WO2006019182A1

WO2006019182A1 - 血液分析装置

Info

Publication number: WO2006019182A1
Application number: PCT/JP2005/015376
Authority: WO
Inventors: Yasuhiro Horiike; Akio Oki; Hiroko Kouda
Original assignee: National Institute For Materials Science
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2006-02-23
Also published as: DE112005001985T5; US20080138890A1; JP2006058093A

Description

血液分析装置技術分野

本発明は、被検物質を含む試料が導入された石英板や高分子樹脂板などの絶縁材基板に作製した超小型の溝流路によって構成された血液分析装置に関する。背景技術

従来の健康診断や疾病状態の診断は、患者から数 c Cの多量の血液を採取し、その分析に大規模な自動血液分析装置で得た測定値より行われてきた。通常、このような自動分析装置は、病院などの医療機関に設置されており、規模が大きく、また、その操作は専門の資格を有するものに限られるものであった。

しかし、近年、極度に進歩した半導体装置作製に用いられる微細加工技術を応用し、たかだか数匪から数 cm四方の基板上に種々のセンサなどの分析装置を配置して、そこに被験者の血液などの体液を導き、被験者の健康状態を瞬時に把握することができる新しいデバイスの開発とその実用化の気運が高まってきている。このような安価なデバイスの出現により、来たるべき高齢化社会において高齢者の日々の健康管理を在宅で可能にすることなどで増加の一途を迪る健康保険給付金の圧縮を図れる。また救急医療の現場においては被験者の感染症（肝炎、後天性免疫不全症候群など）の有無などを、本デバイスを用いて迅速に判断できれば適切な対応ができるなど、種々の社会的な効果が期待されるために非常に注目されつつある技術分野である。このように従来の自動分析装置に代わって、血液分析を各家庭で自らの手で実施することを目指した小型簡便な血液分析方法ならびに血液分析装置が開発されている (例えば、特許文献 1参照）。

特許文献 1に記載されたマイクロモジュール化された血液分析装置では、高分子基板上に微細な溝流路が設けられ、その一端には針が取り付けられており、他端からポンプにより針から血液を溝に導入し、 U字状流路に導入後、遠心分離で血球と血漿の分離後、当該

血漿を電気化学センサに当該ポンプによって導き、血漿中に被検物質の濃度を測定する。その結果、血液中の pH値、酸素、二酸化炭素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、グルコース、乳酸などの各濃度が測定される。

しかし、電気化学センサ一では肝機能測定用の被検物質であるァ -GTP、 GOT, GPTの各酵素の活性度や総コレステロールや中性脂肪などの濃度の測定は容易ではなく、ァ -GTP、 GOT, GPTの各酵素の活性度は、特許文献 2では比色法を用いて測定を可能にしている。従って、大規模な自動血液検査装置では、ナトリゥムゃ力リゥムなどのイオンは電気化学的に測定するが、他の項目は比色法が主流である。

特許文献 1 ：特開 2 0 0 1— 2 5 8 8 6 8号公報

特許文献 2 ：特願 2 0 0 3— 34643 6

特許文献 3 ：特願 2 0 0 3— 1 2 6 7 5 8 発明の開示

自動血液検査装置では、大量の血液を採取し、大量の血漿と多量の基質緩衝液との混合を試験管内で行い、その反応を吸光度によって測定されるが、本方法を微量の血液を導入した微細な流路からなる数 cm²の高分子などからなる基板を用いて実現するには、特許文献 2と特許文献 3 で述べられているように、まず血漿と多量の基質緩衝液の均一な混合に特殊な流路が必要になる。

特許文献 2ではチップの二つの中心を用いた遠心力による攪拌、特許文献 3では混合室を多段もうけるが、前者では二つの遠心力中心に変える機構の複雑さ、後者では、均一な混合を達成するには混合室の段数を

2/1 増加する必要があり、血液検査チップを実現するには、混合器を配置するための面積が増大する。また、血漿または血清と基質緩衝液の混合比は、被検体物質によって大きくことなるが、一般に 1 ： 1 0〜4 0と広範囲にわたり、その比率を保持するためには、血漿と基質緩衝液の厳密な抨量が極めて重要であり、これをマイクロ流路で実行するためには、血漿と基質緩衝液の蓄蔵用マイクロ流路の精密加工が求められる。また、高分子材料からなる流路基板内に基質緩衝液を長期間保管すると、高分子材料を透過する酸素によって変質し、その保管は極めて難しい。一方、基質緩衝液を保管せず、外部から枰量した液を蓄蔵用マイクロ流路に吐出すれば良いが、測定装置に基質緩衝液容器を備え、吐出用管を蓄蔵用マイクロ流路に正確な位置合わせしなければならず、測定装置の複雑化、大型化が避けられず、在宅用としては実用的でない。

一方、小型化された血液分析装置として、ドライケミストリ一法を用いたレフトロン（独国、ベーリンガー ·マンハイム）、ビトロス（米国、ジョンソン &ジョンソン）、富士ドライケム（富士写真フィルム）、スポットケム（京都第一科学）からシステムが市販されている。構造は富士ドラィケムの例を取ると、図 1に示すような構造の試薬スライド透明支持体 (プラスチックフィルム）（101)上に分析反応に必要な試薬を含有した試薬層（102)がコーティングされている。この試薬層には反応に必要な試薬が調製済みにし、ゲル中に乾燥した状態で保持されている。更にこの上に反射測光を可能にする反射層（103)と検体を均一に展開させる展開層（104)が積層された 4 層構造になっている。このフィルムの上面に 10 / L前後の血漿や血清の検体（105)が展開層に滴下されると、検体は展開層の毛管現象により横方向へ放射状に均一展開し、その後に反射層に浸透する。反射層及びゲルと混合された試薬層は血液成分を吸収し、単位面積あたりに一定量の検体を吸収して保持される。試薬層に吸収された検体と含有された試薬が反応し、検体成分に対応した発色を呈する。この呈色強度を支持体側から、発色に対応した特定の入射光（104)を照

