WO2006018551A1 - Nouveau peptide et composition pharmaceutique le contenant - Google Patents

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WO2006018551A1
WO2006018551A1 PCT/FR2005/001999 FR2005001999W WO2006018551A1 WO 2006018551 A1 WO2006018551 A1 WO 2006018551A1 FR 2005001999 W FR2005001999 W FR 2005001999W WO 2006018551 A1 WO2006018551 A1 WO 2006018551A1
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Patricia Rousselle
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Laboratoires D'anjou
Centre National De La Recherche
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide, to a pharmaceutical composition comprising this peptide and to the use of such a composition for the treatment of skin disorders of various origins.
  • the treatment of said alterations consists in particular in reinforcing the dermal-epidermal junction, the cell-cell adhesion and / or the cell-matrix adhesion at the level of the epidermis and in promoting the repair of the cutaneous surface.
  • the invention also relates to a cosmetic treatment method comprising the application on the skin of this pharmaceutical composition.
  • Skin aging is a complex phenomenon that is due to many intrinsic factors (genetic factors) and extrinsic factors (such as sun, diet, exposure to cigarette smoke ). Clinically, we observe the appearance of wrinkles and fine lines, loss of skin elasticity, loosening of skin and subcutaneous tissues and less good healing.
  • the cosmetic industry is also in the permanent expectation of a new peptide capable of increasing the adhesion of cells to the extracellular matrix and / or the adhesion of the cells to each other.
  • ECM extracellular matrix
  • ECM electrospray mediated cell phenotypes
  • Basal laminae fine continuous protein lattices on which the various cellular sheets of the body are based. They have long been defined as discrete morphological structures whose function was limited to the partitioning of tissue compartments. It is only in the last 15 years that, despite their low representativeness and insolubility, significant advances have been made in the investigation of their molecular composition and functions. These structures appear to play a fundamental role in the control of cellular behavior, both during embryonic development only in maintaining the integrity of differentiated cellular phenotypes.
  • the structure of the skin is composed of:
  • - a coating epithelium the epidermis
  • - a connective tissue the dermis (thick layer determining the morphology of the skin and containing blood and lymphatic vessels, nerves)
  • hypodermis an adipose tissue: the hypodermis.
  • Dermis and epidermis are connected by a unique and complex structure, the dermal-epidermal junction (JDE) or epidermal basal lamina.
  • JDE dermal-epidermal junction
  • epidermal basal lamina Anatomically, it corresponds to the zone between the basal cells of the epidermis and the most superficial layers of the dermis. It is a zone of adhesion that determines a partition between the polarized epithelium and the underlying stroma, ensuring the maintenance and cohesion of adjacent cells.
  • JDE composed exclusively of extracellular matrix, performs two roles:
  • JDE proteins maintain close relations with the basal cells of the epidermis and transmit important morphogenetic information through receptors of the family of integrins.
  • JDE is also a diffusion filter for nutrients and metabolics. It allows the transmission of biological information.
  • the JDE flattened out and gradually lost its characteristic undulations, which considerably reduced the epidermal-dermal interface.
  • the molecular networks are disorganized, the Protein framework becomes weakened and the adhesion of basal keratinocytes is impaired.
  • the mechanical function (support) and the biological function (exchange of information and molecules) of the JDE are altered.
  • the JDE When there is skin injury, the JDE is damaged and its constitutive molecules are degraded by specific enzymes.
  • epidermal reepithelialization begins a few hours after the trauma. Once the repithelium has covered the wound bed, the JDE proteins reappear in a sequential and orderly fashion. With skin aging, each of these stages proceeds more slowly. In particular, a decrease in the expression of the matrix adhesion proteins as well as that of the membrane receptors, which could be the major cause of the delay observed in the process of JDE reconstruction and extreme fragility. healed tissue in the elderly.
  • Laminin 5 is a protein specifically expressed in the basal laminae of specialized squamous and transitional epithelia, as the dermal-epidermal junction of the skin.
  • LN-5 results from heterotrimeric assembly of alpha 3, beta 3 and gamma 2 subunits and is synthesized exclusively by epithelial cells as a precursor of 460 fcDa.
  • each of the a3 and gamma 2 subunits undergo extracellular post-translational cleavage of the carboxy- and amino-terminal ends respectively, resulting in the mature tissue form.
  • Recent studies indicate that the entire precursor gamma 2 chain is required for secretion upon integration of LN-5 into ECM.
  • LN-5 The major role of LN-5 is underlined by the existence of hereditary or acquired pathologies resulting from an anomaly of synthesis and / or expression of one of its constitutive subunits. These diseases, called epidermolysis Oily, junctional, lead in particular to a fragility of the dermo-epidermal junction of the skin characterized by the spontaneous formation of epidermal bubbles. LN-5 thus plays a crucial and irreplaceable role in epithelial-mesenchymal cohesion. LN-5 is a carrier of critical biological signals since it allows adhesion of adjoining epithelial cells via integrins and induces the assembly of stable adhesion structures such as hemidesmosomes.
  • a peptide sequence TALRIRATYGEY sequence present on the gamma chain 2 of the LN-5, specifically induced the adhesion of keratinocytes of the epidermis and other epithelial cells.
  • This peptide makes it possible not only to increase the adhesion of the cells to the ECM but also to increase the adhesion of the cells to each other. Because of its small size and high stability, the peptide has all the characteristics required to successfully cross the epidemic and reach its target, JDE, and interact with basal keratinocytes and transmit adhesion induction signals.
  • Fragment of the LN-5 will restore its deficient or missing native counterpart and will have an immediate biological activity of induction of adhesion and restoration of the mechanical properties of the JDE. Its manufacturing process by chemical synthesis is simple and applicable on an industrial scale. H does not use the use of cell cultures of animal origin, nor growth factors and / or serums or derivatives of serrans. Small in size, it will be little or not the target of specific proteolytic degradation and / or nonspecific.
  • the invention firstly relates to a peptide having the following sequence: TALRIRATYGEY (SEQ ID NO: 1).
  • the subject of the present invention is also other peptides resulting from one or more modification (s) of SEQ ID No. 1, such as the addition, deletion or substitution of one or more amino acids, preferably as indicated. in Table 1, and / or oligomerization, cyclization or refolding of SEQ ID No. 1, it being understood that these modifications in no way diminish the adhesive activity of the reference peptide, or even improve it.
  • * X can be any amino acid.
  • the addition or removal of one or more amino acids can be carried out on the carboxy and / or amino-terminal side of said peptide.
  • the subject of the invention is also any analog or derivative which results from the grafting of a motif of interest (natural molecules or synthesis, proteins and / or sugars) on said peptide. It also relates to any dermatologically active fragment of the peptide of the invention, modified or not.
  • the peptide according to the present invention is characterized in that it is obtained by chemical synthesis.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises at least one peptide according to the present invention.
  • composition any dermatological composition suitable for use for cosmetic purposes and / or for therapeutic purposes.
  • the aforesaid peptide is first solubilized in one or more cosmetically or pharmaceutically acceptable solvents such as water, propylene glycol, butylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, ethanol, propanol or isopropanol.
  • said peptide is first solubilized in a pharmaceutical vector such as liposomes or adsorbed on powdered organic polymers, mineral supports such as talc and bentonite, and more generally solubilized in or fixed on any pharmaceutically acceptable carrier.
  • compositions of the present invention contain from 0.00002 to 5%, preferably from 0.00005 to 0.1%, more preferably from 0.0001 to 0.001% by weight of the peptide of the invention, at least one excipient pharmaceutically acceptable and well known to those skilled in the art such as for example solvents, thickeners, diluents, surfactants, antioxidants, dyes, preservatives, and / or fragrances, depending on the final formulation of the composition of the invention.
  • excipient pharmaceutically acceptable and well known to those skilled in the art such as for example solvents, thickeners, diluents, surfactants, antioxidants, dyes, preservatives, and / or fragrances, depending on the final formulation of the composition of the invention.
