WO2006021724A2 - Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables - Google Patents

Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables Download PDF

Info

Publication number
WO2006021724A2
WO2006021724A2 PCT/FR2005/050642 FR2005050642W WO2006021724A2 WO 2006021724 A2 WO2006021724 A2 WO 2006021724A2 FR 2005050642 W FR2005050642 W FR 2005050642W WO 2006021724 A2 WO2006021724 A2 WO 2006021724A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
sequence
exon
vector according
vector
Prior art date
Application number
PCT/FR2005/050642
Other languages
English (en)
Other versions
WO2006021724A3 (fr
Inventor
Luis Garcia
Original Assignee
Genethon
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genethon, Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Genethon
Priority to DE602005014114T priority Critical patent/DE602005014114D1/de
Priority to DK05797742T priority patent/DK1778297T3/da
Priority to US11/573,811 priority patent/US20120077860A1/en
Priority to CA2576462A priority patent/CA2576462C/fr
Priority to EP05797742A priority patent/EP1778297B1/fr
Priority to JP2007526520A priority patent/JP4885136B2/ja
Priority to PL05797742T priority patent/PL1778297T3/pl
Priority to AT05797742T priority patent/ATE429252T1/de
Publication of WO2006021724A2 publication Critical patent/WO2006021724A2/fr
Publication of WO2006021724A3 publication Critical patent/WO2006021724A3/fr
Priority to US13/458,037 priority patent/US20130072541A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to the use of adeno-associated viral vectors or AAV vector, for delivering to target cells, antisense sequences directed against splice sites of a gene encoding a protein with dispensable domains, as well as its therapeutic applications. , especially in the treatment of Duchenne's disease.
  • judiciously selected sequences introduced into a vector according to the invention are capable of giving rise to transcripts producing a shorter but functional dystrophin protein, correcting certain forms of Duchenne's disease.
  • Duchenne Muscular Dystrophy is a genetic disease carried by the X chromosome that affects about 1 in 3,500 boys. It is characterized by the absence of a 427 kiloDaltons protein, cytoskeletal dystrophin, which has the effect consequence the death of the muscular fibers, correlated with a severe and progressive muscular deterioration.
  • Dystrophin is a modular protein with a central region composed of 24 "spectrin-like" repeat domains. Proteins lacking some of these repeat sequences may, however, be fully functional or at least only partially defective, as found in the attenuated (Becker) forms of DMD.
  • the majority of the serious mutations of the dystrophin gene consist of deletions of one or more exons disturbing the reading frame of the final messenger or of point mutations present in the coding or exon regions, which introduce stop codons. or shifts in the reading phase. In both cases, these mutations result in the absence of dystrophin.
  • a large number of clinical cases of Duchenne's disease are linked to multi-exonetic deletions (severe DMD genotypes: ⁇ 45-50, ⁇ 47-50, ⁇ 48-50 ⁇ 49-50, ⁇ 50, / S). whose reading frame could be restored by deleting exon 51 (light BMD genotypes: ⁇ 45-51, ⁇ 47-51, ⁇ 48-51 ⁇ 49-51 ⁇ 51-52).
  • the third route considered, currently the most exploited, is to attempt to repair the mutated DNA through the use of antisense oligonucleotides (or AON) to jump some exons and thus achieve the expression of a truncated but functionally effective protein.
  • This technique known as “exon skipping” or “exon skipping” recommends the use of oligonucleotides complementary to sequences involved in the splicing of the exons to be masked.
  • the main difficulty of this technology consists in stably and sustainably introducing a non-degraded oligonucleotide (AON) into the diseased muscle fibers, in particular in vivo.
  • AON non-degraded oligonucleotide
  • a synthetic detergent such as the F127 agent.
  • advantageous sequences to be administered by this route to hide exon 19 or 45 of the human dystrophin gene are described, for example, in patent applications EP 1 054 058 and EP 1 191 098, respectively.
  • this method of treatment requires regular injections, relatively restrictive.
  • WO 02/24906 illustrates the use of these two distinct methods to exclude exon 46 in human cells.
  • WO 03/095647 recommends the advantageous selection of U2 and U3 type snRNAs; ii) the simultaneous presence of two target sequences involved in the splicing of the same exon improves the efficiency of the jump of said exon (1, 2).
  • dystrophin can be extended to any protein with dispensable domains. It can thus be concerned with all genes of a multiexonous nature encoding a protein with dispensable domains whose deletion (via exon skipping) does not affect the activity of the protein.
  • the invention proposes to construct an adeno-associated viral vector comprising: a modified U7-type snRNA sequence; the native promoter of U7; at least one antisense sequence directed against at least one splice site of at least one exon, said exon encoding a dispensable domain of dystrophin.
  • cassette U7 the set consisting of these three entities (sequence snRNA / promoter U7 / sequence (s) antisense) is called "cassette U7".
  • the Applicant advantageously selected a vector of viral origin, namely a derivative of adeno-associated viruses or AAV.
  • the AAV used in the particular context of DMD is preferentially an AAV1, that is to say that it is composed of a capsid of serotype 1.
  • AAV1 proves to be transducing most effectively the muscle cells.
  • the sequences of viral origin, in particular the ITRs, associated with the transgene are advantageously derived from FAA V2.
  • the final adeno-associated viral vector is, according to an advantageous embodiment, a 2/1 pseudotype.
  • the vector further contains a modified snRNA sequence.
  • SnRNAs or small nuclear RNAs are small RNAs, present in the nucleus of cells and involved in certain stages of pre-mRNA processing. They are called Ul, U2 ... UlO.
  • snRNA that of U7 type normally involved in the maturation of premonitory mRNA encoding histones is preferably used as a transporter.
  • the snRNA in question can be of human as well as murine origin, insofar as these small sequences are highly conserved between different species.
  • the snRNA used in the invention is that of mice.
  • modified snRNA an RNA in which the sequences involved in the initial function of the snRNA are inactivated. These sequences can also be modified so as to increase the level of expression of said snRNA.
  • the small nuclear ribonucleoprotein (or Sm protein) binding site sequence is modified to inactivate the processing of the histone-encoding mRNAs and at the same time increase the U7 nuclear concentration.
  • snRNA the sequence of 18 nucleotides complementary to the 3 'site of maturation of the premonitory RNAs encoding the histones is replaced by the antisense sequences of interest.
  • the thus modified snRNA gene is then cloned into the AAV vector, preferentially between its two ITR sequences.
  • the present invention could also be realized with U1 or U2 sequences, but with more modifications and for less efficiency.
  • a vector according to the invention also comprises a promoter making it possible to express the antisense sequences at a level sufficient to ensure their biological and therapeutic activity.
  • a promoter making it possible to express the antisense sequences at a level sufficient to ensure their biological and therapeutic activity.
  • AAVs are known to those skilled in the art.
  • the expression of the antisense sequences is placed under the control of the native promoter of the snRNA used in the construction. In the case where U7 is preferred, it is therefore the U7 promoter that transcribes the antisense sequences.
  • the vector according to the invention also comprises at least one antisense sequence directed against at least one splice site of at least one exon, ie capable of interfering with the splicing of said exon.
  • the antisense sequence is preferably a sequence complementary to at least one sequence chosen from the following group: 5 'splice site (donor); splice site 3 '(acceptor); intron sequence BP (Branching Point); and optionally inner regions rich in purine, more specifically ESE (Exon-internai Splicing Enhancer).
  • two antisense sequences having distinct targets are introduced into the same recombinant vector according to the invention.
  • antisense sequences directed against splice sites of at least two distinct exons can also be associated in the same construction antisense sequences directed against splice sites of at least two distinct exons.
  • each construct carrying a distinct antisense sequence, said sequences being directed against one or more exons.
  • the antisense sequences are integrated in the same U7 cassette, carried by a single AAV vector; or the antisense sequences are integrated in different U7 cassettes, carried by a single AAV vector; or the antisense sequences are integrated in different U7 cassettes, each carried by an AAV vector.
  • the antisense sequences are specific to the different exon splice sites constituting the dystrophin gene, whatever its origin.
  • the mouse gene of dystrophin is of obvious interest since the mouse is an experimental animal model of choice.
  • an mdx mouse carrying a mutation in exon 23 of the murine dystrophin gene and producing an inactivated truncated protein, exhibits the symptoms of DMD.
  • the antisense sequences are thus directed against the sequences involved in the splicing of exon 23.
  • a vector according to the invention comprises a sequence SEQ ID 1 comprising a U7snRNA gene modified as described above and integrating antisense sequences directed against the 5 'donor site (SEQ ID 2) and the BP sequence (SEQ ID 3 ) of exon 23 of the murine dystrophin gene placed under the control of the U7 promoter introduced between the 2 ITR sequences of the AAV vector.
  • the selected antisense sequences are directed against at least one splice site of at least one exon of the human dystrophin gene, the exclusion of which generates a truncated but active protein.
  • exon 51 of the human dystrophin gene and more particularly the sequences involved in its splicing, are advantageous targets within the scope of the invention.
  • its exclusion from the dystrophin-encoding transcript could be beneficial in the treatment of approximately 20% of the clinical cases of Duchenne disease genotypes today listed.
  • a suitable construct within the scope of the invention comprises the sequence SEQ ID 4, combining two antisense sequences SEQ ID 5 and SEQ ID 6 directed against internal regions rich in purines of the invention. exon 51 of the human dystrophin gene, in place of the sequences SEQ ID 2 and 3 in the sequence SEQ ID 1.
  • sequences are preferably associated in tandem in a vector according to the invention.
  • DA5 '(SEQ ID 7) and DA3' (SEQ ID 8) or G5 '(SEQ ID 9) and GBP (SEQ ID 10) are associated.
  • sequences SEQ ID 25 and SEQ ID 26 correspond to the sequences SEQ ID 5 and SEQ ID 6 longer. They are preferentially associated. Given their large size, each is advantageously integrated into a cassette U7, carried either by the same AAV vector, or by two distinct AAV vectors to be used in tandem.
  • the Applicant has shown in the present invention that the nature of the antisense sequence could play an important role in the efficiency of the construction and that on the other hand, it was possible to evaluate the effectiveness of these sequences by in vitro experiments performed on target muscle cells by transposing said U7 cassettes into a lentiviral vector.
  • the invention therefore also relates to a lentiviral vector comprising: a modified U7-type snRNA sequence; the native promoter of U7; at least one antisense sequence chosen from the group comprising SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 27 and SEQ ID 28; SEQ ID 5, SEQ ID 6, SEQ ID 7, SEQ ID 8, SEQ ID 9, SEQ ID 10, SEQ ID 11, SEQ ID 12, SEQ ID 13, SEQ ID 25, SEQ ID 26.
  • the lentiviral vector replacing the adeno-associated viral vector according to the invention is a last-generation SIN lentivirus ("self inactivating").
  • any lentiviral vector can be used to insert a "U7 cassette”. The construction and manipulation of lentiviral vectors are well known to those skilled in the art.
  • lentiviral vectors have complementary applications to those of the recombinant AAVs according to the invention. While the latter are intended to be injected in situ in the target muscles, the lentiviral vectors allow on the one hand to test the effectiveness of potential antisense sequences in vitro, directly in the differentiated muscle cells from the patient to be treated. On the other hand, if these vectors are introduced into myoblasts, muscle precursors or even stem cells, it is possible to envisage in situ transplantation of transfected cells.
  • any type of cell transfected with the recombinant vector and in particular muscle cells, in particular muscle fibers (myo tubes), muscle precursors (myoblasts) or any cell capable of muscle differentiation, is also part of the invention.
  • Muscle tissue or a non-human organism transfected by said vector is also included within the range of protection sought.
  • animals - particularly mice - are preferred.
  • the present application describes for the first time a therapeutic potential for the claimed vectors.
  • the present invention thus also relates to pharmaceutical compositions comprising as active ingredient at least one vector as defined in the present application, as well as the use of this vector as drug.
  • transfected cells may also have therapeutic potential in transplantation.
  • a pharmaceutical composition according to the invention contains the claimed vector (s) associated with a pharmaceutically acceptable and inert carrier.
