WO2006062427A1 - Procede de detection quantitative de toxines biologiques - Google Patents

Procede de detection quantitative de toxines biologiques Download PDF

Info

Publication number
WO2006062427A1
WO2006062427A1 PCT/RU2004/000464 RU2004000464W WO2006062427A1 WO 2006062427 A1 WO2006062427 A1 WO 2006062427A1 RU 2004000464 W RU2004000464 W RU 2004000464W WO 2006062427 A1 WO2006062427 A1 WO 2006062427A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biotoxin
biotoxins
immobilized
antibodies
microchip
Prior art date
Application number
PCT/RU2004/000464
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2006062427A8 (fr
Inventor
Ekaterina Igorevna Dementieva
Veronika Igorevna Djukova
Alexandr Sergeevich Zasedatelev
Alla Jurievna Rubina
Andrei Alexandrovich Stomakhin
Vladimir Andreevich Nesmeyanov
Evgeny Vasilievich Grishin
Original Assignee
Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A.Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk
Institut Bioorganicheskoi Khimii Imeni M.M. Shemyakina I Ju.A. Ovchinnikova Rossiiskoi Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A.Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk, Institut Bioorganicheskoi Khimii Imeni M.M. Shemyakina I Ju.A. Ovchinnikova Rossiiskoi Akademii Nauk filed Critical Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A.Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk
Priority to US10/589,143 priority Critical patent/US20070172904A1/en
Priority to EP04821451A priority patent/EP1816473A4/en
Priority to PCT/RU2004/000464 priority patent/WO2006062427A1/ru
Publication of WO2006062427A1 publication Critical patent/WO2006062427A1/ru
Publication of WO2006062427A8 publication Critical patent/WO2006062427A8/ru

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B01J2219/00576—Chemical means fluorophore
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B01J2219/00578—Chemical means electrophoric
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B01J2219/00581—Mass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596—Solid-phase processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
    • B01J2219/00644—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being present in discrete locations, e.g. gel pads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00677—Ex-situ synthesis followed by deposition on the substrate
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00686—Automatic
    • B01J2219/00691—Automatic using robots
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00709—Type of synthesis
    • B01J2219/00711—Light-directed synthesis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00725—Peptides