3 射し、反射光（105)の強度を測定することで、検体中の成分濃度を算出している。ここで、（106)はスリット、（107)はプラスチック製マウントである。

ドライケミストリ一法では、乾燥状態または外観上乾燥した状態で保存された試薬が測定時に液状の試料に出会うとはじめて試薬に含まれるマトリックスにおいて化学反応が進行する検査法であり、予め試薬を調製しておくと、前述した比色法法の血漿または血清と基質緩衝液との厳密な秤量と混合が必要で無くなる大きな利点がある。

そこで、本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、石英板や高分子樹脂板などの絶縁材基板に作製した超小型の溝流路に微量 (数 L以下）の血液を導入して遠心分離を行い、当該血漿から被険を電気化学センサ用の流路とドライケミス卜リー用試薬を収納した流路に導入され、ドライケミストリー反応用流路にあっては血漿との反応によって生じる特定の発色の波長と同じ光を導入し、受光することからなる基板構造を提供することを目的とする。

本願第 1発明は、上記の課題を解決するために、基板に種々の機能を有するマイクロ流路を形成し、遠心力を用いて、血液導入口から全血試料を血球 ·血漿分離用流路に導入し基板内で血漿分画を得て、血漿を案内流路により搬送し、ドライケミストリー用試薬を収納した流路に導入して血漿中の被検成分とドライケミストリー用試薬とを反応させ、特定の測定光を導入し、透過度の変化を受光器により測定することにより血漿中の被検成分する血液分析装置を提供する。

本願第 2発明は、本願第 1発明において、採血針と全血溜め用の管が連結された採血アセンブリを本血液分析装置の基板に設けられた全血導入口に挿入し、採血アセンブリの軸方向の基板の外側に設けた第 1の回転軸を中心として回転することにより、全血を血液導入口から血液案内流路を経て血球 ·血漿分離用流路に搬送し、更に遠心力を用いて血球分画と血漿分画に分離する装置を提供する。これによつて、ポンプによ

4 る吸引や外部からの圧力、及びその案内口と管などを必要としないため装置の設計が容易になり、装置の小型化が図れる。

本願第 3発明は、本願第 1発明と本願第 2発明において、複数の溝からなる流路による血球 ·血漿用分離流路の構造を提供する。まず、全血導入口は全血搬送案内流路と連結し、全血搬送案内流路は、血液導入口を中心に略円弧に、且つ血液導入口の方向に設けられた複数の溝流路が形成された溝群の血液導入口を見て下方側が連結された一本の溝と連結し、第 1の回転軸を中心として回転することにより全血を全血搬送案内流路を経て溝流路に導入し、そのまま回転すると溝流路の下方側に血球分画が収容され、上方側に血漿分画が収容される装置を提供する。当該溝流路は、特開 2 0 0 1 - 2 5 8 8 6 8号公報に述べられ、ここでは上方側に上清された血漿中に電気化学バイオセンサーを設けておくことにより直接に被検成分を測定できる特徴がある。本発明を本願に適用すると、概ね抨量された血漿を後続の測定用流路に分配することができる。

本願第 4発明は、本願第 1発明と本願第 2発明において、血球 ·血漿分離流路は、概ね U字状流路、即ち U字が外側にわずかに開いて形成されている流路によって血漿を得る装置を提供している。 U字状流路のー端は全血導入口と連結した血液搬送案内流路と連結し、 ϋ字状流路下端から前記血液導入口を見て基板の上方に設けられた第 1の回転軸を中心として回転することにより全血を U字状流路に導入され、そのまま遠心を続けると、 U字状流路下端の湾曲部に血球分画が収容され、その上部には血漿分画が収容される装置を提供している。本願も特許文献 2の特願 2 0 0 3— 3 4 6 4 3 6に基本が提示されているが、上清の血漿をドライケミストリ一法のセンサーに導くことにより本方法の新たな応用を本願では述べている。

本願第 5発明は、本願第 1発明と本願第 3発明を基に、ドライケミス卜リー法による被検成分の測定する装置を提供している。即ち、本願第

5 3発明に記載の複数の溝流路の他端の各々は血漿案内流路と血漿秤量用血漿溜めとキヤビラリバルブと各ドライケミス卜リー用試薬導入流路がその順番で直列に接続されている。本願第 3発明に記載の第 2の回転軸を中心に回転し、遠心力により血漿分画収容部から血漿が、各血漿案内流路を経て、一旦各血漿秤量用血漿溜めに導入される。更に遠心力を増すと秤量された血漿が各キャビラリバルブを経て各ドライケミス卜リー用試薬導入流路に導入させ、更に秤量されたドライケミストリ一用試薬が導入された流路の片側から血漿が遠心力で導入される。ドライケミストリー用試薬は、血漿内に一定の濃度の被検成分と、試薬導入流路の長手方向に反応が進む。一連の血漿の搬送はポンプや空気圧を用いずに行われ、装置の動作の簡便さと小型化が達成される。

本願第 6発明は、本願第 1発明と本願第 4発明を基に、 U字状流路の他端の流路に複数の分岐した血液搬送案内流路が設けられ、当該各流路は血液溜めと枰量用血漿溜めとキヤビラリバルブと血漿導入用流路がその順番で直列に同一基板上で接続され、更に、血漿導入用流路の直下に血漿展開層が設けられ、その直下に垂直方向に一致して接合された複数の孔を設けた領域を有する基板と当該孔基板の直下に設けられたドライケミストリー試薬注入比色測定用流路がこの順番で接合されたことによって積層基板が形成された装置を提供している。血漿展開層と複数の孔を設けた領域とドライケミストリー試薬注入比色測定用流路の各面積は等しい。そして、 U字状流路と略直交方向で、当該流路から見て基板の外側に位置する第 2の回転軸を中心に回転させると、遠心力により U字状流路内の血漿をドライケミストリー試薬注入比色測定用流路に導入される。

