WO2006030693A1 - 毛髪問題治療剤、及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

毛髪問題治療剤、及びそのスクリーニング方法 Download PDF

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Mitsuko Kawano
Akiko Kuramochi
Masashi Suzuki
Masahiro Asada
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    • G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]

Definitions

  • the present invention relates to a hair growth promoter comprising a component that promotes the growth of hair follicles (synonymous with hair roots).
  • the present invention relates to a hair growth promoting agent, a hair problem treating agent used as an alopecia treating agent, and a screening method thereof.
  • Fibroblast growth factor hereinafter referred to as FGF
  • FGF Fibroblast growth factor
  • various polypeptide growth factors are known to be expressed in skin tissue.
  • FGF is encoded by 22 different genes (Non-patent Document 1).
  • FGF-1, FGF-2, FGF-5, FGF-7, FGF-10, FGF-13, and FGF-22 are expressed in skin cells and hair follicle cells to control hair growth and skin regeneration. (See Non-Patent Documents 2 to 17).
  • Patent Document 1 discloses a method for promoting hair growth and treatment for baldness using FGF-5.
  • the FGF-5 gene product has a function of inducing hair follicle cells in the regression phase. Therefore, it is not realistic to promote hair growth or treat baldness using FGF-5 disclosed in Patent Document 1.
  • FGF-5 promotes hair growth and has an effect.
  • Non-Patent Documents 2 to 17 listed above suggest that FGF plays an important role in the proliferation and differentiation of skin cells. However, it is still unclear how the FGF group is involved in the effect of promoting hair follicle growth, the accompanying hair growth promoting effect and hair growth promoting effect. .
  • Non-Patent Document 1 Ornitz DM.Itoh N: Fibroblast growth factors.
  • Genome Biol 2 REVIE WS3005, 2001
  • Non-Patent Document 2 du Cros DL: Fibroblast growth factor and epidermal growth factor in h air development.JInvest Dermatol 101: 106S-113S. 1993
  • Non-Special Terms 3 du Cros DL, IsaacsK, Moore GP: Distribution of acidic and basic fibr oblast growth factors in ovineskin during follicle morphogenesis. J Cell 3 ⁇ 4ci 105: 6b / — 6 74, 1993
  • Non-Patent Document 4 Hebert JM, Rosenquist T, Gotz J, Martin GR: FGF5 as a regulator of the hair growth cycle: Evidence from targeted and spontaneous mutations. Cell 78:10 17-1025, 1994
  • Patent Document 5 Danilenko DM, Ring BD, Yanagihara D, Benson W, Wiemann B, Starnes CO, Pierce GF: Keratinocyte growth factor is animportant endogenous mediator of hair follicle growth, development, anddiiFer entiat ion.
  • Patent Document 6 Marchese C, Chedid M, Dirsch OR, et al: Modulation of keratinocyte growth factor and its receptor in reepithelializing human skin.J Exp Med 182: 1369—1 376, 1995
  • Non-Patent Document 10 Mitsui S, Ohuchi A, Hotta M, Tsuboi R, Ogawa H: Genes for a range of growth factors andcyclin— dependent kinase inhibitors are expressed by isolated human hairfollicles. Br J Dermatol 137: 693—698, 1997
  • Non-Patent Document 11 Ortega SJttmann M, Tsang SH, Ehrlich M, Basilico C: Neuronal def ects and delayed woundhealing in mice lacking fibroblast growth factor— 2. Proc Natl Acad Sci USA 95: 5672-5677, 1998
  • Non-Special Reference 12 Suzuki S, Kato T, Takimoto H, et al: Localization of rat FGF-5 prote in in sianmacrophage— like cells and FGF— 5S protein in hair follicle: Possible involve mentof two Fgf-5 gene products in hair growth cycle regulation Invest Dermatol 1 11: 963-972, 1998
  • Non-Patent Document 13 Suzuki S, OtaY, Ozawa K, Imamura T: Dual-mode regulation of hair growth cycle by two Fgf-5 gene products.J Invest Dermatol 114: 456-463, 2000
  • Non-Patent Document 14 Nakatake Y. Hoshikawa M, Asaki T, Kassai Y, Itoh N: Identification of a novel fibroblastgrowth factor, FGF— 22, preferentially expressed in the inner root sheath of thehair follicle. Biochem Biophys Acta 1517: 460—463, 2001
  • Non-Patent Document 15 Stenn KS.Paus R: Controls of hair follicle cycling. Physiol Rev 81:44 9-494, 2001
  • Non-Patent Document 16 Beyer TA'Werner S, Dickson C, Grose R: Fibroblast growth factor 2 2 ana its potentialrole during skin development and repair.Exp Cell Res 287: 228-23 6, 2003
  • Non-Patent Document 17 Kawano M, Suzuki S, Suzuki M, Oki J, Imamura T: Bulge- and basal 1 ayer-specificexpression of fibroblast growth factor 13 (FHF-2) in mouse skin.J Inves t Dermatol 122: 1084- 1090, 2004
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 4-224522
  • an object of the present invention is to elucidate the action of promoting hair follicle growth, and to provide a novel hair growth promoter, a hair growth promoter and a hair problem therapeutic agent used as a hair loss treatment agent. It is said.
  • the present inventors analyzed the expression of all 22 genes belonging to the FGF family in order to identify the FGF gene that plays an important role in hair follicle and hair growth.
  • An exhaustive search at each stage of the long cycle (resting phase, growth phase, and regression phase) revealed that the function of the FGF-18 gene was high in the skin! I found
  • the present inventors conducted a detailed functional analysis on FGF-18.
  • FGF-18 has a function of promoting the proliferation of dermal papilla cells, which is considered to be a control tower for hair follicle growth. I found out.
  • the present inventors have estimated that FGF-18 promotes hair growth, and experimentally confirmed that, thereby completing the present invention. .
  • the present invention includes the following.
  • a hair growth-promoting agent containing, as an active ingredient, an expression vector incorporating a full length or partial peptide of FGF-18 or a cDNA encoding the full length or partial peptide of FGF-18.
  • a hair growth promoter containing, as an active ingredient, an expression vector incorporating a full length or partial peptide of FGF-18 or a cDNA encoding the full length or partial peptide of FGF-18.
  • a therapeutic agent for alopecia comprising as an active ingredient an expression vector incorporating a full length or partial peptide of FGF-18 or a cDNA encoding the full length or partial peptide of FGF-18.
  • the agents (1) to (3) may further contain other protein growth factors and / or hair growth promoters.
  • Other protein growth factors include epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, factors other than FGF-18 belonging to FGF family, transforming growth factor- ⁇ , transforming growth factor-, transforming growth Factors--factors belonging to the j8 superfamily, insulin-like growth factor-1 and insulin-like growth factor-II.
  • the agents (1) to (3) may contain one of these other protein growth factors, but may contain a plurality of types. Moreover, it is not limited to these.
  • the agents (1) to (3) may include one of these hair growth promoters, but may also include a plurality of types.
  • the present invention includes the following.
  • a function of promoting the expression of the FGF-18 gene comprising the step of bringing the test substance into contact with the cultured animal cell or the experimental animal and the step of monitoring the expression of the FGF-18 gene in the cultured animal cell or the experimental animal.
  • a test substance with a hair growth agent candidate One way.
  • a function of promoting the expression of the FGF-18 gene comprising the step of bringing the test substance into contact with the cultured animal cell or the experimental animal and the step of monitoring the expression of the FGF-18 gene in the cultured animal cell or the experimental animal.
  • a function of promoting the expression of the FGF-18 gene comprising the step of bringing the test substance into contact with the cultured animal cell or the experimental animal and the step of monitoring the expression of the FGF-18 gene in the cultured animal cell or the experimental animal.
  • a hair problem therapeutic agent used as a hair growth promoter, hair growth promoter and alopecia therapeutic agent by promoting hair follicle growth.
  • hair growth promoter, hair growth promoter and alopecia treatment agent according to the present invention hair growth, hair growth promotion, and alopecia treatment on the bald and thin haired heads can be more effectively achieved. it can.
  • FIG. 1A is a characteristic diagram showing expression profiles of FGF-1, -5, -7, -10, -11, -13, -18 and -22 genes in each hair cycle.
  • FIG. 1B FGF-2, -3, -4, -6, -8, -9, -12, -14, -15, -16, -17, -20, -21 and -23 in each hair cycle It is a characteristic view which shows the expression profile of a gene.
  • FIG. 2 is a characteristic diagram showing expression profiles of genes belonging to the FGFR family in each hair cycle.
  • FIG. 3 A photograph showing the result of an in situ noise hybridization experiment.
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing the results of DNA synthesis assembly.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of an in vivo analysis test for FGF-18 activity. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • hair growth-promoting agents contain a full-length or partial peptide of FGF-18, and have an action of promoting the growth of hair follicles (sometimes called hair roots). In common.
  • a hair follicle is an organ that produces hair.
  • the growth cycle of the hair follicle is a growth phase (anagen), regression phase (cat agen), telogen force following the regression phase, and entering the growth phase after the rest phase.
  • the growth phase is the period from the 1st to the 19th day after hair removal
  • the regression phase is the period from the 20th to the 21st day.
  • it is known that it enters a resting period 21 to 22 days after hair removal.
  • new hair growth elongation
  • hair follicle growth is activated in the skin, with the bottom reaching the lower part of the skin.
  • the hair follicle is present in a small state in a shallow part of the skin.
  • the skin thickness is completely different between the growing period and the resting period.
  • melanin is synthesized early in the growth period and the skin is blue.
  • the progression of the hair follicle growth cycle can be evaluated by looking at the blue color of the external force of the skin.
  • hair follicles containing a large amount of melanin are arranged at a high density, so that the back side of the skin can be visually recognized as black.
  • the rest period it can be visually recognized that the back side of the skin remains white. For example, in a mouse experiment system, after birth? All hairs on the back of -8-week-old mice are in the resting phase, and the growing phase starts synchronously by removing the growing hair.
  • FGF-18 contained in the novel hair growth promoter, hair growth promoter and alopecia therapeutic agent according to the present invention for example, human-derived FGF-18 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be used.
  • FGF-18 that can be used is not limited to human origin, and for example, FGF-18 derived from other mammals can be used.
  • Other mammals include Mau May include, but is not limited to, squirrel, rat, turkey, turkey, ushi, pig, hidge and magpie.
  • a probe prepared based on the base sequence of human-derived FGF-18 shown in SEQ ID NO: 1 is used according to a standard method, a gene encoding FGF-18 other than human power other than human can be isolated. .
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of human-derived FGF-18 are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the amino acid sequence of mouse-derived FGF-18 is shown in SEQ ID NO: 3, respectively.
  • the amino acid sequence of rat-derived FGF-1 8 is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence of chicken-derived FGF-18 is shown in SEQ ID NO: 5.
  • FGF-18 has very high homology in mammals, and the function of FGF-18 in mammals is It can be understood that they are almost the same.
  • a tamper that has an amino acid sequence ability in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and has a hair follicle growth promoting action.
  • a tamper that has an amino acid sequence ability in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and has a hair follicle growth promoting action.
  • several amino acids mean, for example, 2 to 54, more preferably 2 to 27.
  • the 55th to 177th region in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is considered to be a core part common to various FFGs. Therefore, in the region except for the 55th to 177th regions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, even if one or several amino acids are deleted, substituted, or added, the hair follicle growth promoting action is lost. Without using it as FGF-18 in this application.
  • the novel hair growth promoter, hair growth promoter and hair loss treatment agent according to the present invention may be the above-mentioned partial fragment of FGF-18.