  • the pharmaceutical composition is preferentially in liquid form.
  • the vector concentration, the amount to be injected and the frequency of the injections are easily determined by those skilled in the art.
  • a vector according to the invention can be used for the treatment of any disease associated with the dysfunction of a protein with dispensable domains, the leap of at least one exon coding a dispensable domain restoring its operation.
  • certain myopathies are for example linked to a dysfunction of the protein with dispensable domains that is dysferlin and can therefore be treated with a vector according to the invention.
  • vectors according to the invention In their use in vivo, vectors according to the invention have been found to be stable, to have a specific subcellular localization and to produce therapeutically active and permanent amounts of antisense. More generally, the present application demonstrates the potential of the AAV-U7snRNA system as a tool for the inactivation or modification of mRNA in animals.
  • the top diagram shows a schematic illustration of the structure of the intact dystrophin (427 kDa). It is composed of several domains: an N-terminal actin binding domain (ABD), a central rod domain consisting of 24 spectrin-like repeats (R) and 4 hinge segments (H) capable of to confer flexibility, and a cysteine-rich domain (CR) that binds ⁇ -dystroglycan and other members of the dystrophin-associated complex near the C-terminus.
  • the middle diagram shows the mRNA of dystrophin (about 14,000 bases) consisting of 79 exons.
  • mdx mice In mdx mice, replacement of a cytosine with a thymidine in exon 23 at position 3185 of the coding sequence creates a premature STOP codon.
  • the lower diagram shows the target sequences at the BP (branch point, BP22, SEQ ID 3) sequence upstream of exon 23 and downstream of the splice donor site (SD23, SEQ ID 2) for force the machinery in charge of splicing to skip the mutated exon while maintaining an open reading frame.
  • the U7-SD23 / BP22 cassette consists of the U7 promoter (position -267 to +1, hatched box), the sequence
  • RNA samples were analyzed at 0, 15 and 30 days (columns 1, 2 and 3, respectively) by RT-PCR. The corresponding products of 60bp were visualized on agarose gel. Detection of FARNm from dystrophin with exon skip 23.
  • RNA samples were analyzed at 0, 15 and 30 days by nested RT-PCR, using primer pairs in exon 20 and 26
  • the 901 bp band that corresponds to FARNm without jump (*) is the only species detected on day 0 (column 1), and is progressively replaced by a 688 bp fragment (**) corresponding to FARNm having lost the exon 23.
  • Figure 4 Restoration of the protein complex associated with dystrophin in treated mdx muscles.
  • the left, middle, and right columns show sections of the anterior tibial muscle of normal C57B16, untreated mdx, and mdx mice after treatment, respectively.
  • the sections were immunostained with respect to dystrophin (A, B, C), F ⁇ -sarcoglycan (D, E, F), ⁇ -sarcoglycan (G, H, I) and ⁇ -dystroglycan (J, K, L).
  • the same batch of revertant fibers (*), showing dystrophin as well as the associated protein complex, is shown on the series of sections of untreated mice.
  • Figure 5 Restoration of dystrophin in treated mdx muscles restores normal susceptibility to exercise-induced damage.
  • A superimposed recordings of the tension produced by the EDL muscles of a) C57B16, b) untreated mdx and c) mdx mice after 45 days of treatment, during tonic contractions with forced extension.
  • the isolated muscles were subjected to repetitive stimulation (125 Hz) for 360 ms at 3 min intervals.
  • the voltage developed isometrically, then a forced extension corresponding to 10% of the length L 0 for which the muscle produces a maximum force was imposed at a speed of 1 fiber length per second. After relaxation, the muscle is back to its resting length.
  • FIG. 8 Recovery of dystrophin in adult GRMD dogs, obtained 2 months after a single intramuscular injection of a preparation containing the AAV vectors (U7-ex6) integrating the antisense sequence SEQ ID 27 and AAV (U7-ex8) integrating the antisense sequence SEQ ID 28. Immunological staining with Dys2-Ab of whole cross sections. Scale 1 mm.
  • Figure 9 Immunodetection of the total proteins extracted from the anterior leg muscles, stained with anti-dystrophin monoclonal antibodies Dys2: column 1, human dystrophin in healthy subjects; column 2, dystrophin in healthy dog, column 3, GRMD dog 2 months after treatment; column 4, untreated GRMD dog. Each column was loaded with a total protein amount of 40 ⁇ g.
  • Figure 10 Immunodetection of the total proteins extracted from the anterior leg muscles, stained with anti-dystrophin monoclonal antibodies Dys2: column 1, human dystrophin in healthy subjects; column 2, dystrophin in healthy dog, column 3, GRMD dog 2 months after treatment; column 4, untreated GRMD dog. Each column was loaded with a total protein amount of 40 ⁇ g.
  • Figure 10 Immunodetection of the total proteins extracted from the anterior leg muscles, stained with anti-dystrophin monoclonal antibodies Dys2: column 1, human dystrophin in healthy subjects; column 2, dystrophin in healthy dog, column 3, GRMD dog 2 months after treatment
  • the antisense sequence H51a has the sequence SEQ ID 6 and the antisense sequence H51b has the sequence SEQ ID 5.
  • the antisense sequences AS and DS are as described by DeAngelis (1).
  • FIG. 11 Restoration of dystrophin in SCID-mdx mice, obtained 1.5 months after injection into the anterior tibialis muscles of Lent vector-transduced 49-50 delta stem cells (U7-H51ab) integrating SEQ antisense sequences ID 5 and 6. Immune staining with Dys3.
  • the entire U7 snRNA gene (445 bp) was obtained by PCR on mouse genomic DNA with oligonucleotides: 5'-TAACAACATAGGAGCTGTG-S '(SEQ ID 14) and 5'-CAGATACGCGTTTCCTAGGA-3' (SEQ ID 15).
  • the Sm domain (AATTTGTCTAG; SEQ ID 16) was optimized to smOPT (AATTTTTGGAG; SEQ ID 17), as previously described (3), and the region of U7 capable of pairing with the pre-mRNA was exchanged with a sequence of 44 nucleotides complementary to both the region covering the BP (branch point) sequence upstream of the exon 23 of the dystrophin gene (BP22: 5'-AAATAGAAGTTCATTTACACTAAC-3 '; SEQ ID 3) and the region downstream of the splice donor site (SD23: 5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCT-3 ', SEQ ID 2).
  • the Resulting fragment U7smOPT-SD23 / BP22 was then inserted between 2 end-repeated inverted sequences of AA V2 (SEQ ID 1).
  • Vectors AAV2 / 1 pseudotyped recombinant vectors were prepared in 293 cells, as already described (4), by cotransfecting 3 plasmids: pAAV2 (U7smOPT-SD23 / BP22) coding the rAAV2 genome, pXX6 displaying the functions adenovirus helper and pAAVlplTRCO2, which supersede the rep and cap genes of AAV1.
  • Vector titers ranged from 10 12 to 13 vector (vg) ml -1 genomes.
  • mice All animal procedures were performed according to the protocol approved by the institution and under strict conditions of biological confinement.
  • a first group of mdx mice (8 weeks old) received by injection 50 ⁇ l PBS (phosphate buffered saline) containing 10 12 (vg) AAV (U7-SD23 / BP22) in the anterior leg muscles of the right hind paws. The counter-lateral muscles were used as controls.
  • a second group of mdx mice of the same age were intra- arterially infused with 2 ⁇ 10 13 vectors through the femoral artery. The mice were sacrificed at given times, the muscles were frozen in isopentane cooled with liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • the sections of the intermediate layers were collected and extracted with lysis buffer containing 4% SDS, 125 mM Tris-HCl pH 6.4, 4 M urea, 10% ⁇ -mercaptoethanol, 10% glycerol, 0.001% bromophenol blue. After separation by centrifugation, the protein content was measured using the Bio-Rad "Protein Assay" test. The samples, adjusted to 40 ⁇ g of protein, were loaded on 6% polyacrylamide gels, electrophoresed and transferred to nitrocellulose membranes which were incubated with either NCL-DYS1 (murine monoclonal antibodies against the R8 repeat sequence).
  • RNAs were isolated from a pool of intermediate sections using the TRIZOL reagent (Life Technologies). To detect U7 and U7smOPT-SD23 / BP22, reverse transcription was first performed on the total RNAs with Supercript II reverse transcriptase in the presence of random hexamers (In vitro gen). Then, the cDNAs were amplified by means of Taq polymerase (Promega) with 5'-AAGTGTTACAGCTCTTTTAG-3 '(SEQ ID 18 localized in wild-type U7) or 5'-AAGGCCAAACCTCGGCTTAC-3' (SEQ ID 19 located in FIG.
  • Taq polymerase Promega
  • the extensor digitorum longus (EDL) muscles of control or treated mice were dissected to evaluate contractile / mechanical properties.
  • the isolated muscles were connected on one side to an electromagnetic driver and on the other side to a force sensor, and were stimulated by means of electrodes placed parallel to the muscle.
  • Tonic and brief shaking isometric contractions (125 Hz, 360 ms, separated by 3 min rest periods) were studied at L 0 (the length at which the maximum isometric tonic force is observed).
  • the isometric tension was calculated by dividing the force by the estimated cross sectional area (CSA) area of the muscle.
  • CSA estimated cross sectional area
  • the CSA corresponds to the wet weight of the muscle divided by its length of fibers.
  • the eccentric contractions induce a characteristic muscle damage associated with a rupture of the membrane.These occur when a maximum contracted muscle is forcibly stretched, which leads to a fall in strength.
  • the muscles have been lengthened by 10% of the length L 0 for which the muscle produced maximal force at a rate of 1 fiber length per second
  • Five eccentric contractions were applied at 3 min intervals The cumulative fall of the isometric force was quantified as previously described (5).
  • a U7-type RNA has been modified to introduce antisense sequences capable of interfering with the messenger RNA processing process (mRNA) in the nucleus.
  • the sequence of U7snRNA was optimized to carry antisense sequences directed against introns 22 and 23 of the murine dystrophin gene.
  • the sequences in intron 22 were chosen to compete with U2snRNA binding at the BP splice site (Branching). Point) (BP22, SEQ ID 3), and sequences in intron 23 corresponding to the site of U1 binding at the donor site (SD23, SEQ ID 2) ( Figure 1). These sequences were used in a dual target strategy, as advocated by Brun et al. (2).
  • the modified U7 gene comprising both the promoter and the 3 'elements, was placed in an AAV-2 based construct, which was introduced into the AAV-I capsid to achieve high gene transfer efficiency in the skeletal muscles.
  • Adult mdx mice (8 weeks old) were injected into the anterior tibialis muscle with a single dose of 10 10 vector genomes and analyzed at different times, between 2 and 16 weeks.
  • the molecular analysis of the jump of exon 23 was performed by RT-PCR nested on the total RNAs prepared from the injected muscles.
  • the dystrophin protein was detected by both immunodetection in muscle extracts and immunofluorescence on tissue sections (Figure 3).
  • the levels of dystrophin reflected those of the mRNAs produced (from 0.5% to 30% of the normal level at 2 and 4 weeks, respectively).
  • the difference in molecular weight between the wild-type and truncated protein can not be resolved on the gel shown.
  • all the fibers of the muscle that received the injection were detected positively from 4 weeks after injection and the protein was typically localized at the periphery of the fibers. Histological sections of the treated muscles showed distinctly the disappearance of the dystrophic phenotype, with fibers that returned to their normal polygonal shape and the absence of inflammatory cells.
  • a group of mdx animals received the AAV-U7 vector by intra-arterial infusion at high pressure in the lower limb. This resulted, after a month, in the effective restoration of dystrophin in most fibers, in all muscles of the infused paw, including TA and EDL (Figure 3F).
  • the associated proteins including F ⁇ -sarcoglycan, ⁇ -sarcoglycan and ⁇ -dystroglycan were detected at the periphery of the fibers of the treated animals ( Figure 4). This confirmed that the exon skipped mRNA product contains a C-terminal dystroglycan binding domain that is essential to the membrane anchoring function of dystrophin.
  • mice could be transposed to a large animal, namely the GRMD dog.
  • the GRMD dog has a point mutation in the splice acceptor site of intron 6 (AG transformed to GG, Fig. 6A), prohibiting the inclusion of exon 7 in the dystrophin mRNA (Fig. 6B).
  • the mRNA thus formed (delta exon 7) has a reading frame shift related to the phase shift of exons 6 and 8 (Fig. 6B and C).
  • Two U7-type RNAs have been modified to introduce antisense sequences capable of interfering with the splicing machinery in the vicinity of exons 6 and 8 (Fig.
  • FIG. 8 illustrates the level of dystrophin obtained 2 months after a single intramuscular injection of a 500 ⁇ l preparation containing a mixture of the two vectors (-10 11 viral particles). This dystrophin is also detectable by Western blotting (FIG. 9). As in mice, the protein complex associated with dystrophin is also restored, indirectly suggesting the proper functioning of the "quasi- dystrophin" induced by multi-exon skipping.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention concerne un vecteur viral adéno-associé comprenant : une séquence snRNA modifiée de type U7 ; le promoteur natif de U7 ; au moins une séquence antisens dirigée contre au moins un site d'épissage d'au moins un exon, ledit exon codant un domaine dispensable de la dystrophine.