  • the inventors have been able to show that even very small quantities (of the order of 0.00002% by weight of the peptide of the invention in a composition pharmaceutical or cosmetic) were sufficient to obtain the required activity.
  • the present invention describes maximum amounts of 5% by weight of the peptide of the invention in a pharmaceutical or cosmetic composition, for economic reasons. However, those skilled in the art may consider quantities greater than 5% and adjust the concentration, if necessary to obtain an action at least equal, depending on the cost and purity of the peptide according to the invention.
  • composition according to the present invention further comprises at least one other dermatologically active principle acting either on the reinforcement of the dermal-epidermal junction, the cell-matrix adhesion of the skin, and / or the cell-cell adhesion. or else on the skin according to the nature of the agent (s) used (s) such as a moisturizing agent, a relipidant agent, a super-greasing agent, an exfoliating agent, a keratolytic agent, an anti-oxidizing agent, an agent soothing agent, a softening agent, a sedative agent, a cleaning agent, a makeup remover, a sanitizing agent, an antibacterial agent, an antiseptic agent, an antiseborrhoeic agent, a decongestant, a conditioning agent, a cell renewal activating agent or a or several sunscreens.
  • the agent (s) used (s) such as a moisturizing agent, a relipidant agent, a super-greasing agent, an ex
  • this composition is intended for topical application.
  • compositions of the invention must be in a dermatologically acceptable form, that is to say compatible with the skin, the hairs and / or the hair.
  • These compositions may especially be in the form of creams, milks, oil-in-water emulsions, water-in-oil, multiple emulsions, solutions, suspensions, aqueous gels, oily gels, hydroalcoholic gels, lotions, sticks or even powders, suitable for application on the skin, mucous membranes and in particular the lips and / or the hair.
  • the subject of the invention is also the use of the peptide according to the present invention for the preparation of a pharmaceutical composition intended to reinforce the dermal-epidermal junction, the cell-matrix adhesion and / or the cell-cell adhesion at the epidermis and thus promote the repair of the epidermis.
  • the most commonly observed alteration of the epidermis and JDE is that resulting from skin aging.
  • other alterations of the skin may occur independently of aging and may for example be induced by certain dermatological conditions.
  • the skin undergoes alterations which the present invention proposes to remedy as a therapeutic supplement. It is clear that the present invention is not intended to treat such pathologies but to restore the damaged JDE and cellular adhesion in these pathologies.
  • the present invention allows the repair, regeneration and / or restructuring of the skin.
  • the skin can also be weakened by cosmetic or therapeutic treatments of the skin which, while treating the targeted pathology, generate side effects on the skin which should be treated independently of the pathology itself. This is particularly the case of acne treatments, treatments by puvatherapy, surgical procedures (dermatological or other), laser skin treatments, dermabrasion, peels or cancer treatments by radiotherapy.
  • composition of the invention is also intended for curative and preventive treatment not only of skin aging as seen above, such as wrinkles, sagging, loss of elasticity and less good healing but also to the curative or preventive treatment of senile xerosis, modifications of the pigmentary system of skin, impoverishment of the vascular network of the skin, alteration of the integuments, irregularity of the skin texture and cutaneous atrophy.
  • the invention relates to a method of cosmetic treatment of the skin, characterized in that a cosmetic composition comprising at least one peptide according to the invention is applied to the skin.
  • Said cosmetic composition according to the invention contains from 0.00002% to 5%, preferably from 0.00005% to 0.1% and even more preferably from 0.0001% to 0.001% by weight of peptide and at least one excipient cosmetically acceptable.
  • said cosmetic composition may also comprise at least one other cosmetically active principle.
  • said cosmetic composition is in the form of a cream, a milk, an oil-in-water emulsion, a water-in-oil emulsion, a multiple emulsion, a solution, a suspension, an aqueous gel, an oily gel, a hydroalcoholic gel, a lotion, a stick or a powder.
  • Figure 1 Diagram of the gamma chain 2 of laminin 5 (155 kDa).
  • Figure 2 Cell adhesion of HBL 1000 to peptides 1, 2 and 3.
  • the cells were observed by phase contrast microscopy and then photographed. Bar - 50 ⁇ m.
  • Figure 3 Cell adhesion of HT1080 to peptides 1, 2 and 3.
  • Figure 4 Cell adhesion of A431 to peptides 1, 2 and 3.
  • Figure 5 Cell adhesion of normal human keratinocytes to peptides 1, 2 and 3.
  • FIG. 6 Cell Adhesion of NHK-Young vs NHK-Aged to TALRIRATYGEY Peptide Dose-Dependent Cell Adhesion of NHK-10 Years versus NHK-1
  • FIG. 7 Effect of the TALRIRATYGEY Peptide on the Proliferation of HT1 080 and HBL100 Cells
  • HT1080 cells (A) and HBL100 cells (B) were inoculated in 96-well plates at 10,000 cells per well. After 24 hours, the culture media were removed and replaced with serum-free medium containing the peptide amounts indicated on the graphs and the XTT reagent. The plates were then placed in an incubator at 37 ° C and absorbance readings were taken at 1h, 2h, 3h, 4h and 5h. Controls without peptide were made on the same plate.
  • FIG. 8 Effect of the TALRIRATYGEY Peptide on the Proliferation of A431 Cells
  • A431 cells were seeded in 96-well plates at 10,000 cells per well. After 24 hours, the culture media were removed and replaced with serum-free medium containing the peptide amounts indicated on the graphs and the XTT reagent. Plates were then placed in an incubator at 37 ° C and absorbance readings were taken at 1h, 2h, 3h, 4h and 5h. Controls without peptide were made on the same plate.
  • FIG. 9 Effect of the TALRIRATYGEY Peptide on the Proliferation of
  • NHK-10 years and NHK-71 years were seeded in 96-well plates at a rate of 10,000 cells per well. After 24 hours, the culture media were removed and replaced with serum-free medium containing the peptide amounts indicated on the graphs and the XTT reagent. The plates were then placed in an incubator at 37 ° C. and readings of the absorbance were carried out at 1 h, 2 h, 3 h, 4 h and 5 h. Controls without peptide were made on the same plate.
  • Figure 10 Effect of peptide TALRIRATYGEY on the proliferation of NHKs.
  • NHKs were seeded in 96-well plates at 10,000 cells per well. After 24 hours, the culture media were removed and replaced with KBM-2 medium containing the indicated amounts of peptide. After 24h contact at 37 ° C, the media were replaced by the XTT reagent. The plates were then placed in an incubator at 37 ° C and the reading of the absorbance was carried out at 3h. Controls without peptide were made on the same plate.
  • Figure 11 Effect of TALRIRATYGEY peptide on the behavior of NHKs.
  • Figure 12 Effect of peptide TALRIRATYGEY on the behavior of NHKs.
  • Figure 14 Cell adhesion of NHKs to TALRIRATYGEY peptide co-immobilized with laminin 5. Peptides 1, 2 and 3 (variable amounts indicated) and laminin 5
  • Figure 15 Cell adhesion of NHKs to TALRIRATYGEY peptide co-immobilized with collagen IV.
  • the peptide (variable amounts indicated) and laminin 5 (fixed amount 0.2 mg) were co-immobilized on 96-well plates.3.104 NHK-8 years and 3.104
  • FIG. 20 Adhesion of HT1 080 Cells to the TALRIRATYGEY Peptide
  • Peptides 1 and 2 are located at the amino-terminus in the region called the "short arm" of the gamma chain 2 ( Figure 1).
  • the laminin short arm has cysteine-poor sequences folded into a globular domain (the L4m domain). This area is surrounded by rich repetitions of cysteines arranged in sticks (LE domains, 3 LE domains on each side). These are composed of a 50 amino acid motif with homology to epidermal growth factor (EGF-like domains).
  • Peptide 3 was selected at the carboxy terminus.
