WO2006070729A1 - インスリン産生細胞特異的プロモーターおよびその用途 - Google Patents

インスリン産生細胞特異的プロモーターおよびその用途 Download PDF

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Noriaki Tanaka
Naoya Kobayashi
Takuya Fukazawa
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Okayama University NUC
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors

Definitions

  • the present invention relates to a novel insulin-producing cell-specific promoter and use thereof.
  • a plasmid containing a promoter region involved in expression of the target protein and a reporter gene downstream from the cell population containing cells expressing the target protein is used in the Balta cell population.
  • This is a method in which a reporter gene expression positive cell is selected using a cell sorter or an antibiotic resistance gene (for example, see Soria et al., Diabetologia (2001) 44: 407-415).
  • This method is applicable to the selection of insulin-producing cells.
  • the natural promoter sequence is used as it is, the specificity decreases due to the non-specific transcription active site of insulin-producing cells, and the selection of cells is more strict. I can't do it.
  • An object of the present invention is to provide a novel promoter with high specificity and strong transcriptional activity in order to efficiently select insulin-producing cells.
  • the 363rd 5 'flanking region (from SEQ ID NO: 1, hereinafter,-363/1 1) upstream of the transcription start site (+1) of the human insulin promoter (+1) ⁇ 363 / —1 area, including the Karakcho Hacchohachi box, and 3 areas deleted _363 / _32 areas (SEQ ID NO: 2) are inserted into the ⁇ side of the The present inventors have found that a novel promoter with high specificity and high transcriptional activity can be obtained in production cells.
  • the present invention provides: a) a polynucleotide containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 on the side of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or
  • the present invention also relates to a vector comprising the promoter.
  • a reporter gene and / or an antibiotic resistance gene is preferably linked to the upstream side of the promoter.
  • the present invention further includes (a) introducing a vector having a reporter gene and an antibiotic resistance gene linked to the 3 'side of the promoter into undifferentiated cells,
  • the present invention relates to a method for selecting insulin-producing cells comprising
  • FIG. 1 is a diagram showing the binding sites of major transcription factors of the natural human insulin promoter.
  • FIG. 2 is a diagram showing an embodiment of the method for selecting insulin-producing cells of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing an embodiment of the method for selecting insulin-producing cells of the present invention.
  • FIG. 4 shows an embodiment of subcloning of the present invention.
  • FIG. 5 Electrophoresis photograph. M indicates molecular weight marker, lanes:!
  • To 6 restriction enzymes of pGL3, phlNS—363 / —1 ⁇ Luc, phlNS—363 / —1 + (hINS—363 / —32) XI to 4-Luc, respectively Processed by Hindlll and Kpnl.
  • FIG. 6 is a graph showing the promoter activity of each plasmid in each cell under low-gnorecose conditions.
  • FIG. 7 is a graph showing the promoter activity of each plasmid in each cell under high-gnorecose conditions.
  • the promoter of the present invention includes: a) a polynucleotide containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 on the ⁇ side of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or b) the base sequence of the polynucleotide of a) above And a polynucleotide having a promoter activity in insulin-producing cells, which hybridizes with a polynucleotide comprising a complementary base sequence under stringent conditions.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 represents the _ 1 to _ 363th flanking region (one 363 / -1 region) upstream of the transcription start site (+1) of the natural human insulin promoter. It has a binding site for transcription factors such as PDX1, NeuroD, NKX2.2, NKX6.1 and HNF4a and a C1-A2 region responsible for glucose-dependent transcriptional activity (Figure 1) (German et al., J. Biol. Chem). , 1996, Bartoov—Shifman et al., J. Biol. Chem., 2002, Watada et al., Proc. Natl. Acad.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 2 is a region (_363 / _32) excluding the base sequence ability TATA box of SEQ ID NO: 1.
  • the promoter of the present invention further has the base sequence of SEQ ID NO: 2 inserted in tandem.
  • the number of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 contained in the promoter of the present invention is not particularly limited, but:! To 15 is preferable:! To 4 is more preferable 2 is the most preferable. Only the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 cannot select an efficient insulin cell with low promoter activity. Also represented by SEQ ID NO: 2. If the number of base sequences to be transferred is 16 or more, the total molecular weight becomes too large when inserted into a vector, and the efficiency of introduction into cells tends to decrease.
  • in tandem means repeatedly inserting the same sequence in the same direction.
  • the promoter of the present invention can generally be produced by a PCR subcloning method or the like. For example, using the human genome as a saddle, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is amplified by PCR and inserted into an appropriate vector. Next, the base sequence of SEQ ID NO: 2 is amplified using this vector as a cage. There is a method for producing a desired promoter by inserting an arbitrary number of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 upstream (5 ′ side) of the vector into which the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is inserted.
  • an additional base sequence such as a restriction enzyme cleavage site is inserted between these base sequences. May be.
  • an additional base sequence such as a restriction enzyme cleavage site is inserted between these base sequences. May be.
  • nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 several bases are deleted / replaced / inserted except in the TATA box or the binding site of the main transcription factor unless the promoter activity of the present invention is reduced. are also included in the promoter of the present invention.
  • several bases may be deleted, substituted or inserted as long as they do not interfere with the binding of TATA box binding factors or transcription factors. It is included in the promoter of the invention.
  • stringent conditions means conditions for hybrid formation and subsequent washing.
  • a high ion concentration for example, 6 X SSC
  • a solution containing 1.5M NaCl and 0.15M trisodium citrate is set to 10 X SSC
  • a hybrid is formed at 45 ° C in a solution containing 50% formamide under a low ion concentration (for example, , 2 X SSC) at 50 ° C or under high ion concentration (eg, 6 X SSC) solution at 65 ° C to form a hybrid and under low ion concentration (eg 0 1 X SSC) can be used for cleaning at 65 ° C.
  • the salt concentration in the cleaning step should be selected from 2 X SSC (low stringency conditions) to 0.2 X SSC (high stringency conditions) force, for example, when the temperature is set to 50 ° C. Can do.
  • the temperature in the washing step is, for example, room temperature (low stringency conditions)
  • Hybridization is "Molecular Cloning 3rd Edition", “Current 'Protoco One Norez' In 'Molecular' Biology”, “DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford According to the method described in “University (1995)”, colony 'hybridization method, plaque' hybridization method or Southern blot hybridization method can be performed. .
  • Polynucleotides that can hybridize under stringent conditions include NCBI (National Center for Biotechnology).
  • any plasmid vector is preferred. Any vector can be used as long as any promoter of the original vector is excised by restriction enzyme treatment. Further, those having a plurality of restriction enzyme sites for inserting foreign genes are preferred. Examples of such vectors include a reporter gene, which has no promoter upstream and has a plurality of restriction enzyme recognition sites, and is originally prepared for reporter assembly of any promoter.