Description

VECTEUR VIRAL ADENO-ASSOCIE POUR REALISER DU SAUT D'EXONS DANS UN GENE CODANT UNE PROTEINE A DOMAINES DISPENSABLES
La présente invention concerne l'utilisation de vecteurs viraux adéno-associés ou vecteur AAV, pour délivrer à des cellules cibles, des séquences antisens dirigées contre des sites d'épissage d'un gène codant une protéine à domaines dispensables, ainsi que ses applications thérapeutiques, en particulier dans le traitement de la maladie de Duchenne.
Ainsi, des séquences judicieusement choisies introduites dans un vecteur selon l'invention sont capables de donner naissance à des transcrits produisant une protéine dystrophine plus courte, mais fonctionnelle, corrigeant certaines formes de la maladie de Duchenne.
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique portée par le chromosome X et qui touche environ 1 garçon sur 3 500. Elle se caractérise par l'absence d'une protéine de 427 kiloDaltons, la dystrophine cytosquelettique, ce qui a pour conséquence la mort des fibres musculaires, corrélée à une détérioration musculaire sévère et progressive.
La dystrophine est une protéine modulaire présentant une région centrale composée de 24 domaines répétés de type "spectrin-like". Des protéines dépourvues de certaines de ces séquences répétées peuvent toutefois être parfaitement fonctionnelles ou du moins seulement partiellement défectives, comme constaté dans les formes atténuées (Becker) de DMD.
En revanche, la majorité des mutations graves du gène de la dystrophine consiste en des délétions d'un ou plusieurs exons perturbant le cadre de lecture du messager final ou bien des mutations ponctuelles, présentes dans les régions codantes ou exons, qui introduisent des codons stops ou des décalages de la phase de lecture. Dans les deux cas, ces mutations se traduisent par l'absence de dystrophine. A titre d'illustration, un grand nombre de cas cliniques de la maladie de Duchenne est lié à des délétions multi-exoniques (génotypes DMD sévères : Δ45-50 ; Δ47- 50 ; Δ48-50Δ 49-50 ; Δ50 ; /S ) dont le cadre de lecture pourrait être rétabli par suppression de l'exon 51 (génotypes BMD légers: Δ45-51 ; Δ47-51 ; Δ48-51Δ 49-51Δ 51-52).
Différentes stratégies et techniques ont été envisagées pour tenter de "réparer" les gènes mutés de la dystrophine.
Le remplacement du gène de la dystrophine dans les fibres musculaires malades, ou la compensation par des greffes de cellules saines des cellules nécrosées, a révélé des difficultés considérables.
La troisième voie envisagée, actuellement la plus exploitée, consiste à tenter de réparer l'ADN muté grâce à l'utilisation d'oligo-nucléotides antisens (ou AON) permettant de sauter certains exons et de parvenir ainsi à l'expression d'une protéine tronquée mais fonctionnellement efficace. Cette technique dite "saut d'exon" ou "exon skipping" préconise l'utilisation d'oligo-nucléotides complémentaires à des séquences impliquées dans l'épissage des exons à masquer.
Les études actuellement menées sur cette voie sont essentiellement réalisées sur des souris mdx atteintes de ladite maladie, en raison d'une mutation non-sens introduisant un codon stop dans l'exon 23 du gène murin de la dystrophine.
La difficulté principale de cette technologie consiste à introduire d'une manière stable et durable un oligo-nucléotide (AON) non dégradé dans les fibres musculaires malades, en particulier in vivo. Dans un premier temps, il a été envisagé d'injecter directement lesdits oligo- nucléotides, éventuellement en association avec un détergent synthétique, tel que l'agent F127. Ainsi, des séquences avantageuses à administrer par cette voie pour masquer l'exon 19 ou 45 du gène humain de la dystrophine sont par exemple décrits dans les demandes de brevet EP 1 054 058 et EP 1 191 098, respectivement. Cependant, au vu de la courte durée de vie de ces oligonucléotides dans le muscle, ce mode de traitement nécessite des injections régulières, relativement contraignantes.
Par ailleurs, il a été tenté d'introduire ces séquences dans des vecteurs pour les véhiculer dans les cellules cibles. A ce jour, seuls des essais in vitro ont été réalisés : les constructions utilisées sont basées sur l'utilisation de rétrovirus et sont testées uniquement sur des cultures cellulaires. Les résultats rapportés se sont avérés peu probants, ou du moins insuffisants pour envisager une transposition in vivo.
Par exemple, le document WO 02/24906 illustre l'utilisation de ces deux méthodes distinctes pour exclure l'exon 46 dans des cellules humaines.
L'ensemble des travaux réalisés sur le transfert vectoriel des AON a principalement révélé que : i) la présence de petites séquences de type snRNA (small nuclear RNA) permet une meilleure translocation au niveau du noyau des cellules cibles et une meilleure transcription des séquences. Ainsi, le document WO 03/095647 préconise la sélection avantageuse des snRNA de type U2 et U3 ; ii) la présence simultanée de deux séquences cibles impliquées dans l'épissage d'un même exon améliore l'efficacité du saut dudit exon (1, 2).
Cependant, à cette heure, aucune solution pour réaliser du saut d'exons in vivo, hormis l'injection d'oligo-nucléotides avec les inconvénients mentionnés ci-dessus, n'a été proposée. Pour la première fois, les inventeurs proposent une construction donnant des résultats in vivo remarquables quant à la restauration de l'activité de la protéine dystrophine dans le contexte de la maladie de Duchenne.
En outre, ces résultats obtenus sur la dystrophine peuvent être étendus à toute protéine à domaines dispensables. Peuvent ainsi être concernés tous les gènes de nature multiexonique codant une protéine à domaines dispensables dont la délétion (via le saut d'exons) n'affecte pas ou peu l'activité de la protéine.
A cet effet, l'invention propose de construire un vecteur viral adéno-associé comprenant : une séquence snRNA modifiée de type U7; le promoteur natif de U7 ; au moins une séquence antisens dirigée contre au moins un site d'épissage d'au moins un exon, ledit exon codant un domaine dispensable de la dystrophine.
Dans la suite de la description, l'ensemble constitué par ces trois entités (séquence snRNA / promoteur U7 / séquence(s) antisens) est appelé "cassette U7".
Parmi la multitude de vecteurs disponibles, le Demandeur a avantageusement sélectionné un vecteur d'origine virale, à savoir un dérivé des virus adéno-associés ou AAV.
Parmi les 8 sérotypes identifiés, l'AAV utilisé dans le contexte particulier de la DMD est préférentiellement un AAVl, c'est à dire qu'il est composé d'une capside du sérotype 1. En effet, l'AAVl s'avère transduire le plus efficacement les cellules musculaires.
En revanche, les séquences d'origine virale, en particulier les ITR, associées au transgène sont avantageusement issues de FAA V2. Il en résulte que le vecteur viral adéno-associé final est, selon un mode avantageux de réalisation, un pseudotype 2/1. Ledit vecteur contient en outre une séquence snRNA modifiée. Les snRNA ou small nuclear RNA sont des ARN de petite taille, présents dans le noyau des cellules et impliqués dans certaines étapes de maturation des pré- ARNm. Ils sont appelés Ul, U2 ... UlO.
Parmi ces différents types de snRNA, celui de type U7 normalement impliqué dans la maturation des ARN prémessagers codant les histones est préférentiellement utilisé en tant que transporteur.
Le snRNA en question peut être aussi bien d'origine humaine que murine, dans la mesure où ces petites séquences sont hautement conservées entre les différentes espèces. Préférentiellement, le snRNA utilisé dans l'invention est celui de souris.
On entend par "snRNA modifié", un ARN dans lequel les séquences impliquées dans la fonction initiale du snRNA sont inactivées. Ces séquences peuvent également être modifiées de manière à augmenter le niveau d'expression dudit snRNA.
Par exemple, dans le cas de U7, la séquence du site de fixation de la "small nuclear ribonucléoprotéine" (ou Sm protéine) est modifiée de manière à inactiver la maturation des ARN prémessagers codant les histones et parallèlement à augmenter la concentration nucléaire en U7 snRNA. Par ailleurs, la séquence de 18 nucléotides complémentaires au site 3' de maturation des ARN prémessagers codant les histones est remplacée par les séquences antisens d'intérêt.
En pratique, ces modifications peuvent être introduites au moyen de la mutagénèse dirigée par PCR.
Le gène snRNA ainsi modifié est ensuite clone dans le vecteur AAV, préférentiellement entre ses deux séquences ITR. La présente invention pourrait également être réalisé avec des séquences Ul ou U2, mais moyennant davantage de modifications et pour une efficacité moindre.
Un vecteur selon l'invention comporte également un promoteur permettant d'exprimer les séquences antisens à un niveau suffisant pour assurer leur activité biologique et thérapeutique. De nombreux promoteurs utilisables dans le contexte des
AAV sont connus de l'homme du métier. Cependant, selon un mode privilégié de réalisation, l'expression des séquences antisens est placée sous le contrôle du promoteur natif du snRNA utilisé dans la construction. Dans le cas où le U7 est préféré, c'est donc le promoteur de U7 qui assure la transcription des séquences antisens.
Le vecteur selon l'invention comporte également au moins une séquence antisens dirigée contre au moins un site d'épissage d'au moins un exon, c'est à dire capable d'interférer avec l'épissage dudit exon. La séquence antisens est préférentiellement une séquence complémentaire à au moins une séquence choisie dans le groupe suivant : site d'épissage 5' (donneur) ; site d'épissage 3' (accepteur) ; séquence intronique BP (Branching Point) ; et éventuellement des régions internes riches en purine, plus spécifiquement des ESE (Exon- internai Splicing Enhancer).
Avantageusement, pour assurer l'exclusion d'un même exon, deux séquences antisens ayant des cibles distinctes, préférentiellement le site 5' donneur et la séquence BP, sont introduites dans un même vecteur recombinant selon l'invention.
II peut également être associé dans une même construction des séquences antisens dirigées contre des sites d'épissage d'au moins deux exons distincts.
Alternativement, il est possible d'utiliser plusieurs constructions, chacune portant une séquence antisens distincte, lesdites séquences étant dirigées contre un ou plusieurs exons. En pratique, lorsque plusieurs séquences antisens (dirigées contre le même exon ou plusieurs exons distincts) sont associées, les différents cas de figure suivants peuvent se présenter : - les séquences antisens sont intégrées dans une même cassette U7, portée par un unique vecteur AAV ; ou les séquences antisens sont intégrées dans différentes cassettes U7, portées par un unique vecteur AAV ; ou les séquences antisens sont intégrées dans différentes cassettes U7, chacune portée par un vecteur AAV.
Dans le cadre de l'invention, les séquences antisens sont spécifiques des différents sites d'épissage des exons constituant le gène de la dystrophine, quelque soit son origine.
Le gène murin de la dystrophine présente un intérêt évident puisque la souris constitue un modèle animal expérimental de choix. Ainsi, une souris mdx, portant une mutation dans l'exon 23 du gène murin de la dystrophine et produisant une protéine tronquée inactive, présente les symptômes de la DMD. Dans ce contexte, les séquences antisens sont donc dirigées contre les séquences impliquées dans l'épissage de l'exon 23.
Plus particulièrement, un vecteur selon l'invention comporte une séquence SEQ ID 1 comprenant un gène U7snRNA modifié comme décrit ci-dessus et intégrant des séquences antisens dirigées contre le site 5' donneur (SEQ ID 2) et la séquence BP (SEQ ID 3) de l'exon 23 du gène murin de la dystrophine placées sous le contrôle du promoteur U7, introduit entre les 2 séquences ITR du vecteur AAV.
De manière très intéressante, la fonctionnalité de tels vecteurs a été validée par le Demandeur chez un animal de grande taille, à savoir le chien. En effet, il existe des chiens naturellement myopathes en raison d'une mutation dans le site accepteur d'épissage de l'intron 6 de sorte que la non-prise en compte de l'exon 7 dans FARNm final annule le cadre de lecture, les exons 6 et 8 n'étant pas en phase. Le saut simultané des exons 6 et 8 permet théoriquement de restaurer un cadre de lecture opérationnel, FARNm final étant alors dépourvu des exons 6, 7 et 8. Ainsi, l'association de vecteurs selon l'invention, comprenant les séquences antisens SEQ ID 27 et 28, dirigées contre des régions ESE des exons 6 et 8, respectivement, s'est avérée efficace.
En vue de la thérapie humaine, les séquences antisens choisies sont dirigées contre au moins un site d'épissage d'au moins un exon du gène humain de la dystrophine, dont l'exclusion génère une protéine tronquée mais active.
Comme discuté précédemment, l'exon 51 du gène humain de la dystrophine, et plus particulièrement les séquences impliquées dans son épissage, sont des cibles avantageuses dans le cadre de l'invention. Ainsi, son exclusion du transcrit codant la dystrophine pourrait être bénéfique dans le traitement d'environ 20% des cas cliniques génotypes de maladie de Duchenne aujourd'hui répertoriés.
Ainsi, il a été montré par les inventeurs qu'une construction adaptée dans le cadre de l'invention comprenait la séquence SEQ ID 4, associant deux séquences antisens SEQ ID 5 et SEQ ID 6 dirigées contre des régions internes riches en purines de l'exon 51 du gène humain de la dystrophine, à la place des séquences SEQ ID 2 et 3 dans la séquence SEQ ID 1.
D'autres séquences antisens humaines, utilisables dans le cadre de l'invention, sont les suivantes :
DA5' de séquence SEQ ID 7 dirigée contre le site 5' de l'exon 51 ;
D A3' de séquence SEQ ID 8 dirigée contre le site 3' de l'exon 51 ;
G5' de séquence SEQ ID 9 dirigée contre le site 5' de l'exon 51 ; - GBP de séquence SEQ ID 10 dirigée contre le site BP de l'exon 51 ; ESE4, ESE16 et ESE28 de séquence SEQ ID 11, 12 et 13, respectivement, dirigées contre des sites de type ESE de l'exon 51 ;
- Ex51AONlongl de séquence SEQ ID 25 ;
- Ex51AONlong2 de séquence SEQ ID 26.
Ces séquences sont préférentiellement associées en tandem dans un vecteur selon l'invention. Préférentiellement, DA5' (SEQ ID 7) et DA3' (SEQ ID 8) ou G5' (SEQ ID 9) et GBP (SEQ ID 10) sont associées.
Les séquences SEQ ID 25 et SEQ ID 26 correspondent aux séquences SEQ ID 5 et SEQ ID 6 plus longues. Elles sont préférentiellement associées. Etant donné leur grande taille, chacune est avantageusement intégrée à une cassette U7, portée soit par le même vecteur AAV, soit par deux vecteurs AAV distincts à utiliser en tandem.
De manière très intéressante, le Demandeur a montré dans la présente invention que la nature de la séquence antisens pouvait jouer un rôle important dans l'efficacité de la construction et que d'autre part, il était possible d'évaluer l'efficacité de ces séquences par des expériences in vitro réalisées sur des cellules musculaires cibles en transposant lesdites cassettes U7 dans un vecteur lentiviral.
Selon un autre aspect, l'invention concerne donc également un vecteur lentiviral comprenant : une séquence snRNA modifiée de type U7 ; le promoteur natif de U7 ; - au moins une séquence antisens choisie dans le groupe comprenant SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 27, SEQ ID 28 ; SEQ ID 5, SEQ ID 6, SEQ ID 7, SEQ ID 8, SEQ ID 9, SEQ ID 10, SEQ ID 11, SEQ ID 12, SEQ ID 13, SEQ ID 25, SEQ ID 26.
Le Demandeur a montré qu'un tel vecteur présente une efficacité dans le saut de l'exon 51 humain, bien supérieure à celle observée avec la construction de De Angelis et al. (1). Pour la première fois, il rapporte la production non équivoque de dystrophine in vivo après injection de cellules de patient (delta 49-50) génétiquement modifiées à l'aide d'un vecteur lentiviral selon l'invention dans des souris SCID-mdx.
Préférentiellement, le vecteur lentiviral remplaçant le vecteur viral adéno-associé selon l'invention est un lentivirus SIN de dernière génération ("self inactivating"). Toutefois, tout vecteur lentiviral peut être utilisé pour insérer une "cassette U7". La construction et la manipulation des vecteurs lentiviraux sont bien connues de l'homme du métier.
