WO2006030638A1 - ナガイモ由来マンノース特異的レクチンとその遺伝子 - Google Patents

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dna
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lectin
acid sequence
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Tomohisa Ogawa
Koji Muramoto
Kazuhiro Matsuda
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Tohoku University
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    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a lectin gene (DNA) having an insecticidal action and specifically recognizing mannose, and more particularly, to a mannose-specific lectin of Nagaimo (Dioscorea batatas) and its gene. More specifically, the present invention relates to a plant in which a DNA encoding a mannose-specific lectin having an insecticidal action and the above-described cloned DNA are incorporated using a mannose-specific lectin gene newly isolated from Nagamo. It relates to animals and microorganisms.
  • Lectins are proteins that specifically recognize sugars and bind reversibly. Lectins were found in many plant-derived lectins, including legume seeds, and were found in all living organisms including vertebrates, invertebrates, mushrooms, microorganisms, and viruses. Many discussions have also been developed regarding the physiological significance of these lectins. In addition to their intrinsic roles such as cell differentiation, morphogenesis, and glycoprotein metabolism, bioprotection against bacteria and viruses, symbiosis and supplementation The external roles such as are also reported.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 pine snow lectin (Snowdrop lectin, Galanthus nivalis agglutinin, GNA), which is classified as a monocotyledonous mannose-binding lectin family, has been reported to impart insect resistance to plants that have been genetically modified.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 the safety of ingesting these lectin-modified plants is still well established.
  • DB1 a lectin
  • DB2 a storage protein
  • DB3 a lectin having an affinity for maltose
  • Bichininase DB4 was found and isolated at a ratio of 20: 50: 20: 10.
  • the lectin (DB3) which has an affinity for maltose, consists of one subunit with a molecular weight of approximately 66 kDa and two subunits with a molecular weight of approximately 3 lkDa, each of which has homology with the storage protein ( It is revealed that the strength of 242 amino acid residues and 241 amino acid residues is 90%) (Non-patent Document 3).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 10-506532
  • Non-Patent Document 1 Fitches et al., Effects of Snowdrop Lectin (GNA) Delivered Via Artificial Diet and Transgenic Plants on the Development Tomato Moth (Lacanobia oleracea) Larvae in Laboratory and Glasshouse Trials, Journal of Insect Physiology, 43 (8), 727- 739 (1997).
  • GAA Snowdrop Lectin
  • Non-Patent Document 2 Rao et al., Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper, The Plant Journal, 15 (4), 469-477 (1 998).
  • GAA snowdrop lectin
  • Non-Patent Document 3 Gaidamashviii, Characterization of the Yam Tuber Storage Proteins from Dioscorea batatas Exhibiting Unique Lectin Activities, The Journal of Biologica 1 Chemistry, 279 (25), 26028-26035 (2004).
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a gene for lectin having insecticidal activity, and further to provide this gene that is safer when taken by humans or animals such as domestic animals as food. Incorporating new insect-resistant organisms, especially plants (food) The
  • the present invention relates to the following aspects.
  • DNA according to claim 1 which also has a nucleotide sequence that encodes a polypeptide (protein) of the following (a) or (b): (a) SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 A polypeptide comprising the amino acid sequence shown; or (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a), and the polypeptide of (a) A polypeptide having substantially the same biological activity as
  • the DNA according to claim 2 which is the following DNA (a) or (b): (a) a DNA comprising any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 8; (b) hybridizes with DNA containing a base sequence complementary to the base sequence of (a) under stringent conditions, and exhibits biological activity substantially the same as the polypeptide encoded by the DNA of (a). DNA that encodes a polypeptide.
  • a recombinant vector comprising the DNA according to claim 1 or 3.
  • polypeptide (a) or (b) (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3, or (b) of (a) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and having substantially the same biological activity as the polypeptide of (a).
  • An insecticidal composition comprising the polypeptide according to claim 6 as an active ingredient.
  • the invention's effect it is possible to introduce and express the gene for Nagano-derived mannose-specific lectin, which is a cultivated plant to eat, as an insect resistance gene in an organism such as a plant, and as a food with improved insect resistance. Even when ingested, safer recombinant plants can be produced.
  • FIG. 1 is a graph showing the insecticidal action (A) of Nagaimo-derived mannose-specific lectin DB1-1 on tobacco moth (A) and the insecticidal action (B) on tobacco moth.
  • the “polypeptide having substantially the same biological activity” indicates that the biological activities of the two polypeptides are the same in nature.