  • the caboxy-terminal domains I and II are involved in the assembly of the three alpha, beta and gamma chains and form a supercoiled alpha helix forming the long arm of laminin.
  • the sequence of interest is localized on the globular domain L4m.
  • Trp (W) 0 0.0%
  • Atomic composition Carbon C 63
  • the N-terminal of the sequence in question is T (Thr).
  • the estimated half-life is: 7.2 hours (mammalian reticulocytes, in vitro).
  • the peptide is then analyzed and purified on a Vydac C 18 column (5 ⁇ m) of 4.6 or 10 mm in diameter and 250 mm in length and then characterized by electrospray mass spectrometry on a SCIEX API 165.
  • Peptide 2 GLTKTYTFRLNE (SEQ ID NO: 2)
  • Peptide 3 DVKNLENIRDNL (SEQ ID NO : 3)
  • Peptides 1, 2 and 3 were used in cell adhesion experiments.
  • a range of 7 decreasing concentrations (100 micrograms / ml, 50 micrograms / ml, 25 micrograms / ml, 12.5 micrograms / ml, 6.25 micrograms / ml, 3.125 micrograms / ml and 1.562 micrograms / ml) was achieved by sequential dilution in PBS (Phosphate Buffer Saline, 1.54 mM KH 2 PO 4, 1.42 mM Na 2 HPO 4 , 131 mM NaCl) from a 1 mg / ml starting solution.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • the epithelial cells were detached from the culture dishes by a trypsin / EDTA solution (0.05-0.02%), and then suspended in DMEM medium without additives for the cell lines and KBM-2 without additive for the cells.
  • human keratinocytes The number of cells sown per well is indicated in the legends of the graphs (50,000 to 100,000 cells per well).
  • the multiwell plates were placed in an incubator at 37 ° C. under a 5% CO2 atmosphere. After an incubation period of 30 to 60 minutes, the cells are observed under a phase contrast microscope to verify that the test has been correctly performed.
  • the adhesion medium is then removed and each well is washed with sterile PBS solution to remove non-adhered cells.
  • the remaining cells, adherent to the substrate, are then fixed with a solution of glutaraldehyde to 1% in PBS, for 15 minutes.
  • the glutaraldehyde solution is removed and the cells are then stained with 1% violet crystal solution diluted 1% in distilled water for 30 minutes.
  • the cells After several rinses with water, the cells are sealed with a 0.02% triton solution for 15 minutes, in order to solubilize the crystal violet.
  • the absorbance is read at 570 nm using an ELISA reader plate reader (MR500, Dynatech, Guernsey Chanel, Island). Each experimental point was made in three copies.
  • the value of the blank represents the mean of the absorbance of the 3 control wells (BSA). This was subtracted from each of the optical density values obtained for the experimental points. The averages of the three absorbance values for each of the triplicettes were then calculated.
  • the results are represented in the form of a curve, with the absorbance values as ordinates, and the different substrate concentrations as the abscissa.
  • the adhered cells were photographed by phase contrast microscopy.
  • HBL100 human mammary epithelium
  • HTB -124 cells of the A431 line (skin epithelioids), American
  • the culture medium used during our work was the defined medium for keratinocyte culture KBM-2 (containing: bovine pituitary extract 35 mg, hEGF 10 ng / ml, insulin 5 ⁇ g / ml, Hydrocortisone 0.5 ⁇ g / ml 0.1% transferrin, 0.1% epinephrine) manufactured by Clonetics and marketed by
  • Cambrex (Belgium) containing 0.15 mM CaCl2, pH 7.2 at 7.4.
  • the keratinocytes were obtained according to the technique described by Boyce and Ham (Cultivation, frozen storage, and clonal growth of normal human epidermal keratinocytes in free-media serum, Tissue Cult, Meth., 1985, 9: 83-93).
  • the skin pieces after careful rinsing in PBS buffer containing antibiotics, are removed from the fatty tissue located under the dermis using sterile instruments.
  • the skin was then cut into pieces of 3 mm 2 , which were placed in a sterile solution of 0.25% trypsin in PBS for 16 hours at 40 ° C.
  • the dermis / epidermis separation was carried out on the skin.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the adhesion of the HBL 100 cells is induced for a fixed amount of peptide 1 of 0.31 micrograms and the maximum adhesion is reached for an immobilized peptide 1 amount of 1.25 micrograms (FIG. 2).
  • the adhesion of the HT1080 cells is induced for an amount of immobilized peptide 1 of 0.15 micrograms and the maximum adhesion is reached for a fixed amount of peptide 1 of 0.15 micrograms (FIG. 3).
  • Adhesion of A431 cells was induced for immobilized peptide 1 of 0.62 micrograms and maximal adhesion was achieved for immobilized peptide 1 of 1.2 micrograms.
  • the photos obtained by phase contrast microscopy confirm the quantitative results and confirm the absence of adhered cells on the control peptides 2 and 3.
  • the cells adhered to the peptide TALRIRATYGEY (peptide of the invention) predominantly have a rounded morphology with groupings frequent cells ( Figures 2, 3, 4 and 5). These groupings may be the sign of the establishment of cell-cell interactions.
  • the results were confirmed with normal human keratinocytes (epidemic cells, Figure 5).
  • keratinocytes from biopsies of very young subjects and elderly subjects taken from the same anatomical site the inventors carried out the study on skin biopsies of the face.
  • the area of the face behind the ears has been chosen to study only intrinsic aging and to overcome the effects caused by photo-induced aging.
  • Surgical wastes from cosmetic surgery (facelift in this case) in elderly patients and operative waste from the floppy ear procedures in young children were collected. It was essential to have biopsies on the day of the operation in order to rapidly culture the keratinocytes of the epidemic.
  • the biopsy cells of elderly subjects (60, 63 and 71 years old) and young subjects (8, 10 and 11 years old) were used.
  • the keratinocytes were obtained according to the technique described by Boyce and Ham, 1985.
  • the skin was then cut into pieces of 3 mm 2 , which were placed in a sterile solution of 0.25% trypsin in PBS for 16 hours at 40 ° C.
  • the dermis / epidermis separation was carried out on the skin. using fine forceps in a petri dish containing culture medium to stop the enzymatic action of trypsin.
  • the epidermal fragments were sucked up and pumped several times with a pipette to detach the free basal cells.
  • the cell suspension thus obtained was centrifuged for 5 min at 1000 rpm and the pellet thus obtained was suspended in a known volume of KBM-2 medium to perform counting of living cells using an exclusion dye. : the trypan blue. 3.10 4 living cells were seeded per cm 2 on 25 cm 2 tissue culture dishes (Corning, Polylabo, France). The keratinocytes were cultured at 37 ° C in a CO2 incubator (5% CO2, 95% air and 98% moisture). The medium was changed every other day. Subculture occurred when cells reached subconfluency. The cell layer was then rinsed with PBS and then covered with Trypsin-EDTA solution (0.05-0.02%). After a short incubation at 37 ° C., the cells detached from the plastic support.
  • the cells were then inoculated into 75 cm 2 culture dishes. Freezing of the cells (3 to 5 million per ampoule) was carried out in the culture medium used, in the presence of 10% of dimethyl sulfoxide (DMSO) and 20% of calf serum in a volume of 1 ml. Upon thawing, cells were seeded at 10,000 cells / cm 2 .
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a range of 7 decreasing amounts of TALRIRATYGEY peptide was achieved by sequential dilution in PBS (1.5 mm Saline Phosphate Buffer, 1.54 mM KH2PO4, 1.42 mM Na2HPO4, 131 mM NaCl), from a 1 mg peptide solution. / ml. These solutions were immediately distributed on 96-well culture plates (Greiner, Dutscher, Brumath, France) at the rate of 100 ⁇ l per well. The plates were placed at + 40 ° C. for 16 to 18 hours. The solutions were then removed by flipping the plates and each well was saturated with 1% PBS-BSA solution (bovine serum albumin). Three additional wells without substrate underwent the same treatment and served as white.