血漿展開流路からの血漿はその下部にある孔を通してドライケミストリー用試薬用流路に導入されるが、その導入に用いる遠心力は孔と直角方向にある。しかし、血漿溜め用流路の遠心力が印加される方向の端が壁となり、また血漿溜め用流路に血漿が満たされているため、遠心力

6 によって圧力を受けた血漿が下部の孔へ導入されることになる。このように遠心力を用いるだけで血漿をドライケミストリー用試薬用流路に導入できる。

本願第 7発明は、本願第 5発明と本願第 6発明の秤量用血漿溜めの上流側の壁に過剰血漿収容溜めを設けた装置を提供する。決まった量の血漿を血漿溜めに遠心力で導入する際、過剰な血漿が導入されると、側壁に設けた廃棄血漿搬送案内流路を経て外部の廃棄血漿溜めに廃棄され、秤量用血漿溜めへの正確な血漿量を提供する。

本願第 8発明は、本願第 5発明と本願第 6発明に記載のドライケミス卜リ一用試薬の決まった量を流路に収めるために流路へ試薬を注入し、過剰な試薬は排出するため、ドライケミストリ一用試薬流路に注入口と排出口を設けたことを特徴とする装置を提供する。

ドライケミストリ一試薬はゲル状で調製され、本願によって一定量のゲルをマイクロ流路に導入することが容易になる。

本願第 9発明は、本願第 6発明に記載のドライケミストリ一試薬比色測定用流路にあっては、長手方向の流路の両端は 45度の壁が設けられ、その内部には金属などが塗布され、 45度の壁で光が反射するよう基板の下部または上部から垂直に光導入用と射出用ファイバーが導入されたことを特徴とする装置を提供する。

ドライケミストリ一用試薬は、導入血漿中の被検成分やアンモニアと反応して発色や着色するが、その度合いを調べる比色測定用流路において、特定の波長を基板の下部または上部から導入し、流路内を内壁による光吸収などによる減衰が無く伝播させ、発色や着色などの化学反応のみによる導入光の減衰度を検出器により測定し、且つ外部からの迷光の侵入することを防止するため、流路内部には金属などの光漏洩や侵入を防止する材料が塗布され、更に長手方向の流路の両端は 45度の壁が設けられ、その付近に光導入用と射出用ファイバーが導入されるため、 45 度の壁で光が反射して光導入と受光が高効率で行える。

7 本願第 1 0発明は、本願第 6発明に記載のドライケミストリー試薬注入比色測定用流路にあっては、本願第 9発明と当該測定用流路の内部を金属など光遮蔽材で覆う点は同じであるが、長手方向の流路の両端は流路軸と一致した両方向に光導入用と射出用ファイバーが導入された装置を提供する。

本願第 1 1発明は、本願第 6発明に記載のドライケミストリー試薬注入比色測定用流路にあっては、秤量された一定の血漿とドライケミス卜リー試薬を含有したゲルが反応して膨潤する際、その膨潤量を予め測定しておき、当該流路をその膨潤した容積で設計 ·製作された装置を提供する。

本願第 1 2発明は、本願第 6発明に記載のドライケミストリー試薬注入比色測定用流路にあっては、秤量された一定の血漿がドライケミストリ一試薬を含有したゲルが反応して膨潤しても、一定の流路容積で設計 ·製作された装置を提供する。

ゲルは通常 2倍から 5倍程度に膨潤するが、本願第 1 1発明では、膨潤した全量に特定光を導入してその減衰度を測定でき、 S/N比の大きい測定値が得られるが、逆に減衰度が大き過ぎて測定が困難になる場合もあり、流路が基板に占める面積が大きくなり基板面積が拡大する。一方、本願第 1 2発明では、大きく膨潤した試薬に対しては、導入試薬が本願第 8発明により排出されるため、測定光の減衰度が小さく、 S/N比の低い測定になるが、使用者の被検成分の濃度を予め知っておくことや測定可能なドライケミストリー試薬を調製しておくことにより、一定容積の流路でも多項目の被検成分濃度の測定が可能になる。現実の基板では両発明を併用する。

本願第 1 3発明は、本願第 6発明に記載のドライケミストリ一試薬注入比色測定用流路にあって、アンモニアガス発生用ドライケミストリー試薬流路の基板と多数の孔を設けた基板とアンモニアガス検出用発生用発色材導入比色測定用流路は、この順番で垂直方向に一致して積層さ

8 れ、更に他の項目の検出用流路とアンモニア発生用流路が同一基板内に設けた装置を提供する。尿酸やクレアチニンや尿素窒素の測定では、直接測定することは難しく、各酵素と反応した後にアンモニアガスが発生するが、アンモニアガス発生用流路から発生したアンモニアガスは均一にアンモニアガスと反応して発色する試薬が導入された流路に導入されねばならないが、本発明はそれを可能にする。

本願第 1 4発明は、本願第 1発明に記載のドライケミストリ一試薬を用いた血漿からの被検成分の測定法に加え、従来の電気化学センサーによる被検成分の測定法が同一積層基板に構成された血液分析装置を提供する。

一般の診断では、 Na+、 K+、 Ca⁺⁺、 pHなどの測定は必須であるが、これらをドライケミストリー試薬で測定することは困難であり、多項目を同時に採取した血液から同時に被検成分を測定することにより診断の正確さが増す。図面の簡単な説明

図 1は、従来のドライケミストリーを用いた診断チップの構造を示す図である。

図 2は、血液検査装置を構成する各積層基板のうち、最上層基板を模式的に例示した図である。

図 3は、血液検査装置を構成する各積層基板のうち、全血導入、血球 · 血漿分離、血漿の搬送、血漿の秤量、キヤビラリバルブ、ドライケミス卜リー試薬導入流路、及びアンモニアガス発生試薬導入流路などからなる第 2層基板を模式的に例示した図である。

