WO2006046504A1 - シグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子の取得方法 - Google Patents

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WO2006046504A1
WO2006046504A1 PCT/JP2005/019490 JP2005019490W WO2006046504A1 WO 2006046504 A1 WO2006046504 A1 WO 2006046504A1 JP 2005019490 W JP2005019490 W JP 2005019490W WO 2006046504 A1 WO2006046504 A1 WO 2006046504A1
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protein
library
nuclei
cell
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Hiroyuki Kumagai
Teruhiko Toyooka
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Tohoku University
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1072—Differential gene expression library synthesis, e.g. subtracted libraries, differential screening
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    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining a signal-dependent nuclear translocation protein, and more particularly, to a method capable of efficiently and specifically cloning a low-expression proliferation-differentiation-related protein gene. .
  • a method using interaction with a known signaling molecule For example, there is a method utilizing in vitro binding, such as obtaining an interacting molecule group by passing a cell extract through a affinity column in which a known molecule is bound to a column substrate.
  • interacting proteins may be obtained by utilizing intracellular binding as in the yeast two-hybrid screening method.
  • Non-patent document 1 describes the history of the discovery of protein TAB-1, which activates the TGF-1
  • Non-Patent Document 2 describes a method for searching for a substrate by phosphorylating a cDNA expression library using a known purified signal molecule having tyrosine kinase activity.
  • Non-Patent Document 1 Science, 272, 1179-1182, (1996)
  • Non-patent document 2 Methods in Molecular Biology, 218, 133-141 (2003)
  • an object of the present invention is to provide a method for efficiently obtaining only a signal-dependent nuclear translocation protein in a short time from a DNA library obtained from any cell force! RU
  • the present invention relates to the following aspects.
  • (C) a step of fractionating nuclei from the transformed cells, and then fractionating nuclei containing a fusion protein of a protein expressed from a gene group and a labeled protein;
  • the acquisition method comprising:
  • a method for obtaining a signal-dependent nuclear translocation protein gene comprising: (A) transforming the cells using a gene library comprising a gene group fused with a gene encoding a labeled protein, and expressing the gene group;
  • (C) a step of fractionating nuclei from the transformed cells, and then separating nuclei that do not contain a fusion protein of a protein expressed from a gene group and a labeled protein;
  • the acquisition method comprising:
  • step (A) and Z or (D) the gene library is introduced by a viral vector.
  • steps (A) and Z or (D) the cells are transformed under conditions such that substantially no more than one fusion gene is introduced into one cell on average.
  • the method according to any one of the above.
  • a method for efficiently acquiring only a signal-dependent nuclear translocation protein within a short period of time with a simple operation from a gene library obtained with an arbitrary cell force that is, according to the method of the present invention, it is possible to efficiently clone the target gene that finally encodes the signal-dependent nuclear translocation protein. Furthermore, the target gene can be cloned more efficiently by transforming the cell under conditions in which an average of not more than one fusion gene is introduced into one cell. In addition, by repeating the introduction and fractionation of the gene library twice, it has become possible to clone only proteins that exhibit cytoplasmic nuclear translocation behavior.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the principle of implementation of the present invention.
  • a gene library or gene sub-library consisting of a gene group fused with a gene encoding a marker protein
  • the library of the present invention can be produced using appropriate means. For example, first create a suitable starting DNA (gene) library containing genes, and then use restriction enzymes. And by using a DNA recombination enzyme or the like to fuse the labeled protein to the gene group.
  • a commercially available gene library into which a gene group to be earned has been introduced in advance as the starting gene library.
  • the gene group constituting such a starting gene library may be the whole or a part of DNA derived from a specific species, organ, tissue, cell or the like. Since the main purpose of the present invention is cloning of nuclear translocation protein genes, the gene group used in the present invention is a cDNA library in which transcribed RNA is converted into cDNA and inserted into a vector. Those selected as much as possible are preferred.
  • the type of gene library 'form cell Any method known to those skilled in the art can be used depending on the type and the like. Representative examples thereof include various expression vectors prepared from virus vectors and the like, the calcium phosphate method, the lipofusion method, and the physical introduction methods such as the electoral mouth position, the microinjection and the particle gun.
  • the transformation in the method of the present invention is carried out under the condition that “the cells are transformed under the condition that substantially an average of 1 or less fusion gene is introduced into one cell”.
  • any virus known to those skilled in the art can be used as a virus from which the virus vector is based.
  • retroviruses such as RNA tumor virus, lentivirus, and spumavirus; paramyxoviruses such as Sendai virus; and adenovirus vectors.
  • retroviral vectors are preferred.
  • a gene group contained in an appropriate gene library as a starting material is inserted into the vector using a restriction enzyme and a DNA recombination enzyme, and the like.
  • a viral expression vector is prepared by growing in an appropriate host cell such as E. coli.
  • a gene encoding the labeled protein can be similarly introduced into the expression vector.
  • a viral vector into which a gene encoding a powerful marker protein has been introduced in advance is commercially available, and such a virus marker protein fusion plasmid vector can also be used.
  • the viral expression vector does not contain the viral gene necessary for replication. Therefore, a suitable helper cell (packaging cell) is used, and the viral expression vector is introduced into the producer cell. And transform (infect) the cells with the viral particles they produce.
  • transformation means, “under the condition that an average of one or less target genes are introduced into one cell on average. It is possible to appropriately set conditions suitable for transforming cells.
  • any protein known to those skilled in the art can be used as a substance used for detecting the expressed protein.
  • Typical examples of such substances are green, yellow, red, GFP (Green fluorescent protein), YFP (Yellow fluorescent protein), RFP (Red fluorescent protein) and BFP (Blue fluorescent protein) derived from jellyfish.
  • Examples include proteins that emit autofluorescence in various colors of visible light castles such as blue, or proteins that change in color over time.
  • the nucleus can be made fluorescent, and the above sorting method is applied. be able to.
  • a specific enzyme protein is used as the labeling protein and a substrate that produces a substance that emits fluorescence by the action of the enzyme protein is used, a fluorescent substance is formed in the nucleus. It becomes possible to have light, and the above sorting method can be applied.
  • the types of libraries and vectors used are not particularly limited. It can be selected as appropriate according to the conditions. For example, if a proliferating cell is used, but a viral vector derived from a virus species that can infect non-proliferating cells, such as a lentiviral vector, for example, screening for nuclear translocation proteins in non-proliferating cells. It becomes possible to do.
  • a viral vector derived from a virus species that can infect non-proliferating cells such as a lentiviral vector, for example, screening for nuclear translocation proteins in non-proliferating cells. It becomes possible to do.
  • an adenovirus vector makes it possible to introduce a gene effectively into cells that are in resting phase or slow in dividing growth.
  • an established cultured cell line is preferable.
  • cells transformed with the gene library express the gene group by culturing under appropriate conditions. Thereafter, in the steps (B) and (E), the transformed cells are cultured in the presence or absence of extracellular stimuli.
  • the signal transduction pathway in the transformed cell works according to the applied stimulus, and the nuclear translocating protein is transferred into the nucleus. To do.
  • extracellular stimulation for example, physical stimulation such as temperature and light, synthesis, etc. that cause the gene expression pattern to change in the cells
  • chemical stimuli such as natural chemicals, drugs, and changes in pH can be selected as appropriate.
  • the type of culture medium, culture temperature, pH, culture time, etc. used in each of the above steps are appropriately selected by those skilled in the art according to the conditions such as the type of cells used, the type of stimulation applied, and the strength. You can.
  • the culture conditions such as the intensity of stimulation and the culture time in steps (B) and (E) are determined according to the present invention so that a sufficient amount of the nuclear translocating protein is sufficient for clotting the signal-dependent nuclear translocation protein gene. It must be something that can be transferred into the nucleus.
  • the medium to be used is preferably a serum-free medium.
  • Nuclei fractionation in steps (C) and (F) of the method of the present invention can be performed using any means known to those skilled in the art based on the physical and physical properties of the labeled protein. . Therefore, for example, when a protein having autofluorescence is used as the labeling protein, and when the nucleus can be made fluorescent as a result as described above, the nucleus is determined based on the presence or absence of fluorescence. Sorting can be performed.
  • nuclei can be sorted in a short time. More specifically, nuclei can be sorted based on the presence or absence of fluorescence using a fluorescence activated cell sorter (FACS).
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • the cell from which the gene group is derived and the cell to be transformed with the library of the present invention may be of the same cell type or the same tissue origin, or they may be mutually. Different cell types or different animal species / tissue origins are acceptable.
  • Cells that are transformed with a gene library for the first time to sort nuclei and cells that are transformed with a gene sublibrary for the second time to sort nuclei are the same type of cells. Although it is preferable that it is a kind, another kind may be sufficient. Furthermore, these cells are usually tissue-derived cells, but when they are cells derived from different tissues, it is possible to screen for nuclear translocation proteins that are common to the cells in general.
  • the first transformation with the gene library and the second transformation with the gene sub-library can be performed by the same or different means, for example, viral vectors derived from different virus species. Alternatively, viral vectors with different indices can be used. It is also possible to use different labeled proteins.
  • a part of a gene group derived from the gene library or gene library contained in the sorted nucleus can be obtained by any method known to those skilled in the art.
  • PCR is performed using primers that can specifically amplify the gene group inserted into the vector used for transformation. Genes derived from gene libraries or gene sub-libraries can be easily obtained. Alternatively, it is possible to treat the separated nuclei to such an extent that the gene derived from the library can be amplified by PCR, and to perform PCR using the nuclei as a cage. In addition, the gene derived from the above library is obtained by PCR using the separated nuclei. If it is possible, PCR can be performed with the separated nuclei.
  • the number of types of genes that constitute a part of the gene group derived from the gene library or gene sub-library contained in these sorted nuclei is derived from the type of gene group that constitutes the starting gene library. Depending on various conditions such as the type of cells to be transformed and the type of stimulation, there are cases where only a few types or sometimes only one type of gene is included.
  • the fraction of nuclei from transformed cells can be obtained by appropriately selecting and combining any method known to those skilled in the art, such as mechanical disruption and chemical disruption with a surfactant.
  • the cell wall can be selectively destroyed and the nucleus can be preserved and removed (as is).
