WO2006048576A1 - Procede de preparation d'anticorps anti-progesterone specifiques et affins, anticorps obtenus et leur utilisation en diagnostic in vitro - Google Patents

Procede de preparation d'anticorps anti-progesterone specifiques et affins, anticorps obtenus et leur utilisation en diagnostic in vitro Download PDF

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WO2006048576A1
WO2006048576A1 PCT/FR2005/050913 FR2005050913W WO2006048576A1 WO 2006048576 A1 WO2006048576 A1 WO 2006048576A1 FR 2005050913 W FR2005050913 W FR 2005050913W WO 2006048576 A1 WO2006048576 A1 WO 2006048576A1
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antibodies
antibody
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Olivier Dubreuil
Frédéric Ducancel
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Biomerieux SA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
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Biomerieux SA
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors

Definitions

  • the present invention relates to the field of diagnosis through the assay of the human steroid hormone progesterone. More particularly, the subject of the invention is a new process for the preparation of anti-progesterone antibodies exhibiting a reduction in cross-reactions for at least one progesterone analogue chosen from C-5 ⁇ derivatives and C-5 ⁇ derivatives, as well as than their use in diagnosis.
  • oestradiol and progesterone are part of the hormonal assessment carried out in cases of infertility and the monitoring of cycles stimulated during the various protocols of medical assistance to procreation (AMP), as well as during monitoring of pregnancies.
  • This assessment is complemented by the determination of other reproductive hormones such as FSH (Follicle Stimulating Hormone) and LH (Luteinizing Hormone), in particular.
  • Progesterone is a steroid hormone synthesized from cholesterol mainly by the ovary (corpus luteum) and, to a lesser degree, by the adrenal glands, placenta and testis. Non-endocrine synthesis also exists at the level of neurons. In women, progesterone is present in the blood only during the second part of the menstrual cycle (luteal phase) or during pregnancy. During the first phase of the menstrual cycle (follicular phase), its concentration is low, of the same order as that found in humans. The essential function of this hormone is to prepare the uterus for implantation - implantation of the blastocyst - and maintenance of pregnancy.
  • progesterone associated with other hormones, estradiol, FSH and LH
  • evaluation of progesterone allows to assess the ovulation and the quality of the luteal phase.
  • progesterone associated with the measurement of the hormone hCG, Chorionic Gonadotropin can differentiate a normal pregnancy from an EGU (Extra-Uterine Pregnancy).
  • EGU Extra-Uterine Pregnancy
  • This dosage is also urgently needed for the diagnosis and monitoring of these USG and progesterone concentration is an important decision-making element in the conduct of medical or surgical treatment.
  • the determination of progesterone is also of great clinical interest for the monitoring of induced cycles (AMP).
  • AMP induced cycles
  • anti-progesterone antibodies used in these assay kits in order to reduce the cross-reactions with respect to the C-5 ⁇ and C-5 ⁇ derivatives of progesterone that the antibodies may present. anti ⁇ progesterone used.
  • Progesterone can be represented according to the following structural formula:
  • the C-5 ⁇ derivatives of progesterone comprise all the derivatives lacking a double bond between the carbon 4 and 5 and which, moreover, have an additional hydrogen atom oriented in the reverse direction of that of the two methyl groups present at the Qs positions. and Q 9 located on the ⁇ side of the steroid. These different derivatives may have various groups at the 3, 11 and 17 positions.
  • the C-5 ⁇ derivatives of progesterone include, for example, 5 ⁇ -DHP, 5 ⁇ -pregnane-3 ⁇ -hemisucinate, 5 ⁇ -pregnan-3 ⁇ -ol-20-one and 5 ⁇ -androstane-3,17-dione.
  • the C-5 ⁇ derivatives of progesterone comprise all the derivatives lacking a double bond between the carbon 4 and 5 and which also have a hydrogen atom additional oriented on the same side as the two methyl groups present at the positions Ci 8 and Ci 9 . These different derivatives may have various groups at the 3, 11 and 17 positions.
  • Examples of such C-5 ⁇ derivatives of progesterone include 5 ⁇ -DHP, aetiocholanolone, 5 ⁇ -pregnan-3 ⁇ -ol-20-one and 5 ⁇ -androstane-3,17,20-dione.
  • the C-5 ⁇ and C-5 ⁇ derivatives for which the cross reactions must be improved are in particular 5 ⁇ -DHP and 5 ⁇ -DHP.
  • the Applicant has developed a new method for the preparation of antibodies making it possible to obtain anti-progesterone antibodies exhibiting such a decrease in cross-reactions with the C-5 ⁇ and C-5 ⁇ derivatives of progesterone, while the progesterone binding affinity of these antibodies remains very satisfactory and in particular less than nanomolar.
  • This method is based on the preparation of antibodies modified to present in the 94 and 95 positions of their light variable domain (VL) certain well-defined amino acids, the position of the amino acids being given according to the Kabat numbering (Kabat EA, 1991, Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242).
  • VL light variable domain
  • the subject of the present invention is a method for preparing anti ⁇ progesterone antibodies, characterized in that it comprises the step of introducing at their VL domain level: (i) a praline or a basic amino acid at level of the amino acid 94 and
  • the subject of the invention is also the antibodies that can be obtained by the method of the invention. Finally, because these antibodies have also maintained a good affinity for progesterone, the invention also relates to their use in in vitro diagnostics.
  • Anti-progesterone antibodies within the meaning of the invention are both a whole antibody and an antibody fragment.
  • whole antibody is meant an antibody in its complete form and of recombinant or monoclonal origin.
  • the recombinant antibodies can be obtained according to standard methods known to those skilled in the art, from prokaryotic organisms, such as bacteria, or from eukaryotic organisms, such as yeasts, mammalian cells, plant cells, insects or animals, or by extracellular production systems.
  • the preparation of these recombinant antibodies will be such that the nucleic acid sequence used to prepare the antibody will comprise the codons of the amino acids referred to in positions 94 and 95.
  • the monoclonal antibodies may be prepared according to standard techniques known to those skilled in the art such as the technique of hybridomas whose general principle is recalled below.
  • an animal usually a mouse (or cells cultured in the context of in vitro immunizations) is immunized with a target antigen of interest, whose B lymphocytes are then capable of producing antibodies against the said antigen. antigen.
  • lymphocytes are then fused with "immortal" myeloma cells (murine in the example) to give rise to hybridomas.
  • the cells capable of producing a particular antibody and of multiplying indefinitely are then selected.
  • Each hybridoma is multiplied in the clone form, each leading to the production of a monoclonal antibody whose recognition properties with respect to the antigen of interest can be tested, for example by ELISA, by immunoblotting in one or two-dimensional, in immunofluorescence, or with a biosensor.
  • the monoclonal antibodies thus selected are subsequently purified, in particular according to the affinity chromatography technique.
  • the process of the invention can be carried out by subjecting these anti-progesterone monoclonal antibodies to directed mutagenesis, for example by using commercial kits such as the Quick Change Site Kit. Directed Mutagenesis from Stratagene, and to all another method known to those skilled in the art for modifying amino acids in a peptide chain.
  • antibody fragment is meant in the present application any antibody fragment exhibiting a decrease in cross-reactions for the C-5 ⁇ derivatives of progesterone and / or C-5 ⁇ derivatives of progesterone, and being affine for the progesterone.
  • these antibody fragments have a progesterone binding affinity of less than nanomolar.
  • antibody fragments may for example be obtained by proteolysis.
  • they can be obtained by enzymatic digestion, resulting in Fab-type fragments (papain treatment, Porter RR, 1959, Biochem J., 73: 119-126) or F (ab) ' 2 type (treatment pepsin, Nisonoff A. et al., 1960, Science, 132: 1770-1771).
  • F (ab) ' 2 type treatment pepsin, Nisonoff A. et al., 1960, Science, 132: 1770-1771.
  • They can also be prepared recombinantly (Skerra A., 1993, Curr Opin Immunol., 5: 256-262).
  • Another antibody fragment which is suitable for the purposes of the invention comprises a fragment Fv which is a dimer consisting of the non-covalent association of the light variable domain (VL) and the heavy variable domain (VH) of the Fab fragment, therefore of the association of two polypeptide chains.
  • VL light variable domain
  • VH heavy variable domain
  • Obtaining this type of Fv fragment is relatively difficult by enzymatic treatment and in general recombinant production methods are preferred by those skilled in the art.
  • this Fv fragment can be modified by genetic engineering by inserting a suitable peptide link between the VL domain and the VH domain (Huston P. et al., 1988 Proc Natl.Acad Sci.USA 85: 5879-5883).
  • fragment scFv single chain Fragment variable
  • the use of a peptide bond preferably composed of 15 to 25 amino acids makes it possible to connect the C-terminal end of one domain to the N-terminus of the other domain, thus constituting a monomeric molecule with properties similar to those of the antibody in its complete form.
  • the two orientations of the VL and VH domains are suitable (VL-link-VH and VH-link-VL) because they have identical functional properties.
  • the antibodies prepared according to the process of the invention which exhibit a decrease in cross-reactions for the C-5 ⁇ and C-5 ⁇ derivatives of progesterone, thus have at their VL domain the following amino acids: a proline or an acid basic amine at position 94 and an amino acid other than a proline at position 95, the position of the amino acids being given according to the Kabat numbering.
  • amino acids are classified into 4 families, namely (1) acidic amino acids such as aspartate and glutamate, (2) basic amino acids such as lysine, arginine and histidine (3) nonpolar amino acids such as alanine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine and tryptophan and (4) polar uncharged amino acids such as asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine and tyrosine. Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are sometimes classified as aromatic amino acids.
  • amino acid at position 94 which is particularly suitable for the purposes of the invention is chosen from lysine, arginine and proline, the latter amino acid being particularly preferred.
  • the amino acid at position 94 is a proline, an arginine or a lysine, preferably a proline.
  • the amino acid at position 95 on the VL domain of the antibodies of the invention should be different from proline.
  • the amino acid at position 95 is not an acidic amino acid and is selected from basic amino acids, nonpolar amino acids and polar uncharged amino acids.
  • the amino acids at position 95 which are particularly suitable for the purposes of the invention are chosen from arginine, histidine, leucine and tyrosine, which constitutes a particular embodiment of the invention.
  • the antibodies may also have particular amino acids at positions 58, 31 and 32 at the VH domain.
  • the method of the invention is such that it comprises at least one of the following steps: a step of introducing at their VH domain a lysine in position
  • anti-progesterone antibodies obtained by the method of the invention are novel in that they exhibit the affinity and cross-reactivity characteristics never obtained by anti-progesterone antibodies, as follows:
  • an affinity for progesterone preferably less than nanomolar, and a decrease in cross-reactions for the C-5 OC and C-5 ⁇ derivatives.
  • Another subject of the invention relates to the anti-progesterone antibodies obtainable by the method of the invention.