図 4は、血液検査装置を構成する各積層基板のうち、アンモニアガス展開用の多数の孔などからなる第 3層基板を模式的に例示した図である。

図 5は、血液検査装置を構成する各積層基板のうち、アンモニアガス

9 反応発色剤試薬導入流路などからなる第 4層基板を模式的に例示した図である。

図 6は、血液検査装置を構成する各積層基板のうち、最下層基板を模式的に例示した図である。

図 7は、アンモニアガス検出以外の検査項目用流路を設けた積層基板の構造を示す図である。

図 8は、アンモニアガス検出用の流路（223)を含む多層の流路構造を示す図である。

図 9は、複数の比色センサーと複数の電気化学センサ一を一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板のうち、最上層基板を模式的に例示した図である。

図 1 0は、複数の比色センサーと複数の電気化学センサ一を一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板のうち、第 2層基板を模式的に例示した図である。

図 1 1は、複数の比色センサーと複数の電気化学センサーを一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板のうち、第 3層基板を模式的に例示した図である。

図 1 2は、複数の比色センサーと複数の電気化学センサーを一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板のうち、最下層基板を模式的に例示した図である。

図 1 3は、電気化学センサー領域の図 12 に一点斜線で示した構造の断面を示す図である。

図 1 4は、ブドウ糖標準液中のグルコース濃度に対する吸光度の関係を示す図である。

図 1 5は、尿素標準液の尿素濃度変化に対する吸光度の関係を示す図である。

なお、図中の符号は次のものを示す。

101 試薬スライド透明支持体（プラスチックフィルム）

10 102 分析反応に必要な試薬を含有した試薬層

103 反射層

104 展開層

105 血漿や血清の検体

106 スリット

107 プラスチック製マウント

201 最上層基板

202 第 2層基板

203 第 3層基板

204 第 4層基板

205 最下層基板

206 基板接続用孔

207 基板接続用孔を貫通する円柱

208 スティンレス管製針

209 スティンレス管

210 ガラス管

211 血液搬送案内流路

212 第 1の回転軸

213 複数の血液溜め溝

214 第 2の回転軸

215 血液搬送案内溝

216 抨量用血漿溜め

217 空気導入孔

218 案内溝

219 空気導入孔

220 過剰血漿案内流路

221 過剰血漿廃棄溜め

222 キヤビラリバルブ

11 223 アンモニアガスの検出用流路

224 アンモニアガス以外の検査項目用流路

225 ゲルの導入口

226 ゲルの排出口

227 4 5度の傾斜壁

228 貫通孔

229 ファイバー

230 アルミ膜

231 ハロゲンランプやタングステンランプ 232 バンドパスフィルター

233 受光器

234 多数の孔

235 アンモニアガス反応発色剤含有流路

236 4 5度の傾斜壁

237 アルミ膜

238 ファイバー用貫通孔

239 ファイバー

240 注入孔

241 排出孔

242 ガラス管挿入孔

501 最上層

502 第 2層

503 第 3層

504 最下層

505 基板接続用貫通孔

506 貫通孔に揷入される円柱

507 無痛針

508 スティンレス管

12 509 ガラス管

510 概ね U字管

511 第 1の回転軸

512 血球溜め

513 血球逆流防止用柱

514 第 2の回転軸

515 血漿溜め

516 血漿搬送案内流路

517 キヤビラリバルブ

518 血漿秤量用血漿溜め

519 血漿導入用流路

520 廃棄血漿搬送案内流路

521 廃棄血漿溜め

522 血漿展開層

523 ドライケミストリ一比色法のセンサー領域 524 電気化学センサー法のセンサー領域

525 較正液の導入口

526 較正液導入案内流路

527 較正後廃液案内流路

528 廃液口

529 多数の孔を設けた領域

530 ドライケミストリー比色法のセンサー領域

531 電気化学センサー法のセンサー領域

532 ドライケミストリー試薬注入比色測定用流路

533 ドライケミストリー試薬注入比色測定用流路

534 ドライケミス卜リー試薬注入比色測定用流路

535 ドライケミストリー試薬注入比色測定用流路

536 注入口

13 537 排出口

538 測定光の入射口

539 射出口

540 ファイバー

541 ファイバ一

542 電気化学センサー領域

543 AgZAgC l電極'

544 KC1飽和 Ag/AgCl参照電極

545 銀カーボン配線

546 信号取り出し用の外部電極

547 ィオノフォア膜

548 KC1溶失防止膜

549 ガラス管揷入孔発明を実施するための最良の形態

第 1実施形態

図 2〜図 6は血液検査装置を構成する各積層基板を示し、図 2は最上層基板（201)、図 3は第 2層基板（202)、図 4は第 3層基板（203)、図 5 は第 4層基板（204)、図 6は最下層基板（205)である。各基板は厚さが 0. 5匪のポリカーボネート製であり、流路ゃ孔は射出成型で形成する。勿論、リソグラフィによって作製した SU-8などのパターンを PET (ポリエチレンテレフ夕レート）板などの高分子基板にモールドすることによつても作製され、製法に特徴があるものではない。図 2〜図 6の各積層基板に設けられた孔（206)は、（207)の円柱が孔（206)へ挿入されることによって、最下層基板（205)の上に第 4層基板（204)、第 4 層基板（204)の上に第 3層基板（203)、第 3層基板（203)の上に第 2層基板（202)、そして第 2層基板（202)の上に最上層基板（201)が接続され、各基板は接着剤などにより接着される。その結果、各基板に設けられた流路の位置が決