  • PGL2 basic vector Promega
  • pGL3 basic vector Promega
  • pGL4 basic vector Promega
  • a reporter gene is linked to the downstream side of the promoter of the present invention. Considering the transfection into cells that are preferred, it is preferable that the final vector size is about 1 OKbp or less.
  • the most commonly used method is the luciferase atsey method.
  • the luciferase atsey method can measure even very fine activities and is a simple method, so it is preferable for the purpose of activity evaluation.
  • Such a reporter gene is not particularly limited as long as the detection method of the gene product is known, for example, an enzyme gene such as a luciferase gene and a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene, green Fluorescent protein genes such as fluorescent protein (GFP) gene and red fluorescent protein (DS-RED) gene can be used.
  • an enzyme gene such as a luciferase gene and a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene
  • green Fluorescent protein genes such as fluorescent protein (GFP) gene and red fluorescent protein (DS-RED) gene
  • GFP fluorescent protein
  • DS-RED red fluorescent protein
  • an antibiotic resistance gene since the promoter of the present invention functions specifically in insulin-producing cells, an antibiotic resistance gene must be linked downstream of the 3 'side to select insulin-producing cells. Furthermore, it is preferable to use a reporter gene and an antibiotic resistance gene linked together.
  • Antibiotic resistance genes used in the present invention are useful, such as nodal, idalomycin resistance gene, neomycin resistance gene, zeocin resistance gene, bradysidine resistance gene, etc., and may be more appropriate depending on the cell type and selection design. One can be selected as appropriate. In addition, other resistance genes from other promoters can be linked to the vector of the present invention for different selection.
  • GFP and hygromycin resistance gene fusion gene GFP and hygromycin resistance gene fusion gene (GFP_HygroR fusion) or RED and hygromycin resistance gene fusion.
  • a reporter gene such as a gene (DS-RED-HygroR fusion) and an antibiotic resistance gene fusion can also be linked.
  • the reporter gene can be easily detected with a fluorescence microscope.
  • the gene encoding green fluorescent protein or red fluorescent protein is preferred because it can be detected and color is easily recognized.
  • a method for linking such a reporter gene, an antibiotic resistance gene, or a fusion gene of a reporter gene and an antibiotic resistance gene (hereinafter also referred to as a fusion gene) to the promoter of the present invention is known in the art.
  • Various methods can be used.
  • the reporter assembly vector as described above is used to produce the promoter of the present invention, the reporter gene present in the vector is replaced with the reporter gene, antibiotic resistance gene or fusion gene to be ligated. Can do.
  • the luciferase gene can be excised with two restriction enzymes, Ncol and Xbal, and the target gene can be obtained by using a primer that adds Ncol and Xbal cleavage sites, respectively.
  • the gene can be exchanged by amplifying the RFRF by PCR and ligating the insert fragment treated with the restriction enzyme.
  • a ribofusion method As a method for introducing the obtained vector into a cell, a ribofusion method, an electopore position method, a calcium phosphate method, or the like can be used. If the size of the vector produced exceeds lOkbp, or if the target cells are cells that are difficult to enter by the lipofusation method, such as ES cells, mesenchymal stem cells, and bone marrow cells, the electoral position method is preferred.
  • the promoter of the present invention specifically functions in insulin-producing cells, it can be used for selection of insulin-producing cells.
  • the promoter of the present invention containing n base sequences represented by SEQ ID NO: 2 on the 5 ′ side of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1: phINS—363 / —l + (hINS—363 / — 32) Plasmid vector ligated with a gene encoding green fluorescent protein (GFP) fused with hygromycin resistance gene upstream of X n: pMNS _ 363 / _ l + (MNS— 363 /-32) X n 'GFP—Build HygroR.
  • GFP green fluorescent protein
  • Undifferentiated cells such as human ES cells or mesenchymal stem cells are cultured and proliferated, and an optimal amount of the plasmid is introduced by electoporation. Differentiation is induced after exchanging the culture medium. Insulin-producing cells into which the plasmid has been introduced develop a green color under a fluorescence microscope, so when observed over time, hygromycin is added to the culture solution when the percentage of green cells and the fluorescence intensity become maximum. Insulin-producing cells can be obtained by selecting GFP-positive cells ( Figure 2).
  • plasmid pMNS— 363 / — 1 + (M NS-363 /-32) X n 'GFP— HygroR / SV40' Neo can be used.
  • plasmid cells into which the plasmid has been introduced can be selected by neomycin treatment before induction of differentiation into insulin-producing cells (Fig. 3).
  • the antibiotic resistance gene to be used can be changed as appropriate to the above-mentioned antibiotic resistance genes other than hygromycin and neomycin, and the reporter gene can also be changed appropriately to the above-mentioned genes other than GFP. it can.
  • the optimal amount for introducing the plasmid is preferably 2 ⁇ g to 20 / g of the plasmid for 2 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 7 cells.
  • Differentiation induction is preferably carried out at a high gno-lecose concentration, and the culture period is preferably 2 to 6 weeks.
  • Human genome l OOng purified from a human normal lung fibroblast cell line (NHLF) from the _ 1 to _ 363 th 5 r flanking region (SEQ ID NO: 1) upstream of the transcription start site (+1) of the human insulin promoter
  • the reaction conditions (94.C, 15 ° C, 62.5 ° C, 30 ° C, 68 ° C, 1 min.) PCR product 1 (hereinafter referred to as Xhol / 363 / -l) / HindIII).
  • forward primer 1 (SEQ ID NO: 3) incorporating an Xhol cleavage site on the 5 ′ side and reverse primer 1 (SEQ ID NO: 4) incorporating a Hindlll cleavage site on the 3 ′ side were used for the human insulin promoter 363 / — Set at both ends of one area.
  • PCR Table 1 shows the composition of the reaction solution.
  • the total amount of PCR product 1 (Xhol / —363 / —1 / Hindlll) obtained in (A) above was treated with restriction enzymes Xhol and Hindlll at 10 U for 16 hours at 37 ° C.
  • the luciferase expression plasmid pGL3 basic vector (Promega) 5 was treated with the same two restriction enzymes 15 U for 3 hours at 37 ° C for 3 hours, and then the Quick ligation kit (M220 OS: Ligation was performed using New England Biolab (Fig. 4).
  • ligation For ligation, mix 3 times the amount of insert DNA in a molar ratio with 50 ng of vector DNA, dilute with nucleic acid-free water to make 10 ⁇ ⁇ , and use the 2 X Quick Ligation Buffer supplied with the kit and 1 ⁇ l. This was performed by adding quill quick T4DNA ligase and incubating at room temperature for 5 minutes. Of the obtained ligation product, ⁇ ⁇ was added to a 100 a 1 competent cell (DH5a, Toyobo Co., Ltd.) placed on ice for 30 minutes after dissolution.