  • the signal-dependent nuclear import protein gene thus obtained can be cloned by an appropriate method known to those skilled in the art.
  • the cDNA group derived from the nucleoprotein cDNA sub-library is recovered by PCR, inserted into a retrovirus GFP fusion plasmid vector, and cloned.
  • Each loan can be checked to determine whether it is nuclear-dependent in a stimulus-dependent manner, and the cDNA sequence can be determined for those that translocate into the nucleus.
  • FIG. 1 shows a retrovirus that expresses a fusion protein in which green fluorescent protein (GFP) is fused to the amino terminal of the protein encoded by the cDNA inserted into the polycloning site, as described in the following examples.
  • GFP green fluorescent protein
  • a "retrovirus GFP fusion plasmid cDNA library” is prepared by inserting the cDNA library prepared for the target cell force into the vector. Packaging it Transgenic 'transformation into a cell line generates a retroviral GFP fusion viral cDNA library. This is the same type of culture as the cell under investigation After infecting cells and expressing the GFP fusion protein cDNA library (Fig. 1 [1]), the cells are stimulated outside the cell to activate the signal transduction system of transformed cells (Fig. 1 [2]).
  • Genomic DNA is also extracted from the collective power of the collected nuclei, and DNA-derived DNA is recovered by PCR. This is hereinafter referred to as “nuclear protein cDNA sub-library”.
  • nuclear protein cDNA sub-library By inserting the nuclear protein cDNA sublibrary into a retroviral GFP fusion plasmid vector and transfecting the packaging cell line as described above, a retroviral GFP fusion nuclear protein virus cDNA sublibrary is generated, By infecting this with the same type of cultured cells, the GFP-fused nuclear protein cDNA sub-library is introduced.
  • the cDNA group derived from the nucleoprotein cDNA sublibrary is recovered by PCR, inserted into a retrovirus GFP fusion plasmid vector, cloned, and each clone cloned. Check whether it is nuclear-dependent, stimulus-dependent. Nuclear Determine the cDNA sequence for those that are internalized.
  • Example Nuclei in vascular smooth muscle cells in response to stimulation with PDGF (platelet-derived growth factor)
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • retrovirus GFP fusion plasmid cDNA library (virus vector)
  • pLEGFP-C1 Commercially available pLEGFP-C1 (Clontech) was used as the retrovirus GFP fusion plasmid vector.
  • a cDNA library of vascular smooth muscle cells was obtained by PCR amplification of the insert portion using the MATCHMAKER human aorta library (BD Bioscience—Clontech # 638813 (for yeast two-hybrid screening)) as a cage. .
  • MATCHMAKER human aorta library BD Bioscience—Clontech # 638813 (for yeast two-hybrid screening)
  • This is slightly different from a general cDNA library construction method, but a library prepared by such a simple method can be sufficiently used to demonstrate the effectiveness of the present invention.
  • the MATCHMAKER cDNA library uses an adapter with a Sail cleavage site at the time of construction, with the force previously revealed by DNA sequencing, cleaving upstream of the PCR product in the cDNA library. Is also the power that was intended to use the sail part derived from this adapter.
  • PCR was performed under the following reaction conditions.
  • the reaction solution is as follows.
  • the PCR product was cleaved with Sail and BamHI by a conventional method, and then ligated to a retroviral GFP fusion plasmid vector that had been cleaved in advance (1a).
  • the ability to examine whether or not the protein ER K1 cDNA that is known to be translocated into the nucleus by PDGF is concentrated. Appearance of ER K1 cDNA in the cDNA library
  • the following procedure was performed to intentionally cut the ERK1 cDNA to some extent by restriction enzymes.
  • the entire ligated product was digested with the restriction enzyme Apal at 25 ° C for 15 minutes at a concentration of 0.1 U / 1, 20 1 scale.
  • This step also has the effect of reducing self-ligated pLEGFP—C1. That Thereafter, transformation was carried out by electo-pore positioning on Electo-mouth-competent E. coli ElectroMAX DH10B Tl Phage- Resistant Competent Cells (Invitrogen). Collected can force the colonies came out the next day, after titration, was amplified approximately 5xl0 7 cfu phase question plasmid on LB plates. From here, the plasmid was purified for CONCERT High Purity Plasmid Purification System (Marngen Biosciences: ⁇ ) to obtain a retroviral GFP fusion plasmid cDNA library.
  • CONCERT High Purity Plasmid Purification System Marngen Biosciences: ⁇
  • the SM3 cell line was seeded on 20 100 mm dishes at a density of about 20%, and 10% FCS-containing DMEM medium was cultured in 10 ml per dish at 37 degrees under humid conditions. After 12 hours, add 1 ml of the solution containing the retrovirus GFP fusion virus cDNA library obtained in (2) per petri dish to make a polyprene (Hexadimethrine Bromide) aqueous solution to a final concentration of 8 g / ml. Then, the cells were returned to the incubator and cultured for 48 hours.
  • FCS-containing DMEM medium was cultured in 10 ml per dish at 37 degrees under humid conditions. After 12 hours, add 1 ml of the solution containing the retrovirus GFP fusion virus cDNA library obtained in (2) per petri dish to make a polyprene (Hexadimethrine Bromide) aqueous solution to a final concentration of 8 g / ml. Then, the cells were returned to the incubator and cultured
  • Plasma membrane removal and nuclear fixation The method described in Chapter 12 of Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons) was used with some modifications. The cells were washed twice with PBS and then detached from the petri dish with 0.05% Trypsin, 0.5 mM EDTA. The supernatant was discarded with decantation, and the volume of cell sediment was measured (hereinafter referred to as 1 volume). Next, it was suspended in 5 volumes of a “low osmotic pressure buffer” (shown below) and centrifuged in a microcentrifuge at 15,000 rpm for 20 seconds. The supernatant was then drained and suspended in a hypotonic buffer so that the final volume was 3 volumes.
  • a “low osmotic pressure buffer” shown below
  • the nucleus was weakly fixed to prevent leakage of nuclear proteins. Specifically, first, the nuclear precipitate was suspended in 4 ml of PBS, and 1 ml of 18.5% formalin solution was slowly added drop by drop while vortexing vigorously.
  • the composition of the low osmotic pressure buffer is 10 mM HEPES, pH 7.9 (4 ° C), 1.5 mM MgCl
  • Formalin-fixed nuclei were washed 3 times with FACS Flow (Betaton Dickinson) and suspended in 20 mL of the same solution (20 petri dishes). This was collected using a Betaton Dickinson FACS Calibur to collect only the fluorescent nuclei. Out of approximately 7 4xl0 nuclei, 5716 fluorescent nuclei were obtained.
  • the collected nuclei were precipitated, suspended in 200 mM NaCl 200 ⁇ 1, and incubated at 65 ° C. Add 1M Tris (pH 6.8) 10 ⁇ 1, 0.5 ⁇ EDTA 5 ⁇ ⁇ , 2 ⁇ ⁇ ( ⁇ 5 mg / ml Proteinase K, and put it at 45 ° C for 2 hours to degrade the protein. After removal, the genomic DNA is extracted with phenol-chloroform and ethanol precipitated.
  • the cDNA derived from the cDNA library in the genomic DNA thus obtained was recovered by PCR as follows.
  • the primer used the following combination. These are based on sequences outside the cDNA insertion site of the retroviral GFP fusion plasmid vector. I have to.
  • AAACCTACAGGTGGGGTCTTTCATTCCC-3 (SEQ ID NO: 4)
  • PCR was performed under the following reaction conditions.
  • the reaction solution is as follows.
  • the plasmid of the nucleoprotein plasmid cDNA sublibrary obtained in (8) above was transfected into AmphoPack293 (Clontech), and the supernatant containing the nucleoprotein virus cDNA sublibrary was recovered.
  • AmphoPack293 Cell-based Biotech
  • three 100mm petri dish AmphoPack293 cells, about 1. 5xl0 6 cells were seeded per dish, 37 ° C, and cultured in a wet condition (10% FCS input Rino DMEM medium) After 24 hours, Lipofectamine2000 ( Using Invitrogen 1 20 ⁇ g of nucleoprotein plasmid cDNA sub-library per petri dish was transiently transfected. After 48 hours, the supernatant containing the nuclear protein virus cDNA sublibrary was collected and stored at ⁇ 80 ° C.
  • the SM3 cell line was seeded on 20 100 mm dishes at a density of about 20%, and 10% FCS-containing DMEM medium was cultured in 10 ml per dish at 37 degrees under humid conditions. After 12 hours, add 1 ml of the nucleoprotein virus cDNA sublibrary solution prepared in (9) above to each dish, and add an aqueous solution of polyprene (described above) to a final concentration of 8 / z gZml. The culture was continued for 48 hours after returning to the incubator.
  • Formalin-fixed nuclei were washed 3 times with FACS Flow (Betaton Dickinson) and suspended in 20 mL of the same solution (20 petri dishes). Using the Betaton Dickinson FACS Calibur, only nuclei with almost no fluorescence intensity were collected. In the first sorting, we obtained 1255 non-fluorescent nuclei out of 6 l.OxlO nuclei.
  • the nucleoprotein cDNA sublibrary-derived cDNA in the genomic DNA thus obtained was recovered by PCR as in (8). After recloning in pLEGFP-Cl, PCR was performed in order to confirm nuclear translocation by transient transfer one clone at a time. The product is cleaved with Sail and BamHI, pLEGFP—C1 is cut with the same enzyme, and inserted into the same. went . The colonies that emerged were collected and a “pool of PDGF signal-dependent nuclear translocation protein cDNAs” was created.
  • MAP kinase One type of MAP kinase, ERK1, is known to translocate cytoplasmic power into the nucleus in a signal-dependent manner in vascular smooth muscle cells.
  • the inventor confirmed by sequencing how the human ERK1 sequence occupies the above-mentioned Boolean.
  • the sequencing primer was pLEGFP-CI-fwd and was performed by a conventional method.
  • Example Isolation of proteins that translocate into the nucleus in response to stimulation with PDGF (platelet-derived growth factor) in vascular smooth muscle cells
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the retrovirus YFP fusion plasmid vector was constructed by recombinant DNA manipulation as follows based on a commercially available product.