  • PBS-BSA solution bovine serum albumin
  • Keratinocytes from young or aged subjects were detached from the culture dishes with a trypsin / EDTA solution (0.05-0.02%) and then suspended in KBM-2 medium. The number of cells sown per well is indicated on the graphs. The same number of young / aged cells is used in comparative experiments.
  • the multiwell plates were placed in an incubator at 37 ° C. under a 5% CO2 atmosphere. After an incubation period of 30 to 60 minutes, the cells are observed using a phase contrast microscope to verify that the test has been correctly performed.
  • the adhesion medium was then removed and each well was washed with sterile PBS solution to remove the non-adhered cells.
  • the remaining cells, adherent to the substrate, were fixed with a solution of 1% glutaraldehyde in PBS for 15 minutes. The glutaraldehyde solution was removed and the cells were stained with 1% Crystal Violet solution diluted in distilled water for 30 minutes.
  • the results were represented in the form of a curve, with the absorbance values as ordinates, and on the abscissa the different quantities of substrate deposited in the wells.
  • the adhered cells were photographed with a phase contrast microscope.
  • the interesting point is that it is still significantly expressed and functional since the dose-response effect of the peptide on the NHK-aged is identical to the dose effect obtained with the NHK-young .
  • the photos obtained by phase contrast microscopy confirm the quantitative results.
  • the NHK-young adherents to the TALRIRATYGEY peptide predominantly have a rounded morphology with frequent cell clusters (as described in Example 1), fewer cells are noted in the case of NHK-aged.
  • the adhesion of the NHK-youths is induced for the amount of deposited peptide 0.08 ⁇ g and that of NHK-aged for a deposited amount ranging from 0.08 to 0, 15 ⁇ g.
  • the adhesion plateau is reached in the range of 0.3 to 0.6 micrograms of peptide deposited per well.
  • the chemical reaction of the assay is based on the production of NADPH from living cells allowing the reduction of yellow XTT tetrazolium salts to orange formazan salts.
  • Absorbance gauge is set at 490nm using an ELISA reader.
  • the cells were inoculated into 96-well plates at 10,000 cells per well (6 wells / condition) in KBM-2 culture medium. After 24 hours of culture at 37 ° C in the presence of 5% CO 2, the culture media were removed and replaced with serum-free medium containing the amounts of peptide indicated on the graphs and test reagent. The plates were then placed in an incubator at 37 ° C. and absorbance readings were carried out at 1 h, 2 h, 3 h, 4 h and 5 h. Controls without peptide were made on the same plate. The results are presented in 2 forms:
  • % viability (Abs cells with peptide / Abs, control cells) X 100.
  • TALRIRATYGEY peptide In order to analyze the effect of TALRIRATYGEY peptide on cell proliferation, the inventors first analyzed the effect of 2 different concentrations 0.5 and 1% on HT1 080, HBL100 and A431 cells (FIGS. 8 and 9). The cells were seeded in 96-well plates at the rate of 10,000 cells per well. After 24 hours of culture, the culture media were removed and replaced with serum-free medium containing the peptide amounts indicated on the graphs and test reagent. The plates were then placed in an incubator at 37 ° C and absorbance readings were taken at 1 h, 2 h, 3 h, 4 h and 5 h. Controls without peptide were made on the same plate.
  • the TALRIRATYGEY peptide induces cell adhesion when attached to the 96-well plates (Examples 1 and 2).
  • the NHKs were seeded in 12-well plates at a rate of 5,000 cells per well. After 24 hours of culture, the culture media were removed and replaced with fresh medium containing the amounts of peptide 5%; 2.5%; 1.25%; 0.6% and 0.3%. A control without peptide was made in the same plate. The plate was then placed in an incubator at 37 ° C and the operation was repeated once for an additional 24 hours of culture.
  • NHKs are, for the most part, still isolated and begin to assemble in colonies (Figure 1 IA). It is found that the NHKs grown in the presence of the peptide are already pooled into larger identifiable colonies ( Figure 1 IB-F). Observation of these colonies at higher magnification ( Figure 12) shows that cells cultured in the presence of peptide form a contiguous and cohesive cell layer. There was no morphological differences between the cells cultivated in the presence of the peptide ( Figure 12B 5 C) and the control cells ( Figure 12A). However, the addition of the peptide in the NHK medium allowed the formation of cohesive colonies more rapidly. This effect may be the consequence of the small increase in cell proliferation induced by the peptide.
  • the basic molecular network of the dermo-epidermal junction consists of the assembly of collagen IV molecules (COL4). This molecular network leads to the formation of a loose mesh net, a polygonal structure serving as a framework for stowing the other proteins of the basal lamina ( Figure 13A).
  • a second molecular network is formed by laminin molecules.
  • Laminin 5 (LN5) is the quantitatively most important glycoprotein of the dermoepidermal junction and is the component of the anchoring filaments. LL5 plays a crucial and irreplaceable role in the adhesion of the epidermis through interactions with integrins.
  • the inventors carried out co-immobilization experiments of the peptide with LN5 and COL4 and analyzed the adhesion capacities of the keratinocytes.
  • substrate adhesion experiments LN5 and COL4 alone were performed.
  • the experiments were carried out with the amounts of peptides: 0; 0.03; 0.06; 0.125; 0.25; 0.5; 1 and 2 micrograms per well.
  • the 2 tested proteins induce the adhesion of NHKs but LN5 is a much better substrate.
  • Peptides 2 and 3 (described in Example 1) were used as controls during this experiment.
  • the adhesion tests were carried out with NHK under the same conditions as in the experiment presented in FIG. 13 (50,000 cells per well).
  • a control without peptide was performed and represents the 100% adhesion (LN5 alone or COL4 alone). The results were then expressed as a percentage of this control.
  • the TALRIRATYGEY peptide progressively and significantly increases the adhesion of the NHKs to the LN5.
  • the adhesion to the LN5 is on average doubled for a quantity of peptide of 0.21 to 0.87 ⁇ g / well. This effect is specific since it is not observed for the control peptides 2 and 3.
  • the photographs obtained by phase contrast microscopy confirm the quantitative results and show that the LN5 used alone at 0.2 mg induces an average adhesion.
  • the contribution of the peptide P 1 induces the formation of a confluent cellular mat while the peptides P2 and P3 do not modify the adhesion obtained with the LN5 alone.
  • the same experiment conducted with COL4 (FIG.
  • the peptide was constructed as described in Example 1. Peptide synthesis was performed on a Milligen 9050 Synthesizer using Fmoc-Opfp / Hobt chemistry. The peptide was then detached from the resin and deprotected using a solution of TFA (trifluoroacetic acid) containing scavengers (phenol, water, ethanedithiol and thioanisole). The peptide was then analyzed and purified on a Vydac Cl 8.5mm column of 4.6 or 10 mm in diameter and 250 mm in length and then characterized by electrospray mass spectrometry on a SCIEX API 165.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • scavengers phenol, water, ethanedithiol and thioanisole
  • the peptide was diluted in sterile PBS. Samples containing the peptide to be assayed were freeze-dried by evaporation. They were deposited in a reactor and subjected to a high vacuum in order to eliminate the oxygen molecules capable of oxidizing certain amino acids. The hydrolysis of the peptide bonds was carried out using a mixture of hydrochloric acid (HCL 6N, 2/3), trifluoroacetic acid (TFA, 1/3) in a chamber at 150 ° C. for 45 minutes. minutes. Hydrolysis in the gas phase makes it possible to avoid contamination by ions present in the acids. The samples were then dried and solubilized in a buffer suitable for ion exchange chromatography (sodium citrate).
  • Ion-exchange chromatography allowed the amino acids to be separated according to their ionic strength, and when they exit the column, they react with a reagent, ninhydrin, to form a colored complex with the primary amines (violet, readable at 570 nm ). Ninhydrin also reacts with the secondary amines (proline, hydroxyproline) to form a yellow compound readable at 440 nm.
