WO2006069676A1 - Hydroxypyridinon-derivate, deren metallkomplexe und deren verwendung zur herstellung von konjugaten mit biomolekülen - Google Patents

Hydroxypyridinon-derivate, deren metallkomplexe und deren verwendung zur herstellung von konjugaten mit biomolekülen Download PDF

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Heribert Schmitt-Willich
Heiko Schirmer
Johannes Platzek
Stephane Dumas
Vincent Jacques
Thomas Brumby
Detlev Sülzle
Bernd Misselwitz
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Schering Ag
Epix Pharmaceuticals Inc.
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    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
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    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings

Definitions

  • the invention relates to the subject matter characterized in the claims, i. Hydroxypyridinone derivatives, their metal complexes and their use for the preparation of conjugates with biomolecules.
  • the conjugates are suitable for the production of contrast agents for NMR diagnosis.
  • Precondition for a targeted and successful therapy is an exact diagnosis.
  • the possibilities have increased very much in recent years, for example, the NMR diagnostics is able to represent virtually any anatomical detail selectively and with great accuracy.
  • the corresponding structures are only visible through the use of contrast agents.
  • contrast agents for NMR diagnosis chelate complexes of paramagnetic metals are suitable.
  • gadolinium (III) chelates as NMR contrast agents are reviewed in a review by P. Caravan et al. in Chem. Rev. 1999, 99, 2293-2352.
  • the image intensity in proton NMR is essentially determined by the water protons. It depends on the core relaxation times. Complexes of paramagnetic transition metals and lanthanides shorten the relaxation times of adjacent protons through dipolar interactions.
  • the paramagnetic contrast agents are not detected directly, but indirect detection is performed based on the fact that the contrast agents can alter relaxation times of adjacent protons such as water protons. Due to their high magnetic moments and relaxation efficiency, Gd 3+ , Fe 3+ and Mn 2+ are preferred paramagnetic metal cations in NMR diagnostics.
  • Tissues with short relaxation times T 1 generally give higher intensity images than those with longer relaxation times. If one applies the reciprocal of the measured relaxation time T 1 as a function of the concentration c for a particular paramagnetic compound, one obtains lines of slope R. This slope is also called relaxivity, which is a measure of the property of the corresponding paramagnetic ion To shorten the relaxation time of the neighboring protons.
  • the required ions are usually not administered in the form of water-soluble salts, but in the form of chelate complexes. These can be excreted practically unchanged by the body.
  • the smaller the complexes in solution the lower their moment of inertia and the faster they turn into solution (tumbling motion time).
  • the faster a complex rotates the lower its relaxivity.
  • the relaxivity thus increases with the molecular mass of the entire complex. High molecular mass can be achieved by binding to macromolecules.
  • a good NMR contrast agent is characterized, inter alia, by the fact that it has a large value for the relaxivity.
  • Gd-DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid conjugates with albumin
  • Conjugates of macrocyclic metal complexes and biomolecules are disclosed in WO 95/31444.
  • WO 01/08712 proposes a contrast agent which at least two metal chelate moieties as image-enhancing groups and at least two "target binding moieties" for binding the contrast agent molecule to the desired target molecule or organ in the body.
  • Tetraazacyclododecantetraacetic acid derivatives of high stability and good solubility due to lack of charge, which are suitable for attachment to biomolecules, are described in EP-A-0 565 930.
  • NMR contrast agents should have as high a relaxivity as possible
  • these contrast agents have their NMRD maximum in a range which is best suited for use with clinical NMR diagnostic equipment.
  • Currently used clinical NMR diagnostic devices usually operate at 60 MHz.
  • the NMRD maximum of known NMR contrast agents is generally about 20 MHz at most. There is thus a need for NMR contrast agents with a high field shifted NMRD maximum.
  • ligands suitable for preparing NMR contrast media is described by SM Cohen, et al. in Inorg. Chem. 2000, 39, 5747-5756 and in US 5,624,901. These are hydroxypyridinone derivatives, but they are not suitable for binding to biomolecules. Hydroxypyridinone and hydroxypyrimidone chelating agents and their gadolinium (III) complexes are also described in WO 03/016923. Some of these compounds have high relaxivities, but the metal content per molecule of the compounds is low due to their high molecular weight. This leads to the fact that high absolute doses have to be injected in comparison to the compounds according to the invention.
  • Gadolinium (III) complexes are based Hydroxypyridinone and terephthalamide KN Raymond in Abstracts of Papers, 227 ACS National Meeting, Anaheim, CA, United States, March 28-m April 1, 2004 (2004) and KN Raymond et al. in Abstracts of Papers, 228h ACS National Meeting, Philadelphia, PA, United States, August 22-26, 2004 (2004). Also in Abstracts of Papers, 227 th ACS National Meeting, Anaheim, CA, United States, March 28-April 1, 2004 (2004), DG Churchill et al.
  • CAM catecholamide
  • TAM terephthalamide
  • HOPO hydroxypyridone
  • HPY hydroxypyrimidone
  • MK Thompson et al. describe lanthanide complexes with tripodal hydroxypyridonate (HOPO) -based ligands
  • EJ. Werner et al. describe hydroxypyridinone (HOPO) -based Gd (III) complexes with high stability.
  • thermodynamic stability of Gd (III) complexes with pentadentate ligands including 2,3-dihydroxyterephthalamide and 2,3-hydroxypyridonate chelating moieties are described by G. Xu et al. in Inorg. Chem. 2004, 43 (18), 5492-4.
  • chelating agents are suitable for attachment to biomolecules, inter alia, the connection by means of a reactive group is in a side chain of the hydroxypyridinone or hydroxypyrimidone chelator.
  • the immediate proximity between the coordinating oxygen atoms of the chelating agent and the reactive group intended for attachment to a biomolecule requires that the chelator be attached to the biomolecule prior to complex formation with the gadolinium ion, for example complexation between the gadolinium ion and the reactive group to avoid formation of particularly stable 5-rings.
  • Conjugates with particularly sensitive biomolecules such as antibodies can thus be produced with the chelators known from WO 03/016923 or only with great effort.
  • these NMR contrast agents should have the highest possible relaxivity, as selectively as possible to accumulate at a desired location in the body and have an NMRD maximum, which is particularly suitable for the use of the agent together with clinical NMR diagnostic equipment.
  • the NMR contrast agents should have a good solubility in water, the specificity of the biomolecules should not be impaired by the binding of the chelators and the conjugates should be just as compatible as the unconjugated biomolecules.
  • the stability of the conjugates should be as high as possible.
  • the attachment of the ligand via the linker allows the complex with the metal ion to be coordinated to be ligated to the biomolecule without the risk of side reaction and undesirable coordination for the reaction provided with the biomolecule reactive group.
  • the finished complex can then be attached under mild reaction conditions to sensitive biomolecules such as antibodies.
  • the present invention thus relates to compounds of general formula I: (K) 3 -AUX
  • Z represents a hydrogen atom or a metal ion equivalent
  • R 1 is a hydrogen atom or a straight-chain or branched, saturated or unsaturated Ci-i O alkyl group, optionally substituted with 1-3 oxygen atoms, 1-3
  • Nitrogen atoms and / or 1-3 -NR 3 radicals is interrupted, optionally with 1-4
  • 1-2 halogen atoms is substituted and / or in which optionally 1-2 carbon atoms are present as carbonyl groups, wherein the alkyl radical or a part of the alkyl radical may be configured annularly,
  • R 2 is hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated Ci-i O alkyl optionally substituted with 1 -3 oxygen atoms, 1-3
  • Nitrogen atoms and / or 1-3 -NR 3 radicals is interrupted, optionally with 1-2
  • Halogen atoms is substituted and / or in which optionally 1-2 carbon atoms as
  • Carbonyl groups are present, wherein the alkyl radical or a part of the alkyl radical may be ring-shaped, -COOH, halogen, -CONR 3 R 4 , -SO 3 H or -PO 3 H 2 ,
  • R 3 and R 4 independently of one another represent a hydrogen atom or a straight-chain, branched or cyclic, saturated or unsaturated C 1-6 -alkyl radical which is optionally substituted by 1-4-hydroxy groups or interrupted by 1-2 oxygen atoms,
  • W 1 and W 2 independently of one another represent a radical R 1 or -CONR 3 R 4 ,
  • alkyl radical or “alkylene radical” herein is understood as meaning a saturated or unsaturated, straight-chain or branched or cyclic alkyl radical having the stated number of carbon atoms. If this group may contain or may be interrupted by other groups or atoms, it is understood that the other groups or atoms may be in addition to the already existing atoms of the group and may be inserted at any position of the group including the terminal positions.
  • aryl is preferably meant phenyl, biphenyl, pyridyl, furanyl, pyrrolyl and imidazolyl. Particularly preferred are phenyl and pyridyl.
  • the compounds of the formula I according to the invention comprise three hydroxypyridinone, hydroxypyrimidone and / or catechol radicals. These residues contribute to the coordination or charge balance of a coordinated metal ion. Therefore, Z is either a hydrogen atom or a metal ion equivalent.
  • the hydroxypyridinone or hydroxypyrimidone radical which may stand for K in the general formula I, carries a substituent R 1 which represents a hydrogen atom or a straight-chain or branched, saturated or unsaturated d-io-alkyl radical which optionally has 1-3 oxygen atoms , 1-3 nitrogen atoms and / or 1-3 -NR 3 radicals is interrupted, optionally with 1-4 hydroxy groups, 1-2 carboxyl (which may be present in protected form), 1-2 -SO 3 H- the optionally present in protected form), 1-2 -PO 3 H 2 groups and / or 1-2 halogen atoms is substituted and / or in which optionally 1-2 carbon atoms are present as carbonyl groups, wherein the alkyl radical or a part of the alkyl group ring configured can be.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a straight-chain or branched, saturated or unsaturated d-io-alkyl radical which optionally has 1-3 oxygen atoms
  • R 1 is a hydrogen atom or a straight-chain or branched, preferably straight-chain Ci. 5 alkyl radical which may be interrupted with 1-2 oxygen atoms and / or substituted 1-4 hydroxy groups, a carboxyl group and / or a group -SO 3 H.
  • R 1 are -H, -CH 3 , -CH 2 -CH 3 , -CH 2 -CH 2 -CH 3 , -CH (CH 3 ) -CH 3 , -C (CH 3 ) (CH 3 ) -CH 3 , -CH 2 -OH, -CH 2 -CH 2 -OH, -CH 2 -CH 2 -O-CH 3 , -CH 2 -COOH, -CH 2 -COOt-BUt, -CH 2 -COOCH 2 C 6 H 5, -CH 2 -CH 2 -SO 3 H, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -SO 3 H, - CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -SO 3 H, -CH 2 -CH (OH) -CH 2 -OH, -CH 2 -CH 2 -O-CH 2 -CH 3 , -CH 2 -CH 2 -O-CH 3 , -CH 2
  • W 1 and W 2 independently represent a radical R 1 , wherein R 1 is as defined above and also includes the above preferred radicals.
  • W 1 and W 2 are independently a hydrogen atom or a straight-chain or branched, preferably straight-chain Ci. 5 alkyl, in particular a hydrogen atom or a methyl radical.
  • W 1 and W 2 may be a hydrogen atom and the other of W 1 and W 2 may be a methyl radical, or W 1 and W 2 may both be a hydrogen atom.
  • the catechol radical which may alternatively be K in formula I, bears a substituent R 2 .
  • This may be a hydrogen atom, a straight-chain or branched, saturated or unsaturated d-io-alkyl radical which is optionally interrupted by 1-3 oxygen atoms, 1-3 nitrogen atoms and / or 1-3 -NR 3 radicals, optionally with 1-2 Substituted hydroxy groups, 1-2 carboxyl, 1-2 -SO 3 H, 1-2 -PO 3 H 2 groups and / or 1-2 halogen atoms and / or in which optionally 1-2 carbon atoms are present as carbonyl groups, wherein the alkyl radical or a part of the alkyl radical may be ring-shaped, -COOH, halogen, -CONR 3 R 4 , -SO 3 H or -PO 3 H 2 represent.
  • Preferred alkyl radicals as well as substituted and hetoatom interrupted alkyl radicals for R 2 are those as described above for R 1 . Suitable halogens are fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • R 3 and R 4 independently of one another represent a hydrogen atom or a straight-chain, branched or cyclic, saturated or unsaturated C 1-6 -alkyl radical which is optionally substituted by 1 to 2 hydroxyl groups.
  • Ci. 6- Alkyl radicals for R 3 and R 4 are especially methyl, ethyl, propyl, iso-propyl, n-butyl, iso-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, cyclohexyl, 2-hydroxyethyl and -CH [CH 2 - O-CH- (CH 2 -OH) 2 ] 2
  • the three hydroxypyridinone, hydroxypyrimidone and / or catechol radicals of the compounds of general formula I serve to coordinate a metal ion.
  • the three complex-forming radicals K of the compounds according to the invention are held together by a central tetravalent radical A (linker), so that a polydentate ligand is provided.
  • this central residue A not only links the three coordinating residues K to each other but additionally to them with a group X which can react with a biomolecule so that the compounds of the invention can be linked to a biomolecule to form a conjugate.
  • A is a radical
  • the compounds according to the invention can be bound to a biomolecule via a spacer U by means of a group X which can react with a biomolecule.
  • 6- alkyl groups (wherein the alkyl radical is straight-chain, branched or cyclic, saturated or unsaturated) is substituted and / or in which optionally 1-3 carbon atoms are present as carbonyl groups, wherein the alkylene radical or a part of the alkylene radical may be configured annular.
  • R 3 is herein defined as above.
  • Preferred alkyl and aryl groups are also defined as above.
  • U represents a phenylene or cyclohexylene radical or a straight-chain or branched, saturated C 1-6 -alkylene radical which is substituted by an oxygen atom, an -NR 3 radical, one or two amide radicals and / or a phenylene radical may be interrupted and in which one or two carbon atoms (s) may be present as the carbonyl group (s).
  • U may be selected from the group consisting of -CH 2 -CH 2 -, -CH 2 -CH 2 -CO-NH-CH 2 -CH 2 -, -CH 2 -CO-NH-CH 2 -, -CH (CHa) -CO-NH-CH 2 -CO-NH-CH 2 -CH 2 -, -CH 2 -phenylene-, -phenylene-, -cyclohexylene-, -CH 2 -phenylene-O-CH 2 -, -CHz-phenylene-O-CHa-CO-NH-CHg-CHs, -phenylene-O-CH 2 -, -CO-phenylene-,
  • a group X is attached to the radical A of the formula I.
  • This group X is a group that can react with a biomolecule.
  • carboxyl (-COOH), activated carboxyl, amino (-NH 2 ), isocyanate (-NCO), isothiocyanate (-NCS), hydrazine (-NHNH 2 ), semicarbazide (-NHCONHNH 2 ), thiosemicarbazide (-NHCSNHNH 2 ), chloroacetamide (-NHCOCH 2 Cl), bromoacetamide (-NHCOCH 2 Br), iodoacetamide (-NHCOCH 2 I), acylamino such as acetylamino (-NHCOCH 3 ), mixed anhydrides, azide, hydroxide, sulfonyl chloride, carbodiimide, pyridyl -CH CH 2 or a group of the formulas
  • Hal represents a halogen atom
  • activated carboxyl group are meant above those carboxyl groups which are derivatized so as to facilitate the reaction with a biomolecule. Which groups can be used for activation is known and reference can be made, for example, to M. and A. Bodanszky, "The Practice of Peptide Synthesis", Springerverlag 1984. Examples are adducts of the carboxylic acid with carbodiimides or activated esters such as hydroxybenzotriazole. Most preferably, the activated carboxyl group for X is selected from
  • Z represents a hydrogen atom or a metal ion equivalent.
  • Which metal ion is to be complexed in the compound according to the invention depends on the intended use of the conjugates prepared with the compounds according to the invention with a biomolecule.
  • Corresponding conjugates are suitable, for example, for NMR diagnosis.
  • the conjugates are particularly preferably used in NMR diagnosis as contrast agents.
  • the preparation of complexes for NMR diagnosis can be carried out in the manner disclosed in patents EP 71564, EP 130934 and DE-OS 34 01 052.
  • the metal oxide or a metal salt for example a chloride, nitrate, acetate, carbonate or sulfate
  • a lower alcohol such as methanol, ethanol or isopropanol
  • another organic solvent such as THF, pyridine, etc.
  • the complexing agent is dissolved in methanol / THF and a solution of the metal salt in methanol / THF is added dropwise to the complexing agent solution. Subsequently, pyridine is added and heated under reflux. The precipitated complex is centrifuged off and washed with methanol / THF.
  • the compounds according to the invention are used for NMR diagnosis in the form of their complexes with the ions of the paramagnetic elements having atomic numbers 21-29, 42, 44 and 58-70.
  • suitable ions are the chromium (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II), copper (II), praseodymium (III), neodymium (III), samarium (III) and ytterbium (III) ion. Because of their strong magnetic moment are for NMR diagnosis particularly preferably the gadolinium (III), manganese (II) and iron (III) ions.
  • the compounds according to the invention and in particular their conjugates with biomolecules fulfill the diverse requirements for suitability as contrast agents for magnetic resonance imaging.
  • they are ideally suited to improve after oral or parenteral administration by increasing the signal intensity of the image obtained using the magnetic resonance imaging in its validity.
  • they show the high potency necessary to burden the body with the least possible amounts of foreign matter and the good compatibility needed to maintain the noninvasive nature of the studies.
  • the complex compounds according to the invention can be used advantageously as susceptibility reagents and as shift reagents for in vivo NMR spectroscopy.
  • inorganic bases e.g., hydroxides, carbonates or bicarbonates
  • inorganic bases e.g. Sodium, potassium, lithium, magnesium or calcium
  • organic bases such as, but not limited to, primary, secondary and tertiary amines, e.g. Ethanolamine, morpholine, pyridine, glucamine, N-methyl and N, N-dimethylglucamine, as well as basic amino acids, e.g. Lysine, arginine and ornithine or amides original neutral or acidic amino acids.
  • the neutral complex compounds it is possible to add, for example, in acidic complex salts in aqueous solution or suspension, so much of the desired base that the neutral point is reached.
  • the resulting solution can then be concentrated to dryness in vacuo.
  • the neutral salts formed by the addition of water-miscible solvents such as lower alcohols (methanol, ethanol, isopropanol and others), lower ketones (acetone and others) and / or polar ethers (tetrahydrofuran (THF), dioxane , 1, 2-dimethoxyethane and others) to precipitate and thus easy to isolate and easy to clean crystals.
  • water-miscible solvents such as lower alcohols (methanol, ethanol, isopropanol and others), lower ketones (acetone and others) and / or polar ethers (tetrahydrofuran (THF), dioxane , 1, 2-dimethoxyethane and others)
  • the compounds of the formula I according to the invention can be prepared by processes known to the person skilled in the art.
  • the compounds of formula I can be obtained by a process wherein a compound of formula II
  • U and X are as defined above and A 'is the precursor to the tetravalent A radical is reacted with Nu-K, where K is as defined above, K and X are optionally in their protected form and Nu is a nucleofug, thereafter the optional protective groups are removed and, if desired, reacted in a manner known per se with at least one metal oxide or metal salt of a desired element and optionally subsequently in the resulting complexes remaining acidic hydrogen atoms wholly or partly by cations of inorganic and / or organic bases, Amino acids or amino acid amides substituted.
  • the nucleofug for example, are the radicals:
  • the reaction is carried out, for example, in a mixture of water and organic solvents such as: isopropanol, ethanol, methanol, butanol, dioxane, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, formamide or dichloromethane.
  • organic solvents such as: isopropanol, ethanol, methanol, butanol, dioxane, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, formamide or dichloromethane.
  • Ternary mixtures of water, isopropanol and dichloromethane are preferred.
  • the reaction is carried out in a temperature range between -1O 0 C and 100 0 C, preferably between 0 0 C and 30 0 C.
  • Suitable acid protecting groups are C 1 -C 6 -alkyl, C 6 -C 10 -n / and C 6 -C 10 -aryl (C 1 -C 4 ) -alkyl groups and also trialkylsilyl groups.