  • the partial fragment of FGF-18 include a polypeptide having the amino acid sequence at positions 55 to 177 in SEQ ID NO: 2. That is, even a polypeptide having the amino acid sequence from 55 to 177 has a high probability of binding to a receptor and heparin and promoting hair follicle growth.
  • a polypeptide consisting of the 28th to 207th amino acid sequence can be most preferably used as a partial fragment of FGF-18.
  • the novel hair growth promoter, hair growth promoter and hair loss according to the present invention can be used even if they are polypeptides consisting of amino acid sequences corresponding to the above ranges.
  • As an active ingredient Can be used.
  • any fragment that is necessary for exerting the activity of FGF-18 in the present invention has a length sufficient for any partial force of amino acid sequences 1 to 207. It may be a peptide of about 3-50 amino acids. However, even a peptide having an amino acid strength exceeding this numerical range is included in the partial fragment of FGF-18 in the present invention.
  • the full length and partial peptides of FGF-18 defined as described above have an action of promoting hair follicle growth. The details of this action will be described later in Examples, but hair follicles are cultured in a medium containing the full length of FGF-18 and a partial peptide, and the dermal papilla cells, skin fibers by the full length of FGF-18 and the partial peptide are used.
  • the ability to induce DNA synthesis in blast cells and epidermal keratinocytes can be confirmed by examining each of them using a pure culture system or a complex culture system with outer root sheath cells.
  • the full length and partial peptides of FGF-18 were administered subcutaneously to experimental animals in the resting phase, and the growth of hair follicles was observed by observing the growth of hair follicles. Can be confirmed.
  • FGF-18 full-length polypeptide and / or partial polypeptide described in “1.
  • FGF-18 are, for example, solutions, creams, ointments, gels, lotions, shampoos or aerosols adapted for skin application. And is provided as a hair growth promoter, hair growth promoter and alopecia treatment.
  • the hair growth promoter, the hair growth promoter and the alopecia therapeutic agent are in the form of a pharmaceutical composition containing FGF-18 together with a pharmacologically acceptable carrier adapted for topical administration. Be administered. It is preferable that the hair growth promoter, the hair growth promoter and the alopecia therapeutic agent further contain heparin.
  • a hair growth promoter, hair growth promoter and alopecia treatment containing FGF-18 is usually about 0.01 to about 100 g / day / cm 2 , preferably about 0.1 to about 10 in a pharmaceutically acceptable carrier. / zg / day / cm 2 of active compound. In other words, the concentration of FGF-18 is typically about 0.01 to about 100 g / day / cm 2 , preferably about 0.1 to about 10 g / day / cm 2 in a pharmaceutically acceptable carrier. It is a compound.
  • the hair growth promoter, hair growth promoter and alopecia therapeutic agent may contain other purified or recombinant protein growth factor (PGF) well known in the art, FGF-18
  • PGF protein growth factor
  • the growth factor that increases or enhances the effect of promoting hair follicle growth is not particularly limited, epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor-a (TGF-a), transforming The group of growth factors-/ 3 (TGF- ⁇ ), insulin-like growth factor (IGF), and vascular endothelial growth factor can be mentioned (Fan'Brant and Klausner, Neurotechnology, VI, 25- 30 pages, 1988).
  • TGF-a, hTGF-a and their production methods are described in European Patent Application Publication No. 154,434, Cell No. 38, pages 287-297 (1984). You can refer to it.
  • TGF-j8, hTGF-j8 and methods for producing them see US Pat. No. 4,774,228, US Pat. No. 4,774,322, DNA No. 7, pages 1-8 (1988), Journal of “Biological”. It is described in Chemistry 262, pp. 12127-12131 (1987) and can be referred to.
  • IGF-I hIGF-I and methods for producing them, published PCT patent application WO / 88/03409, European patent application publication 264,074, European patent application publication 219,814 It is listed and can be referred to.
  • IGF-II, hlGF-II and their production methods are described in European Patent Application Publication No. 280,460 and can be referred to.
  • the hair growth promoter, hair growth promoter and alopecia treatment agent may contain other compounds or agents exhibiting hair growth promoting activity well known in the art!
  • Other hair growth promoters are not particularly limited, and may include antiandrogens, 5 ⁇ -reductase inhibitors, minoxidil, minoxidil derivatives or analogs, and related compounds or analogs.
  • pharmacologically acceptable carriers adapted for topical administration are not particularly limited, but include pastes such as ointments such as hydrophilic petrolatum or polyethylene glycol ointment, rubbers such as xanthan gum, Alcohol, aqueous or buffered solution, gel such as aluminum hydroxide or sodium alginate gel, albumin such as human or animal albumin, collagen such as human or animal collagen, alkyl cellulose, hydroxy Cellulose such as alkylcellulose and alkylhydroxyalkylcellulose, methinoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, canoleoxy methinorescenellose, hydroxypropinoremethinoresenorelose and hydroxypropinoresenorelose, punorelonic F 1
  • pastes such as ointments such as hydrophilic petrolatum or polyethylene glycol ointment, rubbers such as xanthan gum, Alcohol, aqueous or buffered solution, gel such as aluminum hydroxide or sodium alg
  • hair growth promoter, hair growth promoter and hair loss treatment agent according to the present invention are the above-mentioned "1.
  • the expression vector may contain an expression vector having cDNA encoding FGF-18 full-length polypeptide and / or partial polypeptide described in “FGF-18” as an active ingredient. That is, the hair growth promoter, hair growth promoter and alopecia therapeutic agent according to the present invention can be used for gene therapy using the above expression vector.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it has a sequence such as a promoter for realizing expression in animal cells. Examples of expression vectors include, but are not limited to, plasmid vectors and virus vectors that can be used.
  • FGF-18 cDNA encoding the full-length FGF-18 polypeptide and / or partial polypeptide described in "1.
  • FGF-18 is used as, for example, a virus vector. Incorporate and infect the patient with a virus (detoxified) having the recombinant viral vector. In the patient, a full-length polypeptide and / or a partial polypeptide of FGF-18 is produced, which can promote hair follicle growth.
  • Methods for introducing a hair growth promoter, hair growth promoter and alopecia therapeutic agent for gene therapy into cells include gene transfer methods using viral vectors and non-viral gene transfer methods (Nikkei). Science, April 1994, pp. 20-45, Special Issue on Experimental Medicine, 12 (15) (1 994), Supplementary Experimental Medicine "Basic Technology of Gene Therapy", Yodosha (1996)) Can be applied.
  • Gene transfer methods using viral vectors include, for example, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, vaccinia viruses, box viruses, polioviruses, simbis viruses, and other DNA viruses or RNA viruses, TR4 Alternatively, a method of introducing a DNA encoding a mutant TR4 can be mentioned. Of these, methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and vaccinia viruses are particularly preferred.
  • Non-viral gene transfer methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a ribosome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electoral position method, etc.
  • DNA vaccine method a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle
  • ribosome method a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle
  • lipofectin method a lipofectin method
  • microinjection method a microinjection method
  • calcium phosphate method a calcium phosphate method
  • electoral position method etc.
  • the DNA vaccine method and the ribosome method are preferred.
  • the gene therapy agent when administered by an in vivo method, it is administered by an appropriate route of administration such as intravenous, arterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular, etc., depending on the disease, symptoms and the like.
  • the gene therapy agent is generally an injection, but a conventional carrier may be added if necessary.
  • ribosome or membrane fusion ribosome Sendai virus-ribosome, etc.
  • it can be prepared as a ribosome preparation such as a suspension, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freezing agent.
  • the skin tissue means a tissue having various cellular forces of skin obtained by culturing separated skin stem cells.
  • the various cells of the skin are not particularly limited, but mean skin epidermis epithelial cells, cells of the skin epithelial base layer, various cells constituting hair follicles, dermis cells, fat cells and the like.
  • Cells used to regenerate skin tissue are xenogeneic, allogeneic and allogeneic cells. It is okay if the cell is out of position.
  • a method for controlling the differentiation of skin stem cells into various cells of the skin is not particularly limited in the present invention because there is no particularly established technique.
  • the natural component spontaneous component
  • cells with different differentiation directions are selectively amplified. be able to. After selectively amplifying cells having different differentiation directions, skin tissue can be prepared.
  • the method for producing artificial skin tissue is not particularly limited, and thus is not limited to the present invention.
  • the present invention also applies to a skin tissue preparation method in so-called regenerative medicine, in which skin stem cells are separated from skin tissue collected from humans and the skin tissue is prepared using the separated skin stem cells. At this time, the newly created skin tissue may be assumed to be returned to treatment for the same person as the collected human, or transplanted for treatment to another person different from the collected human. Even if it is a premise.
  • the growth of hair follicles can be promoted in the regenerated skin tissue by adding the full length and / or partial peptide of FGF-18 to the medium at an appropriate time. It is possible to promote hair growth or hair growth in the skin tissue. Furthermore, in the method for producing skin tissue, the growth of skin cells can be promoted by adding the full length and / or partial peptide of FGF-18 to the medium at an appropriate time, and the volume of the whole skin tissue can be promoted. Can be increased.
  • a culture method for growing hair follicles can be constructed using the full length and / or partial peptide of FGF-18.
  • the hair follicle is, for example, a growing human hair follicle with a drawn hair force prepared. Can be used.
  • the hair follicles are washed with an acceptable washing solution, buffer or medium.
  • the acceptable washing solution is not particularly limited, and distilled water, physiological saline, or the like can be used.
  • the acceptable buffer solution is not particularly limited, and is a phosphate buffer solution or a phosphate buffer solution. Saline (PBS), phosphate buffered saline glucose, Tris HC1, etc. can be used.
  • the medium is not particularly limited, and a force Dulbecco's modified Eagle medium capable of using an Eagle's minimum essential medium, Eagle's basic medium, Dulbecco's modified Eagle medium, or the like is preferable. Washed hair follicles are placed in cell culture plates with about 1 to about 10 hair follicles Zwell.
  • Hair follicles are usually supplemented with heat-inactivated serum, preferably about 10% fetal bovine serum, antibiotics, preferably 10,000 ⁇ 1, penicillin G, about 10,000 ⁇ g, streptomycin sulfate and about 1% fungizone. Cultured in the prepared medium.
  • the selected medium is preferably Dulbecco's modified Eagle medium.
  • the hair follicles are about 1 to 37 ° C at about 5% CO and about 95% air.
  • FGF-18 full length and / or partial peptide of FGF-18 is added at, for example, about 0.01 to about 1.0 gFGF / ml / day.
  • HSA Human serum albumin
  • Cell stimulation was achieved by adding 3 H-thymidine (about 5 Ci, about 0.14 g / well) followed by cold thymidine (about 14.2 g / well) followed by FGF-18 full length and / Alternatively, the action of partial peptides can be examined.
  • Hair follicle DNA is precipitated with about 5% triclonal acetic acid and dissolved in about 1N NaOH at about 45 ° C overnight. The scintillation count is done 3 times for the final cut of 50 1 volume.
  • the full length and / or partial peptide of FGF-18 promotes DNA synthesis in the hair follicle. Therefore, the ability to promote hair follicle growth can be clarified by testing the amount of hair follicle DNA as described above.
  • the screening method according to the present invention is a method for screening a substance having a function of promoting hair growth, promoting hair growth, or treating alopecia through the follicle growth promoting action of FGF-18.
  • test substance is contacted with animal cultured cells or experimental animals.
  • the experimental animals mean, for example, mice, rats, turkeys, turkeys, eagle, pigs, hidges, and rabbits except humans.
  • test substance include, but are not limited to, peptides, proteins, non-peptide compounds, low molecular compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, animal tissue extracts, and the like. These substances may be novel substances or known substances.
  • the expression of the FGF-18 gene in animal cultured cells or experimental animals is monitored.