14 められ、各基板間の溶液の流れが可能になる。次に第 2層基板（202)について説明する。（208)は外径 100 ΠΙ、内径 50 πιのスティンレス管であり、先端は 10度で三面研磨が行われた無痛針を示す。内壁を超平滑化に研磨してあるため、静脈に刺すと、血圧により自動的に採血できる。また（209)は外径 250 /i mのスティンレス管であり、（208)と接着されている。（210)は外径 1. 8匪、内径 1顴のガラス管であり、（209)と接着され、無痛針（208)から採取された血液は、ガラス管（210)に溜められる。（211)は基板（202)に加工された血液搬送案内流路であり、第 2層基板 (202)の第 1の回転軸（212)を中心として遠心力を印加すると、複数の血液溜め溝（213)に導入される。更に遠心を続けると、第 1の回転軸（212) を見て外側に血球が、内側に血漿が分離される。次に、第 2の回転軸（2 14)を中心に遠心力を印加すると、上清の血漿が血液搬送案内溝（215)を経て抨量用血漿溜め（216)に導入される。その際、導入を可能とするため空気導入孔（217)とその案内溝（218)を設けてある。空気導入孔（217) は、最上層基板（201)の空気導入孔（219)と直結している。秤量用血漿溜め（216)を満たした後の過剰な血漿は過剰血漿案内流路（220)を経て過剰血漿廃棄溜め（221)に捨てられる。更に、第 2の回転軸（214)を中心として 1000G以上の遠心力を印加すると（216)に抨量用溜めてあった血漿はキヤビラリバルブ（222)を介して、基板（202)に設けられた複数の流路に導入される。

前述のキヤビラリバルブに関しては、 Nam- Trung Nguyen と Steven T. Were l eyの著作による「Fundamental s and Appl icat ions of

Microf lud icsj (発行所： Artech House (Bos ton - London) 2002)の 315 ページに述べられている。簡単に説明すると、細管（キヤビラリ）に溶液が存在する時、細管の軸方向の一端の延長上に回転軸があり、細管の他端に溶液が表面張力で溜まっているとすると、その回転軸を中心に回転すると、小さい遠心力ではこの溶液は細管の他端からは吐出しないが、遠心力を増していくと遂に表面張力を勝り、溶液が吐出する。従って、

15 遠心力の大小がバルブの働きをするのでキヤビラリバルブと呼ぶ。溶液が細管から吐出する最小の回転数 fmは、溶液が回転軸から、回転軸側の細管半径と吐出側の半径 R₂の間に存在し、溶液が細管から吐出する時の溶液の細管に対する接触角を 0、表面張力をァ、細管の半径を R、溶液の密度を p とすると、以下の関係にある。

fm² > r cos 0 /R - p · π ² · (R₂-R,) (R₂+R,)

25での水の Ύは 72 x lO-³ [N/m]であり、 PETを基板として用いた場合、水との接触角 Θ は 80度となり、水の p は l x i0³ [kg/m³]なので、これらの値を用いると、この式から、 R₂を 5cm、キヤビラリバルブの長さ、つまり ₂- ）を 0. 5cm、その直径（2R)を 100 /z m程度に形成すれば、 fm が約 1000回転/秒以上の時に血漿が抨量用血漿溜めからドライケミス卜リー試薬流路に流れ込む。この時の重力加速度は 60G以上となる。

ドライケミストリ一では少なくとも 2種類の反応系がある。その一つはクレアチニンや尿素窒素の測定と、他一つはグルコース、ァ- GTP、 GO T、 GPTや総コレステロールなどの測定である。前者の測定は、まずクレァチニンの場合は、クレアチニンディアミラーゼ、尿素窒素の場合はゥレアーゼの各酵素との反応でアンモニア（NH₃)ガスが発生し、その NH₃ガスは各々ブロムクレゾールグリーンやブロムフエノールブルーと反応して発色させる 2段階の反応を用いる。一方、上記の他の被検物質は、それぞれの反応に応じての酵素と発色試薬を含有したゲルと一段階の反応で検出する。そこで、（223)は NH₃の検出用流路を示し、（224)は NH 3以外の検査項目用流路を示し、それぞれ上述のゲルが満たされている。図 7 は、 NH₃以外の検査項目用流路を設けた積層基板の構造を示す。最上層基板（201)の孔（225)と孔（226)は各々、当該ゲルの導入口と排出口であり、導入口の径は排出口の径より大きく、試薬を含有したゲルの導入はマイクロディスペンサーで行われる。導入口と排出口は、（223) と（224)の 2 つの異なる反応系の流路に注入し、内部を満たした後の余分なゲルを排出するためと、血漿がゲル中に遠心力で導入されると、ゲ

16 ルの種類にもよるが、 2〜5倍に膨潤するため、膨潤したゲルを外部に排出するための孔である。また、流路（224)の長手方向の両端には 45度の傾斜壁（227)が形成されている。その内壁はアルミ膜がスパッ夕蒸着され、第 3層基板（203)、第 4層基板（204)、最下層基板（205)に貫通孔（22 8)を設け、その中にファイバー（229)が挿入され、その端面が流路の 45 度の傾斜壁の下方に留める。アルミ膜（230)を流路（224)の内壁にスパッ夕蒸着する方法は、まず最上層基板（201)と第 2層基板（202)を接触させ、第 2層基板（202)の裏面からアルミをスパッタ蒸着し、流路以外の部分のアルミ膜は CMP (化学的機械研磨）によって除去する。次に、第 2層基板（202)から最上層基板（201)を除去して、第 2層基板（202)と第 3層基板（203)を接触させ、最上層基板（201)の上方からアルミをスパッ夕蒸着し、流路以外の部分のアルミ膜は CMPによって除去する。なお、アルミの他、光が流路から外部に逃げず、流路内で効率よく反射する材料であるならば金属の他いかなる材料でも良い。ファイバー（229)には、（23 1)のハロゲンランプやタングステンランプから（232)のバンドパスフィルターを介して選択した波長の光を導入し、（233)の受光器によってその減衰度を測定する。