  • the methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, i-butyl and tert-butyl groups are preferred.
  • the cleavage of these acid protecting groups is carried out by the methods known in the art, for example by hydrolysis, hydrogenolysis, alkaline saponification of the esters with alkali in aqueous-alcoholic solution at temperatures of 0 to 50 c C, acid saponification with mineral acids or in the case of tert-butyl esters Help of trifluoroacetic acid.
  • the NH groups can be protected in a variety of ways and released again.
  • the N-trifluoroacetyl derivative is dissolved in water by potassium or sodium carbonate (H. Newman, J. Org. Chem., 30: 287 (1965), MA Schwartz et al., J. Am. Chem. Soc., 95 G12 (1973). ) or simply cleaved by ammonia solution (M. Imazama and F. Eckstein, J. Org. Chem., 44: 2039 (1979)).
  • the tert-butyloxycarbonyl derivative is also mildly cleavable: stirring with trifluoroacetic acid is sufficient (BF Lundt et al., J. Org.
  • the group of hydrogenolytic or reducing NH protecting groups is very large:
  • the N-benzyl group is conveniently cleaved with hydrogen / Pd-C (WH Hardening and R. Rimonoff, Org. Reactions VII, 262 (1953)) also for the trityl group (L. Zervas et al., J. Am. Chem. Soc., 78: 1359 (1956)) and the benzyloxycarbonyl group (M. Bergmann and L. Zervas Ber. 65: 1192 (1932)) ,
  • esters of the compounds described above are prepared as known to those skilled in the art.
  • isothiocyanates or ⁇ -haloacetates the corresponding terminal amine precursors are reacted by methods known from the literature with thiophosgene or 2-haloacetic acid halides.
  • reaction with appropriately derivatized esters of N-hydroxysuccinimide such as:
  • Nu-K is preferably first synthesized independently.
  • the molecule contains an amide group, it is prepared by reacting an activated carboxylic acid with an amine. The activation of the carboxylic acid is carried out by the usual methods.
  • activating reagents are dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), benzotriazole 1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP) and 0- (benzotriazole-1 -yl) -1, 1, 3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), preferably DCC.
  • O-nucleophilic catalysts such as N-hydroxysuccinimide (NHS) or N-hydroxybenzotriazole is possible.
  • group X is a carboxylic acid function
  • this can be used in protected form (for example in the form of the benzyl ester), the deprotection can then be carried out by hydrogenolysis.
  • Activated esters are preferably generated intermediately, which are then attacked by a nucleophilic group of the biomolecule. In this way, a covalent linkage between the biomolecule and the compound of the formula I according to the invention is formed.
  • Preferred activated esters are the esters of N-hydroxysuccinimide, the esters of paranitrophenol or the esters of pentafluorophenol. If the group X is to be linked to the biomolecule in the form of an isothiocyanate, preference is given to first using a terminal amine which, if necessary, may be provided with a suitable protective group.
  • Suitable protecting groups are known from peptide chemistry. After cleavage of the protective group, the isothiocyanate can be produced by reaction of the primary terminal amine with thiophosgene. At this nucleophilic groups of the biomolecule can be added.
  • the group X represents a maleimide which, for example, can react selectively with thiol functions of the biomolecule.
  • the group X is a nucleophile (NH 2 , SH) which acts on a suitable functionality of the biomolecule (activated ester, maleimide, etc.). Numerous maleinimide functionalized biomolecules are commercially available.
  • the present invention further relates to the use of the above-described compounds of the formula I for the preparation of conjugates with a biomolecule.
  • the synthesis of the conjugates is usually carried out in such a way that first a derivatized and functionalized chelate complex is generated, which is then linked to the biomolecule.
  • the chelate complex according to the invention is incorporated during the synthesis of the biomolecule in this. This can be done, for example, during the sequential synthesis of oligopeptides on the synthesis robot.
  • the usual in the synthesis of the corresponding biomolecule protecting groups can be introduced into the compound of the invention. These are then split off again in the course of the usual synthesis algorithms on the synthesizer.
  • biomolecule is understood to mean any molecule which either naturally occurs, for example, in the body or has been prepared synthetically with an analogous structure.
  • these are understood to mean those molecules which can interact with a biologically occurring, for example, in the body molecule or a structure occurring there, so that, for example, accumulate the conjugates at certain desired locations of the body.
  • body is understood to mean any plant or animal body, animal and especially human bodies being preferred.
  • Biomolecules are, in particular, the molecules occurring in living beings, which, as products of evolutionary selection through ordered and complex interaction, perform specific tasks for the organism and form the basis of its vital functions (metabolism and form change, reproduction, energy balance).
  • larger molecules proteins, nucleic acids, polysaccharides, lipids, etc.
  • Corresponding macromolecules are also referred to as biopolymers.
  • the biomolecule can advantageously have a polypeptide backbone of amino acids with side chains which can react with the reactive group X of the compounds of the formula I according to the invention.
  • Such side chains include, for example, the carboxyl groups of aspartic and glutamic acid residues, the amino groups of lysine residues, the aromatic groups of tyrosine and histidine residues, and the sulfhydryl groups of cysteine residues.
  • biomolecules are particularly suitable for the formation of conjugates with the compounds according to the invention:
  • Biopolymers proteins, such as proteins that have a biological function, HSA, BSA, etc., proteins and peptides that accumulate in certain places in the organism (eg at receptors, cell membranes, channels, etc.), peptides that can be cleaved by proteases, peptides with synthetic breaking points (eg labile esters, amides, etc.), peptides cleaved by metalloproteases, peptides with photocleavable linkers, peptides with oxidative (oxidase) cleavable groups, peptides with natural and unnatural amino acids, glycoproteins (glycopeptides), signaling Proteins, antiviral proteins and apoptosis, synthetically modified biopolymers such as linker-derivatized biopolymers, modified metalloproteases and derivatized oxidase, etc., carbohydrates (mono- to polysaccharides), such as derivatized sugars, organocleavable
  • biomolecules are commercially available, for example, from Merck, Aldrich, Sigma, Calbiochem or Bachern.
  • the number of compounds of formula I per biomolecule according to the invention is in principle arbitrary, but is preferably a molecular ratio of 0.1: 1 to 10: 1, in particular from 0.5: 1 to 2: 1.
  • the compounds according to the invention are suitable for conjugation to all those molecules which are reacted with fluorescent dyes in the prior art for example, to determine their localization by epifluorescence microscopy within the cell.
  • the compounds can be conjugated with any drugs in principle, and then after administration of the drug to track the transport within the organism by the NMR technique.
  • the conjugates of the compounds according to the invention and the biomolecules contain further additional molecules which have been conjugated to the biomolecules.
  • biomolecule in the sense of the invention therefore includes all molecules which occur in biological systems and all molecules which are biocompatible.
  • the conjugates obtained with the compounds according to the invention are preferably used as contrast agents in NMR diagnosis. Therefore, the conjugates should be water soluble.
  • the conjugates obtained with the compounds of the invention are to be used as NMR contrast agents, they are preferably dosed in an amount of 0.0001-5 mmol / kg body weight and more preferably in an amount of 0.005-0.5 mmol / kg body weight. Details of the application are e.g. in H. -J. Weinmann et al., Am. J. of Roentgenology 142, 619 (1984). Due to the surprisingly high relaxivity of the compounds according to the invention with simultaneous target specificity of the conjugates obtained with these compounds, they can be dosed particularly low, for example for the detection of tumors.
  • the compounds according to the invention are distinguished in particular by the fact that they possess the highest relaxivities hitherto described for metal complex conjugates in the immobilized state. This is particularly important since the conjugates are used as NMR contrast agents for sometimes very specific biomolecules whose steady state concentration in the target tissue is extremely low. In addition, the conjugates of the present invention exhibit increased relaxivities at high field strengths in the range of 60 MHz, making them particularly suitable for use with equipment used in clinics.
  • the conjugates also show good water solubility and the specificity of the biomolecule is not affected by the conjugate.
  • the metal complex conjugates are generally as compatible as the unconjugated biomolecule.
  • the stability of the conjugates is very high, so that solutions or freeze-dried products can be stored for a longer time without loss of activity.
  • the complexes have high complex stability which ensures that no toxic metal is released in vivo. This is particularly important because the residence time of such compounds in the tissue can be more than 24 hours.
  • reaction mixture is extracted with 100 ml of 1 N sodium hydroxide solution and with 100 ml of saturated sodium chloride solution, the organic phase is dried with sodium sulfate, evaporated to dryness and chromatographed on silica gel (methylene chloride / methanol 20: 1). The fractions containing the product are combined and evaporated. Yield: 14.5 g (83% of theory)
  • reaction mixture is extracted with 100 ml of 1N sodium hydroxide solution and with 100 ml of saturated sodium chloride solution, the organic phase dried with sodium sulfate, evaporated to dryness and chromatographed on silica gel (methylene chloride / methanol 20: 1). The fractions containing the product are combined and evaporated. Yield: 18.4 g (84% of theory)
  • reaction mixture is extracted with 100 ml of 1 N sodium hydroxide solution and with 100 ml of saturated sodium chloride solution, the organic phase dried with sodium sulfate, evaporated to dryness and chromatographed on silica gel (methylene chloride / methanol 20: 1). The fractions containing the product are combined and evaporated. Yield: 13.7 g (85% of theory)
  • reaction mixture is mixed with 300 ml of water, twice extracted with 250 ml of ethyl acetate, the organic phase dried with sodium sulfate, evaporated to dryness and chromatographed on silica gel (ethyl acetate / hexane 1: 3). The fractions containing the product are combined and evaporated. Yield: 35.7 g (90% of theory)
  • the reaction mixture is extracted twice with 100 ml of ice-water each time and the organic phase is dried with sodium sulfate.
  • the crude product is now at -20 0 C to a solution of 18:57 g (50 mmol) N, N "-di-Z-diethylenetriamine (Fluka) 12.9 g, and (100 mmol) Ethyldiisopropylamin added dropwise in 200 mL of methylene chloride and stirred at -20 0 C for 6 h.
  • the mixture is then stirred for a further 24 h at room temperature.
  • the reaction mixture is extracted twice with 150 ml of water, the organic phase dried with sodium sulfate, evaporated to dryness and chromatographed on silica gel
  • reaction mixture is extracted with 100 ml of 1N sodium hydroxide solution and with 100 ml of saturated sodium chloride solution, the organic phase dried with sodium sulfate, to dryness evaporated and chromatographed on silica gel (methylene chloride / methanol 20: 1). The fractions containing the product are combined and evaporated. Yield: 14.6 g (83% of theory)
  • reaction mixture is extracted with 100 ml of 1 N sodium hydroxide solution and with 100 ml of saturated sodium chloride solution, the organic phase dried with sodium sulfate, evaporated to dryness and chromatographed on silica gel (methylene chloride / methanol 20: 1). The fractions containing the product are combined and evaporated. Yield: 13.2 g (84% of theory)
  • reaction mixture is extracted with 100 ml of 1 N sodium hydroxide solution and with 100 ml of saturated sodium chloride solution, the organic phase dried with sodium sulfate, evaporated to dryness and chromatographed on silica gel (methylene chloride / methanol 10: 1). The fractions containing the product are combined and evaporated. Yield: 4.4 g (42% of theory)
  • reaction mixture is extracted with 100 ml of 1 N sodium hydroxide solution and with 100 ml of saturated sodium chloride solution, the organic phase dried with sodium sulfate, evaporated to dryness and chromatographed on silica gel (methylene chloride / methanol 10: 1). The fractions containing the product are combined and evaporated. Yield: 5.7 g (89% of theory)
  • reaction mixture is extracted with 100 ml of 1 N sodium hydroxide solution and with 100 ml of saturated sodium chloride solution, the organic phase dried with sodium sulfate, evaporated to dryness and chromatographed on silica gel (methylene chloride / methanol 10: 1). The fractions containing the product are combined and evaporated. Yield: 4.9 g (47% of theory)
  • Examples 23-52 describe metal complex conjugates of the gadolinium complexes described above with biomolecules.
  • the conjugates were prepared according to the following general procedures IV. The results are summarized in Table 1.
  • AAV stands for general working instruction
  • ACTH for adrenocorticotropic hormone
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • RP-18 refers to a reversed phase stationary chromatography phase.
  • the number of complexes per biomolecule was determined by inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP).
  • the comparative substance used was a conjugate of the following formula (1: 1 complex):
  • T1 relaxivities 40.6 at 20 MHz and 21, 7 at 60 MHz were measured.
  • the T1 relaxivities of the conjugates according to the invention are higher at 60 MHz than at 20 MHz 1 as can be seen from Table 1 above.
  • the conjugates of the invention thus have a higher relaxivity at higher field, so that they are particularly suitable for use in conjunction with clinical NMR diagnostic devices.

Abstract

Die Erfindung betrifft Hydroxypyridinon-Derivate, deren Metallkomplexe, deren Herstellung und deren Verwendung zur Herstellung von Konjugaten mit Biomolekülen. Die Konjugate eignen sich als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik. Durch eine spezielle Ausgestaltung der Liganden wird eine hohe Relaxivität erreicht und das NMRD-Maximum angehoben.

Description

Hydroxypyridinon-Derivate, deren Metallkomplexe und deren Verwendung zur Herstellung von Konjugaten mit Biomolekülen
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, d.h. Hydroxypyridinon-Derivate, deren Metallkomplexe sowie deren Verwendung zur Herstellung von Konjugaten mit Biomolekülen. Die Konjugate eignen sich für die Herstellung von Kontrastmitteln für die NMR-Diagnostik.
Voraussetzung für eine gezielte und erfolgreiche Therapie ist eine exakte Diagnose. Gerade auf dem diagnostischen Gebiet haben die Möglichkeiten in den vergangenen Jahren sehr stark zugenommen, wobei beispielsweise die NMR-Diagnostik in der Lage ist, praktisch jedes anatomische Detail selektiv und mit großer Genauigkeit darzustellen. In vielen Fällen werden die entsprechenden Strukturen aber erst durch die Anwendung von Kontrastmitteln sichtbar. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, die Kontrastmittel so auszugestalten, daß sie sich selektiv in den gewünschten Zielstrukturen anreichern. Hierdurch läßt sich die Genauigkeit der Bildgebung bei gleichzeitiger Verringerung der benötigten Kontrastmittelmenge erhöhen.
Als Kontrastmittel für die NMR-Diagnostik eignen sich Chelatkomplexe von paramagnetischen Metallen. Theorie und Anwendung von Gadolinium(lll) Chelaten als NMR-Kontrastmittel sind in einem Übersichtsartikel von P. Caravan et al. in Chem. Rev. 1999, 99, 2293-2352 ausführlich erläutert. Die Bildintensität im Protonen-NMR wird im wesentlichen durch die Wasserprotonen bestimmt. Sie hängt von den Kernrelaxationszeiten ab. Komplexe von paramagnetischen Übergangsmetallen und Lanthanoiden verkürzen die Relaxationszeiten von benachbarten Protonen durch dipolare Wechselwirkungen. Die paramagnetischen Kontrastmittel werden nicht direkt detektiert, sondern es erfolgt eine indirekte Detektion auf der Grundlage der Tatsache, daß die Kontrastmittel Relaxationszeiten von benachbarten Protonen wie Wasserprotonen verändern können. Aufgrund ihrer hohen magnetischen Momente und Relaxationseffizienz sind Gd3+, Fe3+ und Mn2+ bevorzugte paramagnetische Metallkationen in der NMR-Diagnostik.
Eine wichtige physikalische Größe, welche das Relaxationsverhalten von Protonen beschreibt, ist die longitudinale Relaxationszeit Ti. Gewebe mit kurzen Relaxationszeiten T1 liefern im allgemeinen Bilder höherer Intensität als solche mit längeren Relaxationszeiten. Trägt man für eine bestimmte paramagnetische Verbindung den Reziprokwert der gemessenen Relaxationszeit T1 in Abhängigkeit von der Konzentration c auf, so erhält man Geraden der Steigung R. Diese Steigung nennt man auch Relaxivität, welche ein Maß für das Vermögen des entsprechenden paramagnetischen Ions ist, die Relaxationszeit der benachbarten Protonen zu verkürzen.
Aufgrund ihrer zum Teil relativ hohen Giftigkeit werden die benötigten Ionen im Regelfall nicht in Form von wasserlöslichen Salzen verabreicht, sondern in Form von Chelatkomplexen. Diese können praktisch unverändert vom Körper ausgeschieden werden. Je kleiner die Komplexe in Lösung sind, desto geringer ist ihr Trägheitsmoment und desto schneller drehen sie sich in Lösung (Tumbling Motion Time). Je schneller ein Komplex rotiert, desto geringer ist seine Relaxivität. Die Relaxivität steigt somit mit der Molekularmasse des gesamten Komplexes. Eine hohe Molekularmasse kann man durch Anbindung an Makromoleküle erreichen. Ein gutes NMR-Kontrastmittel zeichnet sich unter anderem dadurch aus, daß es einen großen Wert für die Relaxivität hat.
Konjugate aus Gd-DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) mit Albumin sind beispielsweise von M.D. Ogan et al. in Invest. Radiol. 1987, 22, 665-671 und U. Schmiedl et al. in Radiology 1987, 162, 205-210 beschrieben. Konjugate aus makrocyclischem Metallkomplexen und Biomolekülen sind in der WO 95/31444 offenbart. Zur Verbesserung der Selektivität von Kontrastmitteln schlägt die WO 01/08712 ein Kontrastmittel vor, das mindestens zwei Metallchelateinheiten als bildverbessernde Gruppen und mindestens zwei "Zielbindungseinheiten" zur Bindung des Kontrastmittelmoleküls an das gewünschte Zielmolekül oder Zielorgan im Körper umfaßt.
Große Kontrastmittelmoleküle mit hoher Molmasse werden gemäß der WO 97/02051 durch Einbau von makrocyclischen Metallkomplexen in Kaskadenpolymere erhalten.
Tetraazacyclododecantetraessigsäurederivate hoher Stabilität und guter Löslichkeit aufgrund fehlender Ladung, die sich zur Anbindung an Biomoleküle eignen, sind in dem EP- A-O 565 930 beschrieben.
Die vorstehend beschriebene Anbindung von makrocyclischen Metallkomplexen an Biomoleküle ermöglicht sowohl eine Erhöhung der Relaxivität als auch der Selektivität des Kontrastmittels. Die durch die Immobilisierung erreichten Relaxivitäten sind jedoch immer noch so gering, daß die Verbindungen nur schlecht als Marker für besonders spezifisch bindende Biomoleküle eingesetzt werden können, da die Konzentration im Target-Gewebe so gering ist, daß ein zu geringes oder zumindest zu stark verrauschtes Signal zur Verfügung gestellt wird. Um zu diagnostisch eindeutigen Aussagen zu gelangen, ist jedoch der Nachweis eines rauscharmen Signals Vorraussetzung. Es besteht daher in der NMR- Diagnostik weiterhin ein Bedarf an Metallkomplexen, die bei Konjugation mit Biomolekülen selbst in kleinsten Konzentrationen noch ein signifikantes Signal erzeugen.
Neben dem vorstehend geschilderten Problem, daß NMR-Kontrastmittel eine möglichst hohe Relaxivität aufweisen sollten, ist es wünschenswert, daß diese Kontrastmittel ihr NMRD-Maximum in einem Bereich haben, der sich für eine Anwendung zusammen mit klinischen NMR-Diagnosegeräten möglichst gut eignet. Derzeit eingesetzte klinische NMR- Diagnosegeräte arbeiten üblicherweise bei 60 MHz. Das NMRD-Maximum bekannter NMR- Kontrastmittel liegt demgegenüber im allgemeinen bei maximal ca. 20 MHz. Es besteht somit ein Bedürfnis nach NMR-Kontrastmitteln mit einem nach hohem Feld verschobenen NMRD-Maximum.