  • the affinity for progesterone of the anti-progesterone antibodies of the invention is determined according to the method described by Nieba et al., 1996, Anal. Biochem., 234: 155-165.
  • Reducing the ⁇ ogos reactions for the C-5 ⁇ and C-5 ⁇ derivatives of the anti-progesterone antibodies means a decrease in their capacity to bind to either the C-5 ⁇ or C-5 ⁇ derivatives, or both, which improves their specificity.
  • the decrease in the ability to bind C-5 ⁇ derivatives and / or C-5 ⁇ derivatives can be demonstrated in different ways.
  • P [IC 50 of progesterone / IC 50 of the compound C-5 ⁇ or C-5 ⁇ progesterone] ⁇ 100, provided that the concentration at 50% inhibition (ICs 0) is determined by competition assays and corresponds to the competitor concentration (progesterone or C-5 ⁇ derivative or C-5 ⁇ derivative) resulting in a signal decrease of 50% compared to the control performed in the absence of a competitor (100% of signal is then obtained).
  • the anti-progesterone antibodies of the invention have, in addition to a high affinity as defined above, at least one of the following characteristics: at most 10%, preferably at most 4% and preferably still at most 2%, cross reaction for the C-5 ⁇ derivatives of progesterone and at most 23%, preferably at most 15%, preferably at most 10%, and more preferably at most 4% cross reaction for G5 ⁇ derivatives of progesterone.
  • the calculation of the percentage of cross-reactions and the threshold is, of course, a function of the protocol used.
  • the decrease in the ability to bind to C- ⁇ derivatives and / or C-5 ⁇ derivatives can also be demonstrated by determining a reduction factor using a known anti-progesterone antibody as a reference. The determination of this factor is then a function of the reference antibody and is independent of the determination protocol used.
  • the Anti-progesterone antibodies of the invention have, in addition to a high affinity as defined above, at least one of the following characteristics:
  • the antibodies of the invention can be used in all applications where the specific and affine binding between an anti-progesterone antibody and progesterone is an important feature.
  • the antibodies of the invention are particularly suitable for the in vitro diagnosis of progesterone levels in a biological sample that may contain progesterone.
  • the subject of the invention is also the use of the anti-progesterone antibodies of the invention for the in vitro diagnosis of the level of progesterone in a biological sample which may contain progesterone.
  • biological sample a biological sample of human or animal origin likely to contain progesterone such as a sample of blood, plasma or serum.
  • progesterone level using the antibodies or antibody fragments of the invention can be carried out by the method for determining the level of progesterone in a biological sample that may contain progesterone according to the steps of :
  • the first step of the process is a step conventionally known to those skilled in the art.
  • the second step of the method of the invention which consists in revealing the binding between said antibody or antibody fragment of the invention, can be carried out by any known detection means in the field of immunological assays of very small molecules, such as that direct detection, that is to say without the intermediary of binding partner (s), and indirect detection, that is to say via partner (s) link.
  • Direct detection of the binding between the antibody or antibody fragment of the invention and progesterone can be carried out for example by surface plasmon resonance or by cyclic voltammetry on an electrode carrying a conductive polymer.
  • the antibody of the invention serves to immunocapture progesterone, the immunocaptured progesterone being then eluted.
  • the elution of the immunocaptured progesterone by said antibody or antibody fragment of the invention may be carried out by any elution method known to those skilled in the art, such as a pH shock.
  • the second step of the process of the invention may be carried out according to the standard competitive ELISA technique.
  • the antibody of the invention then serves as a binding partner for the capture of progesterone in the sample.
  • the detection can then be implemented by competition between the progesterone likely to be contained in the test sample and a known amount of progesterone previously labeled.
  • the anti-progesterone antibody of the invention may be previously bound to a solid support, which constitutes a particular embodiment of the invention.
  • Marking means the fixing of a marker capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • markers consists of:
  • Enzymes that produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholine esterase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • Chromophores such as luminescent compounds, dyes, • radioactive molecules such as 32 P, 35 S or 125 I,
  • Fluorescent molecules such as fluorescein, rhodomine, alexa or phycocyanins, and
  • ligand / anti-ligand pairs are well known to those skilled in the art, and there may be mentioned for example the following pairs: biotin / streptavidin, biotin / avidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin polynucleotide / polynucleotide complement. In this case, it is the ligand that is bound to the binding partner.
  • the anti-ligand can be detectable directly by the markers described in the preceding paragraph or be itself detectable by a ligand / antiligand.
  • the last step of the method of the invention which consists in determining the level of progesterone, can be implemented by any method known to those skilled in the art for this purpose.
  • the solid supports to which an antibody of an invention is linked are novel and constitute another subject of the invention.
  • the solid supports on which the antibodies of the invention are bound may be any support to which proteins may be attached.
  • a capture support mention may be made of microwells, microplates, polymeric supports, membranes, microscopy slides, functionalized or non-functionalized inorganic supports, such as silica, glass, mica or quartz, metal supports such as gold and silver, and particles and microparticles, especially magnetic ones.
  • binding of the antibody of the invention to the solid support is meant an adsorption bond or a covalent bond. Such bonds are widely known to those skilled in the art.
  • the deposition of the antibodies of the invention can also be carried out manually using glass capillaries whose internal diameter is around one hundred microns. In this case, the capillary must come into contact with the deposition surface for deposition to occur, resulting in a slight impact with the deposition surface.
  • the solid support may be functionalized by a function capable of forming a bond with a function carried by the capture partner.
  • the solid support is functionalized by an NHS (N-hydroxysuccinimide) bond or by an NH 2 function. This function can react with a function carried on the capture partner, such as an NH 2 or COOH function.
  • FIG. 1 gives the schematic of the steps for preparing antibody fragments of the invention of the scFv type consisting of VL-link-VH, the numbers 1 to 6 corresponding to the different oligonucleotides used and the asterisks corresponding to the mutated positions and
  • FIG. 2 gives two graphs representing the percentage of cross reactions P with respect to the 5 ⁇ -DHP derivative (FIG. 2A) or to the 5 ⁇ -DHP derivative (FIG. 2B) obtained with a fragment of the invention having a proline at position 94, a histidine at position 95 and an arginine at position 58 (called P94-H95-R58) and with a scFv fragment of monoclonal antibody 15G12C12G11 not mutated according to the process of the invention (called Sauvage) depending on the dose of competitor used, this competitor can be either progesterone, derivative 5 ⁇ -DHP or derivative 5 ⁇ -DHP.
  • Example 1 Preparation of Antibodies of the Invention
  • the anti-progesterone antibodies of the invention were obtained by constructing a library of a set of phage-antibody variants.
  • the amino acid sequences for the VL and VH domain are given in the sequence listing respectively in SEQ ID N 0 I and SEQ ID No. 2.
  • the antibody fragments of the invention were obtained according to a particular method of production.
  • a library of DNA mutants encoding the anti-progesterone single chain frag fragment (scFv) fragment was constructed via three PCR amplifications.
  • the DNA template used corresponds to the wild-type sequence of the scFv-type anti-progesterone antibody fragment obtained from the 15G12C12G11 antibody and modified to be incorporated into the pAKIOO phagemid according to the method of Krebber A, et al. (1997, J. Immunol Methods, 201: 35-55).
  • the main steps necessary for the construction of the library are shown in FIG.
  • the asterisks correspond to the mutated positions
  • the L94-L95 annotation signifies the positions of the amino acids 94 and 95 on the light chain
  • the annotation H58 means the position of the amino acid mutated at position 58 of the heavy chain
  • the indication Sf iL corresponds to the cleavage sites by the enzyme of SfK restriction.
  • PCR amplifications were carried out using oligonucleotides 1 to 6, some of which exhibited, inter alia, the mutated positions relating to the invention: positions 94 and 95 on the VL and position 58 on the VH. At these positions in particular, all twenty natural amino acids have been introduced by saturation mutagenesis (Barbas CF, et al., 2001, Phage Display A Laboratory Manual, CSHL Press). Oligonucleotides were constructed to have an overlapping end to ultimately reconstitute the complete DNA encoding mutants of scFv-like antibody fragments. The oligonucleotides are shown in Table I, their location with respect to the sequence of the antibody fragment being shown in Figure 1.
  • N A, G, T, C
  • the mixtures were incubated in an Applied Biosystems Gene Amp PCR System 2700 thermocycler, according to the following program: (95 ° C., 5 min) - [(95 ° C., 1 min); (50 ° C., 1 min); (72 ° C., 1 min)] x 30 min (72 ° C., 10 min).
  • reaction media were then mixed at 0.7 pmol each and 10 elongation cycles without oligonucleotide were performed under the same conditions as previously mentioned. At the end of these 10 cycles, l / 50th of the reaction was used for the final amplification stage through the use of Lac2 and Nter glllp2 oligonucleotides in the same conditions as previously mentioned.
  • the reaction mixture was then subjected to enzymatic digestion with 10 units of the endonuclease SfH (biolabs) under appropriate conditions for 4 hours at 50 ° C.
  • the phagemid pAKIOO was also digested under the same conditions.
  • the DNA fragments obtained after cleavage (the phagemid and the amplified fragments) were inserted into the phagemid pAKIOO using 400 units of T4 Ligase (Roche) .
  • the ligation products (at a rate of 110 ng) were electroporated in XLl-Blue bacteria using an electroporator (E. coli to draw,
  • the production of the phage antibodies constituting the library was carried out in Erlenmeyer. For this, 50 ml of 2YT medium (Difco), 25 ⁇ g / ml chloramphenicol (Sigma), 1% glucose (Prolabo) were combined with 10 9 XL1-Blue bacteria from the library and then cultured at 37 ° C. with stirring until a 550 nm OD of 0.5-0.6. Auxiliary phages (10 11 pfu, plate-forming unit, M13KO17, Biorad) and 0.5 mM IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside, Sigma) were then added.
  • the overnight culture was centrifuged at 10750 g at 40 ° C for 40 min.
  • the supernatants containing the phage-antibodies were recovered, 30 ml of PEG / NaCl (PEG for polyethylene glycol) (Prolabo 200 g / l, Sigma 146 g / l, respectively) were added and this solution was incubated for 2 hours. at 4 0 C (precipitation of phages).
  • the phage-antibody pellet was taken up in 15 ml of PBS pH 7.4 (Phosphate Buffer Saline, Eurobio) and 3 ml of PEG / NaCl.
  • the selection principle used is derived from that originally described by Hawkins RE, et al. (1992, J. Mol Biol., 234, 958-964). This is a solution selection system based on the use of streptavidin-coated magnetic beads to specifically fix, in our case, a biotinylated derivative of progesterone. Using this system, a competitive screening method called the subtractive method (Saviranta P, et al., 1998, Protein Eng., 11: 143-152), made it possible to isolate within the bank, the antibody fragments of the invention having the particular amino acids at positions 94 and 95 on the VL domain (and 58 on the VH domain) and having decreased cross-reactions for 5 ⁇ -DHP and 5 ⁇ -DHP.
