-terminale (1211) et fusionnée au domaine de liaison à l'ADN LexA. Ces appâts sont exprimés dans les levures Saccharomyces cerevisiae souche L40AgaI4 (MATa ade2, trpl-901, leu2-3, 112, lys2-801, his3A200, LYS2 (IexAop)4-HIS3, ura3-52::URA3 (IexAop)$-LacZ, GAL4::KanR) et mis io en préculture à 30 C dans un milieu synthétique dépourvu de tryptophane (DO-Trp) jusqu'à obtention d'une densité optique DO600nm comprise entre 0,1 et 0,5. Cinquante ml d'une dilution de cette préculture (DO600nm =0,006) sont incubés à 30 C pendant une nuit.
b) Une collection de levures Saccharomyces cerevisiae, souche YHGX13 (MATa Gal4A GaI80A ade2-101::KanR, his3, leu2-3-112, trpl-901, ura3-52 URA3::UASGALI-LacZ, Met) contenant les plasmides exprimant les banques de cDNA fusionnés au domaine d'activation de la transcription Gal4 est obtenue par transformation après sélection sur un milieu de culture dépourvu en leucine (DO-Leu). Ces levures sont aliquotées et conservées à -80 C.
2) Conjugaison La conjugaison est réalisée avec un ratio appât / proie égal à 2.
Une quantité de cellules de levures appâts obtenues au stade 1)a) correspondant à 50 unités DO600nm est mélangée aux levures proies obtenues au stade 1)b). Après centrifugation, le culot est resuspendu dans un milieu YPGIu, étalé sur des boîtes de culture YPGIu et incubé 4 heures 30 à 30 C. La sélection des levures conjuguées contenant un appât et une proie capables d'interagir ensembles est réalisée sur un milieu DO- Leu-Trp-His: l'absence de leucine et de tryptophane permet de maintenir une pression de sélection ne permettant qu'aux levures contenant les deux types de plasmides ( appâts / proies ) de pousser; l'absence d'histidine dans le milieu permet de sélectionner les levures conjuguées contenant un plasmide appât et un plasmide proie capables d'interagir ensembles: cette complérnentation permet d'activer le gène HIS3, en tant que gène rapporteur codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'histidine.
3) Identification des clones positifs Les fragments proies d'une colonie de levures sélectionnées selon la méthode de conjugaison décrite au paragraphe 2) sont amplifiés par PCR à partir d'un lysat brut de cette colonie, en utilisant des amorces spécifiques du vecteur proie : ABS1 5'-GCTTTGGAATCACTACAGG-3 SEQ ID N0.3) ABS2 5'-CACGATGCACGTTGAAGTG-3 SEQ ID N0.4).
Les produits de PCR sont ensuite séquencés et les:séquences obtenues sont identifiées par comparaison avec des banques de données.
4) Identification du peptide décrit figure 1 Pour chaque fragment appât testé, le système du double hybride permet d'identifier plusieurs fragments proies . Cette identification se fait par comparaison de séquences des proies sélectionnées à partir d'un programme informatique tel que Blastwun disponible sur le site internet de l'Université de Washington: http://bioweb.pasteur. fr/seganal/interfaces/blastwu.html.
EXEMPLE 2: Validation de l'interaction entre le peptide décrit dans l'Exemple 1 et Bd-2, E3cl-X, et/ou Bd-W 1) Détermination de Ki en polarisation de fluorescence La détermination de Ki en polarisation de fluorescence consiste à mesurer l'effet compétitif du peptide Beclin sur l'interaction entre le peptide proapoptotique Bak les membres antiapoptotiques de la famille de protéines Bd-2 tels que BcI-XL, Bd-2 ou BclW.
Les réactifs suivants sont mélangés dans l'ordre précisé : a) du peptide compétiteur à une concentration finale de 1 nM à 100 pM; b) du peptide ligand fluorescent (Bak BH3 carboxyfluoresceine) à une concentration finale de 15 nM; c) du membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 à une concentration finale de 100 nM pour Bcl-XL, 1 pM pour Bd-2 et Bcl-W.
Ces réactifs sont en solution dans le tampon d'interaction (Na2HPO4 20 mM pH 7.4, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM et acide pluronique F-68 0. 05%).
Le mélange est ensuite incubé 30 minutes à température ambiante et la polarisation de fluorescence déterminée sur l'appareil (Packard) Fusion (excitation à 485 nm et lecture à 530 nrn). Les valeurs sont données en mP (unité de polarisation de fluorescence).
Ces analyses en polarisation de fluorescence ont mis en évidence l'effet compétitif du peptide Beclin sur l'interaction peptidique entre Bak et Bcl-XL, Bd-2 ou Bcl-W. Les Ki obtenus au cours de ces tests en polarisation de fluorescence sont les suivants: Bcl-XL / Bak /Beclin Ki = 1 15 M Bd-2 / Bak / Beclin Ki = 1,8 M Bcl-W / Bak / Beclin Ki = 7,41aM Ces analyses démontrent l'affinité élevée du peptide Beclin vis à vis des membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bd-2.
2) Détermination de Ki en polarisation de fluorescence avec le peptide 5 Beclin muté (L116A) La détermination de Ki en polarisation de fluorescence consiste à mesurer l'effet compétitif du peptide Beclin muté, de leucine en alanine en position 116 de la séquence complète de la protéine Beclin (L116A), sur l'interaction io entre le peptide pro- apoptotique BAK les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bd-2 tels que Bd-X:1_, Bd-2 ou Bcl-W.