  • biological activity means a specific biological action or activity that the polypeptide exerts on the outside world or an object (organism), for example, as shown in the Examples of the present specification. Such as hemagglutination lectin activity and insecticidal activity against organisms such as Z or insects.
  • deletion, substitution or attachment of one or several amino acids is It preferably occurs in areas that are not related to Alternatively, amino acids having the same chemical properties (polarity, acidity, basicity, aromaticity, hydrophobicity, hydrophilicity, etc.) are preferably substituted.
  • polypeptide having the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 is considered to be a pro-form, and therefore, in each amino acid sequence, the first A polypeptide lacking methionine and the second alanine is a mature protein that has a hemagglutinating lectin activity and an insecticidal activity against organisms such as Z or insects. It is an example of a “peptide”.
  • under no stringent conditions means, for example, when the probe is labeled with DIG DNA Labeling (Cat No. 1175033 manufactured by Boehringer Mannheim) Hybridize in 32 ° C DIG Easy Hyb solution (Boehringer Mannheim Cat No. 1603558) and wash the membrane in 40 ° C O.lxSSC solution (containing 0.1% [w / v] SDS) Hybridize to the human DNA probe of the present invention by Southern blot hybridization under the following conditions (lxSSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate) The condition is sufficient Hybridization can be performed according to a method known in the art such as the method described in Molecular cloning third. Ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) or a method analogous thereto. In addition, when using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • a DNA that can hybridize with a DNA containing a base sequence complementary to a specific base sequence under stringent conditions for example, the degree of homology with the entire base sequence of the DNA is the average of the whole.
  • the gene (DNA) of the present invention can be isolated and prepared using a known method.
  • a method for isolating cDNA can be mentioned by using.
  • the poly (A) + RNA can be directly amplified by ReverseTranscriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”) using a predetermined primer.
  • RT-PCR method ReverseTranscriptase Polymerase Chain Reaction
  • these base sequences can be determined by the Didioxia termination method or the like.
  • DNA obtained by using a degenerate codon that preserves the amino acid sequence or by changing the base by genetic engineering so as to be an optimal codon according to the host is also included in the category of the DNA of the present invention. included.
  • the recombinant vector containing the DNA of the present invention can be easily prepared by any method known to those skilled in the art. That is, for example, as an expression vector for E. coli, pTV118N, 119
  • Nagamo-derived lectin can be used in appropriate hosts such as Escherichia coli and plant cells.
  • the recombinant vector of the present invention that produces can be constructed.
  • the recombinant vector of the present invention includes, as desired, in the art.
  • Known transcriptional regulatory elements such as promoters and enhancers, splicing signals, poly A addition signal, selection marker, replication origin, and the like can be added.
  • the protein encoded by the DNA of the present invention can be expressed as a fusion protein with other proteins (for example, glutathione S-transferase, histidine tag, calmodulin binding protein, protein A, etc.). Is possible.
  • Such a fusion protein can be cleaved using an appropriate protease and separated into each protein.
  • An organism into which the DNA of the present invention is incorporated can be easily prepared by any method known to those skilled in the art.
  • the recombinant vector constructed as described above is transformed into plants such as tobacco, arabidopsis, roses, or rice, animals such as rats and hamsters, or Escherichia coli, Bacillus subtilis, or It can be obtained by introducing it into a microorganism such as yeast and transforming it.
  • the transformed organism thus obtained has excellent resistance particularly against insects and the like.
  • the polypeptide of the present invention is a mannose-specific lectin, and particularly has excellent insecticidal activity against insects. Therefore, this polypeptide can be used as an active ingredient of an insecticidal composition.
  • the insecticidal composition can be prepared and used by methods known to those skilled in the art. That is, the insecticidal composition can take any form such as condyles, powders, and liquids, and includes active ingredients other than the polypeptide of the present invention, buffering agents, excipients, solvents, solvents, and the like. Various auxiliary components can be included as appropriate. In addition, the content of the active ingredient and other ingredients can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose of use and form of use.
  • the protein-containing fraction was measured using a HiTrap Q column (5 ml) (made by Amersham Armasia), and the linear concentration of 0.3 M sodium chloride in 0 M force in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Elution was performed using a gradient, and the peak of DB1, which was a flow-through fraction, was collected.
  • a specific degenerate oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 10: 5, -TAYGAYAAYG GNAARGCNATHTGGGC-3, SEQ ID NO: 11: 5, -GCNGCNCCRTADATNACNAC RTT-3,) was synthesized, and the cDNA library (600 bp) encoding lectin was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the cDNA library prepared in (4) as a saddle. Subcloning into PCR-Blunt I I TOPO vector (Invitrogen) was introduced into Escherichia coli Top 10 strain to obtain a transformant.