  • a type of retroviral expression plasmid vector pLIB (Clontech) was used. It was.
  • PCR amplification was performed from the CMV promoter portion of the EYFP (YFP mutant with strong fluorescence intensity) expression vector, pEYFP-Cl (Clontech) to the EYFP cDNA and the polycloning site to the SV40 polyadenine-capped signal. It was inserted into the polycloning site. Specifically, the following experimental operation was performed.
  • pLIB was cleaved with Sfil by a conventional method, and stump dephosphorylation treatment was performed using urinary intestinal alkaline phosphatase.
  • a part of pEYFP-C1 was amplified using the following primer set. Both have a Sfil site at the 5 'end and several bases to improve cleavage, and direct the PCR product to two different Sfil sites in the pLIB multicloning site. It becomes possible to insert it in! Sfil recognizes the base sequence of GGCCNNNNNGGCC and cuts DNA. N does not work with any base. Therefore, the stumps of two Sfil sites with different NNNNN parts cannot be combined. Therefore, using this method, a known method is used to make the directionality constant.
  • the PCR conditions are as follows.
  • the reaction liquid is as follows.
  • the product was cleaved with Sfil by a conventional method, and ligated by a conventional method with pLIB that had been cleaved with the same enzyme. After transforming into E. coli and confirming that the construction was as planned, we completed the work. The resulting vector was confirmed to fluoresce yellow when irradiated with excitation light by applying normal light to HEK293 cells, and DNA sequencing was performed according to the normal method. And I also confirmed that. This completed plasmid vector was called pLEYFP-C1.
  • Formalin-fixed nuclei were washed 3 times with FACS Flow (Betaton Dickinson) and suspended in 20 mL of the same solution (20 petri dishes). This was collected using a Betaton Dickinson FACS Calibur to collect only the fluorescent nuclei. Of the 1. lxlO 7 nuclei, 7714 fluorescent nuclei were obtained.
  • Formalin-fixed nuclei were washed 3 times with FACS Flow (Betaton Dickinson) and suspended in 20 mL of the same solution (20 petri dishes). Using the Betaton Dickinson FACS Calibur, only the nuclei with almost no fluorescence intensity were collected (the gate was based on the non-fluorescent nuclei in the first sorting. About l.OxlO 6 nuclei) Of these, 1821 non-fluorescent nuclei were obtained.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the retrovirus RFP fusion plasmid vector was constructed by recombinant DNA manipulation based on a commercially available product as follows.
  • a kind of retroviral expression plasmid vector pLIB (Clontech) was used.
  • PCR amplification of the RFP expression vector, pDsRed2-Cl (Clontech) CMV promoter, ERFP cDNA, polycloning site, and SV40 polyadenine-linked signal was also PCR-amplified and inserted into the polycloning site of pLIB. Specifically, the following experimental operation was performed.
  • pLIB was cleaved with Sfil by a conventional method, and a dephosphorylation treatment of stumps was performed using urine small intestine alkaline phosphatase.
  • PCR amplification of a part of pDsRed2-C1 was performed using the following primer set. Both have a Sfil site at the 5 'end (and a few bases to improve the scission), and the PCR product is placed in two different Sfil sites in the pLIB multicloning site. It is possible to insert in the direction.
  • PCR conditions are as follows.
  • reaction solution 95 ° C for 1 minute ⁇ (95 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 2 minutes) x20 cycles ⁇ 68 ° C for 2 minutes ⁇ 4 ° C for cooling
  • the reaction solution is as follows.
  • the product was cleaved with Sfil by a standard method, and ligated by a standard method with pLIB that had been cleaved with the same enzyme. After transforming into E. coli and confirming that the construction was as planned, we completed the work. The resulting vector was confirmed to fluoresce red when excited by applying normal light to HEK293 cells, and DNA sequencing was performed according to the standard method. I also confirmed it. This completed plasmid vector will be referred to as pLRFP-C1.
  • Formalin-fixed nuclei were washed 3 times with FACS Flow (Betaton Dickinson) and suspended in 20 mL of the same solution (20 petri dishes). This was collected using a Betaton Dickinson FACS Calibur to collect only the fluorescent nuclei. Of the 1. lxlO 7 nuclei, 8154 fluorescent nuclei were obtained.
  • a signal-dependent nuclear translocation protein on the IL-2 signaling pathway of a human T-cell leukemia strain (Jurkat) was screened in the same manner as in Example 1.
  • 18 clones contained NF-AT known as IL 2-dependent nuclear translocation protein.
  • the proteins contained in 92 clones including 18 clones actually translocate into the nucleus.
  • the method of the present invention can also be used to search for proteins that translocate into the nucleus in response to physical stimuli, chemical stimuli, and the like. For example, in certain types of cells, changes in gene expression patterns can be seen by sensing external stimuli such as changes in temperature, light, pH, etc., but it can also be applied to searching for signal transmission pathways in such cases. . It can also be widely used as a test method for measuring the effects of various synthetic and natural substances including drugs on cells.