Definitions

  • the invention relates to analytical biochemistry and quantitative immunochemical analysis and for the quantitative detection of various biological toxins by the immunochemical method using three-dimensional microchips based on hydrogels.
  • the proposed method for the detection of biotoxins can be used in medicine, in the food industry, in environmental protection.
  • Currently, the development of fast and sensitive methods for the analysis of biological toxins is becoming important due to the threat of bioterrorism, since many natural toxins can be used as components of biological weapons.
  • toxins that have a strong toxic effect on the human body are well known.
  • the most powerful toxins produced by microorganisms include botulinum, tetanus and cholera toxins; of plant toxins, ricin and abrin are the most powerful.
  • toxins secreted by poisonous animals snakes, spiders, scorpions, etc.
  • Most biotoxins are polypeptide in nature, however, low molecular weight compounds with high toxicity are known, for example, tetrodotoxin (acupuncture fish), T-2 toxin (fungi), blue-green alga toxins.
  • Napogep (USA) has proposed electronic microarrays with immobilized antibodies [5].
  • ViPrakhis USA is developing a microarray technology in which Raman spectroscopy (Raman scattering) is used for signal detection [6].
  • Biomolecules in particular anti-biotoxin antibodies, are immobilized on a metal surface at points with a diameter of about 1 micron. After processing the microchip with a solution containing the analyte, an antibody-antigen complex forms, which is detected by obtaining Raman spectra, from which the spectra of free antibodies are subtracted. The possibility of detecting B (1) and G (1) aflatoxins from a mixture is shown. Three-dimensional microarrays based on polyacrylamide hydrogels were first developed at the IMB RAS [7].
  • gel microarrays are obtained by copolymerization and polymerization immobilization methods [8, 9].
  • the technology for producing hydrogel microarrays includes preparing a substrate (glass, plastic, silicon) (1), applying a polymerization mixture containing gel components and immobilized substances, in the form of droplets onto a substrate using a robot (T), photo-induced gel polymerization with the formation of gel elements containing immobilized probes (3). As a result, arrays of discrete gel elements are obtained, each of which contains an immobilized probe. Oligonucleotides, DNA, proteins, and various low molecular weight compounds can serve as probes [10-12]. It was shown that protein microarrays obtained by copolymerization can be used to study protein-protein interactions, in particular, antigen-antibody interactions, and immunochemical and enzymatic reactions [11, 12].
  • microchips based on three-dimensional hydrogels are used to develop a method for the quantitative detection of biological toxins.
  • the disadvantage of traditional immunological methods of analysis is the inability to conduct simultaneous analysis of several compounds, in particular biotoxins, in the sample. Multiple parallel analysis of several compounds is achieved using microchips.
  • the disadvantages of the methods for analyzing biological toxins on microchips described in the literature include the complex technology for manufacturing microchips: combining several blocks, connecting channels for supplying solutions, attaching electrodes. Signals are recorded using complex and expensive equipment: confocal microscope, Raman spectroscopy, etc. These disadvantages were overcome when developing a method for immunoassay of biological toxins using three-dimensional microchips based on hydrogels.
  • the aim of the invention is to develop a method for the quantitative detection of biological toxins of bacterial, plant and animal origin, allowing simultaneous parallel analysis of several biotoxins in a sample with a sensitivity not equal to or greater than the sensitivity of standard immunological tests.
  • This goal is achieved by developing a method for the quantitative detection of biological toxins using microchips based on hydrogels.
  • Hydrogel elements with a diameter of 100-600 ⁇ m and a height of 30-100 ⁇ m, containing immobilized antibodies against biotoxins or biotoxins, were obtained by photo- or chemically induced polymerization and covalently attached to the surface of the substrate (glass, plastic or silicon).
  • the proposed method includes the following stages: a) the manufacture of a biological microchip, which is an ordered array of three-dimensional; hydrogel cells on a solid support containing immobilized antibodies to various biotoxins or biotoxins, moreover, an antibody to an individual biotoxin or an individual biotoxin is immobilized in each individual cell; b) incubation of the microchip in a reaction medium including a sample containing biotoxins to be analyzed for the formation of biotoxin-antibody immune complexes, which, if necessary, is carried out under stirring conditions; c) detection of the resulting complex; d) quantitative detection of the analyzed biotoxin.
  • the reaction medium in step b) contains the analyzed biotoxin, which forms a specific complex with antibodies against this toxin immobilized on a chip.
  • the reaction medium in stage b) additionally contains labeled antibodies to the analyzed biotoxin, and labeled antibodies compete for binding with biotoxin in solution and biotoxin immobilized on a microchip.
  • the microchip contains immobilized antibodies, and the reaction medium in step b) additionally contains labeled biotoxin. There is a competition between labeled and unlabeled biotoxin for binding to immobilized antibodies.
  • the microchip contains immobilized antibodies
  • the reaction medium in stage b) contains the analyzed biotoxin, which forms a specific complex with the immobilized on the chip antibodies.
  • the microchip is developed with labeled antibodies specific for another epitope of the given biotoxin.
  • stage b) is carried out under stirring conditions, which significantly reduces the analysis time.
  • Immunoassay results are recorded using fluorescence, chemiluminescence, or mass spectrometry directly from the gel elements of the microchip.
  • Antibodies or biotoxins may contain fluorescent labels or conjugates to proteins or other compounds capable of participating in reactions leading to light emission (chemiluminescence or bioluminescence). Mass spectral detection does not require the introduction of additional labels.
  • Quantitative detection of biotoxin is carried out by carrying out stages a) - c) with standard (reference) samples containing known concentrations of the analyzed biotoxin.
  • the calibration dependence “microchip gel cell signal - biotoxin concentration” is built. After this stage a) - c) is carried out with the analyzed sample, and the concentration of the analyzed biotoxin in the sample is determined by the calibration dependence.
  • the proposed method allows simultaneous parallel analysis of several biotoxins in the sample.
  • the microchip for parallel multiple analysis contains immobilized antibodies against several toxins and / or several immobilized biotoxins.
  • An antibody to an individual biotoxin or an individual biotoxin is immobilized in each individual gel cell.
  • a reaction medium including a sample containing several biotoxins to be analyzed, specific biotoxin-antibody immune complexes are formed.
  • the reaction medium contains a sample comprising several toxins to be analyzed, and after incubation of the microchip with the sample, the signals of the microchip cells containing the corresponding immobilized antibody are recorded.
  • the reaction medium on stage b) additionally contains a mixture of labeled antibodies to all analyzed biotoxins or a mixture of all analyzed labeled biotoxins.
  • a sandwich immunoassay the development of a microchip after incubation in a reaction medium including a sample is carried out with a mixture of labeled antibodies against all of the analyzed biotoxins.
  • the sensitivity of the proposed method for the detection of biological toxins is not inferior to the sensitivity of the spot version of the immunoassay, for example, the detection limit of ricin by sandwich immunoassay using gel microarrays was 0.1 ng / ml (Table 1).
  • the proposed method for the analysis of biotoxins based on the use of gel microarrays has a number of significant advantages over the microarrays described in the literature: the developed three-dimensional gel structure has a much greater capacity for immobilization compared to two-dimensional microarrays, which greatly increases the sensitivity of the analysis; in addition, immobilized proteins are in a hydrophilic environment, and there is no contact with the hydrophobic surface of the substrate, which helps to preserve the biological activity of the immobilized molecules and ensures high storage stability.
  • Figure 1 shows the results of ricin immunoassay on microarrays.
  • the microchips contained gel elements with immobilized antibodies against ricin Rchl, 0.1 mg / ml. Dependence of the fluorescence intensity on the concentration of ricin labeled with Cy3 in solution.
  • the microchips contained gel elements with immobilized antibodies against ricin Rêthl, 0.1 mg / ml; microchips after incubation with ricin solutions were developed with anti-ricin antibodies IRKl labeled with Cy3, 20 ⁇ g / ml. Intensity dependence fluorescence from ricin concentration in solution.
  • the inset in FIG. IB shows fluorescence signals at low ricin concentrations. The dashed line corresponds to fluorescence intensity 3 times higher than the scatter of the background signal; the ricin detection limit was 0.1 ng / ml.
  • the microchips contained gel elements with immobilized antibodies against ricin 1RK2, 0.1 mg / ml; microarrays after incubation with ricin solutions showed biotinylated antibodies against ricin 2RKl (40 ⁇ g / ml), an avidin peroxidase conjugate (45 ⁇ g / ml), and chemiluminescent peroxidase substrates. Dependence of the intensity of chemiluminescence on the concentration of ricin in solution.
  • Figure 2 shows MALDI-TOF mass spectra of staphylococcal enterotoxin B obtained from gel cells of a microchip with immobilized monoclonal antibodies against this toxin S222, 0.1 mg / ml, after incubation of the microchip with a toxin solution.
  • Figure 3 presents the results of the simultaneous analysis of several biotoxins on one microchip.
  • the microchips contained gel elements with immobilized monoclonal antibodies against staphylococcal toxin (S222), diphtheria toxin (7D9), tetanus toxin ( ⁇ D2C6), lethal anthrax toxin factor (10EDG7), ricin (IRKl) and viscumin (TAS). Each antibody was immobilized in 4 gel cells at a concentration of 0.1 mg / ml.
  • Fluorescence images were obtained after incubating the microchip with a solution of staphylococcal toxin (chip 1), diphtheria toxin (chip 2), tetanus toxin (chip 3), lethal factor anthrax toxin (chip 4), ricin (chip 5) and viscumin (chip 6) and manifestations of a mixture of Cy3-labeled monoclonal antibodies against all 6 studied biotoxins (antibodies against staphylococcal enterotoxin B S643, antibodies against diphtheria toxin 2 AZ, antibodies against tetanus toxin ZD10B11, antibodies against lethal factor anthrax toxin ZB4D9, antibodies against ricin Rchl, antibodies against viscumin MNA9).
  • Hydrogel microchips for the quantitative detection of biological toxins are produced by the method of photo- or chemically induced radical polymerization using a patented technology [9].
  • the microchip is an ordered array of three-dimensional hydrogel cells on a solid substrate containing immobilized antibodies to various biotoxins of bacterial, plant and animal origin or immobilized biotoxins of various nature. An individual ligand is immobilized in each individual cell of the microchip.
  • the binding of a ligand with a hydrogel matrix is possible both directly during its immobilization during gel formation, and through the formation of specific complexes of avidin (streptavidin) - biotin, for example, immobilized avidin - a biotinylated antibody, or immobilized nitrilotriacetic acid - a recombinant protein containing another recombinant protein .
  • avidin streptavidin
  • Ligands are antibodies of various types, all types of immunoglobulins (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE), monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant antibodies, various types of mini antibodies, including Fab fragments and single chain antibodies (scFv and others ), as well as low molecular weight biotoxins and biotoxins of protein nature.
  • Ligands for the formation of a specific complex with the analyzed biotoxins can also be aptamers - DNA or RNA molecules capable of high affinity interaction with the corresponding compound. For example, an RNA aptamer consisting of 31 nucleotides specific for ricin A chain [13] and DNA aptamers specific for cholera toxin and staphylococcal enterotoxin B [14] were obtained.
  • the type of compounds used for immobilization depends on the analyzed object and the method of analysis (direct, competitive, sandwich analysis, etc.).
  • a method for quantitative detection of biotoxins using hydrogel microarrays involves the following steps: a) manufacturing a biological microchip, which is an ordered array of three-dimensional hydrogel cells on a solid substrate, obtained by photo- or chemically induced polymerization and containing immobilized antibodies to various biotoxins of bacterial, plant and animal origin or biotoxins, moreover, an antibody to an individual is immobilized in each individual cell oval biotoxin or individual biotoxin; b) incubation of the microchip in a reaction medium including a sample containing biotoxins to be analyzed for the formation of biotoxin-antibody immune complexes, which, if necessary, is carried out under stirring conditions; c) detection of the resulting complex; d) quantitative detection of the analyzed biotoxin.
  • buffer solutions are used, which are usually used in immunoassays, for example, 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.05 M Tris-Hcl, pH 7.4 , etc.
  • polyvinyl alcohol, bovine serum albumin and sucrose, milk powder proteins, etc. are added to the reaction medium.
  • a method for the quantitative detection of biotoxins can be carried out in the form of various types of immunoassay, for example, direct, competitive and sandwich immunoassay (Example 1).
  • the microchip contains immobilized antibodies against the analyzed biotoxin, and the reaction medium in stage b) contains the analyzed biotoxin, which forms a specific immune complex with immobilized antibodies.
  • the analyzed biotoxin contains a fluorescent label; in chemiluminescent registration, biotoxin is a conjugate with a protein or other compound capable of participating in reactions leading to light emission (chemiluminescence or bioluminescence).
  • the recorded fluorescent or chemiluminescent signal of the microchip cells with immobilized antibodies is proportional to the concentration of biotoxin (Example 1, Fig. IA).
  • Methods for introducing a fluorescent label or for conjugating to a protein or other compound are well known in the art. In particular, the procedures described in G.T. Nermapsop, ⁇ schreib Whyjugate ⁇ soirhpiquanss, Academis Press, Sap Diego, 1996. In the case of mass spectral detection, an additional label is not required.