図 8は、アンモニアガス検出用の流路（223)を含む多層の流路構造を示す。第 3層基板（203)には、アンモニアガスを通す役割の直径 5 Π！〜 5 Ο ΠΙ程度の多数の孔（234)が設けられている。この多数の孔を設けた領域の面積は第 2層基板（202)に設けたアンモニアガス発生用試薬を収容した流路（223)と同じ面積を有する。この孔領域（234)はドライケミストリーの展開層の役目も果たす。図 4にはその鳥瞰図を示す。当該孔の作成法は、大きい径の場合は、スティンレスや高分子製のメッシュや射出成型で形成可能だが、小さい径の場合はシリコン基板にディープエッチングで形成される。多数の孔（234)を通過した ΝΗ₃ガスは、第 4層基板（ 204)と最下層基板（205)に形成した図 8で述べた流路に導入される。流路内壁へのアルミ膜のコーティング形成法は前述と同様である。流路（2

17 35)にはアンモニアガスと反応して発色する試薬を含有したゲルが導入される。ここで、（236)は 45度の傾斜壁、（237)アルミ膜、（238)フアイバ一用貫通孔、（239)はファイバー、（240)と（241)はそれぞれアンモニァガス反応発色試薬含有ゲルの注入孔と排出孔である。ランプ、パンドパスフィルター、受光器などの光学部品の図示は省いた。

第 2実施形態

図 9〜図 1 2は、複数の比色センサーと複数の電気化学センサーを一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板示す。一般に、診断にとっては基本的に必要な pHや Na⁺⁺、 K+、 CI—、 Ca⁺⁺などイオンの濃度測定も必要であり、 pHはアンべロメトリ、 Na⁺⁺と K+と C1-と Ca⁺⁺の各濃度はポテンシオメトリによる電気化学的方法によって測定される。従って、比色センサーと電気化学センサーの両方を一つの基板に集積化し、一度の採血で測定することが望ましい。この比色センサ一群には NH₃検出用の比色センサ一を構成が煩雑になるので搭載しなかったが、 N H₃を検出する場合は、図 2〜図 6と同様に NH₃ガスの発生層が追加される。

図 9は最上層（501)、図 1 0は第 2層（502)、図 1 1は第 3層（503)、図 1 2は最下層（504)であり 4枚の基板からなる。図 2〜図 6と同様に図 9〜図 1 2の各積層基板にあっては、（506)の円柱が孔（505)へ挿入されることによって、最下層（504)の上に第 3層（503)、第 3層（503)の上に第 2層（502)、そして第 2層（502)の上に最上層（501)が接続され、各基板は接着剤などにより接着される。まず、第 2層基板（502)では、図 3 と同様に、無痛針（507)からスティンレス管（508)を経て（509)のガラス管に接続され、ガラス管（509)に血液が採取される。採血は、開いた概ね U字管（510)に第 1の回転軸（511)を中心に遠心力によって導入され、更に遠心を続けると、第 1の回転軸（51 1)を見て外側に血球分画が、内側に血漿分画が分離され、血球分画は血球溜め（512)に溜められる。（ 513)は血球が U字管に戻ることを防ぐ柱である。次に、第 2の回転軸（5

18 14)を中心に遠心力を印加すると、上清の血漿が一旦血漿溜め（515)に導入される。更に、回転を続けると、血漿搬送案内流路（516)を経て、更に 60G以上の重力加速度の遠心力によってキヤビラリバルブ（517)を通過して血漿秤量用血漿溜め（518)と血漿導入用流路（519)に導入される。その際、血漿秤量用血漿溜め（518)の側壁に秤量後の余分な血漿を廃棄血漿搬送案内流路（520)を経て廃棄血漿溜め（521)に廃棄される。血漿導入用流路（519)の直下には血漿展開層（522)が設けられ、一旦血漿を平板上に拡大した。ここで、（523)はドライケミストリ一比色法のセンサー領域を示し、（524)は電気化学センサー法のセンサ一領域を示す。電気化学センサーは測定前に較正しなければならず、（525)は較正液の導入口、（526)は較正液導入案内流路、（527)は較正後廃液案内流路、（528) は較正後廃液の廃液口を示す。

図 1 1に示すように、血漿展開層（522)の直下に、第 3層（503)に図 4 と同様に直径 5 n！〜 50 z m程度の多数の孔を設けた領域（529)を形成し、この領域の面積と位置は血漿展開層（522)と一致させる。ここで、（530) はドライケミストリー比色法のセンサ一領域を示し、（531)は電気化学センサー法のセンサ一領域を示す。

図 1 2に示すように、最下層（504)には、血漿展開層（522)の直下の同位置に、同面積のドライケミストリ一試薬注入比色測定用流路（532)、 (533)、（534)、（535)が接合される。これらの流路の内壁は、図 7で述ベた方法に準じてアルミなどの光を反射させる金属がコートされている。（536)と（537)はそれぞれドライケミストリー試薬の注入口と排出口である。ドライケミストリ一試薬注入比色測定用流路（531)の長手方向の側壁の一端には測定光の入射口（538)と他端には流路を伝播した後の射出口（539)が設けられ、各口にはファイバ一（540)と（541)が接続され、測定光の入射と受光光への射出の役割を果たす。両ファイバ一はドライケミストリ一試薬注入比色測定用流路（532)〜（535)の長手方向の中心軸と一致して基板（504)に設けられる。試薬の発色による導入光の減衰

19 度を光ダイオードなどによるフォトディテクタ一により検出する。

血漿展開流路（522)からの血漿はその直下にある多数の孔が形成された領域（529)を通してドライケミストリ一用試薬用流路（532) ~ (535)と電気化学センサー領域（542)に導入されるが、その導入に用いる遠心力は孔と直角方向にあり、垂直方向には遠心力が働かない。しかし、血漿溜め用流路の遠心力が印加される方向の端が壁となり、また血漿溜め用流路に血漿が満たされているため、遠心力によって圧力を受けた血漿が下部の孔へ導入されることになる。このように遠心力を用いるだけで血漿をドライケミストリ一用試薬用流路（532)〜（535)と電気化学センサ —領域（542)に導入できる。