  • PCR-Blunt I I TOPO vector Invitrogen
  • plasmid DNA was purified.
  • the reaction for determining the base sequence was carried out using a dye terminator 1 DNA base sequencing reagent kit manufactured by ABI according to the manual specified by ABI.
  • the primers used were SP6 primer and T7 primer.
  • the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377A manufactured by ABI.
  • a primer (SEQ ID NO: 12: 5'-CTGGT ATAAACGACCAGGTT-3, SEQ ID NO: 13: 5, TTTGTTGCTACTGGTATAAA-3,) is synthesized and the 5 'and 3' ends of the cDNA library Using the primers specific to the adapter sequence added to the nuclease, the entire nucleotide sequence of the mannose-specific lectin was determined by the 5 ′ RACE method and the 3 ′ RACE method.
  • the lectin (DBl (Leu) DBl-l), which matches the amino acid sequence of protein, is the base sequence of the isolectin DBl (Cy s) with several amino acid substitutions (DB1-2, DB1-) 3 and DB1-4) were revealed.
  • the nucleotide sequences thus determined are shown in SEQ ID NOs: 5-8.
  • amino acid sequences that have been revealed to be encoded by them are shown in SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • hemagglutination lectin activity of the protein of the present invention was examined. Specifically, a 2-fold dilution series of the prepared lectin was prepared, mixed with 4% Usagi erythrocytes in an equal volume (50 1) on a round bottom 96-well microtiter plate, allowed to stand for 30 minutes, The agglutination reaction was observed. As a result, the protein of the present invention showed hemagglutination lectin activity at a minimum aggregation concentration of 2.7 g / ml.
  • D-Darcose D-Acetyldarcosamine
  • D-Galactoose D-Acetylgalatatosamine
  • D-Xylose D-Fucose
  • L-Arabinose L-Rhamnose
  • Lattose Maltose
  • Meribio Sucrose trehalose
  • mannose 3.1 mM
  • methyl ⁇ -mannose 1.5 mM
  • a 1, 2-mannobiose 6.2 mM
  • mannosyl- ⁇ 1, 3-D -Mannose 0.2 mM
  • the protein of the present invention is a lectin specific to mannose.
  • mannose-specific lectin DB1-1 was investigated by growth tests using tobacco and tobacco. Specifically, artificial diets containing 0.01% DB1-1, DB2 + DB3 + DB4 mixture and soybean lectin SBA were fed, and 15 larvae and 15 moths were born from eggs (7 larvae from moths). Stage, 5 larvae stages in tobacco moth), pupae, and further adult growth were observed. The number of moths and adult moths in the DB1-1 administration group decreased to half that in the control group, indicating that they have insecticidal activity (Fig. 1). In the figure, “SBA” represents soybean lectin. Industrial applicability
  • the present invention it is possible to introduce a gene of mannose-specific lectin derived from Nagaimo, which is a cultivated plant that eats raw, into an organism such as a plant as an insect resistance gene, and when it is ingested as a food with improved insect resistance.
  • Nagaimo is a cultivated plant that eats raw
  • an organism such as a plant as an insect resistance gene
  • safer recombinant plants can be produced, it can be highly expected as an industrially useful gene.