Eine weitere Ligandenklasse, die sich zur Herstellung von NMR-Kontrastmitteln eignet, wird von S. M. Cohen, et al. in Inorg. Chem. 2000, 39, 5747-5756 sowie in US 5,624,901 beschrieben. Hierbei handelt es sich um Hydroxypyridinon-Derivate, die sich jedoch nicht zur Anbindung an Biomoleküle eignen. Hydroxypyridinon- und Hydroxypyrimidon-Chelatbildner sowie deren Gadolinium(lll)- Komplexe sind auch in WO 03/016923 beschrieben. Einige dieser Verbindungen weisen hohe Relaxivitäten auf, jedoch ist der Metallgehalt pro Molekül der Verbindungen aufgrund ihres hohen Molekulargewichts nur gering. Dies führt dazu, daß im Vergleich zu den erfindungsgemäßen Verbindungen hohe absolute Dosen injiziert werden müssen.
Gadolinium (III) Komplexe basierend auf Hydroxypyridinon und Terephthalamid sind von K.N. Raymond in Abstracts of Papers, 227m ACS National Meeting, Anaheim, CA, United States, March 28-April 1 , 2004 (2004) und K.N. Raymond et al. in Abstracts of Papers, 228lh ACS National Meeting, Philadelphia, PA, United States, August 22-26, 2004 (2004) beschrieben. Ebenfalls in Abstracts of Papers, 227th ACS National Meeting, Anaheim, CA, United States, March 28-April 1 , 2004 (2004) beschreiben D. G. Churchill at al. auf Catecholamid (CAM)-, Terephthalamid (TAM)-, Hydroxypyridon (HOPO)- und Hydroxypyrimidon (HOPY)-basierende Ligandensysteme zur Eisensequestration und als Gadolinium MRI Kontrastmittel, M. K. Thompson et al. beschreiben Lanthanid-Komplexe mit tripodalen, auf Hydroxypyridonat (HOPO)-basierenden Liganden, und EJ. Werner et al. beschreiben auf Hydroxypyridinon (HOPO)-basierende Gd(III) Komplexe mit hoher Stabilität.
M. K. Thompson offenbart in J. Am. Chem. Soc. 2003, 125(47), 14274-5 ein heteropodales Gd(III) Chelat, das auf einem Hydroxypyridinat (HOPO)-Terephthalamid (TAM) Ligandendesign beruht.
Die thermodynaische Stabilität von Gd(III) Komplexen mit fünfzähnigen Liganden, die 2,3- Dihydroxyterephthalamid und 2,3-Hydroxypyridonat chelatierende Einheiten einschließen, werden von G. Xu et al. in Inorg. Chem. 2004, 43(18), 5492-4 offenbart.
Diese Chelatbildner eignen sich zur Anbindung u.a. an Biomoleküle, wobei die Anbindung mittels einer, reaktiven Gruppe in einer Seitenkette des Hydroxypyridinon- bzw. Hydroxypyrimidon-Chelators erfolgt. Die unmittelbare Nachbarschaft zwischen den koordinierenden Sauerstoffatomen des Chelatbildners und der für die Anbindung an ein Biomolekül vorgesehenen reaktiven Gruppe erfordert es, daß der Chelator noch vor der Komplexbildung mit dem Gadoliniumion an das Biomolekül angebunden wird, um eine Komplexbildung zwischen dem Gadoliniumion und der reaktiven Gruppe beispielsweise unter Ausbildung besonders stabiler 5-Ringe zu vermeiden. Bei dieser Reaktionsfolge erweist es sich als problematisch, daß die Komplexbildung zwischen dem Chelator und dem Gadoliniumion drastische Reaktionsbedingungen erfordert, die zu einer Beeinträchtigung bis hin zur Zerstörung des zuvor angebundenen Biomoleküls führen können. Konjugate mit besonders empfindlichen Biomolekülen wie beispielsweise Antikörper lassen sich mit den aus WO 03/016923 bekannten Chelatoren somit nicht oder nur mit hohem Aufwand herstellen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, Kontrastmittel für die NMR- Diagnostik zur Verfügung zu stellen, die die vorstehend beschriebenen Probleme lösen. Insbesondere sollen diese NMR-Kontrastmittel eine möglichst hohe Relaxivität aufweisen, sich möglichst selektiv an einem gewünschten Ort im Körper anreichern und ein NMRD- Maximum aufweisen, das sich für den Einsatz der Mittel zusammen mit klinischen NMR- Diagnosegeräten besonders eignet. Ferner sollen die NMR-Kontrastmittel eine gute Wasserlöslichkeit aufweisen, die Spezifität der Biomoleküle soll durch die Anbindung der Chelatoren nicht beeinträchtigt werden und die Konjugate sollen genauso verträglich sein wie die unkonjugierten Biomoleküle. Schließlich soll die Stabilität der Konjugate möglichst hoch sein.
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe überraschend dadurch gelöst werden kann, daß drei Hydroxypyridinon-, Hydroxypyrimidon- und/oder Catecholreste mittels eines Linkers in einem Liganden vereinigt werden, der dann wiederum über diesen Linker an ein Biomolekül angebunden wird. Die neuen Qualitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen werden deutlich, wenn sie an Biomoleküle gebunden werden. Durch die spezielle Ausgestaltung der Liganden wird die Relaxivität des erhaltenen Kontrastmittels erhöht und außerdem wird das NMRD-Maximum gegenüber den vorbekannten Verbindungen zu höherem Feld verschoben. Ferner erlaubt die Anbindung des Liganden über den Linker anstelle über einen der Hydroxypyridinon- bzw. Hydroxypyrimidonreste, daß der Komplex mit dem zu koordinierenden Metallion vor Anbindung des Liganden an das Biomolekül hergestellt werden kann, ohne Risiko einer Nebenreaktion und dadurch unerwünschter Koordination der für die Reaktion mit dem Biomolekül vorgesehenen reaktiven Gruppe. Der fertige Komplex kann anschließend unter milden Reaktionsbedingungen auch an empfindliche Biomoleküle wie beispielsweise Antikörper angebunden werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Verbindungen der allgemeinen Formel I: (K)3-A-U-X
worin K unabhängig voneinander für einen Rest
Figure imgf000007_0001
steht, worin Z ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquivalent darstellt,
R1 ein Wasserstoff atom oder einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Ci-iO-Alkylrest darstellt, der gegebenenfalls mit 1-3 Sauerstoffatomen, 1-3
Stickstoff atomen und/oder 1-3 -NR3-Resten unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1-4
Hydroxygruppen, 1-2 Carboxyl- (die gegebenenfalls in geschützter Form vorliegen), 1-2 -
SO3H- (die gegebenenfalls in geschützter Form vorliegen), 1-2 -PO3H2-Gruppen und/oder
1-2 Halogenatomen substituiert ist und/oder bei dem gegebenenfalls 1-2 Kohlenstoffatome als Carbonylgruppen vorliegen, wobei der Alkylrest oder ein Teil des Alkylrests ringförmig ausgestaltet sein kann,
R2 ein Wasserstoff atom, einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Ci-iO-Alkylrest, der gegebenenfalls mit 1 -3 Sauerstoffatomen, 1-3
Stickstoffatomen und/oder 1-3 -NR3-Resten unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1-2
Hydroxygruppen, 1-2 Carboxyl-, 1-2 -SO3H-, 1-2 -PO3H2-Gruppen und/oder 1-2
Halogenatomen substituiert ist und/oder bei dem gegebenenfalls 1-2 Kohlenstoffatome als
Carbonylgruppen vorliegen, wobei der Alkylrest oder ein Teil des Alkylrests ringförmig ausgestaltet sein kann, -COOH, Halogen, -CONR3R4, -SO3H oder -PO3H2 darstellt,
R3 und R4 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C^o-Alkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit 1 -4 Hydroxygruppen substituiert ist oder mit 1-2 Sauerstoffatomen unterbrochen ist,
W1 und W2 unabhängig voneinander einen Rest R1 oder -CONR3R4 darstellen,
A für einen Rest
Figure imgf000008_0001
steht, worin die Positionen α an K und die Positionen ß an U gebunden sind, U eine direkte Bindung oder einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Ci-2o-Alkylenrest darstellt, der gegebenenfalls mit 1-4 Sauerstoffatomen, 1-4 Schwefelatomen, 1-4 Stickstoffatomen, 1-4 -NR3-Resten, 1-4 -NHCO-Resten, 1-4 -CONH- Resten, 1-4 -O-P-(=O)(-OH)-O-Resten und/oder 1-2 Arylenresten unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1-3 geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C-i-io-Alkylresten, 1-3 Hydroxygruppen, 1-3 Carboxylgruppen, 1-3 Arylgruppen, 1-3 Halogenatomen und/oder 1-3 -O-Ci-6-Alkylgruppen (wobei der Alkylrest geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt ist) substituiert ist und/oder bei dem gegebenenfalls 1-3 Kohlenstoffatome als Carbonylgruppen vorliegen können, wobei der Alkylenrest oder ein Teil des Alkylenrests ringförmig ausgestaltet sein kann, und X eine Gruppe darstellt, die mit einem Biomolekül eine Reaktion eingehen kann, sowie deren Salze und deren Verwendung zur Herstellung eines Konjugats mit einem Biomolekül.
Wenn nicht anders angegeben wird vorliegend unter "Alkylrest" bzw. "Alkylenrest" ein gesättigter oder ungesättigter, gradkettiger oder verzweigter oder cyclischer Alkyl(en)rest mit der angegebenen Anzahl von Kohlenstoffatomen verstanden. Wenn dieser Rest weitere Gruppen oder Atome enthalten kann oder damit unterbrochen sein kann, wird darunter verstanden, daß die weiteren Gruppen oder Atome zusätzlich zu den bereits vorhandenen Atomen des Restes vorliegen und an einer beliebigen Position des Restes einschließlich der terminalen Positionen eingefügt sein können.
Unter "Aryl" wird vorzugsweise Phenyl, Biphenyl, Pyridyl, Furanyl, Pyrrolyl und Imidazolyl verstanden. Besonders bevorzugt sind Phenyl und Pyridyl. Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I umfassen drei Hydroxypyridinon-, Hydroxypyrimidon- und/oder Catecholreste. Diese Reste tragen zur Koordination bzw. zum Ladungsausgleich eines koordinierten Metallions bei. Daher steht Z entweder für ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquivalent.
Der Hydroxypyridinon- bzw. Hydroxypyrimidonrest, der für K in der allgemeinen Formel I stehen kann, trägt einen Substituenten R1, der ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten d-io-Alkylrest darstellt, der gegebenenfalls mit 1-3 Sauerstoffatomen, 1-3 Stickstoffatomen und/oder 1-3 -NR3-Resten unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1-4 Hydroxygruppen, 1-2 Carboxyl- (die gegebenenfalls in geschützter Form vorliegen), 1-2 -SO3H- (die gegebenenfalls in geschützter Form vorliegen), 1-2 -PO3H2-Gruppen und/oder 1-2 Halogenatomen substituiert ist und/oder bei dem gegebenenfalls 1-2 Kohlenstoffatome als Carbonylgruppen vorliegen, wobei der Alkylrest oder ein Teil des Alkylrests ringförmig ausgestaltet sein kann.
Bevorzugt steht R1 für ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen oder verzweigten, vorzugsweise geradkettigen Ci.5-Alkylrest, der mit 1-2 Sauerstoffatomen unterbrochen und/oder 1-4 Hydroxygruppen, einer Carboxylgruppe und/oder einer Gruppe -SO3H substituiert sein kann. Bevorzugte Beispiele für R1 sind -H, -CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH3, -CH(CH3)-CH3, -C(CH3)(CH3)-CH3, -CH2-OH, -CH2-CH2-OH, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-COOH, -CH2-COOt-BUt, -CH2-COOCH2C6H5, -CH2-CH2-SO3H, -CH2-CH2-CH2-SO3H, - CH2-CH2-CH2-CH2-SO3H, -CH2-CH(OH)-CH2-OH, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2- 0-CH2-CH2-OH, -CH2-CH2-O-CH2-COOH und -CH[CH2-O-CH-(CH2-OH)2]2. Besonders bevorzugt sind -H, Methoxyethyl, Methyl und -CH2-COOH, insbesondere Methoxyethyl und Methyl.
W1 und W2 stehen unabhängig voneinander für einen Rest R1, wobei R1 wie vorstehend definiert ist und auch die vorstehenden bevorzugten Reste umfaßt. Besonders bevorzugt stehen W1 und W2 unabhängig für ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen oder verzweigten, vorzugsweise geradkettigen Ci.5-Alkylrest, insbesondere ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest. Beispielsweise kann einer von W1 und W2 für ein Wasserstoffatom und der andere von W1 und W2 für einen Methylrest stehen, oder W1 und W2 können beide für ein Wasserstoff atom stehen. Der Catecholrest, der alternativ für K in der Formel I stehen kann, trägt einen Substituenten R2. Dieser kann ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten d-io-Alkylrest, der gegebenenfalls mit 1-3 Sauerstoffatomen, 1-3 Stickstoffatomen und/oder 1-3 -NR3-Resten unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1-2 Hydroxygruppen, 1-2 Carboxyl-, 1-2 -SO3H-, 1-2 -PO3H2-Gruppen und/oder 1-2 Halogenatomen substituiert ist und/oder bei dem gegebenenfalls 1-2 Kohlenstoffatome als Carbonylgruppen vorliegen, wobei der Alkylrest oder ein Teil des Alkylrests ringförmig ausgestaltet sein kann, -COOH, Halogen, -CONR3R4, -SO3H oder -PO3H2 darstellen. Bevorzugte Alkylreste sowie substituierte und mit Hetoatomen unterbrochene Alkylreste für R2 sind diejenigen wie vorstehend für R1 beschrieben. Als Halogen eignen sich Fluor, Chlor, Brom und lod.
Die vorstehenden Reste R3 und R4 stellen unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C1-6- Alkylrest dar, der gegebenenfalls mit 1-2 Hydroxygruppen substituiert ist. Als Ci.6-Alkylreste für R3 und R4 eignen sich insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Hexyl, Cyclohexyl, 2-Hydroxyethyl und -CH[CH2-O-CH-(CH2-OH)2]2
Die drei Hydroxypyridinon-, Hydroxypyrimidon- und/oder Catecholreste der Verbindungen der allgemeinen Formel I dienen zur Koordination eines Metallions. Damit die gebildeten Komplexe eine möglichst hohe Stabilität aufweisen, werden die drei komplexbildenden Reste K der erfindungsgemäßen Verbindungen von einem zentralen vierbindigen Rest A (Linker) zusammengehalten, so daß ein mehrzähniger Ligand zur Verfügung gestellt wird. Außerdem verknüpft dieser zentrale Rest A nicht nur die drei koordinierenden Reste K untereinander sondern zusätzlich diese mit einer Gruppe X, die mit einem Biomolekül eine Reaktion eingehen kann, so daß die erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem Biomolekül zu einem Konjugat verbunden werden können.
In den Verbindungen der allgemeinen Formel I steht A für einen Rest
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worin die Positionen α an K und die Positionen ß an U gebunden sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mittels einer Gruppe X, die mit einem Biomolekül eine Reaktion eingehen kann, über einen Spacer U an ein Biomolekül angebunden werden.
Der Spacer U stellt dabei eine direkte Bindung oder einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten d.20-Alkylenrest dar, der gegebenenfalls mit 1-4 Sauerstoffatomen, 1 -4 Schwefelatomen, 1-4 Stickstoffatomen, 1-4 -NR3-Resten, 1-4-NHCO-Resten, 1 -4 -CONH-Resten, 1-4 -O-P(=0)(-OH)-O-Resten und/oder 1-2 Arylenresten unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1-3 geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Ci.io-Alkylresten, 1-3 Hydroxygruppen, 1-3 Carboxylgruppen, 1-3 Arylgruppen, 1-3 Halogenatomen und/oder 1-3 -O-Ci.6-Alkylgruppen (wobei der Alkylrest geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt ist) substituiert ist und/oder bei dem gegebenenfalls 1-3 Kohlenstoffatome als Carbonylgruppen vorliegen, wobei der Alkylenrest oder ein Teil des Alkylenrests ringförmig ausgestaltet sein kann. R3 ist hierin wie vorstehend definiert. Bevorzugte Alkyl- und Arylgruppen sind ebenfalls wie vorstehend definiert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt U einen Phenylen- oder Cyclohexylenrest oder einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten C^o-Alkylenrest dar, der mit einem Sauerstoff atom, einem -NR3-Rest, einem oder zwei Amidrest(en) und/oder einem Phenylenrest unterbrochen sein kann und bei dem ein oder zwei Kohlenstoffatom(e) als Carbonylgruppe(n) vorliegen können.
Beispielsweise kann U ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-, -CH2-CO-NH-CH2-, -CH(CHa)-CO-NH-CH2-CO-NH-CH2-CH2-, -CH2-Phenylen-, -Phenylen-, -Cyclohexylen-, -CH2-Phenylen-O-CH2-, -CHz-Phenylen-O-CHa-CO-NH-CHg-CHs-, -Phenylen-O-CH2-, -CO-Phenylen-,
-CO-Phenylen-CO-NH-CHa-CHz-, -(CH2)4-, -(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2- und
-(CH2J4-NH-CO-CH2-O-CH2-, wobei diese Reste in Leserichtung links an A und in Leserichtung rechts an X gebunden sind.
Über den Spacer U ist eine Gruppe X an den Rest A der Formel I angebunden. Bei dieser Gruppe X handelt es sich um eine Gruppe, die mit einem Biomolekül eine Reaktion eingehen kann. Beispielsweise eignet sich hierfür Carboxyl (-COOH), aktiviertes Carboxyl, Amino (-NH2), Isocyanat (-NCO), Isothiocyanat (-NCS), Hydrazin (-NHNH2), Semicarbazid (-NHCONHNH2), Thiosemicarbazid (-NHCSNHNH2), Chloracetamid (-NHCOCH2CI), Bromacetamid (-NHCOCH2Br), lodacetamid (-NHCOCH2I), Acylamino, wie beispielsweise Acetylamino (-NHCOCH3), gemischte Anhydride, Azid, Hydroxid, Sulfonylchlorid, Carbodiimid, Pyridyl-CH=CH2 oder eine Gruppe der Formeln
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worin HaI ein Halogenatom darstellt.
Unter aktivierter Carboxylgruppe werden vorstehend solche Carboxylgruppen verstanden, die so derivatisiert sind, daß sie die Reaktion mit einem Biomolekül erleichtern. Welche Gruppen zur Aktivierung verwendet werden können, ist bekannt und es kann beispielsweise auf M. und A. Bodanszky, "The Practice of Peptide Synthesis", Springerverlag 1984 verwiesen werden. Beispiele sind Addukte der Carbonsäure mit Carbodiimiden oder aktivierte Ester wie z.B. Hydroxybenzotriazolester. Besonders bevorzugt wird die aktivierte Carboxylgruppe für X ausgewählt aus
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In der Formel I steht Z für ein Wasserstoffatom oder ein Metallionäquivalent. Welches Metallion in der erfindungsgemäßen Verbindung komplexiert vorliegen soll, hängt von der beabsichtigten Anwendung der mit den erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellten Konjugate mit einem Biomolekül ab. Entsprechende Konjugate eignen sich beispielsweise für die NMR-Diagnostik. Besonders bevorzugt werden die Konjugate in der NMR-Diagnostik als Kontrastmittel eingesetzt.