(532)〜（535)の流路の長手方向の長さが異なって示されている理由を以下に述べる。試薬をゲルに分散させる際、試薬とゲルとを馴染ませるためには各試薬に適したゲルが必要であるが、各種のゲルが血漿と反応するとゲルの膨潤度が異なり、通常、ゲルは通常 2倍から約 5倍程度に膨潤する。そこで、ドライケミストリ一用試薬用流路（532) ~ (535)は、抨量され供給された血漿と最大限にゲルと反応させるため最適な長さで設計されなければならない。試薬を含有したゲルの注入口と排出口の (536)と（537)は、流路の容積を越えて膨潤したゲルを外部に排出する役目も果たしている。しかし、膨潤した全量に特定光を導入してその減衰度を測定でき、 S/N比の大きい測定値が得られるが、逆に減衰度が大き過ぎて測定が困難になる場合もあり、流路が基板に占める面積が大きくなり基板面積が拡大する。

一方、図 3における NH₃の検出用流路（223)と NH₃以外の検査項目用流路（224)は同じ面積と体積で示した。大きく膨潤した試薬に対しては、導入試薬が排出孔から排出されるため、測定光の減衰度が小さく、 S/N 比の低い測定になるが、使用者の被検成分の濃度を予め知っておくことや測定可能なドライケミストリー試薬を調製しておくことにより、一定容積の流路でも多項目の被検成分濃度の測定が可能になる。現実の基板

20 では両発明を併用する。

(542)は電気化学センサ一領域である。（543)は Ag/AgCl電極であり、その上に Na⁺や K+イオン用のィオノフォアを含むセンサー膜が塗布されている。（544)は KC 1飽和 Ag/AgCl参照電極であり、これらの電極は銀カーボン配線（545)に設けられ、（546)は信号取り出し用の外部電極である。

図 1 3は電気化学センサー領域（542)の図 1 2に一点斜線で示した構造の断面を示す。

電気化学センサーは血漿導入前にまず較正される。その後、第 2層（502) に設けられた血漿搬送案内流路（516)を経て、更に 60G以上の重力加速度の遠心力によってキヤビラリバルブ（517)を通過して血漿秤量用血漿溜め（518)と血漿導入用流路（519)と血漿展開層（522)に導入され、多数の孔が形成された領域（529)を通して電気化学センサー領域（542)に導入される。ここで、（547)はィオノフォア膜、（548)は KC 1飽和 AgZAgCl 参照電極の KC1が電解液に溶失するのを防止する膜である。実施例

第 1実施例

ぐグルコース測定 >

図 2〜図 6を基にした血液分析装置を用いて、グルコース測定を行つた例を示す。測定原理は、試料に発色試薬を作用させると、試料中のグルコースは発色試薬中に含まれるム夕ロ夕一ゼの作用により α型から 13型へすみやかに変換する。 |3 -D-グルコースは、グルコースォキシダーゼ（GOD)の作用を受けて酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素は、共存するペルォキシダ一ゼ（POD)の作用により、発色試薬中のフエノールと 4-ァミノアンチピリンとを定量的に酸化縮合させ、赤色（505nm)の色素を生成させる。この赤色の吸光度を測定することにより弒料中のグルコース濃度を求める。

21 ドライケミストリー試薬として、（1)黒かぴ Aspergi l ius niger 由来のグルコースォキシダ一ゼを 1. 8ϋ、 (2) 1, 7-ジヒドロォキシナフタレンを 0. 03mg (0. 188 mol)、 (3) 4-ァミノアンチピリンを 0. lig (0. 492 IO1)、 (4)ペルォキシダ一ゼを 0. 13U、（5)ム夕ロターゼ（ブタ腎臓由来）を 0. 065Uの粉末を混合し、燐酸緩衝液に溶解させる。次に、その溶解液をゼラチンに全てを含有させ、ゼラチンゲルを形成する。これをドライケミストリー試薬注入比色測定用流路に注入する。当該比色測定用流路は 0. 4腿 X 0. 4龍の断面積で長さは 1匪であった。その中に前述のゲルを注入し、更に 0. 2 i L のブドウ糖標準液をグルコース濃度を Omg/dl から 600ig/dlに変化させた。この流路に 505nmの光を入射させて得られた吸光度を図 14に示す。この結果より良好に検出されたことが分かる。第 2実施例

ぐ尿素窒素測定 >

図 7〜図 12 を基にした血液分析装置を用いて、尿素窒素測定を行つた例を示す。

尿素窒素（H₂NC0NH₂)は水の存在下でゥレアーゼの作用で NH₃と C0₂に分解され、この NH₃はブロムクレゾールグリーンと反応して青色（620ηπι) 色素を生じる。尿素測定は以下のように測定された。デンプンーァクリルニトリルからなる吸水性ポリマー lOmg に 2mL のゥレアーゼ溶液を含ませたゲル状のものを 0. 4腿 X 0. 4匪の断面積で長さは 1匪の NH₃発生用流路に注入した。発色剤は、エタノール 2mLにブロムクレゾールグリーン（BCG) 3¾ (重量比）を溶いたものに、イソプロビルアルコール 20mLとその 5¾重量比の PVB (ポリビニールプチラール） 1. 28mg を合わせて溶かし込んだものを調製し、発色用流路に注入した。多数の孔が形成された基板の厚さは 1. 2匪であった。図 15は、 lOmgから 50mgの尿素標準液を作製し、 620nmの光を入射したときの吸光度を示す。この結果より良好に検出されたことが分かる。

22 発明の効果

以上のように、本発明の血液分析装置は、全血の基板への導入、血球 · 血漿分離、血漿の秤量、及びドライケミストリー試薬への展開の一連の動作をポンプを一切使わずに遠心力で行い、ドライケミストリー試薬が導入された流路の長手方向の光の減衰を測定することから、極微量血液の血漿中から多項目の被検成分を測定可能とすることが可能な安価 ·簡便な多項目の血液分析装置を実現できる。