  • the expression of the FGF-18 gene in cultured animal cells or experimental animals is, for example, the ability to analyze using conventional methods such as ELISA using the FGF-18 antibody, or FGF-18 in the cells or experimental animals.
  • the amount of mRNA of a gene is analyzed by quantitative reverse transcription PCR method or Northern plot method, it can be monitored by any method.
  • test substance By any of these analyses, compared to the expression level of the FGF-18 gene in animal cultured cells cultured in the absence of the test substance, the culture of the animal cultured in the presence of the test substance If the expression level of the FGF-18 gene in cells or laboratory animals increases, the test substance is considered to have the potential to have the functions of promoting hair growth, promoting hair growth, or treating alopecia! it can.
  • the substance screened in this manner can be used alone for the clinical application, but it can be used as a pharmaceutical composition by blending with a pharmaceutically acceptable carrier. You can also.
  • the ratio of the active ingredient to the carrier at this time can vary between 1 and 90% by weight.
  • a powerful drug can be administered in various forms, and examples of such administration forms include parenteral administration such as solution, cream, ointment, gel, lotion, shampoo or aerosol. The dose can be appropriately selected depending on symptoms, age, body weight and the like.
  • mice 25 7-week-old C3H / HeN male mice (Tlr4 + / + ) were obtained from Nippon SLC Co., Ltd. did. After acclimation for 1 week, 5 mice were euthanized, the back hair was trimmed shortly, and the skin samples were separated to give a “Day 0 (resting)” sample. For the remaining 20 mice, without using a box, tape or hair removal agent, gloves were worn and the dorsal hair shaft was gently pulled out with fingers to induce the growth phase of the hair cycle.
  • the hair force was also cut short, and the partial skin force (including epidermis, hair shaft, hair follicle, sebaceous gland, subcutaneous fat, skin muscle and blood vessels) was also collected.
  • the full-thickness skin sample was used for mRNA separation, in situ hybridization and immunohistochemical staining described below.
  • Skin samples for in situ hybridization were immediately embedded in OCT-compound and frozen in liquid nitrogen.
  • skin samples for immunohistochemical staining were first fixed with 10% formaldehyde for 24 hours at room temperature and embedded in paraffin by standard methods.
  • Total RNA was prepared using the skin sample strength Isogen (Corporation-Poppongene) prepared as described above according to the manufacturer's instructions. Next, 01igotex-dT3 0
  • MRNA was purified from total RNA using a Super mRNA purification kit (Takara Bio Inc.). The purified mRNA sample (100 ng) was made into a saddle type, and a reverse transcription reaction was performed with Superscript Il (Gibco BRL) using 01igo (dT) 12-18 as a primer in a total volume of 20 ml.
  • the PCR product was ligated to pCR-Bluntll-TOPO beta (Invitrogen) and used for transformation of E. coli.
  • the nucleotide sequence of the recombinant plasmid was confirmed using a BigDye terminator cycle sequencing kit and ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • Real-time PCR amplification was performed with a Light Cycler (Roche Diagnostics) using 2 ml of RT mixture diluted 1:10 as a saddle.
  • the plasmid DNA corresponding to each FGF was used as a copy number control.
  • Cyber Green was used for quantification of DNA amplified by Light Cy cler.
  • the Light Cycler reaction was performed at the optimal annealing temperature, extension time, and acquisition temperature. Primer specificity was first verified using whole mouse cDNA as a background sequence. Primer specificity and reaction conditions were further experimentally verified by cloning amplified fragments into plasmid DNA to verify these sequences.
  • the melting point temperature of the amplification products was measured at the end of the individual experiment, and it was proved that they were uniform at the melting point temperature.
  • the product was analyzed by 2.0% agarose gel electrophoresis, confirming that the reaction resulted in accurate amplification of DNA fragments of known size. This experimental system ensures specific quantification of individual genes. In mRNA evaluation, Light
  • Fig. 1A, Fig. IB and Fig. 2 show the mRNA expression levels of each FGF and FGFR at the indicated time of the hair cycle.
  • Table 2 summarizes the highest expression level of all mRNAs and their time in the hair cycle.
  • the maximum expression level of these FGFs is 1 ⁇ 10 4 copies / ng mRNA such as FGF-7 and -18. This mRNA expression level was about 1/60 of j8-actin (5.6 x 10 5 copies / ng mRNA at growth stage V; Table 2), one of the abundant structural proteins.
  • FGF- 18 mRNA was also expressed in a high amount, and it became clear that the amount of FGF-18 mRNA showed a peak in the resting phase (days 0 and 22; FIG. 1A). Also, from FIG. 1A, it became clear that FGF-18 expression level is higher at almost all times than FGF-2 (or basic FGF) and other FGFs that have been well studied.
  • FGF-3, -6, -9, -11, -20 and -21 mRNA was also moderately expressed ( Figure 1B), while FGF-4, -8, -14, -15 and -23 mRNA expression Little or no was detected at any stage of the hair cycle ( ⁇ 100 copies / ng mRNA; Table 2).
  • both FGFR-1 and FGFR-3 mRNA were expressed in large amounts (up to 47,000 copies / ng mRNA in FGFR-1, up to 28,000 copies / ng mRNA in FGFR-3; Fig. 2)
  • the strongest expression appeared in growth period VI to regression (day 18 and day 20), and the latter was highest in growth period VI (day 18; Figure 2).
  • the expression level of FGFR-2 mRNA is lower than that of FGFR-1 or 3, including the Illb subclass, which is specific to epithelial cells (Fig. 2).
  • Example 1 since the expression of FGF-18 in the skin was newly clarified, in this example, the mRNA distribution was measured using in situ hybridization. ⁇ Materials and methods>
  • the sense and antisense riboprobes for FGF-18 were synthesized using SP6 and T7 RNA polymerases, respectively, in the presence of digoxigenin-dU TP (Roche Applied Science). No, during the hybridization process, every measure was taken to avoid RNA alteration. Frozen tissue was cut into 10 mm using a cryostat (Microm, model HM500OM), immediately placed on a slide glass (Matsunami Glass Co., Ltd.) coated with MAS, dried at 50 ° C for 1 hour, and then dried. Stored at 80 ° C with the agent.
  • the sections were fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature and washed with PBS for 5 minutes. Then, infiltrate the proteinase K (0.01 mg / ml in 2 X TE) for 5 minutes at 37 ° C, rinse with PBS !, and fix again with PBS containing 4% paraformaldehyde for 5 minutes. Washed for 5 minutes. The fixed sections were soaked twice in PBS containing 0.1% DEPC for 15 minutes and rinsed with PBS.
  • the hybridisation is a hybrid containing 50% (v / v) formamide, 5 X SSC, 500 mg / ml salmon testis DNA, 250 mg / ml tRNA, 5 X Denhardt, s solution, and ImM DTT. This was carried out at 45 ° C for 16-18 hours using a thermal denaturation (70 ° C for 10 minutes) probe added at 500 ng / ml in 100 ml of lysis buffer.
  • the slides are rinsed with 2 X SSC at 45 ° C, washed twice with 2 X SSC at 45 ° C for 30 minutes, and further twice with 0.2 X SSC at 45 ° C for 20 minutes. Washed. Detection was performed using an anti-digoxigenin antibody (1: 500, manufactured by Roche Applied Science) in which the bound riboprobe was conjugated with alkaline phosphatase. For visualization, a colorimetric reaction using nitro blue tetrazolium and 5-bromo-4-chromo-3-indolyl-1-phosphate (NBT / BCIP) was performed using BM purple (Roche Applied Science). ) At room temperature in the dark until a signal was observed.
  • NBT / BCIP 5-bromo-4-chromo-3-indolyl-1-phosphate
  • Figure 3 shows the results of in situ hybridization.
  • a and B show the results using the antisense riboprobe, and C and D show the results using the sense probe.
  • the bar in Figure 3 means 100 m.
  • F GF-18 shows the results using the sense probe.
  • FGF-18 human outer follicular root sheath (OR S) cells, hair papilla (HFDP) cells, skin fibroblasts (HDF cells), and epidermal keratinocytes (HE K cells), and the mitogenic effect of FGF-18 was examined.
  • OR S outer follicular root sheath
  • HFDP hair papilla
  • HDF skin fibroblasts
  • HE K cells epidermal keratinocytes
  • the first cultured human dermal fibroblasts (derived from newborn foreskin; manufactured by Toyobo Co., Ltd.) are subcultured on HDF growth medium (FBM (Fibroblast basic medium) supplemented with growth auxiliary components; manufactured by Toyobo Co., Ltd.) It was used for [ 3 H] -thymidine incorporation assembly within 2 passages of culture.
  • FBM Fibroblast basic medium
  • the first cultured human dermal papilla cells (derived from adult scalp; manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were subcultured with HFDP growth medium (papillary cell basal medium containing 20% Ushi fetal serum; manufactured by Toyobo Co., Ltd.). It was used for [ 3 H] -thymidine incorporation assembly within 2 passages of culture.
  • Cell trypsin Disperse to collagen-coated plates (Sumilon) at a density of 1 x 10 4 cells / well at 48 wells (HDF cells) or 1 x 10 4 cells / well at 24 wells (HFDP cells). The medium was maintained at 37 ° C.
  • the HDF growth medium was replaced with FBM containing 0.5% thiacol-adsorbed serum, and the cells were cultured for 48 hours (HDF cells) or 96 hours (HFDP cells), and the force was also stimulated with the prescribed concentration of FGF. .
  • [ 3 H] -thymidine (lmCi / well; manufactured by Moravek Biochemicals) was added to the medium at 18 hours (HDF cells) or 8 hours (HFDP cells) after FGF was added, and the cells were left for 8 hours (HDF Cells) or 18 hours (HFDP cells). Cells were then collected and the amount of radioactivity incorporated was measured.
  • the first cultured human epidermal keratinocytes (derived from neonatal foreskin; manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and the first human outer root sheath cells (derived from adult male scalp) are keratinocyte growth medium (usi pituitary gland) Within 2 passages of subculture in cornified basal medium (KBM-2, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) supplemented with extract, insulin, epidermal growth factor, hyoid cortisone, transferrin, epinephrine, and antibiotics Used in.
  • KBM-2 cornified basal medium
  • HEK cells are trypsinized and dispensed onto collagen-coated plates at a density of 1 x 10 4 cells / well at 48 wells (HEK cells) or 1.2 x 10 4 cells / well at 24 wells (ORS cells).
  • HEK cells HEK cells
  • ORS cells 1.2 x 10 4 cells / well at 24 wells
  • HEK cells HEK cells
  • ORS cells KB M-2 medium containing heparin to growth medium after 4 days
  • ORS cells 10- 8 to M insulin and 5 mg / ml
  • stimulated the cells with FGF predetermined concentration did.
  • [] -Thymidine (lmCi / 0.5 ml; manufactured by Moravek Biochemicals) was added to the medium at 18 hours (HEK cells) or 8 hours (ORS cells) after FGF was added, and the cells were further added for 8 hours. (HEK cells) or 18 hours (ORS cells). Cells were collected and the amount of radioactivity incorporated was measured.
  • FIG. 4 shows the results of the DNA synthesis assay.
  • A shows the results of the assembly using HFDP cells (designated DPC in the figure)
  • B shows the results of the assembly using ORS cells (designated ORSC in the figure)
  • C shows HDF.
  • the result of using the cell (designated as DF in the figure)
  • D shows the result of using the HEK cell (designated as EK in the figure).
  • DNA synthesis was induced in HFDP cells, HDF cells, and HEK cells by relatively high concentrations (100 and 1000 ng / ml) of FGF-18 (Figs. 4A, 4C and 4D). This means that HEK cells stimulate DNA synthesis (Fig. 4D) but HFDP cells (Fig. 4A) and HDF cells (Fig. 4C) are well characterized by very weak stimulation, unlike keratinocyte mitogenic FGF-7 (KGF)!