Die Herstellung von Komplexen für die NMR-Diagnostik kann in der Weise erfolgen, wie sie in den Patentschriften EP 71564, EP 130934 und DE-OS 34 01 052 offenbart worden ist. Dazu wird das Metalloxid oder ein Metallsalz (beispielsweise ein Chlorid, Nitrat, Acetat, Carbonat oder Sulfat) des gewünschten Elements in Wasser, einem niederen Alkohol (wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol) und/oder einem anderen organischen Lösungsmittel, wie THF, Pyridin, etc., gelöst oder suspendiert und mit der Lösung oder Suspension der äquivalenten Menge des erfindungsgemäßen Komplexbildners umgesetzt. Ein konkretes Herstellungsbeispiel ist in Inorg. Chem. 2000, 39, 2652-2660 offenbart. Gemäß diesem Beispiel wird der Komplexbildner in Methanol/THF gelöst, und eine Lösung des Metallsalzes in Methanol/THF wird zu der Komplexbildnerlösung zugetropft. Anschließend wird Pyridin zugegeben und unter Rückfluß erwärmt. Der ausgefallene Komplex wird abzentrifugiert und mit Methanol/THF gewaschen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen kommen zur Anwendung für die NMR-Diagnostik in Form ihrer Komplexe mit den Ionen der paramagnetischen Elemente mit den Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 und 58-70. Geeignete Ionen sind beispielsweise das Chrom(lll)-, Eisen(ll)-, Cobalt(ll), Nickel(ll)-, Kupfer(ll)-, Praseodym(lll)-, Neodym(lll)-, Samarium(lll)- und Ytterbium(lll)-ion. Wegen ihres starken magnetischen Moments sind für die NMR-Diagnostik besonders bevorzugt das Gadolinium(lll)-, Mangan(ll)- und Eisen(lll)- ion.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen und insbesondere deren Konjugate mit Biomolekülen erfüllen die vielfältigen Voraussetzungen für die Eignung als Kontrastmittel für die Kernspintomographie. So sind sie hervorragend dazu geeignet, nach oraler oder parenteraler Applikation durch Erhöhung der Signalintensität das mit Hilfe des Kernspintomographen erhaltene Bild in seiner Aussagekraft zu verbessern. Ferner zeigen sie die hohe Wirksamkeit, die notwendig ist, um den Körper mit möglichst geringen Mengen an Fremdstoffen zu belasten, und die gute Verträglichkeit, die notwendig ist, um den nichtinvasiven Charakter der Untersuchungen aufrechtzuerhalten.
Ferner können die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen vorteilhaft als Suszeptibilitäts-Reagenzien und als shift-Reagenzien für die in vivo-NMR-Spektroskopie verwendet werden.
Die Neutralisation eventuell noch vorhandener freier Carboxygruppen erfolgt mit Hilfe anorganischer Basen (z.B. Hydroxyden, Carbonaten oder Bicarbonaten) von z.B. Natrium, Kalium, Lithium, Magnesium oder Calcium und/oder organischer Basen wie unter anderem primärer, sekundärer und tertiärer Amine, wie z.B. Ethanolamin, Morpholin, Pyridin, Glucamin, N-Methyl- und N,N-Dimethylglucamin, sowie basischer Aminosäuren, wie z.B. Lysin, Arginin und Ornithin oder von Amiden ursprüngliche neutraler oder saurer Aminosäuren.
Zur Herstellung der neutralen Komplexverbindungen kann man beispielsweise in sauren Komplexsalzen in wäßriger Lösung oder Suspension soviel der gewünschten Base zusetzen, daß der Neutralpunkt erreicht wird. Die erhaltene Lösung kann anschließend im Vakuum zur Trockne eingeengt werden. Häufig ist es von Vorteil, die gebildeten Neutralsalze durch Zugabe von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie z.B. niederen Alkoholen (Methanol, Ethanol, Isopropanol und andere), niederen Ketonen (Aceton und andere) und/oder polaren Ethern (Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, 1 ,2-Dimethoxyethan und andere) auszufällen und so leicht zu isolierende und gut zu reinigende Kristallisate zu erhalten. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die gewünschte Base bereits während der Komplexbildung der Reaktionsmischung zuzusetzen und dadurch einen Verfahrensschritt einzusparen. Ein besonders vorteilhaftes Herstellungsverfahren unter Verwendung von Methanol/THF als Lösungsmittel sowie Pyridin als Base ist in Inorg. Chem. 2000, 39, 2652-2660 beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I lassen sich nach dem Fachmann bekannten Verfahren herstellen. Beispielsweise können die Verbindungen der Formel I durch ein Verfahren erhalten werden, worin eine Verbindung der Formel Il
A'-U-X II,
worin U und X wie oben definiert sind und A' die Vorstufe zu dem vierbindigen Rest A darstellt, mit Nu-K umgesetzt wird, wobei K wie oben definiert ist, K und X gegebenenfalls in ihrer geschützten Form vorliegen und Nu ein Nucleofug ist, anschließend die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen entfernt werden und wenn gewünscht in an sich bekannter Weise mit mindestens einem Metalloxid oder Metallsalz eines gewünschten Elements umgesetzt wird und gegebenenfalls anschließend in den so erhaltenen Komplexen noch vorhandene acide Wasserstoffatome ganz oder teilweise durch Kationen von anorganischen und/oder organischen Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamiden substituiert werden.
Als Nucleofug dienen beispielsweise die Reste:
Cl, Br, I, O-Triflat, Mesylat und Tosylat.
Die Umsetzung wird beispielsweise im Gemisch von Wasser und organischen Lösungsmitteln wie: Isopropanol, Ethanol, Methanol, Butanol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Formamid oder Dichlormethan durchgeführt. Bevorzugt sind ternäre Gemische aus Wasser, Isopropanol und Dichlormethan.
Die Umsetzung wird in einem Temperaturbereich zwischen -1O0C und 1000C, vorzugsweise zwischen 00C und 300C durchgeführt.
Der Schutz der vorstehend benannten Gruppen kann auf zahlreichen, dem Fachmann bekannten Möglichkeiten erfolgen. Die nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen dienen zur Erläuterung dieser Schutzgruppentechniken ohne auf diese Synthesewege beschränkt zu sein. Als Säureschutzgruppen kommen C1-C6-AIkYl-, C6-C10-An/!- und C6-C10-Ar(C1-C4)- alkylgruppen sowie Trialkylsilylgruppen in Frage. Bevorzugt werden die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl, n-Butyl-, i-Butyl- und die tert-Butylgruppe.
Die Abspaltung dieser Säureschutzgruppen erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise durch Hydrolyse, Hydrogenolyse, alkalische Verseifung der Ester mit Alkali in wäßrig-alkoholischer Lösung bei Temperaturen von 0 bis 50cC, saure Verseifung mit Mineralsäuren oder im Fall von tert-Butylestern mit Hilfe von Trifluoressigsäure.
Die NH-Gruppen lassen sich in vielfältiger Weise schützen und wieder freilegen. Das N- Trifluoracetylderivat wird durch Kalium- oder Natriumcarbonat in Wasser (H. Newman, J. Org. Chem., 30: 287 (1965), M.A. Schwartz et al., J. Am. Chem. Soc, 95 G12 (1973)) oder einfach durch Ammoniaklösung gespalten (M. Imazama u. F. Eckstein, J. Org. Chem., 44: 2039 (1979)). Ebenfalls milde zu spalten ist das tert-Butyloxycarbonylderivat: es genügt Rühren mit Trifluoressigsäure (B. F. Lundt et al., J. Org. Chem., 43: 2285 (1978)). Sehr groß ist die Gruppe der hydrogenolytisch oder reduzierend zu spaltenden NH-Schutzgruppen: Die N-Benzylgruppe ist bequem mit Wasserstoff/Pd-C zu spalten (W. H. Härtung u. R. Rimonoff, Org. Reactions VII, 262 (1953)), was auch für die Tritylgruppe (L. Zervas et al., J. Am. Chem. Soc, 78: 1359 (1956)) und die Benzyloxycarbonylgruppe gilt (M. Bergmann u. L. Zervas Ber. 65: 1 192 (1932)).
Aktivierte Ester der vorstehend beschriebenen Verbindungen werden wie dem Fachmann bekannt hergestellt. Für den Fall von Isothiocyanaten oder α-Halogenacetaten werden die entsprechenden terminalen Aminvorstufen nach literaturbekannten Methoden mit Thiophosgen oder 2-Halo-Essigsäure-Halogeniden umgesetzt. Auch die Umsetzung mit entsprechend derivatisierten Estern von N-Hydroxysuccinimid wie beispielsweise:
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ist möglich (HaI = Halogen). Allgemein können für diesen Zweck alle üblichen Aktivierungsmethoden für Carbonsäuren verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Das Molekül Nu-K wird bevorzugt zunächst unabhängig synthetisiert. Enthält das Molekül eine Amidgruppe, so wird diese beispielsweise hergestellt, indem eine aktivierte Carbonsäure mit einem Amin umgesetzt wird. Die Aktivierung der Carbonsäure erfolgt nach den üblichen Methoden. Beispiele für geeignete Aktivierungsreagentien sind Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC), Benzotriazol-1 -yloxytris- (dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP) und 0-(Benzotriazol-1-yl)-1 ,1 ,3,3- tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), vorzugsweise DCC. Auch der Zusatz von O-nukleophilen Katalysatoren, wie z.B. N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder N- Hydroxybenzotriazol ist möglich.
Handelt es sich bei der Gruppe X um eine Carbonsäurefunktion, so kann diese in geschützter Form (z.B. in Form des Benzylesters) eingesetzt werden, die Abspaltung der Schutzgruppe kann dann hydrogenolytisch erfolgen.
Um diese Carbonsäurefunktion an eine geeignete funktionelle Gruppe eines geeigneten Biomoleküls zu knüpfen, sollte diese im Regelfall zunächst aktiviert werden. Bevorzugt werden dazu aktivierte Ester intermediär erzeugt, welche dann von einer nukleophilen Gruppe des Biomoleküls angegriffen werden. Auf diese Weise entsteht eine kovalente Verknüpfung zwischen dem Biomolekül und der erfindungsgemäßen Verbindung der Formel I. Bevorzugte aktivierte Ester sind die Ester des N-Hydroxysuccinimids, die Ester des Paranitrophenols oder die Ester des Pentafluorphenols. Soll die Gruppe X in Form eines Isothiocyanats an das Biomolekül geknüpft werden, so wird bevorzugt zunächst ein terminales Amin verwendet, welches, wenn notwendig, mit einer geeigneten Schutzgruppe versehen sein kann. Geeignete Schutzgruppen sind aus der Peptidchemie bekannt. Nach Abspaltung der Schutzgruppe kann durch Umsetzung des primären terminalen Amins mit Thiophosgen das Isothiocyanat erzeugt werden. An dieses können nukleophile Gruppen des Biomoleküls addiert werden.
In einer Ausführungsform stellt die Gruppe X ein Maleinimid dar, welches z.B. selektiv mit Thiolfunktionen des Biomoleküls reagieren kann. In einer anderen Ausführungsform ist die Gruppe X ein Nukleophil (NH2, SH), welches an einer geeigneten Funktionalität des Biomoleküls angreift (aktivierter Ester, Maleinimid, etc.). Zahlreiche mit Maleinimiden funktionalisierte Biomoleküle sind kommerziell erhältlich.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Verwendung der vorstehend beschriebenen Verbindungen der Formel I zur Herstellung von Konjugaten mit einem Biomolekül.
Die Synthese der Konjugate erfolgt in der Regel derart, daß zunächst ein derivatisierter und funktionalisierter Chelatkomplex erzeugt wird, welcher dann an das Biomolekül geknüpft wird. Es ist aber auch möglich, daß im Falle der Verwendung von synthetisch hergestellten Biomolekülen der erfindungsgemäße Chelatkomplex während der Synthese des Biomoleküls in dieses eingebaut wird. Dies kann beispielsweise während der sequentiellen Synthese von Oligopeptiden am Syntheseroboter erfolgen. Falls erforderlich, können dazu die in der Synthese des entsprechenden Biomoleküls üblichen Schutzgruppen in die erfindungsgemäße Verbindung eingeführt werden. Diese werden dann im Zuge der üblichen Synthesealgorithmen am Synthesizer wieder abgespalten.
Unter "Biomolekül" wird vorliegend jedes Molekül verstanden, das entweder natürlich beispielsweise im Körper auftritt oder mit analoger Struktur synthetisch hergestellt wurde. Darüber hinaus werden hierunter solche Moleküle verstanden, die mit einem biologisch, beispielsweise im Körper auftretenden Molekül oder einer dort auftretenden Struktur in Wechselwirkung treten können, so daß sich beispielsweise die Konjugate an bestimmten, gewünschten Stellen des Körpers anreichern. Unter "Körper" wird vorliegend jeder pflanzliche oder tierische Körper verstanden, wobei tierische und insbesondere menschliche Körper bevorzugt sind.
Biomoleküle sind insbesondere die in Lebewesen auftretenden Moleküle, die als Produkte einer evolutionären Selektion durch geordnetes und komplexes Zusammenwirken spezifische Aufgaben für den Organismus erfüllen und die Grundlage seiner Lebensfunktionen (Stoff- und Formwechsel, Fortpflanzung, Energiehaushalt) ausmachen. In Biomolekülen sind zumeist aus einfachen Bausteinen (Aminosäuren, Nucleobasen, Monosacchariden, Fettsäuren, etc.) größere Moleküle (Proteine, Nucleinsäuren, Polysaccharide, Lipide, etc.) aufgebaut. Entsprechende Makromoleküle werden auch als Biopolymere bezeichnet. Vorteilhaft kann das Biomolekül beispielsweise ein Polypeptidgerüst aus Aminosäuren mit Seitenketten aufweisen, die mit der reaktiven Gruppe X der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I eine Reaktion eingehen können. Solche Seitenketten schließen beispielsweise die Carboxylgruppen von Asparaginsäure- und Glutaminsäureresten, die Aminogruppen von Lysinresten, die aromatischen Gruppen von Tyrosin- und Histidinresten und die Sulphhydrylgruppen von Cysteinresten ein.
Eine Übersicht über Biomoleküle mit zahlreichen Beispielen findet sich in dem Skriptum "Chemie der Biomoleküle" der TU-Graz (H. Berthold et al., Institut für Organische Chemie, TU-Graz, 2001), das auch über das Internet unter www.orgc.tu-graz.ac.at eingesehen werden kann. Der Inhalt dieses Dokuments wird durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
Zur Bildung von Konjugaten mit den erfindungsgemäßen Verbindungen sind folgende Biomoleküle besonders geeignet:
Biopolymere, Proteine, wie Proteine, die eine biologische Funktion haben, HSA, BSA, etc., Proteine und Peptide, die sich an bestimmten Stellen im Organismus anreichern (z.B. an Rezeptoren, Zellmembranen, Kanälen etc.), durch Proteasen spaltbare Peptide, Peptide mit synthetischen Sollbruchstellen (z.B. labile Ester, Amide etc.), Peptide, die durch Metalloproteasen gespalten werden, Peptide mit photospaltbaren Linkern, Peptide mit oxydativen Mitteln (Oxidasen) spaltbaren Gruppen, Peptide mit natürlichen und unnatürlichen Aminosäuren, Glycoproteine (Glycopeptide), Signal-Proteine, antivirale Proteine und Apoptosis, synthetisch modifizierte Biopolymere, wie mit Linkern derivatisierte Biopolymere, modifizierte Metalloproteasen und derivatisierte Oxidase etc., Kohlenhydrate (Mono- bis Polysaccharide), wie derivatisierte Zucker, im Organismus spaltbare Zucker, Cyclodextrine und dessen Derivate, Aminozucker, Chitosan, Polysulfate und Acetylneuraminsäure-Derivate, Antikörper, wie monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, polyklonale Antikörper, Minibodies, Single Chains (auch solche, die mit Linkern zu mehrfachen Fragmenten verknüpft sind), rote Blutkörperchen und andere Blutbestandteile, Cancermarker (z.B. CAA) und Zell-Adhäsions-Stoffe (z.B. Lewis X und Anti-Lewis X-Derivate), DNA und RNA Fragmente, wie derivatisierte DNAs und RNAs (z.B. solche, die durch das SELEX-Verfahren gefunden wurden), synthetische RNA und DNA (auch mit unnatürlichen Basen), PNAs (Hoechst) und Antisense, ß-Aminosäuren (Seebach), Vektoramine zur Einschleusung in die Zelle, biogene Amine, Pharmazeutika, onkologische Präparate, synthetische Polymere, die auf ein biologisches Target (z.B. Rezeptor) gerichtet sind, Steroide (natürliche und modifizierte), Prostaglandine, Taxol und dessen Derivate, Endotheline, Alkaloide, Folsäure und deren Derivate, bioaktive Lipide, Fette, Fettsäureester, synthetisch modifizierte Mono-, Di- und Triglyceride, Liposome, die an der Oberfläche derivatisiert sind, Micellen aus natürlichen Fettsäuren oder aus Perfluoralkyl-Verbindungen, Porphyrine, Texaphrine, erweitere Porphyrine, Cytochrome, Inhibitoren, Neuramidasen, Neuropeptide, Immunomodulatoren, wie FK 506, CAPE und Gliotoxin, Endoglycosidasen, Substrate, die durch Enzyme aktiviert werden wie Calmodolin Kinase, Casein-Kinase II, Glutathion-S-Transferase, Heparinase, Matrix-Metalloprotheasen, ß-lnsulin-Rezeptor- Kinase, UDP-Galactose 4-Epimerase, Fucosidasen, G-Proteine, Galactosidasen, Glycosidasen, Glycosyltransferasen und Xylosidase, Antibiotika, Vitamin und Vitamin- Analoga, Hormone, DNA-Interkalatoren, Nucleoside, Nucleotide, Lektine, Vitamin B12, Lewis-X und Verwandte, Psoralene, Dientrienantibiotika, Carbacycline, VEGF (vascular endothelial growth factor), Somatostatin und dessen Derivate, Biotin-Derivate, Antihormone, tumorspezifische Proteine und Synthetika, Polymere, die sich in sauren oder basischen Bereichen des Körpers anreichern (pH-gesteuerte Verteilung), Myoglobine, Apomyoglobine etc., Neurotransmitter-Peptide, Tumornecrosefaktoren, Peptide, die sich in entzündetem Gewebe anreichern, Bloodpool-Reagenzien, Anionen- und Kationen-Transporterproteine, Polyester (z.B. der Milchsäure), Polyamide und Polyphosphate.
Die meisten der vorgenannten Biomoleküle sind kommerziell beispielsweise bei Merck, Aldrich, Sigma, Calbiochem oder Bachern erhältlich.
Außerdem können als Biomoleküle alle in der WO 96/23526 und der WO 01/08712 offenbarten "Plasmaproteinbindungsgruppen" bzw. "Zielbindungsgruppen" eingesetzt werden. Der Inhalt dieser beiden Offenlegungsschriften wird daher durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
Die Anzahl der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I pro Biomolekül ist prinzipiell beliebig, bevorzugt ist jedoch ein molekulares Verhältnis 0,1 :1 bis 10:1 , insbesondere von 0,5:1 bis 2:1.
Ferner eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Konjugation an all diejenigen Moleküle, welche im Stand der Technik mit Fluoreszenzfarbstoffen umgesetzt werden, um beispielsweise ihre Lokalisation durch Epifluoreszenzmikroskopie innerhalb der Zelle zu bestimmen. Auch können die Verbindungen mit prinzipiell beliebigen Medikamenten konjugiert werden, um dann nach Verabreichung des Medikaments den Transport innerhalb des Organismus durch die NMR-Technik zu verfolgen. Ferner ist es möglich, daß die Konjugate aus den erfindungsgemäßen Verbindungen und den Biomolekülen weitere zusätzliche Moleküle enthalten, die an die Biomoleküle konjugiert worden sind. Mit dem Begriff "Biomolekül" im Sinne der Erfindung sind also alle Moleküle umfaßt, die in biologischen Systemen vorkommen und alle Moleküle, die biokompatibel sind.
Bevorzugt werden die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen erhaltenen Konjugate als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik eingesetzt. Daher sollten die Konjugate wasserlöslich sein. Wenn die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen erhaltenen Konjugate als NMR- Kontrastmittel eingesetzt werden sollen, werden sie vorzugsweise in einer Menge von 0,0001-5 mMol/kg Körpergewicht und besonders bevorzugt in einer Menge von 0,005-0,5 mMol/kg Körpergewicht dosiert. Details der Anwendung werden z.B. in H. -J. Weinmann et al., Am. J. of Roentgenology 142, 619 (1984) diskutiert. Durch die überraschend hohe Relaxivität der erfindungsgemäßen Verbindungen bei gleichzeitiger Targetspezifität der mit diesen Verbindungen erhaltenen Konjugate können diese beispielsweise zum Nachweis von Tumoren besonders niedrig dosiert werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich besonders dadurch aus, daß sie die höchsten Relaxivitäten besitzen, die bislang für Metallkomplex-Konjugate im immobilisierten Zustand beschrieben wurden. Dies ist besonders wichtig, da die Konjugate als NMR- Kontrastmittel für teilweise sehr spezielle Biomoleküle verwendet werden, deren stationäre Konzentration im Ziel-Gewebe außerordentlich gering ist. Darüber hinaus zeigen die erfindungsgemäßen Konjugate erhöhte Relaxivitäten bei hohen Feldstärken im Bereich von 60 MHz, so daß sie sich für einen Einsatz zusammen mit in Kliniken verwendeten Geräten besonders eignen.
