CN115975028B - 一种孕酮抗体、制备方法及其应用 - Google Patents
一种孕酮抗体、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种孕酮抗体、制备方法及其应用。所述孕酮抗体的重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列分别如SEQ ID NO:3‑5所示。所述制备方法包括以下步骤：S1，以已知孕酮抗体晶体结构为模板，通过同源建模分析对接结果，获得孕酮抗体识别孕酮的关键位点；S2，对步骤S1获得的关键位点进行定点突变，构建抗体突变基因，再构建表达载体进行突变抗体表达；S3，纯化突变抗体，进行抗原抗体亲和力测试和抗体性能测试，筛选出高亲和力的孕酮抗体。所述孕酮抗体的抗原亲和力高和抗原结合稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种孕酮抗体、制备方法及其应用，属于抗体技术领域。
背景技术
孕酮(progesterone,PROG)是一种在生殖中起重要作用的类固醇激素，是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，对受精卵的着床以及妊娠有重要作用，为维持妊娠所必需，可以维系正常女性生理状态、月经周期、排卵功能、维系妊娠和胚胎生长发育，是女性不可或缺的激素。它通过在月经周期后期使子宫粘膜内腺体生长，子宫充血，内膜增厚，为受精卵植入作好准备，受精卵植入后则使之产生胎盘，并减少妊娠子宫的兴奋性，抑制其活动，使胎儿安全生长；其次，与雌激素共同作用下，促使乳房充分发育，为产乳作准备；再者，使子宫颈口闭合，粘液减少变稠，使精子不易穿透；最后，通过对下丘脑的负反馈作用，抑制垂体促性腺激素的分泌，产生抑制排卵作用。
足量的孕酮不但能保证子宫内膜功能的正常，促进胚胎的正常发育，还具有抗排异和抑制子宫收缩的作用，从而保证胎儿在子宫内顺利的正常发育，直至足月。如果孕酮过低，通常表示黄体功能不全或黄体过早衰退，以致子宫内膜分泌不良，从而导致孕卵着床困难或早孕流产，无法继续维持妊娠。因此怀孕后通过孕酮的测定可以及时发现孕酮低的情况，并采取措施补救，保证胎儿顺利发育。而怀孕之前也可以通过孕酮的测定，及时发现孕酮缺乏的现象，并进行积极的调理，使怀孕更加顺利。目前可通过免疫法检测人血清中孕酮的含量，因此开发特亲和力高和稳定性好的检测抗体至关重要。
目前，现有技术中比较缺乏的亲和力高和稳定性好的孕酮抗体。
发明内容
本发明提供了一种孕酮抗体、制备方法及其应用，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
一种孕酮抗体，其重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列分别如SEQ ID NO:3所示。
一种孕酮抗体，其重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列分别如SEQ ID NO:4所示。
一种孕酮抗体，其重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列分别如SEQ ID NO:5所示。
一种上述孕酮抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1，以已知孕酮抗体晶体结构为模板，通过同源建模分析对接结果，获得孕酮抗体识别孕酮的关键位点；
S2，对步骤S1获得的关键位点进行定点突变，构建抗体突变基因，再构建表达载体进行突变抗体表达；
S3，纯化突变抗体，进行抗原抗体亲和力测试和抗体性能测试，筛选出高亲和力的孕酮抗体。
作为进一步改进的，所述同源建模分析采用SWISS-Model软件。
作为进一步改进的，所述已知孕酮抗体为单克隆抗体8H8，其重链序列如SEQ IDNO:1所示，其轻链序列如SEQ ID NO:2所示。
作为进一步改进的，所述定点突变采用Q5定点突变试剂盒进行。
作为进一步改进的，所述抗原抗体亲和力测试采用Biacore方法测试。
作为进一步改进的，所述关键位点为轻链上的VL-His98、VL-Val99、VL-Val101。
一种上述的孕酮抗体在检测孕酮中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的孕酮抗体具有高亲和力和高结合稳定性。
本发明通过计算机同源建模辅助分析来设计了一系列突变体，并定点突变构建了表达载体，对所构建的突变体进行了全抗体表达，再用进行亲和层析纯化，测定亲和力进行排序，并利用免疫试剂初步检测抗体性能，获得高亲和力和高结合稳定性的抗PROG抗体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为293F细胞重组表达抗PROG抗体突变株的结果。