  • DH5a a 1 competent cell
  • the obtained plasmid was treated with Xhol and Hindlll, and it was confirmed after electrophoresis on a 1% agarose gel containing ethidium bromide that the target sequence was cut out as an insert (Fig. 5, lane 2). 1 (hereinafter also referred to as phINS_ 363 / _ l 'Luc)
  • Has a cleavage site—363 / —32 regions as PCR products 2 to 5 (hereinafter referred to as Smal / —363 / —32 / XhoI, Nhel / —363 / —32 / SmaI, Mlul / -363 / — 32 / NheI and KpnlZ—363Z—32ZMluI.
  • Plasmid 1 phlNS—363 / —1'Luc obtained in (B) and PCR product 2: Smal / —363 / —32 / XhoI obtained in (C) were used with restriction enzymes Smal and Xhol. After the treatment, ligation was performed in the same manner as in (B) below, and the target of incorporating one 363 / -32 region into the Smal and Xhol sites of phlNS—363 / —l 'Luc. Plasmid 2 (also referred to as phINS (363 / -32) X l 'Luc) was obtained.
  • reporter assembly was performed as follows.
  • pCMV j3 -gal (6 ⁇ g) 1.
  • Opti_men ribofunction-specific culture medium Opti_men (Gibco BRL)
  • a negative control a mixture of pCMV j3—gal ⁇ z g) and pGL3 basic vector (6 ⁇ g) was used.
  • ribofusion reagent (manufactured by Falcon) was added, and Opti-men was added to the total volume of 300 ⁇ 1. It was. After standing for 45 minutes, each plasmid in the small tube was added to the clear tube together with the medium, mixed with the ribofecation reagent, and allowed to stand for another 15 minutes.
  • a serum-containing culture solution (Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM or 16 mM L-glucose) (2.4 ml) was added to a total volume of 3.0 ml, and mixed well to prepare a lipofussion preparation.
  • DMEM Dulbecco's modified eagle medium
  • the medium was renewed (2 ml). There are a total of 7 combinations of pCMV iS -gal + various plasmids to perform this experiment, each cell requires a total of 24 tools (4 on a 6-wall plate), and experiments with low glucose concentrations This multiple was used to divide (2 mM) and high glucose concentration (16 mM), ie a total of 48 tools (eight on a 6 tool plate).
  • Table 2 shows the test cells and their origins.
  • Test plasmids are shown in Table 3.
  • RLUZ J3 gal value of each well was measured, and the average value of RLU / / 3—gal value of 3 tools of pGL3 + pCMV / 3-gal used as negative control was calculated, and this value was multiplied by fold value. 1.
  • the RLUZ j3_gal value of each tool when 0 was set was calculated. Fold Induction in each combination: Luc (RLU) / / 3—Calculate the mean and SD from the gal value. Analysis was performed.
  • Plasmids 2 to 6 showed no activity in human cells derived from other germ layers other than the inner lung lobe (MCF7 and 293T). Similarly, no activity was observed in other endoderm-derived cells except ⁇ -cells, including endoderm-derived sputum cancer cells (MIAPACA2) and a-cell-derived gonoregonal gon-producing cells (e.g., TC1). ⁇ 6, a ⁇ -cell-derived insulin-producing cell, exhibited 4.3-fold promoter activity in plasmid 1 and gradually increased in plasmids 2-5 (74-4-102.8-fold) under low glucose conditions. (Figure 6). Furthermore, these activities were further enhanced under high glucose conditions (FIG. 7). Industrial applicability
  • the promoter of the present invention shows very strong specificity to insulin-producing cells and has high transcriptional activity, for example, downstream of the promoter of the present invention, reporter genes such as luciferase and GFP, and antibiotic resistance genes
  • reporter genes such as luciferase and GFP, and antibiotic resistance genes
  • the promoter of the present invention is responsive to glucose concentration, and can be selected more strictly for cell populations having insulin promoter activity by culturing under high-concentration glucose conditions.