Die Konjugate zeigen darüber hinaus eine gute Wasserlöslichkeit, und die Spezifität des Biomoleküls wird durch das Konjugat nicht beeinträchtigt. Die Metallkomplex-Konjugate sind im allgemeinen genauso verträglich wie das unkonjugierte Biomolekül. Die Stabilität der Konjugate ist sehr hoch, so daß Lösungen oder gefriergetrocknete Produkte längere Zeit ohne Aktivitätsverlust gelagert werden können. Schließlich weisen die Komplexe eine hohe Komplexstabilität auf, die gewährleistet, daß in vivo kein toxisches Metall freigesetzt wird. Dies ist besonders deshalb wichtig, da die Verweildauer derartiger Verbindungen im Gewebe mehr als 24 Stunden betragen kann.
Durch die nachfolgenden Beispiele wird die vorliegende Erfindung näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken.
Beispiele
Beispiel 1
a) [4-(2-Benzyloxycarbonylamino-3-hydroxypropyl)phenoxy]essigsäurebenzylester
60.2 g (0.2 mol) N-(Z)-Tyrosinol (Kashima et al. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1 , 1988, 535) und 30.4 g (0.22 mol) Kaliumcarbonat werden in 500 mL Tetrahydrofuran und 50 mL Wasser gelöst und bei 0 0C eine Lösung von 50.4 g (0.22 mol) Bromessigsäurebenzylester (Aldrich) in 10O mL Tetrahydrofuran innerhalb 30 min zugetropft und 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 10 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 63.9 g (71 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 69.47 (69.64) H 6.05 (6.01) N 3.12 (3.09)
b) (4-{2-Benzyloxycarbonylamino-3-[bis-(2-benzyloxycarbonylaminoethyl)-amino]-propyl}- phenoxy)essigsäurebenzylester
22.48 g (50 mmol) 4-(2-Benzyloxycarbonylamino-3-hydroxypropyl)phenoxy]essigsäure- benzylester werden in 200 mL Methylenchlorid gelöst und bei -78 0C eine Lösung von 15.5 g (55 mmol) Trifluormethansulfonsäureanhydrid (Aldrich) und 6.97 g (65 mmol) 2,6- Dimethylpyridin (Aldrich) in 100 mL Methylenchlorid innerhalb 30 min zugetropft und 3 h bei 0 0C gerührt. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit je 100 ml Eiswasser extrahiert und die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet. Das Rohprodukt wird nun bei -20 0C zu einer Lösung von 18.57 g (50 mmol) N,N"-Di-Z-diethylentriamin (Fluka) und 12.9 g (100 mmol) Ethyldiisopropylamin in 20O mL Methylenchlorid getropft und 6 h bei -20 0C gerührt. Anschließend wird noch 24 h bei Raumtemperatur nachgerührt. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit je 150 ml Wasser extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Hexan/Ethylacetat 5 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 16.9 g (42 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 68.81 (69.21) H 6.28 (6.15) N 6.98 (6.90)
c) (4-{2-Amino-3-[bis-(2-aminoethyl)-amino]-propyl}-phenoxy)essigsäure
16.06 g (20 mmol) (4-{2-Benzyloxycarbonylamino-3-[bis-(2-benzyloxycarbonylamin-oethyl)- amino]-propyl}-phenoxy)essigsäurebenzylester werden in 300 ml_ Isopropanol gelöst, mit 30 mL Wasser versetzt und 3 g Palladiumkatalysator (10 % Pd/C) hinzugegeben. Man hydriert 8 Stunden bei 50° C. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Ausbeute: 6.2 g (quantitativ) eines farblosen Pulvers
Elementaranalyse:
C 58.04 (58.21) H 8.44 (8.40) N 18.05 (18.01)
d) {4-(3-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}-ethyl)-amino]-2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure
4.65 g (15 mmol) (4-{2-Amino-3-[bis-(2-aminoethyl)-amino]-propyl}-phenoxy)essigsäure und 25.5 g (63 mmol) 3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1[H]- pyridin-2-on (Raymond et al. Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 200 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid- Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 14.5 g (83 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 64.88 (65.09) H 6.14 (6.08) N 8.41 (8.34) e) {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}- ethyl)-amino]-2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure
14.0 g (12 mmol) {4-(3-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-amino]-2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 100O mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 9.9 g (92 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 56.31 (56.67) H 5.96 (6.01) N 10.94 (10.63)
f) Gadolinium-Komplex der {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)-amino]-2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-
1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure
8.96 g (10 mmol) {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-amino]-2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin- 4-carbonyl]-amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure werden in 200 ml_ Tetrahydrofuran und 40 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 20 mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 7.4 g (67 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 4.1 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 48.04 (48.11) H 4.80 (4.86) Gd 14.97 (14.66) N 9.34 (9.39)
Beispiel 2
a) 1 ,5-Bis-[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carboxamido]-3- azapentan
5.16 g (50 mmol) Diethylentriamin (Fluka) und 40.5 g (100 mmol) 3-Benzyloxy-1-(2- methoxyethyl)-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1[H]-pyridin-2-on (Raymond et al. Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 200 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid- Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 18.4 g (84 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 64.18 (64.29) H 6.43 (6.38) N 10.39 (10.35)
b) 2-{[3-Benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-3-(4- tert-butoxycarbonylmethoxyphenoxy)-propionsäuremethylester
30.9 g (100 mmol) 2-Amino-3-(4-tert-butoxycarbonylmethoxyphenoxy)-propionsäuremethyl- ester (Platzek et al., Schering AG, Germany, Ger. Offen. (1996), 33 pp. CODEN: GWXXBX DE 4425781 A1 19960118) und 42.5 g (105 mmol) 3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-4-(2- thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1[H]-pyridin-2-on (Raymond et al. Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 400 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit je 200 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat- Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Ethylacetat/Hexan 1 : 5). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 50.1 g (79 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 64.63 (64.77) H 6.44 (6.38) N 4.71 (4.67)
c) 2-{[3-Benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-3-(4- tert-butoxycarbonylmethoxyphenoxy)-propionsäure
50.0 g (84.1 mmol) 2-{[3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-3-(4-tert-butoxycarbonylmethoxyphenoxy)-propionsäuremethylester werden in 400 mL Methanol und 100 mL 2 N Natriumhydroxid-Lösung gelöst und 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Es wird mit 2 N HCI-Lösung angesäuert (pH = 3.5) und die Hauptmenge Methanol im Vakuum abdestilliert. Die Reaktionsmischung wird mit 300 ml Wasser versetzt, zweimal mit je 250 ml Ethylacetat extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Ethylacetat/Hexan 1 : 3). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 43 g (88 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 64.13 (64.29) H 6.25 (6.19) N 4.82 (4.80)
d) {4-(3-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin- 4-carbonyl]-amino}-ethyl)-phenoxy)essigsäure-tert-butylester
17.42 g (30 mmol) 2-{[3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-3-(4-tert-butoxycarbonylmethoxyphenoxy)-propionsäure und 20.2 g (30 mmol) 1 ,5-Bis-[3-benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbox- amido]-3-azapentan werden in 30O mL Tetrahydrofuran gelöst und bei O 0C 18.9 g (36 mmol) EEDQ [2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1 ,2-dihydrochinolin] (Fluka) hinzugegeben und anschließend 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 24.0 g (65 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 65.09 (65.33) H 6.28 (6.14) N 7.93 (7.88)
e) {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-hydröxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-phenoxy)essigsäure
14.8 g (12 mmol) {4-(3-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-di- hydropyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)-phenoxy)essigsäure-tert-butylester werden in 100 ml_ Essigsäure und 100 ml_ konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 ml_ Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 ml_ Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 1000 mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 9.8 g (90 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 55.44 (55.66) H 5.65 (5.60) N 10.78 (10.75)
f) Gadolinium-Komplex der {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2- oxo-1 , 2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)-phenoxy)essigsäure
9.1 g (10 mmol) {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)-phenoxy)essigsäure werden in 200 ml_ Tetrahydrofuran und 40 ml_ Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 20 ml_ Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft
Ausbeute: 6.7 g (61 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 3.8 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 47.41 (47.56) H 4.55 (4.57) Gd 14.78 (14.69) N 9.21 (9.20)
Beispiel 3
a) {4-(3-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1 -methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)- amino]-2-{[3-benzyloxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-propyl)- phenoxy)essigsäure
4.65 g (15 mmol) (4-{2-Amino-3-[bis-(2-aminoethyl)-amino]-propyl}-phenoxy)essigsäure und 22.7 g (63 mmol) 3-Benzyloxy-1-methyl-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1[H]-pyridin-2-on (Raymond et al.) werden in 200 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid- Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 13.4 g (86 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 66.20 (66.31) H 5.75 (5.72) N 9.48 (9.44)
b) {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)- aminoj^-f^-hydroxy-i-methyl^-oxo-i ^-dihydropyridin^-carbony^-aminoj-propyl)- phenoxy)essigsäure
12.4 g (12 mmol) {4-(3-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}-ethyl)-amino]-2-{[3-benzyloxy-1--methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 1000 mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 8.2 g (90 % d. Th.) Elementaranalyse:
C 56.61 (56.85) H 5.41 (5.33) N 12.84 (12.79)
c) Gadolinium-Komplex der {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-amino]-2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure
7.64 g (10 mmol) {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}-ethyl)-amino]-2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}- propyl)-phenoxy)essigsäure werden in 200 ml_ Tetrahydrofuran und 40 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 2O mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 5.6 g (59 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 3.7 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 47.10 (47.43) H 4.17 (4.22) Gd 17.13 (16.88) N 10.68 (10.67)
Beispiel 4
a) 4-Benzyloxycarbonylamino-5-[bis-(2-benzyloxycarbonylaminoethyl)-amino]pentan- carbonsäurebenzylester
17.87 g (50 mmol) Z-GIu-(OBn)-OH (Bachern) werden in 20O mL Methylenchlorid gelöst und bei -78 0C eine Lösung von 15.5 g (55 mmol) Trifiuomnethansulfonsäureanhydrid (Aldrich) und 6.97 g (65 mmol) 2,6-Dimethylpyridin (Aldrich) in 10O mL Methylenchlorid innerhalb 30 min zugetropft und 3 h bei 0 0C gerührt. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit je 100 ml Eiswasser extrahiert und die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet. Das Rohprodukt wird nun bei -20 0C zu einer Lösung von 18.57 g (50 mmol) N1N^-Di-Z- diethylentriamin (Fluka) und 12.9 g (100 mmol) Ethyldiisopropylamin in 20O mL Methylenchlorid getropft und 6 h bei -20 0C gerührt. Anschließend wird noch 24 h bei Raumtemperatur nachgerührt. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit je 150 ml Wasser extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Hexan/Ethylacetat 5 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 14.5 g (41 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 67.21 (67.44) H 6.52 (6.49) N 7.88 (7.88)
b) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure
14.2 g (20 mmol) 4-Benzyloxycarbonylamino-5-[bis-(2-benzyloxycarbonylaminoethyl)- amino]pentancarbonsäurebenzylester werden in 300 ml_ Isopropanol gelöst, mit 30 ml_ Wasser versetzt und 3 g Palladiumkatalysator (10 % Pd/C) hinzugegeben. Man hydriert 8 Stunden bei 50° C. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Ausbeute: 4.35 g (quantitativ) eines farblosen Pulvers
Elementaranalyse:
C 49.52 (49.67) H 10.16 (10.18) N 25.67 (25.57)
c) 5-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-4-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]amino}pentancarbonsäure
3.27 g (15 mmol) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure und 25.5 g (63 mmol) 3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1 [H]-pyridin-2- on (Raymond et al. Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 200 ml_ Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 13.7 g (85 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 63.73 (63.88) H 6.29 (6.30) N 9.13 (9.07)
d) 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-4-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]amino}pentancarbonsäure
12.9 g (12 mmol) 5-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin- 4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure werden in 100 ml_ Essigsäure und 100 ml_ konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 ml_ Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 ml_ Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 1000 ml_ Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 9.1 g (94 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 53.79 (53.91 ) H 6.14 (6.10) N 12.20 (12.15)
e) Gadolinium-Komplex der 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
8.04 g (10 mmol) 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]amino}pentancarbonsäure werden in 200 ml_ Tetrahydrofuran und 40 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 20 mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Lauf mittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 6.2 g (61 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 4.8 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 45.13 (45.25) H 4.84 (4.87) Gd 16.41 (15.21) N 10.23 (10.23)
Beispiel 5
a) 2-{[3-Benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}pentan- dicarbonsäure-5-tert-butylester-1-methylester
21.7 g (100 mmol) 2-Aminopentandicarbonsäure-5-tert-butylester-1-methylester (Bachern) und 42.5 g (105 mmol) 3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)- 1 [H]-pyridin-2-on (Raymond et al. Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 40O mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit je 200 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Ethylacetat/Hexan 1 : 5). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 41.8 g (83 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 62.14 (62.28) H 6.82 (6.77) N 5.57 (5.54)
b) 2-{[3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}pentan- dicarbonsäure-5-tert-butylester
41.0 g (81.6 mmol) 2-{[3-Benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonylj-aminojpentandicarbonsäure-δ-tert-butylester-i-methylester werden in 400 mL Methanol und 100 mL 2 N Natriumhydroxid-Lösung gelöst und 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Es wird mit 2 N HCI-Lösung angesäuert (pH = 3.5) und die Hauptmenge Methanol im Vakuum abdestilliert. Die Reaktionsmischung wird mit 300 ml Wasser versetzt, zweimal mit je 250 ml Ethylacetat extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Ethylacetat/Hexan 1 : 3). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 35.7 g (90 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 61.46 (61.62) H 6.60 (6.54) N 5.73 (5.70)
c) 4-(2-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin- 4-carbonyl]-amino}buttersäure-tert-butylester
14.66 g (30 mmol) 2-{[3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}pentandicarbonsäure-5-tert-butylester und 20.2 g (30 mmol) 1 ,5-Bis-[3- benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carboxamido]-3-azapentan werden in 300 ml_ Tetrahydrofuran gelöst und bei 0 0C 18.9 g (36 mmol) EEDQ [2-Ethoxy- 1-ethoxycarbonyl-1 ,2-dihydrochinolin] (Fluka) hinzugegeben und anschließend 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 20.3 g (59 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 64.03 (64.21 ) H 6.43 (6.44) N 8.57 (8.50)
d) 4-(2-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-hydroxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}buttersäure
13.7 g (12 mmol) 4-(2-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}buttersäure-tert-butylester werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 100O mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 8.9 g (91 % d. Th.)'
Elementaranalyse:
C 52.87 (52.80) H 5.79 (5.77) N 11.99 (12.00)
e) Gadolinium-Komplex der 4-(2-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-hydroxy-1 -(2-methoxyethyl)-2- oxo-1 , 2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}buttersäure
8.2 g (10 mmol) 4-(2-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-carbamoyl]-2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}buttersäure werden in 200 mL Tetrahydrofuran und 40 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 2O mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 5.8 g (57 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 4.1 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
0 44.48 (44.76) H 4.56 (4.61) Gd 16.18 (15.89) N 10.09 (10.07) Beispiel 6
a) 5-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1 -methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)- amino]-4-{[3-benzyloxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentan- carbonsäure
3.27 g (15 mmol) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure und 22.7 g (63 mmol) 3-Benzyloxy-1-methyl-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1 [H]-pyridin-2-on (Raymond et al., Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 200 ml_ Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 12.3 g (87 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 65.03 (65.14) H 5.88 (5.85) N 10.41 (10.38)
b) 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1 -methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)amino]- 4-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
11.3 g (12 mmol) 5-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-4-{[3-benzyloxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}- pentancarbonsäure werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 100O mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 7.4 g (92 % d. Th.) Elementaranalyse:
C 53.65 (53.88) H 5.55 (5.52) N 14.60 (14.49)
c) Gadolinium-Komplex der 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2.-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]amino}pentancarbonsäure
6.72 g (10 mmol) 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-4-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}- pentancarbonsäure werden in 200 ml_ Tetrahydrofuran und 40 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 2O mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 5.2 g (60 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 3.8 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 43.63 (43.89) H 4.15 (4.17) Gd 19.04 (18.88) N 11.87 (11.89)
Beispiel 7
a) {5-Benzyloxycarbonylamino-6-[bis-(2-benzyloxycarbonylaminoethyl)-amino]hexyl}- carbaminsäure-tert-butylester
18.32 g (50 mmol) Z-Lys-(ε-boc)-ol (Ripka et al. Org. Lett. 2001, 2309-2312.) werden in 20O mL Methylenchlorid gelöst und bei -78 ° C eine Lösung von 15.5 g (55 mmol) Trifluormethansulfonsäureanhydrid (Aldrich) und 6.97 g (65 mmol) 2,6-Dimethylpyridin (Aldrich) in 100 mL Methylenchlorid innerhalb 30 min zugetropft und 3 h bei 0 0C gerührt. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit je 100 ml Eiswasser extrahiert und die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet. Das Rohprodukt wird nun bei -20 0C zu einer Lösung von 18.57 g (50 mmol) N,N"-Di-Z-diethylentriamin (Fluka) und 12.9 g (100 mmol) Ethyldiisopropylamin in 200 mL Methylenchlorid getropft und 6 h bei -20 0C gerührt.
Anschließend wird noch 24 h bei Raumtemperatur nachgerührt. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit je 150 ml Wasser extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel Chromatographien
(Hexan/Ethylacetat- 5 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft.