  • Macrophage stimulates protein promotes hair growth ex vivo and induces anagen from telogen stage hair follicles in vivo. J Invest Dermatol 123: 34-40, 2004).
  • FGF-18 adsorbed bead suspension was subcutaneously injected into the dorsal skin (150 ml / mouse, ie 1 g FGF-18 per mouse). Mice were reared so that food and water could be consumed as desired. Twenty-one days later, the mouse was euthanized with four anesthetics. The dorsal skin was excised in all layers, the internal surface was photographed and the force skin was embedded with paraffin. Embedded skin samples were sectioned 4 m thick with a microtome, stained with hematoxylin, and observed with a microscope. [0077] ⁇ Result>
  • A is a photograph of the skin inner surface of a mouse administered with the FGF-18 adsorbent bead suspension
  • B is a photograph of an enlarged frame in photograph A
  • C is FGF- 18 is a photograph of a skin section in a mouse administered with an adsorbed bead suspension
  • D is a photograph of the skin internal surface in a mouse administered with a control bead suspension
  • E is a control bead suspension. It is the photograph which image
  • the bars in photos C and E shown in Fig. 5 each indicate 100 m.

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Abstract

　毛包の成長を促進する作用を解明し、次の(1)-(3)の毛髪問題治療剤を提供する。 　(1)　FGF-18の全長又は部分ペプチド若しくはこれらをコードするcDNAの発現ベクターを有効成分として含有する毛髪成長促進剤。 　(2)　FGF-18の全長又は部分ペプチド若しくはこれらをコードするcDNAの発現ベクターを有効成分として含有する発毛促進剤。 　(3)　FGF-18の全長又は部分ペプチド若しくはこれらをコードするcDNAの発現ベクターを有効成分として含有する脱毛症治療剤。

Description

明 細 書
毛髪問題治療剤、及びそのスクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、毛包 (毛根と同義)の成長を促進する成分を含有する、毛髪成長促進剤
、発毛促進剤、脱毛症治療剤として用いられる毛髪問題治療剤、及びそれらのスクリ 一二ング方法に関する。 背景技術
[0002] 繊維芽細胞増殖因子（以下 FGFと称する） t 、つた様々なポリペプチド増殖因子が 皮膚組織において発現していることが知られている。マウス及びヒトにおいては、 FGF は 22種類の異なる遺伝子によってコードされる（非特許文献 1)。特に、 FGF-1、 FGF -2、 FGF-5, FGF-7、 FGF-10、 FGF-13及び FGF-22は、皮膚細胞及び毛包細胞に おいて発現し、毛髪成長及び皮膚再生を制御していることが報告されている（非特許 文献 2〜 17参照)。
[0003] また、特許文献 1には、 FGF-5による毛髪成長促進方法及び禿頭症治療方法が開 示されている。し力しながら、非特許文献 13に開示されているように、 FGF-5遺伝子 産物は、毛包細胞を退行期に誘導する機能を有することが知られている。よって、特 許文献 1に開示されている FGF-5を用いて、毛髪の成長を促進したり、禿頭症を治療 するといつたことは現実的ではない。なお、特許文献 1の明細書を詳細に検討しても 、 FGF-5が毛髪の成長を促進すると 、つた作用があることを何ら実証して 、な!/、。
[0004] 上掲した非特許文献 2〜 17を含む他の文献から、 FGFが皮膚細胞の増殖及び分 化に重要な役割を担っていることが示唆される。し力しながら、毛包の成長を促進す る作用、それに伴う毛髪成長促進作用及び発毛促進作用に対して、 FGF群がどのよ うに関与するのかといつた知見は依然として不明のままである。
[0005] 非特許文献 1： Ornitz DM.Itoh N: Fibroblast growth factors. Genome Biol 2:REVIE WS3005, 2001
非特許文献 2 : du Cros DL: Fibroblast growth factor and epidermal growth factor in h air development. JInvest Dermatol 101:106S-113S. 1993 非特言午文献 3 : du Cros DL, IsaacsK, Moore GP: Distribution of acidic and basic fibr oblast growth factorsin ovineskin during follicle morphogenesis. J Cell ¾ci 105:6b /— 6 74, 1993
非特許文献 4 : Hebert JM, Rosenquist T， Gotz J, Martin GR: FGF5 as a regulator of the hair growth cycle: Evidence from targetedand spontaneous mutations. Cell 78:10 17-1025, 1994
特許文献 5 : Danilenko DM, Ring BD， Yanagihara D, Benson W, Wiemann B, Starn es CO, Pierce GF: Keratinocyte growth factor is animportant endogenous mediator of hair follicle growth, development, anddiiFer entiat ion . American J Pathol 147:145-1 54, 1995
特許文献 6 : Marchese C，Chedid M, Dirsch OR, et al: Modulation of keratinocyte growth factor and itsreceptor in reepithelializing human skin. J Exp Med 182:1369—1 376, 1995
特言午文献 7 : Guo L, DegensteinL, Fuchs E: Keratinocyte growth factor is required for hair development but notfor wound healing. Genes Dev 10: 165—175， 1996 非特言午文献 8 : Rosenquist TA,Martin GR: Fibroblast growth factor signalling in the h air growth cycle:Expression of the fibroblast growth factor receptor and ligand genes in themurine hair follicle. Developmental Dynamics 205:379—386， 1996
特言午文献 9 : Petho— SchrammA, Muller HJ, Paus R: FGF5 and the murine hair cycl e. Arch Dermatol Res288:264— 266， 1996
非特許文献 10 : Mitsui S，Ohuchi A, Hotta M, Tsuboi R， Ogawa H: Genes for a range of growth factors andcyclin— dependent kinase inhibitors are expressed by isolated h uman hairfollicles. Br J Dermatol 137:693—698， 1997
非特許文献 11 : Ortega SJttmann M, Tsang SH, Ehrlich M, Basilico C: Neuronal def ects and delayed woundhealing in mice lacking fibroblast growth factor— 2. Proc Natl Acad Sci USA95:5672-5677, 1998
非特言午文献 12 : Suzuki S，Kato T, Takimoto H, et al: Localization of rat FGF-5 prote in in sianmacrophage— like cells and FGF— 5S protein in hair follicle: Possible involve mentof two Fgf-5 gene products in hair growth cycle regulation Invest Dermatol 1 11:963-972, 1998
非特許文献 13 : Suzuki S, OtaY, Ozawa K, Imamura T: Dual-mode regulation of hair growth cycle by two Fgf-5 gene products. J Invest Dermatol 114:456—463, 2000 非特許文献 14 : Nakatake Y.Hoshikawa M, Asaki T, Kassai Y, Itoh N: Identification of a novel fibroblastgrowth factor, FGF— 22, preferentially expressed in the inner roo t sheath of thehair follicle. Biochem Biophys Acta 1517:460—463, 2001
非特許文献 15 : Stenn KS.Paus R: Controls of hair follicle cycling. Physiol Rev 81:44 9-494, 2001
非特許文献 16 : Beyer TA'Werner S, Dickson C, Grose R: Fibroblast growth factor 2 2 ana its potentialrole during skin development and repair. Exp Cell Res 287:228-23 6, 2003
非特許文献 17 : Kawano M, Suzuki S, Suzuki M, Oki J, Imamura T: Bulge- and basal 1 ayer- specificexpression of fibroblast growth factor 13 (FHF-2) in mouse skin. J Inves t Dermatol 122: 1084-1090, 2004
特許文献 1：特開平 4-224522号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] そこで、本発明は、毛包の成長を促進する作用を解明し、新規な毛髪成長促進剤 、発毛促進剤及び脱毛症治療剤として用いられる毛髪問題治療剤を提供することを 目的としている。
課題を解決するための手段
[0007] 上述した目的を達成するため本発明者らは、毛包と毛の成長に重要な働きをする F GF遺伝子を特定するために、 FGFファミリーに属する 22遺伝子全ての発現を、毛成 長周期の各ステージ (休止期、成長期及び退行期)で網羅的に検索したところ、これ まで皮膚でその機能の知られて!/、なかった FGF-18遺伝子の発現レベルが高!、こと を発見した。また、本発明者等は、 FGF-18に関する詳細な機能解析を行ったところ、 FGF-18には毛包成長の司令塔と考えられる毛乳頭細胞の増殖を促進する機能があ ることを見出した。そして、本発明者らは、このような新規な知見に基づいて、 FGF-18 が毛成長を促進することを推定し、それを実験的に確認することによって、本発明を 完成するに至った。
[0008] すなわち、本発明は以下を包含する。
(1) FGF-18の全長又は部分ペプチド若しくは FGF-18の全長又は部分ペプチドを コードする cDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する毛髪成長促 進剤。
(2) FGF-18の全長又は部分ペプチド若しくは FGF-18の全長又は部分ペプチドを コードする cDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する発毛促進剤。
(3) FGF-18の全長又は部分ペプチド若しくは FGF-18の全長又は部分ペプチドを コードする cDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する脱毛症治療 剤。
上記 (1)〜(3)の剤は、他のタンパク質増殖因子及び/又は毛髪成長促進剤を更に 含むものであっても良い。
[0009] 他のタンパク質増殖因子としては、表皮増殖因子、血小板由来増殖因子、 FGFファ ミリ一に属する FGF-18以外の因子、トランスフォーミング増殖因子-《、トランスフォー ミング増殖因子- 、トランスフォーミング増殖因子- j8スーパーファミリーに属する因 子、インシュリン様増殖因子- 1及びインシュリン様増殖因子- IIを挙げることができる。 上記 (1)〜(3)の剤は、これら他のタンパク質増殖因子のうち一種を含むものであって も良いが、複数種を含むものであっても良い。またこれらに限定されるものではない。
[0010] 毛髪成長促進剤としては、ミノキシジル、ミノキシジル類縁体、ミノキシジル誘導体、 抗アンドロゲン及び 5 α -還元酵素阻害剤、 Finasteride (プロべシァ）、を挙げることが できるがこれらに限定されるものではない。上記 (1)〜(3)の剤は、これら毛髪成長促進 剤のうち一種を含むものであっても良いが、複数種を含むものであっても良い。
[0011] また、本発明は以下を包含する。
(4) 被検物質を動物培養細胞又は実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞 又は実験動物における FGF-18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、 FGF-18 遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を毛髪成長剤の候補とする、スクリ 一二ング方法。
