WO2006035687A1 - 遺伝子導入鳥類作製法 - Google Patents

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Takashi Yamashita
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Kaneka Corp
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    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing a transgenic (transgenic) bird applicable to the production of a heterologous protein such as a heterologous protein.
  • transgenic animals are attracting attention as a new protein production method that overcomes these drawbacks. Proteins produced in milk, blood, and eggs by transgenic mammals and birds are given sugar chains, and the production cost is estimated to be 1/10 to 1/100 of animal culture cell reactors. (Nature Biotechnology 19, 18 4 2001). Transgenics using poultry, in particular, are expected to be put to practical use because they have the advantage of a short period until maturity and a small breeding area.
  • a method of infecting an early embryo of a fertilized egg with a retroviral vector is the most effective means.
  • the present inventors used a highly safe replication-defective virus vector and microinjected a gene into the early embryo of an avian fertilized egg, thereby transfecting a chimeric chimera (GO (Referred to as Japanese Patent Laid-Open No. 2002-176880).
  • silencing suppression of protein expression by the host
  • the transgenic bird obtained by this method is a chimera having a transgene in the form of a mosaic in a somatic cell.
  • a transgene GO (germline transgene chimera) with a transgene in the germ cell must be replaced with another transgene GO (germline transgene chimera).
  • G1-G2-G3 the rate at which the mating ability of the germline transgeneic chimera is born is about 3%, and this expression frequency is never high!
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2001-045915 is a trans obtained by a method characterized by introducing a desired heterologous gene into a primordial germline progenitor cell, transplanting it into an avian embryo, and generating and hatching. A transgenic bird is disclosed.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-176880
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-045915
  • Non-patent literature l Nature Biotechnology, 19, 184 2001
  • Non-patent literature 2 Lorraine Vick, ing Li and K. Simkiss, Transgenic bird from transformed primordial germ cells, Proc. R. Soc. Lond. B "99 3) 251, 179- 182
  • Non-Patent Document 3 Mitsuru Naito, In vitro culture and manipulation of avian embryos, protein nucleic acid enzyme Vol. 40 No. 14 (1995)
  • transgenic birds In order to apply transgenic birds as a safe and efficient protein production system, an efficient method for producing transgenic birds in which a transgene enters the whole somatic cell and the protein derived from the transgene is highly expressed. Establishing is essential. In addition, it is necessary to establish an efficient production method for germline transgenic birds by introducing heterologous genes into germ cells.
  • the present inventor has devised an application of the PGC transplantation method in order to more efficiently establish a complete transgenic bird, for example, a G1 complete production method.
  • a complete transgenic bird for example, a G1 complete production method.
  • high-concentration (high titer) retroviral vectors it is possible to efficiently infect primordial germ cells, thereby producing transgenic birds efficiently, and introduced by retroviruses.
  • Transgenic birds produced by these methods can be used to produce proteins that can be used in pharmaceuticals and the like.
  • the method of producing a transgenic bird according to the present invention is an efficient and complete GO transgenic. Can produce birds. According to the present invention, its offspring, for example, a complete G1 transgene can be efficiently born.
  • Gl, G2, G3 to transgenic birds of the present invention express a protein derived from a heterologous gene in somatic cells, and thus have been produced so far by collecting and purifying serum, egg white, and egg yolk force. It is possible to supply an inexpensive production system for proteins and antibodies imparted with sugar chains, which has been difficult.
  • the present invention provides a first bird fertilized egg and a second bird fertilized egg; obtaining a primordial germ cell (PGC) from an early embryo of the first bird fertilized egg; Infecting the primordial germ cell with a viral vector and introducing a heterologous gene into the primordial germ cell; transplanting the primordial germ cell into an early embryo of a second avian fertilized egg; Provided is a method for producing a transgenic bird characterized in that eggs are hatched and grown;
  • the PGC here is a cell that divides into germ cells in birds, and is first recognized as a cell that is strongly stained by PAS staining in early embryos, and then enters the bloodstream with the development of the vascular system. Ride, reach the gonad primordium and become germ cells.
  • the term “fertilized egg early embryo” as used herein refers to the blastoderm (stage X) force immediately after egg release up to 96 hours after incubation.
  • the PGC used in the present invention is obtained from early embryonic blood of a fertilized egg and can be efficiently concentrated by a density gradient centrifugation method or the like. It is preferable to obtain PGC from the first avian fertilized egg that obtains PGC from 40 hours to 60 hours, especially from 48 hours to 60 hours after the start of incubation, assuming that the time immediately after egg release is 0 hours. Taking chickens as an example, it is preferable to prepare PGCs that have a rapid growth rate of germ cells such as white legphones. For example, PGC is prepared by collecting blood of a fertilized avian bird. By concentrating PGC in the obtained blood by density gradient centrifugation, a retroviral vector can be more efficiently infected with the PGC and a heterologous gene can be introduced into the PGC.
  • germline transgenic birds can be produced at a high rate.
  • an individual having or surely having a transgene in a germ cell is referred to as a germline transgenic bird.
  • testes and ovaries are There is a method of preparing a nom and confirming the transgene by PCR.
  • Sperm can also be collected from adult birds and confirmed by PCR. More simply, fluorescence can be confirmed by adding a fluorescent protein marker to the introduced gene.
  • the early embryo of a fertilized egg that has undergone PGC transplantation has a germline in which the germ cells of donor-derived PGCs and the germ cells of the recipient are in a mosaic pattern. It can grow as a transgenic chimeric bird.
  • the first generation of Transgenic Chimeric Birds is called GO Transgenic Chimeric Birds.
  • Their offspring are called Gl, G2 ⁇ Transgenic Birds.
  • a complete transgenic bird can be preferably produced from these offspring.
  • the term “complete transgenic bird” as used herein refers to a bird in which a heterologous gene is introduced into substantially all of somatic cells.
  • the complete transgenic bird of the present invention, such as Gl or G2 contains a heterologous gene evenly in its somatic cell and stably expresses a protein derived from the transgene in blood, egg white, or egg yolk. It is characterized by.
  • the PGC is characterized in that it is obtained from an early embryo of a fertilized egg at a later time except immediately after incubation, and a heterologous gene is introduced by a retroviral vector.
  • the time when the PGC is obtained from the early embryo of the fertilized egg has an optimum time specific to the bird species from which the PGC is derived.
  • the PGC acquisition time is preferably from 48 hours to 64 hours after hatching, more preferably from 40 hours to 60 hours after hatching, and more preferably after 50 hours after hatching. 60 Up to time.
  • This PGC into which this heterologous gene has been introduced and a method for producing the same are also one aspect of the present invention.
  • the period is, for example, 12 hours to 96 hours after the hatching treatment, preferably 24 hours to 72 hours after the hatching treatment, and most preferably 48 hours to about 64 hours after the hatching treatment.
  • the present inventors previously introduced a heterologous gene introduced by a retrovirus into a PGC about 48 hours after the start of incubation in a quail and about 55 hours after the start of incubation in a chicken.
  • a heterologous gene introduced by a retrovirus into a PGC about 48 hours after the start of incubation in a quail and about 55 hours after the start of incubation in a chicken.
  • a retroviral vector capable of mediating the heterologous gene is used in the present invention.
  • Any retroviral vector can be used as the retroviral vector.
  • it may be a VSV-G pseudotyped retroviral vector.
  • the retroviral vector used in the present invention is, for example, a vector derived from Moro-1 'Muline-Leuchemia virus (MoMLV), Evian' Leukosis virus (ALV), or a lentiviral vector. Etc. Of these, those derived from MoMLV are preferred, but the present invention is not limited thereto.
  • a retroviral vector capable of mediating a heterologous gene referred to in this specification is V in a eukaryotic cell, and when the RNA gene information of the virus is incorporated into the DNA of the eukaryotic cell, the retroviral vector A gene that provides a heterologous gene.
  • the base sequence of the RNA has a portion complementary to the base sequence of DNA encoding a heterologous protein.
  • the retrovirus used as a vector capable of mediating a heterologous gene may be of a replication-deficient type.
  • a virus lacking replication ability a virus lacking self-replication ability by lacking any or all of the three genes gag, pol, and env, which are usually required for virus particle replication, is used.
  • a viral vector in which the coat protein is artificially made into a VSV-G (derived from vesicular stomatitis virus) pseudotype is preferred, but the present invention is limited to this viral type. It's not something.
  • An advantage of using a retrovirus as a VSV-G pseudo type is that it can be concentrated by ultracentrifugation.
  • a fluorescent protein-expressing gene such as GFP into this vector as a marker and infecting cultured cells, the infectious virus concentration can be quantified.
  • the virus vector used in the present invention is preferably concentrated at a high concentration by centrifugation from the viewpoint of efficiency.
  • a high-titer retrovirus vector may be preferably used.
  • High titer means, for example, 1 X 10 7 cfu / ml or more, 1 X 10 1Q cfu / ml or less, preferably The titer may be 1 ⁇ 10 8 cfu / ml or more, 1 ⁇ 10 1Q cfu / ml or less, more preferably 1 ⁇ 10 9 cfu / ml or more, 1 ⁇ 10 1Q C fuZml or less.
  • Infecting a PGC with a replication-defective retrovirus vector having a high titer is preferable in terms of efficient gene transfer. Therefore, the present invention also relates to a method for producing or increasing heterologous gene mediated PGC by infecting PGC with a high titer retroviral vector.
  • a fluorescent protein marker may be selected by a flow cytometer.
  • a retroviral vector that can be concentrated by ultracentrifugation by changing the outer skin to a V SV-G pseudo type by genetic recombination techniques. The method of concentrating the virus solution once concentrated by ultracentrifugation by ultracentrifugation is not preferable for use in the injection method from the viewpoint of increasing contamination with unwanted proteins, but is effective as a method for infecting PGC. is there.
  • the virus titer is measured, for example, as follows. The day before (obtained from the American 'type' Karuchiya one 'Collection) NIH3T3 cells and to dish about 7 X 10 4 cells inoculated culture 35mm diameter measurement. Add 1 ml of a virus diluted with a fluorescent marker diluted about 10 2 to 10 6 times to each dish. About 48 hours later, the percentage of cells expressing GFP by fluorescence microscopy (100% is 1 and ) And determine the titer using the following formula.
  • Virus titer number of cells X dilution rate X expression rate
  • a plasmid having a knocking signal sequence is introduced into a packaging cell by a lipofusion, an electoral position method or the like.
  • a retroviral vector mediated by a heterologous gene into an early embryo of a fertilized egg
  • a method of infecting an early embryo of a fertilized egg by a repofusion method an electo-poration method or a microinjection method.
  • a microinstruction method can be used.
  • the heterologous gene referred to here is a residue that originates in a foreign source force for a specific host cell It means a gene or a gene that is modified from its original form, even if it is the same source.
  • a heterologous gene in a host cell includes a gene that has been modified by the use of forces that are foreign to the particular host cell, such as DNA shuffling.
  • the term also includes naturally occurring genes that do not have multiple copies in nature.
  • the terms heterologous (sex), foreign (sex), external (sex) gene or protein may be used interchangeably.
  • the heterologous gene introduced into the bird according to the present invention is not particularly limited.
  • genes not derived from retroviruses include marker genes, structural genes for expressing the target protein, and expression control of these genes. It is appropriately selected from promoter genes, secretory signal genes, and the like.