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Abstract

本発明の目的は、殺虫活性を有する新たな遺伝子を見出し、更に、この遺伝子を生物に組み込むことにより、ヒトや家畜に対して食物として摂取した場合に、より安全な耐虫活性を付加させた新たな組み替え植物を作出することである。 本発明は、ナガイモ由来マンノース特異的レクチンをコードするＤＮＡ、より、具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１ないし配列番号：４のいずれか一つに示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、一つ又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド等に関する。  

Description

明 細 書
ナガィモ由来マンノース特異的レクチンとその遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、殺虫作用をもちマンノースを特異的に認識するレクチン遺伝子 (DNA) に関するものであり、詳細にはナガィモ（Dioscorea batatas)のマンノース特異的レク チンとその遺伝子に関するものである。更に詳細には、本発明は、ナガィモより新規 に単離したマンノース特異的レクチン遺伝子を用いて、殺虫作用をもつマンノース特 異的レクチンをコードする DNAおよび上記のクローン化 DNAが組み込まれた植物、 動物及び微生物等に関するものである。
背景技術
[0002] レクチンは、糖を特異的に認識して可逆的に結合する蛋白質である。レクチンは、マ メ科植物の種子をはじめとする多くの植物起源のレクチンが見出され、さらに脊椎動 物、無脊椎動物、キノコ、微生物、ウィルスなど、あらゆる生物に見出された。これらの レクチンの生理学的な意義に関しても多くの議論が展開されており、細胞分化、形態 形成、糖蛋白質の代謝などの内在的役割に加えて、細菌やウィルスに対する生体防 御、共生や補食などの対外的役割につ 、ても報告されて 、る。
[0003] 応用面においては、血液型の研究をはじめ、がん細胞の表面糖鎖の研究、免疫学な どの細胞生物学の分野での臨床試薬的応用が多く報告されている。また、有害生物 (昆虫）に対する防御活性 (殺虫活性)をもつレクチンを利用して、レクチンをコードす る遺伝子を導入し耐虫性の向上した植物 (作物）を作出する技術も微生物 (バチラス 種)レクチンで報告されている (特許文献 1)。また、単子葉マンノース結合レクチンフ アミリーに分類されるマツユキソウレクチン（スノードロップレクチン， Galanthus nivalis agglutinin, GNA)は、それをコードする遺伝子を組換えた植物に耐虫性を付与するこ とが報告されている（非特許文献 1、 2)。し力しながら、これらのレクチンを組み替えた 植物を摂取した場合の安全性にっ 、てはまだ確立されて ヽな 、。
[0004] 本発明者らは、これまでにナガィモ塊茎力 マンノースと強い親和性を有するレクチ ン (DB1)、貯蔵タンパク質 (DB2)、マルトースに親和性を有するレクチン (DB3)およ びキチナーゼ（DB4)をそれぞれ発見し、 20:50:20: 10の割合で単離した。これらのう ちマルトースに親和性を有するレクチン（DB3)が約 66kDaの分子量をもつ 1つのサブ ユニットと約 3 lkDaの分子量をもつ 2つのサブユニットからなること、それぞれ貯蔵タ ンパク質と相同性（90%)のある 242アミノ酸残基、 241アミノ酸残基力もなることを明 らかにしている（非特許文献 3)。し力しながら、該文献には、かかるナガィモ由来のレ クチンに関して、その全アミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列、並び に該レクチンの殺虫活性等の生理機能についての情報は記載されていない。又、発 明者により、 2003年度の日本農芸化学会にて、上記 DB1に関して報告がなされてい る力 該報告はプレリミナリーなデータを基づくものである。即ち、そのレクチンの成熟 タンパク質領域（108アミノ酸残基）のアミノ酸配列とマツユキソゥ ·レクチン (GNA)との 相同性 (約 65%)を示したのみであって、該マンノース結合特異性レクチンの全ァミノ 酸をコードする DNA配列につ!/、ては何ら発表されて ヽな 、。
[0005] 特許文献 1 :特表平 10— 506532号公報
非特許文献 1： Fitchesら， Effects of Snowdrop Lectin (GNA) Delivered Via Artificial Diet and Transgenic Plants on the Development Tomato Moth (Lacanobia oleracea) Larvae in Laboratory and Glasshouse Trials, Journal of Insect Physiology, 43(8), 727 -739 (1997).
非特許文献 2 : Raoら, Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper, The Plant Journal, 15(4), 469-477 (1 998).
非特許文献 3 : Gaidamashviiiり, Characterization of the Yam Tuber Storage Proteins from Dioscorea batatas Exhibiting Unique Lectin Activities, The Journal of Biologica 1 Chemistry, 279 (25), 26028-26035 (2004).