Ces vecteurs lentiviraux présentent des applications complémentaires à celles des AAV recombinants selon l'invention. Alors que ces derniers sont voués à être injectés in situ dans les muscles cibles, les vecteurs lentiviraux permettent d'une part de tester l'efficacité de séquences antisens potentielles in vitro, directement dans les cellules musculaires différenciées issues du patient à traiter. D'autre part, si ces vecteurs sont introduits dans des myoblastes, précurseurs musculaires, voire des cellules souches, il est possible d'envisager la greffe in situ de cellules transfectées.
Fait donc également partie de l'invention tout type de cellule transfectée par le vecteur recombinant, et en particulier des cellules musculaires, en particulier de type fibres musculaires (myo tubes), précurseurs musculaires (myoblastes) ou toute cellule capable de différenciation musculaire.
Un tissu musculaire ou un organisme non humain transfecté par ledit vecteur sont également compris dans l'étendue de la protection recherchée. Parmi les organismes non humains, les animaux - en particulier les souris - sont préférés.
La présente demande décrit pour la première fois un potentiel thérapeutique pour les vecteurs revendiqués. La présente invention se rapporte donc également à des compostions pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins un vecteur tel que défini dans la présente demande, ainsi que l'utilisation de ce vecteur comme médicament. En outre, comme mentionné ci-dessus à propos des vecteurs lentiviraux, des cellules transfectées peuvent également avoir un potentiel thérapeutique dans le cadre de greffes.
Une composition pharmaceutique selon l'invention contient le vecteur ou les cellules revendiqués, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et inerte.
Lorsque les vecteurs selon l'invention sont à injecter au niveau des muscles malades, la composition pharmaceutique se présente préférentiellement sous forme liquide. La concentration en vecteur, la quantité à injecter et la fréquence des injections sont déterminées aisément par l'homme du métier.
Au vu des effets remarquables observés in vivo sur la restauration de la dystrophine dans les fibres musculaires atteintes de DMD, l'utilisation du vecteur ou des cellules selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de la maladie de Duchenne est également revendiquée.
Plus généralement, un vecteur selon l'invention peut être utilisé pour le traitement de toute maladie associée au dysfonctionnement d'une protéine à domaines dispensables, le saut d'au moins un exon codant un domaine dispensable rétablissant son fonctionnement.
Hormis le dysfonctionnement de la dystrophine associé à la maladie de Duchenne illustré ici, certaines myopathies sont par exemple liées à un dysfonctionnement de la protéine à domaines dispensables qu'est la dysferline et peuvent donc être traitées avec un vecteur selon l'invention.
Dans leur emploi in vivo, des vecteurs selon l'invention se sont avérés être stables, avoir une localisation subcellulaire spécifique et produire des quantités thérapeutiquement actives et permanentes d'antisens. Plus généralement, la présente demande démontre le potentiel du système AAV-U7snRNA comme outil pour Finactivation ou la modification d'ARNm chez les animaux.
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants à l'appui des figures annexées.
Figure 1 :
(A) Le diagramme du haut montre une illustration schématique de la structure de la dystrophine intacte (427 kDa). Elle est composée de plusieurs domaines : un domaine de liaison à l'actine (ABD) en N-terminal, un domaine central en bâtonnet constitué de 24 motifs répétés "spectrine-like" (R) ainsi que 4 segments charnières (H) capables de conférer de la flexibilité, et un domaine riche en cystéines (CR) qui fixe la β-dystroglycane et d'autres membres du complexe associé à la dystrophine, à proximité de l'extrémité C-terminale. Le diagramme du milieu représente FARNm de la dystrophine (environ 14 000 bases) constitué de 79 exons. Dans les souris mdx, le remplacement d'une cytosine par une thymidine dans l'exon 23 à la position 3185 de la séquence codante crée un codon STOP prématuré. Le diagramme du bas met en évidence les séquence cibles au niveau de la séquence BP (branch point ; BP22 ; SEQ ID 3) en amont de l'exon 23 et en aval du site donneur d'épissage (SD23 ; SEQ ID 2) pour forcer la machinerie en charge de l'épissage à sauter l'exon muté tout en maintenant un cadre de lecture ouvert.
(B) Structure du vecteur AAV(U7-SD23/BP22). La cassette U7-SD23/BP22 est constituée du promoteur U7 (position -267 à +1, boîte hachurée), la séquence
U7 snRNA modifiée (boîte grisée et séquence correspondante en dessous) et les séquences en aval de la position 116 (boîte ouverte). Cette cassette a été placée entre deux séquences inversées répétées terminales (ITR) de AA V2 (SEQ ID 1). Figure 2 :
(A) Détection du snRNA modifié U7-SD23/BP22 (a) et du snRNA U7 endogène (B) suite à l'injection intramusculaire du vecteur AAV. Des échantillons d'ARN totaux ont été analysés à 0, 15 et 30 jours (colonnes 1, 2 et 3, respectivement) par RT-PCR. Les produits correspondants de 60pb ont été visualisés sur gel d'agarose. Détection de FARNm de la dystrophine avec le saut de l'exon 23. Des échantillons d'ARN totaux ont été analysés à 0, 15 et 30 jours par RT-PCR nichée, en utilisant des paires de primers dans l'exon 20 et 26. La bande de 901 pb qui correspond à FARNm sans saut (*) est la seule espèce détectée au jour 0 (colonne 1), et est progressivement remplacée par un fragment de 688 pb (**) qui correspond à FARNm ayant perdu l'exon 23.
(B) Séquence en ADN de la bande de 688 pb après purification sur gel.
(C) Immunodétection des protéines totales extraites des muscles jambiers antérieurs, colorées avec des anticorps monoclonaux anti- dystrophine Dysl (les flèches indiquent la dystrophine entière de 427 kDa : colonne 1, mdx, non injectée ; colonne 2, mdx, 2 semaines après injection, colonne 3, mdx, 1 mois après injection ; colonne 4, C57B16). Chaque colonne a été chargée avec une quantité totale de protéine de 40 μg. Le même profil a été observé avec des anticorps Dys2 (résultats non montrés).
Figure 3 : Restauration de la dystrophine dans des souris mdx après administration de AAV(U7-SD23/BP22). Coloration immunologique avec Dys2-Ab de sections transversales entières du "hind limb anterior" compartiment (muscle jambier antérieur = TA et extensor digitorum longus* = EDL) de (A) C57B16 normale, (B) mdx non traitées, (C-E) souris mdx après 2, 4 et 12 semaines après injection intramusculaire, et (F) mdx 4 semaines après libération vectorielle intra-artérielle. Echelles (A-D) : 0,5 mm ; (E-F) : 1 mm. Figure 4 : Restauration du complexe protéique associé à la dystrophine dans des muscles mdx traités. Les colonnes de gauche, centrale et de droite montrent des sections du muscle jambier antérieur de C57B16 normale, mdx non traitées et souris mdx après traitement, respectivement. Les sections ont été immunocolorées vis à vis de la dystrophine (A,B,C), de Fα-sarcoglycane (D,E,F), la β-sarcoglycane (G,H,I) et la β-dystroglycane (J,K,L). Le même lot de fibres révertantes (*), présentant de la dystrophine ainsi que le complexe protéique associé, est montré sur les séries de sections des souris non traitées.
Figure 5 : La restauration de la dystrophine dans des muscles mdx traités rétablit la susceptibilité normale au dommage induit par l'exercice. (A) enregitrements superposés de la tension produite par les muscles EDL de a) C57B16, b) mdx non traitées et c) souris mdx après 45 jours de traitement, au cours de 5 contractions toniques avec extension forcée. Les muscles isolés ont été soumis à des stimulations répétitives (125 Hz) pendant 360 ms, à des intervalles de 3 min. Pendant les premières 160 ms, la tension s'est développée isométriquement, puis une extension forcée correspondant à 10% de la longueur L0 pour laquelle le muscle produit une force maximale a été imposée à une vitesse de 1 longueur de fibre par seconde. Après relaxation, le muscle est revenu à sa longueur de repos. La chute de la force a été quantifiée par (Fi-F5)/Fi, avec Fi la force isométrique développée juste avant l'extension dans le premier tétanus, et F5 celle de la cinquième. La chute de la force a atteint en moyenne 15% pour des muscles C57B16 contre 65% chez mdx. Pour les mdx traités montrés en c), la réduction de la chute de la force a été de 17%, indiquant une pleine réacquisition des propriétés mécaniques des fibres musculaires. (B et C) Détection au bleu d'Evans des fibres musculaires endommagées par l'exercice dans les jambiers antérieurs des pattes non traitées (B) ou traitées (C) d'un seul animal mdx, 60 jours après l'administration du traitement. Les fibres endommagées incorporent le bleu d'Evans, dont la fluorescence est détectée dans le canal rouge. La dystrophine a été colorée immunologiquement avec Ab-dys2 (vert). Figure 6 :
(A) Séquence de la région intron 5 - intron 8 chez le chien GMRD. La mutation responsable du phénotype est identifiée.
(B) Schéma de l'épissage de FARNm chez le chien GMRD. (C) Schéma de l'interruption de la phase de lecture à la fin de l'exon 6 aboutissant à une dystrophine atrophiée.
Figure 7 :
(A) Localisation des séquences cibles situées dans les séquences ESE de l'exon 6 (C6ESE2 ; SEQ ID 27) et de l'exon 8 (C8ESE1 ; SEQ ID 28).
(B) Schéma de l'épissage de FARNm chez le chien GMRD, après saut d'exons multiples réalisé avec les séquences antisens C6ESE2 et C8ESE1.
(C) Schéma de la séquence protéique de la dystrophine synthétisée après le saut d'exons multiples.
Figure 8 : Restauration de la dystrophine dans des chiens GRMD adultes, obtenue 2 mois après une injection intramusculaire unique d'une préparation contenant les vecteurs AAV(U7-ex6) intégrant la séquence antisens SEQ ID 27 et AAV(U7-ex8) intégrant la séquence antisens SEQ ID 28. Coloration immuno logique avec Dys2-Ab de sections transversales entières. Echelle 1 mm.
Figure 9 : Immunodétection des protéines totales extraites des muscles jambiers antérieurs, colorées avec des anticorps monoclonaux anti- dystrophine Dys2 : colonne 1, dystrophine humaine chez sujet sain ; colonne 2, dystrophine chez chien sain, colonne 3, chien GRMD 2 mois après le traitement; colonne 4, chien GRMD non traité. Chaque colonne a été chargée avec une quantité totale de protéine de 40 μg. Figure 10 :
(A) Localisation des séquences cibles permettant le saut de l'exon 51 dans le gène humain de la dystrophine : la séquence antisens H51a a la séquence SEQ ID 6 et la séquence antisens H51b a la séquence SEQ ID 5. Les séquences antisens AS et DS sont comme décrites par DeAngelis (1).
(B) Schéma de l'intégration de la cassette U7 dans le vecteur lentiviral.
(C) Détection de FARNm de la dystrophine humaine avec le saut de l'exon 51. Les échantillons d'ARN totaux ont été analysés par RT-PCR nichée. La flèche noire correspond à FARNm sans saut (*), alors que la flèche blanche indique FARNm dépourvu de l'exon 51.
Figure 11 : Restauration de la dystrophine dans des souris SCID-mdx, obtenue 1 mois et demi après l'injection dans les muscles tibialis antérieur de cellules souches delta 49-50 transduites par le vecteur Lent(U7-H51ab) intégrant les séquence antisens SEQ ID 5 et 6. Coloration immunologique avec Dys3.
A- ETUDE EXPÉRIMENTALE CHEZ LA SOURIS
I) MATÉRIEL ET MÉTHODES 1. Constructions
Le gène entier U7 snRNA (445 pb) a été obtenu par PCR sur FADN génomique de la souris avec les oligonucléotides: 5'-TAACAACATAGGAGCTGTG-S' (SEQ ID 14) et 5'-CAGATACGCGTTTCCTAGGA-3' (SEQ ID 15). Le domaine Sm (AATTTGTCTAG ; SEQ ID 16) a été optimisé en smOPT (AATTTTTGGAG ; SEQ ID 17), ainsi que décrit antérieurement (3), et la région du U7 capable de s'apparier avec le pré-ARNm a été échangée avec une séquence de 44 nucléotides complémentaires à la fois à la région couvrant la séquence BP (branch point) en amont de l'exon 23 du gène de la dystrophine (BP22: 5'- AAATAGAAGTTCATTTACACTAAC-3' ; SEQ ID 3) et la région en aval du site donneur d'épissage (SD23: 5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCT-3' ; SEQ ID 2). Le fragment résultant U7smOPT-SD23/BP22 a ensuite été inséré entre 2 séquences inversées répétées terminales de AA V2 (SEQ ID 1).
2. Vecteurs Des vecteurs recombinants pseudotypés AAV2/1 ont été préparés dans des cellules 293, comme déjà décrit (4), en cotransfectant 3 plasmides: pAAV2 (U7smOPT- SD23/BP22) codant le génome rAAV2, pXX6 arborant les fonctions "adenovirus helper" et pAAVlplTRCO2 qui suppléent les gènes rep et cap de AAVl. Les titres en vecteurs ont varié entre 1012 et 1013 génomes de vecteur (vg) ml"1.
3. Animaux et méthodes de délivrance
Toutes les procédures animales ont été exécutées conformément au protocole approuvé par l'institution et dans des conditions strictes de confinement biologique. Un premier groupe de souris mdx (âgées de 8 semaines) a reçu par injection 50μl PBS (tampon salin phosphate) contenant 1012 (vg) AAV(U7-SD23/BP22) dans les muscles jambiers antérieurs des pattes postérieures droites. Les muscles contre-latéraux ont été utilisés comme contrôles. Un second groupe de souris mdx du même âge ont été soumis à une perfusion intr a- artérielle de 2xlO13 vecteurs à travers l'artère fémorale. Les souris ont été sacrifiées à des temps donnés, les muscles ont été congelés dans de l'isopentane refroidi à l'azote liquide et stockés à -8O0C.
4. Histologie
Des coupes transversales (8 μm) en série, réalisées à intervalles de 200 μm sur la longueur du muscle, ont été examinées pour la dystrophine (NCL-DYS2; anticorps monoclonaux murins contre le domaine C-terminal; NovoCastra) et les protéines associées à la dystrophine (β-dystroglycane, α et β-sarcoglycane; Novocastra) par détection immunologique, conformément aux instructions du fabricant. Les anticorps monoclonaux ont été détectés à l'aide d'anticorps biotinylés suivis par avidine-FITC (M.O.M Kit, Vector Laboratories). Les coupes préparées on été analysées par micro scopie confocale à laser (Leica). Les tissus intermédiaires ont été collectés pour des analyses ultérieures de protéines et d'ARN. 5. Analyse par détection immunologique
Les sections des couches intermédiaires ont été collectées et extraites avec un tampon de lyse contenant 4% SDS, 125 mM Tris-HCl pH 6.4, 4 M urée, 10% β-mercaptoéthanol, 10% glycérol, 0.001% bleu de bromophénol. Après séparation par centrifugation, le contenu en protéines a été mesuré à l'aide du test Bio-Rad "Protein Assay". Les échantillons, ajustés à 40 μg de protéines, ont été chargés sur des gels de polyacrylamide à 6%, soumis à électrophorèse et transférés sur des membranes de nitrocellulose qui ont été incubées avec soit NCL-DYSl (anticorps monoclonaux murins contre la séquence répétée R8 du domaine "spectrine-like" en bâtonnet de la dystrophine; NovoCastra) ou NCL-DYS2, dilué au 1:100, suivi d'une incubation avec des anticorps secondaires de raifort conjugués à la peroxydase (1:1000) et un système d'analyse "ECL Analysis System" (Amersham).
6. Analyse d'ARN
Les ARN totaux ont été isolés d'un pool des coupes intermédiaires en utilisant le réactif TRIZOL (Life Technologies). Pour détecter U7 et U7smOPT-SD23/BP22, la transcription inverse a tout d'abord été réalisée sur les ARN totaux avec de la Supercript II reverse transcriptase en présence d'héxamères aléatoires (In vitro gen). Puis, les ADNc ont été amplifiés grâce à la Taq polymérase (Promega) avec 5'- AAGTGTTACAGCTCTTTTAG-3' (SEQ ID 18 localisée dans l'U7 sauvage) ou 5'- AAGGCCAAACCTCGGCTTAC-3' (SEQ ID 19 localisée dans l'U7smOPT- SD23/BP22) et 5'-AGGGGTTTTCCGACCGAAG-3' (SEQ ID 20) pour 30 cycles (94°C/30 s; 55°C/30 s; 72°C/30 s). Les produits de PCR ont été analysés sur des gels d'agarose à 2%. Pour détecter FARNm de la dystrophine, de la RT-PCR nichée a été réalisée avec 200 ng d'ARN totaux. La première réaction a eu lieu avec les primers Ex20ext (SEQ ID 21 ; 5'CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG-S') et Ex26ext (SEQ ID 22 ; 5 '-TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3') pendant 30 cycles (94°C/30 s; 55°C/1 min; 72°C/2 min). Puis 2 μl de la première réaction ont été amplifiés pendant 23 cycles avec Ex20int (SEQ ID 23 ; 5'-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-S') et Ex26int (SEQ ID 24 ; 5'-CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT-3'). Les produits de PCR ont été analysés sur des gels d'agarose à 2%, et des bandes spécifiques ont été purifiées pour analyse de séquence.