(5) 被検物質を動物培養細胞又は実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞 又は実験動物における FGF-18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、 FGF-18 遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を発毛促進剤の候補とする、スクリ 一ユング方法。
(6) 被検物質を動物培養細胞又は実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞 又は実験動物における FGF-18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、 FGF-18 遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を脱毛症治療剤の候補とする、スク リーニング方法。 発明の効果
[0012] 本発明によれば、毛包の成長を促進することによる、毛髪成長促進剤、発毛促進剤 及び脱毛症治療剤として用いられる毛髪問題治療剤を提供することができる。本発 明に係る毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤によれば、禿頭及び薄毛 頭における毛髪の成長、発毛の促進及び脱毛症の治療をより効果的に達成すること ができる。
[0013] また、本発明に係るスクリーニング方法によれば、毛髪成長剤、発毛促進剤及び脱 毛症治療剤といった毛髪問題治療剤として有効な物質をスクリーニングすることがで きる。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1A]各毛周期における FGF-1、 -5、 -7、 -10、 -11、 -13、 -18及び- 22遺伝子の発現 プロファイルを示す特性図である。
[図 1B]各毛周期における FGF-2、 -3、 -4、 -6、 -8、 -9、 -12、 -14、 -15、 -16、 -17、 -20 、 -21及び- 23遺伝子の発現プロファイルを示す特性図である。
[図 2]各毛周期における FGFRファミリーに属する遺伝子の発現プロファイルを示す特 '性図である。
[図 3]in situノヽイブリダィゼーシヨン実験の結果を示す写真である。
[図 4]DNA合成アツセィの結果を示す特性図である。
[図 5]FGF-18活性の in vivo分析試験の結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明を適用することによって、新規な毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症 治療剤として用いられる毛髪問題治療剤を提供することができる。これら毛髪成長促 進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤は、 FGF-18の全長又は部分ペプチドを含有 する点、及び毛包（毛根と呼ばれる場合もある）の成長を促進する作用を有する点で 共通する。
[0016] 毛包とは、毛を作る器官である。毛包の成長周期は、成長期（anagen)、退行期 (cat agen)、退行期に続く休止期 (telogen)力 なり、休止期の後に成長期に入るというサ イタルである。一般に、マウスの実験系では、成長期は脱毛後 1〜19日目の期間であ り、退行期は 20〜21日目の期間である。また、脱毛後、 21〜22日目に休止期に入る ことが知られている。成長期においては、新しい毛の成長 (伸長）が活発化するととも に、皮膚内では毛包の成長が活発化して、その底部が皮膚の下部近傍に到達する。 一方、休止期においては、毛包は皮膚の浅いところに小さい状態で存在する。また、 成長期と休止期とでは皮膚の厚さも全く異なる。さらに成長期の初期にはメラニン色 素が合成され、皮膚が青
くなつているのを視認することができる。したがって、皮膚の外側力も青い色を見て毛 包の成長周期の進行を評価することもできる。また、成長期に皮膚を切開して裏側か ら見ると、メラニン色素を多量に含んだ毛包が高い密度で並ぶこととなるため、皮膚 の裏側が黒なつているのを視認することができる。これに対して休止期においては、 皮膚の裏側は白いままであることを視認することができる。例えば、マウスの実験系で は、生後？〜 8週齢のマウスの背中の毛は全て休止期にあり、また、生えている毛を抜 くことにより、同調して成長期が開始する。
[0017] 1. FGF-18
本発明に係る新規な毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤に含まれる FGF-18は、例えば配列番号 2に示すアミノ酸配列力もなるヒト由来の FGF-18を使用 することができる。また、使用可能な FGF-18としては、ヒト由来に限定されず、例えば 、他の哺乳動物由来の FGF-18を使用することができる。他の哺乳動物としては、マウ ス、ラット、 -ヮトリ、七面鳥、ゥシ、ブタ、ヒッジ及びゥサギ等を挙げることができるが、 これらに限定されない。例えば、配列番号 1に示すヒト由来 FGF-18の塩基配列に基 づいて作製したプローブを定法に従って用いれば、ヒトを除く他の哺乳動物力 FGF -18をコードする遺伝子を単離することができる。
[0018] ヒト由来 FGF-18の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 1及び 2に示す 。マウス由来 FGF-18のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 3に示す。ラット由来 FGF-1 8のアミノ酸配列を配列番号 4に示す。ニヮトリ由来 FGF-18のアミノ酸配列を配列番 号 5に示す。これら配列番号 2、 3、 4及び 5に示すアミノ酸配列を比較すると判るよう に、哺乳動物において FGF-18は非常に高い相同性を有しており、哺乳動物におけ る FGF-18の機能はほぼ同様であると理解することができる。
[0019] なお、配列番号 2、 3、 4及び 5に示すアミノ酸配列のうち、 1又は数個のアミノ酸が 欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列力もなり、毛包の成長促進作用があるタンパ ク質であれば、本願における FGF-18に含まれる。ここで、数個のアミノ酸とは、例え ば 2〜54個、より好ましくは 2〜27個を意味する。
[0020] 例えば、配列番号 2に示すアミノ酸配列における 55〜177番目の領域は、様々な FG Fに共通するコア部分であると考えられる。したがって、配列番号 2に示すアミノ酸配 列における 55〜177番目の領域を除く領域であれば、 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換及び付加されたとしても、毛包の成長促進作用を欠損することなく本願における FGF-18として使用することができる。
[0021] また、本発明に係る新規な毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤は、 上述した FGF-18の部分断片であっても良い。 FGF-18の部分断片としては、例えば 配列番号 2における 55〜177番目のアミノ酸配列力 なるポリペプチドを挙げることが できる。すなわち、 55〜177番目のアミノ酸配列力もなるポリペプチドであっても、受容 体とへパリンに結合し、毛包の成長を促進する作用を有している蓋然性が高い。また 、 FGF-18の部分断片としては、最も好ましくは 28〜207番目のアミノ酸配列からなる ポリペプチドを使用することができる。なお、配列番号 3、 4及び 5に示すアミノ酸配列 においても、上記の範囲に相当するアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、本 発明に係る新規な毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤の有効成分とし て使用することができる。さら〖こ、 FGF-18の部分断片としては、 FGF-18の本発明に おける活性を発揮するために必要なものなら、 1〜207番目のアミノ酸配列のうちいず れの部分力もなる長さ 3-50アミノ酸程度のペプチドであっても良い。ただし、この数値 範囲を超えるアミノ酸力もなるペプチドであっても、本発明における FGF-18の部分断 片に含まれる。
[0022] 上述したように定義された FGF-18の全長及び部分ペプチドは、毛包の成長を促進 する作用を有する。この作用は、詳細を実施例にて後述するが、 FGF- 18の全長及び 部分ペプチドを含む培地にて毛包を培養し、 FGF-18の全長及び部分ペプチドによ る毛乳頭細胞、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞における DNA合成誘導能を、そ れぞれの純粋培養系又は外毛根鞘細胞との複合培養系を用いて調べることで確認 することができる。また、休止期にある実験動物に対して FGF-18の全長及び部分べ プチドを皮下投与し、毛包の成長を観察することによって、 FGF-18の全長及び部分 ペプチドによる毛包成長促進作用を確認することができる。
[0023] 2.毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤
上記「1. FGF-18」で説明した FGF-18全長ポリペプチド及び/又は部分ポリべプチ ドは、例えば、皮膚適用向けに適合化された溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション 、シャンプー又はエアゾールといった形態で製剤化され、毛髪成長促進剤、発毛促 進剤及び脱毛症治療剤として提供される。
[0024] 特に、毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤は、局所投与用に適合ィ匕 された薬理学上許容されるキャリアと共に FGF-18を含んだ医薬組成物の形で投与さ れる。毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤は、さらにへパリンを含有す ることが好ましい。 FGF-18を含有する毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治 療剤は、薬学上許容されるキャリア中に通常約 0.01〜約 100 g/日 /cm2、好ましくは 約 0.1〜約 10 /z g/日/ cm2の活性ィ匕合物を含有している。言い換えると、 FGF-18の濃 度は薬学上許容されるキャリア中で通常約 0.01〜約 100 g/日 /cm2、好ましくは約 0. 1〜約 10 g/日 /cm2の活性ィ匕合物である。
[0025] また、毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤は、当業界で周知の他の 精製又は組換え由来タンパク質増殖因子 (PGF)を含有していても良い、 FGF-18に よる毛包成長促進効果を増加又は増強させる増殖因子としては特に限定されず、表 皮増殖因子 (EGF)、血小板由来増殖因子 (PDGF)、トランスフォーミング増殖因子- a (TGF- a )、トランスフォーミング増殖因子- /3 (TGF- β )、インシュリン様増殖因子 (IGF)及び血管内皮細胞増殖因子の群を挙げることができる（ファン'ブラント及びク ラウスナー，ノィォテクノロジー，第 6卷，第 25-30頁， 1988年)。
[0026] EGF、 hEGF及びこれらの製造方法につ!、ては、米国特許第 3,914,824号、米国特 許第
3,948,875号、米国特許第 4,528, 186号、公開 PCT特許出願第 WO/85/00369号、プ 口シーデイング ·ォブ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイエンス USAの第 80卷、第 746 1-7465頁（1983年）に記載されており、参照することができる。
[0027] PDGF、 hPDGF及びこれらの製造方法につ!、ては、米国特許第 4,350,687号、ネー チヤ一の第 320卷，第 695- 699頁（1986年）、 EMBOジャーナルの第 3卷，第 921- 928 頁（1984年）、 EMBOジャーナルの第 3卷，第 2963-2967頁（1984年）に記載されており 、参照することがでさる。
[0028] TGF- a、 hTGF- a及びこれらの製造方法につ!、ては、欧州特許出願公開第 154,4 34号、セルの第 38卷，第 287-297頁（1984年）に記載されており、参照することができ る。 TGF- j8、 hTGF- j8及びこれらの製造方法については、米国特許第 4,774,228号 、米国特許第 4,774,322号、 DNAの第 7卷，第 1-8頁（1988年）、ジャーナル'ォブ 'バ ィォロジカル.ケミストリーの第 262卷，第 12127-12131頁（1987年）に記載されており、 参照することができる。
[0029] IGF-I、 hIGF-I及びこれらの製造方法にっ 、ては、公開 PCT特許出願第 WO/88/0 3409号、欧州特許出願公開第 264,074号、欧州特許出願公開第 219,814号に記載さ れており、参照することができる。 IGF-II、 hlGF-II及び及びこれらの製造方法につい ては、欧州特許出願公開第 280,460号に記載されており、参照することができる。
[0030] さらに、毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤は、当業界で周知の他の 毛髪成長促進活性を示す化合物又は薬剤を含んで!/ヽても良!ヽ。他の毛髪成長促進 剤としては、特に限定されず、抗アンドロゲン、 5 α -還元酵素阻害剤、ミノキシジル、 ミノキシジル誘導体又は類縁体及び関連化合物又は類縁体を挙げることができる。 [0031] さらにまた、局所投与用に適合化された薬理学上許容されるキャリアとしては、特に 限定されないが、親水ワセリン又はポリエチレングリコール軟膏のような軟膏、キサン ゴムのようなゴム等のペースト、アルコール、水性又は緩衝液のような溶液、水酸化ァ ルミ-ゥム又はアルギン酸ナトリウムゲルのようなゲル、ヒト又は動物アルブミンのよう なアルブミン、ヒト又は動物コラーゲンのようなコラーゲン、アルキルセルロース、ヒドロ キシアルキルセルロース及びアルキルヒドロキシアルキルセルロースのようなセルロー ス、メチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレロース、ヒ ドロキシプロピノレメチノレセノレロース及びヒドロキシプロピノレセノレロース、プノレロニック F 127で例示されるプル口ニック（Pluronic (商標） )ポリオールのようなポリマー；テトロ ニック 1508のようなテトロニック（tetronic)、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸 塩を挙げることができる。
[0032] また、本発明に係る毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤は、上記「1.