  • Examples of the marker gene include a gene encoding a neomycin resistance gene,
  • the structural gene for expressing the target protein is not particularly limited, and includes human monoclonal antibodies, chimeric antibodies, artificial antibodies with modifications such as single chain, erythropoietin, G-CSF, thrombopoietin, interferon, etc. Examples of such genes useful for the gene industry include genes encoding enzymes and enzymes.
  • Useful protein genes to be introduced into transgenic birds include those that require a sugar chain to maintain the activity and stability of the expressed protein, such as erythropoietin constituent genes, and antibody genes.
  • Genes of other useful physiologically active substances can also be used.
  • it is a gene for an antibody with a constant region of the HgG class, an antibody with a constant region of a subclass of human IgG1, quail IgG2, or chicken IgG2, or mouse IgG2.
  • the structural gene of the foreign antibody is preferred.
  • the preferred structural gene includes a structural gene of a chimeric antibody.
  • a chimeric antibody refers to an antibody composed of two or more different inheritances.
  • medical antibodies produced by mouse and ibridoma are derived from mice, so that there is a problem that when they are injected into the human body, rejection by the immune system is caused. Solve this shortcoming In order to eliminate this, the risk of rejection reaction can be greatly reduced by, for example, humanizing the Fc region of a mouse antibody by a recombinant technique.
  • Examples of the chimeric antibody include an anti-human CD2 antibody, an anti-CD20 receptor antibody, an anti-TNF antibody, and the like, and some of them are already listed as pharmaceuticals.
  • Further preferred structural genes include scFv-Fc antibody structural genes.
  • Immunoglobulin IgG has a domain called VH, VL heterodimer that is called a variable region (Fv: Fragment of variable region) that binds directly to the antigen.
  • This Fv domain is about one-fifth of IgG. It has a sufficient antigen-binding ability by itself even though it has a molecular weight of.
  • An artificially linked peptide linker between the VH and VL domains is a low-molecular-weight antibody called a single chain antibody (scFv: single chain Fv), which can be more stable than VH and VL alone.
  • scFv single chain Fv
  • the promoter gene examples include any promoter, for example, RSV promoter as a constitutive promoter; site-specific promoter, such as j8-actin promoter; time-specific promoter, such as ovalbumin promoter.
  • a constitutive promoter is used.
  • the antibody gene is controlled by a constitutive promoter because the antibody gene expression may be stable.
  • the birds used in the present invention are not particularly limited, and examples thereof include poultry birds and pet birds that have been domesticated for meat and egg collection, such as -birds, turkeys, ducks, ostriches, and quails. it can. Among them, the birds and quails are easy to obtain, and the eggs are preferable because they are prolific.
  • the first bird for obtaining an early embryo of a fertilized egg and the second embryo derived from an early embryo of a fertilized egg to which a primordial germ cell into which a heterologous gene has been introduced should be transplanted.
  • Birds can be the same or different species. When the same species, or the same species and the same line are adopted, the same individual or different individuals can be used. For convenience, different individuals are used. It is also possible, for example, to port a bird cage PGC to a quail. However, transplantation between the same species is preferable from the viewpoint of transplantation efficiency.
  • transplantation between the same strains may be possible, but transplantation between different strains is possible.
  • the line of the bird from which the first embryo of the embryo fertilized egg is acquired may be different from the line of the bird from which the second embryo of the initial fertilized egg is acquired.
  • the growth rate of germ cells in the first embryo of early fertilized eggs may differ from the growth rate of germ cells in the second embryo of early fertilized eggs.
  • the growth rate of germ cells in the first embryo of early fertilized eggs is greater than the growth rate of germ cells in the second embryo of early fertilized eggs.
  • a heterologous gene into a PGC derived from a white chicken leghorn by retrovirus and transplant it into a fertilized egg of a two-bird avian horizontal spot Georgia Rock.
  • white leghorn which is a PGC-providing line
  • white leghorn germ cells into which a heterologous gene has been introduced are preferred in that they are predominantly produced in Plymouth Rock.
  • the donor's offspring can be easily distinguished by the feather color.
  • donor PGC-derived transgenic birds introduced with a heterologous gene can be easily selected visually.
  • a fertilized egg having an early embryo into which the above heterologous gene has been introduced is hatched and grown by a conventional poultry breeding method to produce a transgenic bird.
  • the transgenic birds are produced by applying normal breeding methods, traditional breeding methods, or genetic engineering techniques.
  • GO germline transgenic chimeric birds and non-transgenic birds, such as wild-type birds, or offspring born by crossing GO germline transgenic chimera birds, such as the second and third generation When it is generated from a germ cell having a transgene in its chromosome, it grows as a complete individual containing the transgene in somatic cells throughout the body.
  • the offspring inheriting the transgene also inherited the germline transgenic chimera individual power are called G1-G2-G3-transgenic birds from generation to generation.
  • the mating may be natural mating or artificial mating, but artificial mating is also preferred from the viewpoint of artificially adjusting production.
  • the mating partner may be a donor strain, a recipient strain, or a separate third strain, and can be mated if other species can be fertilized, but mating with a donor strain is preferable in terms of fertilization efficiency.
  • Mating types include GO Transgenenics and wild females, GO Transgenic females and wild males, GO Transgeneic males and females, and backcrossing by offspring and their parents. Is possible.
  • the mating type of GOOS and wild-type females can have 3 to 10 wild-type females mated to one GO-OS, so it is also highly efficient.
  • the transgene By crossing the GO germline transgenic chimera birds according to the present invention as described above, the transgene can be transmitted to the offspring, and the whole body somatic cell has the transgene completely. Can create transgenic birds.
  • GO transgenic birds are produced by directly injecting retroviruses into fertilized eggs, it is necessary to select the breeding transgenic chimera GO.
  • the frequency of nick-complete body G1 birth was low at about 3%, the PGC transplantation method according to the present invention resulted in a high frequency of germline transgenic bird GO, resulting in high! A complete G1 can be born.
  • the growth rate of germ cells in the early embryo of the first fertilized egg is greater than the growth rate of germ cells in the early embryo of the second fertilized egg, in the GO individual, Since germ cells on the donor side with the gene have a higher abundance ratio than germ cells on the recipient side, it is possible to increase the proportion of complete bodies in the offspring such as G1 and G2.
  • the sperm cryopreservation method can be applied to preserve the complete lineage produced in this way.
  • the present invention discloses a method for producing a transgenic bird as a complete body advantageous for protein production as described above. Also disclosed are transgenic birds by the production method.
  • the quality of the protein production system can be stabilized by establishing a transgenic bird line that stably transmits the transgene. Furthermore, since the percentage of somatic cells with a transgene is higher in a complete transgenic bird, the amount of recombinant protein derived from the transgene can be increased compared to the GO transgenic chimera bird.
  • the protein production method of the present invention is characterized in that the above-described transgenic chimera avian antibody is extracted and purified if necessary.
  • the transgenic bird may be GO or a progeny thereof, for example, a transgenic bird offspring of Gl, G2 or later generations. More specifically, it is a method for producing an antibody by recovering and purifying the antibody from the blood and Z or egg of the produced transgenic chimeric bird.
  • Antibody extraction is performed by a combination of removal of unwanted protein by ammonium sulfate precipitation, etc., fractionation by adsorption column such as protein A, ion exchange column, ultrafiltration membrane or the like.
  • these human monoclonal antibody genes, chimera antibody genes, scFv-Fc antibody genes, artificial antibodies modified with a single chain, etc. are introduced as genes introduced into birds.
  • Erythropoietin, G-CSF, thrombopoietin, interferon, and other genes that are useful in the gene industry, such as bioactive proteins and enzymes are used. It is possible to mass-produce drugs such as antibodies that were difficult to produce at low cost.
  • an example of the antibody content in blood is preferably about 0.5 ⁇ g Zml or more, more preferably about 5 ⁇ g / m 1 That's it.
  • an example of antibody content in egg white is preferably about 0.1 ⁇ g Zml or more, more preferably about 1 ⁇ g Zml or more, and an example of antibody content in egg yolk is preferably about 0. 1 ⁇ gZml or more, more preferably about 1 ⁇ gZml or more.
  • an example of the antibody content in the blood is preferably about 20 / z gZml or more, more preferably about 2000 gZml or more. is there.
  • An example of antibody content in egg white is preferably about 5 ⁇ gZml or more.
  • breeding of birds for livestock or pets can be improved by the method for producing a transgenic bird of the present invention.
  • Anti-CD2 antibody expression vector constructs pMSCVZG ⁇ AH, pMSCV / GALAL and pMSCVZG ⁇ ALIH were prepared as follows.
  • mRNA was obtained from a human antibody (IgM) -producing hybridoma cell D253-15-6 (American 'Type' Cartia I Collection 'HB-8789) using the Quick Prep Micro mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • oligonucleotides 5,-cccaagcttgatctccactgggatggtgggggccc tcctcttgctgctg—3, (underlined is the Hindm restriction enzyme site) and 5,-cccggatcctcag tcaaggcgccttcgcatgaagaggccgag.
  • TM epidermal growth factor receptor transmembrane region
  • pBlue / hC ⁇ force The hC ⁇ gene fragment was excised with the restriction enzymes Xhol and Hindm and inserted into the XhoI and Hindlll sites of pBlue / TM to create plasmid pBlue / hC ⁇ TM. Made.
  • pCEP4ZhC / z TM was cleaved with the restriction enzyme BamHI, the ends were blunted with T4 DNA polymerase, and the plasmid pCEP4ZhC ⁇ TM was used with self-ligation.
  • Anti-human CD2 mouse antibody-producing hybridoma cells TS2Z18 1. 1 (American 'Type' Culture Collection HB- 195) was used to obtain mRNA using the Quick Prep Micro mRNA Purification Kit, and the first mRNA was obtained from the obtained mRNA. — A cDNA library was prepared using the Strand cDNA Synthesis Kit.
  • the above cDNA library by PCR using two chemically synthesized oligonucleotides 5'-cgcggccgcctcagggaaagtttgaagatg-3 '(underlined Notl restriction enzyme site) and 5'-cggcgccgccacagtccgttttatttccagcttggt-3g (underlined Narl restriction enzyme site)
  • the mouse antibody L chain variable region (mVL) gene fragment was amplified from, then cut out with restriction enzymes Notl and Narl, and inserted into NotI and Narl sites of pBlueZhVLN to prepare plasmid pBlueZmVL.
  • the mVL gene fragment was excised from pBlueZmVL with restriction enzymes Notl and Xhol and inserted into the NotI and Xhol sites of pCEP4 / hC ⁇ to produce plasmid pCEP4 / lgL ⁇ .
  • the hVH gene fragment was excised from pBlueZhVHB with restriction enzymes Notl and Xhol and inserted into the NotI and Xhol sites of pCEP4 / hC ⁇ to prepare plasmid pCEP4ZhIgH ⁇ .
  • the mVH gene fragment was excised from pBlueZmVH with restriction enzymes Notl and BamHI, and ligated to the vector fragment of pCEP4ZhIgH ⁇ treated with restriction enzymes Notl and BamHI to prepare plasmid pCEP4ZlgH / z ⁇ .
  • pMSCVneo was completely synthesized (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) based on publicly known literature (Gene Ther. 1994 MAR; 1 (2): 136-8) and information on the Internet.