  • streptavidin magnetic beads 600 ⁇ l, Streptavidin Magnesphere Paramagnetic particles, Promega
  • streptavidin Magnesphere Paramagnetic particles 1 ml
  • PBS / skimmed milk 2% 1 ml
  • 1 ml of the phage solution diluted 10 phage
  • was added to 1 ml of the progesterone-11 ⁇ -EMC-ODN-biotin solution bioMérieux, 5 nM
  • EMC Ethoxy-Methyl-carboxylate
  • the non-biotinylated 5 ⁇ and 5 ⁇ -dihydroprogesterone analogs at 5 ⁇ M were added to the progesterone-11 ⁇ -EMC-ODN-biotin solution.
  • These different phage and antigen solutions were prepared in PBS - 0.1% Tween (Sigma) - 4% skimmed milk. After 1 hour incubation with gentle stirring and at room temperature, this mixture was contacted for 15 minutes with the streptavidin magnetic beads previously saturated. Using a magnetic rack, the beads were then separated from the supernatant containing unbound antibody phages. Ten washings of 3 ml were carried out: five washes in PBS-0.05% Tween-1% skimmed milk and then five washes in PBS. The beads were finally recovered in 1 ml of PBS.
  • the solution containing the phages-antibodies bound to the biotinylated progesterone was used directly to infect XL1-Blue bacteria in the exponential growth phase. These infected bacteria were then spread on 24.5x24.5 cm 2 boxes. After incubation overnight at 37 ° C., the clones were recovered in 2YT medium, chloramphenicol 25 ⁇ g / ml, glucose 1% and subjected to a new round of selection. In the end, five successive selection rounds made it possible to isolate the antibody fragments of the invention.
  • the antibody fragments of the invention may also have mutations at positions 31 and 32 of the VH domain at their VH domain and advantageously a 31-position lysine and a 32 position histidine. These mutations have been introduced at using the Quick Change Site Directed Mutagenesis (Stratagene) site-directed mutagenesis method using the oligonucleotides shown in the table and following the recommendations of the supplier. Table m
  • the antibody fragments of the invention can be recombinantly produced in E. coli bacteria and characterized by competitive ELISA assays in a form anchored to the bacteriophage M13 surface.
  • the phagemid pAKIOO containing the DNA sequences coding for the antibody fragments of the invention makes it possible to express the said fragments of the scFv type fused to the minor capsid protein pIH and thus to expose them on the surface of the phages (bacteriophage M13 ).
  • the supernatants containing the phage particles were recovered and 515 ⁇ l of 15% glycerol were added.
  • Example 2 Characterization of the antibody fragments of the invention exposed on the surface of phages.
  • the supernatants obtained in the previous step containing the phages were tested as follows: 50 ⁇ l of these supernatants to which were added increasing concentrations of competitor (progesterone and analogues, and in particular 5 ⁇ - and 5 ⁇ -DHP) were incubated on the microplate for 1 hour at 37 ° C. After this incubation step, followed by three washes (in PBS-Tween 0.1%), 200 ⁇ l per well of a biotinylated anti-phage antibody M13 were added (Anti-fd Bacteriophage-Biotin Conjugate, Sigma, diluted 1/2000 in PBS-Tween 0.1%), then the plates were incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • competitor progesterone and analogues, and in particular 5 ⁇ - and 5 ⁇ -DHP
  • streptavidin-HRP conjugate 200 ⁇ l per well of the streptavidin-HRP conjugate were added (Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate, Amersham, diluted 1/2000 in PBS-0.1% Tween). After incubation for one hour at 37 ° C. followed by three washes, the revelation was carried out with 100 ⁇ l of ABTS solution (2,2'azino bis (3-ethylbenzathiazoline 6-sulphonate), Sigma) prepared at 0 ° C. 55 mg / ml 0.1 M sodium acetate pH 4.3, PiO 2 0.01%. The plates were read at 410 nm on an ASYS Hitech Expert 86 plate reader.
  • P [IC50 of the progesterone / ICso of the derivative C-5 ⁇ or C-5 ⁇ ] x 100.
  • the percentages P of the antibody fragments of the invention were compared with the percentages P of the wild-type antibody fragment (derived from the initial murine monoclonal antibody 15G12C12G11) produced according to the same format.
  • FIG. 2 shows two graphs representing the percentage of cross-reactions P with respect to the 5 ⁇ -DHP derivative (FIG. 2A) or to the 5 ⁇ -DHP derivative (FIG. 2B).
  • a fragment of the invention having a praline at position 94, a histidine at position 95 (VL) and an arginine at position 58 (VH) (designated P94-H95-R58) as prepared in Example 1 above and with a scFv fragment of the antibody monoclonal 15G12C12G11 not mutated according to the method of the invention (called Sauvage), depending on the dose of competitor used, this competitor can be either progesterone, derivative 5 ⁇ -DHP or derivative 5 ⁇ -DHP.
  • Table IV below gives the results obtained for several antibody fragments of the invention having improved binding specificity (decrease of cross-reactions for C-5 ⁇ and C-5 ⁇ derivatives) compared with wild (scFv fragment). of the initial monoclonal antibody), the affinity for progesterone being comparable to that of wild (the latter being appreciated by considering the variation of IC 5 O for progesterone: IC 5 O progesterone for the antibody fragment of the (mutated) / IC 5 O progesterone of the wild-type antibody fragment).
  • the fragments of the invention are indicated with the particular amino acids mutated at positions 94 and 95 on the VL domain, and where appropriate positions 58, 31 and / or 32 on the VH domain.
  • the improvement factor is calculated as follows (P of the derivative C-5 ⁇ or C-5 ⁇ for the wild / P of the derivative C-5 ⁇ or C-5 ⁇ for the fragment of the invention).
  • Allopregnanolone and pregnanolone are two analogues of progesterone. They can be found in sera at significant concentrations. Allopregnanolone is a C-5 ⁇ derivative while pregnanolone is a C-5 ⁇ derivative. These two compounds are distinguished from progesterone by the presence of a hydroxyl group at the 3-position instead of a keto group.
  • Example 3 Determination of the binding affinity for progesterone and for the analogs of the antibodies or antibody fragments of the invention. 1. Recombinant production of the antibody fragments of the invention (or wild type) in fusion to a peptide sequence of six histidines.
  • the antibody fragments prepared according to the method of the invention may be produced recombinantly, in a form fused to a sequence composed of six histidine amino acids (ScFv-HiS 6 ). These particular antibody fragments are produced in the periplasm of E. coli using an expression vector derived from pLIP6GN (Muller BH, et al., 1999, J. Immunol Methods., 257: 177-185).
  • An overnight preculture at 37 ° C. with shaking was carried out by seeding 3 ml of LB medium (Difco), Chloramphenicol 25 ⁇ g / ml, with a colony of W3110 bacteria transformed with the expression vector.
  • 50 ml of medium LB (Difco), Chloramphenicol 25 ⁇ g / ml were inoculated with 1 ml of the overnight culture and incubated at 37 ° C. with stirring.
  • the OD 50 nm reached a value of 0.5-0.6
  • the induction was carried out for 4 hours at 30 ° C. with stirring after addition of 0.5 mM IPTG.
  • the culture was centrifuged at 3500 g for 15 min at 40 ° C. After removal of the supernatant, the cell pellets were taken up in 1/10 of the volume of the initial culture in TS ⁇ ( 300 mM Tris-HCl, pH 8, Sigma, 20% Sucrose, Fisher Scientific, 1 mM ⁇ DTA, Sigma), then lysozyme at 100 ⁇ g / ml (Sigma), and a mixture of anti-proteases ⁇ Complete, Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche) have been added. The solution was placed at 40 ° C. with gentle stirring for 20 min, then centrifuged for 30 min at 16000 g and at 40 ° C. The supernatants corresponding to the extracts periplasmic were kept at -2O 0 C.
  • the nickel ion column (flIS-Select TM, Sigma) was previously washed with distilled water and equilibrated with dialysis buffer. After passage of the sample on the column, it was washed with at least 30 ml of 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.9, 250 mM NaCl, 30 mM Imidazole. Elution was performed with 5 ml of 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.9, 250 mM NaCl, 500 mM imidazole. The column was then regenerated with dialysis buffer and then stored at 40 ° C. in a dialysis buffer / 30% ethanol mixture.
  • the eluate containing the scFv-His6 was concentrated five times in 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.8 using Vivaspin systems (MWCO 10000, Vivascience), then the solutions containing the scFv-Hiso were stored at 40 ° C. vs.
  • the apparent K D dissociation constants were determined using the surface plasmon resonance method using the BIAcore 3000 biosensor optical (BIAcore) apparatus.
  • Biosensors metal supports coated with a fine gold particle
  • carboxymethyl type CM5 pre-adsorbed with streptavidin (BIAcore) were used to immobilize biotinylated derivatives of progesterone, 5 (X-DHP and 5 ⁇ -D).
  • DHP 200 RU
  • the (mutated) antibody fragments from the preparation method of the invention and the wild-type antibody fragment were diluted at different concentrations (0.5 nM to 25 nM) in HEPES buffer 10 mM pH 7.4 (Sigma), 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA (Merck), 0.05% surfactant (BIAcore). These mixtures were injected onto the biosensors at a constant flow of 60 ⁇ l / min at 25 ° C.
  • the monoclonal antibody 10H3C2D4 (bioMérieux, Marcy, France), whose amino acid sequences for the VL and VH domain are given in the sequence listing respectively in SEQ ID No. 12 and SEQ ID No. 13, was used.
  • the DNA sequences encoding the variable domains were cloned as shown in Example 1.
  • mutants were prepared by site-directed mutagenesis using, as template DNA, the pAKIOO phagemid in which the DNA encoding the scFv of the 10H3C2D4 antibody was cloned, in the presence of the oligonucleotide primers as described in the following Table VII:
  • mutant P94-H95-R58 * was obtained in two steps, from the wild-type pAK100 / scFvi0H3C3D4 matrix and P94H95-COD and P94H95- comp mutagenesis primers to give the pAK100 / scFv10H3C3D4 / P L94 H L95 matrix , which itself was treated with R58-COD and R58-comp mutagenesis primers.
  • the P94-H95-R58-K31-H32 * mutant was obtained from the pAK100 / scFv10H3C3D4 / P L94 H95 H58 matrix and K31H32-COD and K31H32-comp mutagenesis primers.
  • the mutant P94-H95-R58-K31-H32-K27 6 * was obtained from the matrix pAK100 / scFv 0H3C3D4 1 / P L94 L95 H R K + H58 H31 H H32 and mutagenesis primers COD K27- and K27 -comp.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'anticorps anti- progestérone, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VL : (iii) une proline ou un acide aminé basique au niveau de l'acide aminé 94 et (iv) un acide aminé différent d'une proline au niveau de l'acide aminé 95. Elle concerne également les anticorps susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention, ainsi que leur utilisation pour la détermination du taux de progestérone dans un échantillon biologique susceptible de contenir de la progestérone.