图2为免疫层析竞争法检测抗PROG抗体突变株的性能结果。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种孕酮抗体，其重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列分别如SEQ ID NO:3所示。
本发明实施例提供一种孕酮抗体，其重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列分别如SEQ ID NO:4所示。
本发明实施例提供一种孕酮抗体，其重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列分别如SEQ ID NO:5所示。
上述孕酮抗体为已知孕酮抗体经同源建模分析预测和定点突变后，再经抗原抗体亲和力测试和抗体性能测试的二次筛选后得到的抗原高亲和力和高结合稳定性的突变抗体。
为了解决现有技术中比较缺乏的亲和力高和稳定性好的孕酮抗体的技术问题，本发明实施例提供了一种孕酮抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1，以已知孕酮抗体晶体结构为模板，通过同源建模分析对接结果，获得孕酮抗体识别孕酮的关键位点；
S2，对步骤S1获得的关键位点进行定点突变，构建抗体突变基因，再构建表达载体进行突变抗体表达；
S3，纯化突变抗体，进行抗原抗体亲和力测试和抗体性能测试，筛选出高亲和力的孕酮抗体。
在本实施例的方法中，通过同源建模分析对孕酮抗体识别孕酮的关键位点进行预测，对关键位点进行定点突变形成突变的抗体，再通过抗原抗体亲和力测试和抗体性能测试对突变的抗体进行二次筛选，从而能够得到高亲和力的孕酮抗体。
在一些实施例中，所述同源建模分析采用SWISS-Model软件。该软件对蛋白质的三维结构预测的准确性较高，提高了高亲和力的孕酮抗体的筛选效率。虽然SWISS-Model软件预测的准确性较高，但其预测的结果仍带有一定的随机性，需要抗原抗体亲和力测试和抗体性能测试对其预测的结果进行进一步的验证。
在一些实施例中，所述已知孕酮抗体为单克隆抗体8H8，其重链序列如SEQ ID NO:1所示，其轻链序列如SEQ ID NO:2所示。单克隆抗体8H8是发明人前期开发的抗体，对抗原孕酮有一定的亲和力，但是不够理想，经过本发明实施例的方法进行改进后，其抗原亲和力和抗原结合的稳定性得到显著的提高。
在一些实施例中，所述定点突变采用Q5定点突变试剂盒进行。Q5定点突变试剂盒能在2h内实现双链DNA上的定点突变，突变效率高。由于突变具有随机性，所述定点突变后，抗体的性能如何仍需抗原抗体亲和力测试和抗体性能测试才能确定。
在一些实施例中，所述纯化为采用Protein G柱进行亲和层析纯化。
在一些实施例中，所述抗原抗体亲和力测试采用Biacore方法测试。Biacore方法是一种基于光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)原理的用于分子互作分析的常用方法，其准确性高、重复性好。
在一些实施例中，所述抗体性能测试采用免疫层析竞争法进行测试。
在一些实施例中，所述关键位点为轻链上的VL-His98、VL-Val99、VL-Val101。所得的孕酮抗体为对轻链上的关键氨基酸位点VL-His98、VL-Val99、VL-Val101进行了突变的抗体。
一种上述的孕酮抗体在检测孕酮中的应用。上述的孕酮抗体具有抗原高亲和力和高结合稳定性，可以用于免疫法检测人血清中孕酮的含量，具有较高的检测特异性和灵敏度。
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但不构成对的本发明要求保护保护的范围的限制。
实施例1
一种孕酮抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将PROG-BSA抗原皮下多点免疫Balb/c小鼠，再取免疫后小鼠的脾脏细胞，与骨髓瘤细胞进行PEG融合，用HAT和PROG抗原进行筛选、亚克隆，最终筛选获得阳性杂交瘤细胞株8H8，再通过巢式PCR扩增得到抗体基因，表达纯化获得8H8孕酮抗体。以8H8抗体的晶体结构为模板，将其氨基酸序列(其重链序列如SEQ ID NO:1所示，其轻链序列如SEQ ID NO:2所示)上传至SWISS-Model在线服务器，通过同源建模分析对接结果，获得在大多数结合构象中都发挥了重要作用的氨基酸残基位点，涉及的残基(表1)包括VH-Trp104、VH-Trp50、VH-Trp101、VL-His98、VL-Val99、VL-Val101。
表1通过分子对接分析获取的关键氨基酸位点