  • Two separate chromatograms allow the analysis of the samples. A Beckman 6300 semi-automatic analyzer optimized for this analysis was used, associated with the Beckman GoId software allowing quantification of the chromatograms. The results were then transferred to an MS-Excel table on which a macro allowed the calculation of relative compositions.
  • the cell adhesion experiments carried out with the peptide require a first step of immobilizing the peptide on the 96-well culture plates. This step is carried out by contacting the solution containing the peptide with the plastic surface for 18 hours at + 4 ° C. The solutions are then removed by aspirations and the peptide is immobilized on the surface, ready to interact with the cells provided during the cell adhesion test itself. Depending on the physicochemical properties of the peptides or proteins used, a greater or lesser percentage is actually immobilized on the support. It was therefore necessary to precisely determine the percentage of immobilization of the peptide TALRIRATYGEY in order to know the actual amount of peptide inducing adhesion.
  • Figure 17 summarizes the data obtained during the development experiments of the assay conditions of the peptide deposited on the 96-well plates and not immobilized.
  • Five experiments were carried out with decreasing amounts of peptides ranging from 5 ⁇ g to 0.7 ⁇ g.
  • the amount of peptide indicated was deposited in 3 different wells (100 ⁇ l / well) of a 96 well plate.
  • the supernatants were collected and placed in tubes intended for the assay by the method for determining the amino acid composition.
  • Two identical samples of the solution used for the deposits were re-measured under the same conditions.
  • the first experiments carried out with 5, 19 ⁇ g show immediately that the amount of immobilized peptide is very low.
  • the assay allowed to assay an average quantity of 2.44 ⁇ g in Ql.
  • the determination of the supernatants made it possible to determine an average amount of 2.212 ⁇ g remaining in solution in the wells, showing that 90.7% of the peptide remains in the solution after immobilization. This means that only 9.3% of peptides have been immobilized.
  • An equivalent percentage was found for the quantity Q2, the average starting quantity of which was 1.09 ⁇ g.
  • the assay made it possible to determine the average amount of 1,002 ⁇ g in the supernatants, which means that 92% of the amount of peptide was not immobilized.
  • the 2 adhesion curves are parallel and reach the adhesion plateau for the same amount of immobilized peptide.
  • the difference observed between the two curves is related to the difference in intensity of the absorbance which is greater in the case where there is the double of cells.
  • Images on the right illustrate the homogeneous and confluent cellular carpet obtained in the case where 150,000 cells were seeded. The cells are joined and are associated with each other. It should be noted that the peptide induces cell spreading and the establishment of cell-cell junctions, two guarantors of good cellular communication.
  • Composition No. 1 emulsion W / O (water in oil)
  • Composition No. 2 OAV (oil in water) emulsion
  • composition N ° 3 lotion
  • composition N ° 4 gel

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Abstract

La présente invention se rapporte à un nouveau peptide, à une composition pharmaceutique comprenant ce peptide et à l'utilisation d'une telle composition pour le traitement des altérations de la peau d'origine diverses. Plus particulièrement, le traitement desdites altérations consiste notamment à renforcer la jonction dermo-épidermique, l'adhérence cellule-matrice et/ou l'adhérence cellule-cellule au niveau de l'épiderme et à favoriser la réparation de la surface cutanée.

Description

NOUVEAU PEPTIDE ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LE
CONTENANT
La présente invention se rapporte à un nouveau peptide, à une composition pharmaceutique comprenant ce peptide et à l'utilisation d'une telle composition pour le traitement des altérations de la peau d'origines diverses.
Plus particulièrement, le traitement > desdites altérations consiste notamment à renforcer la jonction dermo-épidermique, l'adhérence cellule-cellule et/ou P adhérence cellule-matrice au niveau de P épidémie et à favoriser la réparation de la surface cutanée.
L'invention se rapporte encore à un procédé de traitement cosmétique comprenant l'application sur la peau de cette composition pharmaceutique.
L'altération de la peau la plus commune et la plus naturelle est tout simplement celle due au vieillissement cutané.
Le vieillissement cutané est un phénomène complexe qui est dû à de nombreux facteurs intrinsèques (facteurs génétiques) et extrinsèques (tels que le soleil, l'alimentation, l'exposition à la fumée de cigarette...). Cliniquement, on observe l'apparition de rides et de ridules, une perte de l'élasticité cutanée, un relâchement des tissus cutanés et sous-cutanés ainsi qu'une moins bonne cicatrisation.
De nombreuses voies de recherches sont proposées pour lutter contre le vieillissement cutané, parmi lesquelles la protection contre l'environnement (soleil, pollutions...), l'activation de la régénération cellulaire, le renforcement de la matrice extracellulaire (collagène et élastiήe). Récemment, des études ont montré l'importance de l'adhérence des cellules entre elles d'une part, et de l'adhérence entre les cellules et la matrice extracellulaire d'autre part, dans le processus du vieillissement cutané et donc de la nécessité à les renforcer pour prévenir voire traiter le relâchement de la peau.
Les études dermatologiques récemment tournées vers l'utilisation des peptides en biologie cutanée (séquences dérivées de l'alpha-MSH, certains neuropeptides, peptide RGD...), s'orientent vers la recherche de peptides ayant une activité forte au niveau cutané.
L'industrie cosmétique est également dans l'attente permanente d'un nouveau peptide capable d'augmenter l'adhérence des cellules à la matrice extracellulaire et/ou l'adhérence des cellules entre elles.
Les interactions entre les cellules et la matrice extracellulaire (MEC) jouent en effet un rôle important dans le contrôle du comportement cellulaire. Ce contrôle s'effectue par des interactions spécifiques entre les molécules matricielles et les cellules au niveau de récepteurs transmembranaires, principalement de la famille des intégrines, dont le domaine intracellulaire est relié aux constituants du cytosquelette. Ceci permet à la matrice d'assurer la transmission de signaux intracellulaires modulant selon les cas 1 ' adhérence, la migration, la prolifération, la différentiation ou l'apoptose des cellules de l'épiderme. Ce contrôle du comportement cellulaire est crucial au cours du développement mais également lors des remaniements tissulaires.
Selon les molécules constitutives et l'organisation qui en découle, on distingue plusieurs types de MEC, les lames basales étant sans doute les plus spécialisées. Ces dernières sont de fins treillis protéiques continus sur lesquels reposent les différents feuillets cellulaires de l'organisme. Elles ont longtemps été définies comme des structures morphologiques discrètes dont la fonction était limitée au cloisonnement des compartiments tissulaires. C'est seulement au cours des 15 dernières années que, malgré leur faible représentativité et leur grande insolubilité, des avancées significatives ont été réalisées dans l'investigation de leur composition moléculaire et de leurs fonctions. Il apparaît que ces structures jouent un rôle fondamental dans le contrôle du comportement cellulaire, tant au cours du développement embryonnaire que dans le maintien de l'intégrité des phénotypes cellulaires différenciés.
La structure de la peau est composée :
- d'un épithélium de revêtement : l'épiderme, - d'un tissu conjonctif : le derme (couche épaisse déterminant la morphologie de la peau et contenant les vaisseaux sanguins et lymphatiques, les nerfs), et
- d'un tissu adipeux : Phypoderme.
Derme et épiderme sont reliés par une structure unique et complexe, la jonction dermo-épidermique (JDE) ou lame basale épidermique. Anatomiquement, elle correspond à la zone comprise entre les cellules basales de l'épiderme et les couches les plus superficielles du derme. C'est une zone d'adhérence qui détermine un cloisonnement entre l'épithélium polarisé et le stroma sous-jacent, assurant le maintien et la cohésion des cellules adjacentes. La JDE, composée exclusivement de matrice extracellulaire, assure deux rôles :
1°) rôle mécanique, son architecture moléculaire unique lui confère une grande stabilité mécanique lui permettant d'assurer l'ancrage solide de l'épiderme ;
2°) rôle biologique, les protéines de la JDE entretiennent avec les cellules basales de l'épiderme des relations étroites et leur transmettent des informations morphogénétiques importantes par l'intermédiaire des récepteurs de la famille des intégrines.