  • the reaction medium in step b) further comprises fluorescently labeled antibodies to the biotoxin to be analyzed (or the corresponding antibody conjugates).
  • the reaction mixture is incubated with a standard or assayed sample before application to the microchip.
  • labeled antibodies compete for binding to the biotoxin in solution and the biotoxin immobilized on the microchip.
  • the recorded fluorescent or chemiluminescent signal of the microchip cells with immobilized biotoxins is the higher, the lower the concentration of the analyzed toxin in the sample (Example 1, Fig. 1B)
  • the microchip contains immobilized antibodies, and the reaction medium in step b) further contains a fluorescently-labeled biotoxin (or the corresponding biotoxin conjugate).
  • the reaction medium in step b) further contains a fluorescently-labeled biotoxin (or the corresponding biotoxin conjugate).
  • the recorded fluorescent or chemiluminescent signal of the microchip cells with immobilized antibodies is the higher, the lower the concentration of the analyzed toxin in the sample.
  • the microchip contains immobilized antibodies
  • the reaction medium in stage b) contains the analyzed biotoxin, which forms a specific complex with antibodies immobilized on a chip.
  • the microchip is developed with fluorescently labeled antibodies (or corresponding antibody conjugates) specific for another epitope of the given biotoxin.
  • the recorded fluorescent or chemiluminescent signal of the microchip cells with immobilized antibodies is proportional to the concentration of biotoxin (Example 1, Fig. IB, D).
  • Direct and competitive microchip assays can be performed for toxins of both protein nature and low molecular weight toxins.
  • the sandwich variant of immunoassay is possible, as a rule, only for protein biotoxins, for which antibodies specific for different epitopes of the protein molecule can be obtained (immobilized binding antibodies and showing labeled antibodies).
  • Quantitative detection of biotoxins is carried out by carrying out stages a) -c) with known concentrations of the analyzed biotoxin and constructing a calibration dependence by which the amount of the analyzed biotoxin in the sample is determined.
  • a calibration graph is plotted for the intensity of the fluorescent or chemiluminescent signal of the corresponding gel cells of the microchip on the known concentrations of biotoxin in a standard (reference) solution.
  • the unknown concentration of biotoxin in the sample is determined from the calibration curve by the value of the signal intensity obtained after the interaction of the analyzed sample with a microchip.
  • the biotoxin detection limit is defined as the concentration corresponding to the intensity of the fluorescent / chemiluminescent signal, 3 times the spread of the background signal.
  • results of the immunoassay of biotoxins using gel microarrays can be recorded by several methods: by fluorescence intensity; by chemiluminescence intensity; mass spectrometry directly from the gel elements of the microchip.
  • fluorescent dyes for example, such as Texas Red, tetramethylrodamine
  • fluorescein, cyanine 3 and 5 Cy3, Cy5
  • the registration of fluorescence signals from the cells of the microchip is carried out using fluorescence microscopes or scanning microscopes of various types, allowing you to record the signal from the used fluorescent label.
  • conjugates of antibodies, biotoxins or avidin are used (for biotinylated proteins), for example, with such enzymes as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, luciferase, but not limited to them, giving chemiluminescent signals as a result of the corresponding enzyme reactions, for example, peroxidase-catalyzed oxidation of luminol by hydrogen peroxide.
  • Chemiluminescent signals are recorded using CCD cameras or other recording devices, in particular, fluorescence microscopes with the excitation light source turned off.
  • the procedure for recording the analysis results in this case includes processing the microchip with a solution that destroys the complex formed by the studied biotoxin with an anti-toxin antibody immobilized on the chip (biotoxin elution from the microchip cell), direct mass spectral analysis directly from the gel element, and biotoxin identification by its molecular weight (Example 2, Fig. 2).
  • Example 3 shows the results of an immunoassay of 6 different biological toxins on hydrogel microarrays.
  • the method for the quantitative detection of biotoxins using hydrogel microscales is characterized by high sensitivity, not inferior to the sensitivity of standard immunological methods: for ricin, the detection limit was 0.1 ng / ml.
  • the proposed method for the quantitative detection of biotoxins using hydrogel microarrays allows for simultaneous, parallel analysis of samples for the presence of several toxins, which dramatically increases the detection efficiency and significantly reduces the amount of test material: 20 ⁇ l of the test sample is sufficient for analysis.
  • the microchip for parallel multiple analysis contains immobilized antibodies against several toxins and / or several immobilized biotoxins.
  • the reaction medium contains a sample comprising one or more of the analyzed toxins, and after incubation of the microchip with the sample, the signals of the microchip cells containing the corresponding immobilized antibodies are recorded.
  • the reaction medium in step b) further comprises a mixture of labeled antibodies to all of the analyzed biotoxins or a mixture of all of the analyzed labeled biotoxins.
  • a sandwich immunoassay the development of a microchip after incubation in a reaction medium containing a sample is carried out with a mixture of labeled antibodies against all of the analyzed biotoxins.
  • Example 4 demonstrated the simultaneous sandwich analysis of 6 different biological toxins on one microchip during the development of the microchip with a mixture of fluorescently-labeled antibodies. The sensitivity of the parallel analysis was no less than the sensitivity for determining one toxin.
  • stage b the stage of incubation of the microchip in a reaction medium including a sample containing the biotoxins to be analyzed (stage b) is carried out under stirring conditions, which significantly reduces the analysis time (Example 5).
  • Mixing can be carried out, for example, by switching the direction of flow of the reaction solution from direct to reverse using various types of pumps, ultrasound, electrophoresis, but not limited to these methods.
  • hydrogel microchips in comparison with the two-dimensional chips described in the literature is the hydrophilic environment of molecules immobilized in the gel and the absence of contact with the hydrophobic surface of the substrate, which is especially important for protein molecules.
  • the hydrophilic environment helps to preserve the biological activity of proteins and enzymes and ensures their stabilization during storage.
  • Microchips with immobilized antibodies are stable for at least six months when stored in the presence of glycerol at 1 0 0 C (Example 6).
  • Hydrogel microarrays containing immobilized antibodies against ricin and ricin were obtained using the previously patented technology of polymerization immobilization [9].
  • microarrays were preincubated in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 1% polyvinyl alcohol (PBC-50) or 3% bovine serum albumin (BSA) and 4% sucrose (“blocking buffer”), 2 hours at room temperature temperature.
  • the solutions of ricin (sample) were diluted with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.15% PBC-50 and 0.15% polyvinylpyrrolidone 360 (PBP-360).
  • a microchip with immobilized ricin (0.1 mg / ml) was used.
  • a solution containing detectable ricin was incubated with a solution of Cy3-labeled anti-ricin 1RIC2 monoclonal antibodies (4 ⁇ g / ml) for 2 hours at 37 ° C with stirring.
  • the mixture (20 ⁇ l) after incubation was applied to the microchip and kept for 2 hours at 37 °. After washing (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, 15 min, room temperature), the intensity of the fluorescent signals was measured.
  • microchips were made with immobilized monoclonal antibodies against ricin 1RK2 and other biotoxins (antibodies against staphylococcal enterotoxin B S222, antibodies against tetanus toxin ZD2C6, antibodies against diphtheria toxin 7D9, to control the cross-linking antibodies (0.1 mg / ml), 20 ⁇ l of ricin solution was added, and the chips were incubated at 1 ° C.
  • Antibodies against ricin and ricin labeled with Cy3, as well as biotinylated antibodies and the avidin peroxidase conjugate, were obtained by known methods described, for example, in [15].
  • the microscope allows you to simultaneously analyze data from all elements of the microchip and to obtain two-dimensional and three-dimensional images of the fluorescent signal from the gel elements.
  • the chemiluminescent signals were measured using the same fluorescence microscope with the excitation source turned off.
  • a plot was made of the dependence of the fluorescence or chemiluminescence intensity on the concentration of ricin in the solution (Fig. 1).
  • the ricin detection limit was calculated as the concentration corresponding to the signal intensity, 3 times the background signal spread.
  • the fluorescence intensity of the gel cells of the microchip was inversely proportional to the concentration of ricin in the solution (Fig. 1B), and the detection limit was 4 ng / ml.
  • FIG. 1 B and D Calibration plots for ricin sandwich analysis with fluorescence and chemiluminescent detection are shown in FIG. 1 B and D.
  • the inset in FIG. IB illustrates the determination of the detection limit: the dashed line corresponds to a fluorescence intensity three times the background signal spread, so the lowest concentration of ricin reliably determined by this method is OD ng / ml.
  • the detection limit was 0.7 ng / ml.
  • nonspecific signals i.e., signals from microchip cells containing antibodies to other toxins, did not differ from background or from signals of empty gel elements.
  • Example 2 Identification of proteins on the gel element of the microarray by direct mass spectral analysis.
  • Direct analysis of staphylococcal enterotoxin B on a microchip with mass spectral registration A microchip was prepared containing gelled cells immobilized monoclonal antibodies to staphylococcal enterotoxin B S222 (0.1 ⁇ g antibodies / gel cell). After polymerization, the microchip was washed with 0.01 M phosphate buffer containing 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, with stirring for 1 hour (2O 0 C).
  • the microchip was incubated with a solution of staphylococcal enterotoxin in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl (20 h, 2O 0 C), and then washed from a protein that was not specifically bound to the gel, first by treatment with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, OD% Tween-20 (2 hours with stirring, 2O 0 C), then with water.
  • the antigen-antibody complex was destroyed and the antigen was eluted on the gel surface by adding 1 ⁇ l of a saturated MALDI monitoring matrix solution (sinapic acid) in a solution of 10% formic acid in 30% aqueous aceto nitrile to each microarray cell.
  • a saturated MALDI monitoring matrix solution sinapic acid
  • the microchip was kept for 20 min at room temperature in a humid chamber, then dried on a heating table at 4O 0 C.
  • Staphylococcal enterotoxin B was identified by its molecular weight of 28,400 Da.
  • Table 1 The results of the quantitative immunoassay of various biological toxins on gel microarrays obtained by polymerization immobilization are shown in Table 1.
  • an analysis was made of viscumin, staphylococcal enterotoxin B, tetanus toxin, diphtheria toxin and lethal factor sib.
  • Direct, competitive and sandwich immunoassay with fluorescence and chemiluminescent registration was carried out according to the methods described in Example 1, using the antibodies indicated in Table 1.
  • Table 1 also shows the concentration range at which the dependence of the intensity of the fluorescent or chemiluminescent signal of the gel cells of the microchip on the concentration of biotoxin was observed; the lower limit of the interval corresponds to the detection limit calculated as described in Example 1.
  • Example 4 Simultaneous analysis of several biotoxins on one microchip.
  • the main advantage of microchips over traditional immunoassay methods is the possibility of quantitative analysis of samples simultaneously for the presence of several antigens.
  • Microchips with gel elements containing immobilized antibodies to biotoxins ricin, viscumin, staphylococcal enterotoxin B, tetanus toxin, diphtheria toxin, lethal anthrax toxin factor
  • ricin, viscumin, staphylococcal enterotoxin B, tetanus toxin, diphtheria toxin, lethal anthrax toxin factor were obtained.
  • the microchip was developed with a mixture of Cy3-labeled secondary antibodies against all b toxins (Fig. 3).
  • Antibody pairs for parallel analysis of several toxins were selected so that non-specific interaction with other toxins and antibodies was minimal.
  • antibodies against ricin IRKl were used as immobilized, and Rêthl antibodies were used as developing ones, and not vice versa, as in Example 1 for sandwich analysis, since immobilized Rvichl antibodies gave non-specific signals with C3-labeled antibodies against staphylococcal enterotoxin B SEB 643. Bright fluorescent signals were observed in gel elements containing the corresponding antibodies.
  • the detection limits of biotoxins for parallel analysis were the same as in the determination of each toxin separately (Table 1).
  • a sandwich immunoassay of ricin was performed as described in Example 1, but microarrays were incubated with ricin solutions for 1 hour with stirring. Stirring was carried out using a peristaltic pump. For this the microchip was placed in a 50 ⁇ l flow chamber equipped with sample supply tubes. The chamber was attached to a peristaltic pump, and 100 ⁇ l of ricin solution was placed in the system. The sample was mixed by switching the flow direction from the forward to the reverse every 2 seconds; flow rate was 1.5 ml / min. Simultaneously, an analysis was carried out with stirring on 6 microchips, i.e. measurement of 6 samples with various ricin concentrations. After incubation, the microchips showed Cy3-labeled secondary antibodies against ricin.
  • the calibration graph for ricin determination by sandwich immunoassay with 1 hour stir was similar to the calibration graph for a sandwich assay with incubation overnight without stirring (Fig. IB).
  • the implementation of the mixing of the sample significantly reduced the time of immunoassay using microarrays.
  • Microchips with immobilized anti-ricin antibodies were made as described in Example 1.
  • the microchips were stored at 1 0 0 C in a humid chamber in the presence of 20% glycerol.
  • a sandwich analysis of ricin with fluorescence detection was carried out, a calibration curve was constructed "fluorescence signal intensity - concentration of ricin in solution" and the detection limit of ricin was determined as described in Example 1.
  • the detection limit of ricin on microarrays after 6 months. storage was 0.1 ng / ml, i.e. the same as for microchips immediately after manufacture.
  • microchips with immobilized antibodies fully retain their activity for at least 6 months. storage. Table 1.
  • Table 1 The results of quantitative immunoassay of various biotoxins on a microchip