S2、根据上述分子对接结果，对VL-His98、VL-Val99、VL-Val101、VH-Trp104四个位点的氨基酸进行定点突变，设计引物，通过Q5定点突变试剂盒进行突变构建抗体突变基因，分别为突变1、突变2、突变3和突变4。将产物转化到Escherichia coli DH5α感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min后，加入500μL的LB液体培养基，放在温度为37℃，转速为150rpm的摇床培养1h；然后取30μL培养液涂布到含有氨苄抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养16小时后，从中挑选出单一菌落加入到含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，置于温度为37℃，转速为220rpm的摇床上培养16小时后，用天根高纯度质粒小提中量试剂盒提取，送生工生物测序。
S3、测序正确后，重组表达抗PROG抗体，通过PEI转染法将步骤S2所得抗体重轻链质粒转染进293F细胞，转染成功后，置于37℃、8％ CO2、120rpm培养箱中培养24h后，补加与培养液等体积的OPM-293CD05新鲜培养基，待细胞生长至4×106个/mL密度时，每天添加1％体积比的OPM-293ProFeed补料培养基，放回37℃、8％ CO2、120rpm培养箱中继续培养96h，获得表达抗PROG抗体的293F细胞培养液。
S4、通过Protein G柱纯化抗PROG抗体：将步骤S3所得表达抗PROG抗体的293F细胞培养液在转速为9000rpm的条件下离心15min，收集上清，用0.22μm的滤膜过滤，选用Protein G填料进行蛋白纯化；Protein G柱使用前用5倍柱体积含有0.02M PB和0.15MNaCl，pH为7.4的平衡缓冲液对柱子进行平衡，再将离心取得的上清液流过柱子，再用5倍柱体积含有0.02M PB和0.15M NaCl，pH为7.4的平衡缓冲液对柱子进行冲洗，再用5倍柱体积含0.1M Glycine-HCl，pH为2.7的洗脱液进行洗脱，并立即用1.0M Tris-HCl，pH为9.0的中和液中和洗脱液，最后将纯化的抗PROG抗体透析到PH8.0的PBS中，获得重组抗PROG抗体(如图1所示)。
S5、利用Biacore检测抗原抗体亲和力并排序，首先利用anti-mouse捕获芯片特异性抓取鼠Fc的特性，将不同的重组表达抗PROG抗体样品及对照作为流动相直接流经芯片表面，捕获芯片特异性捕获抗体的Fc端，使得重组抗体在芯片表面富集，随后将梯度稀释的抗原PROG作为流动相，每个循环1个浓度进样，进行亲和力检测。获得数据如下表2。
表2 Biacore测定抗PROG抗体突变株的亲和力结果
| 配体 | 分析物 | Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) |
| 原始序列 | PROG-Ag | 1.39E+06 | 2.19E-03 | 1.58E-09 |
| 突变1 | PROG-Ag | 4.73E+06 | 1.35E-04 | 2.86E-11 |
| 突变2 | PROG-Ag | 4.28E+06 | 2.64E-04 | 6.18E-11 |
| 突变3 | PROG-Ag | 4.77E+06 | 3.55E-04 | 7.44E-11 |
| 突变4 | PROG-Ag | 3.73E+05 | 6.93E-03 | 1.86E-08 |
注：Ka代表结合速率常数，表征结合快慢，数字越大，结合/识别越快；Kd待变解离速率常数，表征复合体的稳定性，数字越小，解离越慢，复合体越稳定；KD代表亲和力，表征结合强弱，数字越小，结合越强。
S6、利用免疫层析竞争法检测抗体的性能，首先将PROG抗原和羊抗鼠二抗分别按顺序固定在硝酸纤维素膜上并烘干，同时将抗PROG抗体偶联标记上荧光微球，喷在样本垫上并烘干，组装成试剂条。随后加入不同浓度的临床样本，读取检测荧光数值。结果如下表3和图2。
表3
注：T为检测线，C为控制线，T/(T+C)为检测结果，随着PROG抗原量的增加，荧光检测结果成梯度降低，说明抗体能够特异性结合抗原。
所述定点突变试剂盒为Q5定点突变试剂盒(E0552S)，购自NEB(北京)有限公司；所属目的质粒的提取试剂盒为高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)，购自天根生化科技(北京)有限公司；所述293F细胞来自厦门大学；所述引物由广州擎科生物技术有限公司合成；所述Escherichia coli DH5a感受态菌株购自天根生化科技(北京)有限公司；所述LB液体培养基试剂购自sigma公司；所述新鲜培养基为OPM-293CD05培养基，购自上海奥浦迈生物科技有限公司；所述补料培养基为OPM-293ProFeed培养基，购自上海奥浦迈生物科技有限公司；所述opti-MEM培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；所述Protein A柱购自汇研生物科技有限公司；所述PCR用96孔板购自Axygen；所述酶切试剂、洗脱液试剂购自国药集团。