La JDE est aussi un filtre de diffusion vis-à-vis des éléments nutritifs et métaboliques. Elle permet donc la transmission des informations biologiques.
Au cours du vieillissement cutané, la JDE s'aplanit et perd progressivement ses ondulations caractéristiques, ce qui réduit considérablement l'interface épideπne-derme. De plus, les réseaux moléculaires se désorganisent, la charpente protéique se fragilise et l'adhérence des kératinocytes basaux est amoindrie.
En conséquence, la fonction mécanique (soutien) et la fonction biologique (échange d'informations et de molécules) de la JDE sont altérées. Lorsqu'il y a blessure cutanée, la JDE est endommagée et ses molécules constitutives sont dégradées par des enzymes spécifiques. Dans des conditions favorables, la réépithélisation épidermique débute quelques heures après le traumatisme. Dès que répithélium a recouvert le lit de la plaie, les protéines de la JDE réapparaissent de façon séquentielle et ordonnée. Avec le vieillissement cutané, chacune de ces étapes se déroule plus lentement. En particulier, il a été observé une diminution de l'expression des protéines d'adhérence matricielle ainsi que de celle des récepteurs membranaires, qui pourrait constituer la cause majeure du retard observé dans le processus de reconstitution de la JDE et de l'extrême fragilité des tissus cicatrisés chez les sujets âgés.
La laminine 5 (LN- 5) est une protéine spécifiquement exprimée dans les lames basales des épithélia squameux et transitionnels spécialisés comme la jonction dermo-épidermique de la peau. La LN-5 résulte de l'assemblage hétérotrimérique des sous-unités alpha 3, bêta 3 et gamma 2 et est synthétisée exclusivement par les cellules épithéliales sous la forme d'un précurseur de 460 fcDa. Dans les conditions physiologiques, chacune des sous-unités a3 et gamma 2 subit un clivage post-traductionnel extracellulaire des extrémités carboxy-et amino- terminales respectivement, aboutissant à la forme tissulaire mature. Des études récentes indiquent que la totalité de la chaîne gamma 2 précurseur est nécessaire à la sécrétion à l'intégration de la LN-5 dans la MEC.
Le rôle majeur de la LN-5 est souligné par l'existence de pathologies héréditaires ou acquises, résultant d'une anomalie de synthèse et/ou d'expression de l'une de ses sous-unités constitutives. Ces maladies, appelées épidermolyses huileuses jonctionnelles, conduisent notamment à une fragilité de la jonction dermo-épidermique de la peau caractérisée par la formation spontanée de bulles épidermiques. La LN-5 joue ainsi un rôle crucial et irremplaçable dans la cohésion épithélio-mésenchymateuse. La LN-5 est porteuse de signaux biologiques déterminants puisqu' elle permet 1 ' adhérence des cellules épithéliales adj acentes par l'intermédiaire des intégrines et induit l'assemblage des structures d'adhérence stable que sont les hémidesmosomes.
La demande de brevet internationale WO 00/66731 au nom de Biostatum décrit la production de LN-5 entière sous forme recombinante dans des cellules eucaryotes (L5r) et documente son activité pour améliorer la cicatrisation, la prolifération et l'adhérence cellulaire.
Or, la demanderesse a trouvé, de façon surprenante et inattendue, qu'une quantité efficace d'un peptide de séquence TALRIRATYGEY, séquence présente sur la chaîne gamma 2 de la LN-5, induit de façon spécifique l'adhérence des kératinocytes de l' épiderme et d' autres cellules épithéliales. Ce peptide permet non seulement d'augmenter l'adhérence des cellules à la MEC mais également d'augmenter l'adhérence des cellules entre elles. De par sa petite taille et sa grande stabilité, le peptide présente toutes les caractéristiques requises pour traverser convenablement l' épidémie et atteindre sa cible, la JDE, et interagir avec les kératinocytes basaux et transmettre des signaux d'induction d'adhérence. Fragment de la LN-5, il permettra de restaurer son homologue natif déficient ou manquant et aura une activité biologique immédiate d'induction de l'adhérence et de restauration des propriétés mécaniques de la JDE. Son procédé de fabrication par synthèse chimique est simple et applicable à l'échelle industrielle. H ne fait pas appel à l'utilisation de cultures de cellules d'origine animale, ni à des facteurs de croissance et/ou de sérums ou dérivés de serrans. De petite taille, il sera peu ou pas la cible de dégradations protéolytiques spécifiques et/ou non spécifiques.
Ainsi, l'invention a pour premier objet un peptide présentant la séquence suivante : TALRIRATYGEY (SEQ ID N ° 1).
La présente invention a également pour objet d'autres peptides résultant d'une ou plusieurs modification(s) de SEQ ID N° 1 telles que l'ajout, la suppression ou la substitution d'un ou plusieurs acides aminés, de préférence comme indiqué dans le tableau 1, et/ou d'une oligomérisation, d'une cyclisation ou du repliement de SEQ ID N° 1, étant entendu que ces modifications ne diminuent en rien l'activité adhésive du peptide de référence, voire l'améliorent.
Tableau 1
Figure imgf000008_0001
* X pouvant être n'importe quel acide aminé. .
Plus particulièrement, l'ajout ou le retrait d'un ou plusieurs acides aminés peut être réalisé du côté carboxy et /ou du coté amino-terminal dudit peptide. L'invention a également pour objet tout analogue ou dérivé qui résulterait de la greffe d'un motif d'intérêt (molécules naturelles ou synthèse, protéines et/ou sucres) sur ledit peptide. Elle a également pour objet tout fragment dermatologiquement actif du peptide de l'invention, modifié ou non. Le peptide selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il est obtenu par la synthèse chimique.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide selon la présente invention.
Par « composition pharmaceutique », on entend toute composition dermatologique apte à être utilisée à des fins cosmétiques et/ou à des fins thérapeutiques. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le susdit peptide est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables tel(s) que 1 ' eau, le propylène glycol, le butylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, l'éthanol, le propanol ou l'isopropanol. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit peptide est préalablement solubilisé dans un vecteur pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbé sur des polymères organiques poudrés, des supports minéraux comme le talc et la bentonite, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur pharmaceutiquement acceptable. Les compositions pharmaceutiques de la présente invention contiennent de 0,00002 à 5 %, de préférence de 0,00005 à 0,1 %, plus préférentiellement encore de 0,0001 à 0,001 % en poids du peptide de l'invention, au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable et bien connu(s) de l 'homme du métier tel que par exemple des solvants, épaississants, diluants, tensioactifs, anti-oxydants, colorants, conservateurs, et/ou parfums, en fonction de la formulation finale de la composition de l'invention.
Les inventeurs ont pu montrer que des quantités, même très faibles (de l'ordre de 0,00002% en poids du peptide de l'invention dans une composition pharmaceutique ou cosmétique) étaient suffisantes pour obtenir l'activité requise. La présente invention décrit des quantités maximales de 5 % en poids du peptide de l'invention dans une composition pharmaceutique ou cosmétique, pour des raisons économiques. Néanmoins l'homme du métier pourra envisager des quantités supérieures à 5 % et adapter la concentration, si nécessaire à l'obtention d'une action au moins égale, en fonction du coût et de la pureté du peptide selon l'invention.
Plus particulièrement, la composition selon la présente invention comprend en outre au moins un autre principe dermatologiquement actif agissant soit sur le renforcement de la jonction dermo-épidermique, l'adhérence cellules- matrice de la peau, et/ou l'adhérence cellule-cellule soit autrement sur la peau selon la nature de ou des agent(s) utilisé(s) tels qu'un agent hydratant, un agent relipidant, un agent surgraissant, un agent exfoliant, un agent kératolytique, un agent anti¬ oxydant, un agent apaisant, un agent adoucissant, un agent sédatif, un agent nettoyant, un agent démaquillant, un agent assainissant, un agent antibactérien, un agent antiseptique, un agent antiséborrhéique, un agent décongestionnant, un agent revitalisant, un agent activateur du renouvellement cellulaire ou un ou plusieurs filtres solaires.