Description

Procédé de préparation d'anticorps anti-progestérone spécifiques et affîns, anticorps obtenus et leur utilisation en diagnostic in vitro
La présente invention concerne le domaine du diagnostic à travers le dosage de l'hormone stéroïde humaine progestérone. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un nouveau procédé de préparation d'anticorps anti- progestérone présentant une diminution des réactions croisées pour au moins un analogue de la progestérone choisi parmi les dérivés C- 5 α et les dérivés C-5β, ainsi que leur utilisation en diagnostic.
La détermination des taux d'hormones stéroïdes humaines est une préoccupation quotidienne en biologie clinique. Ainsi le diagnostic in vitro et le suivi des manifestations cliniques liées à la modification et/ou au dysfonctionnement du métabolisme des hormones stéroïdes nécessitent le développement de dosages immunologiques performants.
Parmi ces hormones stéroïdes, l'œstradiol et la progestérone font partie du bilan hormonal effectué dans les cas d'infertilité et le suivi des cycles stimulés au cours des différents protocoles d'assistance médicale à la procréation (AMP), ainsi que lors du suivi de grossesses. Ce bilan est complété par le dosage d'autres hormones de la reproduction comme la FSH (Hormone Folliculo- Stimulante) et la LH (Hormone Luténeisante), notamment.
La progestérone est une hormone stéroïde synthétisée à partir du cholestérol essentiellement par l'ovaire (corps jaune) et, à moindre degré, par les glandes surrénales, le placenta et le testicule. Une synthèse non endocrine existe également au niveau des neurones. Chez la femme, la progestérone n'est présente dans le sang que pendant la deuxième partie du cycle menstruel (phase lutéale) ou lors de la grossesse. Pendant la première phase du cycle menstruel (phase folliculaire), sa concentration est faible, du même ordre que celle que l'on trouve chez l'homme. La fonction essentielle de cette hormone est de préparer l'utérus à la nidation - implantation du blastocyte - et le maintien de la gestation. Ainsi, dans les cas d'hypofertilité ou d'avortements à répétition, l'évaluation de la progestéronémie (associée aux dosages des autres hormones, œstradiol, FSH et LH) permet d'apprécier l'ovulation et la qualité de la phase lutéale. Par ailleurs, lors du suivi des grossesses, la détermination de la progestéronémie (associée au dosage de l'hormone hCG, Gonadotrophine Chorionique humaine) permet de différencier une grossesse normale d'une GEU (Grossesse Extra- Uterine). Ce dosage est d'ailleurs demandé en urgence pour le diagnostic et la surveillance de ces GEU et la concentration en progestérone est un élément décisionnel important dans la conduite d'un traitement médical ou chirurgical. Outre son importance pour le suivi de l'évolution des grossesses, le dosage de la progestérone présente également un intérêt clinique important pour le suivi des cycles induits (AMP). Ainsi, en vue d'une fécondation in vitro, la progestéronémie en fin de phase folliculaire permet de prévoir d'éventuels échecs d'implantation. En effet, les élévations prématurées des concentrations plasmatiques en progestérone à ce stade du cycle sont systématiquement associées à une diminution des taux de grossesse.
Le développement de dosages immunologiques des hormones stéroïdes présentent des difficultés liées aux caractéristiques physico- chimiques particulières de ces molécules. En effet, en raison de leur faible poids moléculaire, elles ne sont pas directement immunogènes. L'obtention d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux nécessite donc le couplage à des protéines porteuses de haut poids moléculaires (Sérum Albumine de bœuf ou BSA, thyroglobuline ou hémocyanine). De plus, dans certains cas, les anticorps obtenus peuvent présenter une affinité plus importante pour le stéroïde couplé chimiquement qαe pour le stéroïde naturel non couplé (effet "bras", Monnet C, et al., 2002, J. Mol. Biol., 315 : 699- 712). Par ailleurs, la faible variabilité des structures chimiques adoptées par les différentes hormones d'une même famille, sont responsables des difficultés rencontrées pour obtenir des anticorps très spécifiques d'un composé en particulier.
Des études comparatives concernant la validité des dosages immunochimiques de la progestérone dans le sang ont été réalisées en comparant les performances des douze trousses de dosage de la progestérone commercialisées en France qui utilisent chacune des anticorps anti-progestérone différents (Patricot MC, et al., 1998, Annales de Biologie Clinique, 57(2) : 201-210 et Boudou P, et al., 2001, Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 78 : 97- 104). Plusieurs paramètres analytiques ont été évalués : la limite de détection, la précision et l'exactitude des mesures, et les valeurs obtenues ont été comparées à celles obtenues avec une méthode de référence, la CPG-SM (Chromatographie en Phase Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse). Les conclusions de ces études sont équivoques, à savoir que les différentes méthodes utilisées dans ces trousses de dosage, comprenant des anticorps polyclonaux ou monoclonaux différents, présentent des limites de détection et une précision acceptables, mais qu'une dispersion des résultats est observée en fonction des trousses et des méthodes de dosage. De plus, toutes ces stratégies de dosage immunologique présentent, de façon plus ou moins prononcée, des problèmes d'exactitude par rapport à la CPG-SM. Selon les auteurs, cette discordance serait principalement due à la présence dans le sang de composés structuralement similaires à la progestérone et notamment deux métabolites de la progestérone : la 5α- et la 5β-prégnane-3,20-dione (appelée également 5α- et la 5β-dihydroprogestérone et nommées par la suite 5α et 5β-DHP). Ainsi, des efforts doivent être entrepris pour améliorer la spécificité des anticorps anti-progestérone utilisés dans ces trousses de dosages afin de diminuer les réactions croisées vis-à-vis des dérivés C-5α et C-5β de la progestérone que peuvent présenter les anticorps anti¬ progestérone utilisés.
La progestérone peut être représentée selon la formule développée suivante :
Figure imgf000004_0001
Les dérivés C-5α de la progestérone comprennent l'ensemble des dérivés dépourvus de double liaison entre les carbone 4 et 5 et qui présentent par ailleurs un atome d'hydrogène supplémentaire orienté dans la direction inverse de celle des deux groupements méthyle présents aux positions Qs et Q9 situés sur la face β du stéroïde. Ces différents dérivés peuvent présenter divers groupements aux positions 3, 11 et 17.
Les dérivés C-5α de la progestérone comprennent par exemple la 5α-DHP, le 5α- prégnane-3β-hémisucinate, la 5α-prégnane-3α-ol-20-one et la 5α-androstane-3,17- dione.
Les dérivés C- 5 β de la progestérone comprennent l'ensemble des dérivés dépourvus de double liaison entre les carbone 4 et 5 et qui présentent par ailleurs un atome d'hydrogène supplémentaire orienté du même côté que les deux groupements méthyle présents aux positions Ci8 et Ci9. Ces différents dérivés peuvent présenter divers groupements aux positions 3, 11 et 17.
Des exemples de tels dérivés C- 5 β de la progestérone comprennent k 5β-DHP, l'aetiocholanolone, la 5β-prégnane-3α-ol-20-one et la 5β-androstane-3,1720-dione.
Les dérivés C-5α et C-5β pour lesquels les réactions croisées doivent être améliorées sont en particulier la 5α-DHP et la 5β-DHP.
De façon surprenante, la Demanderesse a mis au point un nouveau procédé de préparation d'anticorps permettant d'obtenir des anticorps anti- progestérone présentant une telle diminution des réactions croisées avec les dérivés C-5α et C-5β de la progestérone, tandis que l'affinité de liaison à la progestérone de ces anticorps reste très satisfaisante et notamment inférieure au nanomolaire.
Ce procédé repose sur la préparation d'anticorps modifiés pour présenter en positions 94 et 95 de leur domaine variable léger (VL) certains acides aminés bien déterminés, la position des acides aminés étant donnée selon la numérotation Kabat (Kabat EA, 1991, Séquences of proteins of immunological interest, NIH publication n°91-3242).
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'anticorps anti¬ progestérone, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VL : (i) une praline ou un acide aminé basique au niveau de l'acide aminé 94 et
(ii) un acide aminé différent d'une praline au niveau de l'acide aminé 95.
Comme les anticorps ainsi obtenus présentent des propriétés jamais obtenues avec d'autres anticorps anti- progestérone, l'invention a également pour objet les anticorps susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention. Enfin, du fait que ces anticorps ont également conservé une bonne affinité pour la progestérone, l'invention concerne également leur utilisation en diagnostic in vitro.
Par anticorps anti-progestérone au sens de l'invention, on entend tant un anticorps entier qu'un fragment d'anticorps. Par anticorps entier, on entend un anticorps sous sa forme complète et d'origine recombinante ou monoclonale.
Les anticorps recombinants peuvent être obtenus selon des procédés classiques connus de l'homme du métier, à partir d'organismes procaryotes, tels que bactéries, ou à partir d'organismes eucaryotes, tels que levures, cellules de mammifères, de plantes, d'insectes ou d'animaux, ou par des systèmes de production extra- cellulaire.
La préparation de ces anticorps recombinants sera telle que la séquence nucléique utilisée pour préparer l'anticorps comprendra les codons des acides aminés visés en positions 94 et 95. Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés selon les techniques classiques connues de l'homme du métier telles que la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci- après.
Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro) avec un antigène cible d'intérêt, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène.
Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de l'antigène d'intérêt pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité.
Pour obtenir les acides aminés appropriés aux positions 94 et 95, le procédé de l'invention peut être mis en œuvre en soumettant ces anticorps monoclonaux anti¬ progestérone à une mutagénèse dirigé, par exemple en utilisant des kits commerciaux tels que le kit Quick Change Site Directed Mutagenesis de la société Stratagene, ainsi qu'à tout autre procédé connu de l'homme du métier permettant de modifier des acides aminés dans une chaîne peptidique.
Par fragment d'anticorps, on entend dans la présente demande tout fragment d'anticorps présentant une diminution des réactions croisées pour les dérivés C-5α de la progestérone et/ou les dérivés C- 5 β de la progestérone, et étant affins pour la progestérone.
De préférence, ces fragments d'anticorps présentent une affinité de liaison à la progestérone inférieure au nanomolaire.
Ces fragments d'anticorps peuvent par exemple être obtenus par protéolyse. Ainsi, ils peuvent être obtenus par digestion enzymatique, résultant en des fragments de type Fab (traitement à la papaïne ; Porter RR, 1959, Biochem. J., 73 : 119-126) ou de type F(ab)'2 (traitement à la pepsine ; Nisonoff A. et al., 1960, Science, 132 : 1770-1771). Ils peuvent également être préparés par voie recombinante (Skerra A., 1993, Curr. Opin. Immunol., 5 : 256-262).