  • SEQ ID NO: 3 Forward primer incorporating a Xhol restriction site on the ⁇ side of the region of the human insulin promoter — 363 / — 1
  • SEQ ID NO: 4 Hindlll restriction site on the: ⁇ side of the human insulin promoter — 363 / —1 region Reverse primer incorporating position
  • SEQ ID NO: 5 Forward primer incorporating a Smal restriction site on the ⁇ side of the 363 / -32 region of the human insulin promoter
  • SEQ ID NO: 6 Reverse primer incorporating the Xhol restriction site on the: ⁇ side of the —363 / —32 region of the human insulin promoter
  • SEQ ID NO: 7 Forward primer incorporating a Nhel restriction site 5 ′ of the 363 / _32 region of the human insulin promoter
  • SEQ ID NO: 8 Reverse primer incorporating a Smal restriction site on the: ⁇ side of the -363 / -32 region of the human insulin promoter
  • SEQ ID NO: 9 Forward primer incorporating a Mlul restriction site 5 ′ of the human insulin promoter — 363 / _32 region
  • SEQ ID NO: 10 Reverse primer incorporating a Nhel restriction site on the ⁇ side of the -363 / -32 region of the human insulin promoter
  • SEQ ID NO: 11 Forward primer incorporating a Kpnl restriction site 5 'to the 363 / -32 region of the human insulin promoter
  • SEQ ID NO: 12 Reverse primer incorporating a Mlul restriction site 3 'to the 363 / -32 region of the human insulin promoter

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Abstract

　インスリンを産生するヒトβ細胞の選択を効率よく行なうために、特異性が高く、転写活性の強い新規なプロモーターを提供すること。ａ）配列番号１で表わされる塩基配列の５′側に配列番号２で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、またはｂ）前記ａ）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、インスリン産生細胞においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドからなるプロモーター。

Description

明 細 書
インスリン産生細胞特異的プロモーターおよびその用途
技術分野
[0001] 本発明は、新規なインスリン産生細胞特異的プロモーターおよびその用途に関す る。
背景技術
[0002] 本邦では、糖尿病患者は増加の一途を迪つており、糖尿病が強く疑われる人が 69 0万人、その可能性を否定できない人を含めると 1 , 370万人である (1997年糖尿病 実態調査)。現在わが国で、インスリン療法施行者は約 41万人である。その内の腎不 全などの重症合併症を有する 5%の 2万人がバイオ人工勝臓の治療対象となる。また 、国民医療費の概況 (厚生省実施 1998年）によると、糖尿病患者の直接医療費が日 本で 1兆 325億円である。また、世界の糖尿病人口は現在 1億 5千万人で、 2010年 にはその数は 1. 4倍になると予測されており市場は今後ますます増加する。
[0003] インスリン投与療法では、厳格な監視下でも合併症 (失明、四肢切断、腎不全など） の発症防止は極めて困難である。そこで、生きた細胞を利用した糖尿病治療は、廃 絶した血糖降下の生理的システムを再び獲得させることができ、患者の QOLの著名 な改善 (飲食の制限、頻回な血糖測定、インスリン投与の副作用である低血糖の恐 怖力 解放）、長期合併症の予防ができる。本研究の成功は、糖尿病という慢性疾患 の完全治癒を可能とし、さらにはかって天然痘、ポリオなどの感染症に対して人類が なしえた撲滅宣言を糖尿病に対しても果たし得る大きな原動力となる。臓器移植に伴 うドナー不足の問題がなぐ万人がその恩恵を受けることができる。 2000年にアルバ ータ大学から良好な陴島移植の成績が報告され、糖尿病治療に関して膝島移植は 理想的な治療法であるとの認識が広まった。しかし提供元となる膝臓の絶対的不足 が大きな課題となっており、移植用細胞源の候補として、ヒト ES細胞、肝幹細胞、間 葉系幹細胞などのヒト由来の未分化細胞からヒト β細胞を分化誘導する研究が行わ れている（たとえば、モリトウら、 DIABETES, VOL. 2003 May 52(5): 1163_1168、ルメ ルスキー（Lumelsky)ら、 Science, 2001 May 18;292(5520)： 1389-1394、ザルツマン（Z alzman)ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003 Jun. 10; 100(12):7253_7258およびマシ マら、 J. Clin. Invest. 1996 Apr. 1;97(7): 1647_1654参照）。これらの方法によって j3 細胞が誘導される確率は、あまり高いものではなぐむしろその母集団となる未分化 細胞から誘導された少数の /3細胞を選定する操作が重要となる。
[0004] 一般的に選別前の複数のバックグラウンドを持つ細胞集団（バルタの状態）から目 的の集団を選別する場合、 1)リングクローニング法、 2)限界希釈法、 3)単一細胞選 別法、 4)抗体を用いた細胞選別法、および 5)プロモーターを用いた選別法などが用 レ、られている。し力 ながら、 1)〜3)の方法では、選別の過程において細胞を増殖さ せることを前提に選別を行なうものであり、ヒト ES細胞、間葉系幹細胞などのヒト由来 の未分化細胞は増殖能を持っているものの、分化誘導を行うと増殖能を失うためこの ような方法を適用することができなレ、。また、 4)の方法では、選別対象とする細胞集 団がその表面に特異的膜タンパク質 (レセプター類)を発現していることを前提として いる。したがって、そのような特異的レセプターを細胞表面に提示していないインスリ ン産生細胞には好適に使用することができない。
[0005] 一方、前記 5)の方法は、 目的タンパク質を発現する細胞を含む細胞集団に対して 、 目的タンパク質発現に関与するプロモーター領域とその下流にレポーター遺伝子 とを含有するプラスミドをバルタ細胞集団にトランスフエクシヨンし、レポーター遺伝子 発現陽性細胞をセルソーターや抗生剤耐性遺伝子などを用いて選別する方法であ る（たとえば、ソリア（Soria)ら、 Diabetologia (2001) 44: 407-415参照）。この方法は、ィ ンスリン産生細胞の選別に適用可能である力 S、天然のプロモーター配列をそのまま 使用した場合、インスリン産生細胞非特異的転写活性部位により特異度が落ち、より 厳密な細胞の選定を行なうことはできなレ、。そのため、より目的タンパク質特異的な 転写活性を有するプロモーター領域を同定、使用する必要があり初期実験に時間を 要する。また、特異度があってもプロモーター活性が微弱であった場合、レポーター 遺伝子等、下流に揷入された配列を充分に発現できないという問題点がある。