Ausbeute: 15.9 g (44 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 65.07 (65.23) H 7.42 (7.37) N 9.73 (9.67)
b) {5-Amino-6-[bis-(2-aminoethyl)amino]hexyl}carbaminsäure-tert-butylester
14.4 g (20 mmol) {5-Benzyloxycarbonylamino-6-[bis-(2-benzyloxycarbonylaminoethyl)- amino]hexyl}carbaminsäure-tert-butylester werden in 300 mL Isopropanol gelöst, mit 30 mL Wasser versetzt und 3 g Palladiumkatalysator (10 % Pd/C) hinzugegeben. Man hydriert 8 Stunden bei 50° C. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Ausbeute: 6.3 g (quantitativ) eines farblosen Pulvers
Elementaranalyse:
C 56.75 (56.89) H 1 1.11 (1 1.09) N 22.06 (22.01)
c) 6-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-5-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]amino}hexylcarbaminsäure-tert-butylester
4.76 g (15 mmol) {5-Amino-6-[bis-(2-aminoethyl)amino]hexyl}carbaminsäure-tert-butylester und 25.5 g (63 mmol) 3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)- 1 [H]-pyridin-2-on (Raymond et al. Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 20O mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid- Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 14.6 g (83 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 64.49 (64.58) H 6.87 (6.84) N 9.55 (9.49)
d) 6-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-5-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyljhexylamin
14.1 g (12 mmol) 6-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-5-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin- 4-carbonyl]amino}hexylcarbaminsäure-tert-butylester werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 100O mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 8.9 g (92 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 55.35 (55.54) H 6.78 (6.73) N 13.96 (13.88)
e) Gadolinium-Komplex des 6-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)amino]-5-{[3-hydroxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]hexylamins
8.03 g (10 mmol) 6-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-5-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]hexylamin werden in 200 mL Tetrahydrofuran und 40 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 2O mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 ml_ Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 5.9 g (59 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 4.1 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 46.43 (46.62) H 5.37 (5.39) Gd 16.43 (16.26) N 11.71 (11.68)
f) Gadolinium-Komplex des {6-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)amino]-5-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]hexyl}-2-(maleinimido)propionamides
2.87 g (3 mmol) des in Beispiel 7e beschriebenen Gd-Komplexamides werden in 15 mL Dimethylformamid gelöst unter Eiskühlung mit 879 mg (3.3 mmol) N- Maleinimidopropionsäure-(-N-hydroxysuccinimid)ester (Aldrich) und 0.7 mL N1N- Diisopropylethylamin in 10 ml Dimethylformamid hinzugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird im Eisbad gekühlt, filtriert, und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol: 1/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 2.0 g (58 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 5.7 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 47.69 (47.88) H 5.09 (5.1 1) Gd 14.19 (13.92) N 11.38 (11.33) Beispiel 8
a) 2-{[3-Benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-6-tert- butoxycarbonylaminohexansäuremethylester
26 g (100 mmol) 2-Amino-6-tert-butoxycarbonylaminohexansäuremethylester (Bachern) und 42.5 g (105 mmol) 3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1[H]- pyridin-2-on (Raymond et al. Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 400 ml_ Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit je 200 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Ethylacetat/Hexan 1 : 5). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 44.3 g (81 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 61.64 (61.79) H 7.20 (7.14) N 7.70 (7.72)
b) 2-{[3-Benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-6-tert- butoxycarbonylaminohexansäure
43.0 g (78.8 mmol) 2-{[3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-6-tert-butoxycarbonylaminohexansäuremethylester werden in 400 ml_ Methanol und 100 ml_ 2 N Natriumhydroxid-Lösung gelöst und 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Es wird mit 2 N HCI-Lösung angesäuert (pH = 3.5) und die Hauptmenge Methanol im Vakuum abdestilliert. Die Reaktionsmischung wird mit 300 ml Wasser versetzt, zweimal mit je 250 ml Ethylacetat extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Ethylacetat/Hexan 1 : 3). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 37.3 g (89 % d. Th.) Elementaranalyse:
C 61.00 (61.35) H 7.02 (6.89) N 7.90 (7.82)
c) {5-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2.-dihyclropyridin-4-carbonyl]- amino}-ethyl)-carbamoyl]-5-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 )2-dihydropyridin- 4-carbonyl]-amino}pentyl}carbaminsäure-tert-butylester
15.95 g (30 mmol) 2-{[3-Benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-6-tert-butoxycarbonylaminohexansäure und 20.2 g (30 mmol) 1 ,5-Bis-[3- benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carboxamido]-3-azapentan werden in 300 ml_ Tetrahydrofuran gelöst und bei 0 0C 18.9 g (36 mmol) EEDQ [2-Ethoxy- 1-ethoxycarbonyl-1 ,2-dihydrochinolin] (Fluka) hinzugegeben und anschließend 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 22.5 g (63 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 63.73 (63.89) H 6.62 (6.59) N 9.44 (9.38)
d) 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}- ethyl)-carbamoyl]-5-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}pentylamin
14.25 g (12 mmol) (5-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-carbamoyl]-5-{[3-benzyloxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}pentyl}carbaminsäure-tert-butylester werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 1000 mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 8.8 g (90 % d. Th.) Elementaranalyse:
C 54.40 (54.67) H 6.42 (6.39) N 13.72 (13.65)
e) Gadolinium-Komplex des 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1 -(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)-carbamoyl]-5-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2- oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}pentylamins
8.17 g (10 mmol) 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}-ethyl)-carbamoyl]-5-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}pentylamin werden in 200 mL Tetrahydrofuran und 40 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 2O mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 6.2 g (61 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 3.7 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 45.76 (45.99) H 5.09 (5.13) Gd 16.19 (15.88) N 11.54 (11.49)
f) Gadolinium-Komplex der {6-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)amino]-5-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]hexylcarbamoyl}methoxyessigsäure
2.91 g (3 mmol) des in Beispiel 8e beschriebenen Gd-Komplexamides werden in 15 mL Dimethylformamid gelöst unter Eiskühlung mit 697 mg (6 mmol) Diglycolsäureanhydrid (Aldrich) und 1.2 mL N.N-Diisopropylethylamin in 10 ml Dimethylformamid hinzugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird im Eisbad gekühlt, filtriert, und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird an Kieselgel Chromatographien (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol: 1/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 1.45 g (41 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 6.4 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 45.30 (45.52) H 4.91 (4.95) Gd 14.46 (14.22) N 10.31 (10.30)
Beispiel 9
a) 6-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1 -methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)- amino]-5-{[3-benzyloxy-1 -methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}hexyl- carbaminsäure-tert-butylester
4.76 g (15 mmol) {5-Amino-6-[bis-(2-aminoethyl)amino]hexyl}carbaminsäure-tert-butylester und 22.7 g (63 mmol) 3-Benzyloxy-1-methyl-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1 [H]-pyridin- 2-on (Raymond et al. Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 200 ml_ Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 13.2 g (84 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 65.75 (65.91) H 6.58 (5.62) N 10.76 (10.68)
b) 6-[Bis-(2-{[3-hydroxy-ϊ -methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)amino]- 5-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}hexylamin
12.5 g (12 mmol) 6-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-5-{[3-benzyloxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}- hexylcarbaminsäure-tert-butylester werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 ml_ Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 ml_ Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 1000 ml_ Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 7.6 g (93 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 55.51 (55.60) H 6.31 (6.31) N 16.71 (16.64)
c) Gadolinium-Komplex des 6-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-5-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]amino}hexylamins
6.71 g (10 mmol) 6-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-5-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}- hexylamin werden in 200 ml_ Tetrahydrofuran und 40 ml_ Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 20 ml_ Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 ml_ Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 5.1 g (57 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 4.4 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 45.14 (45.47) H 4.76 (4.80) Gd 19.06 (18.77) N 13.58 (13.45) d) Gadolinium-Komplex des 6-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-5-{[3-hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]amino}-6-(isothiocyanato)-hexylamins
2.47 g (3 mmol) des in Beispiel 9c beschriebenen Gd-Komplexamins werden in einem zwei Phasen Gemisch aus 50 ml_ Wasser und 50 ml_ Methylenchlorid gelöst und bei 0 0C mit 1.73 g (15 mmol) Thiophosgen versetzt. Man läßt auf Raumtemperatur erwärmen und rührt noch zwei Stunden bei dieser Temperatur. Anschließend wird die wäßrige Phase dreimal mit je 50 ml_ Methylenchlorid extrahiert und gefriergetrocknet. Der Rückstand wird an Kieselgel Chromatographien (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol: 1/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 721 mg (27 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 6.1 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 44.33 (44.71) H 4.30 (4.34) Gd 18.14 (17.88) N 12.92 (12.84)
Beispiel 10
Gadolinium-Komplex des {4-(3-[Bis-(2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl]-amino}-ethyl)-amino]-2-{[3-hydroxy-1-(2-methoxyethyl)-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}-propyl)-phenoxy)-Λ/-[2-(aminoethylethyl)-maleinimido]- acetamides
3.15 g (3 mmol) der in Beispiel 1f beschriebenen Gd-Komplexsäure werden in 15 ml_ Dimethylformamid gelöst, und unter Eiskühlung mit 380 mg (3.3 mmol) N- Hydroxysuccinimid und 681 mg (3.3 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 1 Stunde im Eis voraktiviert. Anschließend wird eine Mischung aus 839 mg (3.3 mmol) N-(2- Aminoethyl)maleinimid Trifluoracetatsalz (Arano et al., J. Med. Chem., 1996, 39, 3458) und 0.7 ml_ N,N-Diisopropylethylamin in 10 ml Dimethylformamid hinzugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird erneut im Eisbad gekühlt, filtriert, und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol: 1/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 1.4 g (37 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 6.1 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 49.18 (49.44) H 4.81 (4.84) Gd 13.41 (13.21) N 10.75 (10.69)
Beispiel 11
a) 5-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)- amino]-4-{[3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentan- carbonsäure
3.27 g (15 mmol) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure und 22.7 g (63 mmol) 3-Benzyloxy-6-methyl-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1 [H]-pyridin-2-on (Doble et al., Inorg. Chem. 2003, 42, 4935) werden in 200 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 mL 1 N Natriumhydroxid- Lösung und mit 100 mL gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 11.6 g (82 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 65.03 (64.94) H 5.88 (5.77) N 10.41 (10.51)
b) 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)amino]- 4-{[3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
11.3 g (12 mmol) 5-[Bis-(2-{[3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-4-{[3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}- pentancarbonsäure werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlor- wasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 ml_ Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 ml_ Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 100O mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 6.9 g (85 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 53.65 (53.52) H 5.55 (5.67) N 14.60 (14.81)
c) Gadolinium-Komplex der 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-car- bonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- aminojpentancarbonsäure
6.72 g (10 mmol) 5-[Bis-(2-{[3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-4-{[3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}- pentancarbonsäure werden in 200 mL Tetrahydrofuran und 40 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 2O mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1 ). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 5.9 g (71 % d. Th.) eines leicht graugelblich gefärbten Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 3.8 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 43.63 (43.55) H 4.15 (4.23) Gd 19.04 (18.74) N 11.87 (1 1.91) Beispiel 12
a) 5-Benzyloxy-2,3-dimethyl-6-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-1 [H]-pyrimidin-4-on
21.94 g (80 mmol) 5-Benzyloxy-2,3-dimethyl-6-carboxy-1 [H]-pyrimidin-4-on (Sunderland et al., Inorg. Chem. 2001 , 40, 6746) und 12.24 g (88 mmol) 4-Nitrophenol werden in 60O mL Tetrahydrofuran gelöst und bei 0 0C 18.16 g (88 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (Fluka) hinzugegeben und anschließend 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird abfiltriert, das Filtrat wird zur Trockene eingedampft und das Rohprodukt aus Diisopropylether umkristallisiert. Ausbeute: 25.5 g (81 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 60.76 (60.91) H 4.33 (4.27) N 10.63 (10.42)
b) 5-[Bis-(2-{[5-benzyloxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin-6-carbonyl]- amino}ethyl)amino]-4-{[5-benzyloxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin-6- carbonyl]amino}pentancarbonsäure
3.27 g (15 mmol) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure und 24.91 g (63 mmol) 5-Benzyloxy-2,3-dimethyl-6-(4-nitrophenyloxycarbonyl-1 [H]-pyrimidin-4-on) werden in 200 ml_ Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 9.6 g (65 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 62.06 (61.93) H 5.92 (5.85) N 14.19 (14.28) c) 5-[Bis-(2-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-314-dihydropyrimidin-6-carbonyl]-amino}ethyl)- aminol^-ttS-hydroxy^.S-dinnethyl^-oxo-S.Φdihydropyrimidin-e-carbonyljaminoJpentan- carbonsäure
1 1.8 g (12 mmol) 5-[Bis-(2-{[5-benzyloxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin-6- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[5-benzyloxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin -6- carbonyl]amino}pentancarbonsäure werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 1000 mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 7.5 g (87 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 50.28 (50.02) H 5.63 (5.68) N 19.54 (19.20)
d) Gadolinium-Komplex der 5-[Bis-(2-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin - 6-carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin - 6-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
7.17 g (10 mmol) 5-[Bis-(2-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin -6- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin -6- carbonyl]amino}pentancarbonsäure werden in 200 mL Tetrahydrofuran und 40 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 2O mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 6.9 g (73 % d. Th.) eines graugelblichen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 7.8 % Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 41.37 (41.05) H 4.28 (4.22) Gd 18.06 (17.81 ) N 16.08 (15.84)
Beispiel 13
a) {4-(3-[Bis-(2-{[5-benzyloxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin-6-carbonyl]-amino}- ethyl)-amino]-2-{[5-benzyloxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin -6-carbonyl]- amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure
4.65 g (15 mmol) (4-{2-Amino-3-[bis-(2-aminoethyl)-amino]-propyl}-phenoxy)essigsäure und 23.65 g (63 mmol) 3-Benzyloxy-1 ,6-dimethyl-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1[H]- pyrimidin-2-on (Raymond et al., Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 200 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 10O mL 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 10O mL gesättigter Natriumchlorid- Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 12.5 g (77 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 63.44 (63.31 ) H 5.79 (5.62) N 12.98 (13.21 )
b) {4-(3-[Bis-(2-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin -6-carbonyl]-amino}- ethyl)-amino]-2-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin -6-carbonyl]- amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure
12.95 g (12 mmol) {4-(3-[Bis-(2-{[5-benzyloxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin -6- carbonyl]-amino}-ethyl)-amino]-2-{[5-benzyloxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyhmidin -6- carbonyl]-amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure werden in 10O mL Essigsäure und 10O mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 200 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 25 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 1000 ml_ Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 7.9 g (81 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 53.46 (53.13) H 5.48 (5.39) N 17.32 (17.27)
c) Gadolinium-Komplex der {4-(3-[Bis-(2-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrirni- din-6-carbonyl]-amino}-ethyl)-amino]-2-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydro- pyrimidin -6-carbonyl]-amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure
7.64 g (10 mmol) {4-(3-[Bis-(2-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin-6- carbonyl]-amino}-ethyl)-amino]-2-{[5-hydroxy-2,3-dimethyl-4-oxo-3,4-dihydropyrimidin -6- carbonyl]-amino}-propyl)-phenoxy)essigsäure werden in 200 ml_ Tetrahydrofuran und 40 ml_ Methanol unter Rückfluß gelöst und 2.3 g (10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 2O mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft Ausbeute: 7.43 g (72 % d. Th.) eines leicht gelblichen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 6.7 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 44.90 (45.05) H 4.29 (4.22) Gd 16.33 (15.89) N 14.54 (14.32)
Beispiel 14
a) 4-(Amino)-5-(bis-{2-[(3-benzyloxy-1 -methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)- amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure
3.27 g (15 mmol) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure und 10.8 g (30 mmol) 3-Benzyloxy-1-methyl-4-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1[H]-pyridin-2-on (Ray- mond et al., Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 200 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 10 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 4.4 g (42 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 63.42 (63.52) H 6.33 (6.29) N 11.99 (11.94)
b) 4-[2,3-Bisbenzyloxy-(4-carboxy)benzoylamino]-5-(bis-{2-[(3-benzyloxy-1-methyl-2-oxo- 1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure
4.2 g (6 mmol) 4-(Amino)-5-(bis-{2-[(3-benzyloxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl)-amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure und 5.8 g (10 mmol) (2,3-Bisbenzyloxy)- 1 ,4-(bis-2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)benzol (Raymond et al., Inorg. Chem. (2003), (42), 4930) werden in 100 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 10 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 5.7 g (89 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 66.78 (66.89) H 5.70 (5.66) N 7.92 (7.95)
c) 4-[2,3-Dihydroxy-(4-carboxy)benzoylamino]-5-(bis-{2-[(3-hydroxy-1 -methyl-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure
5.3 g (5 mmol) 4-[2,3-Bisbenzyloxy-(4-carboxy)benzoylamino]-5-(bis-{2-[(3-benzyloxy-1- methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure werden in 50 ml_ Essigsäure und 50 mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 100 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 20 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 1000 mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 3.15 g (90 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 53.14 (53.27) H 5.18 (5.16) N 11.99 (11.95)
d) Gadolinium-Komplex der 4-[2,3-Dihydroxy-(4-carboxy)benzoylamino]-5-(bis-{2-[(3- hydroxy-1-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentan- carbonsäure
2.8 g (4 mmol) 4-[2,3-Dihydroxy-(4-carboxy)benzoylamino]-5-(bis-{2-[(3-hydroxy-1-methyl-2- oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure werden in 100 mL Tetrahydrofuran und 20 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 0.92 g (4 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 10 mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 2 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft
Ausbeute: 2.0 g (56 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 4.1 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 43.55 (43.69) H 3.89 (3.92) Gd 18.39 (18.17) N 9.83 (9.81)
Beispiel 15 a) 4-(Amino)-5-(bis-{2-[(3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)- amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure
3.27 g (15 mmol) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure und 10.8 g (30 mmol) 3-Benzyloxy-6-methyl-4>-(2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)-1 [l-l]-pyridin-2-on (Raymond et al., Inorg. Chem. (2000), (39), 2652) werden in 200 ml_ Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 10 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 4.9 g (47 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 63.42 (63.49) H 6.33 (6.30) N 1 1.99 (1 1.91 )
b) 4-[2,3-Bisbenzyloxy-(4-carboxy)benzoylamino]-5-(bis-{2-[(3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo- 1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure
4.2 g (6 mmol) 4-(Amino)-5-(bis-{2-[(3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl)-amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure und 5.8 g (10 mmol) (2,3-Bisbenzyloxy)- 1 ,4-(bis-2-thioxothiazolidin-3-carbonyl)benzol (Raymond et al., Inorg. Chem. (2003), (42), 4930) werden in 100 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 100 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 100 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 10 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 5.8 g (91 % d. Th.) Elementaranalyse:
C 66.78 (66.92) H 5.70 (5.65) N 7.92 (7.88)
c) 4-[2,3-Dihydroxy-(4-carboxy)ben2oylamino]-5-(bis-{2-[(3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure
5.3 g (5 mmol) 4-[2,3-Bisbenzyloxy-(4-carboxy)benzoylamino]-5-(bis-{2-[(3-benzyloxy-6- methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure werden in 50 ml_ Essigsäure und 50 mL konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und drei Tage unter Stickstoff abgedunkelt gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingeengt, dreimal mit je 100 mL Methanol versetzt und jeweils erneut eingeengt. Der Rückstand wird in 20 mL Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam in 1000 mL Diethylether gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wird abgesaugt, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 3.0 g (86 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 53.14 (53.32) H 5.18 (5.24) N 11.99 (11.87)
d) Gadolinium-Komplex der 4-[2,3-Dihydroxy-(4-carboxy)benzoylamino]-5-(bis-{2-[(3- hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentan- carbonsäure
2.8 g (4 mmol) 4-[2,3-Dihydroxy-(4-carboxy)benzoylamino]-5-(bis-{2-[(3-hydroxy-6-methyl-2- OXO- 1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)amino]ethyl}amino)pentancarbonsäure werden in 100 mL Tetrahydrofuran und 20 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 0.92 g (4 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 10 mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 2 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft
Ausbeute: 2.2 g (61 % d. Th.) eines farblosen Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 4.3 % Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 43.55 (43.59) H 3.89 (3.87) Gd 18.39 (18.22) N 9.83 (9.86)
Beispiel 16 -
a) 1 -(Natrium sulfonatobutyl)-4-carboxy-3-benzyloxy-6-methyl-1 [H]-pyridin-2-on
4.31 g (15 mmol) 4-Ethoxycarbonyl-3-benzyloxy-6-methyl-1 [H]-pyridin-2-on (Internationale Patentanmeldung WO 03/016923, Beispiel 2) in 15 mL DMF werden mit 0.41 g (17 mmol) Lithiumhydroxid versetzt und nach Zugabe von 2.04 g (15 mmol) 1 ,4-Butansulton über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand mit 50 mL 2 N Natronlauge versetzt und 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird durch Zugabe von Amberlite® I R- 120 (H+) Ionenaustauscher auf pH 3 eingestellt und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wird an einer RP-18-Lichroprep-Säule (Eluent: Wasser) Chromatographien. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 2.44 g (39 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 51.79 (51.53) H 4.83 (4.97) N 3.36 (3.12) Na 5.51(5.1 1) S 7.68 (7.29)
b) 1 -(Natrium sulfonatobutyl)-4-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-3-benzyloxy-6-methyl-1[H]-pyri- din-2-on
2.09 g (5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 16a und 765 mg (5.5 mmol) Nitrophenol werden in 30 mL DMF gelöst, mit 1 mL Ethyldiisopropylamin und 1.77 g (5.5 mmol) O- (Benzotriazol-1 -yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborat versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Isopropanol). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 2.02 g (75 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 53.53 (53.42) H 4.31 (4.55) N 5.20 (5.03) Na 4.27 (4.02) S 5.95 (6.20) c) 5-[Bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3-benzyloxy-6-methyl-2- oxo-1 , 2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
2.15 g (4 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 16b und 262 mg (1.2 mmol) 4-Amino-5- [bis-(2-aminoethyl)arnino]pentancarbonsäure (Beispiel 4b) werden in 50 ml_ DMF gelöst, mit 870 μL (5 mmol) Ethyldiisopropylamin versetzt und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP-18 chroma- tographiert (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 1.51 g (89 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 53.42 (53.21) H 5.41 (5.67) N 6.92 (6.77) Na 4.87 (5.01) S 6.79 (6.38)
d) 5-[Bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3- hydroxy -6-methyl-2-oxo- 1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
Zu einer Lösung von 1.42 g (1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 16c in 10O mL Ethanol gibt man 1.0 g Palladium Katalysator (10% Pd/C) und hydriert 48 h bei Raumtemperatur. Man filtriert vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockene ein. Der Rückstand wird ohne weitere Charakterisierung komplexiert. Ausbeute: 1.15 g (quant.)