Un autre fragment d'anticorps qui convient aux fins de l'invention comprend un fragment Fv qui est un dimère constitué de l'association non covalente du domaine variable léger (VL) et du domaine variable lourd (VH) du fragment Fab, donc de l'association de deux chaînes polypeptidiques. L'obtention de ce type de fragment Fv est relativement difficile par traitement enzymatique et en général les méthodes de production par voie recombinante sont préférées par l'homme du métier. Afin d'améliorer la stabilité du fragment Fv due à la dissociation des deux chaînes polypeptidiques, ce fragment Fv peut être modifié par génie génétique en insérant un lien peptidique adapté entre le domaine VL et le domaine VH (Huston P. et al., 1988, Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 85 : 5879-5883). On parle alors de fragment scFv (« single chain Fragment variable ») car il est constitué d'une seule chaîne polypeptidique. L'utilisation d'un lien peptidique composé préférentiellement de 15 à 25 acides aminés permet de relier l'extrémité C-terminale d'un domaine à l'extrémité N-terminale de l'autre domaine, constituant ainsi une molécule monomérique dotée de propriétés de liaison similaires à celles de l'anticorps sous sa forme complète. Les deux orientations des domaines VL et VH conviennent (VL- lien- VH et VH- lien- VL) car elles présentent des propriétés fonctionnelles identiques.
Bien entendu, tout fragment connu de l'homme du métier et présentant les caractéristiques de réactions croisées et d'affinité telles que définies ci- dessus conviennent aux fins de l'invention.
Les anticorps préparés selon le procédé de l'invention, lesquels présentent une diminution des réactions croisées pour les dérivés C-5β et C-5α de la progestérone, possèdent donc au niveau de leur domaine VL les acides aminés suivants : une proline ou un acide aminé basique en position 94 et un acide aminé différent d'une proline en position 95, la position des acides aminés étant donnée selon la numérotation Kabat.
De façon générale, les acides aminés sont classés en 4 familles, à savoir (1) les acides aminés acides tels que l'aspartate et le glutamate, (2) les acides aminés basiques tels que la lysine, l'arginine et l'histidine, (3) les acides aminés non polaires tels que l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine et le tryptophane et (4) les acides aminés non chargés polaires tels que l'asparagine, la glutamine, la cystéine, la serine, la thréonine et la tyrosine. La phénylalanine, le tryptophane et la tyrosine sont parfois classés en acides aminés aromatiques.
L'acide aminé en position 94 particulièrement approprié aux fins de l'invention est choisi parmi la lysine, l'arginine et la proline, ce dernier acide aminé étant particulièrement préféré.
Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, l'acide aminé en position 94 est une proline, une arginine ou une lysine, de préférence une proline.
L'acide aminé en position 95 sur le domaine VL des anticorps de l'invention doit être différent de la proline. De préférence, l'acide aminé en position 95 n'est pas un acide aminé acide et est choisi parmi les acides aminés basiques, les acides aminés non polaires et les acides aminés non chargés polaires. Les acides aminés en position 95 particulièrement appropriés aux fins de l'invention sont choisis parmi l'arginine, l'histidine, la leucine et la tyrosine, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention. Pour améliorer davantage les caractéristiques de spécificité, les anticorps peuvent également présenter des acides aminés particuliers en positions 58, 31 et 32 au niveau du domaine VH.
Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention est tel qu'il comprend au moins l'une des étapes suivantes : une étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VH une lysine en position
31, une étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VH une histidine en position 32, - une étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VH en position 58 un acide aminé choisi parmi l'alanine, l'acide aspartique, l'histidine et l'arginine, de préférence l'histidine ou l'arginine, et
- une étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VL un acide aminé basique et de préférence une lysine en position 27e, les positions des acides aminés étant données selon la numérotation Kabat.
L'obtention de ces acides aminés particuliers peut être mise en œuvre selon les procédés décrits précédemment, comme par exemple par mutagenèse dirigée.
Les anticorps anti- progestérone obtenus par le procédé de l'invention sont nouveaux en ce sens qu'ils présentent les caractéristiques d'affinité et de réactions croisées jamais obtenues par les anticorps anti- progestérone, comme suit :
- une affinité pour la progestérone, de préférence inférieure au nanomolaire, et une diminution des réactions croisées pour les dérivés C- 5 OC et C-5β.
Ainsi, un autre objet de l'invention concerne les anticorps anti-progestérone susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention. L'affinité pour la progestérone des anticorps anti- progestérone de l'invention est déterminée selon la méthode décrite par Nieba et al., 1996, Anal. Biochem., 234 : 155-165. Par diminution des réactions σoisées pour les dérivés C-5α et C-5β des anticorps anti-progestérone, on entend une diminution de leur capacité à se lier soit aux dérivés C-5α, soit aux dérivés C-5β, soit aux deux, ce qui permet d'améliorer leur spécificité. La diminution de la capacité à se lier aux dérivés C- 5 α et/ou aux dérivés C- 5 β peut être mise en évidence de différentes façons.
Ainsi, elle peut être mise en évidence par la détermination des pourcentages des réactions croisées selon un protocole précis. Une telle détermination peut être mise en œuvre selon l'équation suivante (P=pourcentage) :
P = [CI50 de la progestérone/CI50 du dérivé C-5α ou C-5β de la progestérone] x 100, étant entendu que la concentration à 50% d'inhibition (CIs0) est déterminée par des tests de compétition et correspond à la concentration en compétiteur (progestérone ou dérivé C- 5 α ou dérivé C-5β) entraînant une diminution du signal de 50% par rapport au contrôle réalisé en l'absence de compétiteur (100% de signal est alors obtenu).
Selon ce type de détermination, les anticorps anti- progestérone de l'invention présentent, outre une haute affinité telle que définie précédemment, au moins l'une des caractéristiques suivantes : - au plus 10 %, de préférence au plus 4% et de préférence encore au plus 2%, de réaction croisée pour les dérivés C- 5 α de la progestérone et au plus 23 %, de préférence au plus 15 %, de préférence au plus 10 %, et de préférence encore au plus 4% de réaction croisée pour les dérivés G5β de la progestérone. Le calcul de pourcentage de réactions croisées et du seuil est bien entendu fonction du protocole utilisé.
La diminution de la capacité à se lier aux dérivés C- 5 α et/ou aux dérivés C- 5 β peut également être mise en évidence par détermination d'un facteur de diminution en prenant comme référence un anticorps anti- progestérone connu. La détermination de ce facteur est alors fonction de l'anticorps de référence et est indépendant du protocole de détermination utilisé.
Selon ce type de détermination, si on prend l'anticorps anti- progestérone 15G12C12G11 (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) comme anticorps de référence, les anticorps anti- progestérone de l'invention présentent, outre une haute affinité telle que définie précédemment, au moins l'une des caractéristiques suivantes :
- une diminution des réactions croisées pour les dérivés C- 5 α de la progestérone selon un facteur d'au moins 2, de préférence d'au moins 4,9 et de préférence encore d'au moins 10, et une diminution des réactions croisées pour les dérivés C- 5 β de la progestérone selon un facteur d'au moins 1,7, de préférence d'au moins 4,5 et de préférence encore d'au moins 6,5.
Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés dans toutes les applications où la liaison spécifique et de manière affine entre un anticorps anti- progestérone et la progestérone est une caractéristique importante. Les anticorps de l'invention sont particulièrement appropriés pour le diagnostic in vitro du taux de progestérone dans un échantillon biologique susceptible de contenir de la progestérone.
Ainsi, l'invention a également pour objet l'utilisation des anticorps anti-progestérone de l'invention pour le diagnostic in vitro du taux de progestérone dans un échantillon biologique susceptible de contenir de la progestérone.
Par échantillon biologique, on entend un échantillon biologique d'origine humaine ou animale susceptible de contenir de la progestérone tel qu'un échantillon de sang, de plasma ou de sérum. Le diagnostic in vitro du taux de progestérone en utilisant les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention peut être mis en œuvre par le procédé de détermination du taux de progestérone dans un échantillon biologique susceptible de contenir de la progestérone selon les étapes consistant à :
(i) mettre en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps anti-progestérone de l'invention,
(ii) révéler la liaison entre ledit anticorps anti- progestérone et la progestérone contenue dans ledit échantillon et (iii) déterminer le taux de progestérone. La première étape du procédé est une étape classiquement connue de l'homme du métier.
La deuxième étape du procédé de l'invention, qui consiste à révéler la liaison entre ledit anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention, peut être réalisée par tout moyen de détection connu dans le domaine des dosages immunologiques de très petites molécules, tel que la détection directe, c'est-à-dire sans l'intermédiaire de partenaire(s) de liaison, et la détection indirecte, c'est-à-dire par l'intermédiaire de partenaire(s) de liaison.
La détection directe de la liaison entre l'anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention et la progestérone peut être mise en œuvre par exemple par résonance plasmonique de surface ou par voltamétrie cyclique sur une électrode portant un polymère conducteur. Dans ce cas, l'anticorps de l'invention sert à immunocapturer la progestérone, la progestérone immunocapturée étant ensuite éluée.
L'élution de la progestérone immunocapturée par ledit anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut être mise en œuvre par tout procédé d'élution connu de l'homme du métier, tel qu'un choc de pH.
Dans le cas de la détection indirecte, la deuxième étape du procédé de l'invention peut être mise en œuvre selon la technique classique ELISA de dosage par compétition. L'anticorps de l'invention sert alors de partenaire de liaison servant à la capture de la progestérone dans l'échantillon. La détection peut alors être mise en œuvre par compétition entre la progestérone susceptible d'être contenue dans l'échantillon à tester et une quantité connue de progestérone préalablement marquée. L'anticorps anti- progestérone de l'invention peut être préalablement lié à un support solide, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
Par marquage, on entend la fixation d'un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs consiste en :
• les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, l'acétylcholine estérase, la β-galactosidase, la glucose- 6-phosphate déshydrogénase,
• les chromophores comme les composés luminescents, colorants, • les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I,
• les molécules fluorescentes telles que la fluorescéine, la rhodomine, l'alexa ou les phycocyanines, et
• les particules telles que les particules en or, en latex magnétique, les liposomes. Des systèmes indirects de marquage peuvent être aussi utilisés, comme par exemple par l'intermédiaire d'un autre couple ligand/anti-ligand. Les couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, et on peut citer par exemple les couples suivants : biotine/streptavidine, biotine/avidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui est lié au partenaire de liaison. L' anti- ligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un ligand/anti- ligand.
Ces systèmes indirects peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR98/10084 ou
WO95/08000 de la Demanderesse ou à l'article J. Histochem. Cytochem., (1997), 45 : 481-
491.
Le marquage de molécules est largement connu de l'homme du métier et est décrit par exemple par Greg T. Hermanson dans Bioconjugate Techniques, 1996, Académie Press Inc, 525B Street, San Diego, CA92101 USA.
Selon le type de marquage utilisé, comme par exemple en utilisant une enzyme, l'homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage.