  • a series of murine phosphoglycerate 'kinase (PGK) promoter and Neor gene-containing fragments were removed from pMSCVneo with restriction enzymes Bglll and BamHI, and plasmid pMSCV was prepared by self-ligation of the remaining vector fragments.
  • PGK murine phosphoglycerate 'kinase
  • a GFP gene fragment was excised from pGREEN LANTERN-1 with the restriction enzyme Notl and inserted into the Notl site of pZeoSV2 (+).
  • a plasmid having a structure in which the GFP gene was inserted in the same direction as the T7 promoter was designated as pZeoZGFP.
  • a GFP gene fragment was cut out from pZeoZGFP with restriction enzymes EcoRI and Xhol and ligated to a pMSCV vector fragment treated with restriction enzymes EcoRI and Xhol to prepare plasmid pMSCVZG.
  • the restriction enzymes BamHI and Hindlll The plasmid pBlue / hCy1 was prepared by excision and insertion into BamHI and Hindlll sites of pBluescriptIISK (+).
  • the mVH gene fragment was excised from pCEP4 / lgH ⁇ with restriction enzymes Hindlll and BamHI.
  • the hC y 1 gene fragment was excised from pBlueZhC y 1 with restriction enzymes BamHI and Hind ⁇ .
  • the two fragments cut out were ligated to the vector fragment of plasmid pETBlue-2 (manufactured by Novagen) treated with the restriction enzyme Hindlll to prepare plasmid pETBlueZlgHyl.
  • the gene fragment of the antibody chain ⁇ 1 (IgH ⁇ 1) was excised from pETBlue / lgH ⁇ 1 with the restriction enzyme Hin dill and inserted into the Hindlll site of pMSCVZG.
  • a plasmid having a structure in which the IgH ⁇ 1 gene was inserted in the same direction as the GFP gene was designated as pMSCVZGH.
  • the ⁇ Act promoter fragment was excised from pETBlueZ ⁇ Act with the restriction enzyme Sail and inserted into the Xhol site of pMSCV / GH.
  • a plasmid having a structure in which the ⁇ Act promoter was inserted in the same direction as the IgH ⁇ 1 gene was designated as pMSCVZG ⁇ AH.
  • the ⁇ Act promoter fragment was cut from pETBlueZ ⁇ Act with the restriction enzyme Sail and inserted into the Xhol site of pMSCVZG.
  • a plasmid having a structure in which the ⁇ Act promoter was inserted in the same direction as the GFP gene was designated as pMSCVZG ⁇ A.
  • the IgL kappa gene fragment was excised from pETBlue / lgL kappa with the restriction enzyme Sail and inserted into the pM SCVZG ⁇ A sail site.
  • a plasmid having a structure in which the IgL ⁇ gene fragment was inserted in the same direction as the ⁇ Act promoter was designated as pMSCVZG ⁇ AL.
  • the IRES fragment was cut from pETBlueZlRES with the restriction enzymes Sail and Xhol and inserted into the Sail site of pM SCVZG A AH.
  • a plasmid having a structure in which IRES was inserted in the same direction as the IgH ⁇ 1 gene was designated as pMSCVZG ⁇ AIH.
  • the IgL ⁇ gene fragment was excised from pETBlue / lgL ⁇ with the restriction enzyme Sail and inserted into the Sail site of pMS CV / G ⁇ AIH.
  • a plasmid having an IgL kappa gene fragment inserted in the same direction as the ⁇ Act promoter was designated as pMSCVZG ⁇ ALIH.
  • Fig. 1 shows the structure of the vector construct P M SCV / G ⁇ ALIH of the replication-defective retrovirus vector prepared as described above.
  • a knocking cell GP293 (Clontech) was used with a diameter of 100 mm. 5 ⁇ 10 6 cells were planted in a culture dish and cultured. The medium was replaced with fresh DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), and 8 ⁇ g of p-VSV-G vector (Clontech) and 8 ⁇ g of pMS CVN AA jS were introduced into the GP293 cells by the lipofusion method. After 48 hours, the culture supernatant containing virus particles was collected, and impurities were removed through a 0.45 m cellulose acetate filter (manufactured by Advantech). Polyprene (manufactured by Sigma) was added to the obtained solution to a concentration of 10 ⁇ g Zml to obtain a virus solution.
  • the obtained stable transformants were cultured in 100 mm diameter dishes so as to be 80% confluent, and 16 / zg of pVSV-G was introduced by the lipofussion method. After 48 hours, 12 ml of the culture supernatant containing virus particles was recovered.
  • This culture supernatant was centrifuged at 50,000 X g and 4 ° C for 1.5 hours to precipitate the virus.
  • the virus titer was measured as follows. The day before the measurement, NIH3T3 cells (obtained from the American 'type' culture 'collection) were planted and cultured in 7 x 10 4 cells in a 35 mm diameter dish. The virus solution diluted 10 2 to 10 6 times was added to each dish, and after 48 hours, the proportion of cells expressing GFP was measured with a fluorescence microscope, and the titer was determined by the following formula.
  • Virus titer number of cells X dilution rate X expression ratio (cfuZml)
  • a chicken fertilized egg (from Shiroyama Breeder) 50 hours after the start of incubation (stages Xin to XV) was set aside and allowed to stand for 1 minute or longer. Since the embryo moved to the upper part by standing, the egg was gently broken in this state and transferred to a petri dish.
  • Confirm that there is an embryo at the top of the yolk cut 0.5 to 1. Ocm outside the blood vessel with scissors along the blood vessel, scoop it up with a spatula and tweezers, and add phosphate buffer (in 1N hydrochloric acid). And adjusted to pH 7.4). The embryo body was picked with tweezers, and the yolk was washed off with a phosphate buffer. The washed embryo was transferred to a share filled with a phosphate buffer heated to 38 ° C and spread with tweezers.
  • PGCs collected near the boundary of Ficoll were collected by centrifugation, washed 3 times with Dulbecco's modified minimum essential medium, suspended in 1 ml of the same medium, and concentrated by centrifugation.
  • the anti-CD2 antibody-expressing retroviral vector prepared in Example 2 was incubated with the same amount of PGC suspension at 37 ° C for 4 hours to obtain a PGC into which a gene for anti-CD2 antibody expression had been introduced. It was.
  • a set of primers capable of amplifying a part of 355 bp of the GFP gene contained in the transgene 5′-CAACACTGGTCACTACCTTCACCTATG—3, / 5, —A CGGATCCATCCTCAATGTTGTGTC-3.
  • a primer set capable of amplifying a part of 317 bp of the ovalbumin gene contained in the ⁇ avian genome was used: 5, — CGCTTTGATAAACTTCCAGGATTCGG—3, / 5, — CATCTAGCT GTCTTGCTTAAGCGTACA 3,
  • Example 5 The results are shown in FIG. [Example 5]-Retroviral vector infection of chicken embryos Injecting PGCs from chicken embryos other than Example 1 and equipped with an automatic egg-turning device (manufactured by Showa Franchi)
  • the incubation time was set at 37.9 ° C and 65% humidity in P-008) as the incubation start time (0 hour).
  • the eggshell of the fertilized egg was sterilized with 70% ethanol, and the sharp end was cut into a circle with a diameter of 3.5 cm with a diamond cutter (MINOMO7C710, manufactured by Miniter) to expose the embryo.
  • a diamond cutter (MINOMO7C710, manufactured by Miniter)
  • cover the glass tube (CD-1, Olympus) with a micropipette maker (PC-10, Olympus) so that the outer diameter is about 20 m.
  • PCG into which the gene for anti-CD2 antibody expression prepared in Example 3 was introduced in the center of the subblastospace using a microinjector (Transjector 5246, manufactured by Etsu Pendorf). The suspension was injected 21.
  • the egg white After filling the egg shell to the cut end of the eggshell, the egg white is glued with a Teflon (registered trademark) membrane (Milliwrap, manufactured by Millipore) and Poly-Shibi-Ridenwrap (Saran Wrap, manufactured by Asahi Kasei). Incubation was carried out by turning 90 degrees every 15 minutes.
  • Teflon registered trademark
  • Poly-Shibi-Ridenwrap Saran Wrap, manufactured by Asahi Kasei
  • the method for producing a transgenic bird of the present invention can efficiently produce a complete GO transgenic bird.
  • its progeny for example, a complete G1 transgene can be efficiently born.
  • the Gl, G2, G3 to transgenic birds of the present invention express proteins derived from heterologous genes in somatic cells, and thus have been produced so far by collecting and purifying serum, egg white, and egg yolk strength. It is possible to supply inexpensive production systems for proteins and antibodies provided with sugar chains, which have been difficult.
  • FIG. 1 shows the structures of anti-CD2 antibody expression vector constructs pMSCVZG AAH, pMSCV / G AAL and pMSCVZG ⁇ ALIH.
  • Amp 1 "indicates ampicillin resistance gene .
  • ⁇ ⁇ act indicates the j8-actin promoter gene.
  • ⁇ + indicates a packaging signal array.
  • GFP represents the green 'fluorescent' protein gene.
  • L represents an anti-CD2 antibody light chain gene.
  • H represents an anti-CD2 antibody heavy chain gene.
  • 5'LTR and 3'LTR represent MoMLV long terminal repeat sequences, respectively.
  • FIG. 2 PCR results of PGC in which an anti-CD2 antibody expression gene was introduced using a retroviral vector. Lane 1 is untreated PGC. Lane 2 represents PGC introduced with an anti-CD2 expression gene. Arrows indicate transgenes.