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Description

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ТОКСИНОВ
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к аналитической биохимии и количественному иммунохимическому анализу и касается количественного обнаружения различных биологических токсинов иммунохимическим методом с использованием трехмерных микрочипов на основе гидрогелей.
Предлагаемый способ обнаружения биотоксинов может быть использован в медицине, в пищевой промышленности, в охране окружающей среды. В настоящее время разработка быстрых и чувствительных методов анализа биологических токсинов приобретает важное значение в связи с угрозой биотерроризма, так как многие природные токсины могут быть использованы в качестве компонентов биологического оружия.
Уровень техники
В настоящее время хорошо известны многие бактериальные, растительные и животные токсины, обладающие сильным токсическим действием на человеческий организм. К наиболее сильным токсинам, продуцируемым микроорганизмами, относятся ботулинический, столбнячный и холерный токсины; из токсинов растительного происхождения наиболее сильными являются рицин и абрин. Существует также множество токсинов, секретируемых ядовитыми животными: змеями, пауками, скорпионами и т.д. Большинство биотоксинов имеют полипептидную природу, однако известны и низкомолекулярные соединения, имеющие высокую токсичность, например, тетродотоксин (иглобрюхие рыбы), T-2 токсин (грибы), токсины сине-зеленых водорослей.
Для идентификации и анализа как самих токсинов, так и организмов, которые их вырабатывают, в настоящее время используются различные лабораторные методы, включающие тесты на животных, микробиологические методы, анализ ДНК с использованием ПЦР, иммунологические методы: прямой и непрямой радиоиммунологический, иммунофлуоресцентный и иммуноферментный анализ. Наиболее чувствительным, быстрым и удобным методом анализа токсинов является иммунохимический метод с использованием антител против токсинов. Чувствительность иммуноанализа биотоксинов с использованием классического "плашечного" варианта достигает 0,01-1 нг вещества в 1 мл исследуемого раствора (например, в случае рицина [1], стафилококкового энтеротоксина В [2], дифтерийного токсина [3]).
[1] М.А. PoIi, V.R. Rivеrа, J.F. Неvеtsоп, G.А. Меrril, Dеtесtiоп оf riсiп bу соlоrimеtriс and chemiluminescence ELISA, Тохiсоп, 1994, 32, 1371-1377.
[2] М.А. PoIi, V.R. Rivеrа, D. Nеаl, Sепsitivе апd sресifiс соlоrimеtriс ELISAs fоr Stарhуlососсus аurеus епtеrоtохiпs A and B iп uriпе апd buffеr, Тохiсоп, 2002, 40, 1723- 1726.
[3] K.H. Епglеr, А. Еfstrаtiоu, Rарid епzуmе immuпоаssау fоr dеtеrmiпаtiоп оf tохigепiсitу аmопg сliпiсаl isоlаtеs оf соrупеbасtеriа, J. CHn. МiсrоbiоL, 2004, 38, 1385- 1389.
Традиционные иммунологические методы не позволяют проводить одновременный тест на наличие нескольких токсинов в образце, поэтому существует необходимость разработки быстрого, чувствительного и эффективного метода одновременного параллельного анализа. Параллельный анализ образцов на присутствие нескольких соединений достигается при использовании микрочипов — массивов индивидуальных ячеек, содержащих различные зонды (белки, рецепторы, антитела, антигены и др.). Проведение одновременного анализа образца по многим параметрам, значительно увеличивает эффективность анализа, позволяет миниатюризировать проведение исследований и значительно снижает количество исследуемого материала.
Описано применение чипов различной конструкции для детекции биологических токсинов. Для одновременного иммунологического определения биологических токсинов предложен чип-биосенсор на основе иммобилизованных антител против биотоксинов [4].
[4] F.S. Liglеr, CR. Таitt, L.С. Shrivеr-Lаkе, KE Sарsfоrd, Y. Shubiп, IP. Gоldеп, Аiтау biоsепsоr fоr dеtесtiоп оf tохiпs, Апаl. Вiоапаl. Сhеm., 2003, 377, 469-477. Биочип состоял из двух элементов (блоков). На поверхности предметного стекла располагали каналы с иммобилизованными антителами. Иммобилизация проводилась путем образования комплекса авидин - биотинилированные антитела. Токсины белковой природы анализировали с помощью сэндвич-анализа с использованием пары соответствующих антител. Растворы антигенов и флуоресцентно-меченных проявляющих антител подавали к иммобилизованным антителам через каналы на втором блоке, ориентированном перпендикулярно колонкам иммобилизованных антител. Флуоресцентные сигналы комплексов антитело-антиген-меченое антитело регистрировали с помощью конфокального микроскопа. Пределы детекции токсинов составили 1,6 нг/мл для холерного токсина, 8 нг/мл для рицина, 40 нг/мл для ботулинического токсина А, 4 нг/мл для стафилококкового энтеротоксина В, 6,2- 104 КОЕ/мл для бактерий Васilhιs glоbigii. Этот биосенсор использовали также для детекции низкомолекулярных токсинов методом конкурентного иммуноанализа.
Для прямого иммуноанализа меченных флуоресцеином стафилококкового и холерного токсинов фирмой Nапоgеп (США) предложены электронные микрочипы с иммобилизованными антителами [5].
[5] K.L. Еwаlt, R. W. Наigis, R. Rоопеу, D. Асklеу, M. Кrihаk, Dеtесtiоп оf biоlоgiсаl tохiпs on ап асtivе еlесtrопiс miсrосhiр, Апаl. Вiосhет., 2001, 289, 162-172. Иммобилизация биотинилированых антител на микрочипе осуществлялась путем образования комплексов авидин-биотин на микросайтах, содержащих авидин. К микросайтам были подведены электроды, и биотинилированные антитела, а также растворы анализируемых токсинов подавались под действием электрического поля. В этом случае эксперименты по анализу проводили только с токсинами, в которые предварительно была введена флуоресцентная метка.
Фирма Вiорrахis (США) разрабатывает технологию микрочиriбв, в которой для детекции сигнала используется Рамановская спектроскопия (комбинационное рассеяние) [6].
[6] А.Е. Grоw, L.L. Wооd, J.L. Сlаусоmb, Р.А. Тhоmрsоп, Nеw biосhiр tесhпоlоgу fоr lаbеl-frее dеtесtiоп оf раthоgепs апd thеir tохiпs, J. МiсrоЫоl. Меthоds, 2003, 53, 221- 233.
Биомолекулы, в частности, антитела против биотоксинов, иммобилизуют на металлической поверхности в точках диаметром приблизительно 1 микрон. После обработки микрочипа раствором, содержащим анализируемое вещество, происходит образование комплекса антитело-антиген, которое детектируют, получая спектры комбинационного рассеяния, из которых вычитают спектры свободных антител. Показана возможность детекции В (1) и G (1) афлатоксинов из смеси. Трехмерные микрочипы на основе полиакриламидных гидрогелей впервые были разработаны в ИМБ РАН [7].
[7] G.М. Еrshоv, А.D. Мirzаbеkоv, Меthоd оf mапufасturiпg а mаtriх fоr thе dеtесtiоп оf mismаtсhеs, US Раtепt N° 5770721.
В настоящее время гелевые микрочипы получают методами сополимеризации и полимеризационной иммобилизации [8, 9].
[8] A.Д. Мирзабеков, А.Ю. Рубина, CB. Паньков, Б. К. Чернов Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гелях при формировании микрочипа. Патент N 2175972, 20 ноября 2001 (Б.И. 2001, N 25).
[9] A.Д. Мирзабеков, А.Ю. Рубина, CB. Паньков Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ N 2216547.
Технология получения гидрогелевых микрочипов включает подготовку подложки (стекло, пластик, кремний) (1), нанесение полимеризационной смеси, содержащей компоненты геля и иммобилизуемые вещества, в виде капель на подложку с помощью робота (T), фотоиндуцированную полимеризацию геля с образованием гелевых элементов, содержащих иммобилизованные зонды (3). В результате получаются массивы дискретных гелевых элементов, каждый их которых содержит иммобилизованный зонд. В качестве зондов могут выступать олигонуклеотиды, ДНК, белки, различные низкомолекулярные соединения [10-12]. Показано, что белковые микрочипы, полученные методом сополимеризации, можно использовать для исследования белок-белковых взаимодействий, в частности, взаимодействий антиген-антитело, проведения иммунохимических и ферментативных реакций [11, 12].
[10] A. Yu. Rubiпа, S.V. Рап'kоv, Е.I. Dеmепtiеvа, D.N. Реп'kоv, А. V. Вutуgiп, V.А. Vаsiliskоv, А. V. Сhudiαоv, A.L. Мikhеikiп, V.М. Мikhаilоviсh, A.D. Мirzаbеkоv, Нуdrоgеl drор miсrосhiрs with immоbilizеd DNA: рrореrtiеs апd mеthоds fоr lаrgе-sсаlе рrоduсtiоп, Апаl. Вiосhет., 2004, 325, 92-106.
[11] A.Ю. Рубина, CB. Паньков, CM. Иванов, Е.И. Дементьева, А.Д. Мирзабеков, Белковые микрочипы, Докл. Акад. Наук, 2001, 381, 701-704.
[12] A. Yu. Rubiпа, Е.I. Dеmепtiеvа, А.А. Stоmаkhiп, EX. Dаrii, S.V. Рап'kоv, V.Е. Ваrskу, S. M. Ivапоv, E. V. Копоvаlоvа, A.D. Мirzаbеkоv, Нуdrоgеl-Ъаsеd рrоtеiп miсrосhiрs: mапufасturiпg, рrореrtiеs, апd аррliсаtiопs, ВiоТесhпiqиеs, 2003, 34, 1008- 1022.
В предлагаемом изобретении микрочипы на основе трехмерных гидрогелей использованы для разработки способа количественного обнаружения биологических токсинов.
Недостатки
Недостатком традиционных иммунологических методов анализа является невозможность проводить одновременный анализ нескольких соединений, в частности, биотоксинов, в образце. Множественный параллельный анализ нескольких соединений достигается при использовании микрочипов.
К недостаткам описанных в литературе способов анализа биологических токсинов на микрочипах относятся сложная технология изготовления микрочипов: объединение нескольких блоков, подведение каналов для подачи растворов, присоединение электродов. Регистрация сигналов производится с использованием сложной и дорогостоящей аппаратуры: конфокальный микроскоп, Рамановская спектроскопия и др. Эти недостатки преодолены при разработке способа иммуноанализа биологических токсинов с использованием трехмерных микрочипов на основе гидрогелей.
Раскрытие изобретения
Целью изобретения является разработка способа количественного обнаружения биологических токсинов бактериального, растительного и животного происхождения, позволяющего проводить одновременный параллельный анализ нескольких биотоксинов в образце с чувствительностью, не уступающей или превышающей чувствительность стандартных иммунологических тестов. Поставленная цель достигается путем разработки способа количественного обнаружения биологических токсинов с использованием микрочипов на основе гидрогелей. Гидрогелевые элементы диаметром 100-600 мкм и высотой 30-100 мкм, содержащие иммобилизованные антитела против биотоксинов или биотоксины, получены методом фото- или химически индуцированной полимеризации и ковалентно закреплены на поверхности подложки (стекло, пластик или кремний). Предлагаемый способ включает следующие стадии: а) изготовление биологического микрочипа, представляющего собой упорядоченный массив трехмерных; гидрогелевых ячеек на твердой подложке, содержащих иммобилизованные антитела к различным биотоксинам или биотоксины, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано антитело к индивидуальному биотоксину или индивидуальный биотоксин; б) инкубацию микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу биотоксины, для образования иммунных комплексов биотоксин-антитело, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; в) детекцию образовавшегося комплекса; г) количественное обнаружение анализируемого биотоксина.
При нанесении на микрочип реакционной среды, содержащей анализируемый образец (биотоксин), происходит образование иммунных комплексов со специфическими лигандами, иммобилизованными в гелевых ячейках микрочипа. Детекцию образовавшегося комплекса на стадии в) и последующее количественное обнаружение на стадии г) проводят в формате прямого, конкурентного или сэндвич- иммуноанализа.
Для прямого иммуноанализа реакционная среда на стадии б) содержит анализируемый биотоксин, который образует специфический комплекс с иммобилизованными на чипе антителами против этого токсина.
Конкурентный анализ проводят с использованием микрочипа с иммобилизованными биотоксинами или иммобилизованными антителами. В первом случае реакционная среда на стадии б) дополнительно содержит меченые антитела к анализируемому биотоксину, и происходит конкуренция меченых антител за связывание с биотоксином в растворе и биотоксином, иммобилизованным на микрочипе. В другом варианте конкурентного анализа микрочип содержит иммобилизованные антитела, а реакционная среда на стадии б) дополнительно содержит меченый биотоксин. Происходит конкуренция между меченым и немеченым биотоксином за связывание с иммобилизованными антителами.