De tels réactifs sont largement connus de l'homme du métier et sont décrits notamment dans Principles and Practice of Immunoessay, Tά Edition, Edited by C. Price, DJ. Newman Stockton Press, 1997, 345 Park Avenue South, New York.
La dernière étape du procédé de l'invention, qui consiste à déterminer le taux de progestérone, peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l'homme du métier à cette fin. Ainsi, par exemple, il est possible d'utiliser une courbe d'étalonnage obtenue selon les mêmes conditions opératoires que le procédé de l'invention, à ceci près que l'échantillon est remplacé par des quantités connues de progestérone.
Les supports solides sur lesquels sont liées un anticorps de l'invention sont nouveaux et constituent un autre objet de l'invention. Les supports solides sur lesquels sont liés les anticorps de l'invention peuvent être tout support sur lequel on peut fixer des protéines. A titre de support de capture, on peut citer les micropuits, les microplaques, les supports polymères, les membranes, les lames de microscopie, les supports inorganiques fonctionnalisés ou non, tels que silice, verre, mica ou quartz, les supports métalliques telles que d'or et d'argent, et les particules et microparticules, notamment magnétiques.
Par liaison de l'anticorps de l'invention au support solide, on entend une liaison par adsorption ou une liaison par covalence. De telles liaisons sont largement connues de l'homme du métier.
Ainsi, dans le cas de la liaison par adsorption où l'anticorps de l'invention est juste déposé, on peut procéder au dépôt par exemple selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR2 816 711 qui est un procédé de dépôt sans contact particulièrement adapté au format de microplaque 96 puits. Ce procédé consiste à éjecter des nanogouttes calibrées à travers une buse, sous l'effet d'un choc mécanique, sur le fond des puits de la microplaque. On obtient ainsi à chaque choc une goutte dont le diamètre varie selon celui de la buse, de 50 à 500 μm environ.
Le dépôt des anticorps de l'invention peut être également effectué manuellement à l'aide de capillaires de verre dont le diamètre interne avoisine la centaine de microns. Dans ce cas, le capillaire doit entrer en contact avec la surface de dépôt pour que le dépôt ait lieu, ce qui entraîne un léger choc avec la surface de dépôt. Pour la liaison covalente, le support solide peut être fonctionnalisé par une fonction susceptible de former une liaison avec une fonction portée par le partenaire de capture. Ainsi, par exemple, le support solide est fonctionnalisé par une liaison NHS (N-hydroxysuccinimide) ou par une fonction NH2. Cette fonction peut réagir avec une fonction portée sur le partenaire de capture, telle qu'une fonction NH2 ou COOH. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 et 2 annexées, sur lesquelles :
- la figure 1 donne le schéma des étapes permettant de préparer des fragments d'anticorps de l'invention de type scFv constitués de VL-lien-VH, les numéros 1 à 6 correspondant aux différents oligonucléotides utilisés et les astérisques correspondant aux positions mutées et
- la figure 2 donne deux graphes représentant le pourcentage de réactions croisées P soit vis- à-vis du dérivé 5β-DHP (figure 2A), soit vis-à-vis du dérivé 5α-DHP (figure 2B) obtenus avec un fragment de l'invention présentant une proline en position 94, une histidine en position 95 et une arginine en position 58 (appelé P94-H95-R58) et avec un fragment scFv de l'anticorps monoclonal 15G12C12G11 non muté selon le procédé de l'invention (appelé Sauvage) en fonction de la dose de compétiteur utilisé, ce compétiteur pouvant être soit la progestérone, soit le dérivé 5β-DHP soit le dérivé 5α-DHP. Exemple 1 : Préparation des anticorps de l'invention Les anticorps anti-progestérone de l'invention ont été obtenus par la construction d'une banque d'un ensemble de variants de type phage- anticorps. La préparation de ces anticorps améliorés par rapport à l'anticorps monoclonal murin anti- progestérone initial, dans le cas présent l'anticorps monoclonal 15G12C12G11 (bioMérieux, Marcy, France), a nécessité la réalisation de plusieurs étapes successives. Les séquences en acides aminés pour le domaine VL et VH sont données dans le listage de séquences respectivement en SEQ ID N0I et SEQ ID N°2.
1. Construction d'une banque de fragments d'anticorps.
Les fragments d'anticorps de l'invention ont été obtenus selon un procédé de réalisation particulier. Une banque de mutants de l'ADN codant pour le fragment d'anticorps scFv (single chain Fragment variable) anti- progestérone a été construite via trois amplifications par PCR. La matrice d'ADN utilisée correspond à la séquence sauvage du fragment d'anticorps anti- progestérone de type scFv obtenu à partir de l'anticorps 15G12C12G11 et modifié pour être incorporé dans le phagemide pAKIOO selon la méthode de Krebber A, et al. (1997, J. Immunol. Methods, 201 : 35-55). Les principales étapes nécessaires à la construction de la banque sont indiquées sur la figure 1 sur laquelle les numéros 1 à 6 correspondent aux différents oligonucléotides utilisés et tels que définis ci- après, les astérisques correspondent aux positions mutées, l'annotation L94-L95 signifie les positions des acides aminés mutés 94 et 95 sur la chaîne légère, l'annotation H58 signifie la position de l'acide aminé muté en position 58 de la chaîne lourde et l'indication Sf iL correspond aux sites de coupure par l'enzyme de restriction SfK.
Les amplifications par PCR ont été réalisées à l'aide des oligonucléotides 1 à 6 dont certains présentaient, entre autre, les positions mutées relatives à l'invention : positions 94 et 95 sur le VL et position 58 sur le VH. À ces positions notamment, a été introduit l'ensemble des vingt acides aminés naturels par mutagenèse à saturation (Barbas CF, et al., 2001, Phage Display A Laboratory Manual, CSHL Press). Les oligonucléotides ont été construits de façon à présenter une extrémité chevauchante permettant de reconstituer, in fine, l'ADN complet codant pour les mutants de fragments d'anticorps de type scFv. Les oligonucléotides sont présentés dans le tableau I, leur localisation par rapport à la séquence du fragment d'anticorps étant indiquée sur la figure 1.
Tableau I
Figure imgf000017_0001
N=A, G, T, C
M=A, C
K=G, T
Les codons mutés ont été soulignés.
Les réactions de PCR suivantes ont été réalisées.
Tableau π
Figure imgf000017_0002
Les mélanges ont été incubés dans un thermocycleur Applied Biosystems Gène Amp PCR System 2700, selon le programme suivant : (950C, 5 min) - [(950C, 1 min) ; (5O0C, 1 min) ; (720C, 1 min)] x 30 - (720C, 10 min).
Les milieux réactionnels ont ensuite été mélangés à raison de 0,7 pmol de chaque et 10 cycles d'élongation sans oligonucléotide ont été réalisés dans les mêmes conditions que précédemment citées. A l'issue de ces 10 cycles, l/50eme du milieu réactionnel a été utilisé pour l'étape d'amplification finale via l'utilisation des oligonucléotides Lac2 et Nter glllp2 dans les mêmes conditions que précédemment citées.
Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à une digestion enzymatique par 10 unités de l'endonucléase SfH (biolabs) dans des conditions adaptées pendant 4 heures à 5O0C. Le phagemide pAKIOO a également été digéré dans les mêmes conditions. Après purification par électro-élution (Biotrap, Schleicher & Schull), les fragments d'ADN obtenus après coupure (le phagemide et les fragments amplifiés) ont été insérés dans le phagemide pAKIOO à l'aide de 400 unités de T4 Ligase (Roche). Les produits de ligation (à raison de 110 ng) ont été électroporés dans des bactéries XLl-Blue à l'aide d'un électroporateur (E.coli puiser,
Biorad). Après plusieurs séries d'électroporation, la banque était constituée de 8,6 x 106 clones bactériens indépendants.
2. Production des phases- anticorps constituant la banque.
La production des phages- anticorps constituant la banque a été réalisée en Erlen- Meyer. Pour cela, 50 ml de milieu 2YT (Difco), chloramphenicol 25 μg/ml (Sigma), glucose 1% (Prolabo) ont été ensemmencés avec 109 bactéries XLl-Blue issues de la banque, puis mis en culture à 370C sous agitation jusqu'à obtention d'une DO550nm de 0,5-0,6. Les phages auxiliaires (1011 pfu, plaque forming unit, M13KO17, Biorad) et 0,5 mM d'IPTG (isopropyl- β-D-thiogalactopyranoside, Sigma) ont alors été ajoutés. Après 15 min de contact sans agitation, entre les bactéries et les phages auxiliaires, 100 ml de milieu 2YT (Difco), chloramphenicol 25 μg/ml (Sigma), glucose 1% (Prolabo), IPTG 0,5 mM (Sigma) ont été ajoutés, puis la culture a été mise à incuber à 260C sous agitation pendant deux heures. A l'issue de cette étape, 450 μl de kanamycine 30 μg/ml (Sigma) ont été ajoutés et la culture a de nouveau été mise à incuber à 260C sous agitation, pour la production des particules phagiques pendant une nuit.
La culture de nuit a été mise à centrifuger à 10750 g à 40C pendant 40 min. Les surnageants contenant les phages- anticorps ont été récupérés, 30 ml de PEG/NaCl (PEG pour polyéthylèneglycol) (respectivement Prolabo 200 g/1, Sigma 146 g/1) ont été ajoutés et cette solution a été mise à incuber pendant 2 heures à 40C (précipitation des phages). Après centrifugation à 10750 g à 40C pendant 40 min, le culot de phages- anticorps a été repris dans 15 ml de PBS pH 7.4 (Phosphate Buffer Saline, Eurobio) et 3 ml de PEG/NaCl. Après incubation d'au moins 1 heure à 40C, le culot a finalement été repris dans 1,5 ml de PBS. Cette solution de phages est conservée à 40C. 3. Obtention des fragments d'anticorps de l'invention par une procédure de criblage en phage display.
Le principe de sélection utilisé est dérivé de celui initialement décrit par Hawkins RE, et al. (1992, J. Mol. Biol., 234, 958-964). Il s'agit d'un système de sélection en solution reposant sur l'utilisation de billes magnétiques recouvertes de streptavidine permettant de fixer de façon spécifique, dans notre cas, un dérivé biotinylé de la progestérone. A l'aide de ce système, une méthode de criblage par compétition dite méthode soustractive (Saviranta P, et al., 1998, Protein Eng., 11 : 143-152), a permis d'isoler au sein de la banque, les fragments d'anticorps de l'invention présentant les acides aminés particuliers aux positions 94 et 95 sur le domaine VL (et 58 sur le domaine VH) et possédant des réactions croisées diminuées pour la 5α-DHP et la 5β-DHP.