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明が解決しょうとする課題は、殺虫活性をもったレクチンの遺伝子を提供し、さら に、ヒトあるいは家畜をはじめとする動物が食物として摂取した場合により安全な、こ の遺伝子を組み込んだ、耐虫性の新しい生物、特に植物 (食物）を提供することにあ る。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは前記の課題を解決するために、 日本において古来より生で食されてき たナガィモ塊茎力もマンノース特異性レクチンを単離精製し、このレクチンが有害昆 虫に対する防御活性 (殺虫活性)をもつことを示し、さらに、このレクチン遺伝子のクロ 一ユングおよび塩基配列の解析に成功した。また、本遺伝子は、マンノース結合レク チンファミリーであるマツユキソウレクチンと相同性があることを見出した。これらの事 実から、本発明に至ったのである。
[0008] 即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
1.ナガィモ由来マンノース特異的レクチンをコードする DNA。
2.以下の（a)又は (b)のポリペプチド（蛋白質)をコードする塩基配列力も成る、請求 項 1記載の DNA: (a)配列番号： 1ないし配列番号: 4のいずれか一つに示されるアミ ノ酸配列から成るポリペプチド;又は (b) (a)のアミノ酸配列において、一つ又は数個 のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（a)のポリペプチドと実 質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
3. 以下の（a)又は（b)の DNAである、請求項 2記載の DNA: (a)配列番号： 5ない し配列番号： 8のいずれか一つに示される塩基配列を含む DNA; (b) (a)の塩基配 列と相補的な塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 (a )の DNAがコードするポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリべ プチドをコードする DNA。
4.請求項 1な!、し 3記載の DNAを含む組換えベクター。
5.請求項 1ないし 3記載の DNAが組み込まれた、ヒトを除く生物。
6.以下の（a)又は（b)のポリペプチド：（a)配列番号： 1ないし配列番号： 3のいずれ か一つに示されるアミノ酸配列力 成るポリペプチド;又は（b) (a)のアミノ酸配列にお いて、一つ又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、 ( a)のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
7. 請求項 6記載のポリペプチドを有効成分として含有する殺虫組成物。
発明の効果 [0009] 本発明によって、生食する栽培植物であるナガィモ由来マンノース特異的レクチンの 遺伝子を耐虫性遺伝子として植物などの生物に導入し、発現させることが可能となり 、耐虫性の向上した食物として摂取した場合にもより安全性のより高い組み替え植物 の作出が可能となる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]ナガィモ由来マンノース特異的レクチン DB1-1のォォタバコガに対する殺虫作 用（A)、及び、タバコガに対する殺虫作用（B)を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本明細書において、「実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド」とは、互 いのポリペプチドが有する生物的活性が性質的に同質であることを示す。ここで、「生 物学的活性」とは、該ポリペプチドが外界又は対象物（生物）に対して示す特定の生 理的作用又は活性を意味し、例えば、本明細書の実施例に示すような、赤血球凝集 レクチン活性及び Z又は昆虫等の生物に対する殺虫活性を含む。従って、上記の（ a)のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドにおいて、 一つ又は数個のアミノ酸の欠失、置換又は付カ卩は、力かる生物学的活性に関連のな い領域で生起することが好ましい。或いは、化学的性質 (極性、酸性、塩基性、芳香 性、疎水性、親水性等）が同じアミノ酸同士が置換されていることが好ましい。尚、配 列番号： 1な 、し配列番号： 4の 、ずれか一つに示されるアミノ酸配列力 成るポリべ プチドはプロ体であると考えられ、従って、夫々のアミノ酸配列において、 1番目のメ チォニン及び 2番目のァラニンが欠失したポリペプチドは、成熟蛋白質として、赤血 球凝集レクチン活性及び Z又は昆虫等の生物に対する殺虫活性を有する「実質的 に同質の生物学的活性を有するポリペプチド」の一例である。