7. Physiologie du muscle Les muscles extensor digitorum longus (EDL) de souris contrôles ou traitées ont été disséqués pour évaluer les propriétés contractiles/mécaniques. Les muscles isolés ont été connectés d'un côté à un entraîneur électromagnétique et de l'autre côté à un capteur de force, et ont été stimulés au moyen d'électrodes placées parallèlement au muscle. Les contractions isométriques toniques et liées à une secousse brève (125 Hz; 360 ms, séparées par des temps de repos de 3 min) ont été étudiées à L0 (la longueur à laquelle la force tonique isométrique maximale est observée). La tension isométrique a été calculée en divisant la force par la surface estimée de la section (cross- sectional area : CSA) du muscle. En supposant que les muscles ont une forme cylindrique et une densité de 1,06 mg.mm"3, la CSA correspond au poids humide du muscle divisé par sa longueur de fibres (5). Les contractions excentriques induisent d'une manière caractéristique des dommages musculaires corrélés à une rupture de membrane. Elles ont lieu lorsque un muscle contracté au maximum est étiré de force, ce qui mène à une chute de force. Ici, les muscles ont été allongés de 10% de la longueur L0 pour laquelle le muscle produit une force maximale à une vitesse de 1 longueur de fibre par seconde. Cinq contractions excentriques ont été appliquées à des intervalles de 3 min. La chute cumulée de la force isométrique a été quantifiée comme décrit précédemment (5).
II) RÉSULTATS
Un ARN de type U7 a été modifié afin d'y introduire des séquences antisens, aptes à interférer avec le processus de maturation des ARN messagers (ARNm), dans le noyau. La séquence du U7snRNA a été optimisée de manière à transporter des séquences antisens dirigées contre les introns 22 et 23 du gène murin de la dystrophine. Les séquences dans l'intron 22 ont été choisies de manière à entrer en compétition avec la fixation du U2snRNA au niveau du site d'épissage BP (Branching Point) (BP22 ; SEQ ID 3), et des séquences dans l'intron 23 correspondant au site de fixation de Ul au niveau du site donneur (SD23 ; SEQ ID 2) (Figure 1). Ces séquences ont été utilisées dans une stratégie de double cible, comme préconisé par Brun et al. (2).
Le gène U7 modifié, comprenant à la fois le promoteur et les éléments 3', a été placé dans une construction basée sur AAV-2, qui a été introduite dans la capside AAV-I pour obtenir une haute efficacité du transfert de gènes dans les muscles squelettiques. Des souris mdx adultes (âgées de 8 semaines) ont reçu en injection dans le muscle jambier antérieur une dose unique de 1010 génomes de vecteur et ont été analysées à différents temps, entre 2 et 16 semaines. L'analyse moléculaire du saut de l'exon 23 a été réalisée par RT-PCR nichée sur les ARN totaux préparés à partir des muscles ayant reçu l'injection. Un transcrit plus court, en l'occurrence dépourvu de l'exon 23, a été détecté. Il représentait de 5 à 10% du matériel amplifié, 2 semaines après injection et devenait l'espèce majoritaire après un mois (Figures 2B et 2C). Cette lente accumulation des transcrits ayant subi le saut d'exon n'a pas résulté de l'expression progressive du transgène pendant les premières semaines suivant le transfert de gènes médié par AAV, puisque les niveaux du U7 modifié, mesurés à 2 et 4 semaines, se sont avérés équivalents et représentaient 5 fois le niveau du U7snRNA endogène (Figure 2A). Plutôt, cela suggère une disponibilité limitée du pré- ARNm et une rotation lente de FARNm mature de la dystrophine dans les fibres musculaires.
En accord avec la génération de transcrits ayant subi le saut d'exon, la protéine dystrophine a été détectée à la fois par immunodétection dans des extraits musculaires mais aussi par immunofluorescence sur des sections tissulaires (Figure 3). Les niveaux de dystrophine reflétaient ceux des ARNm produits (de 0,5% à 30% du niveau normal à 2 et 4 semaines, respectivement). Le saut d'exon a généré des espèces protéiques immunoréactives de la taille attendue, sans évidence de la présence de multiples produits de dégradation. Il est à noter que la différence en poids moléculaire entre la protéine sauvage et tronquée ne peut pas être résolue sur le gel montré. Virtuellement, toutes les fibres du muscle ayant reçu l'injection ont été détectées positivement à partir de 4 semaines après l'injection et la protéine était typiquement localisée à la périphérie des fibres. Des coupes histologiques des muscles traités ont montré distinctement la disparition du phénotype dystrophique, avec des fibres qui ont retrouvé leur forme polygonale normale et l'absence de cellules inflammatoires.
Un groupe d'animaux mdx a reçu le vecteur AAV-U7 par perfusion intr a- artérielle à haute pression dans la patte inférieure. Cela a abouti, après un mois, à la restauration efficace de la dystrophine dans la plupart des fibres, dans tous les muscles de la patte perfusée, dont TA et EDL (Figure 3F). En plus de la dystrophine, les protéines associées incluant Fα-sarcoglycane, la β-sarcoglycane et la β-dystroglycane ont été détectées à la périphérie des fibres des animaux traités (Figure 4). Cela a confirmé que le produit de FARNm ayant subi le saut d'exon contient un domaine C-terminal de fixation de la dystroglycane qui est essentiel à la fonction d'ancrage à la membrane de la dystrophine.
La susceptibilité aux dommages induits par l'exercice a été évaluée chez les animaux traités en mesurant la résistance aux contractions toniques suivies d'une élongation forcée. Pour cette expérience, les souris ont reçu une dose unique de AAV-U7 dans le muscle EDL et ont été analysées après 45 jours. Alors que les muscles des animaux mdx étaient incapables de supporter des élongations répétées, les muscles traités exprimant une dystrophine rétablie dans plus de 70% de leurs fibres présentaient des performances essentiellement équivalentes aux muscles normaux avec une chute de force de 17% suivant 5 stimuli, comparé à 15% pour les sauvages (Figure 5A). Les dommages induits par l'exercice ont aussi été évalués en soumettant les souris mdx injectées dans le muscle jambier antérieur à une course de grande envergure, suivie d'une injection au Bleu d'Evans, un colorant imperméable aux cellules. Les lésions musculaires, mises en évidence par l'entrée du colorant dans les fibres, étaient significatives dans le muscle traité (Figure 5B) et absentes dans le muscle non traité contre-latéral du même animal (Figure 5C). B- ETUDE IN VIVO CHEZ LE CHIEN
Les résultats obtenus chez la souris ont pu être transposés à un animal de grande taille, à savoir le chien GRMD. Le chien GRMD présente une mutation ponctuelle dans le site accepteur d'épissage de l'intron 6 (AG transformé en GG ; Fig. 6A), interdisant l'inclusion de l'exon 7 dans FARNm de la dystrophine (Fig. 6B). L'ARNm ainsi formé (delta exon 7) présente un décalage du cadre de lecture lié au déphasage des exons 6 et 8 (Fig. 6B et C). Deux ARN de type U7 ont été modifiés afin d'y introduire des séquences antisens, aptes à interférer avec la machinerie d'épissage au voisinage des exons 6 et 8 (Fig. 7A), de sorte que les exons 6, 7 et 8 ne soient pas pris en compte dans FARNm final (multi-skipping ; Fig. 7B). Cet ARNm, dont le cadre de lecture est restauré, permet la production d'une protéine légèrement tronquée dans le domaine ABD (Fig. 7C), mais théoriquement parfaitement fonctionnelle. L'efficacité des vecteurs AAV(U7-ex6) intégrant la séquence antisens SEQ ID 27 et AAV(U7-ex8) intégrant la séquence antisens SEQ ID 28 a été testée in vivo par injection loco-régionale chez des sujets GRMD adultes. La figure 8 illustre le niveau de dystrophine obtenu 2 mois après une injection intramusculaire unique d'une préparation de 500 μl contenant un mélange des deux vecteurs (-1011 particules virales). Cette dystrophine est également détectable par Western-blot (figure 9). Comme chez la souris, le complexe de protéines associées à la dystrophine est également restauré suggérant indirectement le bon fonctionnement de la « quasi- dystrophine » induite par saut multi-exon.
C- ETUDE IN VITRO CHEZ L'HOMME
Nous avons développé une approche permettant de combiner les approches de thérapie cellulaire et de saut d'exon dans des populations de cellules capables de participer à la régénération musculaire in vivo. Pour cela, nous avons développé des vecteurs lentiviraux véhiculant des cassettes U7 susceptibles d'induire des sauts thérapeutiques (modèles murin, canin et humain). A titre d'exemple, nous présentons ci-dessous la restauration de dystrophine dans des cellules d'un patient DMD présentant une délétion des exons 49-50. Différents vecteurs Lenti(U7ex51 humains) ont été générés, l'un d'entre eux portant les séquences précédemment décrites par DeAngelis (1) (Fig. 10A et B). Nos résultats montrent dans des conditions de transduction, de culture et d'analyse identiques que les séquences cibles précédemment publiée (U7-ASDS) ne fonctionnent que très modestement et ne permettent pas la restitution d'un niveau de dystrophine compatible avec un rationnel thérapeutique (Fig. 10C). En revanche, le vecteur (U7- H51ab), intégrant les séquences antisens SEQ ID 5 et SEQ ID 6, se révèle extrêmement efficace et autorise la modification quasi complète des ARNm dystrophine qui sont ici tous débarrassés de l'exon 51 ciblé par le vecteur (Fig. 10C). Des cellules souches AC133+ circulantes (20 x 104) fraîchement prélevées chez un patient DMD (delta 49-50) ont été transduites par le vecteur Lent(U7-H51ab) intégrant les séquences antisens SEQ ID 5 et SEQ ID 6, et rapidement réinjectées dans les muscles tibialis antérieur de souris SCID-mdx dans le dessein de faire la preuve de la possibilité d'un saut d'exon thérapeutique in vivo à partir de cellules de patients DMD.
L'analyse histologique, après un mois et demi, démontre de façon conclusive la restauration de dystrophine humaine (révélation par anticorps DYS3 ne croisant pas avec la dystrophine murine) dans de nombreuses fibres musculaires vraisemblablement chimères homme/souris (Fig. 11).
BIBLIOGRAPHIE
1) De Angelis FG, Sthandier O, Berarducci B, To so S, Galluzzi G, Ricci E, Cossu G, Bozzoni I, "Chimeric snRNA molécules carrying antisense séquences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells", PNAS U.S.A. 2002 JuI 9;9(14):9456-61. 2) Brun C, Suter D, Pauli C, Dunant P, Lochmuller H, Burgunder JM, Schumperli D, Weis J, "U7 snRNAs induce correction of mutated dystrophin pre-mRNA by exon skipping", CeU Mol Life Sci. 2003 Mar;60(3):557-66.
3) Gorman L, Suter D, Emerick V, Schumperli D, KoIe R, "Stable altération of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs", PNAS
U.S.A. 1998; 95:4929-34.
4) Snyder RO et al., "Efficient and stable adeno-associated virus-mediated transduction in the skeletal muscle of adult immunocompetent mice", Hum Gène Ther 1997; 8: 1891-900.
5) Fougerousse F, Gonin P, Durand M, Richard I, Raymackers JM, "Force impairment in calpain 3-deficient mice is not correlated with mechanical disruption", Muscle Nerve 2003; 27: 616-23.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Vecteur viral adéno-associé comprenant : une séquence snRNA modifiée de type U7 ; - le promoteur natif de U7; au moins une séquence antisens dirigée contre au moins un site d'épissage d'au moins un exon, ledit exon codant un domaine dispensable de la dystrophine.
2/ Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que le vecteur AAV est composé d'une capside du sérotype 1.
3/ Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce que le vecteur AAV est un pseudo type 2/1.
Al Vecteur selon d'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le site d'épissage est choisi dans le groupe comprenant le site 5' donneur, le site 3' accepteur,la séquence BP ("Branch Point") et les séquences ESE.
5/ Vecteur selon d'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le vecteur comprend deux séquences antisens.
6/ Vecteur selon la revendication 5 caractérisé en ce que les séquences antisens sont dirigées contre le site 5' donneur et la séquence BP, respectivement.
11 Vecteur selon la revendication 6 caractérisé en ce que les séquences antisens ont une séquence SEQ ID 2 et SEQ ID 3, respectivement.
8/ Vecteur selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID 1. 9/ Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence antisens dirigée contre une séquence ESE de l'exon 6 et/ou de l'exon 8 du gène canin de la dystrophine, préférentiellement de séquence SEQ ID 27 et/ou SEQ ID 28.
10/ Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'au moins une séquence antisens est dirigée contre au moins un site d'épissage d'au moins un exon du gène humain de la dystrophine.
11/ Vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'au moins un exon est l'exon 51.
12/ Vecteur selon la revendication 11 caractérisé en ce que les séquences antisens ont une séquence choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID 5, SEQ ID 6, SEQ ID 7, SEQ ID 8, SEQ ID 9, SEQ ID 10, SEQ ID 11, SEQ ID 12, SEQ ID 13, SEQ ID 25 et SEQ ID 26.
13/ Vecteur selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend les séquences SEQ ID 5 et SEQ ID 6, ou SEQ ID 7 et SEQ ID 8, ou SEQ ID 9 et SEQ ID 10, ou SEQ ID 25 et SEQ ID 26, respectivement.
14/ Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID 4.
15/ Vecteur selon l'une des revendications I à 5 et 9 à lθ caractérisé en ce que les séquences antisens sont dirigées contre des sites d'épissage d'au moins deux exons distincts. 16/ Vecteur lentiviral comprenant : une séquence snRNA modifiée de type U7 ; le promoteur natif de U7 ; au moins une séquence antisens choisie dans le groupe comprenant SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 27, SEQ ID 28 ; SEQ ID 5, SEQ ID 6, SEQ ID 7, SEQ ID
8, SEQ ID 9, SEQ ID 10, SEQ ID 11, SEQ ID 12, SEQ ID 13, SEQ ID 25, SEQ ID 26.
17/ Cellule transfectée par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16.
18/ Cellule selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule musculaire.
19/ Cellule selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un myoblaste ou d'une cellule capable de différenciation musculaire.
20/ Tissu musculaire transfecté par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16.
21/ Organisme non humain transfecté par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16.
22/ Composition pharmaceutique comprenant un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 ou des cellules selon l'une des revendications 17 à 19.
23/ Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 ou de cellules selon l'une des revendications 17 à 19 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter une maladie associée au dysfonctionnement de la dystrophine, le saut d'au moins un exon codant un domaine dispensable rétablissant son fonctionnement.
24/ Utilisation selon la revendication 23 caractérisée en ce que la maladie est la maladie de Duchenne.
PCT/FR2005/050642 2004-08-17 2005-08-02 Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables WO2006021724A2 (fr)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE602005014114T DE602005014114D1 (de) 2004-08-17 2005-08-02 Adeno-assoziierter viraler vektor zur exon-überspringung in einem für ein protein mit überflüssiger domäne kodierenden gen
DK05797742T DK1778297T3 (da) 2004-08-17 2005-08-02 Adenoassocieret viral vektor til exon-overspringning i et gen, som koder for et protein med overflödige domæner
US11/573,811 US20120077860A1 (en) 2004-08-17 2005-08-02 Adeno-Associated Viral Vector for Exon Skipping in a Gene Encoding a Dispensable Domain Protein
CA2576462A CA2576462C (fr) 2004-08-17 2005-08-02 Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables
EP05797742A EP1778297B1 (fr) 2004-08-17 2005-08-02 Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables
JP2007526520A JP4885136B2 (ja) 2004-08-17 2005-08-02 欠失可能なドメインタンパク質をコードする遺伝子におけるエクソンスキッピングのためのアデノ随伴ウイルスベクター
PL05797742T PL1778297T3 (pl) 2004-08-17 2005-08-02 Wirusowy nośnik adenozespolony do realizacji pominięcia egzonów w genie kodującym białko o obszarach zbędnych
AT05797742T ATE429252T1 (de) 2004-08-17 2005-08-02 Adeno-assoziierter viraler vektor zur exon- überspringung in einem für ein protein mit überflüssiger domäne kodierenden gen
US13/458,037 US20130072541A1 (en) 2004-08-17 2012-04-27 Adeno-associated viral vector for exon skipping in a gene encoding a dispensible-domain protein