В случае сэндвич-иммуноанализа микрочип содержит иммобилизованные антитела, реакционная среда на стадии б) содержит анализируемый биотоксин, который образует специфический комплекс с иммобилизованными на чипе антителами. После образования комплекса микрочип проявляют мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу данного биотоксина.
При необходимости стадию б) проводят в условиях перемешивания, которое значительно уменьшает время проведения анализа.
Способы прямого и конкурентного анализа возможны как для токсинов белковой природы, так и для низкомолекулярных токсинов. Сэндвич-вариант иммуноанализа возможен только для биотоксинов белковой природы, для которых можно получить антитела, специфичные к разным эпитопам белковой молекулы.
Регистрацию результатов иммуноанализа проводят с помощью флуоресценции, хемилюминесценции либо масс-спектрометрии непосредственно с гелевых элементов микрочипа. Антитела или биотоксины могут содержать флуоресцентные метки или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хеми- или биолюминесценции). Для масс-спектр альной детекции не требуется введения дополнительных меток.
Количественное обнаружение биотоксина осуществляют путем проведения стадий а) - в) со стандартными (эталонными) образцами, содержащими известные концентрации анализируемого биотоксина. Строится калибровочная зависимость "сигнал гелевой ячейки микрочипа - концентрация биотоксина". После этого стадии а) - в) проводят с анализируемым образцом, и по калибровочной зависимости определяют концентрацию анализируемого биотоксина в образце.
Предлагаемый способ позволяет проводить одновременный параллельный анализ нескольких биотоксинов в образце. Микрочип для параллельного множественного анализа содержит иммобилизованные антитела против нескольких токсинов и/или несколько иммобилизованных биотоксинов. В каждой отдельной гелевой ячейке иммобилизовано антитело к индивидуальному биотоксину или индивидуальный биотоксин. После инкубации микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий несколько подлежащих анализу биотоксинов, образуются специфические иммунные комплексы биотоксин-антитело. В случае прямого иммуноанализа реакционная среда содержит образец, включающий несколько анализируемых токсинов, и после инкубации микрочипа с образцом регистрируют сигналы ячеек микрочипа, содержащих соответствующее иммобилизованное антитело. Для конкурентного анализа реакционная среда на стадии б) дополнительно содержит смесь меченых антител ко всем анализируемым биотоксинам или смесь всех анализируемых меченых биотоксинов. В случае сэндвич-иммуноанализа проявление микрочипа после инкубации в реакционной среде, включающей образец, осуществляют смесью меченых антител против всех анализируемых биотоксинов.
Чувствительность предлагаемого способа обнаружения биологических токсинов не уступает чувствительности плашечного варианта иммуноанализа, например, предел обнаружения рицина сэндвич-иммуноанализом с использованием гелевых микрочипов составил 0,1 нг/мл (Таблица 1).
Предлагаемый способ анализа биотоксинов, основанный на использовании гелевых микрочипов имеет ряд существенных преимуществ перед микрочипами, описанными в литературе: развитая трехмерная гелевая структура обладает гораздо большей емкостью для иммобилизации по сравнению с двумерными микрочипами, что намного увеличивает чувствительность анализа; кроме того, иммобилизованные белки находятся в гидрофильном окружении, и отсутствует контакт с гидрофобной поверхностью подложки, что способствует сохранению биологической активности иммобилизованных молекул и обеспечивает высокую стабильность при хранении.
Краткое описание фигур
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими фигурами, на которых:
Фигура 1 демонстрирует результаты иммуноанализа рицина на микрочипах.
A. Прямой иммуноанализ. Микрочипы содержали гелевые элементы с иммобилизованными антителами против рицина Rсhl, 0,1 мг/мл. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации рицина, меченного СуЗ, в растворе. Б. Конкурентный анализ. Микрочипы содержали гелевые элементы с иммобилизованным рицином, 0,05 мг/мл. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации рицина в растворе после инкубации рицина с раствором СуЗ -меченных антител 1RK2, 4 мкг/мл.
B. Сэндвич-анализ с флуоресцентной регистрацией. Микрочипы содержали гелевые элементы с иммобилизованными антителами против рицина Rсhl, 0,1 мг/мл; микрочипы после инкубации с растворами рицина проявляли антителами против рицина IRKl, меченными СуЗ, 20 мкг/мл. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации рицина в растворе. Врезка на Фиг. IB показывает флуоресцентные сигналы при низких концентрациях рицина. Пунктирная линия соответствует интенсивности флуоресценции в 3 раза выше, чем разброс фонового сигнала; предел обнаружения рицина составил 0,1 нг/мл.
Г. Сэндвич-анализ с хемилюминесцентной регистрацией. Микрочипы содержали гелевые элементы с иммобилизованными антителами против рицина 1RK2, 0,1 мг/мл; микрочипы после инкубации с растворами рицина проявляли биотинилированными антителами против рицина 2RKl (40 мкг/мл), конъюгатом авидин-пероксидаза (45 мкг/мл) и хемилюминесцентными субстратами пероксидазы. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от концентрации рицина в растворе.
Каждая точка на графиках является средним из четырех параллельных измерений.
Фигура 2 демонстрирует MALDI-TOF масс-спектры стафилококкового энтеротоксина В, полученные с гелевых ячеек микрочипа с иммобилизованными моноклональными антителами против этого токсина S222, 0,1 мг/мл, после инкубации микрочипа с раствором токсина. Концентрации биотоксина в растворе 100 (А), 10 (Б) и 1 (В) мкг/мл.
Фигура 3 представляет результаты одновременного анализа нескольких биотоксинов на одном микрочипе. Микрочипы содержали гелевые элементы с иммобилизованными моноклональными антителами против стафилококкового токсина (S222), дифтерийного токсина (7D9), столбнячного токсина (ЗD2C6), летального фактора сибиреязвенного токсина (10EDG7), рицина (IRKl) и вискумина (TAS). Каждое антитело было иммобилизовано в 4-х гелевых элементах в концентрации 0,1 мг/мл. Флуоресцентные изображения получены после инкубации микрочипа с раствором стафилококкового токсина (чип 1), дифтерийного токсина (чип 2), столбнячного токсина (чип 3), летального фактора сибиреязвенного токсина (чип 4), рицина (чип 5) и вискумина (чип 6) и проявления смесью СуЗ-меченных моноклональных антител против всех 6 исследуемых биотоксинов (антитела против стафилококкового энтеротоксина В S643, антитела против дифтерийного токсина 2 АЗ, антитела против столбнячного токсина ЗD10B11, антитела против летального фактора сибиреязвенного токсина ЗB4D9, антитела против рицина Rсhl, антитела против вискумина MNA9). Концентрация биотоксинов в растворе 50 нг/мл (для каждого из токсинов), концентрация каждого проявляющего антитела в смеси 20 мкг/мл, общая концентрация меченых антител в смеси 120 мкг/мл.
Осуществление изобретения
Гидрогелевые микрочипы для количественного обнаружения биологических токсинов изготавливаются методом фото- или химически индуцируемой радикальной полимеризации по запатентованной технологии [9].- Микрочип представляет собой упорядоченный массив трехмерных гидрогелевых ячеек на твердой подложке, содержащих иммобилизованные антитела к различным биотоксинам бактериального, растительного и животного происхождения или иммобилизованные биотоксины различной природы. В каждой отдельной ячейке микрочипа иммобилизован индивидуальный лиганд. Связывание лиганда с гидрогелевой матрицей возможно как напрямую при его иммобилизации в процессе формирования геля, так и через образование специфических комплексов авидин (стрептавидин) - биотин, например, иммобилизованный авидин - биотинилированное антитело, или иммобилизованная нитрилотриуксусная кислота - рекомбинантный белок, содержащий полигистидиновый фрагмент и др.
В качестве лигандов используются антитела различных типов, все типы иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE), моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антитела, различные типы мини антител, в том числе Fаb-фрагменты и одноцепочечные антитела (sсFv и другие), а также низкомолекулярные биотоксины и биотоксины белковой природы. Лигандами для образования специфического комплекса с анализируемыми биотоксинами могут являться также аптамеры — молекулы ДНК или РНК, способные к высоко аффинному взаимодействию с соответствующим соединением. Например, получен РНК-аптамер, состоящий из 31 нуклеотида, специфичный к А-цепи рицина [13] и ДНК-аптамеры, специфичные к холерному токсину и стафилококковому энтеротоксину В [14].
[13] IR. Неssеlbеrth, D. Мillеr, J. Rоbеrtus, А.D. Еlliпgtоп, In vitrо selection of RNA mоlесulеs thаt iпhibit thе асtivitу оf riсiп А-сhаiп, J. ВЫ Сhет., 2000, 275, 4937-4942 [14] J. G. Вruпо, J.L. Кiеl, Usе оf magnetic beads in selection апd dеtесtiоп оf biоtохiп арtаmеrs bу еlесtrосhеmiluшiпеsсепсе апd епzуmаtiс mеthоds, Вiоtесhпiqиеs, 2002, 32, 178-183. Используемый для изготовления микрочипов метод полимеризационной иммобилизации позволяет получать микрочипы, содержащие иммобилизованные ДНК, РНК и белки [9-12].
Тип используемых для иммобилизации соединений зависит от анализируемого объекта и способа проведения анализа (прямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.).
Способ проведения количественного обнаружения биотоксинов с использованием гидрогелевых микрочипов включает следующие стадии: а) изготовление биологического микрочипа, представляющего собой упорядоченный массив трехмерных гидрогелевых ячеек на твердой подложке, полученных методом фото- или химически индуцированной полимеризации и содержащих иммобилизованные антитела к различным биотоксинам бактериального, растительного и животного происхождения или биотоксины, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано антитело к индивидуальному биотоксину или индивидуальный биотоксин; б) инкубацию микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу биотоксины, для образования иммунных комплексов биотоксин-антитело, которое при необходимости проводят в условиях перемешивания; в) детекцию образовавшегося комплекса; г) количественное обнаружение анализируемого биотоксина.
В качестве реакционной среды при проведении анализа используют буферные растворы, которые обычно применяются в иммуноанализе, например, 0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,05 M трис-НСl, рН 7,4, и др. Для уменьшения неспецифических взаимодействий в реакционную среду добавляют поливиниловый спирт, бычий сывороточный альбумин и сахарозу, белки сухого молока и др. (так называемые "блокировочные буферы", которые хорошо известны специалистам в данной области)
Способ количественного обнаружения биотоксинов может быть осуществлен в виде различных типов иммуноанализа, например, прямого, конкурентного и сэндвич-иммуноанализа (Пример 1). Для прямого иммуноанализа микрочип содержит иммобилизованные антитела против анализируемого биотоксина, а реакционная среда на стадии б) содержит анализируемый биотоксин, который образует специфический иммунный комплекс с иммобилизованными антителами. При флуоресцентной регистрации анализируемый биотоксин содержит флуоресцентную метку, при хемилюминесцентной регистрации биотоксин представляет собой конъюгат с белком или другим соединением, способным участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хеми- или биолюминесценции). Регистрируемый флуоресцентный или хемилюминесцентный сигнал ячеек микрочипа с иммобилизованными антителами пропорционален концентрации биотоксина (Пример 1, Фиг. IA). Способы введения флуоресцентной метки или получения конъюгатов с белком или другим соединением хорошо известны в данной области. В частности, можно использовать процедуры, описанные в G.Т. Неrmапsоп, Вiосоηjugаtе Тесhпiquеs, Асаdеmiс Рrеss, Sап Diеgо, 1996. В случае масс-спектральной детекции не требуется введения дополнительной метки.