  • a DNA chip obtained by the method of the present invention or a part of the nuclear translocation protein gene or a part thereof as a probe, or a protein chip in which the nuclear translocation protein is arrayed are produced. I can do it. Furthermore, by using such a chip, it becomes possible to comprehensively analyze changes in the transcription amount of the nuclear translocation protein gene, DNA binding ability and characteristics of the nuclear translocation protein, and the like.

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Description

明 細 書
シグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子の取得方法
技術分野
[0001] 本発明は、シグナル依存性核内移行蛋白質の取得方法に関するものであり、特に、 低発現の増殖'分化関連蛋白遺伝子を、効率的に且つ特異的にクローユングするこ とが出来る方法に関する。
背景技術
[0002] 従来、新しいシグナル伝達分子を探索する際には、主として次の 2つの方法が使わ れていた。（1)既知のシグナル伝達分子との相互作用を利用する方法。例えば、既 知の分子をカラム基質に結合させたァフィユティーカラムに細胞抽出液を通すことに より相互作用分子群を得るなど、 invitroにおける結合を利用する方法がある。また、 酵母 Two— hybridスクリーニング法のように細胞内での結合を利用して相互作用蛋 白群を得る場合もある。
[0003] (2)リン酸化を利用する方法。例えば、既知のシグナル伝達分子とのキナーゼ-基質 関係にある蛋白を得る、あるいは細胞外刺激を与えた際にリン酸ィ匕される蛋白を検 索するなどの手段がとられた。
[0004] 上記（1)の例は非特許文献 1、上記（2)の例は、非特許文献（2)に開示されて 、る。
非特許文献 1には、 TGF— |8経路のシグナル伝達分子 TAK— 1を活性ィ匕する蛋白 TAB— 1が発見された経緯が記載されている。また、非特許文献 2には、チロシンキ ナーゼ活性を持つ精製した既知のシグナル分子を用いて cDNA発現ライブラリーを リン酸化させ、基質を探索する方法が記載されている。
[0005] しかしながら、これら従来の方法には共通して、主に次の 2つの欠点がある。一つ目 は、相互作用分子群、あるいはキナーゼの基質の中に実際に細胞内で重要な役割 を果たす蛋白が存在する力否かが不明なことである。もう一つは、たとえそのような蛋 白が存在したとしても極めて多数の候補分子群の中力 見つけ出すには、非常に大 きな労力と時間を要することである。
非特許文献 1 : Science,第 272卷， 1179〜1182頁， （1996年） 非特許文献 2 : Methods in Molecular Biology,第 218卷， 133〜141頁（200 3年）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] このように、シグナル依存的に核内あるいは核外に移行するタンパク質はごく稀な 存在であるため、上記のような従来の技術では、任意の細胞力も構築した cDNAライ ブラリーから網羅的にその遺伝子を取得するには、膨大な作業時間を要するという問 題があった。従って、本発明は、任意の細胞力も取得した DNAライブラリーの中から 単純な操作でしかも短時間にシグナル依存性核内移行蛋白質だけを効率的に取得 する方法を提供することを目的として！、る。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は、以下の態様にかかるものである。
[1]シグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子の取得方法であって、
(A)標識蛋白質をコードする遺伝子と融合した遺伝子群からなる遺伝子ライブラリー を用いて該細胞を形質転換し、遺伝子群を発現させる工程、
(B)細胞外刺激の存在下で該形質転換細胞を培養する工程、
(C)該形質転換細胞から核を分画した後、遺伝子群から発現された蛋白質と標識蛋 白質との融合蛋白質を含む核を分取する工程、
(D)分取して得られた核に含まれる遺伝子ライブラリー由来の一部の遺伝子群から なる遺伝子サブライブラリーを用いて該細胞を形質転換し、遺伝子群を発現させるェ 程、
(E)細胞外刺激の非存在下で該形質転換細胞を培養する工程、
(F)該形質転換細胞から核を分画した後、遺伝子群から発現された蛋白質と標識蛋 白質との融合蛋白質を含まない核を分取する工程、及び
(G)分取された核内に含まれる遺伝子サブライブラリー由来の一部の遺伝子群から なるシグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子をクローユングする工程
を含む、前記取得方法。
[2]シグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子の取得方法であって、 (A)標識蛋白質をコードする遺伝子と融合した遺伝子群からなる遺伝子ライブラリー を用いて該細胞を形質転換し、遺伝子群を発現させる工程、
(B)細胞外刺激の非存在下で該形質転換細胞を培養する工程、
(C)該形質転換細胞から核を分画した後、遺伝子群から発現された蛋白質と標識蛋 白質との融合蛋白質を含まない核を分取する工程、
(D)分取して得られた核に含まれる遺伝子ライブラリー由来の一部の遺伝子群から なる遺伝子サブライブラリーを用いて該細胞を形質転換し、遺伝子群を発現させるェ 程、
(E)細胞外刺激の存在下で該形質転換細胞を培養する工程、
(F)該形質転換細胞から核を分画した後、遺伝子群から発現された蛋白質と標識蛋 白質との融合蛋白質を含む核を分取する工程、及び
(G)分取された核内に含まれる遺伝子サブライブラリー由来の一部の遺伝子群から なるシグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子をクローユングする工程
を含む、前記取得方法。
[3]遺伝子群が cDNAライブラリーから選択される、上記 1又は 2記載の方法。
[4]工程 (A)及び Z又は (D)において、遺伝子ライブラリーがウィルスベクターにより 導入される、上記 1、 2又 3は記載の方法。
[5]ウィルスがレトロウイルスである、上記 1〜4のいずれか一項に記載の方法。
[6]標識蛋白質が蛍光蛋白質である、上記 1〜5のいずれか一項に記載の方法。
[7]蛍光が可視光域である、上記 6記載の方法。
[8]蛍光蛋白質が GFPである上記 7に記載の方法。
[9]蛍光蛋白質が YFPである上記 7に記載の方法。
[10]蛍光蛋白質が RFPである上記 7に記載の方法。
[11]標識蛋白質が抗原性蛋白質である、上記 1〜5の 、ずれか一項に記載の方法 [ 12]標識蛋白質が酵素である、上記 1〜5の 、ずれか一項に記載の方法。
[13]ェ程( 及び7又は ）において、核の分取を蛍光の有無に基づき行う、上記
6〜 12のいずれか一項に記載の方法。 [ 14] FACSを用 、て核の分取を行う、上記 13記載の方法。
[15]細胞が榭立培養細胞株である、上記 1〜14のいずれか一項に記載の方法。
[ 16]形質転換細胞力も核のみを取り出す為に細胞膜を破壊する、上記 1〜 15のい ずれか一項に記載の方法。
[17]工程 (B)及び Z又は (E)において、無血清培地で該形質転換細胞を培養する 、上記 1〜16のいずれか一項に記載の方法。
[18]工程 (A)及び Z又は (D)において、 1個の細胞内に実質的に平均 1つ以下の 融合遺伝子が導入される条件下で該細胞を形質転換する、請求項 1〜17のいずれ か一項に記載の方法。
発明の効果
[0008] 本発明により、任意の細胞力 取得した遺伝子ライブラリーの中から単純な操作でし 力も短時間にシグナル依存性核内移行蛋白質だけを効率的に取得する方法が提供 される。即ち、本発明方法によって、最終的にシグナル依存性核内移行蛋白質をコ ードする対象遺伝子を効率的にクローユングすることが可能となる。更に、 1個の細胞 内に実質的に平均 1つ以下の融合遺伝子が導入される条件下で該細胞を形質転換 することによって、より効率的に該対象遺伝子をクローユングすることが可能となる。 又、遺伝子ライブラリーの導入と分取を 2回繰り返すことで細胞質力 核内移行の挙 動を示す蛋白質に限定してクロー-ングすることが可能となった。更に、標識として蛍 光を使用し、蛍光の有無を基準に多数の微粒子を短時間で分取するのに用いられ る装置を利用して細胞膜を破壊した核の分取を行う場合には、核局在を基準に、極 めて多数のクローンを高速に弁別することができる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]本発明の実施の原理を説明するための図である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明において、標識蛋白質をコードする遺伝子と融合した遺伝子群からなる遺伝 子ライブラリー又は遺伝子サブライブラリー（以下、まとめて「本発明ライブラリー」とも いう）は、当業者に公知の適当な手段を用いて作製することができる。例えば、まず 遺伝子群を含む適当な出発 DNA (遺伝子)ライブラリーを作製し、更に、制限酵素 及び DNA組換え酵素等を用いて標識蛋白質を該遺伝子群に融合させることによつ て作製することが出来る。或いは、カゝかる遺伝子群が予め導入されている市販の遺 伝子ライブラリーを出発遺伝子ライブラリ一として利用することも可能である。
[0011] このような出発遺伝子ライブラリーを構成する遺伝子群は、ある特定の種、器官、組 織、若しくは細胞等に由来する DNAの総体又はその一部であっても良い。又、本発 明の主な目的は核内移行性蛋白質遺伝子のクローユングであるので、本発明で使 用する遺伝子群としては、転写された RNAを cDNAに変換してベクターに挿入され た cDNAライブラリ一力も選択されたものが好ましい。
[0012] 本発明において、標識蛋白質をコードする遺伝子と融合した遺伝子群からなる遺伝 子ライブラリーを用いて細胞を形質転換 (遺伝子導入)する手段としては、遺伝子ライ ブラリーの種類 '形態、細胞の種類等に応じて当業者に公知の任意の方法を使用す ることが出来る。その代表例として、ウィルスベクター等から作製された各種の発現べ クタ一、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、並びに、エレクト口ポレーシヨン、マイ クロインジェクション及びパーティクルガン等の物理的導入法を挙げることが出来る。 本発明方法における形質転換を、「1個の細胞内に実質的に平均 1つ以下の融合遺 伝子が導入される条件下で該細胞を形質転換する」という条件下で行うことによって