アンモニアガスの測定には、アンモニアガス発生層と展開層とアンモニァガスと反応して発色層が積層分離構造になっているため、アンモニァガスの高感度測定を可能にした血液分析を実現できる。その結果、ァンモニァガス測定を含むドライケミストリ一比色法センサ一に加え電気化学センサーを併用できるので通常の血液検査項目のほとんどを測定可能になり、べッドサイドのみならず無痛針の使用により在宅での診断が実現される。

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Claims

請求の範囲

1 . 血液導入口とこれに連結された全血搬送案内流路並びに血球 ·血漿分離用流路、血漿案内流路とを有し、遠心により血液導入口から全血試料を導入し、血球 ·血漿分離行い、血漿を案内流路により搬送し、ドライケミストリー用試薬を収納した流路に導入し、血漿中の被検成分とドライケミストリー用試薬とを反応させ、特定の測定光を導入し、透過度の変化を受光器により測定する各手段を備えた積層基板により血漿中の被検成分する血液分析装置。

2 . 血液導入口には略直線状に連結した採血針と採血した血液溜めが連結され、更に血液導入口は全血搬送案内流路を経て血球 ·血漿分離用流路と連結し、血球 ·血漿分離用流路から血液導入口を見て上方に第 1 の回転軸を中心として回転することにより全血を血液導入口から血液案内流路を経て血球 ·血漿分離用流路に搬送し、血球分画と血漿分画に分離することを特徴とする請求項 1の血液分析装置。

3 . 全血搬送案内流路と血球 ·血漿用分離流路は、血液導入口を見て下方に設けられ、血球 ·血漿用分離流路は血液導入口を中心に略円弧に、且つ血液導入口に向かって複数の溝流路が設けられ、当該溝流路の血液導入口を見て下方側は一つの流路で連結され、第 1の回転軸を中心として回転することにより全血を、当該溝流路の下方側に血球分画を収容し、上方側に血漿分画を収容することを特徴とする請求項 1または 2の血液分析装置。

4 . 血球 ·血漿分離流路は、概ね U字状流路で形成され、一端は全血導入口と連結した血液搬送案内流路と連結し、 U字状流路下端から前記血液導入口を見て基板の上方に設けられた第 1の回転軸を中心として回転することにより全血を、 ϋ字状流路に導入し、 U字状流路下端の湾曲部には前記血球分画収容部が設けられ、その上部が血漿分画収容部とされていることを特徴とする請求項 1または 2の血液分析装置。

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5 . 請求項 3に記載の血液分析装置にあって、複数の溝流路の他端の各々は血漿案内流路と血漿抨量用血漿溜めとキヤピラリバルブと各ドライケミストリー用試薬導入流路がその順番で直列に接続され、複数の溝流路の下方側の外側に設けた第 2の回転軸を中心に回転し、遠心力により血漿分画収容部から血漿が、各血漿案内流路と各血漿案内流路と各血漿抨量用血漿溜めと各キヤビラリバルブを経て各ドライケミストリ一用試薬導入流路に導入することを特徴とする血液分析装置。

6 . 請求項 4の血液分析装置にあって、 ϋ字状流路の他端の流路に複数の分岐した血液搬送案内流路が設けられ、当該各流路は血液溜めと秤量用血漿溜めとキヤビラリバルブと当該血漿抨量用血漿溜めと血漿導入用流路がその順番で直列に接続され、血漿導入用流路の直下に血漿展開層が設けられ、当該血漿展開層の直下に垂直方向に一致して接合された血嫫展開層と同面積の複数の孔を設けた領域を有する基板と当該孔基板の直下に設けられた血漿展開層と同面積のドライケミストリー試薬注入比色測定用流路がこの順番で接合されたことにより形成された積層基板を、 U字状流路と略直交方向で、当該流路から見て基板の外側に位置する第 2の回転軸を中心に回転させ、遠心力により U字状流路内の血漿をドライケミストリー試薬注入比色測定用流路に導入することを特徴とする血液分析装置。

7 . 請求項 5または 6の血流分析装置の抨量用血漿溜めにあって、当該血漿溜めの側壁に廃棄血漿搬送案内流路とそれに連結した廃棄血漿溜めを設けたことを特徴とする 5または 6の血液分析装置。

8 . 前記ドライケミストリー用試薬を収める流路へ当該試薬の注入口と排出口を設けたことを特徴とする請求項 5または 6の血液分析装置。

9 . 前記ドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、長手方向の流路の両端は 45度の壁が設けられ、その全内部には金属が塗布され、 45度の壁基板の下部または上部から垂直に 45度の壁の近傍に光導入用と射出用フアイパーが導入されたことを特徴とする請求項 6の血

25 液分析装置。

1 0 . 前記ドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、その内部に金属を塗布され、長手方向の流路の両端の壁には流路軸と一致した両方向から光導入用と射出用ファイバーが導入されたことを特徴とする請求項 6の血液分析装置。

1 1 . 前記ドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、血漿と反応してドライケミストリー試薬を含有したゲルが膨潤する容積を有することを特徴とする請求項 6の血液分析装置。

1 2 . 前記ドライケミストリ一試薬比色測定用流路にあっては、同一の容積を有することを特徴とする請求項 6の血液分析装置。

1 3 . 前記ドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、アンモニァガス発生用ドライケミストリ一試薬流路の基板と多数の孔を設けた基板とアンモニアガス検出用発生用発色材導入比色測定用流路は、この順番で垂直方向に一致して積層され、アンモニアガス発生用ドライケミストリ一試薬流路と多数の孔を設け領域とアンモニアガス検出用発生用発色材導入比色測定用流路は、同面積を有し、更に他の項目の検出用流路がアンモニア発生用流路と同一基板内に設けたことを特徴とする請求項 6の血液分析装置。

1 4 . ドライケミストリー試薬を用いた比色法センサーと電気化学センサ一が積層基板から構成された血液分析装置に設けられたことを特徵とする請求項 1の血液分析装置。

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