Конкурентный анализ проводят с использованием микрочипа с иммобилизованными биотоксинами или иммобилизованными антителами. В первом варианте реакционная среда на стадии б) дополнительно содержит флуоресцентно- меченные антитела к анализируемому биотоксину (или соответствующие конъюгаты антител). Реакционную смесь перед нанесением на микрочип инкубируют со стандартным или анализируемым образцом. При инкубации микрочипа с реакционной смесью происходит конкуренция меченых антител за связывание с биотоксином в растворе и биотоксином, иммобилизованным на микрочипе. Регистрируемый флуоресцентный или хемилюминесцентный сигнал ячеек микрочипа с иммобилизованными биотоксинами тем выше, чем меньше концентрация анализируемого токсина в образце (Пример 1, Фиг. 1Б)
В другом варианте конкурентного анализа микрочип содержит иммобилизованные антитела, а реакционная среда на стадии б) дополнительно содержит флуоресцентно-меченный биотоксин (или соответствующий конъюгат биотоксина). Происходит конкуренция между меченым и немеченым биотоксином за связывание с иммобилизованными антителами. Регистрируемый флуоресцентный или хемилюминесцентный сигнал ячеек микрочипа с иммобилизованными антителами тем выше, чем меньше концентрация анализируемого токсина в образце.
В случае сэндвич-иммуноанализа микрочип содержит иммобилизованные антитела, реакционная среда на стадии б) содержит анализируемый биотоксин, который образует специфический комплекс с иммобилизованными на чипе антителами. После образования комплекса микрочип проявляют флуоресцентно- меченными антителами (или соответствующими конъюгатами антител), специфичными к другому эпитопу данного биотоксина. Регистрируемый флуоресцентный или хемилюминесцентный сигнал ячеек микрочипа с иммобилизованными антителами пропорционален концентрации биотоксина (Пример 1, Фиг. IB, Г).
Прямой и конкурентный анализы на микрочипах можно проводить для токсинов как белковой природы, так и для низкомолекулярных токсинов. Сэндвич- вариант иммуноанализа возможен, как правило, только для биотоксинов белковой природы, для которых можно получить антитела, специфичные к разным эпитопам белковой молекулы (иммобилизованные связывающие антитела и проявляющие меченые антитела).
Количественное обнаружение биотоксинов осуществляют путем проведения стадий а) -в) с известными концентрациями анализируемого биотоксина и построения калибровочной зависимости, по которой определяют количество анализируемого биотоксина в образце. Для всех вариантов анализа строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресцентного или хемилюминесцентного сигнала соответствующих гелевых ячеек микрочипа от известной концентраций биотоксина в стандартном (эталонном) растворе. Неизвестную концентрацию биотоксина в образце определяют из калибровочной кривой по значению интенсивности сигнала, полученного после взаимодействия анализируемого образца с микрочипом. Предел обнаружения биотоксина определяют как концентрацию, соответствующую интенсивности флуоресцентного/хемилюминесцентного сигнала, в 3 раза превышающего разброс фонового сигнала.
Регистрацию результатов иммуноанализа биотоксинов с использованием гелевых микрочипов можно проводить несколькими методами: по интенсивности флуоресценции; по интенсивности хемилюминесценции; масс-спектрометрией непосредственно с гелевых элементов микрочипа.
При регистрации результатов по интенсивности флуоресценции используют антитела против биотоксинов и биотоксины, меченные флуоресцентными красителями, например, такими как Техасский красный, тетраметилродамин, флуоресцеин, цианиновый 3 и 5 (СуЗ, Cy5), но, не ограничиваясь ими. Регистрацию флуоресцентных сигналов с ячеек микрочипа проводят с помощью флуоресцентных микроскопов или сканирующих микроскопов различных типов, позволяющих регистрировать сигнал с используемой флуоресцентной метки.
При регистрации результатов по интенсивности хемилюминесценции используют конъюгаты антител, биотоксинов или авидина (для биотинилированных белков), например, с такими ферментами, как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, люцифераза, но не ограничиваясь ими, дающими хемилюминесцентные сигналы в результате соответствующих ферментативных реакций, например, катализируемом пероксидазой окислении люминола перекисью водорода. Хемилюминесцентные сигналы регистрируют с помощью ССD-камер или других регистрирующих устройств, в частности, флуоресцентных микроскопов при выключенном источнике возбуждающего света.
Для регистрации результатов с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии разработана методика получения MALDI TOF масс-спектров непосредственно с гелевых ячеек микрочипа. Процедура регистрации результатов анализа в этом случае включает обработку микрочипа раствором, разрушающим комплекс, образованный исследуемым биотоксином с иммобилизованным на чипе антителом против этого токсина (элюирование биотоксина с ячейки микрочипа), прямой масс-спектр альный анализ непосредственно с гелевого элемента, и идентификацию биотоксина по его молекулярной массе (Пример 2, Фиг. 2).
Пример 3 показывает результаты иммуноанализа б различных биологических токсинов на гидрогелевых микрочипах. Способ количественного обнаружения биотоксинов с использованием гидрогелевых микрочшюв характеризуется высокой чувствительностью, не уступающей чувствительности стандартных иммунологических методов: для рицина предел обнаружения составил 0,1 нг/мл.
Предлагаемый способ количественного обнаружения биотоксинов с использованием гидрогелевых микрочипов позволяет проводить одновременный, параллельный анализ образцов на наличие нескольких токсинов, что резко увеличивает эффективность обнаружения и значительно снижает количество исследуемого материала: для анализа достаточно 20 мкл исследуемого образца. Микрочип для параллельного множественного анализа содержит иммобилизованные антитела против нескольких токсинов и/или несколько иммобилизованных биотоксинов. В случае прямого иммуноанализа реакционная среда содержит образец, включающий один или несколько анализируемых токсинов, и после инкубации микрочипа с образцом регистрируют сигналы ячеек микрочипа, содержащих соответствующие иммобилизованные антитела. Для конкурентного анализа реакционная среда на стадии б) дополнительно содержит смесь меченых антител ко всем анализируемым биотоксинам или смесь всех анализируемых меченых биотоксинов. В случае сэндвич-иммуноанализа проявление микрочипа после инкубации в реакционной среде, содержащей образец, осуществляют смесью меченых антител против всех анализируемых биотоксинов. В Примере 4 продемонстрировано проведение одновременного сэндвич-анализа 6 различных биологических токсинов на одном микрочипе при проявлении микрочипа смесью б флуоресцентно-меченных антител. Чувствительность параллельного анализа оказалась не меньше, чем чувствительность для определения одного токсина.
При необходимости стадию инкубации микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу биотоксины (стадия б) проводят в условиях перемешивания, которое значительно уменьшает время проведения анализа (Пример 5). Перемешивание можно осуществлять, например, путем переключения направления потока реакционного раствора с прямого на обратное с помощью насосов различного типа, ультразвуком, электрофорезом, но, не ограничиваясь указанными способами.
Преимуществом гидрогелевых микрочипов по сравнению с описанными в литературе двумерными чипами является гидрофильное окружение иммобилизованных в геле молекул и отсутствие контакта с гидрофобной поверхностью подложки, что особенно важно для белковых молекул. Гидрофильное окружение способствует сохранению биологической активности белков и ферментов и обеспечивает их стабилизацию при хранении. Микрочипы с иммобилизованными антителами стабильны, по крайней мере, в течение полугода при хранении в присутствии глицерина при 1O0C (Пример 6).
Далее изобретение иллюстрируется конкретными воплощениями, которые приводятся исключительно для целей наглядности. Не предполагается, что приводимые примеры являются исчерпывающими или ограничивают изобретение конкретными раскрытыми формами, и очевидно, что возможно множество модификаций и вариаций, не отклоняющихся от духа изобретения и не выходящие за рамки формулы изобретения.
Пример 1. Количественный иммуноанализ рицина с использованием гидрогелевых микрочипов
Гидрогелевые микрочипы, содержащие иммобилизованные антитела против рицина и рицин, получали по ранее запатентованной технологии полимеризационной иммобилизации [9]. Для уменьшения неспецифических взаимодействий во всех вариантах анализа микрочипы предварительно инкубировали в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1 % поливинилового спирта (ПBC-50) или 3 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 4 % сахарозы ("блокировочный буфер"), 2 ч при комн. температуре. Перед проведением анализа растворы рицина (образца) разбавляли 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, содержащим 0,15 M NaCl, 0,15 % ПBC-50 и 0,15 % поливинилпирролидона 360 (ПBП-360).
Прямой иммуноанализ К микрочипам, содержащим гелевые элементы с иммобилизованными моноклональными антителами против рицина Rсhl и других биотоксинов (антитела против стафилококкового энтеротоксина В S222, антитела против столбнячного токсина ЗD2C6, антитела против дифтерийного токсина 7D9, для контроля перекрестных взаимодействий (концентрация иммобилизованных в геле антител 0,1 мг/мл), добавляли по 20 мкл растворов рицина, меченного СуЗ, и выдерживали при 1O0C в течение ночи. После отмывки микрочипов 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20 (15 мин, комн. температура) измеряли интенсивность флуоресцентных сигналов гелевых элементов микрочипов.
Для конкурентного анализа использовали микрочип с иммобилизованным рицином (0, 1 мг/мл). Раствор, содержащий определяемый рицин, инкубировали с раствором СуЗ -меченных моноклональных антител против рицина 1RIC2 (4 мкг/мл) в течение 2- х ч при 370C и перемешивании. Смесь (20 мкл) после инкубации наносили на микрочип и выдерживали 2 час при 37°. После отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20, 15 мин, комн. температура) измеряли интенсивность флуоресцентных сигналов. В сэндвич-варианте иммуноанализа изготавливали микрочипы с иммобилизованными моноклональными антителами против рицина 1RK2 и других биотоксинов (антитела против стафилококкового энтеротоксина В S222, антитела против столбнячного токсина ЗD2C6, антитела против дифтерийного токсина 7D9, для контроля перекрестных взаимодействий (концентрация иммобилизованных в геле антител 0,1 мг/мл), добавляли 20 мкл раствора рицина, и чипы инкубировали при 1O0C в течение ночи. После кратковременной (15 мин) отмывки 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20, микрочипы проявляли СуЗ -меченными антителами IRKl, специфичными к другому эпитопу антигена, 20 мкг/мл (флуоресцентная детекция), 40 мин, комн. температура. После отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0, 1 % Tвин-20, 15 мин, комн. температура) измеряли интенсивность флуоресцентных сигналов. При хемилюминесцентной детекции на микрочип после взаимодействия с рицином наносили 20 мкл биотинилированных антител против рицина 2RKl с концентрацией 40 мкг/мл, а затем 20 мкл конъюгата авидина с пероксидазой хрена с концентрацией 45 мкг/мл и хемилюминесцентные субстраты пероксидазы (люминол, H2O2); детектировали хемилюминесцентный сигнал в течение 60 сек.
Антитела против рицина и рицин, меченные СуЗ, а также биотинилированнные антитела и конъюгат авидин-пероксидаза получали по известным методикам, описанным, например, в [15].
[15] G.Т. Неrmапsоп, Вiосопjugаtе Тесhпiquеs, Асаdеmiс Рrеss, Sап Diеgо, 1996. Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный микроскоп, снабженный CCD камерой и компьютерными программами для визуализации изображения и обработки полученных данных, разработанный в лаборатории биочипов ИМБ РАН [16].