、最終的なクローユングの効率をより高めることが可能となる。
[0013] ウィルス感染においては、ウィルス干渉現象によって、既にウィルス感染した宿主細 胞には、近縁の細胞は重感染することが出来ない。従って、標識蛋白質をコードする 遺伝子と融合した遺伝子群を有するウィルス発現ベクターを含むウィルス粒子で細 胞を感染することによって、上記の「1個の細胞内に実質的に平均 1つ以下の融合遺 伝子が導入される条件下で該細胞を形質転換する」 t ヽぅ好適条件を容易に達成す ることが出来る。従って、本発明においては、ウィルスベクターを使用することが好ま しい。
[0014] ウィルスベクターの元になるウィルスは当業者に公知の任意の種類を使用することが 出来る。例えば、 RNA腫瘍ウィルス、レンチウィルス、及びスプマウィルス等のレトロ ウィルス；センダイウィルス等のパラミクソウィルス；並びに、アデノウイルスベクター等 を挙げることが出来る。この中で、レトロウイルスベクターを使用した場合には、導入 遺伝子が宿主細胞のゲノム内に組み込まれるために、本発明にお 、て細胞の形質 膜を除去して核のみにする際に導入した遺伝子が核外に漏出してしまう恐れがない こと力ら、レトロウイルスベクターが好適である。
[0015] ウィルスベクターを使用する場合には、出発原料である適当な遺伝子ライブラリーに 含まれる遺伝子群を、制限酵素及び DNA組換え酵素等を用 、て該ベクター内に挿 入し、これを大腸菌等の適当な宿主細胞中で増殖させることによってウィルス発現べ クタ一を作製する。尚、標識蛋白質をコードする遺伝子も同様に該発現べクタ一へ導 入することが出来る。或いは、力かる標識蛋白質をコードする遺伝子が予め導入され ているウィルスベクターが市販されており、このようなウィルス標識蛋白質融合プラス ミドベクターを使用することも可能である。
[0016] 通常、ウィルス発現ベクターには複製に必要なウィルス遺伝子が入っていないため に、適当なヘルパー細胞 (パッケージング細胞）を使用して、これにウィルス発現べク ターを導入してプロデューサー細胞を作成し、これが産生するウィルス粒子を用いて 細胞を形質転換 (感染)する。
[0017] 同様に、当業者であれば、上記の任意の形質転換 (遺伝子導入)手段において、「1 個の細胞内に実質的に平均 1つ以下の対象遺伝子が導入される条件下で該細胞を 形質転換する」 t ヽぅ好適条件下を適宜設定することが可能である。
[0018] 本発明方法で使用する標識蛋白質は、発現した蛋白質の検出に使用する物質とし て当業者に公知の任意の蛋白質を使用することが出来る。このような物質の代表例と して、ォワンクラゲ由来の GFP (Green fluorescent protein)、 YFP (Yellow fluorescent protein)、 RFP (Red fluorescent protein)及び BFP (Blue fluorescent protein)のよう な緑、黄色、赤、青等の可視光城の多彩な色彩で自家蛍光を発する蛋白質、又は、 経時に色彩が変化する蛋白質を挙げること出来る。更には、赤外光城や紫外光城の 蛍光を発する蛋白質を使用することも可能である。
[0019] また、標識蛋白質として特定の抗原性を持つ蛋白質を用い、その抗原性を認識する 蛍光抗体を用いれば、核に蛍光を持たせることが可能となり、上記の分取の方法を 適用することができる。更に、標識蛋白質として特定の酵素蛋白質を用い、その酵素 蛋白質の働きにより、蛍光を発する物質が産生されるような基質を用いれば、核に蛍 光を持たせることが可能となり上記の分取の方法を適用することができる。
[0020] 本発明のライブラリーで形質転換する細胞としては、動物細胞及び植物細胞等の核 を有する真核細胞である限り、その種類に特に制約はなぐ使用するライブラリー及 びベクターの種類等に応じて適宜選択することが出来る。例えば、通常は増殖性の 細胞を用いるが、非増殖性の細胞でも感染できるウィルス種由来のウィルスベクター 、例えば、レンチウィルスベクターを用いる場合には、非増殖性細胞において核内移 行蛋白質をスクリーニングすることが可能となる。或いは、アデノウイルスベクターを使 用すると、休止期又は分裂増殖の遅い細胞に有効に遺伝子を導入することが可能と なる。又、形質転換後に、一定期間培養して導入された遺伝子が発現される必要が あるので、榭立された培養細胞株が好ましい。
[0021] 本発明の工程 (A)及び (D)において、遺伝子ライブラリーを用いて形質転換された 細胞は適当な条件下で培養することによって遺伝子群を発現する。その後、工程 (B )及び (E)において、細胞外刺激の存在下又は非存在下で該形質転換細胞を培養 する。細胞外刺激の存在下での工程 (B)又は (E)における培養中に、加えられた刺 激に応じて形質転換細胞中のシグナル伝達経路が働き、核内移行性蛋白質が核内 に移行する。
[0022] 形質転換した細胞に加える細胞外刺激の種類に特に制限はなぐ目的等に応じて、 例えば、細胞に遺伝子発現パターンの変化を生じさせるような、温度や光等の物理 的刺激、合成あるいは天然化学物質、薬物、 pHの変化等の化学的刺激力 適宜選 択することが出来る。
[0023] 以上の各工程で使用する培地の種類、培養温度、 pH,培養時間等は、使用する細 胞の種類、加える刺激の種類及び強度等の条件に応じて当業者が適宜選択するこ とが出来る。工程 (B)及び (E)における刺激の強度及び培養時間等の培養条件は、 本発明にお 、てシグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子がクローユングできるため に十分な量の核内移行性蛋白質が核内に移行できるようなものである必要がある。
[0024] 尚、血清に含まれる増殖因子等による影響を排除して、細胞外から加えた刺激によ る影響を出来るだけ顕著に検出するために、培養条件工程 (B)及び (E)で使用する 培地は無血清培地で行うことが好まし 、。 [0025] 本発明方法の工程 (C)及び (F)における核の分取は、標識蛋白質が有する物理ィ匕 学的性質に基づき、当業者に公知の任意の手段を用いて行うことが出来る。従って、 例えば、標識蛋白質として自家蛍光を有する蛋白質を使用する場合、及び、上記の ように結果的に核に蛍光を持たせることができるような場合には、蛍光の有無に基づ き核の分取を行うことが出来る。
[0026] 更に、核の分取はフローサイトメトリーを用いて行うことによって、多数の核を短時間 で分取することが可能となる。より具体的には、蛍光活性ィ匕セルソーター (FACS)を 用いて蛍光の有無に基づく核の分取を行うことが出来る。
[0027] 尚、遺伝子群が由来する細胞と、本発明のライブラリーによる形質転換の対象となる 細胞とは同一の細胞種若しくは同じ組織起源の細胞のものでも良いし、又は、これら は互 、に異なる細胞種若しくは異なる動物種 ·組織起源のものでも良 、。
[0028] 初回に遺伝子ライブラリーで形質転換させて核を分取する細胞と、 2回目に遺伝子サ ブライブラリーで形質転換させて核を分取する細胞が同一種類の細胞とは、互いに、 同一種類であることが好ましいが、別種類であっても良い。更に、通常、これら細胞は 互いに組織由来の細胞であるが、異なる組織由来の細胞である場合には、細胞一般 に共通する核内移行蛋白をスクリーニングすることが可能となる。
[0029] 同様に、遺伝子ライブラリーによる初回の形質転換と遺伝子サブライブラリーによる 2 回目の形質転換とは同じ又は別の手段で行うことも可能があり、例えば、異なるウイ ルス種由来のウィルスベクターや、異なる指標をもつウィルスベクターを使用すること もできる。更に、異なる標識蛋白質を使用することも可能である。
[0030] 本発明において、分取した核に含まれる遺伝子ライブラリー又は遺伝子サブライブラ リー由来の一部の遺伝子群は、当業者に公知の任意の方法で取得することが出来る
。例えば、分取した核力 抽出したゲノム DNAを铸型に使用し、形質転換に使用し たベクターに挿入されていた遺伝子群を特異的に増幅することができるプライマーを 用いて PCRを行なうことによって、遺伝子ライブラリー又は遺伝子サブライブラリ一由 来の遺伝子を容易に取得することが出来る。或いは、上記ライブラリー由来の遺伝子 を PCRで増幅できる程度に、分取した核を処理し、それを铸型にして PCRを行うこと も可能である。又、分取した核のまま PCRにて上記ライブラリー由来の遺伝子を取得 することが可能なのであれば、分取した核のまま PCRを行うことも可能である。尚、こ れらの分取した核に含まれる遺伝子ライブラリー又は遺伝子サブライブラリー由来の 一部の遺伝子群を構成する遺伝子の種類数は、出発遺伝子ライブラリーを構成する 遺伝子群の種類'由来、形質転換される細胞の種類、及び刺激の種類等の各種条 件によって変動し、数種類、ときには一種類の遺伝子のみカゝらなる場合もある。
[0031] 形質転換細胞からの核の分画は、機械的破壊法及び界面活性剤による化学的破壊 法等の当業者に公知の任意の方法を適当に選択'組み合わせることによって、細胞 膜 (場合によっては、更に細胞壁)を選択的に破壊し、核を温存して (そのままの状態 で）取り出すことによって行うことが出来る。
[0032] 最後に、こうして取得されたシグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子は、当業者に公 知の適当な方法でクローユングすることが出来る。最後に、この核力もゲノム DNAを 抽出した後、 PCRにて核蛋白 cDNAサブライブラリー由来の cDNA群を回収し、レト ロウィルス GFP融合プラスミドベクターに挿入してクローユングし、必要に応じて、 1ク ローンずつ、刺激依存性に核内移行するかどうかチェックし、核内移行するものにつ V、て cDNAの配列を決定することが出来る。
[0033] 以下、本発明の一態様を添付の図 1を参照しながら更に詳しく説明する。
ここで、図 1の [1]は請求項 1における工程 (A)、 [2]は請求項 1における工程 (B)、 [3]は請求項 1における工程 (C)、 [4]は請求項 1における工程 (D)及び (E)、並び に、 [5]は請求項 1における工程 (F)に夫々対応するものである。図 1は、以下の実 施例に記載されるように、ポリクローユングサイトに挿入した cDNAがコードする蛋白 のァミノ末端に緑色蛍光蛋白質 (GFP)が融合した融合蛋白質が発現するようなレト ロウィルス発現プラスミドベクターを使用した場合を示したものである。これを以下、「 レトロウイルス GFP融合プラスミドベクター」（本発明のウィルスベクターに相当する）と 称する。
[0034] 該ベクターに対象の細胞力 調製した cDNAライブラリーを挿入することにより、「レト ロウィルス GFP融合プラスミド cDNAライブラリー」を作成する。それをパッケージング 細胞株にトランジェント'トランスフエクシヨンをすることにより、レトロウイルス GFP融合 ウィルス cDNAライブラリーを生成させる。これを調査対象の細胞と同一種類の培養 細胞に感染させ、 GFP融合蛋白 cDNAライブラリーを発現させた後（図 1の [1])、細 胞外刺激を与え、形質転換細胞のシグナル伝達系を働かせる（図 1の [2] )。
[0035] その結果、核に蛍光を持つ細胞に内在する cDNAライブラリー由来の cDNAがコー ドする蛋白は次の 3通り存在する。
(1)刺激に応じて核内移行する蛋白（図 1の細胞 a、 b)、
(2)刺激の存在に依らず細胞全体に局在する蛋白（図 1の細胞 d)、
(3)刺激の存在に依らず核に局在して 、る蛋白（図 1の細胞 e)。