FGF-18」で説明した FGF-18全長ポリペプチド及び/又は部分ポリペプチドをコード する cDNAを有する発現ベクターを有効成分として含有するものであってもよ ヽ。すな わち、本発明に係る毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤は、上記発現 ベクターを用いた遺伝子治療に使用することができる。発現ベクターとしては、動物 細胞において発現を実現するためのプロモーターなどの配列を備える力 特に限定 されるものではない。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウィルスべク ターなどが利用可能である力 これらに限定されない。
[0033] より具体的には、遺伝子治療においては、上記「1. FGF-18」で説明した FGF-18全 長ポリペプチド及び/又は部分ポリペプチドをコードする cDNAを、例えばウィルスべク ターに組み込んで、該組換えウィルスベクターを有するウィルス (無毒化されたもの） を患者に感染させる。患者体内では FGF-18の全長ポリペプチド及び/又は部分ポリ ペプチドが産生され、毛包の成長を促進することができる。
[0034] 遺伝子治療用の毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤を細胞内に導 入する方法としては、ウィルスベクターを利用した遺伝子導入方法、非ウィルス性の 遺伝子導入方法（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、実験医学増刊， 12(15)(1 994)、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」，羊土社 (1996))のいずれの方法も 適用することができる。
[0035] ウィルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウィ ルス、アデノ関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、 ポリオウイルス、シンビスウィルス等の DNAウィルス又は RNAウィルスに、 TR4あるいは 変異 TR4をコードする DNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロ ウィルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、ワクシニアウィルスを用いた方法が、 特に好ましい。非ウィルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉 内に投与する方法 (DNAワクチン法）、リボソーム法、リポフエクチン法、マイクロインジ ェクシヨン法、リン酸カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられ、特に DNA ワクチン法、リボソーム法が好ましい。
[0036] また遺伝子治療用の毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤を実際に医 薬として作用させるには、 DNAを直接体内に導入するインビボ法及びヒトからある種 の細胞を取り出し体外で DNAを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエタスビボ がある（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20- 45頁、月刊薬事， 36(1), 23-48(1994)、実 験医学増刊， 12(15X1994))。
[0037] 例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応 じ、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与される。またイン ビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、 必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リボソーム又は膜融合リボソーム (セ ンダイウィルス—リボソーム等)の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃 縮凍結剤等のリボソーム製剤とすることができる。
[0038] 3.インビトロ毛髪再生系への応用〜 1
FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドを用いて、再生された皮膚組織における毛 髪のインビトロ再生系を構築することができる。ここで、皮膚組織とは、分離した皮膚 幹細胞を培養することによって得られる、皮膚の各種の細胞力 なる組織を意味する 。皮膚の各種の細胞とは、特に限定されないが、皮膚表皮の上皮細胞、皮膚上皮基 底層の細胞、毛胞を構成する各種細胞、真皮の細胞及び脂肪細胞等を意味する。 皮膚組織を再生する際に使用される細胞は、異種細胞、同種他家細胞及び同種自 家細胞の 、ずれであっても良 、。
[0039] 先ず、皮膚幹細胞からの皮膚の各種細胞への分化を制御する方法としては、特に 確立された技術がないため、本発明においては特に限定されない。例えば、自然分 ィ匕 (spontaneous
differentiation)が起きた段階において異なる発現を示す増殖因子受容体を利用し、 それぞれに対応するリガンド増殖因子を培地中に加えることにより、異なった分ィ匕方 向を有する細胞を選択的に増幅することができる。異なった分化方向を有する細胞 を選択的に増幅した後、皮膚組織を作製することができる。
[0040] 人工皮膚組織の作製方法としては、特に定まった技術はな 、ため、本発明にお!/ヽ ては限定されないが、例えば、上皮細胞だけを培養し層状に仕上げる方法、繊維芽 細胞など真皮の構成細胞により真皮層を形成した後、上皮細胞を重層させて一体化 する方法、その後上皮細胞の表面を空気に暴露することにより表皮化を促進させる 方法、真皮層の変わりに、生物分解が可能な成分により形成された層状フィルムを用 いる方法、など、様々な方法をとることができる。また、本発明は、ヒトから採取した皮 膚組織から皮膚幹細胞を分離し、分離した皮膚幹細胞を用いて皮膚組織を作製す るといった、いわゆる再生医療における皮膚組織の作製方法も適用される。このとき、 新たに作製した皮膚組織は、採取したヒトと同一人に対して治療のために戻すことを 前提としても良いし、採取したヒトと異なる他人に対して治療のために移植することを 前提するものであってもよ 、。
[0041] このような皮膚組織の作製方法において、培地中に FGF-18の全長及び/又は部分 ペプチドを適当な時期に添加することによって、再生した皮膚組織において毛包の 成長を促進することができ、当該皮膚組織における毛髪の成長或いは発毛を促進す ることができる。さらに、皮膚組織の作製方法において、培地中に FGF-18の全長及 び/又は部分ペプチドを適当な時期に添加することによって、皮膚細胞の増殖を促 進することができ、皮膚組織全体の体積の増大を図ることができる。
[0042] 4.インビトロ毛髪再生系への応用〜 2
FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドを用いて、毛包を成長させる培養法を構築 することができる。毛包は、例えば、引き抜いた毛髪力も調製された成長期ヒト毛包を 使用することができる。毛包は、許容される洗浄用溶液、緩衝液又は培地で洗浄され る。許容される洗浄用溶液としては、特に限定されず、蒸留水、生理塩水等を使用す ることができ、許容される緩衝液としては、特に限定されず、リン酸緩衝液、リン酸緩 衝塩水（PBS)、リン酸緩衝塩水グルコース、トリス HC1等を使用することができる。培地 としては、特に限定されず、イーグル最小必須培地、イーグル基本培地及びダルべ ッコ修正イーグル培地等を使用することができる力 ダルベッコ修正イーグル培地が 好ましい。洗浄された毛包は約 1〜約 10毛包 Zゥエルで細胞培養プレートにおかれ る。
[0043] 毛包は、通常、熱不活化血清、好ましくは約 10%牛胎児血清、抗生物質、好ましく は 10,000 μ 1、ペニシリン G、約 10,000 μ g、硫酸ストレプトマイシン及び約 1%フンギゾ ンで補充された培地で培養される。選択される培地はダルベッコ修正イーグル培地 が好ましい。毛包は、約 5%の CO及び約 95%空気雰囲気下において 37°Cで約 1〜
2
約 5日間培養される。このとき、 FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドを、例えば約 0 .01〜約 1.0 gFGF/ml/日で添加される。また、へパリンは各ゥエルに約 3 : 1 =へパリ ン： FGFでカ卩えられる。ヒト血清アルブミン（HSA)は、すべてのゥエルに約 10 : 1 = HSA ： FGFでカ卩えられる。細胞刺激は最終 24時間のインキュベートにおいて、 3H-チミジン 約 5 Ci、約 0.14 g/ゥエルの添カ卩後、冷チミジン約 14.2 g/ゥエルの添カ卩により、 F GF-18の全長及び/又は部分ペプチドの作用を調べることができる。
[0044] 毛包 DNAは、約 5%トリクロ口酢酸で沈降され、約 1Nの NaOHに約 45°Cで一夜かけ て溶解される。シンチレーシヨンカウントは 50 1容量の最終切断物について 3回行わ れる。 FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドは、毛包において DNA合成を促進す る。よって、以上のように毛包 DNA量を検定することによって、毛包の成長促進能を 明らかにすることができる。
[0045] 5.スクリーニング方法
本発明に係るスクリーニング方法は、 FGF-18による毛包の成長促進作用を介して、 毛髪成長促進、発毛促進或いは脱毛症治療といった機能を有する物質をスクリー二 ンする方法である。
[0046] 本スクリーニング方法では、先ず、被検物質を動物培養細胞又は実験動物に接触 させる。なお、実験動物とは、ヒトを除ぐ例えば、マウス、ラット、 -ヮトリ、七面鳥、ゥ シ、ブタ、ヒッジ及びゥサギ等を意味する。被検物質としては、何ら限定されないが、 例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、 発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な 物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
[0047] 次に、本スクリーニング方法では、動物培養細胞又は実験動物における FGF-18遺 伝子の発現をモニターする。動物培養細胞又は実験動物における FGF-18遺伝子の 発現は、例えば、 FGF-18抗体を用いた ELISA等の常法を用いて解析する力、あるい は該細胞内又は実験動物内における FGF-18遺伝子の mRNA量を定量的逆転写 PC R法やノーザンプロット法等により解析するといつた方法によりモニターすることができ る。
[0048] これらいずれかの解析により、被検物質の非存在下で培養された動物培養細胞内 における FGF-18遺伝子の発現量と比べて、被検物質の存在下で培養された動物培 養細胞内又は実験動物内における FGF-18遺伝子の発現量が増加すれば、当該被 検物質は毛髪成長促進、発毛促進或いは脱毛症治療と!/、つた機能を有する可能性 力 Sあると判断できる。
[0049] このようにスクリーニングされた物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単 独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成 物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜90重量 %の間で変動され得る。また、力かる薬剤は種々の形態で投与することができ、それ らの投与形態としては、溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、シャンプー又はエア ゾールといった非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、 体重等によって適宜選択することができる。
実施例
[0050] 以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以 下の実施例に限定されるものではない。
[0051] 〔実施例 1〕
本実施例では、マウスの皮膚における FGFファミリーに属する遺伝子の発現プロフ アイルを検討した。
<材料と方法 >
マウスおよび皮膚サンプルの調製
毛周期の実験用として 7週齢の C3H/HeN雄マウス（Tlr4+/+) 25匹を日本エスエルシ 一株式会社から入手し、標準的な実験動物用飼料および水を任意に摂取させて飼 育した。 1週間馴化させた後、マウス 5匹を安楽死させ、背部毛を短く刈り、皮膚サン プルを分離し、「0日（休止期）」サンプルとした。残りのマウス 20匹については、ヮック ス、テープ又は脱毛剤を用いずに、手袋を装着して指によって背部毛幹を優しく抜 いて、毛周期の成長期を誘発した。そして毛包周期の時期、すなわち脱毛後 8日（成 長期 V)、 18日（成長期 VI)、 20日（退行期 IV)及び 22日（休止期）を選択し、マウスを 安楽死させ、毛を短く刈り、全層皮膚サンプル (表皮、毛幹、毛包、皮脂腺、皮下脂 肪、皮膚筋及び血管を含む)を脱毛した部位力も採取した。全層皮膚サンプルは、 後述する mRNA分離、 in situハイブリダィゼーシヨン及び免疫組織染色に使用した。 なお、これらの実験は基本的に同一試験計画によって 3回実施して結果の再現性を 確証した。
[0052] in situハイブリダィゼーシヨン用の皮膚サンプルは、直ちに OCT- compoundで包理 して液体窒素で凍結した。また、免疫組織染色用の皮膚サンプルは、最初に 10%ホ ルムアルデヒドで室温 24時間固定し、標準的な方法によってパラフィンで包理した。
[0053] mRNA調製および逆転写