発明の開示
[0006] 本発明の目的は、インスリン産生細胞の選択を効率よく行なうために、特異性が高 ぐ転写活性の強い新規なプロモーターを提供することである。 [0007] 前記問題点に鑑み鋭意検討した結果、ヒトインスリンプロモーターの転写開始部位 ( + 1)の上流— 1から— 363番目の 5' フランキング領域 (配列番号 1、以下、 - 363 /一 1領域ともいう。）の^ 側に、該ー363/—1領域カら丁八丁八ボックスを含むー3 領域を削除した _ 363/_ 32領域 (配列番号 2)を挿入することにより、イン スリン産生細胞に特異性が高ぐ転写活性の強い新規プロモーターが得られることを 見出し、本発明を完成した。
[0008] すなわち、本発明は、 a)配列番号 1で表わされる塩基配列の 側に配列番号 2で 表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または
b)前記 a)のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチ ドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、インスリン産生細胞においてプロモ 一ター活性を有するポリヌクレオチド
力、らなるプロモーターに関する。
[0009] 本発明はまた、前記プロモーターを含むベクターに関する。
[0010] 前記ベクターにおいて、前記プロモーターの^ 側にレポーター遺伝子および/ま たは抗生剤耐性遺伝子が連結されていることが好ましい。
[0011] 本発明はさらに、（a)前記プロモーターの 3' 側にレポーター遺伝子および抗生剤 耐性遺伝子が連結されているベクターを、未分化細胞に導入する工程、
(b) (a)で得られたベクター含有未分化細胞をインスリン産生細胞に分化誘導するェ 程、
(c)レポーター遺伝子の発現により、インスリン産生細胞への分化を確認する工程、 および
(d)抗生剤耐性遺伝子に対応する抗生剤を添加することにより、インスリン産生細胞 を選択する工程
を含むインスリン産生細胞の選択方法に関する。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]天然のヒトインスリンプロモーターの主要転写因子の結合部位を示す図である。
[図 2]本発明のインスリン産生細胞の選別方法の一実施態様を示す図である。
[図 3]本発明のインスリン産生細胞の選別方法の一実施態様を示す図である。 [図 4]本発明のサブクローニングの一実施態様を示す図である。
[図 5]電気泳動写真である。 Mは分子量マーカーを示し、レーン:!〜 6はそれぞれ、 p GL3、 phlNS— 363/— 1 · Luc、 phlNS— 363/— 1 + (hINS— 363/— 32) X I〜 4 - Lucの制限酵素 Hindlllおよび Kpnlによる処理物を示す。
[図 6]低グノレコース条件における、各プラスミドの各細胞におけるプロモーター活性を 示すグラフである。
[図 7]高グノレコース条件における、各プラスミドの各細胞におけるプロモーター活性を 示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明のプロモーターは、 a)配列番号 1で表わされる塩基配列の^ 側に配列番 号 2で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または b)前記 a)のポリヌクレ ォチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条 件下でハイブリダィズし、インスリン産生細胞においてプロモーター活性を有するポリ ヌクレオチドである。
[0014] ここで、配列番号 1の塩基配列は、天然のヒトインスリンプロモーターの転写開始部 位（+ 1)の上流 _ 1から _ 363番目までの フランキング領域（一 363/— 1領域） を示し、 PDX1、 NeuroD、 NKX2. 2、 NKX6. 1および HNF4aといった転写因子 の結合部位と、グルコース依存性転写活性を担う C1〜A2領域を有する（図 1) (Ger manら、 J. Biol. Chem. , 1996、 Bartoov— Shifmanら、 J. Biol. Chem., 2002, Watadaら、 Pr oc. Natl. Acad. Sci.,2000、 Harringtonら、 J. Biol. Chem., 2001、 Watadaら、 J. Biol. C hem., 2000) これらの転写因子またはその組み合せは、膝臓 /3細胞特異的である。 また、配列番号 2の塩基配列は、前記配列番号 1の塩基配列力 TATAボックスを 除いた領域（_ 363/_ 32)である。
[0015] 本発明のプロモーターにはさらに配列番号 2の塩基配列がタンデムに揷入されて レ、ることが好ましい。本発明のプロモーターに含まれる配列番号 2で表される塩基配 列の数は、特に制限されるものではないが、：!〜 15が好ましぐ：!〜 4がより好ましぐ 2が最も好ましい。配列番号 1で表わされる塩基配列のみでは、プロモーター活性が 低ぐ効率的なインスリン細胞の選定を行なうことができない。また、配列番号 2で表 わされる塩基配列の数が 16以上になると、ベクターに挿入した場合に全体の分子量 が大きくなり過ぎ、細胞への導入効率が低下する傾向がある。
[0016] 本明細書において、「タンデムに挿入する」とは、同じ配列を同じ方向で繰り返し挿 入することを意味する。
[0017] 本発明のプロモーターは、一般的には PCRサブクローニング法などにより製造する こと力 Sできる。たとえば、ヒトゲノムを铸型とし PCRにより配列番号 1の塩基配列を増幅 し、適当なベクターに揷入する。つぎにこのベクターを錡型として配列番号 2の塩基 配列を増幅する。配列番号 1の塩基配列が揷入されたベクターの上流（5' 側）に任 意の数の配列番号 2の塩基配列を揷入して目的のプロモーターを製造する方法があ げられる。
[0018] したがって、本発明のプロモーターは、前記配列番号 1の塩基配列と配列番号 2の 塩基配列のほかに、これら塩基配列間に制限酵素切断部位などの付カ卩的な塩基配 列が挿入されていてもよい。また、配列番号 1および 2の塩基配列において、 TATA ボックスや、主要転写因子の結合部位以外においては、本発明のプロモーター活性 を減少させるものでない限り、数個の塩基が欠失 ·置換または挿入されているものも、 本発明のプロモーターに包含される。さらに、それらの TATAボックスや主要転写因 子の結合部位においても、 TATAボックス結合因子または転写因子の結合を妨げな い限り、数個の塩基が欠失 ·置換または挿入されているものも、本発明のプロモータ 一に包含される。
[0019] 本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリッドの形成およびその後の 洗浄における条件を意味し、ノ、イブリダィゼーシヨンを、たとえば、高イオン濃度（たと えば、 6 X SSC (1. 5M NaCl、 0. 15Mクェン酸三ナトリウムを含む溶液を 10 X SS Cとする））、 50%フオルムアミドを含む溶液中で 45°Cにてハイブリッドを形成させ、低 イオン濃度下 (例えば、 2 X SSC)で 50°Cにて洗浄するような条件や、高イオン濃度（ 例えば、 6 X SSC)溶液中で 65°Cにてハイブリッドを形成させ、低イオン濃度下（例え ば、 0. 1 X SSC)で 65°Cにて洗浄するような条件などを挙げることができる。洗浄ス テツプにおける塩濃度は、たとえば、温度を 50°Cに設定した場合、 2 X SSC (低ストリ ンジエンシーな条件）から 0. 2 X SSC (高ストリンジエンシーな条件）力、ら選択すること ができる。洗浄ステップにおける温度は、たとえば、室温 (低ストリンジエンシーな条件
)から 65°C (高ストリンジエンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、 もちろん塩濃度と温度の両方を変化させることもできる。