La séquence du peptide muté (L116A) est la suivante GTMENLSRRAKVTGDLFDIMSGQTDV (SEQ ID NO.5).
Le protocole de détermination de Ki en polarisation de fluorescence est identique au protocole décrit supra.
On observe, par comparaison des résultats d'analyses en polarisation de fluorescence, une perte d'effet compétitif du peptide Beclin muté (L116A) par rapport au peptide Beclin selon l'invention dans l'interaction peptidique entre le peptide pro-apoptotique Bak et les membres antiapoptotiques de la famille de protéines Bd-2 tels que BcI-XL, Bd-2 ou BolW.
3) Co-immunoprécipitation Des cellules HeLa sont co-transfectées (kit Effectene, Qiagen) par un vecteur d'expression codant pour la protéine Bcl-XL portant un épitope flag et un vecteur d'expression codant pour la protéine Beclin sauvage ou muté (L116A).
Vingt-quatre heures après transfection les cellules sont reprises dans le 30 tampon de lyse (Hepes 10 mM pH 7.5, KCI 150 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, Triton 0.4%, antiprotéases et aritiphosphatases), incubées dans la glace et centrifugées à 10000 rpm.
Le surnageant (lysat cellulaire) est ensuite incubé en présence de billes d'agarose conjuguées à des anticorps anti-Flag (Flag M2 agarose, sigma) 5 pendant 2 heures.
Les billes d'agarose sont ensuite centrifugées et lavées dans le tampon de lyse puis reprises dans du tampon de Laemli et analysées par westernblots avec des anticorps anti-Beclin La co-immunoprécipitation de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL avec la protéine entière Beclin par interaction protéine/protéine a confirmé l'interaction structurelle existant réellement entre la protéine Bcl-XL et la protéine Beclin.
EXEMPLE 3: Test de criblage de molécules capables d'inhiber l'interaction entre Bd-2 et/ou Bcl-XL et le peptide obtenu dans l'Exemple 1 Les produits à tester sont distribués dans des plaques 384 puits (Corning Flat Bottom) à une concentration finale de 10 pg/ml. Un puits est rempli avec une quantité équivalente de tampon/solvant sans composé à tester et constituera le témoin. Le peptide obtenu dans l'Exemple 1 marqué à la fluorescéine est ajouté dans chaque puits de manière à obtenir une concentration finale allant de 1 à 100 nM. La protéine de fusion GST-BcIXL ou GST-Bcl-2 ou encore GST-Bcl-W est ensuite ajoutée de façon à obtenir une concentration finale de 0,1 à 1 M dans un tampon contenant Na2HPO4 20 mM pH 7,4, de l'EDTA 1 mM, NaCI 50 mM, de l'acide pluronique F- 68 0,05%. La polarisation de fluorescence est ensuite mesurée par l'appareil En Vision (Packard Perkin-Elmer). Une diminution significative de la polarisation de fluorescence enregistrée dans l'essai réalisé avec le composé à tester comparée à celle obtenue sans le composé à tester (puits témoin) permet de conclure à une activité inhibitrice de la molécule. A l'inverse, une augmentation significative de la polarisation de fluorescence dans l'essai avec le produit à tester comparée au témoin permet de conclure à une activité activatrice de la molécule.
Claims (19)
1. Méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire programmée caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) l'interaction entre le motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de 5 la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2; b) la détection de l'interaction en présence ou non du composé à tester.
2. Méthode d'identification de modulateurs de la mort cellulaire io programmée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) le marquage par sonde de fluorescence du motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de la protéine Beclin; b) l'addition d'un membre anti-apoptotique de la famille des protéines Bd-2 audit motif; c) l'incubation de ce système en présence ou non du composé à tester; d) la mesure de la polarisation de fluorescence; et e) la comparaison de la mesure avec et sans le composé à tester.
3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le modulateur de l'interaction entre le motif de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 est un inhibiteur diminuant la polarisation de fluorescence.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le modulateur de l'interaction entre le motif de la protéine Beclin et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 est un activateur augmentant la polarisation de fluorescence.
5. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que la sonde de fluorescence est la fluorescéine.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bd-2 est la protéine Bd-2, Bcl-XL ou Bcl-W.
7. Séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 du motif GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV de la protéine Beclin et de ses io variants fonctionnels.
8. Séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO.2 5'ggcaccatggagaacctcagccgaagactgaaggtcactggggacctttttgacatcatgtcg ggccagacagatgtg3' codant pour le motif de la protéine Beclin selon la revendication 7.
9. Séquence d'acides nucléiques déduite selon le code génétique de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 selon la revendication 7.
10. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 8 et 9.
11. Vecteur recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide, un cosmide, un chromosome bactérien artificiel ou un bactériophage comprenant les séquences nécessaires à l'expression du motif de la protéine Beclin.
12. Vecteur recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce que les séquences nécessaires à l'expression du motif de la protéine Beclin comprennent une séquence promotrice de la transcription et de la traduction.
13. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 10 à 12.
14. Cellule hôte selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une cellule bactérienne ou eucaryote.
15. Peptide caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés selon la revendication 7.
io
16. Peptide selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'il est codé par la séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 8 ou 9.
17. Composition pharmaceutique comprenant un peptide selon l'une des revendications 15 ou 16, en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17 utile comme médicament en tant qu'inducteur de la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique chez les patients atteints de cancers.
19. Composition pharmaceutique selon la revendication 17 utile comme médicament dans le traitement de cancers.
Priority Applications (7)
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