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Abstract

　鳥類受精卵の初期胚から始原生殖細胞（ＰＧＣ）を取得し、レトロウイルスベクターにより目的遺伝子を導入して別の鳥類受精卵の初期胚に移植し、孵化することよりなる遺伝子導入鳥類作製法及び遺伝子導入鳥類。また該トランスジェニック鳥類を、野生型又は別のトランスジェニック鳥類と交配することによるトランスジェニック鳥類の子孫の作製法及びトランスジェニック鳥類の子孫。本発明の、トランジェニック鳥類及びトランジェニック鳥類の子孫は、体細胞で異種遺伝子の由来する蛋白質を高発現するので、有用蛋白質を安価で安定に供給することに利用することが出来る。

Description

明 細 書
遺伝子導入鳥類作製法
技術分野
[0001] 本発明は、異種蛋白質などの異種蛋白質生産に応用可能な遺伝子導入 (トランス ジェニック)鳥類を、効率的に作製する方法に関する。
背景技術
[0002] 遺伝子組換え技術の発展により、異種蛋白質の大規模な工業生産が可能となった 。しかし組換え生産に多用される大腸菌等の微生物は糖鎖付与能力がなぐまた抗 体 ·酵素のような複数のユニットからなる蛋白質を生産する能力がないため、その応 用範囲は限られている。
[0003] 現在糖鎖を必要とするエリスロポエチンや抗体医薬品などは、動物培養細胞リアク ターによって生産されている力 このような動物細胞による生産法は微生物培養に比 ベコストが高ぐ患者や行政の負担増加が問題となっている。
[0004] こうした欠点を克服した新たな蛋白質生産法として、遺伝子導入動物（トランスジェ ニック動物）の利用が注目を浴びている。トランスジヱニック哺乳類、鳥類が乳汁や血 液、卵中に生産する蛋白質は糖鎖が付与されるうえ、その生産コストは動物培養細 胞リアクターの 1/10〜1/100との試算もある（Nature Biotechnology 19, 18 4 2001)。 なかでも家禽類を使ったトランスジヱニックは、成熟までの期間が短い事 や、飼育面積が少なくて済むとの利点があるため、実用化が嘱望されている。
[0005] このような利点を持つトランスジエニック鳥類を作製するには、レトロウイルスベクタ 一を受精卵の初期胚に感染させる方法が最も有効な手段である。本発明者らは安全 性の高い複製能欠失型ウィルスベクターを用い、鳥類受精卵の初期胚に遺伝子を マイクロインジェクションすることで、体細胞の一部に導入遺伝子を持つトランスジェ- ックキメラ (GOと呼ぶ）を効率的に作製することに成功した (特開 2002— 176880号 公報)。更に放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の時期にウィルスベクターを導入 することで、宿主による蛋白質発現の抑制（サイレンシングと呼ばれる）が解除され、 高 、発現量が得られることも見出した。このように異種遺伝子の発現に導入時期依存 性があることを明らかにし、この知見を基に高い蛋白質発現量をもつトランスジェ-ッ ク鳥類の作製を可能にしたのは、当該方法が唯一のものである。
[0006] し力しこの方法で得られるトランスジエニック鳥類は、体細胞中に導入遺伝子をモザ イク状にもつキメラである。トランスジエニック鳥類による蛋白質生産を、安定な工業的 手法として実用化するためには、体細胞全体に導入遺伝子を均一にもつ完全体を 生産母体とする必要がある。この完全体を得るには、これまでのところ、生殖細胞に 導入遺伝子をもつトランスジエニック GO (生殖系列トランスジエニックキメラ体)を、別 のトランスジエニック GO (生殖系列トランスジエニックキメラ体)または野生型と交配し、 その子孫から高発現系統を選び出す (世代数に準じて G1〜G2〜G3と呼ばれる）方 法がある。しかし、生殖系列トランスジエニックキメラ体の交配力 完全体が生まれる 率は 3%程度であり、この発現頻度は決して高!、とは言えな!/、。
[0007] Simkissらは、レトロウイルスベクターを感染させた始原生殖細胞（Primordial Ge rm Cell:以下 PGCと略称する）を他の同種初期胚に移植することにより、異種遺伝 子を導入したトランスジエニック-ヮトリを作製した例を報告している（Lorraine Vick , Ying Li and K. ¾imkiss, Transgenic bird from transiormed primo rdial germ cells, Proc. R. Soc. Lond. B (1993) 251, 179— 182)。し力 S imkissらの方法は、導入したプロモーター以下の配列が蛋白発現を構成的に実現 する配列ではない等の理由から、次世代のトランスジエニック鳥類における異種遺伝 子の発現頻度は低い。
[0008] 内藤らは、異なる系統の-ヮトリ間で PGCの移植を行ったところ、その組み合わせ により後代として生まれるドナー (提供種）由来個体の比率が大きく変わることを見出 している。すなわち、ドナーとして白色レグホン種の PGCを横斑プリマスロック種初期 胚に移植したところ、レシピエント（受容種)であるプリマスロック生殖巣で成熟した生 殖細胞は、 80%以上がドナーである白色レグホン由来のものであることが確認されて いる（内藤充 鳥類胚の体外培養と操作法 蛋白質核酸酵素 Vol. 40 No. 14 (1 995) )。
[0009] 特開 2001— 045915〖こは、始原生殖前駆細胞に所望の異種遺伝子を導入し、こ れを鳥類胚に移植して発生、孵化させることを特徴とする方法により得られるトランス ジェニック鳥類が開示されて 、る。
特許文献 1 :特開 2002— 176880号公報
特許文献 2 :特開 2001— 045915号公報
非特許文献 l :Nature Biotechnology, 19, 184 2001
非特干文献 2： Lorraine Vick, ing Li and K. Simkiss, Transgenic bird from transformed primordial germ cells, Proc. R. Soc. Lond. B "99 3) 251, 179- 182
非特許文献 3 :内藤充、鳥類胚の体外培養と操作法、蛋白質核酸酵素 Vol. 40 N o. 14 (1995)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] トランスジエニック鳥類を、安全で効率のよい蛋白質生産系として応用するには、体 細胞全体に導入遺伝子が入り、導入遺伝子に由来する蛋白質を高発現する効率の よいトランスジェニック鳥類作製法の確立が不可欠である。また、生殖細胞に異種遺 伝子が導入されて 、る生殖系列トランスジエニック鳥の効率的な生産方法を、確立す る必要がある。
課題を解決するための手段
[0011] そこで本発明者は、より効率的に、完全体トランスジエニック鳥類、例えば G1完全 体作製法を確立するため、 PGC移植法の応用を考案した。特に、高濃度 (高タイタ 一）のレトロウイルスベクターを作製することによって、効率よく始原生殖細胞に感染 を行い、それによつてトランスジエニック鳥を効率的に生産出来ること、またレトロウイ ルスによって導入された異種遺伝子が、宿主による蛋白質発現抑制を受けるのを、 回避する方法を見出した。
[0012] これら方法により作製されたトランスジエニック鳥類は、医薬品等に利用可能な蛋白 質の生産に利用できる。
発明の効果
[0013] 本発明の、トランスジエニック鳥類作製法は、効率的に完全な GOトランスジエニック 鳥類を生産し得る。本発明によれば、その子孫、例えば完全な G1トランスジエニック を効率的に、誕生させることができる。
[0014] 本発明の Gl、 G2、 G3〜トランスジエニック鳥類は、体細胞で異種遺伝子に由来す る蛋白質を発現するので、血清、卵白、卵黄力 回収、精製することで、これまで生 産困難であった糖鎖が付与した蛋白質や抗体類の安価な生産系を供給することが できる。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下に本発明を詳述する。
[0016] 本発明は、第一の鳥受精卵および第二の鳥受精卵を準備し;第一の鳥受精卵の 初期胚から始原生殖細胞 (PGC)を取得し；異種遺伝子を媒介したレトロウイルスべク ターを該始原生殖細胞に感染させて、異種遺伝子を該始原生殖細胞に導入し;該 始原生殖細胞を、第二の鳥受精卵の初期胚に移植し;該第二の鳥受精卵を孵化成 長させる;ことを特徴とするトランスジエニック鳥類の作製法を提供する。
[0017] ここにいう PGCは、鳥類において生殖細胞に分ィ匕する細胞であり、初期胚では PA S染色で強く染められる細胞として最初に認められ、その後血管系の発達に伴って 血流に乗り、生殖巣原基に達して生殖細胞になる。ここにいう受精卵初期胚とは、放 卵直後の胚盤葉期 (ステージ X)力も孵卵後 96時間程度までを指す。
[0018] 本発明で使用する PGCは、鳥受精卵初期胚血液中より取得され、密度勾配遠心 分離法などにより、効率的に濃縮できる。 PGCを取得する第一の鳥受精卵から、放 卵直後を 0時間とすると孵卵開始後 40時間以降 60時間までに、特に 48時間以降 6 0時間までに、 PGCを取得するのが好ましい。ニヮトリを例にとると、白色レグホンのよ うな生殖細胞の増殖速度が速 、種類力 PGCを調製することが好ま U、。 PGCの調 製は、例えば鳥類受精卵の血液を採取することにより実施する。得られた血液を、密 度勾配遠心法によって PGCを濃縮することにより、より効率的にレトロウイルスベクタ ーを該 PGCに感染させて異種遺伝子を該 PGCに導入することができる。
[0019] 上記方法によれば、生殖系列トランスジ ニック鳥類が高率に作製できる。ここで、 生殖細胞に導入遺伝子が入っている、または入っていることが確実な個体を、生殖 系列トランスジエニック鳥類と称する。生殖系列キメラの確認には、精巣、卵巣からゲ ノムを調製し、 PCR法により導入遺伝子を確認する方法がある。また成鳥から精子を 採取し、 PCR法により確認することができる。より簡便には、蛍光蛋白マーカーを導 入遺伝子に付加することで、蛍光により確認することが可能である。
[0020] 本発明の作製法で、 PGC移植を受けた受精卵初期胚は、その生殖細胞にドナー 由来 PGC力 分ィ匕した生殖細胞とレシピエント本来の生殖細胞がモザイク状になつ た生殖系列トランスジェニックキメラ鳥類として成長し得る。一般的に、一世代目のトラ ンスジエニックキメラ鳥類は、 GOトランスジエニックキメラ鳥類と呼ばれる。また、その 子孫は、 Gl、 G2〜トランスジエニック鳥類と呼ばれる。ここで本発明の作製法を利用 することで、それら子孫において、好ましくは、完全体トランスジェニック鳥類が作製で きる。本明細書にいう完全体トランスジエニック鳥類とは、体細胞の実質的に全部に、 異種遺伝子が導入されている鳥類をいう。本発明の Gl、 G2などの完全体トランスジ エニック鳥類は、異種遺伝子をその体細胞に均等に含有し、その導入遺伝子に由来 する蛋白質を、血中、卵白中あるいは卵黄中に安定に発現することを特徴とする。
[0021] 本発明において PGCは、孵卵処理直後を除くそれ以降の時期に受精卵初期胚か ら取得され、レトロウイルスベクターによって異種遺伝子を導入されることを特徴とす る。蛋白質発現量をより高くするために、 PGCが受精卵初期胚から取得される時期 は、その PGCの由来する鳥類種に特有の最適時間がある。例えば-ヮトリにおいて は PGC取得時期として、孵化処理後 48時間以降 64時間までが好ましぐより好まし くは孵化処理後 40時間以降 60時間まで、さらに好ましくは、孵化処理後 50時間以 降 60時間までである。この異種遺伝子を導入された PGCおよびその製造方法も、本 発明のひとつである。
[0022] 異種遺伝子が導入された PGCを、他の受精卵初期胚に導入すべき時期は、種々 の時期があり得る。具体的には、その時期は、例えば、孵化処理後 12時間以降 96 時間まで、好ましくは孵化処理後 24時間以降 72時間まで、もっとも好ましくは孵化処 理後 48時間以降約 64時間までである。