[0020] ハイブリダィゼーシヨンは、「モレキュラークローニング第 3版」、「カレント 'プロトコ一 ノレズ'イン'モレキュラー 'バイオロジー」、 "DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Prac tical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) "などに記載されている方 法に準じてコロニ一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法又 はサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法などを行なうことができる。
[0021] ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとしては、 NCBI ( ナショナノレ センター フォア ノ ィォテクノロジー (National Center for Biotechnology
) )—BLAST (インフォメーション ベーシック ロー力ノレ アラインメント サーチ ツー ノレ（Information Basic Local Alignment Search Tool) )などの相同性検索ソフトウェア により、デフォルト (初期設定)のパラメータを用いて計算したときに、配列番号 1で表 わされる塩基配列の 5' 側に配列番号 2で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレ ォチドと少なくとも 70%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは 80%以上 の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有するポリ ヌクレオチドを挙げることができる。
[0022] 本発明のプロモーターを組み込むベクターとしては、プラスミドベクターが好ましぐ 元ベクターの何らかのプロモーターが制限酵素処理で切り出されるものであれば、ど のようなものでも使用すること力 Sできる。また、外来遺伝子を挿入するための制限酵素 部位を複数有しているものが好ましい。そのようなベクターとしては、レポーター遺伝 子を含有し、その上流にプロモーターをもたず、複数の制限酵素認識部位を有する 、もともと任意のプロモーターのレポーターアツセィ用に調製されているベクター、たと えば、 pGL2 ベーシック ベクター（Basic vector) (プロメガ社製）、 pGL3 ベーシッ ク ベクター（プロメガ社製）、 pGL4 ベーシック ベクター（プロメガ社製)などが巿販 されており、好適に使用できる。
[0023] また、本発明のプロモーターを含有するベクターは、本発明のプロモーターの活性 を評価するために、本発明のプロモーターの:^ 側下流にレポーター遺伝子が連結 されたものであることが好ましぐ細胞へのトランスフエクシヨンを考慮すると、最終的な ベクターサイズが l OKbp程度以下であることが好ましい。
[0024] プロモーターの活性を評価する方法としては、一般的に最も現在使われている方 法がルシフェラーゼアツセィ法である。もちろん、従来より使用されている他のレポ一 ターアツセィを使用することもできる。ルシフェラーゼアツセィ法はきわめて微細な活 性をも測定でき、かつ簡単な方法であるため活性の評価という目的において好ましい
[0025] このようなレポーター遺伝子としては、該遺伝子産物の検出方法が知られているも のであれば特に限定はなぐたとえば、ルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフエニコ ールァセチルトランスフェラーゼ (CAT)遺伝子などの酵素遺伝子、緑色蛍光タンパク 質 (GFP)遺伝子および赤色蛍光タンパク質（DS-RED)遺伝子などの蛍光タンパク 質遺伝子などを使用することができる。
[0026] また、本発明のプロモーターは、インスリン産生細胞において特異的に機能するた め、インスリン産生細胞を選別するためには、 3' 側下流に抗生剤耐性遺伝子を連 結して使用することができ、さらにレポーター遺伝子と抗生剤耐性遺伝子を共に連結 して使用することが好ましい。
[0027] 本発明に使用される抗生剤耐性遺伝子としては、ノ、イダロマイシン耐性遺伝子、ネ ォマイシン耐性遺伝子、ゼォシン耐性遺伝子、ブラヂイスチジン耐性遺伝子などが有 用であり、細胞種および選別のデザインにより適切なものを適宜選択することができ る。その他、本発明のベクターには、異なる選別を行なうためにさらに他のプロモータ 一による他の耐性遺伝子を連結することも可能である。
[0028] さらには、本発明のプロモーターの下流にレポーター遺伝子と抗生剤耐性遺伝子 とを共に連結する場合、 GFPとハイグロマイシン耐性遺伝子融合遺伝子 (GFP _ Hy groR融合）または REDとハイグロマイシン耐性遺伝子融合遺伝子（DS— RED— H ygroR融合)などのレポーター遺伝子と抗生剤耐性遺伝子の融合物を連結すること もできる。このような融合物を使用することにより、インスリン産生細胞への分化誘導の 程度をレポーター遺伝子で確認し、また抗生剤を加えることによって発色しない細胞 を削除することができる。この際のレポーター遺伝子としては、蛍光顕微鏡で容易に 検出でき、色の認識がし易いことから、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク 質をコードする遺伝子が好ましレ、。
[0029] このようなレポーター遺伝子や抗生剤耐性遺伝子、またはレポーター遺伝子と抗生 剤耐性遺伝子との融合遺伝子（以下、融合遺伝子ともいう）の本発明のプロモーター への連結方法としては、当該分野で既知の様々な方法を使用することができる。たと えば、前述したようなレポーターアツセィ用ベクターを使用して本発明のプロモーター を作製した場合、該ベクターに存在するレポーター遺伝子と、連結したいレポーター 遺伝子や抗生剤耐性遺伝子、または融合遺伝子を入れ替えることができる。具体的 には、前述の PGL3 ベーシック ベクターでは、 Ncolおよび Xbalという、 2つの制限 酵素でルシフェラーゼ遺伝子を切り出すことができ、そこへ Ncolおよび Xbal切断部 位をそれぞれ付加したプライマ一^ ^ァにより目的遺伝子の〇RFを PCRで増幅し当 該制限酵素処理した挿入断片をライゲーシヨンすれば遺伝子の入れ替えができる。
[0030] 得られたベクターを細胞内に導入する方法としては、リボフヱクシヨン法、エレクト口 ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法などを使用することができる。作製したベクターの サイズが lOkbpを超える場合や、 目的細胞が ES細胞、間葉系幹細胞、骨髄細胞な どリポフエクシヨン法で入りにくい細胞の場合には、エレクト口ポレーシヨン法が好まし レ、。
[0031] 本発明のプロモーターは、インスリン産生細胞において特異的に機能するため、ィ ンスリン産生細胞の選定に使用することができる。その方法としては、たとえば、配列 番号 1で表わされる塩基配列の 5' 側に配列番号 2で表わされる塩基配列を n個含 有する本発明のプロモーター： phINS— 363/—l + (hINS— 363/— 32) X nの 上流にハイグロマイシン耐性遺伝子を融合させた緑色蛍光タンパク質 (GFP)をコー ドする遺伝子を連結したプラスミドベクター： pMNS _ 363/_ l + (MNS— 363/ - 32) X n'GFP— HygroRを構築する。ヒト ES細胞または間葉系幹細胞などの未 分化細胞を培養増殖させ、至適量の前記プラスミドをエレクト口ポレーシヨンにより導 入する。培養液を交換したのち分化誘導を行なう。前記プラスミドが導入されたインス リン産生細胞は蛍光顕微鏡下で緑色に発色するため、経時的に観察し緑色細胞の 割合および蛍光強度が最大になった時点でハイグロマイシンを培養液中に添加し、 GFP陽性細胞の選定を行い、インスリン産生細胞を得ることができる（図 2)。
[0032] プラスミドの導入が達成されなかった未分化細胞がインスリン産生細胞に分化誘導 された場合は、インスリン産生細胞であっても GFP— HygroRが発現せず、これを選 別できないことになる。したがって、インスリン産生細胞に分化誘導された細胞を効率 よく得るため、分化誘導に供する細胞をプロモーター含有プラスミドが導入されてい る細胞のみに限定することが好ましレ、。その方法としては、プラスミド: phlNS— 363