e) Gadolinium-Komplex der 5-[Bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3-hydroxy-6-methyl-2- OXO- 1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3- hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
Zu 1.15 g (1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 16d in 50 mL Wasser werden bei pH 8.5 (pH-Stat) 371 mg (1 mmol) Gadoliniumchlorid-hexahydrat zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP-18 chromatographiert (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 1.04 g (72 % d. Th.) Wassergehalt (Karl-Fischer): 8.1 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 38.15 (37.88) H 4.12 (4.23) Gd 11.89 (11.62) N 7.41 (7.39) Na 6.95 (7.11)
S 7.27 (7.09)
Beispiel 17
a) 2,3-Bisbenzyloxyterephthalsäuremono-N-methylamid
20.0 g (34.9 mmol) Disuccinimido 2,3 Bis(benzyloxy)terephthalat (J Am Chem Soc 1991 , 113, 2965) werden mit 2.73 g (34.9 mmol) 40%iger wäßriger N-Methylamin-Lösung versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 9.7 g (71 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 70.58 (70.41) H 5.41 (5.29) N 3.58 (3.62)
b) 2,3-Bisbenzyloxyterephthalsäuremono-N-methylamid-mono-(p-nitrophenylester)
7.83 g (20 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 17a und 3.06 g (22 mmol) Nitrophenol werden in 100 ml_ DMF gelöst, mit 5 ml_ Ethyldiisopropylamin und 7.1 g (22 mmol) O- (Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborat versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und aus Isopropanol umkristallisiert. Ausbeute: 8.40 g (82 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 67.96 (67.79) H 4.72 (4.66) N 5.47 (5.53) c) 4-Amino-5-[bis-(2-{1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3-benzy!oxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl}-aminoethyl)amino]-pentancarbonsäure
2.15 g (4 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 16b und 437 mg (2 mmol) 4-Amino-5-[bis- (2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure (Beispiel 4b) werden in 50 ml_ DMF gelöst, mit 870 μl_ (5 mmol) Ethyldiisopropylamin und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP- 18 Chromatographien (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 1.14 g (56 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 53.14 (52.94) H 5.75 (5.67) N 8.26 (8.32) Na 4.52 (4.76) S 6.30 (6.03)
d) 4-[(2,3-bis(benzyloxy)-4-methylaminocarbonyl)-benzoylamino]-5-[Bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)- amino]-pentancarbonsäure
1.02 g (1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 17c und 0.67 g (1.3 mmol) des in Beispiel 17b beschriebenen Aktivesters werden in 5O mL DMF gelöst, mit 1 ml_ N- Ethyldiisopropylamin versetzt und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP-18 Chromatographien (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 1.17 g (84 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 58.74 (58.47) H 5.58 (5.67) N 7.05 (7.13) Na 3.31 (3.12) S 4.61 (4.22)
e) 4-[(2,3-Dihydroxy-4-methylaminocarbonyl)-benzoylamino]-5-[Bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)- aminoj-pentancarbonsäure Zu einer Lösung von 973 mg (0.7 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 17d in 5O mL Ethanol gibt man 0.5 g Palladium Katalysator (10% Pd/C) und hydriert 48 h bei Raumtemperatur. Man filtriert vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockene ein. Der Rückstand wird ohne weitere Charakterisierung komplexiert. Ausbeute: 720 mg (quant.)
f) Gadolinium-Komplex der 4-[(2,3-dihydroxy-4-methylaminocarbonyl)-benzoylamino]-5- [Bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatobutyl)-3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-pentancarbonsäure, Natriumsalz
Zu 720 mg (0.7 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 17e in 50 mL Wasser werden bei pH 8.5 (pH-Stat) 260 mg (0.7 mmol) Gadoliniumchlorid-hexahydrat zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP-18 chromatographiert (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 755 mg (79 % d. Th.) Wassergehalt (Karl-Fischer): 10.0 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
C 39.12 (39.34) H 3.94 (4.07) Gd 12.80 (12.82) N 7.98 (8.21) Na 7.49 (7.86)
S 5.22 (5.03)
Beispiel 18
a) 1 -(Natrium sulfonatopropyl)- 4-carboxy-3-benzyloxy-6-methyl-1 [H]-pyridin-2-on
4.31 g (15 mmol) 4-Ethoxycarbonyl-3-benzyloxy-6-methyl-1[H]-pyridin-2-on (Internationale Patentanmeldung WO 03/016923, Beispiel 2) in 15 mL DMF werden mit 0.41 g (17 mmol) Lithiumhydroxid versetzt und nach Zugabe von 1.83 g (15 mmol) 1 ,3-Propansulton über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand mit 50 mL 2 N Natronlauge versetzt und 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird durch Zugabe von Amberlite® IR-120 (H+) Ionenaustauscher auf pH 3 eingestellt und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wird an einer RP-18-Lichroprep-Säule (Eluent: Wasser) chromatographiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 5.49 g (37 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 50.62 (50.41) H 4.50 (4.77) N 3.47 (3.30) Na 5.70 (5.92) S 7.95 (7.51)
b) 1 -(Natrium sulfonatopropyl)-4-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-3-benzyloxy-6-methyl-1 [H]- pyridin-2-on
2.02 g (5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 18a und 765 mg (5.5 mmol) Nitrophenol werden in 30 ml_ DMF gelöst, mit 1 mL Ethyldiisopropylamin und 1.77 g (5.5 mmol) O- (Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborat versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Isopropanol). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 2.02 g (77 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 52.67 (52.55) H 4.04 (3.89) N 5.34 (5.67) Na 4.38 (4.05) S 6.11 (6.49)
c) 5-[Bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatopropyl)-3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[1 -(Natrium sulfonatopropyl)-3-benzyloxy-6-methyl-2- oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
2.10 g (4 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 18b und 262 mg (1.2 mmol) 4-Amino-5- [bis-(2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure (Beispiel 4b) werden in 50 mL DMF gelöst, mit 870 μL (5 mmol) Ethyldiisopropylamin und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP-18 chromatographiert (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 1.35 g (82 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 52.43 (52.21) H 5.13 (5.43) N 7.13 (6.96) Na 5.02 (5.00) S 7.00 (6.69) d) 5-[Bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatopropyl)-3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[1 -(Natrium sulfonatopropyl)-3-hydroxy-6-methyl-2-oxo- 1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
Zu einer Lösung von 1.37 g (1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 18c in 10O mL Ethanol gibt man 1.0 g Palladium Katalysator (10% Pd/C) und hydriert 48 h bei Raumtemperatur. Man filtriert vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockene ein. Der Rückstand wird ohne weitere Charakterisierung komplexiert. Ausbeute: 1.10 g (quant.)
e) Gadolinium-Komplex der 5-[Bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatopropyl)-3-hydroxy-6-methyl-2- oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)amino]-4-{[1 -(Natrium sulfonatopropyl)- 3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]amino}pentancarbonsäure
Zu 1.10 g (1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 18d in 50 mL Wasser werden bei pH 8.5 (pH-Stat) 371 mg (1 mmol) Gadoliniumchlorid-hexahydrat zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP-18 Chromatographien (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 1.03 g (75 % d. Th.) Wassergehalt (Karl-Fischer): 7.0 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
0 36.59 (36.33) H 3.78 (3.87) Gd 12.28 (12.04) N 7.66 (7.50) Na 7.18 (6.82)
S 7.51 (7.62)
Beispiel 19
a) 4-Amino-5-[bis-(2-{1 -(Natrium sulfonatopropyl)-3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydro- pyridin-4-carbonyl}-aminoethyl)amino]-pentancarbonsäure
2.10 g (4 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 18b und 437 mg (2 mmol) 4-Amino-5-[bis- (2-aminoethyl)amino]pentancarbonsäure (Beispiel 4b) werden in 50 mL DMF gelöst, mit 870 μL (5 mmol) Ethyldiisopropylamin und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP-18 chromato- graphiert (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 1.03 g (52 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 52.22 (52.13) H 5.50 (5.67) N 8.50 (8.38) Na 4.65 (4.86) S 6.48 (6.17)
b) 4-[(2,3-Bis(benzyloxy)-4-methylaminocarbonyl)-benzoylamino]-5-[bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatopropyl)-3-benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}- ethyl)amino]-pentancarbonsäure
989 mg (1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 19a und 0.67 g (1.3 mmol) des in Beispiel 17b beschriebenen Aktivesters werden in 5O mL DMF gelöst, mit 1 ml_ N- Ethyldiisopropylamin versetzt und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP-18 chromato- graphiert (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 1.08 g (79 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 58.18 (58.35) H 5.40 (5.61) N 7.20 (7.06) Na 3.37 (3.20) S 4.71 (4.44)
c) 4-[(2,3-Dihydroxy-4-methylaminocarbonyl)-benzoylamino]-5-[bis-(2-{[1-(Natrium sulfonatopropyl)-3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl]-amino}ethyl)- amino]-pentancarbonsäure
Zu einer Lösung von 954 mg (0.7 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 19b in 5O mL Ethanol gibt man 0.5 g Palladium Katalysator (10% Pd/C) und hydriert 48 h bei Raumtemperatur. Man filtriert vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockene ein. Der Rückstand wird ohne weitere Charakterisierung komplexiert. Ausbeute: 701 mg (quant.) Elementaranalyse:
0 45.55 (45.32) H 4.93 (5.12) N 9.79 (9.60) Na 4.59 (4.76) S 6.40 (6.17)
d) Gadolinium-Komplex der 4-[(2,3-Dihydroxy-4-methylaminocarbonyl)-benzoylamino]-5- [bis-(2-{[1 -(Natrium sulfonatopropyl)-3-hydroxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl]-amino}ethyl)amino]-pentancarbonsäure
Zu 701 mg (0.7 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 19c in 50 ml_ Wasser werden bei pH 8.5 (pH-Stat) 260 mg (0.7 mmol) Gadoliniumchlorid-hexahydrat zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und an Lichroprep RP-18 Chromatographien (Wasser/Acetonitril-Gradient). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 700 mg (75 % d. Th.) Wassergehalt (Karl-Fischer): 10 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
0 38.03 (37.88) H 3.70 (3.67) Gd 13.10 (12.96) N 8.17 (8.31) Na 7.66 (7.39)
S 5.34 (5.61)
Beispiel 20
a) Trifluormethansulfonsäure-[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]- ester
30.02 g (50 mmol) 1 ,3-Bis-(2-benzyloxy-1-benzyloxymethyl-ethoxy)-propan-2-ol (Cassel et al., Eur. J. Org. Chem., 2001 , 5, 875-896) und 6.43 g (60 mmol) 2,6-Dimethylpyridin werden in 30O mL Methylenchlorid gelöst, bei -20 0C langsam mit 15.52 g (55 mmol) Trifluormethansulfonsäureanhydrid versetzt und 2 h bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird auf 0 0C erwärmt und zweimal mit je 100 mL Eiswasser extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum zur Trockene eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Hexan/Ethylacetat 10 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 30.2 g (82 % d. Th.) als farbloses Öl
Elementaranalyse: C 62.28 (62.66) H 5.91 (6.12) N 7.78 (7.44)
b) 3-Benzyloxy-1 -[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-6-methyl-2- oxo-1 , 2-dihydropyridin-4-carbonsäureethylester
11.5 g (40 mmol) 3-Benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonsäureethylester (Doble et al., Inorg. Chem. 2003, 42, 4935) werden bei 0 0C in 150 ml THF gelöst und langsam mit 41.5 ml (44 mmol) LiHMDS (1.06 M in THF) versetzt. Anschließend werden bei -20 0C 29.31 g (40 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 20a gelöst in 10O mI THF zugetropft und 2 h bei dieser Temperatur, sowie 4 h bei 0 0C gerührt. Die Reaktionsmischung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromato- graphiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 23.4 g (67 % d. Th.) als farbloses Öl
Elementaranalyse:
C 73.17 (73.44) H 6.84 (6.87) N 1.61 (1.59)
c) 3-Benzyloxy-1 -[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-6-methyl-2- oxo-1 , 2-dihydropyridin-4-carbonsäure
22.5 g (25.86 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 20b werden in 200 ml Methanol und 50 ml 2 N Kaliumhydroxid-Lösung gelöst und 6 h unter Rückfluß erhitzt. Es wird zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 250 ml Wasser aufgenommen und mit 6 N Salzsäure angesäuert (pH = 1). Der ausfallende Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser mehrfach nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 21.4 g (98 % d. Th.) als farbloser Feststoff
Elementaranalyse:
C 72.75 (72.88) H 6.58 (6.62) N 1.66 (1.58) d) 3-Benzyloxy-1-[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1-benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-6-methyl-4- nitrophenyloxycarbonyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin
20.8 g (24.7 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 20c und 3.78 g (27.17 mmol) 4- Nitrophenol werden in 20O mL Tetrahydrofuran gelöst und bei O 0C 5.61 g (27.17 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (Fluka) hinzugegeben und anschließend 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird abfiltriert, das Filtrat zur Trockene eingedampft und das Rohprodukt aus Diisopropylether umkristallisiert. Ausbeute: 20.5 g (87 % d. Th.) als farbloser Feststoff
Elementaranalyse:
C 71.09 (71.25) H 6.07 (6.11) N 2.91 (2.87)
e) [1 ,3-Bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-amin
14.66 g (20 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 20a werden in 20O mL Dimethylacetamid gelöst, mit 1.44 g (22 mmol) Natriumazid in 20 ml Wasser versetzt und anschließend 12 h bei 60 °C gerührt. Nach Abkühlen wird die Reaktionsmischung mit 800 ml Wasser verdünnt und zweimal mit je 300 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das Rohprodukt wird in 500 ml Diethylether gelöst, vorsichtig mit 1.9 g (50 mmol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt und 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges Hydrid wird durch vorsichtige Zugabe von 30 ml Ethanol und 500 ml Wasser zerstört und das Gemisch anschließend zweimal mit je 300 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und der Rückstand an Kieselgel Chromatographien (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 8.6 g (71 % d. Th.) als farbloses Öl
Elementaranalyse:
C 74.10 (74.35) H 7.56 (7.59) N 2.34 (2.27) f) 2,3-Bisbenzyloxy-N-[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1-benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]- terephthalsäuremonoamidmethylester
Zu einer Lösung von 5.89 g (15 mmol) 2,3-Bisbenzyloxyterephthalsäuremonomethylester (Doble et al., Inorg. Chem. 2003, 42, 4935) in 50 ml Toluol gibt man 2.2 ml (25 mmol) Oxalylchlorid und einen Tropfen DMF und erhitzt 4 h auf 60 0C. Nach Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand in 30 ml THF gelöst und zu einer auf 0 0C abgekühlten Lösung von 9.6 g (16 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 2Oe und 2.05 g (20 mmol) Triethylamin zugetropft und 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 12.9 g (89 % d. Th.) als farbloses Öl
Elementaranalyse:
C 73.98 (74.21 ) H 6.52 (6.48) N 1.44 (1.37)
g) 2,3-Bisbenzyloxy-N-[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]- terephthalsäuremonoamid
12.5 g (12.83 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 2Of werden in 100 ml Methanol und 25 ml 2 N Kaliumhydroxid-Lösung gelöst und 6 h unter Rückfluß erhitzt. Es wird zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 250 ml Wasser aufgenommen und mit 6 N Salzsäure angesäuert (pH = 1). Der ausfallende Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser mehrfach nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 11.8 g (96 % d. Th.) als farbloser Feststoff
Elementaranalyse:
C 73.81 (73.96) H 6.40 (6.42) N 1.46 (1.44)
h) 2,3-Bisbenzyloxy-N-[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]- terephthalsäurernonoamid-(4-nitrophenyl)-ester 11.5 g (11.98 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 20g und 1.83 g (13.18 mmol) 4- Nitrophenol werden in 20O mL Tetrahydrofuran gelöst und bei 0 0C 2.72 g (27.17 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (Fluka) hinzugegeben und anschließend 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird abfiltriert, das Filtrat wird zur Trockene eingedampft und das Rohprodukt aus Diisopropylether umkristallisiert. Ausbeute: 10.7 g (82 % d. Th.) als farbloser Feststoff
Elementaranalyse:
C 72.21 (72.39) H 5.97 (6.00) N 2.59 (2.56)
i) 4-(Amino)-5-[bis-(2-{3-benzyloxy-1-[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1-benzyloxymethyl-ethoxy)- prop-2-yl]-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl}-aminoethyl)amino]-pentan- carbonsäure
1.09 g (5 mmol) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)-amino]-pentancarbonsäure und 9.63 g (10 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 2Od werden in 100 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 50 ml 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 50 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 10 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 4.37 g (47 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 71.44 (71.62) H 6.91 (6.97) N 4.50 (4.41 )
j) 4-({2,3-Bisbenzyloxy-N-[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]- ethylcarbamoyl}-benzoylamino)-5-[bis-(2-{3-benzyloxy-1-[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1- benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl}- aminoethyl]-amino)-pentancarbonsäure
4.0 g (2.14 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 2Oi und 2.89 g (2.67 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 20h werden in 500 mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 50 ml 1 N Natriumhydroxid- Lösung und mit 50 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 10 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 5.66 g (94 % d. Th.)
Elementaranalyse:
C 72.71 (72.93) H 6.71 (6.77) N 3.49 (3.44)
k) 4-({2,3-Dihydroxy-N-[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1 -hydroxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-ethyl- carbamoyl}-benzoylamino)-5-[bis-(2-{3-hydroxy-1 -[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1 -hydroxymethyl- ethoxy)-prop-2-yl]-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl}-aminoethyl]-amino)- pentancarbonsäure
Zu einer Lösung von 5.0 g (1.78 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 2Oj in 100 ml Ethanol gibt man 1.0 g Palladium Katalysator (10% Pd/C) und hydriert 48 h bei Raumtemperatur. Man filtriert vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockene ein. Ausbeute: 2.45 g (quantitativ) eines farblosen Feststoffs
Elementaranalyse:
C 50.98 (51.26) H 6.71 (6.78) N 7.18 (7.04)
I) Gadolinium-Komplex der 4-({2,3-Dihydroxy-N-[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1-hydroxymethyl- ethoxy)-prop-2-yl]-ethylcarbamoyl}-benzoylamino)-5-[bis-(2-{3-hydroxy-1-[1 ,3-bis-(2- hydroxy-1 -hydroxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4- carbonyl}-aminoethyl]-amino)-pentancarbonsäure
2.1 g (1.54 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 20k werden in 40 mL Tetrahydrofuran und 10 mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 0.36 g (1.55 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 50 mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft
Ausbeute: 1.67 g (67 % d. Th.) eines leicht graugelblich gefärbten Pulvers Wassergehalt (Karl-Fischer): 4.7 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz): C 45.16 (45.47) H 5.68 (5.81) Gd 10.19 (10.00) N 6.36 (6.22)
Beispiel 21
a) 3-Benzyloxy-6-formyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonsäureethylester
5.75 g (20 mmol) 3-Benzyloxy-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonsäureethylester (Doble et al., Inorg. Chem. 2003, 42, 4935) werden in 50 ml Dioxan gelöst und mit 8.88 g (80 mmol) Selenoxid versetzt. Anschließend wird 60 min in der Mikrowelle auf 100 0C erhitzt. Die Reaktionsmischung wird abfiltriert, das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 5.05 g (84 % d. Th.) als gelben Feststoff
Elementaranalyse:
C 63.78 (64.02) H 5.02 (5.17) N 4.65 (4.33)
b) 3-Benzyloxy-6-carboxylato-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonsäureethylester
4.5 g (14.94 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 21a werden in 50 ml DMF gelöst und mit 9.22 g (15 mmol) Oxone versetzt. Anschließend wird 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 200 ml 0.5 M Salzsäure versetzt und dreimal mit je 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Magnesiumsulfat getrocknet, im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand an Kieselgel chroma- tographiert (Methylenchlorid/Methanol 10 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft.