[0023] 本発明者らは先にゥズラでは孵卵開始後約 48時間後、ニヮトリでは孵卵開始後約 55時間の PGCにレトロウイルスによって導入された異種遺伝子は、宿主による不活 性ィ匕を受けず、蛋白を高発現するトランスジエニック鳥類作製が可能であることを見 出した。本発明においても、これら最適時間に PGCを取得し、レトロウイルスを感染さ せることにより、蛋白発現量の高い生殖系列トランスジヱニック鳥類を作製可能である
[0024] 異種遺伝子を PGCに導入するために、本発明では異種遺伝子を媒介し得るレトロ ウィルスベクターを使用する。レトロウイルスベクターとしては、任意のレトロウイルスべ クタ一が使用できる。例えば VSV—G偽型レトロウイルスベクターであってもよい。好 ましくは、本発明で使用されるレトロウイルスベクターとしては、例えばモロ-一 'ミュー リン ·ロイケミア ·ウィルス (MoMLV)、ェビアン'ロイコシス ·ウィルス (ALV)等に由来 するベクターや、レンチウィルスベクター等が挙げられる。なかでも MoMLVに由来 するものが好ましいが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[0025] 本明細書にいう異種遺伝子を媒介し得るレトロウイルスベクターは、真核細胞にお V、てそのウィルスの RNA遺伝子情報が真核細胞の DNAに組み込まれた場合、真 核細胞にその異種遺伝子が提供されるものをいう。好ましくは、その RNAの塩基配 列が、異種蛋白質をコードする DNAの塩基配列と相補的な部分を有する。
[0026] 安全性を考慮し、異種遺伝子を媒介し得るベクターとして用いられるレトロウイルス は、複製能欠失型であってもよい。複製能欠失型ウィルスとしては、通常ウィルス粒 子の複製に必要な 3種の遺伝子 gag、 pol、 envのうちいずれかまたは全てを欠くこと により、自己複製能を欠失したウィルスが用いられる。鳥類細胞にこのウィルスベクタ 一を効率的に感染させるため、外皮タンパクを人工的に VSV— G (水疱性口内炎ゥ ィルス由来）シユードタイプとしたウィルスベクターが好ましいが、本発明はこのウィル スタイプに限定されるものではな 、。
[0027] レトロウイルスを VSV— Gシユード型とする利点としては、超遠心により濃縮可能で ある点も挙げられる。本ベクターに、 GFPのような蛍光蛋白質発現遺伝子をマーカー として組み込み、培養細胞に感染させることにより感染可能なウィルス濃度を定量す ることができる。本発明に使用するウィルスベクターは、遠心法により高濃度に濃縮さ れたものが効率の点から好ま 、。
[0028] 本発明の作製法では好ましくは、高タイターのレトロウイルスベクターを使用してもよ い。高タイターとは、例えば 1 X 107cfu/ml以上、 1 X 101Qcfu/ml以下、好ましくは 1 X 108cfu/ml以上、 1 X 101Qcfu/ml以下、より好ましくは 1 X 109cfu/ml以上、 1 X 101Q CfuZml以下のタイターであってもよい。高タイターを持つ複製能欠失型レト ロウィルスベクターを PGCに感染させることが、遺伝子を効率よく導入できる点で好ま しい。したがって、本発明は、高タイターのレトロウイルスベクターを PGCに感染させ ることによる、異種遺伝子を媒介した PGCの生産あるいは増加させる方法にも関する
[0029] 高タイターのレトロウイルスベクターを作製するには、高タイターのウィルスパッケ一 ジング細胞の選別が必要である力 そのためには蛍光蛋白マーカーを、フローサイト メーターにより選別する方法によってもよい。また遺伝子組換え技法により、外皮を V SV—Gシユード型等に変えることで、超遠心法による濃縮に耐えるレトロウイルスべク ターの作製が可能になる。一度超遠心で濃縮したウィルス液を、再度超遠心法で濃 縮する方法は、不要蛋白の混入増大の観点からインジェクション法に使用するには 好ましくはないが、 PGCに感染させる手法としては有効である。
[0030] ウィルスタイターの測定は、例えば、以下のように行う。測定の前日に NIH3T3細 胞（アメリカン'タイプ'カルチヤ一'コレクションより入手）を直径 35mmのディッシュに 約 7 X 104細胞植え培養する。蛍光マーカーを付与したウィルスの、約 102から 106倍 に希釈した溶液を各ディッシュに lmlカ卩え、約 48時間後に蛍光顕微鏡により GFPを 発現している細胞の割合（100%を 1とする）を測定し、以下の計算式によりタイター を決定する。
[0031] ウィルスタイター =細胞数 X希釈率 X発現割合
レトロウイルスベクターに異種遺伝子を導入するには、ノ ッケージングシグナル配列 を有するプラスミドを、パッケージング細胞にリポフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン 法等により導入する方法がある。
[0032] 異種遺伝子を媒介したレトロウイルスベクターを、受精卵初期胚に導入するには、リ ポフエクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法や、マイクロインジェクション法によって受 精卵初期胚に感染させる方法がある。好ましくはマイクロインジヱクシヨン法を使用し 得る。
[0033] ここにいう異種遺伝子とは、特定の宿主細胞に対して外来のソース力 起源する遺 伝子、あるいは、同じソースであっても、本来の形態から修飾されている遺伝子を意 味する。よって、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して外来性であ る力、例えば、 DNAシャッフリングの使用によって修飾された遺伝子を含む。該用語 はまた、天然には多重コピーが存在しない天然に存在する遺伝子を含む。なお、本 明細書では、異種 (性)、外来 (性)、外部 (性)遺伝子または蛋白質の語は、相互交 換的〖こ使用されることちある。
[0034] 本発明により鳥類に導入される異種遺伝子は特に限定されないが、レトロウイルス に由来しない遺伝子としては、マーカー遺伝子や、目的蛋白質を発現するための構 造遺伝子、これらの遺伝子発現をコントロールするプロモーター遺伝子、分泌シグナ ル遺伝子等から適宜選ばれる。
[0035] 上記マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、 |8—ガラクトシダーゼ遺 伝子、蛍光蛋白質例えば GFP (グリーン 'フルォレツセント ·プロテイン)等をコードし た遺伝子が挙げられる。
[0036] 上記目的蛋白質を発現するための構造遺伝子としては特に限定されず、ヒトモノク ローナル抗体、キメラ抗体、 1本鎖化等の修飾を施した人工抗体、エリスロポエチン、 G— CSF、トロンボポェチン、インターフェロンなどの遺伝子産業上有用な抗体、酵 素等をコードした遺伝子などが挙げられる。
[0037] トランスジエニック鳥類に導入する有用蛋白質遺伝子としては、エリスロポエチンの 構成遺伝子のように、発現したタンパクの活性、安定性維持に糖鎖が必要なものや、 抗体遺伝子などが挙げられる。
[0038] また、その他の有用生理活性物質の遺伝子を用いることもできる。特に、卵中での 蓄積がよいことから、ヒ HgGクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子や、ヒト IgGl,ゥズ ラ IgG2, -ヮトリ IgG2やマウス IgG2のサブクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子な ど外来性抗体の構造遺伝子が好まし ヽ。
[0039] また好ましい上記構造遺伝子としては、キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。キメ ラ抗体とは、 2種以上の異なる遺伝形質から構成される抗体のことをいう。従来マウス ノ、イブリドーマによって作製された医療用抗体は、マウス由来であるためヒト体内に投 与されると免疫系による拒絶反応が引き起こされるという問題があった。この欠点を解 消するため、例えばマウス抗体を組換え手法によって Fc部等をヒト化することにより、 拒絶反応のリスクを大幅に軽減することができる。
[0040] 上記キメラ抗体としては、例えば抗ヒト CD2抗体、抗 CD20受容体抗体、抗 TNF抗 体などが挙げられ、すでに医薬品として上巿されているものもある。
[0041] さらに好ましい上記構造遺伝子としては、 scFv— Fc抗体の構造遺伝子が挙げられ る。医療用の組換え抗体には、この他に低分子抗体と称される一群がある。免疫グロ ブリン IgGには直接抗原と結合する可変領域（Fv : Fragment of variable regeo n)と呼ばれる VH, VLのへテロ二量体力もなるドメインがあり、この Fvドメインは IgG の約 5分の 1の分子量でありながら、単独で充分な抗原結合能を持つ。 VH、 VLドメ イン間を人工的にペプチドリンカ一で結合したものが 1本鎖抗体（scFv: single chai n Fv)と呼ばれる低分子抗体で、 VH, VL単独よりも安定性が向上することが知られ ている。
[0042] Powersら（Powers, D. Bら（2000)J Immunol Method. 251 , 123)は、この s cFvにヒト IgGlに由来する Fc部を融合させることで、血中での安定性が増すことを見 出した。この scFv— Fc抗体は医療用として有用と考えられる力 安価な大量生産シ ステムである大腸菌では生産されな!、。
[0043] 上記プロモーター遺伝子としては、任意のプロモーター、例えば構成的プロモータ 一として RSVプロモーター；部位特異的プロモーター、例えば j8—ァクチンプロモー ター；時期特異的プロモーター、例えばオボアルブミンプロモーターなどが挙げられ る。好ましくは、構成的なプロモーターを使用する。抗体遺伝子が構成的なプロモー ターにより制御されている場合、抗体遺伝子発現が安定してよいので好ましい。より 好ましい構成的なプロモーターとして、 -ヮトリ βァクチンプロモーターが挙げられる。 βァクチンプロモーターで発現制御した場合、 目的タンパクは血中に発現される特 徴がある。
[0044] 一般的なトランスジヱニック動物による蛋白質生産では、乳汁、あるいは卵中に目 的蛋白質を生産させる時、性成熟によって乳汁分泌、あるいは産卵等が開始される までその生産量がどれくらいか見当がつかないとの欠点がある。生物種によっては性 成熟には数年力かる場合もあり、産業的に目的タンパクを計画生産する時の大きな 不安定要素となっている。この点、 j8ァクチンプロモーターで発現制御したトランスジ エニック鳥類においては、幼鳥類の段階で血液中のタンパク発現量を調べる事で、 性成熟後の卵中タンパク発現量を予見的に把握することが可能であり、計画生産に は大きなプラス要因となる。
[0045] 本発明で使用する鳥類としては特に限定されず、例えば-ヮトリ、七面鳥類、カモ、 ダチョウ、ゥズラなど、食肉、採卵目的で家畜化されている家禽鳥類や愛玩用鳥類を 挙げることができる。なかでも-ヮトリやゥズラは入手が容易で、産卵種としても多産で ある点が好ましい。
[0046] 本発明にお 、て、受精卵初期胚を取得するための第一の鳥類と、異種遺伝子が導 入された始原生殖細胞を移植すべき受精卵初期胚の由来となる第二の鳥類とは、同 一種でも異なる種でも可能である。同一種、または同一種かつ同一系統を採用する 場合、同一個体でも異なる個体でも可能である。簡便には、異なる個体を使用する。 また、例えば-ヮトリの PGCをゥズラに移植することも可能である。しかし移植効率の 観点から、同一種間の移植が好ましい。