(MNS - 363/ - 32) X n ' GFP— HygroRに、 SV40プロモータードライ ブ型ネオマイシン耐性遺伝子カセットを揷入し、プラスミド: pMNS— 363/— 1 + (M NS - 363/ - 32) X n ' GFP— HygroR/SV40 ' Neoを使用することができる。こ のプラスミドを使用することにより、インスリン産生細胞への分化誘導前にプラスミドを 導入した細胞をネオマイシン処理により選別することができる (図 3)。もちろん使用す る抗生剤耐性遺伝子は、ハイグロマイシンやネオマイシン以外の前述の抗生剤耐性 遺伝子などに適宜変更することができ、レポーター遺伝子も、 GFP以外の前述の遺 伝子などに適宜変更することができる。
[0033] プラスミドを導入する至適量は、 2 X 107〜5 X 107個の細胞に対してプラスミド 2 μ g 〜20 / gが好ましい。分化誘導は、高グノレコース濃度で行なうことが好ましぐ培養期 間は 2〜6週間が好ましい。
[0034] 本発明を以下の実施例によりさらに詳述するが、本発明はこれらに限定されるもの ではない。
実施例 1
[0035] (A)ヒトインスリンプロモーターの _ 363Z 1領域の調製
ヒトインスリンプロモーターの転写開始部位（+ 1 )の上流 _ 1から _ 363番目までの 5r フランキング領域 (配列番号 1 )を、ヒト正常肺線維芽細胞株 (NHLF)より精製し たヒトゲノム l OOngを錡型とし、反応条件（94。C、 15禾少、 62. 5°C、 30禾少、 68°C、 1分 ) X 35サイクノレで、 PCR産物 1 (以下、 Xhol/ 363/—l/HindIIIとも言う）として 得た。プライマーとしては、 5' 側に Xhol切断部位を組み込んだフォワードプライマー 1 (配列番号 3)と、 3' 側に Hindlll切断部位を組み込んだリバースプライマー 1 (配列 番号 4)をヒトインスリンプロモーターの 363/—1領域の両端に設定した。 PCR反 応液の組成を表 1に示す。
フォアワードプライマー 1 :
5' - 号 3)
リバ
5r - 番号 4)
[0036] [表 1]
Figure imgf000011_0001
[0037] (B)前記 PCR産物 1のルシフェラーゼ構築物へのサブクローニング
前記 (A)で得られた PCR産物 1 (Xhol/— 363/— 1 /Hindlll)の全量を制限酵素 Xholおよび Hindlll各 10Uにて 37°Cで 16時間処理した。ルシフェラーゼ発現プラスミ ドである pGL3 ベーシック ベクター (プロメガ社製) 5 を同じ 2種の制限酵素各 15 Uにて 37°Cで 3時間処理し、クイックライゲーシヨンキット（Quick ligation kit) (M220 OS：ニューイングランドバイオラボ（New England Biolab)社製）を用いてライゲーショ ンを行なった（図 4)。ライゲーシヨンは、 50ngのベクター DNAに対しモル比で 3倍量 のインサート DNAを混和し、核酸不含水で希釈し 10 μ ΐとしたのち、キットに付属の 2 Xクイックライゲーシヨン緩衝液と 1 μ ΐのクイック T4DNAリガーゼを加えて、室温で 5 分間インキュベートして行なった。得られたライゲーシヨン産物のうち Ι μ ΐを、溶解後 3 0分間氷上においた 100 a 1のコンビテントセル (DH5a、東洋紡績株式会社製）に添 加し、 37°Cで 45秒処理したのち、 2分間氷上に静置し、ついで LB培地を 900 μ 1添 加し、 37°Cで 1時間振とう培養後、 lOO g/mlアンピシリン含有 LB寒天培地に播 種した。 37°Cで 14時間培養し、多数のコロニーを得た。複数のコロニーをピックアツ プし、同様の培地で小スケール培養を行なった後、ミニプレップキット（miniprep kit) ( キアゲン（Qiagen)社製）を用いて、そのプロトコールにしたがってプラスミドを精製し た。得られたプラスミドを Xholおよび Hindlllで処理し、 目的配列がインサートとして切 り出されることをェチジゥムブロマイド含有 1%ァガロースゲルにて電気泳動後確認し (図 5、レーン 2)、 目的のプラスミド 1 (以下、 phINS_ 363/_ l 'Lucとも言う。）を得た
(C)ヒトインスリンプロモーターの一 363/— 32領域の調製
(B)で得られたプラスミド： phINS_ 363/_ l 'Luc50ngを錡型とし、ヒトインスリンブ 口モーター領域— 363Z— 32を（1)制限酵素 Smal切断部位を付加したフォアワード プライマー 2 (配列番号 5)および Xhol切断部位を付加したリバースプライマー 2 (配列 番号 6)、（2)制限酵素 Nhel切断部位を付加したフォアワードプライマー 3 (配列番号 7)および Smal切断部位を付加したリバースプライマー 3 (配列番号 8)、（3)制限酵素 Mlul切断部位を付加したフォアワードプライマー 4 (配列番号 9)および Nhel切断部位 を付加したリバースプライマー 4 (配列番号 10)、（4)制限酵素 Kpnl切断部位を付加 したフォアワードプライマー 5 (配列番号 11)および Mlul切断部位を付加したリバース プライマー 5 (配列番号 12)を使用し、（A)と同様の方法で PCRによる増幅を行ない 、制限酵素切断部位を有する— 363/— 32領域を PCR産物 2〜5として 4種類（以 下、それぞれ、 Smal/— 363/— 32/XhoI、 Nhel/— 363/— 32/SmaI、 Mlul/ - 363/— 32/NheIおよび KpnlZ— 363Z— 32ZMluIともレ、う。）得た。
フォアワードプライマー 2:
5/ —TATCCCGGGACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG— 3' (配列番号 5) リバースプライマー 2 :
5; —ATACTCGAGTCTCAGAGCCCATCTCCCCTACCTG— 3' (配列番号 6) フォアワードプライマー 3:
5; —ATAGCTAGCACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG— 3' (配列番号 7) リバースプライマー 3 : 列番号 8)
フォアワードプライマー 4:
5; —TATACGCGTACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG— 3' (配列番号 9) リバースプライマー 4 : 番号 10)
フォアワードプライマー 5:
5; —TATGGTACCACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG 3' (配列番号 11) リバースプライマー 5 :
2)
[0039] (D)プロモーターの作製
(B)で得られたプラスミド 1： phlNS— 363/— 1 'Lucと、 (C)で得られた PCR産物 2： Smal/— 363/— 32/XhoIとを、制限酵素 Smalおよび Xholにて処理したのち、以 下（B)と同様の方法にて、ライゲーシヨンを施行し、 phlNS— 363/— l 'Lucの Smalお よび Xhol部位に— 363/— 32領域が 1つ組み込まれた目的のプラスミド 2 (phINS ( 363/— 32) X l 'Lucとも言う。）を得た。この方法を繰り返し、 phlNS— 363/— 1 •Lucの Nhelおよび Smal部位、 Mlulおよび Nhel部位、 Kpnlおよび Mlul部位に、 （C)で 得られた PCR産物 3〜5を組み込み、それぞれ、プラスミド 3〜5 (phINS— 363/— 1 + (MNS - 363/- 32) X 2〜4'Lucとも言う。）を作製した。
[0040] (E)各プロモーターの確認
各プラスミド： phlNS 363Z— 1 + (hINS - 363/— 32) X：!〜 4 'Lucをそれぞれ の長さの揷入断片を一度に切り出せる制限酵素： Hindinおよび Kpnlにて処理。 目的 配列がインサートとして切り出されることをェチジゥムブロマイド含有 1 %ァガロースゲ ノレにて電気泳動により確認した（図 5、レーン 3〜6)。
実施例 2 [0041] プロモーター活性測定
各プロモーターの活性を評価するために、レポーターアツセィを以下の通り実施し
(A)各細胞へのプラスミドの導入