Ausbeute: 3.04 g (64 % d. Th.) als farbloses Feststoff
Elementaranalyse:
C 60.57 (60.72) H 4.77 (4.81) N 4.41 (4.27)
c) 3-Benzyloxy-6-{[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}- 2-oxo-1 , 2-dihydropyridin-4-carbonsäureethylester
Zu einer Lösung von 4.76 g (15 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 21 b in 50 ml Toluol gibt man 2.2 ml (25 mmol) Oxalylchlorid und einen Tropfen DMF und erhitzt 4 h auf 60 0C. Nach Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand in 30 ml THF gelöst und zu einer auf 0 0C abgekühlten Lösung von 9.6 g (16 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 2Oe und 2.05 g (20 mmol) Triethylamin zgetropft und 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand an Kieselgel Chromatographien (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 13.5 g (75 % d. Th.) als farbloses Öl
Elementaranalyse:
C 70.81 (70.99) H 6.50 (6.53) N 3.12 (3.17)
d) 3-Benzyloxy-6-{[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1-benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}- 2-oxo-1 , 2-dihydropyridin-4-carbonsäure
13.0 g (14.46 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 21c werden in 100 ml Methanol und 30 ml 2 N Kaliumhydroxid-Lösung gelöst und 6 h unter Rückfluß erhitzt. Es wird zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 250 ml Wasser aufgenommen und mit 6 N Salzsäure angesäuert (pH = 1). Der ausfallende Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser mehrfach nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 12.25 g (97 % d. Th.) als farbloser Feststoff
Elementaranalyse:
C 70.33 (70.47) H 6.25 (6.31) N 3.22 (3.18)
e) 3-Benzyloxy-6-{[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}- 4-nitrophenylcarbonyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonsäure
11.8 g (13.55 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 21 d und 2.07 g (14.91 mmol) 4- Nitrophenol werden in 15O mL Tetrahydrofuran gelöst und bei 0 0C 3.08 g (14.91 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (Fluka) hinzugegeben und anschließend 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird abfiltriert, das Filtrat zur Trockene eingedampft und das Rohprodukt aus Diisopropylether umkristallisiert. Ausbeute: 11.9 g (89 % d. Th.) als farbloser Feststoff
Elementaranalyse:
C 69.01 (69.38) H 5.79 (5.87) N 4.24 (4.03)
f) 5-(Bis-{2-[(3-benzyloxy-6-{[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]- carbamoyl}-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)-amino]ethyl}amino)-4-[(3-benzyloxy-6- {[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1 -benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}-2-oxo-1 ,2- dihydropyridin-4-carbonyl)-amino]-pentancarbonsäure
685 mg (3.14 mmol) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)-amino]-pentancarbonsäure und 11.2 g (11.29 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 21 e werden in 50 ml_ Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 30 mL 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 30 mL gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 7.78 g (89 % d. Th.) als farbloser Feststoff
Elementaranalyse: C 70.06 (70.34) H 6.46 (6.52) N 5.04 (4.99)
g) 5-(Bis-{2-[(3-hydroxy-6-{[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1 -hydroxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carba- moyl}-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)-amino]ethyl}amino)-4-[(3-hydroxy-6-{[1 ,3- bis-(2-hydroxy-1-hydroxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin- 4-carbonyl)-amino]-pentancarbonsäure
Zu einer Lösung von 7.0 g (2.52 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 21f in 10O mI Ethanol gibt man 1.5 g Palladium Katalysator (10% Pd/C) und hydriert 48 h bei Raumtemperatur. Man filtriert vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockene ein. Ausbeute: 3.61 g (quantitativ) eines farblosen Feststoffs.
Elementaranalyse:
C 48.03 (48.42) H 6.22 (6.31 ) N 9.83 (9.71 )
h) Gadolinium-Komplex der 5-(Bis-{2-[(3-hydroxy-6-{[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1-hydroxymethyl- ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)-amino]ethyl}amino)- 4-[(3-hydroxy-6-{[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1-hydroxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}-2- oxo-1 , 2-dihydropyridin-4-carbonyl)-amino]-pentancarbonsäure
3.0 g (2.10 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 21g werden in 50 mL Tetrahydrofuran und 1O mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 483 mg (2.10 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 5 mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 1.5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel Chromatographien (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft
Ausbeute: 2.33 g (67 % d. Th.) eines leicht graugelblich gefärbten Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 4.5 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz): C 43.34 (43.43) H 5.42 (5.44) Gd 9.95 (9.77) N 8.87 (8.91)
Beispiel 22
a) 5-(Bis-{2-[(3-benzyloxy-1-{[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1-benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]- carbamoyl}-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)-amino]ethyl}amino)-4-[(3- benzyloxy-1-{[1 ,3-bis-(2-benzyloxy-1-benzyloxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}-6- methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbony)-amino]-pentancarbonsäure
607 mg (2.78 mmol) 4-Amino-5-[bis-(2-aminoethyl)-amino]-pentancarbonsäure und 9.63 g (10 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 2Od werden in 5O mL Methylenchlorid gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 30 mL 1 N Natriumhydroxid-Lösung und mit 30 mL gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol 20 : 1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 6.25 g (83 % d. Th.) als farbloser Feststoff
Elementaranalyse:
C 72.40 (72.66) H 6.82 (6.87) N 3.63 (3.59)
b) 5-(Bis-{2-[(3-hydroxy-1-{[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1 -hydroxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carba- moyl}-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)-amino]ethyl}amino)-4-[(3-hydroxy- 1 -{[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1 -hydroxymethyl-ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}-6-methyl-2-oxo- 1 ,2-dihydropyridin-4-carbony)-amino]-pentancarbonsäure
Zu einer Lösung von 6.0 g (2.52 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 22a in 100 ml Ethanol gibt man 1.5 g Palladium Katalysator (10% Pd/C) und hydriert 48 h bei Raumtemperatur. Man filtriert vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockene ein. Ausbeute: 2.23 g (quantitativ) eines farblosen Feststoffs.
Elementaranalyse: C 51.51 (51.79) H 6.93 (6.99) N 7.25 (7.17)
c) Gadolinium-Komplex der 5-(Bis-{2-[(3-hydroxy-1-{[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1-hydroxymethyl- ethoxy)-prop-2-yl]-carbamoyl}-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbonyl)- amino]ethyl}amino)-4-[(3-hydroxy-1-{[1 ,3-bis-(2-hydroxy-1-hydroxymethyl-ethoxy)-prop- 2-yl]-carbamoyl}-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridin-4-carbony)-amino]-pentan- carbonsäure
2.0 g (1.48 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 22b werden in 50 mL Tetrahydrofuran und 1O mL Methanol unter Rückfluß gelöst und 340 mg (1.48 mmol) Gadoliniumtrichloridhexahydrat, gelöst in 5 mL Tetrahydrofuran/Methanol (5 : 1), langsam in der Hitze zugegeben, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt. Anschließend werden 1.5 mL Pyridin hinzugegeben und 18 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Komplexierung wird im Vakuum eingedampft und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan /Methanol /Ammoniak: 20/20/1). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft
Ausbeute: 1.72 g (73 % d. Th.) eines leicht graugelblich gefärbten Pulvers. Wassergehalt (Karl-Fischer): 5.1 %
Elementaranalyse (bezogen auf die wasserfreie Substanz):
0 46.24 (46.51) H 6.02 (6.09) Gd 10.44 (10.31) N 6.51(6.47)
Gadolinium-Komplex-Konjugate mit Biomolekülen (Beispiele 23-52)
Zur Demonstration der extrem günstigen Relaxivity Eigenschaften der neuen erfindungsgemäßen Gd-Komplexe wurden Komplex-Konjugate mit Biomolekülen hergestellt. Durch die Immobilisierung mit einem Makromolekül kann somit die Eignung von Gd-Komplexen als Biomolekülmarker getestet werden.
Die Beispiele 23-52 beschreiben Metall-Komplex-Konjugate der vorstehend beschriebenen Gadoliniumkomplexe mit Biomolekülen. Die Konjugate wurden nach den folgenden allgemeinen Arbeitsvorschriften I-V hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Hierin steht "AAV" für allgemeine Arbeitsvorschrift, "ACTH" für adrenocorticotropes Hormon, "BSA" für Rinderserumalbumin, "HSA" für human Serumalbumin und "RP-18" bezeichnet eine "reversed phase" stationäre Chromatographiephase. Die Anzahl der Komplexe pro Biomolekül wurde mittels ICP (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy) bestimmt.
Allgemeine Arbeitsvorschrift (AAV) I: Albumin-Amid-Konjugate
3 mmol der Gd-komplexsäure werden in 15 mL DMF gelöst, unter Eiskühlung mit 380 mg (3,3 mmol) N-Hydroxysuccinimd und 681 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 1 Stunde unter Eiskühlung voraktiviert. Die Aktivestermischung wird innerhalb von 30 Minuten in eine Lösung von 16,75 g (0,25 mmol) Albumin (BSA bzw. HSA) in 150 mL Phosphatpuffer (pH 7,4) eingetropft und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird filtriert, das Filtrat über eine AMICON® YM30 (cut off 30.000 Da) ultrafiltriert, das Retentat über eine Sephadex® G50 -Säule Chromatographien und die Produktfraktionen gefriergetrocknet.
Allgemeine Arbeitsvorschrift (AAV) II: Albumin-Maleimid-Konjugate
0,0438 mmol des Gd-Komplexmaleimids in 1 mL DMF werden zu 0,84 g (0,0125 mmol) Rinderserumalbumin (BSA), gelöst in 15 mL Phosphatpuffer (pH 7,4), gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird filtriert, das Filtrat über eine AMICON® YM30 (cut off 30.000 Da) ultrafiltriert, das Retentat über eine Sephadex® G50 - Säule Chromatographien und die Produktfraktionen gefriergetrocknet.
Allgemeine Arbeitsvorschrift (AAV) III: Thioharnstoff-Konjugate
0,1 mmol des Gd-Komplex-isothiocyanats in 5 mL DMF werden zu 0,84 g (0,0125 mmol) Rinderserumalbumin (BSA), gelöst in 15 mL Phosphatpuffer (pH 8,0), gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird filtriert, das Filtrat über eine AMICON® YM30 (cut off 30.000 Da) ultrafiltriert, das Retentat über eine Sephadex® G50 - Säule Chromatographien und die Produktfraktionen gefriergetrocknet. Allgemeine Arbeitsvorschrift (AAV) IV: Herstellung von Amid-Konjugaten
3 mmol der Gd-komplexsäure werden in 15 mL DMF gelöst, unter Eiskühlung mit 380 mg (3,3 mmol) N-Hydroxysuccinimd und 681 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 1 Stunde im Eis voraktiviert. Die Aktivestermischung wird in eine Lösung von 2,5 mmol Aminkomponente in 15-150 mL DMF eingetropft und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird filtriert und an Kieselgel Chromatographien.
Allgemeine Arbeitsvorschrift (AAV) V: Herstellung von Maleimido-SH-Konjugaten
3 mmol des Gd-komplexmaleimids in 15 mL DMF werden zu 2,5 mmol SH-Komponente in 15-150 mL DMF eingetropft und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird an Kieselgel chromatographiert.
Tabelle 1
Figure imgf000080_0001
o
Figure imgf000081_0001
* berechnet in Wasser (300C); ** gemessen in Wasser (300C)
Beispiel 53
In diesem Beispiel wurde zu Vergleichszwecken die Relaxivität einer Substanz des Standes der Technik gemessen. Als Vergleichssubstanz wurde ein Konjugat der folgenden Formel eingesetzt (1 :1 Komplex):
Figure imgf000082_0001
Die Messung erfolgte in wäßriger Lösung bei +300C. T1-Relaxivitäten von 40,6 bei 20 MHz und 21 ,7 bei 60 MHz wurden gemessen.
Demgegenüber sind die T1-Relaxivitäten der erfindungsgemäßen Konjugate bei 60 MHz höher als bei 20 MHz1 wie der vorstehenden Tabelle 1 entnommen werden kann. Die erfindungsgemäßen Konjugate weisen somit eine höhere Relaxivität bei höherem Feld auf, so daß sie für den Einsatz zusammen mit klinischen NMR-Diagnosegeräten besonders geeignet sind.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der allgemeinen Formel I:
(K)3-A-U-X
worin K unabhängig voneinander für einen Rest
Figure imgf000083_0001
steht, worin Z ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquivalent darstellt, R1 ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Ci.10-Alkylrest darstellt, der gegebenenfalls mit 1-3 Sauerstoffatomen, 1-3 Stickstoffatomen und/oder 1 -3 -NR3-Resten unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1-4 Hydroxygruppen, 1-2 Carboxyl- (die gegebenenfalls in geschützter Form vorliegen), 1-2 - SO3H- (die gegebenenfalls in geschützter Form vorliegen), 1-2 -PO3H2-Gruppen und/oder 1 -2 Halogenatomen substituiert ist und/oder bei dem gegebenenfalls 1-2 Kohlenstoff atome als Carbonylgruppen vorliegen, wobei der Alkylrest oder ein Teil des Alkylrests ringförmig ausgestaltet sein kann,
R2 ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten C^o-Alkylrest, der gegebenenfalls mit 1 -3 Sauerstoffatomen, 1-3 Stickstoffatomen und/oder 1 -3 -NR3-Resten unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1-2 Hydroxygruppen, 1-2 Carboxyl-, 1-2 -SO3H-, 1-2 -PO3H2-Gruppen und/oder 1-2 Halogenatomen substituiert ist und/oder bei dem gegebenenfalls 1-2 Kohlenstoffatome als Carbonylgruppen vorliegen, wobei der Alkylrest oder ein Teil des Alkylrests ringförmig ausgestaltet sein kann, -COOH, Halogen, -CONR3R4, -SO3H oder -PO3H2 darstellt, R3 und R4 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten CMo-Alkylrest darstellen, der gegebenenfalls mit 1-4 Hydroxygruppen substituiert ist oder mit 1-2 Sauerstoffatomen unterbrochen ist,
W1 und W2 unabhängig voneinander einen Rest R1 ocer CONR3R4 darstellen,
A für einen Rest
Figure imgf000084_0001
steht, worin die Positionen α an K und die Positionen ß an U gebunden sind, U eine direkte Bindung oder einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Ci.2o-Alkylenrest darstellt, der gegebenenfalls mit 1-4 Sauerstoffatomen, 1-4 Schwefelatomen, 1-4 Stickstoff atomen, 1-4 -NR3-Resten, 1-4 -NHCO-Resten, 1-4 -CONH- Resten, 1-4 -O-P(=O)(-OH)-O-Resten und/oder 1-2 Arylenresten unterbrochen ist, gegebenenfalls mit 1-3 geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Ci.io-Alkylresten, 1-3 Hydroxygruppen, 1-3 Carboxylgruppen, 1-3 Arylgruppen, 1-3 Halogenatomen und/oder 1-3 -O-d-6-Alkylgruppen (wobei der Alkylrest geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt ist) substituiert ist und/oder bei dem gegebenenfalls 1-3 Kohlenstoffatome als Carbonylgruppen vorliegen, wobei der Alkylenrest oder ein Teil des Alkylenrests ringförmig ausgestaltet sein kann, und X eine Gruppe darstellt, die mit einem Biomolekül eine Reaktion eingehen kann, sowie deren Salze.
2. Verbindungen nach Anspruch 1 , worin U ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-, -CH2-CO-NH-CH2-,
-CH(CHa)-CO-NH-CH2-CO-NH-CH2-CH2-, -CH2-Phenylen-, -Phenylen-, -Cyclohexylen-, -CH2-Phenylen-O-CH2-, -CH2-Phenylen-O-CH2-CO-NH-CH2-CH2-, -Phenylen-O-CH2-, -CO-Phenylen-, -CO-Phenylen-CO-NH-CH2-CH2-, -(CH2)4-, -(CHz)4-NH-CO-CH2-CH2- und -(CH2J4-NH-CO-CH2-O-CH2-, wobei diese Reste in Leserichtung links an A und in Leserichtung rechts an X gebunden sind.
3. Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carboxyl, aktiviertes Carboxyl, Amino, Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Semicarbazid, Thiosemicarbazid, Chloracetamid, Bromacetamid, lodacetaηnid, Acylamino, gemischten Anhydriden, Azid, Hydroxid, Sulfonylchlorid, Carbodiimid, Pyridyl-CH=CH2 und Resten der Formeln
Figure imgf000085_0001
worin HaI ein Halogenatom ist.
4. Verbindungen nach Anspruch 3, worin die aktivierte Carboxylgruppe ausgewählt ist aus
Figure imgf000085_0002
5. Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin mindestens zwei der Reste Z für ein Metallionenäquivalent eines paramagnetischen Elements der Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 oder 58-70 stehen.
6. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (K)3-A-U-X I1
worin K, A, U und X wie in Anspruch 1 definiert sind, zur Herstellung eines Konjugats mit einem Biomolekül.
7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biopolymeren, Proteinen, synthetisch modifizierten Biopolymeren, Kohlenhydraten, Antikörpern, DNA und RNA Fragmenten, ß-Aminosäuren, Vektoraminen zur Einschleusung in die Zelle, biogenen Aminen, Pharmazeutika, onkologischen Präparaten, synthetischen Polymeren, die auf ein biologisches Target gerichtet sind, Steroiden, Prostaglandinen, Taxol und dessen - Derivaten, Endothelinen, Alkaloiden, Folsäure und dessen Derivaten, bioaktiven Lipiden, Fetten, Fettsäureestem, synthetisch modifizierten Mono-, Di- und Triglyceriden, Liposomen, die an der Oberfläche derivatisiert sind, Micellen aus natürlichen Fettsäuren oder aus Perfluoralkyl-Verbindungen, Porphyrinen, Texaphrinen, erweiterten Porphyrinen, Cytochromen, Inhibitoren, Neuramidasen, Neuropeptiden, Immunomodulatoren, Endoglycosidasen, Substraten, die durch die Enzyme Calmodulin Kinase, Casein-Kinase II, Glutathion-S-Transferase, Heparinase, Matrix Metalloproteasen, ß-lnsulin-Receptor-Kinase, UDP-Galactose A- Epimerase, Fucosidasen, G-Proteine, Galactosidasen, Glycosidasen, Glycosyltransferasen und Xylosidase attackiert werden, Antibiotika, Vitaminen und Vitamin-Analoga, Hormonen, DNA-Interkalatoren, Nucleosiden, Nucleotiden, Lektinen, Vitamin B12, Lewis-X und Verwandten, Psoralenen, Dientrienantibiotika, Carbacyclinen, VEGF, Somatostatin und dessen Derivaten, Biotin-Derivaten, Antihormonen, tumorspezifischen Proteinen und Synthetika, Polymeren, die sich in sauren oder basischen Bereichen des Körpers anreichern, Myoglobinen, Apomyoglobinen, Neurotransmitterpeptiden, Tumomekrose- Faktoren, Peptiden, die sich in entzündeten Geweben anreichern, Bloodpool-Reagentien, Anionen- und Kationen-Transporter Proteinen, Polyestem, Polyamiden und Polyphosphaten.
8. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I
(K)3-A-U-X I1
worin K, A, U und X wie in Anspruch 1 definiert sind, worin eine Verbindung der allgemeinen Formel Il A'-U-X II,
worin U und X wie in Anspruch 1 definiert sind und A' die Vorstufe zu dem Rest A darstellt, mit Nu-K umgesetzt wird, wobei K wie in Anspruch 1 definiert ist, K und X gegebenenfalls in ihrer geschützten Form .vorliegen und Nu ein , Nucleofug ist, anschließend die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen entfernt werden und wenn gewünscht in an sich bekannter Weise mit mindestens einem Metalloxid oder Metallsalz eines gewünschten Elements umgesetzt wird und gegebenenfalls anschließend in den so erhaltenen Komplexen noch vorhandene acide Wasserstoffatome ganz oder teilweise durch Kationen von anorganischen und/oder organischen Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamiden substituiert werden.
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