[0012] 更に、本明細書において、「ストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズ」とは、例えば 、 DIG DNA Labeling (ベーリンガ^ ~ ·マンハイム社製 Cat No. 1175033)でプローブを ラベルした場合に、 32°Cの DIG Easy Hyb溶液 (ベーリンガ一'マンハイム社製 Cat No . 1603558)中でハイブリダィズさせ、 40°Cの O.lxSSC溶液 (0.1%[w/v]SDSを含む)中で メンブレンを洗浄する条件（lxSSCは 0.15MNaCl, 0.015Mクェン酸ナトリウムである） でのサザンブロットハイブリダィゼーシヨンで本発明ヒト DNAプローブにハイブリダィ ズする程度の条件である。尚、ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecular cloning third.ed. (Cold Spring Harbor Lab.Press, 2001)に記載の方法等、当業界で公知の方法ある いはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用 する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
[0013] 従って、特定の塩基配列と相補的な塩基配列を含む DNAとストリンジ ントな条件 下でハイブリダィズできる DNAとしては、例えば、該 DNAの全塩基配列との相同性 の程度が、全体の平均で、約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 9 5%以上である塩基配列を含有する DNA等を挙げることができる。
[0014] 本発明の遺伝子 (DNA)は、公知の方法を用いて単離'調製することができる。例え ば、本明細書中の実施例に示したように、ナガィモ塊茎より単離した poly(A)+RNA より作製した cDNAライブラリーから、レクチンタンパク質の部分アミノ酸配列に基づ いて合成したオリゴヌクレオチドを用いることにより、 cDNAを単離する方法が挙げら れる。また、該 poly(A)+RNAより、所定のプライマーを用いる ReverseTranscriptase Polymerase Chain Reaction (以下、「RT- PCR法」と略称する）によって直接増幅する ことちでさる。
[0015] 尚、それらの塩基配列はダイデォキシチェインターミネイシヨン法などにより決定する ことができる。更に、アミノ酸配列が保存されるような縮重コドンを利用したり、宿主に 応じた至適コドンとなるように、塩基を遺伝子工学的に変更して得た DNAも本発明 の DNAの範疇に含まれる。
[0016] 本発明 DNAを含む組み換えベクターは、当業者に公知の任意の方法で容易に調 製することができる。即ち、例えば、大腸菌用発現ベクターとしては pTV118N、 119
N (タカラバイオ社製）、 pGEX (Pharmacia社製）、 pMAL (NEB社製）、 pTrcHis (I nvitrogen社製）、 pET(Novagen社製）等があり、植物用発現ベクターとしては pBI
101、 pBI121 (Clonetech社製）、 pCGN1548、 pCGN1549 (Calgene社製）等が あり、当該遺伝子をこのような発現ベクターに連結することにより、大腸菌及び植物細 胞等の適当な宿主においてナガィモ由来のレクチンを生産させる本発明の組み換え ベクターを構築することができる。
[0017] 本発明の組み換えベクターには、本発明 DNAの他に、所望により当該技術分野で 公知の、プロモーター及びェンハンサ一等の転写調節要素、スプライシングシダナ ル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、複製オリジン等を付加することができる。ま た、必要に応じて、本発明 DNAにコードされた蛋白質を他の蛋白質 (例えば、グルタ チオン Sトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及 びプロテイン A等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合 蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離するこ とがでさる。
[0018] 本発明 DNAが組み込まれた生物は、当業者に公知の任意の方法で容易に作成す ることができる。例えば、上記のようにして構築した組み換えベクターを、例えばエレ タトロポレーシヨン法などによって、タバコ、ァラビドプシス、バラ、もしくはイネなどの植 物、ラット、ハムスターなどの動物、または大腸菌、枯草菌、もしくは酵母などの微生 物に導入して形質転換させることで得られる。このようにして得られた形質転換生物 は、特に昆虫等に対する優れた耐性を有するものとなる。
[0019] 本発明のポリペプチドは、以下の実施例に示されるように、マンノース特異的なレクチ ンであり、特に昆虫に対する優れた殺虫活性を有するものである。従って、このポリべ プチドは殺虫組成物の有効成分として利用することができる。該殺虫組成物は当業 者に公知の方法で調製し、且つ、使用することが出来る。即ち、該殺虫組成物は、顆 粒、粉末、及び液体等の任意の形態を取ることができ、本発明ポリペプチド以外の活 性成分、並びに、緩衝剤、賦形剤、溶剤及び溶媒等の各種補助成分を適宜含むこと ができる。また、有効成分、及びその他の成分の含有量は、使用目的及び使用形態 などに応じて当業者が適宜選択することができる。
実施例
[0020] 以下に、実施例をあげて本発明を更に詳しく説明する。以下の実施例は本発明の技 術的範囲を何等限定するものではなぐ当業者であれば、本明細書の特許請求の範 囲に記載された範囲であれば、それらの任意の変形、修飾、及び応用等も本発明に 属するものであることは明白である。尚、実施例における各種遺伝子操作は、特に記 載のない限り、 Molecular cloning third.ed. (Cold Spring Harbor Lab.Press, 2001)等 に記載されている当該技術分野における標準的な方法に従った。 [0021] (1)ナガィモ塊茎からのマンノース特異的レクチンの精製：