Les billes magnétiques streptavidine (600 μl, Streptavidin Magnesphere Paramagnetic particles, Promega) ont été lavées trois fois dans du PBS puis saturées avec 1 ml de PBS/lait écrémé 2% (Régilait) pendant 1 heure à 370C sous agitation. 1 ml de la solution de phages (diluée à 1010 phages) a été ajouté à 1 ml de la solution de progestérone - 11 α-EMC- ODN-biotine (bioMérieux, 5 nM) (EMC pour Ethoxy-Méthyl-carboxylate). Pour les tours de sélection en compétition, les analogues non biotinylés, 5α et 5β- dihydroprogestérone à 5 μM (5α et 5β-DHP, Steraloids), ont été ajoutés à la solution de progestérone- 11 α-EMC- ODN-biotine. Ces différentes solutions de phages et d'antigènes ont été préparées en PBS - Tween 0,1% (Sigma) - lait écrémé 4%. Après 1 heure d'incubation sous agitation douce et à température ambiante, ce mélange a été mis en contact 15 min avec les billes magnétiques streptavidine préalablement saturées. A l'aide d'un portoir magnétique, les billes ont ensuite été séparées du surnageant contenant les phages- anticorps non liés. Dix lavages de 3 ml ont été effectués : cinq lavages en PBS-Tween 0,05%-lait écrémé 1% puis cinq lavages en PBS. Les billes ont finalement été récupérées dans 1 ml de PBS.
La solution contenant les phages- anticorps liés à la progestérone biotinylée (celle-ci étant complexée par les billes magnétiques streptavidines) a éé utilisée directement pour infecter des bactéries XLl-Blue en phase exponentielle de croissance. Ces bactéries infectées ont ensuite été étalées sur boîtes 24,5x24,5 cm2. Après incubation sur la nuit à 370C, les clones ont été récupérés dans du milieu 2YT, chloramphenicol 25 μg/ml, glucose 1% et soumis à un nouveau tour de sélection. Au final, cinq tours de sélection successifs ont permis d'isoler les fragments d'anticorps de l'invention.
Les fragments d'anticorps de l'invention peuvent présenter également au niveau de leur domaine VH des mutations au niveau des positions 31 et 32 du domaine VH et avantageusement une lysine en position 31 et une histidine en position 32. Ces mutations ont été introduites à l'aide de la méthode de mutagenèse dirigée Quick Change Site Directed Mutagenesis (Stratagene) en utilisant les oligonucléotides présentés dans le tableau lu et en suivant les recommandations du fournisseur. Tableau m
Figure imgf000020_0001
L'introduction de la totalité des mutations identifiées au niveau des positions 94, 95 et 27e sur le VL et 31, 32 et 58 sur le VH peut être effectuée par les techniques de mutagenèse dirigée connues de l'homme du métier. 4. Production par voie recombinante des fragments d'anticorps de l'invention (ou sauvage) exposés en surface de phases.
Les fragments d'anticorps de l'invention peuvent être produits de façon recombinante dans la bactérie E.coli et caractérisés par des tests ELISA compétitifs sous une forme ancrée à la surface de bactériophages M13. Le phagemide pAKIOO contenant les séquences d'ADN codant pour les fragments d'anticorps de l'invention permet d'exprimer les dits fragments de type scFv fusionnés à la protéine mineure de capside pIH et de les exposer ainsi en surface des phages (bactériophages M13).
La production des phages individuels a été effectuée dans des microplaques 48 puits (puits de 5 ml, plaque stérile, MATRIX Technologues Corporation). Pour cela, 500 μl de milieu 2YT (Difco), chloramphenicol 25 μg/ml (Sigma), glucose 1% (Prolabo) ont été ensemmencés avec une colonie de bactéries XLl-Blue contenant l'ADN codant pour des fragments d'anticorps de l'invention et mis en culture à 370C sous agitation. Lorsque la DO à 550nm a atteint une valeur de 0,6, du phage auxiliaire M13KO7 (Biorad, 109pfu, plaque forming unit) ainsi que 25 μl d'IPTG 0,5 mM ont été ajoutés. Après 15 min de contact sans agitation, 1 ml de milieu 2YT, chloramphenicol 25 μg/ml, glucose 1%, IPTG 0,5 mM, sont ajoutés puis la culture est mise à incuber à 260C sous agitation pendant 2 heures. A l'issue de cette étape, 4,5 μl de kanamycine 30 μg/ml (Sigma) ont été ajoutés et la culture a de nouveau été mise à incuber à 260C sous agitation pendant 1 nuit. Les plaques de culture ont ensuite été centrifugées à 3300g pendant 1 heure à 40C.
Les surnagents contenant les particules de phages ont été récupérés et 515 μl de glycérol 15% ont été ajoutés.
Exemple 2 : Caractérisation des fragments d'anticorps de l'invention exposés en surface de phages.
1. Détermination des pourcentages de réactions croisées vis-à-vis des dérivés 5α- DHP et 53 -DHP par des tests ELISA compétitifs.
Les tests ELISA compétitifs ont été réalisés dans des microplaques de 96 puits (Nunc-Immuno Plate Maxisorb). Une solution de progestérone- llα-EMC- ODN (bioMérieux) à 0,2 μg/ml en PBS (eurobio) a été déposée à raison de 100 μl par puits. Après adsorption passive pendant 1 nuit à 40C, les puits ont été lavés avec une solution de Tris-HCl 10 mM pH 8 Tween 0,05%, puis deux étapes de saturation ont été effectuées. La première a été réalisée en distribuant 200 μl de PBS -lait écrémé 2% et en incubant 2 heures à 370C. Pour la seconde étape de saturation, 200 μl de PBS -gélatine 2% (Sigma) ont été ajoutés et la plaque a été mise à incuber de nouveau pendant 2 heures à 370C.
Les surnageants obtenus lors de l'étape précédente contenant les phages ont été testés de la façon suivante : 50 μl de ces surnageants auxquels ont été ajoutés des concentrations croissantes de compétiteur (progestérone et analogues, et notamment la 5α- et la 5β-DHP) ont été mis à incuber sur la microplaque pendant 1 heure à 370C. Après cette étape d'incubation, suivie de trois lavages (en PBS -Tween 0,1%), 200 μl par puits d'un anticorps biotinylé anti-phages M13 ont été ajoutés (Anti-fd bacteriophages-Biotin Conjugate, Sigma, dilué au 1/2000 en PBS -Tween 0,1%), puis les plaques ont mises été à incuber 1 heure à 370C. Après lavage, 200 μl par puits du conjugué streptavidine-HRP ont été ajoutés (Streptavidin-horseradish peroxydase conjugué, Amersham, dilué au 1/2000 en PBS-Tween 0,1%). Après incubation d'une heure à 370C suivie de trois lavages, la révélation a été effectuée avec 100 μl de solution d'ABTS (2,2'azino bis(3- ethylbenzathiazoline 6-sulphonate), Sigma) préparée à 0,55 mg/ml en acétate de sodium 0,1 M pH 4.3, PiO2 0,01%. La lecture des plaques a été réalisée à 410nm sur un lecteur de plaque ASYS Hitech Expert 86.
La spécificité de liaison des fragments d'anticorps de l'invention a été évaluée en considérant le pourcentage P de réactions croisées, vis-à-vis des analogues, défini de la laçon suivante : P = [CI50 de la progestérone/CIso du dérivé C-5α ou C-5β] x 100. Les pourcentages P des fragments d'anticorps de l'invention ont été comparés aux pourcentages P du fragment d'anticorps sauvage (dérivé de l'anticorps monoclonal murin initial 15G12C12G11) produit selon le même format.
Les résultats sont présentés sur la figure 2, laquelle montre deux graphes représentant le pourcentage de réactions croisées P soit vis-à-vis du dérivé 5β-DHP (figure 2A), soit vis- à-vis du dérivé 5α-DHP (figure 2B), obtenus avec un fragment de l'invention présentant une praline en position 94, une histidine en position 95 (VL) et une arginine en position 58 (VH) (appelé P94-H95-R58) tel que préparé dans l'exemple 1 ci-dessus et avec un fragment scFv de l'anticorps monoclonal 15G12C12G11 non muté selon le procédé de l'invention (appelé Sauvage), en fonction de la dose de compétiteur utilisé, ce compétiteur pouvant être soit la progestérone, soit le dérivé 5β-DHP soit le dérivé 5α-DHP.
Les résultats mettent en évidence une amélioration des réactions croisées dans le cas du fragment de l'invention.
Le tableau IV ci- après donne les résultats obtenus pour plusieurs fragments d'anticorps de l'invention présentant une spécificité de liaison améliorée (diminution des réactions croisées pour des dérivés C- 5 α et C-5β) par rapport au sauvage (fragment scFv de l'anticorps monoclonal initial), l'affinité pour la progestérone étant comparable à celle du sauvage (cette dernière étant appréciée en considérant la variation de CI5O pour la progestérone : CI5O progestérone pour le fragment d'anticorps de l'invention (muté) / CI5O progestérone du fragment d'anticorps sauvage). Dans chaque cas, les fragments de l'invention sont indiqués avec les acides aminés particuliers mutés au niveau des positions 94 et 95 sur le domaine VL, et le cas échéant des positions 58, 31 et/ou 32 sur le domaine VH.
Tableau IV
Figure imgf000024_0001
* Le facteur d'amélioration est calculé de la façon suivante (P du dérivé C- 5 α ou C- 5 β pour le sauvage / P du dérivé C-5α ou C-5β pour le fragment de l'invention considéré).
2. Détermination des pourcentages de réactions croisées pour deux autres dérivés C- 5α et C-5β de la progestérone.
L'allopregnanolone et la pregnanolone sont deux analogues de la progestérone. Ils peuvent être retrouvés dans les sérums à des concentrations non négligeables. L'allopregnanolone est un dérivé C- 5 α tandis que la pregnanolone est un dérivé de type C- 5β. Ces deux composés se distinguent de la progestérone par la présence d'un groupement hydroxyle en position 3 au lieu d'un groupement céto.
Les résultats présentés dans le tableau V ci- dessous mettent en évidence que les fragments d'anticorps préparés selon le procédé de l'invention présentent également une diminution des réactions croisées vis-à-vis de ces deux analogues : allopregnanolone et pregnanolone. Tableau V
Figure imgf000025_0001
Exemple 3 : Détermination de l'affinité de liaison pour la progestérone et pour les analogues des anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention. 1. Production par voie recombinante des fragments d'anticorps de l'invention (ou sauvage) en fusion à une séquence peptidique de six histidines.
Les fragments d'anticorps préparés selon le procédé de l'invention peuvent être produits par voie recombinante, sous une forme fusionnée à une séquence composée de six acides aminés histidines (ScFv-HiS6). Ces fragments d'anticorps particuliers sont produits dans le périplasme d'E. coli à l'aide d'un vecteur d'expression dérivé du pLIP6GN (Muller BH, et al., 1999, J. Immunol Methods., 257 : 177-185).