[0036] 次に、界面活性剤などを用いて核膜を保存しつつ細胞膜のみを破壊する処理を施 すと、細胞質は流出し核のみが残るが、この時、核に蛍光を持つもののみを分取装 置つきの FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)を用いて回収する（図 1の [3])
[0037] 集めた核の集団力もゲノム DNAを抽出し、 PCRにて cDNAライブラリー由来の DN Aを回収する。以下これを「核蛋白 cDNAサブライブラリー」と称することにする。核蛋 白 cDNAサブライブラリーをレトロウイルス GFP融合プラスミドベクターに挿入し、既 述のごとくパッケージング細胞株にトランスフエクシヨンすることにより、レトロウイルス G FP融合核蛋白ウィルス cDNAサブライブラリーを生成させ、これをと同一種類の培 養細胞に感染させることにより、 GFPが融合した核蛋白 cDNAサブライブラリーを導 入する。
[0038] 今度は細胞外刺激なしの状態で培養し（図 1の [4])、既述のごとく細胞膜除去を行 つた後、 FACSにて蛍光のない核のみを分取してくる（図 1の [5])。すると、核蛋白 c DNAサブライブラリーがコードする既述の 3通りの蛋白のうち、（2)刺激の存在に依 らず細胞全体に局在する蛋白（図 1の細胞 d)及び（3)刺激の存在に依らず核に局在 している蛋白（図 1の細胞 e)は、核に蛍光を持っため除去される。それ故、 2度目の F ACSで分取された核の集団に内在する核蛋白 cDNAサブライブラリー由来の cDN Aは、「シグナル依存性に核内移行する蛋白群」のみをコードしていることになる。
[0039] 最後に、この核力 ゲノム DNAを抽出した後、 PCRにて核蛋白 cDNAサブライブラリ 一由来の cDNA群を回収し、レトロウイルス GFP融合プラスミドベクターに挿入してク ローニングし、丄クローンずつ、刺激依存性に核内移行するかどうかチェックする。核 内移行するものについて、 cDNAの配列を決定する。
[0040] 以下に、実施例を参照しつつ本発明を更に詳述する。尚、特に記載のない限り、当 該技術分野にぉ 、て公知の標準的な手法を用いて実施した。
実施例 1
[0041] 実施例：血管平滑筋細胞において、 PDGF (血小板由来増殖因子）の刺激に反応し て核
内移行する蛋白群の単離
(1) レトロウイルス GFP融合プラスミド cDNAライブラリー（ウィルスベクター）の構築 レトロウイルス GFP融合プラスミドベクターとしては、市販の pLEGFP— C1 (クロンテ ック社）を用いた。また血管平滑筋細胞の cDNAライブラリ一は、 MATCHMAKER ヒト大動脈ライブラリー（BDバイオサイエンス—クロンテック社 # 638813 (酵母 Two -hybridスクリーニング用））を铸型にして、インサート部分を PCR増幅することにより得 た。これは、一般的な cDNAライブラリー構築法とはやや異なるが、本発明の有効性 の実証には、このような簡易の方法で作製したライブラリーで充分用を足せる。これを 制限酵素切断後に、あらかじめ同じ制限酵素で切断しておいた pLEGFP— C1ベタ ターに組み込むことによりレトロウイルス GFP融合プラスミド cDNAライブラリーを構築 した。以下に、具体的な実験手順を示す。
[0042] (1— a)レトロウイルス GFP融合プラスミドベクターの制限酵素による切断： まず、 pL EGFP— C1ベクター を Sailと BamHIにて定法により切断し、セルフライゲーシ ヨンの頻度を極力減らすため、牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（Calf Intestine Al kaline Phosphatase (タカラ社)）にて定法により脱リン酸ィ匕処理を行った。
[0043] (1—b)インサートとなる cDNAライブラリーの作製： 市販の MATCHMAKERヒト 大動脈ライブラリー（クロンテック）のインサート挿入部位やや外側のベクター骨格部 分の配列を基に作成した、次の配列のプライマー対を用いた。
(cDNAに対し順方向のプライマー： pACT2— fwd)： 5 ' - CTATTCGATGATG AAGATACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAG - 3 ' (配列番号 1)、 (BamH I部位つきの逆方向プライマー： Bam— pACT2— rvs)： 5 '— CGGGATCCGTGA ACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACG - 3 ' (配列番号 2)。尚、 cDNA上流 側のプライマー pACT—fwdには制限酵素切断部位がついていない。これは、この MATCHMAKERの cDNAライブラリ一は構築時に Sail切断部位を持つアダプタ 一が使用されていることを、あらかじめ DNA配列決定により明らかにしていた力もで 、 cDNAライブラリーの PCR産物の上流側の切断は、このアダプター由来の Sail部 位を利用して行おうと意図していた力もである。
[0044] 尚、 PCRは以下の反応条件で行った。
PCRの温度サイクル： 95°C 1分→(95°C30秒、 68°C6分） x30サイクル→68°C6分 →4°C保冷
また、反応溶液は次の通りである。
MATCHMAKERヒト大動脈ライブラリー (50ngZ \) \ \
オートクレーブした超純水 37 μ 1
10xAdvantage2 ノ ッファー 水水 5 μ 1
2. 5mM dNTP 4 μ Ι
10 μ Μ pACT2-fwd Ι μ Ι
10 μ Μ Bam-pACT2-rvs 1 μ \
50xAdvantage2 ポリメラーゼ * 1 a 1
計 50 /z l
* Advantage2ポリメラーゼはクロンテック社製
* * このバッファ一は、同ポリメラーゼに付属のものを用いた。
[0045] PCR産物は、定法で Sailと BamHIで切断した後、あらかじめ（1 a)で切断してお いたレトロウイルス GFP融合プラスミドベクターにライゲーシヨンした。なお、本実施例 の最後のステップにおいて、 PDGFにて核内移行することが知られている蛋白質 ER K1の cDNAが濃縮されるか否か調べるのである力 cDNAライブラリーにおける ER K1の cDNAの出現頻度を減らすため、故意に、 ERK1の cDNAがある程度、制限 酵素にて切られてしまうような次の操作を行った。ライゲーシヨンした産物全部を制限 酵素 Apalにて 25°Cで、濃度 0. 1U/ 1、 20 1のスケールで 15分間ダイジェストし た。
[0046] このステップは、セルフライゲーシヨンした pLEGFP— C1を減らす効果もある。その 後、エレクト口コンビテント大腸菌 ElectroMAX DH10B Tl Phage- Resistant Competen t Cells (インビトロジェン社）にエレクト口ポレーシヨンによるトランスフォーメーションを 行った。翌日出てきたコロニーを力き集め、タイター測定を行った後、約 5xl07cfu相 当のプラスミドの増幅を LBプレート上で行った。ここから、 CONCERT High Puri ty Plasmid Purification System (Marngen Biosciences社:^)用 ヽてノフス ミド精製を行、、レトロウイルス GFP融合プラスミド cDNAライブラリーを得た。
[0047] (2) レトロウイルス GFP融合ウィルス cDNAライブラリーの産生
前項（1)で得られたレトロウイルス GFP融合プラスミド cDNAライブラリーをパッケ一 ジング細胞株 AmphoPack293 (クロンテック）にトランスフエクシヨンし、産生されたレ トロウィルス GFP融合ウィルス cDNAライブラリーを含む上清を回収した。具体的に は、 AmphoPack293細胞を 100mmシャーレ 3枚に、 1シャーレあたり約 1. 5xl06 個まき、 37°C、湿潤条件で培養した（10%FCS入りの DMEM培地） 24時間後、 Lip ofectamine2000 (インビトロジェン）を用いて、 1シャーレあたり 20 gのレトロウイノレ ス GFP融合プラスミド cDNAライブラリーをトランジェントトランスフエクシヨンした。 48 時間後、レトロウイルス GFP融合ウィルス cDNAライブラリーを含む上清を回収し、 - 80°Cで保存した。
[0048] (3)ゥサギ血管平滑筋細胞株 SM3への感染と GFP融合蛋白の発現
SM3細胞株を 100mmシャーレ 20枚に約 20%の密集度でまき、 10%FCS入りの D MEM培地を 1シャーレに 10ml中で、 37度、湿潤条件で培養した。 12時間後、（2) で得られたレトロウイルス GFP融合ウィルス cDN Aライブラリーを含む液を 1シャーレ あたり lmlずつ添カ卩し、ポリプレン（Hexadimethrine Bromide)水溶液を最終濃度 8 g/mlになるように添カ卩し、再びインキュベータに戻して 48時間培養を続けた。
[0049] (4) PDGFによる細胞の刺激
レトロウイルス GFP融合ウィルス cDNAライブラリーの感染した SM3細胞株のシヤー レ 20枚を、 1シャーレあたり 10mlの PBSで 3回洗浄後、無血清の DMEMを 1シヤー レあたり 10mlずつ添カ卩し、 2時間、 37°Cでインキュベートした。そこへ、 PDGF— BB (Sigma)を最終濃度 lOngZmlで添加し、 15分間、 37°Cでインキュベートした。
[0050] (5)形質膜の除去と核の固定 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)の第 12章に 記載の方法をやや修飾して用いた。細胞を PBSで 2回洗浄した後、 0. 05%Trypsi n、 0. 5mMEDTAによりシャーレから剥離した。上清をデカンテーシヨンで捨て、細 胞の沈殿の容積を量った (以下、これを 1体積とよぶ)。次に、 5体積の「低浸透圧バッ ファー」（以下に示す)で懸濁し、微量遠心機で 15, 000回転、 20秒間遠心した。そ して、上清をすて、最終体積が 3体積となるように低浸透圧バッファーにサスペンドし た。この状態で氷上にて 10分間置いた。し力る後、ダウンスのホモゲナイザーで 10 回上下させて細胞を挽き、細胞をチューブに集めた。微量遠心機で 15、 000回転、 20秒間遠心してペレット (これが核)嫌め、上清は捨てた。次に、核蛋白の漏出を 防ぐため、核を弱固定した。具体的にはまず、核の沈殿を 4mlの PBSに懸濁し、激し くボルテックスしながら、 18. 5%のホルマリン溶液を一滴一滴ゆっくりと lmlカ卩えた。 低浸透圧バッファーの組成は、 10mM HEPES、 pH7. 9 (4°C)、 1. 5mM MgCl
2
, 10mMKCl、 0. 2%NP— 40、 0. 2mMPMSF、 0. 5mMDTTである。
[0051] (6) FACSによる蛍光を持つ核の分取
ホルマリン固定された核を FACS Flow (ベタトンディッキンソン）で 3回洗浄後、同液 20mLに懸濁した（シャーレ 20枚分）。これをべタトンディッキンソン社の FACS Cali burを用いて、蛍光のある核のみを集めた。およそ 1. 4xl07個の核のうち、 5716個 の蛍光核を得た。
[0052] (7)ゲノム DNAに力かった固定の除去と、核からのゲノム DNA抽出
集めた核を沈殿させ、 200mMNaCl 200 μ 1に懸濁し、 65°Cでー晚インキュベート した。ここに 1M Tris (pH6. 8)を 10 μ 1、 0. 5Μ EDTAを 5 μ \, 2 μ \(Ό 5mg/ml Pr oteinase Kを加え、 45°Cで 2時間置くことにより、蛋白を分解、除去した。し力る後、ゲ ノム DNAをフエノールークロロフオルム抽出し、エタノール沈殿させる。