[0047] 同一種の中では同じ系統間の移植でもよいが、異なる系統間の移植が可能である 。具体的には、第一の鳥受精卵初期胚が取得される鳥の系統と、第二の受精卵初期 胚が取得される鳥の系統が異なってもよい。このとき、第一の鳥受精卵初期胚におけ る生殖細胞の増殖速度と、第二の受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度が異 なる場合がある。好ましくは、第一の受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度の 方が、第二の受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度よりも大きい場合である。 例えば、ニヮトリ白色レグホン由来の PGCにレトロウイルスで異種遺伝子を導入し、二 ヮトリ横斑プリマスロックの受精卵に移植することが可能である。この場合、 PGC提供 系統である白色レグホンのほうが生殖細胞の増殖速度において勝るため、異種遺伝 子を導入された白色レグホンの生殖細胞のほうがプリマスロック体内で優位に生成す るとの点で好ましい。またこの場合、羽毛色によってドナーの子孫を簡便に見分ける 事ができる点が好ま 、。本例のように羽毛色の異なる種間で PGC移植を行なう利 点として、異種遺伝子を導入したドナー PGC由来のトランスジエニック鳥類を、目視 により簡便に選別できる。 [0048] 上記異種遺伝子が導入された初期胚を有する受精卵を通常の家禽飼育法にした 力 て孵化成長させ、トランスジエニック鳥類を生産する。該トランスジエニック鳥類に 、通常の繁殖法、伝統的育種法または遺伝子工学的手法を適用して、その子孫を生 産する。
[0049] GO生殖系列トランスジ ニックキメラ鳥類と非トランスジ ニック鳥類、例えば野生型 鳥類、あるいは GO生殖系列トランスジヱニックキメラ鳥類同士を交配させて誕生する 子孫、例えば二世代目、三世代目は、これらが導入遺伝子を染色体にもつ生殖細胞 から発生した場合、全身の体細胞に導入遺伝子を含有する完全体個体として成長 する。この生殖系列トランスジエニックキメラ個体力も導入遺伝子を受け継ぐ子孫を、 代々 G1〜G2〜G3トランスジエニック鳥類と称する。交配は自然交配でも人工交配 でもよいが、生産を人為的に調整できる観点力も人工交配が好ましい。
[0050] また交配する相手は、ドナー系統、レシピエント系統または別個の第三系統でもよく 、他の種でも受精可能ならば交配できるが、受精効率の点からドナー系統との交配 が好ましい。交配型としては GOトランスジエニックォスと野生型メス、 GOトランスジェ- ックメスと野生型ォス、 GOトランスジエニックのォスとメス等が考えられ、更に子孫とそ の親による戻し交配も可能である。中でも GOォスと野生型メスの交配型は、 1羽の GO ォスに対し、野生型メス 3羽から 10羽を交配させることができるため、効率の点力も好 ましい。
[0051] 本発明による GO生殖系列トランスジヱニックキメラ鳥類を、先に述べたごとく交配さ せることにより、導入遺伝子を子孫に伝播させることができるとともに、全身の体細胞 に導入遺伝子をもつ完全なトランスジエニック鳥類を作製できる。レトロウイルスを受 精卵に直接インジェクションする方法で GOトランスジエニック鳥類を作製した場合、生 殖系列トランスジエニックキメラ体 GOの選別を行う必要があり、更にその交配によって 導入遺伝子をもつトランスジヱニック完全体 G1が誕生する頻度が 3%程度と低いとの 問題があつたが、本発明による PGC移植法では、高い頻度で生殖系列トランスジェ ニック鳥類 GOが得られ、その結果高!、頻度で G1完全体が誕生することが可能であ る。また、第一の受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度の方が、第二の受精卵 初期胚における生殖細胞の増殖速度よりも大きい場合、 GO個体において、導入遺 伝子を有するドナー側の生殖細胞が、レシピエント側の生殖細胞より存在比が高くな るため、結果として G1や G2などの子孫における完全体の割合をより高めることが可 能である。こうして作製した完全体の系統保存には、精子凍結保存法の応用が可能 である。
[0052] 本発明は、このように蛋白質生産に有利な完全体としてのトランスジエニック鳥類作 製法を開示する。また該作製法による遺伝子導入鳥類を開示する。
[0053] このように、安定的に導入遺伝子を伝播するトランスジヱニック鳥類の系統を確立す ることで、蛋白質産生システムとしての品質の安定ィ匕が可能である。更に完全なトラン スジエニック鳥類は、導入遺伝子をもつ体細胞の割合が多いことから、 GOトランスジ エニックキメラ鳥類に比べ、導入遺伝子に由来する組換え蛋白質の産生量が増加す ることが可能である。
[0054] 本発明のタンパク生産法は、上記トランスジエニックキメラ鳥類力 抗体を抽出し、 必要により精製することを特徴とする。上記トランスジエニック鳥類は、 GOであってもよ ぐあるいはその子孫例えば、 Gl、 G2またはそれ以降の世代のトランスジエニック鳥 類子孫であってよい。より詳細には、作製されたトランスジエニックキメラ鳥類の血中 及び Z又は卵中から抗体を回収、精製する抗体の生産法である。抗体の抽出は、硫 安沈殿等による不用蛋白除去、プロテイン A等の吸着カラム、イオン交換カラムや、 限外濾過膜等による分別処理の組み合わせにより行う。
[0055] 本発明の GOトランスジエニックキメラ鳥類において、鳥類に導入される遺伝子として 、これらヒトモノクローナル抗体遺伝子、キメラ抗体遺伝子、 scFv— Fc抗体遺伝子、 1 本鎖化等の修飾を施した人工抗体、エリスロポエチン、 G— CSF、トロンボポェチン、 インターフェロンなどの遺伝子産業上有用な抗体、生理活性蛋白、酵素等をコードし た遺伝子を使用する。従来生産が困難だった抗体などの医薬品を安価に大量生産 することができる。
[0056] 例えば、キメラ抗体遺伝子を導入した GOトランスジエニックキメラ鳥類の場合、血液 中の抗体含有量の例は、好ましくは約 0. 5 μ gZml以上、より好ましくは約 5 μ g/m 1以上である。また、卵白中の抗体含有量の例は、好ましくは約 0. 1 μ gZml以上、よ り好ましくは約 1 μ gZml以上であり、卵黄中の抗体含有量の例は、好ましくは約 0. 1 μ gZml以上、より好ましくは約 1 μ gZml以上である。
[0057] また、 scFv—Fc抗体遺伝子を導入した GOトランスジエニックキメラ鳥類の場合、血 液中の抗体含有量の例は、好ましくは約 20 /z gZml以上、より好ましくは約 2000 gZml以上である。また、卵白中の抗体含有量の例は、好ましくは約 5 μ gZml以上
、より好ましくは約 500 μ gZml以上である。
[0058] さらに、本発明によれば、本発明のトランスジエニック鳥類の作製法によって、畜産 用または愛玩用の鳥類の品種改良も行い得る。
実施例
[0059] 以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定され るものではない。
[0060] (実施例 1)抗 CD2抗体発現ベクターコンストラクトの作製
抗 CD2抗体発現用ベクターコンストラクト pMSCVZG Δ AH、 pMSCV/G A AL 及び pMSCVZG Δ ALIHは、以下のように作製した。
[0061] ヒト抗体（IgM)産生ハイブリドーマ細胞 D253— 15— 6 (アメリカン'タイプ'カルチヤ 一'コレクション HB— 8789)から Quick Prep Micro mRNA Purification Kit (フアルマシア社製）を用いて mRNAを取得し、得られた mRNAから First— Str and cDNA Synthesis Kit (フアルマシア社製）を用いて cDNAライブラリを調製 L† 0 2つのィ匕学合成才ジゴヌクレ才チ 5， - atcctcgagaggccaaagtacagtg - 3 ' ( 下線部は Xhol制限酵素サイ卜）及び 5 ' - cccggatccctaacactctcccctgttgaagct - 3 ' (下線部は BamHI制限酵素サイト）をプライマーとする PCR (94°CZl分→50 °CZl分→72°CZl分 30秒： 25サイクル; Taq DNAポリメラーゼ（パーキンエルマ 一社製) )により上記 cDNAライブラリからヒト抗体 L鎖 κ定常領域 (hC κ )の遺伝子 断片を増幅後、制限酵素 Xhol及び BamHIによって切り出し、プラスミド pBluescrip tllKS ( -) (ストラタジーン社製）の XhoI、 BamHIサイトへ挿入し、プラスミド pBlueZ hC κを作製した。
[0062] 同様にして、 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5 '— aecggccgctacaggtgtccactc cgacatcgtgatgacccagtctcc - 3 ' (下線部は Notl制限酵素サイ卜）及び 5， -cctct cgaggatagaagttattcagcaggcacac - 3 ' (下線部は Xhol制限酵素サイト）をプライ マーとする PCRにより上記 cDNAライブラリからヒト抗体 L鎖可変領域 (hVL)の遺伝 子断片を増幅後、制限酵素 Notl及び Xholによって切り出し、 pBluescriptllKS ( - )の NotI、 Xholサイトへ挿入し、プラスミド pBlueZhVLを作製した。
[0063] 同様にして、 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5，一 aceies^scgtggccgttggctgc ctcgcaca - 3 ' (下線部は Xhol制限酵素サイ卜）及び 5， - actaagcttacgttgtacagg gtgggtttacc - 3 ' (下線部は Hindm制限酵素サイト）をプライマーとする PCRにより 上記 cDNAライブラリからヒト抗体 H鎖 μ定常領域 (hC μ )の遺伝子断片を増幅後、 制限酵素 Xhol及び Hindmによって切り出し、 pBluescriptllKS (—）の XhoI、 Hin dillサイトへ挿入し、プラスミド pBlueZhC μを作製した。
[0064] 同様にして、 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5 '— aecggccgctacaggtgtccactc cgaggtgcagctggtggagtctgg - 3 ' (下線部は Notl制限酵素サイト）及び 5 ' - cacgc tcgaggtatccgacggggaattctcacagga - 3 ' (下線部は Xhol制限酵素サイト）をプラ イマ一とする PCRにより上記 cDNAライブラリからヒト抗体 H鎖可変領域 (hVH)の遺 伝子断片を増幅後、制限酵素 Notl及び Xholによって切り出し、 pBluescriptllKS ( 一）の NotI、 Xholサイトへ挿入し、プラスミド pBlueZhVHを作製した。
[0065] pBlue/hC κ力 hC κ遺伝子断片を制限酵素 Xhol及び BamHIによって切り出 し、プラスミド pCEP4 (インビトロジェン社製）の XhoI、 BamHIサイトへ挿入し、プラス ミド pCEP4ZhC κを作製した。
[0066] 2つのィ匕学合成オリゴヌクレオチド 5， - cccaagcttgatctccactgggatggtgggggccc tcctcttgctgctg— 3，（下線部は Hindm制限酵素サイト）及び 5， - cccggatcctcag tcaaggcgccttcgcatgaagaggccgatccccagggccaccaccagcagcaagaggagggcccc - 3 ' (下線部は BamHI制限酵素サイト）を 21bpsにわたつて相補的な 3 '末端でァ- ールさせ、 T4 DNAポリメラーゼ (宝酒造社製)を用いた DNA2重鎖合成反応によ つて上皮増殖因子受容体膜貫通領域 (TM)の遺伝子断片を調製した。得られた T M遺伝子断片を制限酵素 Hindm及び BamHIによって処理後、 pBluescriptllKS ( 一）の HindIII、 BamHIサイトに挿入し、プラスミド pBlue/TMを作製した。