トータル RNAは、上述したように準備した皮膚サンプル力 Isogen (株式会社-ッポ ンジーン)を製造業者の取扱説明書に従って使用して調製した。次に、 01igotex-dT3 0
Super mRNA精製キット（タカラバイオ株式会社）を用いて、トータル RNAから mRNAを 精製した。精製した mRNAサンプル（100ng)を铸型とし、プライマとして 01igo(dT)12- 1 8を用いた Superscript Il (Gibco BRL)によって全量 20mlで逆転写反応を行った。
[0054] PCRプライマの設計および FGF
cDNAのクローニング
各 FGFの mRNA量をリアルタイム PCRによって分析できるように、特異的なプライマ セットを設計した (表 1)。各 FGFの mRNAを定量する際、コピー数対照として cDNAフ ラグメントが必要となる。この cDNAフラグメントをクローユングする際、同じプライマセッ トを使用した。
[表 1]
Figure imgf000018_0001
SCS9T0/S00Zdf/X3d LY C690C0/900Z OAV [0056] 上述した逆転写反応の反応産物（RT混合物）を蒸留水で 10倍希釈したものを PCR 増幅の铸型とした。 PCR増幅には、 Pfoポリメラーゼ (Stratagene社製)を製造業者の取 扱説明書に従って使用した。そして、 PCR増幅反応混合液の一部を 2.0%ァガロース ゲルを用いた電気泳動に使用し、増殖産物の大きさを確証した。また、各 FGFに相当 するそれぞれの cDNAをクロー-ングするため、 PCR産物を pCR-Bluntll- TOPOベタ ター（Invitrogen社製）に連結して E.coliの形質転換に使用した。リコンビナントプラスミ ドのヌクレオチド配列は BigDyeターミネータサイクルシークェンシングキット及び ABI P RISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製）を用いて確認した。
[0057] リアルタイム PCRによる mRNAコピー数の定量
リアルタイム PCR増幅は、 1:10に希釈した RT混合物 2mlを铸型として用い、 Light Cy cler (Roche Diagnostics社製）によって実施した。各 FGFの絶対コピー数を得るため、 各 FGFに対応するプラスミツド DNAをコピー数対照としてそれぞれ使用した。 Light Cy clerによって増幅した DNAの定量には、 Cyber Greenを使用した。特異性の高いプラ イマとともに、最適なアニーリング温度、伸長時間、および取得温度で Light Cycler反 応を実施した。プライマの特異性はバックグラウンド用の配列としてマウスの全 cDNA を用いて最初に確証した。プライマの特異性および反応条件はプラスミド DNAに増幅 フラグメントをクローユングすることによって、さらに実験的に実証してこれらの配列を 検証した。
[0058] さらに個別実験の最後に増幅産物の融点温度を測定してこれらが融点温度で均一 であることが実証された。定量実験後、産物を 2.0%ァガロースゲル電気泳動で分析 し、反応によって既知サイズの DNAフラグメントが正確に増幅されて ヽることが確証さ れた。この実験系によって個別遺伝子の特異的な定量が保証される。 mRNAの評価 では、 Light
Cyclerによる同一実験に標的 cDNA配列を有する DNAの連続希釈サンプルを含め、 これらの測定力 個別サンプルと関連する mRNAの絶対コピー数を算出した。またノヽ ウスキーピング遺伝子のコピー数を同じ方法で評価してこれらの量が予測範囲内で あることを確認した（例えば、 b-ァクチン mRNAコピー数は 8日目のサンプルが 2 X 106 コピー/ ng mRNAであることが測定された)。 [0059] <結果〉
FGF及び FGFRファミリメンバの発現プロファイル
毛周期の指示時期における各 FGFおよび FGFRの mRNA発現量をそれぞれ図 1A、 図 IB及び図 2に示した。さらにすベての mRNAの中で最も高い発現量およびその毛 周期での時期を表 2にまとめて示す。
[0060] [表 2]
Figure imgf000020_0001
[0061] 図 1A及び表 2から、発現量の最も高い遺伝子は Fgf-1、 -5、 -7、 -10、 -13、 -18及び - 22であることが判明した。この群では、 FGF-5及び FGF-22の mRNA量が毛周期全 体を通して同様な変化を示し、成長期 VIにおける発現量が最も高力つた（18日目；図 1A)。 FGF-7及び- 10 (又は、それぞれ角化細胞増殖因子（KGF) -l及び KGF-2)の m RNA量は、成長期 Vで最も高かった（8日目；図 1A)。 FGF-1の mRNA (又は酸性 FGF) 量は比較的一定しており、休止期で最大量を示した (0日目；図 1A)。これら FGFの最 大発現量は FGF-7及び- 18などで 1 X 104コピー/ ng mRNAである。この mRNA発現量 は豊富な構造タンパク質の 1つである j8 -ァクチン (成長期 Vで 5.6 X 105コピー/ ng mR NA；表 2)の約 60分の 1だった。
[0062] 本実施例では、皮膚で発現することが既に知られて ヽるこれら遺伝子、すなわち FG F-l、 -2、 -5、 -7、 -10、 -13及び- 22に加えて、 FGF-18 mRNAも高い量で発現してお り、 FGF-18mRNA量が休止期にピークを示す（0日目及び 22日目；図 1A)ことが明ら 力、になった。また、図 1Aからは、 FGF-18発現量力 十分研究されている FGF-2 (又は 塩基性 FGF)及び他の FGFよりもほとんどの時期で高いことが明ら力となった。 FGF-3 、 -6、 -9、 -11、 -20及び- 21の mRNAも中程度発現された（図 1B)が、 FGF-4、 -8、 -14 、 -15及び- 23の mRNA発現は毛周期のどの時期でもほとんどあるいは全く検出され なかった（〈100コピー/ ng mRNA;表 2)。
[0063] FGFRに関しては、 FGFR-1及び FGFR-3の mRNAともに多量に発現されたが（FGF R-1では最大 47,000コピー/ ng mRNA, FGFR-3では最大 28,000コピー/ ng mRNA;図 2)、前者では最も強い発現が成長期 VI〜退行期（18日目及び 20日目）に現れ、後者 では成長期 VI (18日目；図 2)で最高だった。 FGFR-2の mRNA発現量は、上皮細胞に 特異的である Illbサブクラスも含めて FGFR-1又は 3の mRNAよりも少なく（図 2)、 FGFR -4の mRNA発現量は 4種類の受容体の中
で最も低かった（図 2)。
[0064] 〔実施例 2〕
実施例 1において、皮膚における FGF-18の発現が新規に明らかになつたため、本 実施例では、 in situハイブリダィゼーシヨンを用いてその mRNAの分布を測定した。 <材料と方法 >
in situノヽイブリダィゼーシヨン
in situノヽイブリダィゼーシヨン実験は、 OCTで包理した凍結組織切片およびジゴキ シゲニン標識リボプローブを用いて基本的に既に報告されて 、る方法（Komminoth P ： Digoxygenin as an alternative
probe labeling for in situ hybriodization. Diag Mol Pathol 1:142—150, 1992参照）に 従って実施した。
[0065] FGF- 18のセンスリボプローブ及びアンチセンスリボプローブは、ジゴキシゲニン- dU TP (Roche Applied Science社製）の存在下で、それぞれ SP6及び T7の RNAポリメラー ゼを使用して合成した。ノ、イブリダィゼーシヨン処理中はあらゆる手段を講じて RNA変 性を避けた。凍結組織は、クライオスタツト (Microm社製、モデル HM500OM)を用い て 10mmに切り、直ちに MASでコートしたスライドグラス (松浪硝子株式会社製）にのせ 、 50°Cで 1時間乾燥させてから、乾燥剤とともに 80°Cで保存した。ハイブリダィゼー シヨン前に切片は 4%パラホルムアルデヒドを含む PBSで室温 10分間固定して力も PB Sで 5分間洗浄した。そして切片にプロティナーゼ K (2 X TE中に 0.01mg/ml)を 37°Cで 5分間浸透させ、 PBSですす!、で力 再度 4%パラホルムアルデヒドを含む PBSで 5分 間固定し、 PBSで 5分間洗浄した。固定した切片は 0.1%DEPCを含む PBSで 15分間 2 回浸漬し、 PBSですすいだ。
[0066] 次に切片は 100%ホルムアミドに 45°Cで 10分間浸漬し、 100%及び 50%のホルムァ ミドを用いて 45°Cですす 、でから 5 X SSCに 15分間浸漬した。最終的にハイブリダィ ゼーシヨンは、 50%(v/v)ホルムアミド、 5 X SSC、 500mg/mlのサケ精巣 DNA、 250mg/m 1の tRNA、 5 X Denhardt，s溶液、および ImMの DTTを含むハイブリダィゼーシヨン緩衝 液 100ml中に 500ng/mlで加えた熱変性（70°Cで 10分間）プローブを用いて、 45°Cで 1 6〜18時間実施した。ハイブリダィゼーシヨン後、スライドを 2 X SSCを用いて 45°Cです すぎ、そして 2 X SSCによって 45°Cで 30分間 2回洗浄し、さらに 0.2 X SSCによって 45°C で 20分間 2回洗浄した。結合したリボプローブをアルカリホスファターゼと結合させた 抗ジゴキシゲニン抗体（1:500、 Roche Applied Science社製）を用いて検出した。可視 化するため、ニトロブルーテトラゾリゥムおよび 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル- 1-リン 酸（NBT/BCIP)を用いた比色反応を、 BMパープル（Roche Applied Science社製）を 使用してシグナルが認められるまで暗所において室温で行った。具体的には、脱毛 後 8日（成長期 V)の切片サンプルについては 24時間の比色反応、 18日（成長期 VI) の切片サンプルについては 48時間の比色反応、 20日（退行期 IV)の切片サンプルに ついては 24時間の比色反応、及び 0日（休止期）の切片サンプルについては 96時間 の比色反応を行った。
[0067] <結果 >
in situハイブリダィゼーシヨンの結果を図 3に示す。図 3中、 A及び Bはアンチセンス リボプローブを用いた結果を示し、 C及び Dはセンスプローブを用いた結果を示す。 図 3中のバーは 100 mを意味する。図 3に示すように、成長期における毛包では、 F GF-18
mRNAは実質的に毛包の内毛根鞘細胞のみで発現されることを認めた（図 3A、 B ;紫 色のシグナル）。一方、センスプローブはシグナルを生じなかった（図 3C、 D)。
[0068] また、休止期にお!/、て FGF-18 mRNAは、毛包底部のバルジ領域で発現されること を認めた。なお、休止期においては、 j8 -ァクチン mRNAでさえ非常に微弱にし力検 出できないことから、成長期と比較して休止期の in situノヽイブリダィゼーシヨンは非常 に困難であった。そこで、本実施例では、 0日（休止期）の切片サンプルに対する in si tuノヽイブリダィゼーシヨンの比色反応を 96時間と 、つた長時間で行うことで、休止期の in situハイブリダィゼーシヨンを可能ならしめた。
[0069] 〔実施例 3〕
本実施例では、 FGF-18の皮膚における機能を評価するため、ヒト毛包外根鞘（OR S)細胞、毛乳頭（HFDP)細胞、皮膚線維芽細胞（HDF細胞）及び表皮角化細胞（HE K細胞）ついて、 FGF-18による細胞分裂促進効果を調べた。
[0070] <材料と方法 >
DNA合成アツセィ
培養した最初のヒト皮膚線維芽細胞 (新生児包皮由来；東洋紡績株式会社製)は、 HDF生育培地 (生育補助成分を加えた FBM (線維芽細胞基礎培地）；東洋紡績株式 会社製)で継代培養して 2継代以内に [3H] -チミジン取り込みアツセィに使用した。
[0071] 培養した最初のヒト毛乳頭細胞 (成人頭皮由来；東洋紡績株式会社製）は HFDP生 育培地 (20%ゥシ胎児血清を含む乳頭細胞基礎培地；東洋紡績株式会社製)で継代 培養して 2継代以内に [3H] -チミジン取り込みアツセィに使用した。細胞はトリプシン 処理してコラーゲンコートプレート（Sumilon社製）に、密度が 1 X 104細胞/ゥエルで 48 ゥエル（HDF細胞）又は 1 X 104細胞/ゥエルで 24ゥヱル（HFDP細胞）に分注して HDF 培地で 37°Cに維持した。次の日に HDF生育培地を、 0.5%チヤコール吸着子ゥシ血清 を含む FBMで置き換え、細胞を 48時間（HDF細胞)又は 96時間（HFDP細胞)培養し て力も所定の濃度の FGFで刺激した。 FGFをカ卩えてから 18時間後（HDF細胞)又は 8 時間後（HFDP細胞）に [3H]-チミジン（lmCi/ゥエル； Moravek Biochemicals社製）を 培地に加え、細胞をさらに 8時間（HDF細胞)又は 18時間（HFDP細胞)培養した。そし て細胞を採取して、取り込まれた放射能量を計測した。
[0072] 培養した最初のヒト表皮角化細胞 (新生児包皮由来；東洋紡績株式会社社製)及 び最初のヒト外根鞘細胞 (成人男性頭皮由来）は角化細胞生育培地 (ゥシ下垂体抽 出物、インスリン、上皮増殖因子、ハイド口コルチゾン、トランスフェリン、ェピネフリン、 および抗生物質を添加した角化基礎培地 (KBM) -2；東洋紡績株式会社製)で継代 培養して 2継代以内で使用した。細胞はトリプシン処理してコラーゲンコートプレート に密度が 1 X 104細胞/ゥエルで 48ゥエル（HEK細胞）又は 1.2 X 104細胞/ゥエルで 24ゥ エル（ORS細胞）に分注して HEK生育培地で 37°Cに維持した。次の日（HEK細胞）又 は 4日後（ORS細胞）に生育培地を 10— 8Mインスリンおよび 5mg/mlのへパリンを含む KB M-2培地で置き換え、細胞を所定の濃度の FGFで刺激した。 FGFをカ卩えてから 18時 間後（HEK細胞）又は 8時間後（ORS細胞）に [ ]-チミジン（lmCi/0.5ml;Moravek Bi ◦chemicals社製）を培地に加え、細胞をさらに 8時間（HEK細胞）又は 18時間（ORS細 胞)培養した。そして細胞を採取して、取り込まれた放射能量を計測した。