[0053] (8)ゲノム DNAを铸型にした PCRによる、ライブラリー由来 cDNAの回収と、レトロゥ ィルス GFP融合プラスミドベクターへの組み込み
このようにして得られたゲノム DN Aの中の cDNAライブラリ一由来の cDNAを以下の ごとぐ PCRにより回収した。プライマーは、次の組み合わせのものを用いた。これら は、レトロウイルス GFP融合プラスミドベクターの cDNA挿入部位の外側の配列を基 にしている。
(cDNAに対し、川頁方向のプライマー、 pLEGFP— CI— fwd) :5'— CGCGATCA CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG 3 ' (配列番号 3)
(cDNAに対し、逆方向のプライマー、 pLEGFP-Cl-rvs) :5'-GCC
AAACCTACAGGTGGGGTCTTTCATTCCC - 3，（配列番号 4)
[0054] PCRは以下の反応条件で行った。
PCRの温度サイクル： 95°C 1分→(95°C 30秒、 68°C6分） x40サイクル→68°C6分
→4°C保冷
また、反応溶液は次の通りである。
核カら抽出したゲノムDNA(2iugZ/^l) 1^1
オートクレーブした超純水 37 μ 1
10xAdvantage2 ノ ッファー 水水 5 μ 1
2. 5mM dNTP 4μΙ
10 μΜ pLEGFP-Cl-fwd ΙμΙ
10 μΜ pLEGFP-Cl-rvs 1μ\
50xAdvantage2 ポリメラーゼ 水 1 i 1
計 50/zl これを Sailと BamHIで切断し、 pLEGFP— C1も同じ酵素で切ってそこに挿入し、定 法で大腸菌にトランスフォーメーションした後、 LBプレート上でプラスミドを増幅した。 これを核蛋白プラスミド cDNAサブライブラリーと呼ぶことにする。
[0055] (9)核蛋白プラスミド cDNAサブライブラリーからの核蛋白ウィルス cDNAサブライブ ラリー産生
前項（8)で得られた核蛋白プラスミド cDNAサブライブラリーのプラスミドを AmphoP ack293(クロンテック）にトランスフエクシヨンし、核蛋白ウィルス cDNAサブライブラリ 一を含む上清を回収した。具体的には、 AmphoPack293細胞を 100mmシャーレ 3 枚に、 1シャーレあたり約 1. 5xl06個まき、 37°C、湿潤条件で培養した（10%FCS入 りの DMEM培地） 24時間後、 Lipofectamine2000(インビトロジェン）を用いて、 1 シャーレあたり 20 μ gの核蛋白プラスミド cDNAサブライブラリーをトランジェントトラン スフエクシヨンした。 48時間後、核蛋白ウィルス cDNAサブライブラリーを含む上清を 回収し、— 80°Cで保存した。
[0056] (10)ゥサギ血管平滑筋細胞株への核蛋白ウィルス cDNAサブライブラリーの感染と GFP融合蛋白の発現
SM3細胞株を 100mmシャーレ 20枚に約 20%の密集度でまき、 10%FCS入りの D MEM培地を 1シャーレに 10ml中で、 37度、湿潤条件で培養した。 12時間後、前項 (9)でできた核蛋白ウィルス cDNAサブライブラリーの液を 1シャーレあたり 1mlずつ 添加し、ポリプレン水溶液 (既述）を最終濃度 8 /z gZmlになるように添加し、再びイン キュベータに戻して 48時間培養を続けた。
[0057] (11)細胞外刺激の排除
核蛋白ウィルス cDNAサブライブラリーの感染した SM3細胞株のシャーレ 20枚を、 1 シャーレあたり 10mlの PBSで 3回洗浄後、無血清の DMEMを 1シャーレあたり 10ml ずつ添カ卩し、 2時間、 37°Cでインキュベートした。
[0058] (12)形質膜の除去と核の固定
(5)と同様に行った。
[0059] (13) FACSによる蛍光を持つ核の分取
ホルマリン固定された核を FACS Flow (ベタトンディッキンソン）で 3回洗浄後、同液 20mLに懸濁した（シャーレ 20枚分）。これをべタトンディッキンソン社の FACS Cali burを用いて、蛍光強度のほとんどない核のみを集めた。 1回目のソーティングで蛍 光のない核を、およそ l.OxlO6個の核のうち、 1255個の蛍光のない核を得た。
[0060] (14) DNAに力かった固定の除去と、核からのゲノム DNA抽出
(7)と同様に行った。
[0061] (15)ゲノム DNAを铸型にした PCRによる、 cDNAライブラリー由来 cDNAの回収と 、レトロウイルス GFP融合プラスミドベクターへの組み込み
このようにして得られたゲノム DNAの中の核蛋白 cDNAサブライブラリー由来 cDNA を（8)と同様に PCRにより回収した。 pLEGFP— Clに再クローユングしたのは、後程 、 1クローンずつトランジェントトランスフエクシヨンで核移行を確認するために、 PCR 産物を Sailと BamHIで切断し、 pLEGFP— C1も同じ酵素で切ってそこに挿入し、ェ レクト口コンビテント大腸菌 ElectroMAX DH10B Tl Phage- Resistant Competent Cell s (インビトロジェン社）にエレクト口ポレーシヨンによるトランスフォーメーションを行った 。出てきたコロニーをカゝき集め、「PDGFシグナル依存性核内移行蛋白 cDNA群の プール」を作った。
[0062] (16) PDGF依存性に核内移行することが知られている蛋白 ERK1の cDNAの濃縮 率を見ることによる、本発明の有効性の確認
MAPキナーゼの一種、 ERK1は血管平滑筋細胞においてシグナル依存性に細胞 質力も核内移行することが知られている。発明者は、ヒト ERK1の配列が上記のブー ルのどれだけを占めるかをシーケンシングにより確かめた。シーケンシングプライマー は、 pLEGFP— CI— fwdを用い、定法により行った。
[0063] その結果、上記（15)で得られたコロニーからランダムに選択した 100クローンの cD NA中、 16クローンが ERK1であった。もとのレトロウイルス GFP融合プラスミド cDN Aライブラリー (Apalで切断してトランスフォーメーションし、出てきたもの）の ERK1頻 度を大腸菌のコロニーハイブリダィゼーシヨン (サザンノヽイブリダィゼーシヨン）により 確認すると、およそ lxlO6コロニーのうち 38個であった。単純計算すると約 4, 000倍 の濃縮力 Sかかっていることになる力 より細胞内発現レベルが低くまれな頻度の核移 行蛋白なら、これよりはるかに濃縮率が高くなる（おそらく数百倍以上）と考えられる。 従って、ごく稀なクローンを本発明の手法によってクローユングすることが可能となる 実施例 2
[0064] 実施例：血管平滑筋細胞において、 PDGF (血小板由来増殖因子）の刺激に反応し て核内移行する蛋白群の単離
以下の点を除いて実施例 1と同様に実施した。
(1)レトロウイルス YFP融合プラスミドベクター
レトロウイルス YFP融合プラスミドベクターは、市販のものをもとにして、以下のように 組換え DNA操作により構築した。
[0065] 骨格には、レトロウイルス発現プラスミドベクターの一種 pLIB (クロンテック社）を用い た。また、 EYFP (蛍光強度の強い YFPの変異体)発現ベクター、 pEYFP— Cl (クロ ンテック）の CMVプロモーター部分から EYFPcDNA,ポリクロー-ングサイトを経て SV40ポリアデニン付カ卩シグナルまでを PCR増幅し、 pLIBのポリクローユングサイト にはめ込んだ。具体的には次のような実験操作を行った。
[0066] まず、骨格側の処理としては pLIBを定法により Sfilで切断し、ゥシ小腸アルカリフォ スファターゼを用いて断端の脱リン酸化処理を行った。また pEYFP— C1の一部の P CR増幅は次のプライマー組を用いて行った。どちらも 5 '端には Sfil部位及び切れを よくするためのいくつかの塩基がついていて、 PCR産物を、 pLIBのマルチクロー- ングサイトに存在する 2つの配列の異なる Sfil部位に、一方向性に挿入することが可 能になって!/、る。 Sfilは GGCCNNNNNGGCCと!、う塩基配列を認識して DNAを 切断する。 Nはどの塩基でも力まわない。それゆえ、 NNNNNの部分が異なる 2つの Sfil部位の断端は結合することができない。そこで、これを利用し、公知の方法を用 V、て方向'性を一定にして 、る。
[0067] (CMVプロモーター側： pEYFPCl— fwd)
TCTGTGG 3 ' (配列番号 5)
(SV40ポリアデニン付カ卩シグナル側： pEYFPCl—rvs)
CTCGGTC— 3，（配列番号 6)
[0068] また、 PCRの条件は、次の通りである。
95°C 1分→(95°C 30秒、 68°C2分） x20サイクル→68°C2分→4°C保冷
なお、反応液は次のとおりである。
pEYFP— C1 (クロンテック） （10η
オートクレーブした超純水
10xAdvantage2 ノ ッファー 水
2. 5mM dNTP
10 pEYFPCl -fwd
10 pEYFPCl— rvs 50xAdvantage2 ポリメラーゼ * 1 u 1
計 50 /z l
[0069] 産物は、定法により Sfilで切断し、あら力じめ同酵素で切っておいた pLIBと定法によ りライゲーシヨンした。大腸菌へトランスフォーメーションして、構築が計画通りにでき たことを定法で確認後、作業を完了した。なお、出来上がったベクターは、 HEK293 細胞に定法でトランスフ クシヨンして励起光をあてると黄色に蛍光を発することも確 認し、また、定法で DNAシーケンシングを行い、つなぎ目部分の配列が計画通り正 し 、ことも確かめた。この完成したプラスミドベクターを pLEYFP - C1と称することに した。
[0070] (2) FACSによる核の分取で得られた蛍光核の割合
ホルマリン固定された核を FACS Flow (ベタトンディッキンソン）で 3回洗浄後、同液 20mLに懸濁した（シャーレ 20枚分）。これをべタトンディッキンソン社の FACS Cali burを用いて、蛍光のある核のみを集めた。およそ 1. lxlO7個の核のうち、 7714個 の蛍光核を得た。
[0071] (3) FACSによる核の分取で得られた蛍光のな 、核の割合
ホルマリン固定された核を FACS Flow (ベタトンディッキンソン）で 3回洗浄後、同液 20mLに懸濁した（シャーレ 20枚分）。これをべタトンディッキンソン社の FACS Cali burを用いて、蛍光強度のほとんどない核のみを集めた（ゲートは 1回目のソーティン グで蛍光のない核を基準にした。およそ l .OxlO6個の核のうち、 1821個の蛍光のな い核を得た。
[0072] (4)分取された核力ものゲノム DNA抽出に使用した PCRプライマー
プライマーは、次の組み合わせのものを用いた。これらは、 pEYFP-Clのマルチクロ 一-ングサイト外側の配列を基にして 、る。
(cDNAに対し、川頁方向のプライマー、 pEYFP— CI— fwd) : 5 '— GGGATCACT CTCGGCATGGACGAGCTGTAC 3 ' (配列番号 7)
(cDNAに対し、逆方向のプライマー、 pEYFP— CI— rvs) : 5 '— GTTTCAGGTT CAGGGGGAGGTGTGGGAGG 3 ' (配列番号 8)
[0073] (5) PDGF依存性に核内移行することが知られて 、る蛋白 ERK1の cDNAの濃縮率 を見ることによる、本発明の有効性の確認