Préférentiellement, cette composition est destinée à une application topique.
Les compositions de l'invention doivent se présenter sous une forme dermatologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau, les poils et/ou les cheveux. Ces compositions pourront notamment être sous forme de crèmes, laits, émulsions huile dans eau, eau dans huile, émulsions multiples, solutions, suspensions, gels aqueux, gels huileux, gels hydroalcooliques, lotions, sticks ou encore poudres, adaptés à une application sur la peau, les muqueuses et en particulier les lèvres et/ou les cheveux.
D'éventuels composés additionnels, actifs ou non, pourront être ajoutés à la composition de l'invention et l'homme du métier les choisira de façon à ce que leur adjonction n'altère pas les propriétés avantageuses de ladite composition.
L'invention a également pour objet l'utilisation du peptide selon la présente invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à renforcer la jonction dermo-épidermique, l'adhérence cellule-matrice et/ou l'adhérence cellule-cellule au niveau de l'épiderme et favoriser ainsi la réparation de l'épiderme.
Comme indiqué précédemment, l'altération de l'épidenne et de la JDE la plus communément observée est celle résultant du vieillissement cutané. Cependant, d'autres altérations de la peau peuvent intervenir indépendamment du vieillissement et peuvent par exemple être induites par certaines pathologies dermatologiques. A titre d'exemple, on peut citer l'eczéma, le psoriasis, lepruritles dermites irritatives, l'héliodermie, les kératoses, les mycoses, l'ichtyose. Outre les symptômes spécifiques à chacune de ces pathologies, la peau subit des altérations auxquelles se propose de remédier la présente invention à titre de complément thérapeutique. H est clair que la présente invention n' a pas pour but le traitement de telles pathologies mais de restaurer la JDE endommagée et l'adhérence cellulaire dans ces pathologies.
Ainsi la présente invention permet la réparation, la régénération et/ou la restructuration de la peau.
La peau peut également être fragilisée par des traitements cosmétiques ou thérapeutiques de la peau qui, tout en traitant la pathologie visée, génèrent des effets secondaires sur la peau qu'il convient de traiter indépendamment de la pathologie elle-même. C'est le cas notamment des traitements de l'acné, des traitements par puvathérapie, des interventions chirurgicales (dermatologiques ou autres), des traitements de la peau par laser, de la dermabrasion, des peelings ou des traitements de cancers par radiothérapie.
Enfin, la composition de l'invention est également destinée au traitement curatif et préventif non seulement du vieillissement cutané comme vu plus haut, telles que les rides, le relâchement, la perte d' élasticité et la moins bonne cicatrisation mais également au traitement curatif ou préventif de la xérose sénile, des modifications du système pigmentaire de la peau, de l'appauvrissement du réseau vasculaire de la peau, de l'altération des phanères, de rirrégularité du grain de peau et de l'atrophie cutanée.
En effet, les susdites pathologies, fragilisations de la peau et traitements divers génèrent sur la peau des altérations telles que la diminution de l'adhérence de l'épiderme et de la cohésion épidermique, ou encore une moins bonne restructuration de la surface cutanée.
L'invention concerne enfin un procédé de traitement cosmétique de la peau caractérisé en ce qu'on applique sur la peau une composition cosmétique comprenant au moins un peptide selon l'invention. Ladite composition cosmétique selon l'invention contient de 0,00002 % à 5 %, de préférence de 0,00005 % à 0, 1 % et plus préférentiellement encore de 0,0001 % à 0,001 % en poids de peptide et au moins un excipient cosmétiquement acceptable.
Selon l'invention, ladite composition cosmétique peut également comprendre au moins un autre principe cosmétiquement actif.
Selon la. présente invention, ladite composition cosmétique se présente sous la forme d'une crème, d'un lait, d'une émulsion huile dans l'eau, d'une émulsion eau dans l'huile, d'une émulsion multiple, d'une solution, d'une suspension, d'un gel aqueux, d'un gel huileux, d'un gel hydroalcoolique, d'une lotion, d'un stick ou d'une poudre.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif. LEGENDES DES FIGURES :
Figure 1 : Schéma de la chaîne gamma 2 de la laminine 5 (155 kDa).
Figure 2 : Adhérence cellulaire des HBLlOOO aux peptides 1, 2 et 3.
Adhérence cellulaire dose dépendante des cellules de la lignée HBLlOO aux différents peptides 1, 2 et 3. Les peptides ont été immobilisés sur des plaques à 96 puits aux concentrations indiquées en abscisse. 8.104 cellules ont été déposées dans chaque puits et les plaques ont été incubées à 37°C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie.
Les cellules ont été observées en microscopie à contraste de phase puis photographiées. Barre - 50 μm.
Figure 3 : Adhérence cellulaire des HTl 080 aux peptides 1, 2 et 3.
Adhérence cellulaire dose dépendante des cellules de la lignée HT1080 aux différents peptides 1, 2 et 3. Les peptides ont été immobilisés sur des plaques à 96 puits aux concentrations indiquées en abscisse. 8.104 cellules ont été déposées dans chaque puits et les plaques ont été incubées à 37°C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie.
Les cellules ont été observées en microscopie à contraste de phase puis photographiées. Barre = 50 μm.
Figure 4 : Adhérence cellulaire des A431 aux peptides 1. 2 et 3.
Adhérence cellulaire dose dépendante des cellules de la lignée A431 aux différents peptides 1, 2 et 3. Les peptides ont été immobilisés sur des plaques à 96 puits aux concentrations indiquées en abscisse. 8.104 cellules ont été déposées dans chaque puits et les plaques ont été incubées à 370C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie.
Les cellules ont été observées en microscopie à contraste de phase puis photographiées. Barre = 50 μm.
Figure 5 : Adhérence cellulaire des kératinocytes humains normaux aux peptides 1, 2 et 3.
Adhérence cellulaire dose dépendante des kératinocytes humains normaux aux différents peptides 1 , 2 et 3. Les peptides ont été immobilisés sur des plaques à 96 puits aux concentrations indiquées en abscisse. 105 cellules ont été déposées dans chaque puits et les plaques ont été incubées à 37°C pendant 1 heure.
Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. Les cellules ont été observées en microscopie à contraste de phase puis photographiées. Barre = 50 μm.
Figure 6 : Adhérence cellulaire des NHK-ieunes versus NHK-âgés au peptide TALRIRATYGEY Adhérence cellulaire dose dépendante des NHK-IO ans versus NHK-
71 ans (A) et des NHK-Il ans versus NHK-60 ans (B) au peptide TALRIRATYGEY. Les peptides ont été immobilisés sur des plaques 96 puits aux quantités indiquées en abscisse. 3,5.104 cellules (A) et 4,3.104 cellules (B) ont été déposées dans chaque puit et les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. (C) Les cellules ont été observées en microscopie à contraste de phase puis photographiées. Barre, 50 μm. Figure 7 : Effet du peptide TALRIRATYGEY sur la prolifération des cellules HTl 080 et HBLlOO
Les cellules HT1080 (A) et les cellules HBL100 (B) ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 10 000 cellules parpuit. Après 24 heures, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu sans sérum contenant les quantités de peptide indiquées sur les graphes et le réactif XTT. Les plaques ont ensuite été placées dans un incubateur à 37°C et des lectures de l'absorbance ont été effectuées à Ih, 2h, 3h, 4h et 5h. Des témoins sans peptide ont été réalisés sur la même plaque.