[0067] pBlue/hC μ力 hC μ遺伝子断片を制限酵素 Xhol及び Hindmによって切り出 し、 pBlue/TMの XhoI、 Hindlllサイトへ挿入し、プラスミド pBlue/hC μ TMを作 製した。
[0068] pBlue/hC μ TMから一連の hC μ遺伝子及び ΤΜ遺伝子を含む断片を制限酵素
Xhol及び BamHIによって切り出し、 pCEP4の XhoI、 BamHIサイトへ挿入し、プラ スミド pCEP4ZhC μ TMを作製した。
[0069] pCEP4ZhC /z TMを制限酵素 BamHIによって切断し、末端を T4 DNAポリメラ ーゼによって平滑処理後、セルフライゲーシヨンによりプラスミド pCEP4ZhC μ TM
Δ Βを作製した。
[0070] ィ匕学合成才ジゴヌクレ才チ 5， - tgaagacagatggcgccgccacagttcgttt - 3 ' (下 線部は Narl制限酵素サイト）を用いた部位特異的変異導入により pBlueZhVLが保 有する hVLの 3 '末端にアミノ酸暗号の変更を伴わずに制限酵素 Narlサイトを導入し 、プラスミド pBlue/hVLNを作製した。
[0071] 化学合成オリゴヌクレオチド 5， - tggggcggatgcggatcctgaggagacggt - 3 ' (下線 部は BamHI制限酵素サイト）を用いた部位特異的変異導入により pBlueZhVHが 保有する hVHの 3 '末端にアミノ酸暗号の変更を伴わずに制限酵素 BamHIサイトを 導入し、プラスミド PBlue/hVHBを作製した。
[0072] 抗ヒト CD2マウス抗体産生ハイブリドーマ細胞 TS2Z18. 1. 1 (アメリカン 'タイプ' カルチャー.コレクション HB— 195)から Quick Prep Micro mRNA Purifica tion Kitを用いて mRNAを取得し、得られた mRNAから First— Strand cDNA Synthesis Kitを用いて cDNAライブラリを調製した。 2つの化学合成オリゴヌクレオ チド 5 ' - cgcggccgcctcagggaaagtttgaagatg - 3 ' (下線部は Notl制限酵素サイト )及び 5 ' - cggcgccgccacagtccgttttatttccagcttggt - 3 ' (下線部は Narl制限酵 素サイト）をプライマーとする PCRにより上記 cDNAライブラリからマウス抗体 L鎖可変 領域 (mVL)の遺伝子断片を増幅後、制限酵素 Notl及び Narlによって切り出し、 p BlueZhVLNの NotI、 Narlサイトへ挿入してプラスミド pBlueZmVLを作製した。
[0073] 同様にして、 2つのィ 学合成オリゴヌクレオチド 5 , - cgcggccgcgaacacggamccct caccatg- 3 ' (下線部は Notl制限酵素サイ卜）及び 5， - cggatcctgcagagacagtgac cagagt- 3 ' (下線部は BamHI制限酵素サイト）をプライマーとする PCRにより上記 c DNAライブラリからマウス抗体 H鎖可変領域 (mVH)の遺伝子断片を増幅後、制限 酵素 Notl及び BamHIによって切り出し、 pBluescriptllKS (—）の NotI、 BamHIサ イトへ挿入し、プラスミド pBlue/mVHを作製した。
[0074] pBlueZmVLから mVL遺伝子断片を制限酵素 Notl及び Xholによって切り出し、 pCEP4/hC κの NotI、 Xholサイトへ挿入し、プラスミド pCEP4/lgL κを作製した
[0075] pBlueZhVHBから hVH遺伝子断片を制限酵素 Notl及び Xholによって切り出し 、 pCEP4/hC μ ΤΜ Βの NotI、 Xholサイトへ挿入し、プラスミド pCEP4ZhIgH μ ΤΜを作製した。
[0076] pBlueZmVHから mVH遺伝子断片を制限酵素 Notl及び BamHIによって切り出 し、制限酵素 Notl及び BamHIによって処理した pCEP4ZhIgH μ ΤΜのベクター 断片に連結し、プラスミド pCEP4ZlgH /z ΤΜを作製した。
[0077] pMSCVneoは公知文献（Gene Ther. 1994 MAR; 1(2) : 136— 8. )とインタ 一ネットの情報を元に全合成した (東洋紡績社製)。 pMSCVneoから一連のミューリ ン ·ホスホグリセレート'キナーゼ（PGK)プロモーター及び Neor遺伝子を含む断片を 制限酵素 Bglll及び BamHIによって除去し、残ったベクター断片のセルフライゲーシ ヨンによりプラスミド pMSCVを作製した。
[0078] pGREEN LANTERN— 1から GFP遺伝子断片を制限酵素 Notlによって切り出 し、 pZeoSV2 ( + )の Notlサイトに挿入した。 T7プロモーターと同方向に GFP遺伝 子が挿入された構造のプラスミドを pZeoZGFPとした。
[0079] pZeoZGFPから GFP遺伝子断片を制限酵素 EcoRI及び Xholによって切り出し、 制限酵素 EcoRI及び Xholによって処理した pMSCVのベクター断片に連結し、プラ スミド pMSCVZGを作製した。
[0080] ヒト抗体（IgGl)産生ミエローマ細胞 IM— 9 (ジャパニーズ 'コレクション'ォブ 'リサ ーチ'バイオリソーシズ 0024)力ら mRNA isolation Kit (ロッシュ社製）を用いて mRNAを取得し、得られた mRNAから ReverTra Ace (東洋紡社製）を用 、て cD NAライブラリを調製した。 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5， -caagcttcaagggcc cat— 3 ,及び 5 ' - atttacccggagacaggga- 3 'をプライマーとする PCR (95。CZ2 分→52°CZ30秒→74°CZ3分： 30サイクル； Pfu DNAポリメラーゼ（プロメガ社製 ) )により上記 cDNAライブラリからヒト抗体 H鎖 γ 1定常領域 (Μ γ 1)の遺伝子断片 を増幅した。さらに、 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5 '— ataggatccgctagcttcaa gggcccatcg— 3 ' (下線部は BamHI制限酵素サイト）及び 5 ' -agcaagctttcatttac ccggagacaggga- 3 ' (下線部は Hindlll制限酵素サイト）をプライマーとする PCR (9 4°C/ 15秒→58°CZ30秒→68°CZ 1分： 30サイクル； KOD— plus - DNAポリメラ ーゼ）により上記 PCR産物力 hC y 1遺伝子断片を増幅後、制限酵素 BamHI及び Hindlllによって切り出し、 pBluescriptIISK ( + )の BamHI、 Hindlllサイトへ挿入 し、プラスミド pBlue/hC y 1を作製した。
[0081] pCEP4/lgH μ ΤΜから mVH遺伝子断片を制限酵素 Hindlll及び BamHIによつ て切り出した。 pBlueZhC y 1から hC y 1遺伝子断片を制限酵素 BamHI及び Hind ΠΙによって切り出した。制限酵素 Hindlllによって処理したプラスミド pETBlue— 2 ( ノバジェン社製)のベクター断片に上記切り出した 2断片を連結し、プラスミド pETBlu eZlgH y lを作製した。
22. pETBlue/lgH γ 1から抗体 Η鎖 γ 1 (IgH γ 1)の遺伝子断片を制限酵素 Hin dillによって切り出し、 pMSCVZGの Hindlllサイトへ挿入した。 GFP遺伝子と同方 向に IgH γ 1遺伝子が挿入された構造のプラスミドを pMSCVZGHとした。
[0082] 2つのィ匕学合成オリゴヌクレオチド 5， - acgcgtcgacgtgcatgcacgctcattg - 3 ' (下 線部は Sail制限酵素サイト）及び 5 ' - acgcgtcgacaacgcagcgactcccg - 3 ' (下線 部は Sail制限酵素サイト）をプライマーとする PCR (94°CZ15秒→50°CZ30秒→6 8°CZl分： 10サイクル； 94°CZ15秒→62°CZ30秒→68°CZl分： 30サイクル）に より pMiwZから Δ Actプロモーター断片を増幅後、制限酵素 Sailによって Δ Actプ 口モーター断片を切り出し、 pETBlue— 2の Sailサイトへ挿入し、プラスミド pETBlue Ζ Δ Actを作製した。
[0083] pETBlueZ Δ Actから Δ Actプロモーター断片を制限酵素 Sailによって切り出し、 pMSCV/GHの Xholサイトへ挿入した。 IgH γ 1遺伝子と同方向に Δ Actプロモー ターが挿入された構造のプラスミドを pMSCVZG Δ AHとした。
[0084] 2つのィ匕学合成才ジゴヌクレ才チ 5， - aatgtcgacatggtgtccacttctcagctc - 3 ' ( 下線部は Sail制限酵素サイト）及び 5， - ttcgtcgacctaacactctcccctgttgaa - 3 ' ( 下線部は Sail制限酵素サイト）をプライマーとする PCR (95°C/30秒→50°C/30 秒→74°CZ2分： 10サイクル； 95°CZ30秒→60°CZ30秒→74°CZ2分： 30サイク ル； Pfu DNAポリメラーゼ）により pCEP4Z L κから抗体 L鎖 κ (IgL κ )の遺伝子 断片を増幅後、制限酵素 Sailによって切り出し、 pETBlue— 2の Sailサイトへ挿入し 、プラスミド pETBlue/lgL κを作製した。
[0085] pETBlueZ Δ Actから Δ Actプロモーター断片を制限酵素 Sailによって切り出し、 pMSCVZGの Xholサイトへ挿入した。 GFP遺伝子と同方向に Δ Actプロモーター が挿入された構造のプラスミドを pMSCVZG Δ Aとした。
27. pETBlue/lgL κから IgL κ遺伝子断片を制限酵素 Sailによって切り出し、 pM SCVZG Δ Aの Sailサイトへ挿入した。 Δ Actプロモーターと同方向に IgL κ遺伝子 断片が挿入された構造のプラスミドを pMSCVZG Δ ALとした。
[0086] 2つのィ匕学合成オリゴヌクレオチド 5， - acgcgtcgaccgcccctctccctccccc - 3 ' (下 線部は Sail制限酵素サイト）及び 5， - ccgctcgagattatcatcgtgtttttcaaaggaaaacc acgtc - 3 ' (下線部は Xhol制限酵素サイト）をプライマーとする PCR (94°CZ15秒 →60°C/30秒→68°C/1分： 30サイクル）によりプラスミド pLXIN (クロンテック社製 )から IRES断片を増幅後、制限酵素 Sail及び Xholによって切り出し、 pETBlue— 2 の Sall、 Xholサイトへ挿入し、プラスミド pETBlueZlRESを作製した。
[0087] pETBlueZlRESから IRES断片を制限酵素 Sail及び Xholによって切り出し、 pM SCVZG A AHの Sailサイトへ挿入した。 IgH γ 1遺伝子と同方向に IRESが挿入さ れた構造のプラスミドを pMSCVZG Δ AIHとした。
[0088] pETBlue/lgL κから IgL κ遺伝子断片を制限酵素 Sailによって切り出し、 pMS CV/G Δ AIHの Sailサイトへ挿入した。 Δ Actプロモーターと同方向に IgL κ遺伝 子断片が挿入された構造のプラスミドを pMSCVZG Δ ALIHとした。
[0089] このように作製した複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクト PM SCV/G Δ ALIHの構造を図 1に示した。
[0090] (実施例 2)抗 CD2抗体発現レトロウイルスベクターの調製