[0073] <結果 >
DNA合成アツセィの結果を図 4に示す。図 4中、 Aは HFDP細胞（図中では DPCと表 記）を用いたアツセィの結果を示し、 Bは ORS細胞（図中では ORSCと表記）を用いた アツセィの結果を示し、 Cは HDF細胞（図中では DFと表記）を用 、たアツセィの結果 を示し、 Dは HEK細胞（図中では EKと表記）を用いたアツセィの結果を示している。図 4力ら判るように、比較的高い濃度（100及び 1000ng/ml)の FGF- 18によって、 HFDP 細胞、 HDF細胞及び HEK細胞にお!ヽて DNA合成が誘導されて!ヽた（それぞれ図 4A 、 4C及び 4D)。このことは、 HEK細胞で DNA合成を刺激する（図 4D)が HFDP細胞（図 4A)及び HDF細胞（図 4C)では非常に刺激が弱 、ことが十分特徴付けられて 、る角 化細胞マイトジヱンである FGF-7 (KGF)と相違して!/、る。
[0074] この結果から、 FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドは、毛包の成長を促進する 作用があることが実証された。さらに、この結果から、 FGF-18の全長及び/又は部分 ペプチドは、皮膚細胞の増殖、すなわち皮膚全体の体積の増大に促進的に作用す ることが実証された。
[0075] 〔実施例 4〕
本実施例では、毛包に対する FGF-18の in vivoでの影響の特徴を調べるため、 FG F-18の投与による影響を毛周期の休止期にある C3H/HeNマウスで試験した。
<材料と方法 >
FGF- 18活件の in vivo分析
FGF-18の毛包に対する in vivoでの影響の特徴を調べるため、毛成長が休止期の マウスに組換え FGF-18を投与した。基本的な手順は McElweeらによって開発された 方法に従って、 in vivoにおけるマクロファージ刺激性タンパク質の活性を実証した (M cElwee
KJ, Huth A, Kissling S, Hoffman R; Macrophage— stimulating protein promotes hair growth ex vivo and induces anagen from telogen stage hair follicles in vivo. J Invest Dermatol 123:34-40, 2004参照）。
[0076] すなわち、先ず、 lOmgの組換え FGF-18タンパク質を添カ卩した 0.75mlの PBSを、 0.75 ml (包装容量）のセファロース 4Bビーズ及び 7.5mlの C3H/HeN血清と 37°Cで 2時間混 合してビーズに組換え FGF-18を吸着させた。また、組換え FGF-18をカ卩えずに同一 処理して得られたビーズを対照ビーズとした。 50日齢の C3H/HeN雌マウス 5匹に麻 酔をかけ、背部毛をトリマによって優しく短く刈った。そして FGF-18吸着ビーズ懸濁 液を背部皮膚に皮下注射した（150ml/マウス、すなわち、マウス 1匹あたり 1 gの FGF -18)。マウスは飼料および水を任意に摂取できるようにして飼育した。 21日後にマウ スに麻酔を力 4ナて安楽死させた。背部皮膚を全層で切除し、内部表面を写真撮影し て力 皮膚をパラフィンで包理した。包理した皮膚サンプルはミクロトームで 4 m厚の 切片にしてへマトキシリンで染色して顕微鏡で観察した。 [0077] <結果 >
結果を図 5に示す。図 5中、 Aは FGF-18吸着ビーズ懸濁液を投与したマウスにおけ る皮膚内部表面を撮影した写真であり、 Bは写真 A内の囲み枠を拡大した写真であり 、 Cは FGF-18吸着ビーズ懸濁液を投与したマウスにおける皮膚切片を撮影した写真 であり、 Dは対照ビーズ懸濁液を投与したマウスにおける皮膚内部表面を撮影した写 真であり、 Eは対照ビーズ懸濁液を投与したマウスにおける皮膚切片を撮影した写真 である。なお、図 5に示した写真 C及び E内のバーはそれぞれ 100 mを示している。
[0078] FGF-18吸着ビーズ懸濁液を皮下投与した 21日後に 5匹中 4匹で毛包成長が認めら れた。外観から 1匹には活発な毛成長が背部皮膚の試験部位の全域で認められ、 3 匹では試験部位のいくつかの領域で明らかな色素沈着が認められた（図示せず)。 皮膚の内部表面検査によって、明らかな色素沈着及び/又は毛成長を伴ってマウス の成長期毛包における広範囲にわたる成長が示された（図 5の写真 A及び B)。図 5の 写真 A及び Bは代表的な結果を示しているが、図 5の写真 A及び Bにおいて黒色のス ポットは成長期毛包を示している。さらに、図 5の写真 Cに示すように、皮膚切片の組 織学的検査によってもマウスの成長期毛包における広範囲にわたる成長を確認する ことができた。なお、 5匹のマウスのうち 1匹は FGF-18吸着ビーズ懸濁液の投与によつ ても、試験期間中に明白な変化を示さな力つた。
[0079] これに対して、対照ビーズ懸濁液を投与したマウス 5匹では、毛成長あるいは強!、 色素沈着は認められな力つた。図 5の写真 Dに示すように、内部表面の検査からは、 白色によって示されるように成長期毛包はほとんど又は全く示されな力つた。図 5の 写真 Eに示すように、このことは糸且織学的検査により確認することができた。
[0080] この結果から、 FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドを投与することによって、毛 包の成長を促進できることが in vivoにお 、て実証された。
[0081] また、図 5の写真 C及び Eを比較すると判るように、皮膚が生理学的な成長期毛包を 伴う正常な皮膚と全く同じように非常に厚くなつていた。この結果から、 FGF-18の全 長及び/又は部分ペプチドは、皮膚細胞の増殖、すなわち皮膚全体の体積の増大に 対しても、促進的に作用することが実証された。

Claims

請求の範囲
[1] FGF-18の全長又は部分ペプチドを有効成分として含有する毛髪問題治療剤。
[2] FGF-18の全長又は部分ペプチドをコードする cDNAを組み込んだ発現ベクターを 有効成分として含有する毛髪問題治療剤。
[3] 他のタンパク質増殖因子及び/又は毛髪成長促進剤を更に含むことを特徴とする 請求項 1又は 2に記載の毛髪問題治療剤。
[4] 毛髪問題治療剤が毛髪成長促進剤であることを特徴とする請求項 1〜3の 、ずれ かに記載の毛髪問題治療剤。
[5] 毛髪問題治療剤が発毛促進剤であることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに 記載の毛髪問題治療剤。
[6] 毛髪問題治療剤が脱毛治療剤であることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに 記載の毛髪問題治療剤。
[7] 被検物質を動物培養細胞又は実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞又は 実験動物における FGF-18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、 FGF-18遺伝 子の発現を促進する機能を有する被検物質を毛髪問題治療剤の候補とする、スクリ 一二ング方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006135027A1 (ja) * 2005-06-17 2006-12-21 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 創傷治療及び／又は創傷治癒促進のための薬剤
WO2008102782A1 (ja) * 2007-02-19 2008-08-28 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 毛髪成長阻害剤
EP2127674A4 (en) * 2007-02-19 2011-04-27 Nat Inst Of Advanced Ind Scien MEDIUM TO PROMOTE THE AFTERWORKING OF HAIR
JP2012062294A (ja) * 2010-09-17 2012-03-29 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology 毛成長休止期短縮剤

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2641528T3 (es) * 2006-06-27 2017-11-10 Shiseido Company, Limited Masa celular capaz de servir como estructura de tipo órgano primitivo compuesta por una diversidad de tipos de células de origen somático
EP2478003A4 (en) 2009-09-15 2013-05-29 Five Prime Therapeutics Inc HAIR GROWING PROCEDURES USING EXTRACELLULAR FGFR4 DOMAINS
EP2512501A4 (en) 2009-12-17 2014-01-01 Five Prime Therapeutics Inc METHODS FOR PROMOTING HAIR GROWTH USING FGFR3 EXTRACELLULAR DOMAINS
US8481038B2 (en) 2010-11-15 2013-07-09 Five Prime Therapeutics, Inc. Treatment of cancer with elevated dosages of soluble FGFR1 fusion proteins
FR3008316B1 (fr) * 2013-07-09 2020-01-31 Assistance Publique - Hopitaux De Paris Utilisation de fibroblastes gingivaux dans le traitement de l'alopecie
CN108291197B (zh) 2015-10-21 2022-09-16 印第安纳大学研究与技术公司 生成人内耳感觉上皮和感觉神经元的方法
CN108367099B (zh) * 2015-10-21 2021-11-23 印第安纳大学研究与技术公司 来自多能干细胞的人皮肤类器官的衍生

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04224522A (ja) * 1990-04-27 1992-08-13 Merck & Co Inc 繊維芽細胞増殖因子含有組成物による禿頭症の治療又は予防方法
JPH0543424A (ja) * 1991-08-14 1993-02-23 Sansho Seiyaku Co Ltd 毛髪用外用剤
JPH09316096A (ja) * 1996-03-29 1997-12-09 Agency Of Ind Science & Technol Ｆｇｆ−５類似体タンパク質およびそれを含有する医薬組成物
US20030170822A1 (en) * 2000-03-31 2003-09-11 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04224522A (ja) * 1990-04-27 1992-08-13 Merck & Co Inc 繊維芽細胞増殖因子含有組成物による禿頭症の治療又は予防方法
JPH0543424A (ja) * 1991-08-14 1993-02-23 Sansho Seiyaku Co Ltd 毛髪用外用剤
JPH09316096A (ja) * 1996-03-29 1997-12-09 Agency Of Ind Science & Technol Ｆｇｆ−５類似体タンパク質およびそれを含有する医薬組成物
US20030170822A1 (en) * 2000-03-31 2003-09-11 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLANPAIN C ET AL: "Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.", CELL., vol. 118, no. 5, 2004, pages 635 - 648, XP002994030 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006135027A1 (ja) * 2005-06-17 2006-12-21 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 創傷治療及び／又は創傷治癒促進のための薬剤
WO2008102782A1 (ja) * 2007-02-19 2008-08-28 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 毛髪成長阻害剤
EP2127674A4 (en) * 2007-02-19 2011-04-27 Nat Inst Of Advanced Ind Scien MEDIUM TO PROMOTE THE AFTERWORKING OF HAIR
JP2013209410A (ja) * 2007-02-19 2013-10-10 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology 発毛促進剤
JP5360593B2 (ja) * 2007-02-19 2013-12-04 独立行政法人産業技術総合研究所 発毛促進剤
JP2012062294A (ja) * 2010-09-17 2012-03-29 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology 毛成長休止期短縮剤

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122 Ep: pct application non-entry in european phase