ナガィモ塊茎 500gに等量の 50mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 4. 0)を加え、十分に 破砕した。 15, OOOxg、 40分間遠心分離した。上清を pH 7. 0に調整後、終濃度 25 %の硫安を撹拌しながら加え、硫安沈殿と上清を 15, OOOxg、 40分間遠心分離した 。上清をフエ-ルトヨパール 650M (3. 5x20 cm)の疎水クロマトグラフィーに注ぎ、 25 mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 0)中硫酸アンモ-ゥム濃度を 25%から 0%へ変化させ て溶出した。タンパク質を含む画分を HiTrap Qカラム（5ml) (アマシャムフアルマシア 製）をもちいて、 50 mMトリス塩酸緩衝液（pH 8. 0)中 0 M力ら 0. 3Mの塩化ナトリウ ムの直線濃度勾配により溶出し、素通り画分である DB1のピークを集めた。
[0022] (2)ナガィモ由来マンノース特異的レクチンの部分アミノ酸配列の解析：
マンノース特異的レクチンを SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離後、 Trans -Blot PVDF膜（Bio- Rad社製）に TRANS- BLOT SDセミドライ型転写装置（Bio- Rad社 製)をもちいて転写し、 DB1の転写された膜部分を切り出した。転写した膜断片を島 津製作所製プロテインシーケンサー（PPSQ-10)にかけ、レクチンの N端側アミノ酸配 列（配列番号 9： Asp Phe lie Leu Tyr Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Gly Gin Ser Leu Thr Tyr Ala Ser Tyr Asn Phe He Met Gin Asn Asp Cys Asn Leu Val)を決定した。ま た、レクチンを還元、カルボキシアミドメチルイ匕により遊離システィンを修飾後、ァクロ モパクタープロテアーゼ I (和光純薬社製）、クロストリパイン (ベーリンガー社製)およ び StaDhylococcus aureus V8プロテアーゼ（和光純薬社製）、および Asp- Nエンドプロ テアーゼ (タカラバイオ社製)でそれぞれ酵素消化後、 TSKgel ODS 120Tカラム (東ソ 一社製）による逆相液体クロマトグラフィーでペプチド断片を分離し、濃縮後、島津製 作所製プロテインシーケンサー（PPSQ-10)により各ペプチド断片のアミノ酸配列を決 し 7こ。
[0023] (3) poly(A)+RNAの調製：
ナガィモ塊茎 lgに 5mlの Concert Plant RNA Reagent (Invitrogen製）をカ卩えて、十分 に細胞を破砕した。そこに lmlの 5M塩ィ匕ナトリウムと 3mlのクロ口ホルムをカ卩えて撹拌 後、遠心分離した。上清を回収し、そこに 8mlのイソプロパノールをカ卩え、室温に 10 分間置いた後、遠心分離した。上清を捨て、 3mlの 75%エタノールを加え、遠心分 離した。沈殿をすばやく乾燥させた後、 1 mlの 0. 1% SDSを含む Rnaseフリーの滅菌 水に溶解し、全 RNA標品とした。得られた全 RNA標品から、 Micro-FasTrack mRNA Isolationキット（Invitrogen社製）を用いて poly (A) +RNAの調製し、 lOOngの poly (A )+RNAを得た。
[0024] (4) cDNAライブラリーの作製：
上記（3)で得た poly(A)+RNAを用いて、 Marathon™ cDNA Amplificationキット（ク ローンテック製)を利用してナガィモ塊茎の cDNAライブラリーを作製した。
[0025] (5) cDNAクロー-ングおよび全 cDNA塩基配列の決定：
(2)で得られたナガィモ由来のマンノース特異的レクチンの部分アミノ酸配列を参考 にして、特異的縮重オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号 10： 5， -TAYGAYAAYG GNAARGCNATHTGGGC-3，、配列番号 11 : 5，- GCNGCNCCRTADATNACNAC RTT-3， )を合成し、（4)で作成した cDNAライブラリーを铸型としてポリメラーゼ連鎖 反応（PCR)によりレクチンをコードする cDNA断片（600 bp)を増幅した。 PCR- Blunt I I TOPOベクター（Invitrogen社）へサブクローユングし、これを大腸菌 Top 10株に導入 し、形質転 ·を得た。この形質転換体を培養後、プラスミド DNAを精製した。塩基 配列決定のための反応は、 ABI社製のダイターミネータ一 DNA塩基配列決定試薬 キットを用いて、 ABI社指定のマニュアルに従って行った。プライマーは SP6プライマ 一と T7プライマーを用いた。 ABI社製の DNAシーケンサー 377Aを用いて塩基配 列を決定した。決定した部分塩基配列をもとにプライマー (配列番号 12： 5 ' -CTGGT ATAAACGACCAGGTT-3，、配列番号 13： 5， - TTTGTTGCTACTGGTATAAA- 3， ) を合成し、 cDNAライブラリーの 5'および 3'末端に付加しているアダプター配列に 特異的なプライマーを用いて、 5 ' RACE法および 3 ' RACE法によりマンノース特異的 レクチンの全塩基配列を決定した。タンパク質力ものアミノ酸配列と一致したレクチン (DBl(Leu) = DBl-l)のほ力、いくつかのアミノ酸置換がみられたイソレクチン DBl(Cy s)の塩基配列 3種（DB1-2, DB1-3および DB1-4)が明らかとなった。このように決定さ れた塩基配列を配列番号 5〜8に示した。又、それらにコードされることが明らかにさ れたアミノ酸配列を配列番号 1〜4に示した。