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0451861 2004-08-17
FR0451861A FR2874384B1 (fr) 2004-08-17 2004-08-17 Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/458,037 Division US20130072541A1 (en) 2004-08-17 2012-04-27 Adeno-associated viral vector for exon skipping in a gene encoding a dispensible-domain protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2006021724A2 true WO2006021724A2 (fr) 2006-03-02
WO2006021724A3 WO2006021724A3 (fr) 2006-08-31

Family

ID=34948645

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2005/050642 WO2006021724A2 (fr) 2004-08-17 2005-08-02 Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20120077860A1 (fr)
EP (2) EP1778297B1 (fr)
JP (1) JP4885136B2 (fr)
AT (1) ATE429252T1 (fr)
CA (1) CA2576462C (fr)
DE (1) DE602005014114D1 (fr)
DK (1) DK1778297T3 (fr)
ES (1) ES2324948T3 (fr)
FR (1) FR2874384B1 (fr)
PL (1) PL1778297T3 (fr)
PT (1) PT1778297E (fr)
WO (1) WO2006021724A2 (fr)

Cited By (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008113773A3 (fr) * 2007-03-16 2008-12-24 Biorigen S R L Technique de régulation de l'expression génétique et arn non codant à visée diagnostique et thérapeutique
WO2010093784A2 (fr) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vecteurs viraux modifiés et procédés de fabrication et d'utilisation de ceux-ci
WO2011057350A1 (fr) * 2009-11-12 2011-05-19 The University Of Western Australia Molécules antisens et procédés de traitement de pathologies
WO2011088081A1 (fr) 2010-01-12 2011-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Répétitions terminales inversées restrictives pour vecteurs viraux
WO2011113889A1 (fr) 2010-03-17 2011-09-22 Association Institut De Myologie Snarn u7 modifiés pour traiter les maladies neuromusculaires
WO2012109570A1 (fr) 2011-02-10 2012-08-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vecteurs viraux à profil de transduction modifiée et procédés pour les préparer et les utiliser
EP2500434A1 (fr) 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Vecteurs AAV sans capside, compositions et procédés pour la production des vecteurs et la thérapie génique
WO2012136811A1 (fr) 2011-04-06 2012-10-11 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) Stimulateur spécifique d'un muscle squelettique
WO2014052789A1 (fr) 2012-09-28 2014-04-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vecteurs vaa ciblés sur des oligodendrocytes
WO2014144229A1 (fr) 2013-03-15 2014-09-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Méthodes et compositions de double liaison de glycane de vecteurs avv
WO2014143932A1 (fr) 2013-03-15 2014-09-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Répétitions terminales inversées de synthèse du virus adéno-associé
US8865883B2 (en) 2008-10-24 2014-10-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9018368B2 (en) 2004-06-28 2015-04-28 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
WO2015190922A1 (fr) * 2014-06-10 2015-12-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Oligonucléotides antisens utilisés dans le traitement de la maladie de pompe
US9217148B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
WO2016016449A1 (fr) 2014-07-31 2016-02-04 Association Institut De Myologie Traitement de la sclérose latérale amyotrophique
WO2016115382A1 (fr) 2015-01-14 2016-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Procédés et compositions destinés au transfert de gènes ciblé
US9506058B2 (en) 2013-03-15 2016-11-29 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
WO2017050836A1 (fr) 2015-09-21 2017-03-30 Association Institut De Myologie Oligonucléotides antisens et leurs utilisations
WO2017058892A2 (fr) 2015-09-28 2017-04-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Procédés et compositions pour vecteurs viraux évitant les anticorps
WO2017098187A1 (fr) * 2015-12-09 2017-06-15 Genethon Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
WO2017106236A1 (fr) 2015-12-14 2017-06-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Protéines capsidiques modifiées pour la libération améliorée de vecteurs parvoviraux
US10059947B2 (en) 2013-09-11 2018-08-28 Synthena Ag Nucleic acids and methods for the treatment of Pompe disease
WO2018170310A1 (fr) 2017-03-15 2018-09-20 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vecteurs viraux adéno-associés polyploïdes et leurs procédés de fabrication et d'utilisation
WO2019195444A1 (fr) 2018-04-03 2019-10-10 Stridebio, Inc. Vecteurs viraux évitant les anticorps
WO2019195423A1 (fr) 2018-04-03 2019-10-10 Stridebio, Inc. Vecteurs de virus permettant de cibler des tissus ophtalmiques
WO2019195449A1 (fr) 2018-04-03 2019-10-10 Stridebio, Inc. Vecteurs de virus évitant les anticorps
WO2019241324A1 (fr) 2018-06-12 2019-12-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Capsides synthétiques de virus adéno-associé du foie et leurs utilisations
WO2019246544A2 (fr) 2018-06-22 2019-12-26 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Vecteurs pour l'administration de gènes qui persistent dans les cellules
US10596247B2 (en) 2015-02-20 2020-03-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for attenuated chlamydia as vaccine and vector
WO2020191300A1 (fr) 2019-03-21 2020-09-24 Stridebio, Inc. Vecteurs viraux adéno-associés recombinants
EP3655535A4 (fr) * 2017-07-21 2021-04-14 The Governors of the University of Alberta Oligonucléotides antisens qui se lient à l'exon 51 du pré-arnm de la dystrophine humaine
WO2021076925A1 (fr) 2019-10-17 2021-04-22 Stridebio, Inc. Vecteurs de virus adéno-associés pour le traitement de la maladie de niemann-pick de type c
WO2021089736A1 (fr) 2019-11-06 2021-05-14 Association Institut De Myologie Polythérapie pour maladies musculaires
WO2021205005A2 (fr) 2020-04-09 2021-10-14 Association Institut De Myologie Séquences antisens pour le traitement de la sclérose latérale amyotrophique
WO2022093769A1 (fr) 2020-10-28 2022-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Procédés et compositions de double liaison glycane de vecteurs de vaa2.5
WO2022155578A1 (fr) 2021-01-15 2022-07-21 Outpace Bio, Inc. Système d'expression génique régulé par petites molécules
WO2022155482A1 (fr) 2021-01-14 2022-07-21 Stridebio, Inc. Vecteurs de vaa ciblant des lymphocytes t
WO2022221529A1 (fr) 2021-04-16 2022-10-20 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Virions de vaa à polyploïde rationnel traversant la barrière hémato-encéphalique et déclenchant une réponse humorale réduite
EP4119682A1 (fr) 2021-07-13 2023-01-18 Genethon Procédé permettant de déterminer la nature d'impuretés d'adn à l'intérieur de particules virales
EP4169535A1 (fr) 2019-04-26 2023-04-26 The University of North Carolina at Chapel Hill Procédés et compositions de double liaison glycane de vecteurs de vaa2.5
US11639509B2 (en) 2020-10-28 2023-05-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for dual glycan binding AAV2.5 vector
EP4215614A1 (fr) 2022-01-24 2023-07-26 Dynacure Thérapie de combinaison pour maladies liées à la dystrophine
WO2023150687A1 (fr) 2022-02-04 2023-08-10 Ginkgo Bioworks, Inc. Vecteurs viraux adéno-associés recombinants et méthodes d'utilisation associées
EP4219717A3 (fr) * 2018-06-13 2023-12-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligomères à saut d'exon pour la dystrophie musculaire
EP4344741A2 (fr) 2014-11-21 2024-04-03 The University of North Carolina at Chapel Hill Vecteurs aav ciblant le système nerveux central
WO2024124019A2 (fr) 2022-12-07 2024-06-13 Ginkgo Bioworks, Inc. Vecteurs aav ciblant des cellules souches hématopoïétiques
US12037588B2 (en) 2022-03-04 2024-07-16 Locanabio, Inc. Compositions and methods comprising engineered short nuclear RNA (snRNA)
US12064483B2 (en) 2017-01-06 2024-08-20 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
US12104163B2 (en) 2020-08-19 2024-10-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus vectors for treatment of Rett syndrome