由表2可知，相对于原抗体，突变1、突变2和突变3的抗体的亲和力显著增强，而突变4的抗体的亲和力却降低。由表3和图2可知，相对于原抗体，突变1、突变2和突变3的抗体能够特异性结合抗原，结合稳定性高，而突变4的抗体的结合稳定性降低。由此可知，本发明实施例通过同源建模分析预测和定点突变，意外地得到了三种高抗体亲和力和高结合稳定性的孕酮抗体，即突变1、突变2和突变3的抗体。
本发明实施例的抗体的氨基酸序列如下：
孕酮抗体8H8的重链序列如下：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASSFTFTNNGMYWIQKAPGRRLKWMGWILLYTGEPTYTTDFQGRFAFSLETSANTADLQITNLETEDTATYFCARGGWGHWAFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG(SEQ IDNO:1)。
孕酮抗体8H8的轻链序列如下：
DIVMTQTPLSLPVSLGDQASIICRSSQSLVVSNGNTWLHWYLQRQGQSPKLTIYKVVNRFSGVPDRFHGSGDGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQVAHVPVTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPRDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:2)。
孕酮抗体8H8突变1的轻链序列如下：
DIVMTQTPLSLPVSLGDQASIICRSSQSLVVSNGNTWLHWYLQRQGQSPKLTIYKVVNRFSGVPDRFHGSGDGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQVASVPVTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPRDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:3)。
孕酮抗体8H8突变1的重链序列同原孕酮抗体8H8。
孕酮抗体8H8突变2的轻链序列如下：
DIVMTQTPLSLPVSLGDQASIICRSSQSLVVSNGNTWLHWYLQRQGQSPKLTIYKVVNRFSGVPDRFHGSGDGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQVAHHPVTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPRDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:4)。
孕酮抗体8H8突变2的重链序列同原孕酮抗体8H8。
孕酮抗体8H8突变3的轻链序列如下：
DIVMTQTPLSLPVSLGDQASIICRSSQSLVVSNGNTWLHWYLQRQGQSPKLTIYKVVNRFSGVPDRFHGSGDGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQVAHVPHTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPRDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:5)。
孕酮抗体8H8突变3的重链序列同原孕酮抗体8H8。
孕酮抗体8H8突变4的重链序列如下：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASSFTFTNNGMYWIQKAPGRRLKWMGWILLYTGEPTYTTDFQGRFAFSLETSANTADLQITNLETEDTATYFCARGGWGHVAFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG(SEQ IDNO:6)。
孕酮抗体8H8突变4的轻链序列同原孕酮抗体8H8。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种孕酮抗体，其特征在于，其重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列如SEQ IDNO:3所示。
2.一种孕酮抗体，其特征在于，其重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列如SEQ IDNO:4所示。
3.一种孕酮抗体，其特征在于，其重链序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链序列如SEQ IDNO:5所示。
4.一种权利要求1至3任一项所述的孕酮抗体在制备检测孕酮的试剂中的应用。
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