[16] V. Ваrskу, А. Реrоv, S. Тоkаlоv, А. Сhudiпоv, E. Кrеiпdliα, А. Shаrопоv, E. Коtоvа, А. Мirzаbеkоv, Fluоrеsсепсе dаtа апаlуsis on gеl-Ъаsеd biосhiрs, J. Вiотоl. Sсrеепiпg, 2002, 7, 247-257.
Микроскоп позволяет одновременно анализировать данные со всех элементов микрочипа и получать двумерное и трехмерное изображения флуоресцентного сигнала с гелевых элементов. Для измерения хемилюминесцентных сигналов использовали тот же флуоресцентный микроскоп с выключенным источником возбуждения. Для всех вариантов анализа строили график зависимости интенсивности флуоресценции или хемилюминесценции от концентрации рицина в растворе (Фиг. 1) Предел обнаружения рицина рассчитывали как концентрацию, соответствующую интенсивности сигнала, в 3 раза превышающего разброс фонового сигнала.
Для прямого анализа рицина наблюдали зависимость интенсивности флуоресценции гелевых ячеек микрочипа от концентрации СуЗ -меченного рицина в диапазоне концентраций 0,2-500 нг/мл, линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентраций 0,2-60 нг/мл (Фиг. IA), предел обнаружения составил 0,2 нг/мл.
В случае конкурентного анализа интенсивность флуоресценции гелевых ячеек микрочипа была обратно пропорциональна концентрации рицина в растворе (Фиг. 1Б), и предел обнаружения составил 4 нг/мл.
Калибровочные графики для сэндвич-анализа рицина с флуоресцентной и хемилюминесцентной детекцией показаны на Фиг. 1 В и Г. Зависимость интенсивности флуоресценции и хемилюминесценции гелевых ячеек микрочипа от концентрации рицина наблюдали в диапазоне концентраций рицина 0, 1-500 нг/мл (флуоресцентная детекция) и 0,7-500 нг/мл (хемилюминесцентная детекция). Врезка на Фиг. IB иллюстрирует определение предела детекции: пунктирная линия соответствует интенсивности флуоресценции, в три раза превышающей разброс фонового сигнала, таким образом, наименьшая концентрация рицина, надежно определяемая данным методом, составляет ОД нг/мл. Для иммуноферментного анализа рицина на микрочипе с хемилюминесцентной детекцией предел обнаружения был 0,7 нг/мл.
При данных условиях проведения анализа, в частности, при используемых нами процедурах блокировки и отмывки микрочипов, неспецифические сигналы, т.е., сигналы от ячеек микрочипа, содержащих антитела к другим токсинам, не отличались от фоновых или от сигналов пустых гелевых элементов.
Пример 2. Идентификация белков на гелевом элементе микрочипа путем прямого масс-спектрального анализа. Прямой анализ стафилококкового энтеротоксина В на микрочипе с масс-спектральной регистрацией Изготовлен мшφочип, содержащий в гелевых ячейках иммобилизованные моноклональные антитела к стафилококковому энтеротоксину В S222 (0,1 мкг антител/ячейка геля). После полимеризации микрочип промывали 0,01 M фосфатным буфером, содержащим 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20, при перемешивании в течение 1 час (2O0C). Микрочип инкубировали с раствором стафилококкового энтеротоксина в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl (20 час, 2O0C), и далее отмывали от неспецифически связавшегося с гелем белка сначала обработкой 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, ОД % Tвин-20 (2 часа при перемешивании, 2O0C), затем водой. Перед проведением масс- спектрального анализа разрушали комплекс антиген-антитело и элюировали антиген на поверхность геля добавлением в каждую ячейку микрочипа 1 мкл насыщенного раствора матрицы для MALDI мониторинга (синапиновая кислота) в растворе 10% муравьиной кислоты в 30%-нoм водном ацето нитриле. Микрочип выдерживали 20 мин при комнатной температуре во влажной камере, затем высушивали на нагревательном столике при 4O0C.
Масс-спектры, полученные непосредственно с гелевых элементов микрочипа, после взаимодействия с растворами стафилококкового токсина различной концентрации, показаны на Фиг. 2. Стафилококковый энтеротоксин В идентифицировали по его молекулярной массе, равной 28400 Да. Как видно из рисунка, наблюдается количественная корреляция между абсолютной интенсивностью пиков молекулярных ионов и концентрацией энтеротоксина в интервале концентраций 1-100 мкг/мл. Масс спектры с гелевых ячеек, не содержащих антитела к этому токсину, но инкубированных с раствором антигена, не содержали вышеупомянутых пиков.
Пример 3. Количественный иммуноанализ различных биологических токсинов с использованием гидрогелевых микрочипов
Результаты количественного иммуноанализа различных биологических токсинов на гелевых микрочипах, полученных методом полимеризационной иммобилизации, показаны в Таблице 1. Кроме иммуноанализа рицина, описанного в Примере 1, был проведен анализ вискумина, стафилококкового энтеротоксина В, столбнячного токсина, дифтерийного токсина и летального фактора сибиреязвенного токсина. Прямой, конкурентный и сэндвич-иммуно анализ с флуоресцентной и хемилюминесцентной регистрацией проводили по методикам, описанным в Примере 1, с использованием антител, указанных в Таблице 1. В таблице 1 также указан интервал концентраций, при которой наблюдали зависимость интенсивности флуоресцентного или хемилюминесцентного сигнала гелевых ячеек микрочипа от концентрации биотоксина; нижний предел интервала соответствует пределу обнаружения, рассчитанному как описано в Примере 1.
Пример 4. Одновременный анализ нескольких биотоксинов на одном микрочипе Основное преимущество микрочипов перед традиционными методами иммуноанализа - это возможность количественного анализа образцов одновременно на наличие нескольких антигенов. Получены микрочипы с гелевыми элементами, содержащими иммобилизованные антитела к б биотоксинам (рицин, вискумин, стафилококковый энтеротоксин В, столбнячный токсин, дифтерийный токсин, летальный фактор сибиреязвенного токсина). После инкубации микрочипа с раствором, содержащим один из исследуемых токсинов, микрочип проявляли смесью СуЗ-меченных вторичных антител против всех б токсинов (Фиг. 3). Пары антител для параллельного анализа нескольких токсинов подбирали таким образом, чтобы неспецифическое взаимодействие с другими токсинами и антителами было минимальным. Например, в случае параллельного анализа антитела против рицина IRKl использовали в качестве иммобилизованных, а антитела Rсhl — в качестве проявляющих, а не наоборот, как в Примере 1 для сэндвич-анализа, так как иммобилизованные антитела Rсhl давали неспецифические сигналы с СуЗ- меченными антителами против стафилококкового энтеротоксина В SEB 643. Наблюдали яркие флуоресцентные сигналы в гелевых элементах, содержащих соответствующие антитела. Пределы обнаружения биотоксинов для параллельного анализа оказались такие же, как и при определении каждого токсина в отдельности (Таблица 1).
Пример 5. Ускорение иммуноанализа биотоксина при использовании перемешивания анализируемого образца
Сэндвич-иммуно анализ рицина проводили как описано в Примере 1, но микрочипы инкубировали с растворами рицина в течение 1 час при перемешивании. Перемешивание осуществляли с помощью перистальтического насоса. Для этого микрочип помещали в проточную камеру объемом 50 мкл, снабженную трубками для подачи образца. Камеру присоединяли к перистальтическому насосу, и в систему помещали 100 мкл раствора рицина. Образец перемешивали, переключая направление потока с прямого направления на обратное каждые 2 сек; скорость потока была 1,5 мл/мин. Одновременно проводили анализ с перемешиванием на 6 микрочипах, т.е. измерение 6 образцов с различными концентрациями рицина. После инкубации микрочипы проявляли СуЗ -меченными вторичными антителами против рицина. Калибровочный график для определения рицина методом сэндвич- иммуноанализа с перемешиванием в течение 1 час был аналогичен калибровочному графику при проведении сэндвич-анализа с инкубацией в течение ночи без перемешивания (Фиг. IB). Таким образом, осуществление перемешивания образца позволило существенно сократить время иммуноанализа с использованием микрочипов.
Пример 6. Стабильность гидрогелевых микрочипов с иммобилизованными антителами
Были изготовлены микрочипы с иммобилизованными антителами против рицина, как описано в Примере 1. Микрочипы хранили при 1O0C во влажной камере в присутствии 20% глицерина. Проводили сэндвич-анализ рицина с флуоресцентной регистрацией, строили калибровочную кривую "интенсивность флуоресцентного сигнала - концентрация рицина в растворе" и определяли предел обнаружения рицина, как описано в Примере 1. Предел обнаружения рицина на микрочипах после 6 мес. хранения оказался 0,1 нг/мл, т.е. такой же, как для микрочипов непосредственно после изготовления. Таким образом, микрочипы с иммобилизованными антителами полностью сохраняют свою активность в течение, по крайней мере, б мес. хранения. Таблица 1. Результаты количественного иммуноанализа различных биотоксинов на микрочипе
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ количественного обнаружения биотоксинов в образце, предусматривающий : а) изготовление биологического микрочипа, представляющего собой упорядоченный массив трехмерных гидрогелевых ячеек на твердой подложке, полученных методом фото- или химически индуцированной полимеризации и содержащих иммобилизованные антитела к различным биотоксинам бактериального, растительного и животного происхождения или биотоксины, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано антитело к индивидуальному биотоксину или индивидуальный биотоксин; б) инкубацию микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу биотоксины, для образования иммунных комплексов биотоксин-антитело, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; в) детекцию образовавшегося комплекса; г) количественное обнаружение анализируемого биотоксина.
2. Способ по п. 1, в котором иммобилизованные антитела представляют собой антитела, выбранные из группы антител к рицину, вискумину, стафилококковому энтеротоксину В, столбнячному токсину, дифтерийному токсину, летальному фактору сибиреязвенного токсина.
3. Способ по п. 1, в котором иммобилизованные биотоксины представляют собой биотоксины, выбранные из группы, включающей рицин, вискумин, стафилококковый энтеротоксин B9 столбнячный токсин, дифтерийный токсин, летальный фактор сибиреязвенного токсина.
4. Способ по п. 1, в котором детекцию образовавшегося комплекса на стадии в) и последующее количественное обнаружение на стадии г) проводят в формате прямого иммуноанализа.
5. Способ по п. 1, в котором реакционная среда на стадии б) дополнительно содержит антитела к биотоксину, и детекцию образовавшегося комплекса между иммобилизованным на микрочипе биотоксином и антителом против этого биотоксина на стадии в) и последующее количественное обнаружение на стадии г) проводят в формате конкурентного иммуноанализа. .
6. Способ по п. 1, в котором реакционная среда на стадии б) дополнительно содержит меченый биотоксин, и детекцию образовавшегося комплекса между иммобилизованным на микрочипе антителом и биотоксином на стадии в) и последующее количественное обнаружение на стадии г) проводят в формате конкурентного иммуноанализа.
7. Способ по п. 1, в котором детекцию образовавшегося комплекса на стадии в) и последующее количественное обнаружение на стадии г) проводят в формате сэндвич-иммуноанализа.
8. Способ по п. 1, в котором количественное обнаружение биотоксина осуществляют путем проведения стадий а) - в) с известными концентрациями анализируемого биотоксина и построения калибровочной зависимости, по которой определяют количество анализируемого биотоксина в образце.
9. Способ по п. 1, в котором на стадии в) детекцию образовавшегося комплекса осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически или масс- спектрометрически.
PCT/RU2004/000464 2004-11-24 2004-11-24 Procede de detection quantitative de toxines biologiques WO2006062427A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/589,143 US20070172904A1 (en) 2004-11-24 2004-11-24 Method for quantitative detection of biological toxins
EP04821451A EP1816473A4 (en) 2004-11-24 2004-11-24 PROCESS FOR THE QUANTITATIVE DETECTION OF BIOLOGICAL TOXINS
PCT/RU2004/000464 WO2006062427A1 (fr) 2004-11-24 2004-11-24 Procede de detection quantitative de toxines biologiques