[0026] (6)遺伝子の解析： 本発明遺伝子にコードされるアミノ酸配列と既知遺伝子データベースとのホモロジ一 を検索した結果、マツユキソウレクチンと高いホモロジ一を示した。即ち、各ホモロジ 一の値は、 DB1-1 (アミノ酸配列： 59%、塩基配列： 62%)、 DB1- 2 (アミノ酸配列： 58 %、塩基配列：61 %)、 DB1-3 (アミノ酸配列： 59%、塩基配列： 58%)、 DB1- 4 (ァミノ 酸配列： 58%、塩基配列： 58%)であった。
[0027] (7)本発明蛋白質の赤血球凝集レクチン活性：
更に、本発明蛋白質 (DB1-1)の赤血球凝集レクチン活性について検討した。具体的 には、調製したレクチンの 2倍濃度希釈系列を作成し、丸底 96穴マイクロタイタープレ ート上で 4%ゥサギ赤血球と等量 (50 1)混和し、 30分間静置した後、凝集反応を観 察した。その結果、本発明蛋白質は 2.7 g/mlの最小凝集濃度で赤血球凝集レクチ ン活性を示した。また、本発明蛋白質 10.8 μ g/ml (3タイター濃度)と濃度希釈系列を 作成した各種単糖及びオリゴ糖を混和後、さらに 4%ゥサギ赤血球を等量混和し、 30 分間静置した後、赤血球凝集レクチン阻害活性を検討した。その結果、 D-ダルコ一 ス、 D-M-ァセチルダルコサミン、 D-ガラクトース、 D-M-ァセチルガラタトサミン、 D-キ シロース、 L-フコース、 L-ァラビノース、 L-ラムノース、ラタトース、マルトース、メリビオ ース、トレハロースなどには、阻害活性がみられず、マンノース（3.1mM)、メチル αマ ンノース（1.5 mM)、 a 1 ,2-マンオビオース（6.2 mM)、及びマンノシル- α 1 ,3- D-マン ノース (0.2 mM)は、それぞれかっこ内に示す最小阻害必要濃度で赤血球凝集レク チン阻害活性を示し、本発明蛋白質はマンノースに特異的なレクチンであることが明 らかとなつた。
[0028] (8)本発明蛋白質の殺虫作用：
更に、ォォタバコガとタバコガを用いてマンノース特異的レクチン DB1-1の殺虫作用 を生育試験により調査した。具体的には、 0.01%の DB1-1、 DB2+DB3+DB4混合物及 び大豆レクチン SBAをそれぞれ含む人工の餌を摂食させ、ォォタバコガとタバコガ各 15匹について、卵から幼虫（ォォタバコガで 7幼虫段階、タバコガで 5幼虫段階）、蛹 、さらに成虫までの生育を観察した。 DB1-1投与群のォォタバコガとタバコガの成虫 まで到達した数は、コントロール群の半分まで減少しており、殺虫活性をもつことが明 らカとなった（図 1)。尚、図中、「SBA」は大豆レクチンを示す。 産業上の利用可能性
本発明によって、生食する栽培植物であるナガィモ由来マンノース特異的レクチンの 遺伝子を耐虫性遺伝子として植物などの生物に導入し、発現させることが可能となり 、耐虫性の向上した食物として摂取した場合にもより安全な組み替え植物の作出が 可能となることから、産業上有用な遺伝子として大いに期待できる。

Claims

請求の範囲
[1] ナガィモ由来のマンノース特異的レクチンをコードする DNA。
[2] 以下の（a)又は (b)のポリペプチドをコードする塩基配列力も成る、請求項 1記載の D NA: (a)配列番号： 1ないし配列番号: 4のいずれか一つに示されるアミノ酸配列から 成るポリペプチド；又は (b) (a)のアミノ酸配列において、一つ又は数個のアミノ酸が 欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（a)のポリペプチドと実質的に同質 の生物学的活性を有するポリペプチド。
[3] 以下の（a)又は（b)の DNAである、請求項 2記載の DNA: (a)配列番号： 5ないし配 列番号： 8のいずれか一つに示される塩基配列を含む DNA; (b) (a)の塩基配列と 相補的な塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 (a)の DNAがコードするポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリべプチ ドをコードする DNA。
[4] 請求項 1な!ヽし 3記載の DNAを含む組換えベクター。
[5] 請求項 1ないし 3記載の DNAが組み込まれた、ヒトを除く生物。
[6] 以下の（a)又は（b)のポリペプチド：（a)配列番号： 1ないし配列番号： 3のいずれか一 つに示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；又は (b) (a)のアミノ酸配列にお ヽて 、一つ又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（a)の ポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
[7] 請求項 6記載のポリペプチドを有効成分として含有する殺虫組成物。
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