シーケンシングの結果、 100クローンの cDNA中、 21クローンが ERK1であった。もと のライブラリーの ERK1頻度を大腸菌のコロニーハイブリダィゼーシヨン（サザンハイ ブリダィゼーシヨン）により確認すると、およそ lxlO6コロニーのうち 41個であった。単 純計算すると約 5000倍の濃縮力かかっていることになる。
[0074] 標識蛋白質として、 YFPのほうが GFPの場合よりも効率的であった理由は、 YFPの 励起光の波長が YFPのそれより短ぐ FACSによるソーティングの途中で DNAを損 傷しやす 、からであろうと予想される。
実施例 3
[0075] 実施例：血管平滑筋細胞において、 PDGF (血小板由来増殖因子）の刺激に反応し て核内移行する蛋白群の単離
以下の点を除いて実施例 1と同様に実施した。
(1)レトロウイルス RFP融合プラスミドベクター
レトロウイルス RFP融合プラスミドベクターは、市販のものをもとにして、以下のように 組換え DNA操作により構築した。
[0076] 骨格には、レトロウイルス発現プラスミドベクターの一種 pLIB (クロンテック社）を用い た。また、 RFP発現ベクター、 pDsRed2-Cl (クロンテック）の CMVプロモーター部 分から ERFPcDNA,ポリクローユングサイトを経て SV40ポリアデニン付カ卩シグナル までを PCR増幅し、 pLIBのポリクローユングサイトにはめ込んだ。具体的には次のよ うな実験操作を行った。
[0077] まず、骨格側の処理としては pLIBを定法により Sfilで切断し、ゥシ小腸アルカリフォ スファターゼを用いて断端の脱リン酸ィ匕処理を行った。また pDsRed2— C1の一部の PCR増幅は次のプライマー組を用いて行った。どちらも 5 '端には Sfil部位（と、切れ をよくするためのいくつかの塩基）がついていて、 PCR産物を、 pLIBのマルチクロー ユングサイトに存在する 2つの配列の異なる Sfil部位に、一方向性に挿入することが 可能になっている。
[0078] (CMVプロモーター佃 J： pDsRed2Cl -fwd) 5 ' -TCGTTAGGCCATTAAGGC V40ポリアデニン付カ卩シグナル側： pDsRed2Cl— rvs) 5 ' - TGTTTGGCCG AG 列番号 10)
また、 PCRの条件は、次の通りである。
95°C 1分→(95°C 30秒、 68°C2分） x20サイクル→68°C2分→4°C保冷 なお、反応液は次のとおりである。
pDsRed2-Cl (lOng/ μ 1) 1 μ \
オートクレーブした超純水
10xAdvantage2 ノ ッファー 水水 5 μ
2. 5mM dNTP 4 μ Ι
10 μ Μ pDsRed2Cl -fwd 1 μ \
10 μ Μ pDsRed2Cl -rvs 1 μ \
50xAdvantage2 ポリメラーゼ * 1 a 1
計 50 μ 1
[0080] 産物は、定法により Sfilで切断し、あら力じめ同酵素で切っておいた pLIBと定法によ りライゲーシヨンした。大腸菌へトランスフォーメーションして、構築が計画通りにでき たことを定法で確認後、作業を完了した。なお、出来上がったベクターは、 HEK293 細胞に定法でトランスフ クシヨンして励起光をあてると赤色に蛍光を発することも確 認し、また、定法で DNAシーケンシングを行い、つなぎ目部分の配列が計画通り正 しいことも確かめた。この完成したプラスミドベクターを pLRFP— C1と称することにす る。
[0081] (2) FACSによる核の分取で得られた蛍光核の割合
ホルマリン固定された核を FACS Flow (ベタトンディッキンソン）で 3回洗浄後、同液 20mLに懸濁した（シャーレ 20枚分）。これをべタトンディッキンソン社の FACS Cali burを用いて、蛍光のある核のみを集めた。およそ 1. lxlO7個の核のうち、 8154個 の蛍光核を得た。
[0082] (3) FACSによる核の分取で得られた蛍光のな 、核の割合 ホルマリン固定された核を FACS Flow (ベタトンディッキンソン）で 3回洗浄後、同液 20mLに懸濁した（シャーレ 20枚分）。これをべタトンディッキンソン社の FACS Cali burを用いて、蛍光強度のほとんどない核のみを集めた（ゲートは 1回目のソーティン グで蛍光のない核を基準にした。およそ l.OxlO6個の核のうち、 1821個の蛍光のな い核を得た。
[0083] (4)分取された核力ものゲノム DNA抽出に使用した PCRプライマー
プライマーは、次の組み合わせのものを用いた。これらは、 pERFP-Clのマルチクロ 一-ングサイト外側の配列を基にして 、る。
[0084] (cDNAに対し、 j噴方向のプライマー、 pERFP-Cl -fwd)： 5 '— GGGATCACT CTCGGCATGGACGAGCTGTAC - 3 ' (配列番号 l l) (cDNAに対し、逆方向 のプライマー、 pERFP-Cl -rvs)： 5 ' - GTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTG TGGGAGG— 3' (配列番号 12) (5) PDGF依存性に核内移行することが知られて いる蛋白 ERK1の cDNAの濃縮率を見ることによる、本発明の有効性の確認 シーケンシングの結果、 100クローンの cDNA中、 28クローンが ERK1であった。もと のライブラリーの ERK1頻度を大腸菌のコロニーハイブリダィゼーシヨン（サザンハイ ブリダィゼーシヨン）により確認すると、およそ lxlO6コロニーのうち 33個であった。単 純計算すると約 8400倍の濃縮が力かっていることになる。 RFPのほうが GFPや YFP の場合よりも効率的であった理由は、 GFPや YFPの励起光の波長が RFPのそれより 短ぐ FACSによるソーティングの途中で DNAを損傷しやすいからであろうと予想さ れる。
実施例 4
[0085] ヒト T細胞性白血病株 (Jurkat)の IL— 2シグナル伝達経路上におけるシグナル依存 性核内移行蛋白質を、実施例 1と同様にスクリーニングした。その結果、 100クローン の cDNA中、 18クローンに IL 2依存性核内移行蛋白質として知られている NF— A Tが含まれていた。更に、この 18クローンを含む 92クローンに含まれる蛋白質が実際 に核内移行することが確認された。
実施例 5
[0086] ラット骨芽細胞株 (ROS17/2.8)の BMP— 2経路を本発明の方法で検討した結果、 1 00クローン中、核内移行蛋白質として知られている Smadlが 11クローンに、同じく 核内移行蛋白質として知られている Smad4が 7クローン含まれていた。更に、これら のクローンを含む 88クローンに含まれる蛋白質が実際に核内移行することが確認さ れた。
産業上の利用可能性
[0087] 本発明方法は、物理的刺激、化学的刺激などに反応して核内移行する蛋白群の探 索にも使用可能である。例えばある種の細胞では、温度や光、 pHの変化等の外界の 刺激を感知して遺伝子発現パターンの変化が見られるが、そのような場合のシグナ ル伝達経路探索にも、適用可能である。また、薬物をはじめとする様々な合成あるい は天然ィ匕学物質の、細胞に対する影響を測定する検査手法としても幅広く用いること ができる。
[0088] 更に、本発明方法で得られた核内移行性蛋白質遺伝子若しくはその一部をプロ一 ブとする DNAッップ、又は、該核内移行性蛋白質をアレイ化した蛋白質チップを作 製することが出来る。更に、このようなチップを使用することによって、核内移行性蛋 白質遺伝子の転写量の変化、核内移行性蛋白質の DNA結合能及びその特性等を 網羅的に解析することが可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] シグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子の取得方法であって、
(A)標識蛋白質をコードする遺伝子と融合した遺伝子群からなる遺伝子ライブラリー を用いて該細胞を形質転換し、遺伝子群を発現させる工程、
(B)細胞外刺激の存在下で該形質転換細胞を培養する工程、
(C)該形質転換細胞から核を分画した後、遺伝子群から発現された蛋白質と標識蛋 白質との融合蛋白質を含む核を分取する工程、
(D)分取して得られた核に含まれる遺伝子ライブラリー由来の一部の遺伝子群から なる遺伝子サブライブラリーを用いて該細胞を形質転換し、遺伝子群を発現させるェ 程、
(E)細胞外刺激の非存在下で該形質転換細胞を培養する工程、
(F)該形質転換細胞から核を分画した後、遺伝子群から発現された蛋白質と標識蛋 白質との融合蛋白質を含まない核を分取する工程、及び
(G)分取された核内に含まれる遺伝子サブライブラリー由来の一部の遺伝子群から なるシグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子をクローユングする工程
を含む、前記取得方法。
[2] シグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子の取得方法であって、
(A)標識蛋白質をコードする遺伝子と融合した遺伝子群からなる遺伝子ライブラリー を用いて該細胞を形質転換し、遺伝子群を発現させる工程、
(B)細胞外刺激の非存在下で該形質転換細胞を培養する工程、
(C)該形質転換細胞から核を分画した後、遺伝子群から発現された蛋白質と標識蛋 白質との融合蛋白質を含まない核を分取する工程、
(D)分取して得られた核に含まれる遺伝子ライブラリー由来の一部の遺伝子群から なる遺伝子サブライブラリーを用いて該細胞を形質転換し、遺伝子群を発現させるェ 程、
(E)細胞外刺激の存在下で該形質転換細胞を培養する工程、
(F)該形質転換細胞から核を分画した後、遺伝子群から発現された蛋白質と標識蛋 白質との融合蛋白質を含む核を分取する工程、及び (G)分取された核内に含まれる遺伝子サブライブラリー由来の一部の遺伝子群から なるシグナル依存性核内移行蛋白質遺伝子をクローユングする工程
を含む、前記取得方法。
[3] 遺伝子群が cDNAライブラリーから選択される、請求項 1又は 2記載の方法。
[4] 工程 (A)及び Z又は (D)において、遺伝子ライブラリーがウィルスベクターにより導 入される、請求項 1、 2又 3は記載の方法。
[5] ウィルスがレトロウイルスである、請求項 1〜4のいずれか一項に記載の方法。
[6] 標識蛋白質が蛍光蛋白質である、請求項 1〜5のいずれか一項に記載の方法。
[7] 蛍光が可視光域である、請求項 6記載の方法。
[8] 蛍光蛋白質が GFPである請求項 7に記載の方法。
[9] 蛍光蛋白質が YFPである請求項 7に記載の方法。
[10] 蛍光蛋白質が RFPである請求項 7に記載の方法。
[11] 標識蛋白質が抗原性蛋白質である、請求項 1〜5のいずれか一項に記載の方法。
[12] 標識蛋白質が酵素である、請求項 1〜5のいずれか一項に記載の方法。
[13] 工程 (C)及び Z又は (F)において、核の分取を蛍光の有無に基づき行う、請求項 6
〜 12の!、ずれか一項に記載の方法。
[14] FACSを用いて核の分取を行う、請求項 13記載の方法。
[15] 細胞が榭立培養細胞株である、請求項 1〜14のいずれか一項に記載の方法。
[16] 形質転換細胞から核のみを取り出す為に細胞膜を破壊する、請求項 1〜15のいず れか一項に記載の方法。
[17] 工程 (B)及び Z又は (E)にお ヽて、無血清培地で該形質転換細胞を培養する、請 求項 1〜16のいずれか一項に記載の方法。
[18] 工程 (A)及び Z又は (D)において、 1個の細胞内に実質的に平均 1つ以下の融合 遺伝子が導入される条件下で該細胞を形質転換する、請求項 1〜17のいずれか一 項に記載の方法。
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