実施例 1で作製したベクターコンストラクト pMSCV/G A ALIHよりレトウィルスべク ターを調製するため、ノ ッケージング細胞 GP293 (クロンテック社製)を直径 100mm の培養ディッシュに 5 X 106細胞植え、培養した。培地を新鮮な DMEM (ダルベッコ 変法イーグル培地）に交換し、 p— VSV— Gベクター（クロンテック社製） 8 μ gと pMS CVN AA jS 8 μ gをリポフエクシヨン法により前記 GP293細胞に導入した。 48時間後 、ウィルス粒子を含む培養上清を回収し、 0. 45 m酢酸セルロースフィルター（アド バンテック社製)を通して夾雑物を除去した。得られた溶液にポリプレン (シグマ社製) を 10 μ gZmlとなるように加えウィルス液とした。
[0091] 調製したウィルス液を別に培養した GP293細胞に加え、 48時間培養後 600 μ gZ mlの G418 (GIBCO BRL社製）を含む培養液で植え継ぎ、安定な G418安定形質 転換 GP293株を取得した。
[0092] 得られた安定形質転^ ¾を 80%コンフルェントとなるよう直径 100mmディッシュに 培養し、 16 /z gの pVSV— Gをリポフエクシヨン法で導入した。 48時間後ウィルス粒子 を含む培養上清 12mlを回収した。
[0093] この培養上清を 50, 000 X g、 4°Cで 1. 5時間遠心を行、、ウィルスを沈殿させた。
上清を除き、ウィルス粒子を含む沈殿物に 50 1の 50mM Tris—HCl (pH7. 8)、 130mM NaCl、 ImM EDTA溶液を加え、 4°Cでー晚放置後、よく懸濁してウイ ルス溶液を回収した。このようにして得られた高タイターウィルスベクターは、 108cfu Z mlで toつた。
[0094] ウィルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日に NIH3T3細胞（ァメ リカン 'タイプ'カルチヤ一'コレクションより入手）を直径 35mmのディッシュに 7 X 104 細胞植え培養した。 102から 106倍に希釈したウィルス溶液を各ディッシュに lmlカロえ 、 48時間後に蛍光顕微鏡により GFPを発現している細胞の割合を測定し、以下の計 算式によりタイターを決定した。
[0095] ウィルスタイター =細胞数 X希釈率 X発現割合 （cfuZml)
[0096] (実施例 3) PGCの調製
-ヮトリの受精卵由来 PGCは、以下のように調製した。
[0097] 孵卵開始後 50時間目（ステージ Xin〜XV)のニヮトリ受精卵 (城山種鶏場産)を横 置きにして、 1分間以上静置した。静置することにより胚が上部に移動するため、この 状態を保って静かに卵を割り、シャーレに移した。 [0098] 卵黄の上部に胚体があることを確認し、血管より 0. 5〜1. Ocm外側を血管に沿つ てハサミで切り取り、ヘラとピンセットですくいあげてリン酸緩衝液（1N塩酸にて pH7 . 4に調製)を満たしたシャーレに移した。この胚体をピンセットでつまみ、リン酸緩衝 液で卵黄を洗 ヽ落とした。洗浄後の胚体を 38°Cに熱したリン酸緩衝液を満たしたシ ヤーレに移し、ピンセットで広げた。
[0099] 実体顕微鏡下に観察しながら、胚体の腹部動脈血管を、切断用針を用いて切断し た。この操作によって流出した血液が胚体に溜まるので、先を細くしたノ スツールピ ペットを使ってこの血液を吸引し、ダルベッコ変法最小必須培地（D— MEM インビ トロジヱン社製）に懸濁した。
[0100] 集めた PGCを含む血液を遠心分離によって培地力 分離し、 300 μ 1の 6. 3%Fic oll400 (シグマ社製）【こ懸淘し、 600 /z lの 160/0Ficoll400【こ重層後、 1500rpmで 3 0分間遠心した。
[0101] 遠心処理により、 Ficollの境界付近に集められた PGCを回収し、ダルベッコ変法最 小必須培地で 3回洗浄後、同培地 lmlに懸濁後遠心濃縮した。
[0102] 実施例 2で調製した抗 CD2抗体発現レトロウイルスベクターを、同量の PGC懸濁液 とともに 37°Cで 4時間インキュベートし、抗 CD2抗体発現のための遺伝子が導入され た PGCを得た。
[0103] (実施例 4) PCR法による PGC中導入遺伝子の確認
実施例 3で調製した抗 CD2抗体発現のための遺伝子が導入された PGCから、キッ ト（東洋紡社製 MagExtractor— genome )を用いて抽出したゲノム DNA50ng を使 、、 PCR法で抗 CD2抗体発現用遺伝子が導入されて 、ることを確認した。
[0104] PCR法には、導入遺伝子に含まれる GFP遺伝子の一部 355bpを増幅可能なブラ イマ一セット：5 ' - CAACACTGGTCACTACCTTCACCTATG— 3， /5，— A CGGATCCATCCTCAATGTTGTGTC— 3，を用いた。内部標準として、 -ヮトリ ゲノムに含まれるオボアルブミン遺伝子の一部 317bpを増幅可能なプライマーセット ： 5，— CGCTTTGATAAACTTCCAGGATTCGG— 3， /5，— CATCTAGCT GTCTTGCTTAAGCGTACA 3，を用いた。
[0105] 結果を図 2に示した。 [0106] (実施例 5) -ヮトリ胚へのレトロウイルスベクター感染 PGCのインジェクション 実施例 1とは別のニヮトリ受精卵を用意し、自動転卵装置が内蔵された孵卵器 (昭 和フランキ社製 P— 008型）内で 37. 9°C、湿度 65%環境に置いた時刻を孵卵開始 時刻（0時間）とし、以後 15分毎に 90度転卵しながら孵卵を行なった。
[0107] 孵卵開始後、受精卵の卵殻を 70%エタノールで消毒し、鋭端部を直径 3. 5cmの 円形にダイヤモンドカッター（MINOMO7C710、ミニター社製）で切り取り、胚を露 出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管 (CD— 1、ォリンパス社製） をマイクロピペット製作器 (PC— 10,オリンノス社製)でカ卩ェし、外径約 20 mとなる よう先端を折って作製した針を刺し、マイクロインジェクター（Transjector5246、エツ ペンドルフ社製)を用いて胚盤下腔の中央に、実施例 3で調製した抗 CD2抗体発現 のための遺伝子が導入された PCG懸濁液を 2 1注入した。この卵殻の切り口まで卵 白を満たした後、卵白を糊としてテフロン (登録商標)膜 (ミリラップ、ミリポア社製)とポ リ塩ィ匕ビ-リデンラップ (サランラップ、旭化成社製)とで蓋をし、 15分毎に 90度転卵 しながら孵卵を行なった。
[0108] 以上の操作を、それぞれ、孵卵後 50時間、 55時間、 60時間の受精卵に対して実 施した結果、インジェクションに最も好ましいのは、 -ヮトリの場合孵卵処理後 55時間 の受精卵であることがわ力つた。
産業上の利用可能性
[0109] 本発明の、トランスジエニック鳥類作製法は、効率的に完全な GOトランスジエニック 鳥類を生産し得る。本発明によれば、その子孫、例えば完全な G1トランスジエニック を効率的に、誕生させることができる。
[0110] 本発明の Gl、 G2、 G3〜トランスジエニック鳥類は、体細胞で異種遺伝子に由来す る蛋白質を発現するので、血清、卵白、卵黄力 回収、精製することで、これまで生 産困難であった糖鎖が付与した蛋白質や抗体類の安価な生産系を供給することが できる。
図面の簡単な説明
[0111] [図 1]抗 CD2抗体発現ベクターコンストラクト pMSCVZG AAH、 pMSCV/G AA L及び pMSCVZG Δ ALIHの構造を示す。 Amp1"はアンピシリン耐性遺伝子を示す 。 Ρ Δ actは j8—ァクチンプロモーター遺伝子を示す。 Ψ +はパッケージングシグナ ル配列を示す。 GFPはグリーン 'フルォレツセント'プロテイン遺伝子を示す。 Lは抗 CD2抗体軽鎖遺伝子を示す。 Hは抗 CD2抗体重鎖遺伝子を示す。 5 'LTR及び 3' LTRはそれぞれ MoMLVのロングターミナルリピート配列を示す。
[図 2]抗 CD2抗体発現遺伝子を、レトロウイルスベクターにより導入した PGCの PCR 結果である。レーン 1は無処理の PGC。レーン 2は抗 CD2発現遺伝子を導入した PG Cを表す。矢印は導入遺伝子を示す。
符号の説明
[0112] 1 レーン 1を示す。
[0113] 2 レーン 2を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 第一の鳥受精卵および第二の鳥受精卵を準備し、
第一の鳥受精卵の初期胚から始原生殖細胞を取得し、
異種遺伝子を媒介したレトロウイルスベクターを該始原生殖細胞に感染させて、異種 遺伝子を該始原生殖細胞に導入させ、
該始原生殖細胞を第二の鳥受精卵の初期胚に移植し、そして
該第二の鳥受精卵を孵化成長させることを特徴とする、
トランスジエニック鳥類の作製法。
[2] トランスジエニック鳥類力 生殖系列トランスジエニック鳥である、請求項 1記載のトラ ンジエニック鳥類の作製法。
[3] 始原生殖細胞の取得が、第一の鳥受精卵の孵卵開始力も 40時間以降 60時間ま でに行われることを特徴とする、請求項 1記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
[4] レトロウイルスベクターが、複製能欠失型であることを特徴とする、請求項 1記載のト ランスジエニック鳥類の作製法。
[5] レトロウイルスベクターが、 1 X 107cfu/mL以上、 1 X 101(>cfu/mL以下のタイタ 一をもつレトロウイルスベクターであることを特徴とする、請求項 1記載のトランスジェ ニック鳥類の作製法。
[6] 始原生殖細胞の第二の鳥受精卵初期胚への移植が、第二の鳥受精卵の孵卵開 始から 24時間以降 72時間までに行われることを特徴とする、請求項 1記載のトランス ジェニック鳥類の作製法。
[7] 始原生殖細胞の第二の鳥受精卵初期胚への移植が、第二の鳥受精卵の孵卵開 始カも 48時間以降 64時間までに行われることを特徴とする、請求項 1記載のトランス ジェニック鳥類の作製法。
[8] 第一の鳥の系統と第二の鳥の系統とが異なることを特徴とする、請求項 1〜7いず れカ 1項記載のトランスジエニック鳥類の作製法。
[9] 第一の鳥の系統が-ヮトリ白色レグホンであり、かつ、第二の鳥の系統が-ヮトリ横 斑プリマスロックであることを特徴とする、請求項 8記載のトランジェニック鳥類の作製 法。
[10] 請求項 1記載の作製法にしたがってトランスジエニック鳥類を作製し、 得られたトランスジヱニック鳥類を、野生型又は他のトランスジヱニック鳥類と交配させ ることを特徴とするトランスジエニック鳥類の子孫の作製法。
[11] トランスジエニック鳥類の子孫が完全体トランスジエニック鳥類である、請求項 10記 載のトランジェニック鳥類の子孫の作製法。
[12] 請求項 1記載の作製法にしたがってトランスジエニック鳥類を作製し、そしてその体 細胞、体液又は卵から異種蛋白質を抽出することを特徴とする、異種蛋白質の生産 法。
[13] 請求項 10または 11記載の作製法にしたがってトランスジエニック鳥類の子孫を作 製し、そしてその体細胞、体液又は卵から異種蛋白質を抽出することを特徴とする、 異種蛋白質の生産法。
[14] 鳥始原生殖細胞に、 1 X 107cfu/mL以上、 1 X 101Qcfu/mL以下のタイターをも つレトロウイルスベクターを感染させることを特徴とする、異種遺伝子が導入された生 殖細胞の生産方法。
[15] 鳥始原生殖細胞が、孵卵開始から 40時間以降 60時間までの鳥受精卵の初期胚 力も取得されたものであることを特徴とする、請求項 14記載の始原生殖細胞の生産 方法。
[16] 請求項 1記載の作製法にしたがってトランスジエニック鳥を作製することを特徴とす る、畜産用または愛玩用の鳥類の品種を改良する方法。
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