Une préculture de nuit à 370C sous agitation a été réalisée en ensemençant 3 ml de milieu LB (Difco), Chloramphenicol 25 μg/ml, avec une colonie de bactéries W3110 transformées par le vecteur d'expression. A l'issue de cette préculture, 50 ml de milieu LB (Difco), Chloramphenicol 25 μg/ml, ont été ensemencés avec 1 ml de la culture de nuit et mis à incuber à 370C sous agitation. Lorsque la DOssonm a atteint une valeur de 0,5-0,6, l'induction a été réalisée pendant 4 heures à 3O0C sous agitation après ajout d'IPTG 0,5 mM.
Après la période d'induction, la culture a été mise à centrifuger à 3500 g pendant 15 min à 40C. Après élimination du surnageant, les culots cellulaires ont été repris dans 1/10 du volume de la culture initiale dans du TSΕ (Tris-HCL 300 mM, pH 8, Sigma, Saccharose 20%, Fisher Scientific, ΕDTA 1 mM, Sigma), puis du lysozyme à 100 μg/ml (Sigma), et un mélange d'anti-protéases {Complète, Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche) ont été ajoutés. La solution a été placée à 40C sous agitation lente pendant 20 min, puis centrifugée pendant 30 min à 16000 g et à 40C. Les surnageants correspondants aux extraits périplasmiques ont été conservés à -2O0C.
La purification des ScFv-HiS6 a été réalisée par chromatographie d'affinité sur colonne d'ions nickel (IMAC, Immobilized Métal Affinity Chromatography) grâce à la séquence de six histidines. Les extraits périplasmiques contenant les scFv-HiSô ont été dialyses contre du tampon
Tris- HCl 20 mM pH 7.9, NaCl 500 mM, imidazole 5 mM (Sigma), à l'aide de membranes de dialyse (Spectra Por N0I MWCO 6-8000). Les extraits dialyses ont ensuite été filtrés sur membrane 0,22 mm (unité de filtration Millipore).
La colonne d'ions nickel (flIS-Select™, Sigma) a été préalablement lavée à l'eau distillée et équilibrée avec du tampon de dialyse. Après passage de l'échantillon sur la colonne, celle-ci a été lavée par au moins 30 ml de tampon Tris-HCl 10 mM pH 7.9, NaCl 250 mM, Imidazole 30 mM. L'élution a été réalisée avec 5 ml de tampon Tris-HCl 10 mM pH 7.9, NaCl 250 mM, imidazole 500 mM. La colonne a ensuite été régénérée avec du tampon de dialyse puis stockée à 40C dans un mélange tampon de dialyse/30% éthanol. L'éluat contenant les scFv-His6 a été concentré cinq fois en tampon Tris -HCL 10 mM pH 7.8 à l'aide des systèmes Vivaspin (MWCO 10000, Vivascience), puis les solutions contenant les scFv-Hisô ont été stockées à 40C.
2. Détermination de l'affinité par résonance plasmonique de surface pour la progestérone et pour les analogues 5α-DHP et 5β-DHP, des fragments d'anticorps fusionnés à une séquence peptidique composée de six histidines.
Les constantes apparentes de dissociation KD ont été déterminées en utilisant la méthode de résonance plasmonique de surface à l'aide de l'appareil BIAcore 3000 biosensor optical (BIAcore). Des biocapteurs (supports métalliques recouverts d'une fine particule d'or) de type carboxyméthyle CM5 pré-adsorbés avec de la streptavidine (BIAcore) ont été utilisés pour immobiliser des dérivés biotinylés de progestérone, de 5(X-DHP et de 5β-DHP (200 RU). Les fragments d'anticorps (mutés) issus du procédé de préparation de l'invention et le fragment d'anticorps sauvage ont été dilués à différentes concentrations (0,5 nM à 25 nM) dans un tampon HEPES 10 mM pH 7.4 (Sigma), NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM (Merck), 0,05% de surfactant (BIAcore). Ces mélanges ont été injectés sur les biocapteurs à un flux constant de 60 μl/min à 250C.
Les données cinétiques ont été traitées à l'aide du logiciel BIAevaluation 3.2 et les constantes d'association \ç,ss et de dissociation W déterminées simultanément à partir du modèle de liaison pour des interactions de type monovalente entre deux molécules (dRt/dt = kass x C x Rmax -(kass x C + k,jlss) x R1, où C est la concentration en fragment d'anticorps, R1113x la réponse maximal en RU (Résonance Unit), Rt le signal mesuré au temps t).
Les résultats obtenus pour certains des fragment d'anticorps de l'invention et le fragment d'anticorps sauvage sont présentés dans le tableau VI.
Tableau VI
Figure imgf000027_0001
** Le facteur d'amélioration est calculé de la façon suivante :
[KD Progestérone / K0 dérivé C-5α ou C-5β]poUr k fragment sauvage / [KD Progestérone /
Kβ dérive C- 5 OC OU C-5p]pθur un variant donné de l'invention
"" Le pourcentage de réaction croisée est calculé comme suit : \KD Progestérone / KD dérivé C-5α ou C-5β] x 100.
Les résultats mettent en évidence, comme indiqué précédemment dans le tableau IV, que les fragments de l'invention purifiés présentent une amélioration de la spécificité de reconnaissance avec des diminutions de réactions croisées vis-à-vis de la 5α-DHP et de la 5β-DHP, et ce tout en maintenant une affinité inférieure au nanomolaire pour la progestérone. En comparaison avec le fragment sauvage qui présente des affinités pour la 5α-DHP et la 5β-DHP respectivement de 97 pM et 28 pM, les fragments de l'invention présentent des pertes d'affinités importantes pour la 5DC-DHP et la $-DHP, ce qui se traduit par des facteurs d'amélioration de la spécificité compris entre 4,2 et 23. Exemple 4 : Préparation d'une autre famille d'anticorps de l'invention
L'anticorps monoclonal 10H3C2D4 (bioMérieux, Marcy, France), dont les séquences en acides aminés pour le domaine VL et VH sont données dans le listage de séquences respectivement en SEQ ID N°12 et SEQ ID N°13, a été utilisé. Les séquences d'ADN codant pour les domaines variables ont été clonées comme indiqué dans l'exemple 1.
Les 3 mutants suivants ont été préparés à partir de l'anticorps monoclonal 10H3C2D4 :
- mutant présentant une praline en position 94 (VL), une histidine en position 95 (VL) et une arginine en position 58 (VH) (appelé P94-H95-R58*),
- mutant présentant une praline en position 94 (VL), une histidine en position 95 (VL), une arginine en position 58 (VH), une lysine en position 31 (VH) et une histidine en position 32 (VH) (appelé P94-H95-R58-K31-H32*),
- mutant présentant une praline en position 94 (VL), une histidine en position 95 (VL), une lysine en position 27e (VL) une arginine en position 58 (VH), une lysine en position 31 (VH) et une histidine en position 32 (VH) (appelé P94-H95 -R58-K31-H32-K276*).
Ces mutants ont été préparés par mutagénèse dirigée en utilisant comme ADN matrice le phagemide pAKIOO dans lequel a été clone l'ADN codant le scFv de l'anticorps 10H3C2D4, en présence des amorces oligonucléotidiques telles que décrites dans le tableau VU suivant :
Tableau Vu
Figure imgf000029_0001
Le mutant P94-H95-R58* a été obtenu en deux temps, à partir de la matrice pAK100/scFvi0H3C3D4 sauvage et des amorces de mutagenèse P94H95-COD et P94H95- comp pour donner la matrice pAK100/scFvl0H3C3D4/PL94 HL95, qui elle-même a été traitée avec les amorces de mutagenèse R58-COD et R58-comp.
Le mutant P94-H95-R58-K31-H32* a été obtenu à partir de la matrice pAK100/scFvl0H3C3D4/PL94 HL95 RH58 et des amorces de mutagenèse K31H32-COD et K31H32-comp.
Le mutant P94-H95-R58-K31-H32-K276* a été obtenu à partir de la matrice pAK100/scFv10H3C3D4/PL94 HL95 RH58 + KH31 HH32 et des amorces de mutagenèse K27- COD et K27-comp.
Les affinités relatives et les pourcentages de réactions croisées par rapport aux dérivés 5α-DHP et 5β-DHP, calculés comme indiqué dans l'exemple 2, sont donnés dans le tableau VIII ci- après : Tableau Vin
Figure imgf000030_0001
nd= non déterminé Pg = progestérone
Les résultats dans le tableau ci- dessus confirment bien l'effet bénéfique et progressif des mutations introduites quant à la spécificité de reconnaissance de l'anticorps 10H3C2D4. En effet, on passe successivement de 29, à 12, puis 10 et enfin 8% de réaction croisée pour la 5α-DHP. Bien que moindre, on note également une amélioration de la spécificité vis-à-vis de la 3β-DHP. Ces résultats confirment donc tout à fait, et ce dans le cas d'un second anticorps anti- progestérone, la pertinence et l'intérêt des mutations.
Les résultats mettent également en évidence l'effet bénéfique de la mutation en position 27e, en particulier sur le dérivé C- 5α.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'anticorps anti- progestérone, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VL :
(i) une praline ou un acide aminé basique au niveau de l'acide aminé 94 et (ii) un acide aminé différent d'une praline au niveau de l'acide aminé 95.
2. Procédé de préparation d'anticorps anti- progestérone selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide aminé en position 94 est une praline, une arginine ou une lysine, de préférence une praline.
3. Procédé de préparation d'anticorps anti- progestérone selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'acide aminé en position 95 est choisi parmi l' arginine, l'histidine, la leucine et la tyrosine.
4. Procédé de préparation d'anticorps anti- progestérone selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VH une lysine en position 31.
5. Procédé de préparation d'anticorps anti-progestérone selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VH une histidine en position 32.
6. Procédé de préparation d'anticorps anti- progestérone selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VH en position 58 un acide aminé choisi parmi l'alanine, l'acide aspartique, l'histidine et l' arginine.
7. Procédé de préparation d'anticorps anti- progestérone selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape consistant à introduire au niveau de leur domaine VL un acide aminé basique en position 27e.
8. Anticorps anti- progestérone susceptibles d'être obtenus par le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Utilisation des anticorps anti-progestérone tels que définis dans la revendication 8 pour le diagnostic in vitro du taux de progestérone dans un échantillon biologique susceptible de contenir de la progestérone.
10. Procédé de détermination du taux de progestérone dans un échantillon biologique susceptible de contenir de la progestérone, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : (i) mettre en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps anti-progestérone tel que défini dans la revendication 8 (ii) révéler la liaison entre ledit anticorps anti- progestérone et la progestérone contenue dans ledit échantillon et (ϋi) déterminer le taux de progestérone.
11. Procédé de détermination du taux de progestérone dans un échantillon biologique susceptible de contenir de la progestérone selon la revendication 10, caractérisé en ce ledit anticorps anti- progestérone est lié à un support solide.
12. Support solide sur lequel est lié un anticorps anti- progestérone tel que défini dans la revendication 8.
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