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010115993A1 (fr) * 2009-04-10 2010-10-14 Association Institut De Myologie Oligonucléotides antisens tricyclo-adn, compositions, et méthodes de traitement de maladies
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
WO2012149393A2 (fr) 2011-04-29 2012-11-01 Selecta Biosciences, Inc. Nanovecteurs synthétiques tolérogènes destinés à une délétion, spécifique à un antigène, de cellules effectrices
JP6461917B2 (ja) 2013-04-20 2019-01-30 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル エクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物の組換えアデノ随伴ウイルスによる送達
KR20240119156A (ko) 2013-05-03 2024-08-06 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 제i형 및 제iv형 과민성을 감소시키기 위한 관용유발 합성 나노담체의 국부, 병용 투여
EP3572516A1 (fr) 2014-08-09 2019-11-27 The Research Institute at Nationwide Children's Hospital Procédés et matériaux permettant d'activer un site d'entrée de ribosome interne dans l'exon 5 du gène dmd
AU2015311708A1 (en) 2014-09-07 2017-02-02 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating exon skipping anti-viral transfer vector immune responses
EP3592389A1 (fr) 2017-03-11 2020-01-15 Selecta Biosciences, Inc. Procédés et compositions associés à un traitement combiné avec anti-inflammatoires et nanovecteurs synthétiques comprenant un immunosuppresseur
MX2021001281A (es) 2018-08-02 2021-07-15 Dyne Therapeutics Inc Complejos dirigidos a músculos y sus usos para el tratamiento de distrofinopatías.
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CA3108289A1 (fr) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Complexes de ciblage musculaire et leurs utilisations pour le traitement de la dystrophie musculaire facio-scapulo-humerale
WO2020041634A1 (fr) * 2018-08-22 2020-02-27 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Produits viraux recombinés et procédés pour inhiber l'expression de protéine kinase de dystrophie myotonique et/ou interférer avec une expansion répétée trinucléotidique dans la région non traduite en 3' du gene dmpk
KR102452590B1 (ko) * 2019-08-01 2022-10-12 기초과학연구원 CRISPR/Cas9 매개 체세포 핵 이식에 의한 개 디스트로핀병증 모델 생성 및 이의 용도
EP4188404A1 (fr) * 2020-07-29 2023-06-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Cassettes transgéniques, vecteurs vaa et vecteurs viraux vaa pour l'expression de cstb optimisé par codon humain
CA3195233A1 (fr) 2020-09-15 2022-03-24 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Edition de gene d'integration ciblee independante de l'homologie mediee par vaa pour la correction de diverses mutations dmd chez des patients atteints d'une dystrophie musculaire
AU2022229489A1 (en) 2021-03-04 2023-08-31 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for treatment of dystrophin-based myopathies using crispr-cas9 to correct dmd exon duplications
CA3217491A1 (fr) 2021-04-23 2022-10-27 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Produits et methodes de traitement de la dystrophie musculaire
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
IL311101A (en) * 2021-09-03 2024-04-01 Tacit Therapeutics Inc RNA editing through recruitment of SPLICEOSOME components

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1160318A2 (fr) * 2000-04-26 2001-12-05 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Médicament pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne
WO2002024906A1 (fr) * 2000-09-21 2002-03-28 Academisch Ziekenhuis Leiden Induction d'omission d'exon dans des cellules eucaryotes
US20040040052A1 (en) * 2001-12-21 2004-02-26 Oxford Biomedica (Uk) Limited Transgenic organism
US20040101514A1 (en) * 2000-03-14 2004-05-27 Yuhong Liu High transgene expression of a pseudotyped adeno-associated virus type

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000325085A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
DK1916258T3 (da) * 1999-08-09 2014-07-28 Genzyme Corp Forøgelse af ekspression af en enkeltstrenget, heterolog nukleotidsekvens fra rekombinante, virale vektorer ved en sådan udformning af sekvensen at den danner intrastrengbasepar
US6727355B2 (en) 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
ITRM20020253A1 (it) 2002-05-08 2003-11-10 Univ Roma Molecole chimeriche di snrna con sequenze antisenso per le giunzioni di splicing del gene della distrofina e applicazioni terapeutiche.
WO2004083432A1 (fr) * 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation de la reconnaissance d'exons dans le pre-arnm par interference avec la structure d'arn secondaire

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040101514A1 (en) * 2000-03-14 2004-05-27 Yuhong Liu High transgene expression of a pseudotyped adeno-associated virus type
EP1160318A2 (fr) * 2000-04-26 2001-12-05 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Médicament pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne
WO2002024906A1 (fr) * 2000-09-21 2002-03-28 Academisch Ziekenhuis Leiden Induction d'omission d'exon dans des cellules eucaryotes
US20040040052A1 (en) * 2001-12-21 2004-02-26 Oxford Biomedica (Uk) Limited Transgenic organism

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANGELIS DE F G ET AL: "Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 99, no. 14, 9 juillet 2002 (2002-07-09), pages 9456-9461, XP002250907 ISSN: 0027-8424 *
BREMMER-BOUT MATTIE ET AL: "Targeted exon skipping in transgenic hDMD mice: A model for direct preclinical screening of human-specific antisense oligonucleotides." MOLECULAR THERAPY : THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY. AUG 2004, vol. 10, no. 2, août 2004 (2004-08), pages 232-240, XP004552204 ISSN: 1525-0016 *
BRUN C ET AL: "U7 SNRNAS INDUCE CORRECTION OF MUTATED DYSTROPHIN PRE-MRNA BY EXON SKIPPING" CMLS CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES, BIRKHAUSER VERLAG, BASEL, CH, vol. 60, no. 3, mars 2003 (2003-03), pages 557-566, XP009021235 ISSN: 1420-682X *
FLETCHER S ET AL: "Cryptic splicing involving the splice site mutation in the canine model of Duchenne muscular dystrophy." NEUROMUSCULAR DISORDERS : NMD. APR 2001, vol. 11, no. 3, avril 2001 (2001-04), pages 239-243, XP002363143 ISSN: 0960-8966 *
GOYENVALLE AURÉLIE ET AL: "Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping." SCIENCE. 3 DEC 2004, vol. 306, no. 5702, 3 décembre 2004 (2004-12-03), pages 1796-1799, XP002314369 ISSN: 1095-9203 *
GREGOREVIC PAUL ET AL: "Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors." NATURE MEDICINE. AUG 2004, vol. 10, no. 8, août 2004 (2004-08), pages 828-834, XP002314366 ISSN: 1078-8956 *
HOFFMAN E P ET AL: "Molecular pathophysiology and targeted therapeutics for muscular dystrophy" TRENDS IN PHARMACOLOGICAL SCIENCES, ELSEVIER, HAYWARTH, GB, vol. 22, no. 9, 1 septembre 2001 (2001-09-01), pages 465-470, XP004303319 ISSN: 0165-6147 *
KAPSA ROBERT ET AL: "Novel therapies for Duchenne muscular dystrophy." LANCET. NEUROLOGY. MAY 2003, vol. 2, no. 5, mai 2003 (2003-05), pages 299-310, XP002314368 ISSN: 1474-4422 *
KOBINGER GARY P ET AL: "Correction of the dystrophic phenotype by in vivo targeting of muscle progenitor cells." HUMAN GENE THERAPY, vol. 14, no. 15, 10 octobre 2003 (2003-10-10), pages 1441-1449, XP002376977 ISSN: 1043-0342 *
LI S ET AL: "Stable transduction of myogenic cells with lentiviral vectors expressing a minidystrophin" GENE THERAPY, vol. 12, no. 14, juillet 2005 (2005-07), pages 1099-1108, XP002376978 ISSN: 0969-7128 *
LIU SONGKAI ET AL: "Inhibition of HIV-1 multiplication by antisense U7 snRNAs and siRNAs targeting cyclophilin A." NUCLEIC ACIDS RESEARCH. 2004, vol. 32, no. 12, 2004, pages 3752-3759, XP002376976 ISSN: 1362-4962 *
VACEK MARLA M ET AL: "High-level expression of hemoglobin A in human thalassemic erythroid progenitor cells following lentiviral vector delivery of an antisense snRNA." BLOOD, vol. 101, no. 1, 1 janvier 2003 (2003-01-01), pages 104-111, XP002376975 ISSN: 0006-4971 *
VAN DEUTEKOM J C ET AL: "Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells." HUMAN MOLECULAR GENETICS. 15 JUL 2001, vol. 10, no. 15, 15 juillet 2001 (2001-07-15), pages 1547-1554, XP002250908 ISSN: 0964-6906 *
WANG B ET AL: "Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model." PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA. 5 DEC 2000, vol. 97, no. 25, 5 décembre 2000 (2000-12-05), pages 13714-13719, XP002949073 ISSN: 0027-8424 *