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2004/000464 WO2006062427A1 (fr) 2004-11-24 2004-11-24 Procede de detection quantitative de toxines biologiques

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2006062427A1 true WO2006062427A1 (fr) 2006-06-15
WO2006062427A8 WO2006062427A8 (fr) 2009-05-14

Family

ID=36578170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2004/000464 WO2006062427A1 (fr) 2004-11-24 2004-11-24 Procede de detection quantitative de toxines biologiques

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20070172904A1 (ru)
EP (1) EP1816473A4 (ru)
WO (1) WO2006062427A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014185960A3 (en) * 2013-05-14 2015-01-22 Genomics Usa, Inc. Composition and methods for entrapping a protein on a surface
RU2682721C2 (ru) * 2016-11-17 2019-03-21 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Биологический микрочип для обнаружения опухолевых экзосом в сыворотке крови человека для диагностики колоректального рака
CN110819690A (zh) * 2019-10-24 2020-02-21 广东环凯生物科技有限公司 一种金黄色葡萄球菌免疫磁珠洗液

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8092993B2 (en) * 2007-12-31 2012-01-10 Nellcor Puritan Bennett Llc Hydrogel thin film for use as a biosensor
WO2009134647A2 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Waters Technologies Corporation Apparatus and methods for performing photoreactions and analytical methods and devices to detect photo-reacting compounds
CN111239384A (zh) * 2020-01-15 2020-06-05 中国人民解放军陆军军医大学 一种破伤风毒素检测试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0875742A (ja) * 1994-06-29 1996-03-22 Japan Menburen Technol Kk 抗原もしくは抗体の免疫測定方法
RU2216547C2 (ru) * 2001-10-16 2003-11-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2041261C1 (ru) * 1993-08-11 1995-08-09 Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН Способ изготовления матрицы для детектирования мисматчей
US6406921B1 (en) * 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
CA2380075C (en) * 1999-07-23 2007-05-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Microfabricated devices and method of manufacturing the same using polymer gel

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0875742A (ja) * 1994-06-29 1996-03-22 Japan Menburen Technol Kk 抗原もしくは抗体の免疫測定方法
RU2216547C2 (ru) * 2001-10-16 2003-11-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIGLER F S ET AL: "Array biosensor for detection of toxins.", ANAL BIOANAL CHEM., vol. 377, no. 3, October 2003 (2003-10-01), pages 469 - 477, XP002430514 *
RUBINA A YU ET AL: "Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production.", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY., vol. 325, no. 1, 1 February 2004 (2004-02-01), pages 92 - 106, XP004483538 *
RUBINA A YU ET AL: "Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications.", BIOTECHNIQUES., vol. 34, no. 5, May 2003 (2003-05-01), pages 1008 - 1022, XP001118456 *
See also references of EP1816473A4 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014185960A3 (en) * 2013-05-14 2015-01-22 Genomics Usa, Inc. Composition and methods for entrapping a protein on a surface
US9751069B2 (en) 2013-05-14 2017-09-05 Genomics Usa, Inc. Compositions and methods for entrapping protein on a surface
US10105674B2 (en) 2013-05-14 2018-10-23 Genomics Usa, Inc. Compositions and methods for entrapping protein on a surface
US11260363B2 (en) 2013-05-14 2022-03-01 Pure Transplant Solutions L.L.C. Compositions and methods for entrapping protein on a surface
RU2682721C2 (ru) * 2016-11-17 2019-03-21 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Биологический микрочип для обнаружения опухолевых экзосом в сыворотке крови человека для диагностики колоректального рака
CN110819690A (zh) * 2019-10-24 2020-02-21 广东环凯生物科技有限公司 一种金黄色葡萄球菌免疫磁珠洗液

Also Published As

Publication number Publication date
EP1816473A1 (en) 2007-08-08
US20070172904A1 (en) 2007-07-26
WO2006062427A8 (fr) 2009-05-14
EP1816473A4 (en) 2007-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rubina et al. Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips
Cretich et al. Protein and peptide arrays: recent trends and new directions
KR101232499B1 (ko) 마이코톡신을 확인하는 장치 및 방법
CN100420947C (zh) 用单一捕获剂定量检测特异性分析物的方法及其试剂盒
JP5166240B2 (ja) 種々の系列の抗生物質の検出および特定を同時に行なうインビトロ方法およびこの方法による分析キット
US20110306511A1 (en) Methods for multiplex analyte detection and quantification
US6861251B2 (en) Translucent solid matrix assay device for microarray analysis
Nevídalová et al. Capillary electrophoresis–based immunoassay and aptamer assay: A review
JP5089511B2 (ja) 吸光物質含有コロイドシリカ粒子を用いた生体分子の検出ないしは定量方法
KR20130090892A (ko) 면역분석에서 시약의 반응성을 조절하기 위한 공동 결합
US20080003599A1 (en) Biological Microchip for Multiple Parallel Immunoassay of Compounds and Immunoassay Metods Using Said Microchip
WO2006062427A1 (fr) Procede de detection quantitative de toxines biologiques
Tsutsumi et al. Single-step sandwich immunoreaction in a square glass capillary immobilizing capture and enzyme-linked antibodies for simplified enzyme-linked immunosorbent assay
Lee et al. Gold-nanopatterned single interleukin-6 sandwich immunoassay chips with zeptomolar detection capability based on evanescent field-enhanced fluorescence imaging
Fici et al. A protein multiplex microarray substrate with high sensitivity and specificity
KR100908641B1 (ko) 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지혈액 단백질의 분석방법
RU2320994C1 (ru) Способ количественного обнаружения биологических токсинов
Yin et al. A single layer nitrocellulose substrate for fabricating protein chips
WO2006070180A1 (en) Detection of phosphoproteins
KR20200095144A (ko) 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법
US20230221309A1 (en) Method, use of the method and kit for detecting bioindicators in a sample
Liu et al. Fluorescence-encoded polystyrene microspheres for the application of suspension array technology
WO2003058249A1 (en) Method for quantitation of protein levels in biological samples
Betala et al. Rapid colorimetric detection of proteins and bacteria using silver reduction/precipitation catalyzed by gold nanoparticles
US20030224459A1 (en) Protein detection method

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006125158

Country of ref document: RU

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007172904

Country of ref document: US

Ref document number: 10589143

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004821451

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10589143

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004821451

Country of ref document: EP