表 3の各プラスミド 1〜6 (6 μ g)と、内部標準としてサイトメガロウィルスプロモーター の下流に /3—ガラタトシダーゼを連結したプラスミド： pCMV j3 -gal (6 μ g)との計 1 を、それぞれ 1. 5mlキャップ付き小チューブ（エツペンドルフ社製）内で混合し、 これにリボフヱクシヨン専用培養液 Opti_men (ギブコ（Gibco) BRL社製)を添加し、総 量を 300 とした。陰性対照としては、 pCMV j3— gal ^ z g)と pGL3ベーシックべ クタ一（6 x g)とを混合したものを使用した。一方で 14mlクリアチューブ（ファルコン（ Falcon)社製）内にリボフヱクシヨン試薬：リボフヱクチン（Lipofectin) (インビトロゲン（In vitrogen)社製）を 21 μ 1入れ、これに Opti-menを加え総量を 300 μ 1とした。 45分静 置したのち、小チューブ内の各プラスミドを培地ごとクリアチューブに加え、リボフエタ シヨン試薬と混和し、さらに 15分静置した。血清含培養液（2mMまたは 16mMの L グルコース添加ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM))を 2. 4ml添加して総量を 3. 0mlとし、よく混和してリポフエクシヨン用調製液を作成した。
[0042] リポフエクシヨンの 24時間前に播いていた表 2記載の各細胞（細胞培養用 6ゥエル プレートに各ゥエル 40万細胞個ずつ）から培養液を除いたのち、前記で得られたリポ フエクシヨン用調製液を各ゥエルに 1 · 0mlずつ計 3ゥエルに添カ卩し (実験を三重で行 なうため）、 COインキュベータに入れ、リポフエクシヨンを行なった。 5時間静置したの
2
ち培養液を更新した（2ml)。本実験を行なうのに pCMV iS -gal +各種プラスミドで計 7種類の組み合わせがあり、各細胞に対して計 24ゥヱル (6ゥヱルプレートで 4枚)が必 要であり、さらに、実験を低グルコース濃度（2mM)および高グルコース濃度（16mM )に分けるためこの倍、すなわち総計 48ゥヱル (6ゥヱルプレートで 8枚)を使用した。
[0043] 試験細胞とその由来を表 2に示す。
[0044] [表 2] 表 2
Figure imgf000015_0001
[0045] 試験プラスミドを表 3に示す。
[0046] [表 3] 表 3
Figure imgf000015_0002
[0047] (B)ルシフェラーゼアツセィ
リポフエクシヨン工程終了から 36時間後、各ゥエルの培養液を除き、これにレポータ 一細胞融解緩衝液（プロメガ社製）を 400 μ 1ずつ添加し 5分間静置したのちスクレー パーを用いて、完全に細胞を剥がした。各ゥエルより内容物をエツペンドルフ社製キ ヤップ付き 1. 5mlチューブに移し、軽く遠心して不溶解物を底に落とした。この上清 1 00 β 1と Bright-Gloルシフェラーゼアツセィ基質（プロメガ社製） 100 μ 1を混和し、ル ミノメーターを用いて発光量 (RLU)を測定した。
[0048] β—gal値測定のために、同上清 30 μ 1を 190 μ ΐの β—gal溶液（ImM MgC12、 45mM β—メルカプトエタノール、 0· 88mg/ml ONPG、 67mMリン酸ナトリウム 、 pH 7. 5)と混和し、 10分後プレートリーダーにて〇D =405nm値を測定した。各ゥ エルの RLUZ J3—gal値を測定し、陰性対照として用いた pGL3 + pCMV /3 - gal の 3ゥヱルの RLU/ /3—gal値の平均値を求め、この値を倍率（fold value) 1. 0とした ときの各ゥヱルの RLUZ j3 _ gal値を算出した。各組み合わせでの誘導倍率（Fold I nduction)： Luc (RLU) / /3—gal値からその平均、 SDを計算。解析を行なった。
[0049] 結果を図 6および 7に示す。
[0050] プラスミド 2〜6は、内肺葉以外の他胚葉由来のヒト細胞においては活性が認められ なかった（MCF7および 293T)。また内胚葉由来陴癌細胞（MIAPACA2)および a細胞由来グノレ力ゴン産生細胞（ひ TC1 )を含め、 β細胞を除く他の内胚葉由来細 胞においても同様になんら活性は認められなかった。 β細胞由来でインスリン産生細 胞である ΜΙΝ6においては、低グルコース条件において、プラスミド 1では 4. 3倍の プロモーター活性を示し、プラスミド 2〜5では漸増した（74· 4- 102. 8倍）（図 6)。 さらに、高グルコース条件においては、これらの活性はさらに増強された（図 7)。 産業上の利用可能性
[0051] 本発明のプロモーターは、インスリン産生細胞に非常に強い特異性を示し、転写活 性が高いため、たとえば、本発明のプロモーターの下流に、ルシフェラーゼ、 GFPな どのレポーター遺伝子や抗生剤耐性遺伝子などを連結させた配列を含むベクターを 使用することにより、効率のよいインスリン産生細胞の選択方法を提供できる。
[0052] さらに、本発明のプロモーターは、グルコース濃度応答性であり、高濃度グルコース 条件で培養することでより厳格にインスリンプロモーター活性を持つ細胞集団を選別 すること力 Sできる。
配列表フリーテキスト
[0053] 配列番号 3：ヒトインスリンプロモーターの— 363/— 1領域の^ 側に Xhol制限部位 を組み込んだフォワードプライマー
配列番号 4 :ヒトインスリンプロモーターの— 363/—1領域の:^ 側に Hindlll制限部 位を組み込んだリバースプライマー
配列番号 5 :ヒトインスリンプロモーターの 363/— 32領域の^ 側に Smal制限部 位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号 6 :ヒトインスリンプロモーターの— 363/— 32領域の:^ 側に Xhol制限部 位を組み込んだリバースプライマー
配列番号 7 :ヒトインスリンプロモーターの— 363/_ 32領域の 5' 側に Nhel制限部 位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号 8 :ヒトインスリンプロモーターの— 363/— 32領域の:^ 側に Smal制限部 位を組み込んだリバースプライマー
配列番号 9 :ヒトインスリンプロモーターの— 363/_ 32領域の 5' 側に Mlul制限部 位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号 10 :ヒトインスリンプロモーターの— 363/— 32領域の^ 側に Nhel制限部 位を組み込んだリバースプライマー
配列番号 11：ヒトインスリンプロモーターの 363/— 32領域の 5' 側に Kpnl制限 部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号 12 :ヒトインスリンプロモーターの 363/— 32領域の 3' 側に Mlul制限部 位を組み込んだリバースプライマー

Claims

請求の範囲
[1] a)配列番号 1で表わされる塩基配列の 5' 側に配列番号 2で表わされる塩基配列 を含有するポリヌクレオチド、または
b)前記 a)のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチ ドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、インスリン産生細胞においてプロモ 一ター活性を有するポリヌクレオチド
からなるプロモーター。
[2] 請求の範囲第 1項記載のプロモーターを含むベクター。
[3] 請求の範囲第 1項記載のプロモーターの 3' 側にレポーター遺伝子および/また は抗生剤耐性遺伝子が連結されている請求の範囲第 2項記載のベクター。
[4] (a)請求の範囲第 1記項載のプロモーターの 3' 側にレポーター遺伝子および抗 生剤耐性遺伝子が連結されているベクターを、未分化細胞に導入する工程、
(b) (a)で得られたベクター含有未分化細胞をインスリン産生細胞に分化誘導するェ 程、
(c)レポーター遺伝子の発現により、インスリン産生細胞への分化を確認する工程、 および
(d)抗生剤耐性遺伝子に対応する抗生剤を添加することにより、インスリン産生細胞 を選択する工程
を含むインスリン産生細胞の選択方法。
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