Cited By (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9447415B2 (en) 2004-06-28 2016-09-20 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9994851B2 (en) 2004-06-28 2018-06-12 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
USRE47751E1 (en) 2004-06-28 2019-12-03 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9175286B2 (en) 2004-06-28 2015-11-03 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9441229B2 (en) 2004-06-28 2016-09-13 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US10421966B2 (en) 2004-06-28 2019-09-24 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US10266827B2 (en) 2004-06-28 2019-04-23 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US10227590B2 (en) 2004-06-28 2019-03-12 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US10781451B2 (en) 2004-06-28 2020-09-22 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9249416B2 (en) 2004-06-28 2016-02-02 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US10968450B2 (en) 2004-06-28 2021-04-06 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US10995337B2 (en) 2004-06-28 2021-05-04 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9605262B2 (en) 2004-06-28 2017-03-28 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
USRE47691E1 (en) 2004-06-28 2019-11-05 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
USRE47769E1 (en) 2004-06-28 2019-12-17 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9018368B2 (en) 2004-06-28 2015-04-28 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9024007B2 (en) 2004-06-28 2015-05-05 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9035040B2 (en) 2004-06-28 2015-05-19 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9422555B2 (en) 2004-06-28 2016-08-23 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
WO2008113773A3 (fr) * 2007-03-16 2008-12-24 Biorigen S R L Technique de régulation de l'expression génétique et arn non codant à visée diagnostique et thérapeutique
US9447417B2 (en) 2008-10-24 2016-09-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US8871918B2 (en) 2008-10-24 2014-10-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9434948B2 (en) 2008-10-24 2016-09-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9234198B1 (en) 2008-10-24 2016-01-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9453225B2 (en) 2008-10-24 2016-09-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9447416B2 (en) 2008-10-24 2016-09-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US8865883B2 (en) 2008-10-24 2014-10-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
WO2010093784A2 (fr) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vecteurs viraux modifiés et procédés de fabrication et d'utilisation de ceux-ci
US10287586B2 (en) 2009-11-12 2019-05-14 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
WO2011057350A1 (fr) * 2009-11-12 2011-05-19 The University Of Western Australia Molécules antisens et procédés de traitement de pathologies
US9228187B2 (en) 2009-11-12 2016-01-05 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
US9758783B2 (en) 2009-11-12 2017-09-12 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
US10781450B2 (en) 2009-11-12 2020-09-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense molecules and methods for treating pathologies
EP3431603A1 (fr) * 2009-11-12 2019-01-23 The University Of Western Australia Molécules antisens et procédés de traitement de pathologies
US11447776B2 (en) 2009-11-12 2022-09-20 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
CN103003430A (zh) * 2009-11-12 2013-03-27 西澳大利亚大学 反义分子和治疗疾病的方法
WO2011088081A1 (fr) 2010-01-12 2011-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Répétitions terminales inversées restrictives pour vecteurs viraux
WO2011113889A1 (fr) 2010-03-17 2011-09-22 Association Institut De Myologie Snarn u7 modifiés pour traiter les maladies neuromusculaires
US9080170B2 (en) 2010-03-17 2015-07-14 Association Institut De Myologie Modified U7 snRNAs for treatment of neuromuscular diseases
EP4234571A2 (fr) 2011-02-10 2023-08-30 The University of North Carolina at Chapel Hill Vecteurs viraux à profil de transduction modifiée et procédés pour les préparer et les utiliser
WO2012109570A1 (fr) 2011-02-10 2012-08-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vecteurs viraux à profil de transduction modifiée et procédés pour les préparer et les utiliser
WO2012123430A1 (fr) 2011-03-11 2012-09-20 Association Institut De Myologie Vecteurs aav exempts de capside, compositions et procédés pour la production de vecteurs et l'administration de gènes
EP4227415A2 (fr) 2011-03-11 2023-08-16 Association Institut de Myologie Vecteurs aav exempts de capside, compositions et procédés pour la production de vecteurs et l'administration de gènes
EP2500434A1 (fr) 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Vecteurs AAV sans capside, compositions et procédés pour la production des vecteurs et la thérapie génique
WO2012136811A1 (fr) 2011-04-06 2012-10-11 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) Stimulateur spécifique d'un muscle squelettique
EP3738974A1 (fr) 2012-09-28 2020-11-18 The University of North Carolina at Chapel Hill Vecteurs vaa ciblés sur des oligodendrocytes
WO2014052789A1 (fr) 2012-09-28 2014-04-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vecteurs vaa ciblés sur des oligodendrocytes
US11932851B2 (en) 2013-03-14 2024-03-19 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
US10907154B2 (en) 2013-03-14 2021-02-02 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
US9217148B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
WO2014144229A1 (fr) 2013-03-15 2014-09-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Méthodes et compositions de double liaison de glycane de vecteurs avv
EP3838297A1 (fr) 2013-03-15 2021-06-23 The University of North Carolina at Chapel Hill Méthodes et compositions de double liaison de glycane de vecteurs avv
US12049478B2 (en) 2013-03-15 2024-07-30 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for dual glycan binding AAV vectors
US10337003B2 (en) 2013-03-15 2019-07-02 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
US10364431B2 (en) 2013-03-15 2019-07-30 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
EP3517612A1 (fr) 2013-03-15 2019-07-31 The University of North Carolina At Chapel Hill Répétitions terminales inversées de synthèse du virus adéno-associé
WO2014143932A1 (fr) 2013-03-15 2014-09-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Répétitions terminales inversées de synthèse du virus adéno-associé
US9506058B2 (en) 2013-03-15 2016-11-29 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
US11059862B2 (en) 2013-03-15 2021-07-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for dual glycan binding AAV vectors
US10077291B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for dual glycan binding AAV vectors
US10059947B2 (en) 2013-09-11 2018-08-28 Synthena Ag Nucleic acids and methods for the treatment of Pompe disease
US12091665B2 (en) 2013-09-11 2024-09-17 Synthena Ag Nucleic acids and methods for the treatment of Pompe disease
EP3480312A1 (fr) 2013-09-11 2019-05-08 Synthena AG Acides nucléiques et procédés pour le traitement de la maladie de pomp
US11104903B2 (en) 2013-09-11 2021-08-31 Synthena Ag Nucleic acids and methods for the treatment of Pompe disease
US10829764B2 (en) 2014-06-10 2020-11-10 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonucleotides useful in treatment of Pompe disease
US10308940B2 (en) 2014-06-10 2019-06-04 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonucleotides useful in treatment of Pompe disease
EP4039807A1 (fr) * 2014-06-10 2022-08-10 Erasmus University Rotterdam Medical Center Oligonucléotides antisens utilisés dans le traitement de la maladie de pompe
WO2015190922A1 (fr) * 2014-06-10 2015-12-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Oligonucléotides antisens utilisés dans le traitement de la maladie de pompe
US11859186B2 (en) 2014-06-10 2024-01-02 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonucleotides useful in treatment of Pompe disease
WO2016016449A1 (fr) 2014-07-31 2016-02-04 Association Institut De Myologie Traitement de la sclérose latérale amyotrophique
EP4344741A2 (fr) 2014-11-21 2024-04-03 The University of North Carolina at Chapel Hill Vecteurs aav ciblant le système nerveux central
WO2016115382A1 (fr) 2015-01-14 2016-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Procédés et compositions destinés au transfert de gènes ciblé
US10907176B2 (en) 2015-01-14 2021-02-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for targeted gene transfer
US10596247B2 (en) 2015-02-20 2020-03-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for attenuated chlamydia as vaccine and vector
WO2017050836A1 (fr) 2015-09-21 2017-03-30 Association Institut De Myologie Oligonucléotides antisens et leurs utilisations
US10745447B2 (en) 2015-09-28 2020-08-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for antibody-evading virus vectors
WO2017058892A2 (fr) 2015-09-28 2017-04-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Procédés et compositions pour vecteurs viraux évitant les anticorps
EP3831842A1 (fr) 2015-09-28 2021-06-09 The University of North Carolina at Chapel Hill Procédés et compositions pour vecteurs viraux évitant les anticorps
US11208438B2 (en) 2015-09-28 2021-12-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for antibody-evading virus vectors
US11840555B2 (en) 2015-09-28 2023-12-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for antibody-evading virus vectors
WO2017098187A1 (fr) * 2015-12-09 2017-06-15 Genethon Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
FR3044926A1 (fr) * 2015-12-09 2017-06-16 Genethon Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
CN108368508A (zh) * 2015-12-09 2018-08-03 吉尼松公司 用于抗肌萎缩蛋白外显子53跳读的有效基因治疗工具
US10752898B2 (en) 2015-12-09 2020-08-25 Genethon Effective gene therapy tools for dystrophin exon 53 skipping
WO2017106236A1 (fr) 2015-12-14 2017-06-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Protéines capsidiques modifiées pour la libération améliorée de vecteurs parvoviraux
US12064483B2 (en) 2017-01-06 2024-08-20 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
EP4303225A2 (fr) 2017-03-15 2024-01-10 The University of North Carolina at Chapel Hill Vecteurs viraux adéno-associés polyploïdes et leurs procédés de fabrication et d'utilisation
WO2018170310A1 (fr) 2017-03-15 2018-09-20 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vecteurs viraux adéno-associés polyploïdes et leurs procédés de fabrication et d'utilisation
EP3655535A4 (fr) * 2017-07-21 2021-04-14 The Governors of the University of Alberta Oligonucléotides antisens qui se lient à l'exon 51 du pré-arnm de la dystrophine humaine
US11142767B2 (en) 2017-07-21 2021-10-12 The Governors Of The University Of Alberta Antisense oligonucleotides that bind to exon 51 of human dystrophin pre-mRNA
US11891603B2 (en) 2017-07-21 2024-02-06 The Governors Of The University Of Alberta Antisense oligonucleotides that bind to exon 51 of human dystrophin pre-mRNA
WO2019195423A1 (fr) 2018-04-03 2019-10-10 Stridebio, Inc. Vecteurs de virus permettant de cibler des tissus ophtalmiques
US12116384B2 (en) 2018-04-03 2024-10-15 Ginkgo Bioworks, Inc. Virus vectors for targeting ophthalmic tissues
US12060390B2 (en) 2018-04-03 2024-08-13 Ginkgo Bioworks, Inc. Antibody-evading virus vectors
US12091435B2 (en) 2018-04-03 2024-09-17 Ginkgo Bioworks, Inc. Antibody-evading virus vectors
WO2019195444A1 (fr) 2018-04-03 2019-10-10 Stridebio, Inc. Vecteurs viraux évitant les anticorps
WO2019195449A1 (fr) 2018-04-03 2019-10-10 Stridebio, Inc. Vecteurs de virus évitant les anticorps
US11976096B2 (en) 2018-04-03 2024-05-07 Ginkgo Bioworks, Inc. Antibody-evading virus vectors
WO2019241324A1 (fr) 2018-06-12 2019-12-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Capsides synthétiques de virus adéno-associé du foie et leurs utilisations
EP4219717A3 (fr) * 2018-06-13 2023-12-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligomères à saut d'exon pour la dystrophie musculaire
WO2019246544A2 (fr) 2018-06-22 2019-12-26 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Vecteurs pour l'administration de gènes qui persistent dans les cellules
US11981914B2 (en) 2019-03-21 2024-05-14 Ginkgo Bioworks, Inc. Recombinant adeno-associated virus vectors
WO2020191300A1 (fr) 2019-03-21 2020-09-24 Stridebio, Inc. Vecteurs viraux adéno-associés recombinants
EP4169535A1 (fr) 2019-04-26 2023-04-26 The University of North Carolina at Chapel Hill Procédés et compositions de double liaison glycane de vecteurs de vaa2.5
WO2021076925A1 (fr) 2019-10-17 2021-04-22 Stridebio, Inc. Vecteurs de virus adéno-associés pour le traitement de la maladie de niemann-pick de type c
US11905523B2 (en) 2019-10-17 2024-02-20 Ginkgo Bioworks, Inc. Adeno-associated viral vectors for treatment of Niemann-Pick Disease type-C
WO2021089736A1 (fr) 2019-11-06 2021-05-14 Association Institut De Myologie Polythérapie pour maladies musculaires
WO2021205005A2 (fr) 2020-04-09 2021-10-14 Association Institut De Myologie Séquences antisens pour le traitement de la sclérose latérale amyotrophique
US12104163B2 (en) 2020-08-19 2024-10-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus vectors for treatment of Rett syndrome
WO2022093769A1 (fr) 2020-10-28 2022-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Procédés et compositions de double liaison glycane de vecteurs de vaa2.5
US11639509B2 (en) 2020-10-28 2023-05-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for dual glycan binding AAV2.5 vector
WO2022155482A1 (fr) 2021-01-14 2022-07-21 Stridebio, Inc. Vecteurs de vaa ciblant des lymphocytes t
WO2022155578A1 (fr) 2021-01-15 2022-07-21 Outpace Bio, Inc. Système d'expression génique régulé par petites molécules
WO2022221529A1 (fr) 2021-04-16 2022-10-20 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Virions de vaa à polyploïde rationnel traversant la barrière hémato-encéphalique et déclenchant une réponse humorale réduite
EP4119682A1 (fr) 2021-07-13 2023-01-18 Genethon Procédé permettant de déterminer la nature d'impuretés d'adn à l'intérieur de particules virales
EP4215614A1 (fr) 2022-01-24 2023-07-26 Dynacure Thérapie de combinaison pour maladies liées à la dystrophine
WO2023150687A1 (fr) 2022-02-04 2023-08-10 Ginkgo Bioworks, Inc. Vecteurs viraux adéno-associés recombinants et méthodes d'utilisation associées
US12037588B2 (en) 2022-03-04 2024-07-16 Locanabio, Inc. Compositions and methods comprising engineered short nuclear RNA (snRNA)
WO2024124019A2 (fr) 2022-12-07 2024-06-13 Ginkgo Bioworks, Inc. Vecteurs aav ciblant des cellules souches hématopoïétiques

Also Published As

Publication number Publication date
FR2874384A1 (fr) 2006-02-24
PT1778297E (pt) 2009-07-23
WO2006021724A3 (fr) 2006-08-31
US20130072541A1 (en) 2013-03-21
DE602005014114D1 (de) 2009-06-04
JP2008509695A (ja) 2008-04-03
EP1778297A2 (fr) 2007-05-02
CA2576462C (fr) 2013-03-12
EP2014309A1 (fr) 2009-01-14
US20120077860A1 (en) 2012-03-29
DK1778297T3 (da) 2009-07-27
EP1778297B1 (fr) 2009-04-22
ES2324948T3 (es) 2009-08-20
JP4885136B2 (ja) 2012-02-29
FR2874384B1 (fr) 2010-07-30
ATE429252T1 (de) 2009-05-15
CA2576462A1 (fr) 2006-03-02
PL1778297T3 (pl) 2009-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1778297B1 (fr) Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables
EP3387130B1 (fr) Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
US8236557B2 (en) Hybrid-AAV vectors to deliver large gene expression cassette
JP7416451B2 (ja) ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓによる標的化された核内ＲＮＡ切断及びポリアデニル化
JP2023011865A (ja) ＭｅＣＰ２発現カセット
EP0752004A1 (fr) Adenovirus recombinants codant pour le facteur neurotrophique des cellules gliales (gdnf)
JP2022105105A (ja) Ｐａｈ遺伝子移入のためのアデノ随伴ウイルス組成物及びそれらの使用方法
JP2023521090A (ja) ＡＡＶ遺伝子治療のためのＣｐＧフリーＩＴＲ
US20100266551A1 (en) Adeno-associated viral vectors for the expression of dysferlin
CN115029360A (zh) 用于治疗粘多糖贮积症iiia型的转基因表达盒
WO2023083718A1 (fr) Phytoecdysones et/ou dérivés de 20-hydroxyecdysone en combinaison avec un principe actif visant à restaurer l'expression smn pour leur utilisation dans le traitement de l'amyotrophie spinale
US20230211015A1 (en) Taz gene or enzyme replacement therapy
CA3194122A1 (fr) Produits et methodes de traitement de la dystrophie musculaire
EP2588610A1 (fr) Inhibiteurs de la calpaïne 3 pour le traitement de dystrophies musculaires et de cardiomyopathies
AU2022313258A1 (en) Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
Dominicus ADVANCEMENTS IN GENE THERAPY FOR DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY
WO2024020574A2 (fr) Thérapie génique auf1 pour myopathie des ceintures
Spitali et al. Duchenne Muscular Dystrophy: Therapeutic Approaches to Restore Dystrophin
McClorey The potential of antisense oligonucleotides as a therapy for Duchenne muscular dystrophy in human and canine models of the disease
CN118591396A (zh) 治疗剂的逆行冠状静脉或冠状窦施用
Le Noyau Sous-Thalamique D. Physiopathologie

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005797742

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2576462

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11573811

Country of ref document: US

Ref document number: 2007526520

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005797742

Country of ref document: EP