Figure 8 : Effet du peptide TALRIRATYGEY sur la prolifération des cellules A431
Les cellules A431 ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 10 000 cellules par puit. Après 24 heures, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu sans sérum contenant les quantités de peptide indiquées sur les graphes et le réactif XTT. Les plaques ont ensuite été placées dans un incubateur à 37°C et des lectures de l'absorbance ont été effectuées à Ih, 2h, 3 h, 4h et 5h. Des témoins sans peptide ont été réalisés sur la même plaque.
Figure 9 : Effet du peptide TALRIRATYGEY sur la prolifération des
NHK-ieunes et des NHK-âgés.
Les NHK-10 ans etNHK-71 ans ont été ensemencés dans des plaques 96 puits à raison de 10000 cellules par puit. Après 24 heures, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu sans sérum contenant les quantités de peptide indiquées sur les graphes et le réactif XTT. Les plaques ont ensuite été placées dans un incubateur à 370C et des lectures de l'absorbance ont été effectuées à Ih, 2h, 3h, 4h et 5h. Des témoins sans peptide ont été réalisés sur la même plaque. Figure 10 : Effet du peptide TALRIRATYGEY sur la prolifération des NHKs.
Les NHKs ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 10 000 cellules par puit. Après 24 heures, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu KBM-2 contenant les quantités de peptide indiquées. Après 24h de contact à 37°C, les milieux ont été remplacés par le réactif XTT. Les plaques ont ensuite été placées dans un incubateur à 37°C et la lecture de l'àbsorbance a été effectuée à 3h. Des témoins sans peptide ont été réalisés sur la même plaque.
Figure 11 : Effet du peptide TALRIRATYGEY sur le comportement des NHKs.
Les NHKs ont été ensemencées dans des plaques 12 puits à raison de 5
000 cellules par puit. Après 24 heures de culture, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu neuf contenant les quantités de peptide 5% ; 2,5% ; 1,25% ; 0,6% et 0,3% (B-F). Un témoin sans peptide a été réalisés (A). La plaque a ensuite été placée dans un incubateur à 370C pendant 48 heures.
L'observation a été faite avec un microscope Axiovert 40 Zeiss. Barre, 50 μm.
Figure 12 : Effet du peptide TALRIRATYGEY sur le comportement des NHKs.
Observation, à plus fort grandissement, des colonies cellulaires décrites Figure 6. L'observation a été faite avec un microscope Axiovert 40 Zeiss équipé d'un bloc interférentiel PlasDic. Barre, 50 μm.
. Figure 13
(A) Représentation schématique de la laminine 5 et du collagène IV dans la jonction dermo-épidermique. (B) Adhérence cellulaire dose dépendante des NHKs à la laminine 5 et au collagène FV. La laminine 5 et le collagène FV ont été immobilisés sur des plaques 96 puits aux quantités indiquées en abscisse. 5.104 NHKs ont été déposées dans chaque puit et les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. (C) Les cellules ont été observées en microscopie à contraste de phase puis photographiées. Barre, 50 μm.
Figure 14 : Adhérence cellulaire des NHKs au peptide TALRIRATYGEY co-immobilisé avec la laminine 5. Les peptides 1, 2 et 3 (quantités variables indiquées) et la laminine 5
(quantité fixe 0,2 mg) ont été co-immobilisés sur des plaques 96 puits.5.104 NHKs ont été déposées dans chaque puit et les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. L'adhérence cellulaire en présence du peptide a été présentée en pourcentage de l'adhérence cellulaire obtenue à la laminine 5 seule. Les cellules ont été observées en microscopie à contraste de phase puis photographiées. Barre, 50 μm.
Figure 15 : Adhérence cellulaire des NHKs au peptide TALRIRATYGEY co-immobilisé avec le collagène IV.
Les peptides 1, 2 et 3 (quantités variables indiquées) et le collagène IV (quantité fixe 0,06 mg) ont été co-immobilisés sur des plaques 96 puits. 5.104 NHKs ont été déposées dans chaque puit et les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. L'adhérence cellulaire en présence du peptide a été présentée en pourcentage de l'adhérence cellulaire obtenue au collagène IV seul. Les cellules ont été observées en microscopie à contraste de phase puis photographiées. Barre, 50 μm. Figure 16 : Adhérence cellulaire des NHK-jeunes versus NHK-âgés au peptide TALRIRATYGEY co-immobilisé avec la laminine 5.
Le peptide (quantités variables indiquées) et la laminine 5 (quantité fixe 0,2 mg) ont été co-immobilisés sur des plaques 96 puits.3.104 NHK-8 ans et 3.104
NHK-63 ans ont été déposées dans chaque puit et les plaques ont été incubées à 37
0C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie.
L'adhérence cellulaire en présence du peptide a été présentée en pourcentage de l'adhérence cellulaire obtenue à la laminine 5 seule.
Figure 17
Tableau récapitulatif des dosages de peptide TALRIRATYGEY non immobilisé sur les plaques 96 puits.
Figure 18
Tableau récapitulatif des dosages de peptide TALRIRATYGEY non immobilisé sur les plaques 96 puits.
Figure 19 : Adhérence des cellules HTl 080 au peptide
TALRIRATYGEY
Adhérence cellulaire dose dépendante des cellules HTl 080 au peptide TALRIRATYGEY. Les peptides ont été immobilisés sur des plaques 96 puits aux quantités indiquées en abscisse. 8.104 cellules et 15.104 cellules ont été déposées dans chaque puit et les plaques ont été incubées à 37 0C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. Les cellules ont été observées en microscopie à contraste de phase puis photographiées. Barre, 50 μm. Figure 20 : Adhérence des cellules HTl 080 au peptide TALRIRATYGEY
Adhérence cellulaire dose dépendante des cellules HTl 080 au peptide TALRIRATYGEY. Les peptides ont été immobilisés sur des plaques 96 puits aux quantités indiquées en abscisse. 8.104 cellules et 15.104 cellules ont été déposées dans chaque puit et les plaques ont été incubées à 37 0C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. Les valeurs des absorbances à 570 nm sont indiquées dans le tableau.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 :
Des expériences d' adhérence cellulaire ont été effectuées sur 3 peptides avec des cellules communément utilisées pour les études d'adhérence cellulaire comme les HTl 080 (fibrosarcome humain), les HBL100 (épithélium mammaire humain), et les A431 (épithélioïdes de peau) afin de prouver la spécificité d'adhérence du peptide de l'invention. En plus du peptide de l'invention (peptide 1), deux autres peptides
(peptides 2 et 3, correspondant chacun à une séquence de la chaîne gamma 2 de la laminine-5 mais toutes deux différentes de la séquence du peptide de l'invention), ont été synthétisés et ont été utilisés comme contrôle lors des expériences d'adhérence cellulaire. Les peptides 1 et 2 sont situés au niveau de l'extrémité amino-terminale dans la région appelé « bras court » de la chaîne gamma 2 (Figure 1). Le bras court des laminines comporte des séquences pauvres en cystéines repliées en un domaine globulaire (le domaine L4m). Ce domaine est entouré de répétitions riches en cystéines agencées en bâtonnets (les domaines LE, 3 domaines LE de chaque côté). Ces derniers sont composés d'un motif de 50 acides aminés présentant une homologie avec le facteur de croissance épidermique (domaines type EGF). Le peptide 3 a été choisi au niveau de l'extrémité carboxy-terminale. Les domaines caboxy-terminaux I et II sont impliqués dans l'assemblage des trois chaînes alpha, bêta et gamma et forment une hélice alpha superenroulée formant le bras long de la laminine. La séquence d'intérêt est localisée sur le domaine globulaire L4m.
Au cours des expériences d'adhérence cellulaire, des effets doses- réponses ont été effectuées et le phénotype des cellules adhérées analysé en microscopie à contraste de phase (prise de photos).
I- Informations sur le peptide de l'invention : TALRIRATYGEY (SEO ID N° 1)
Nombre d'acides aminés : 12
Poids moléculaire : 1413,6
Point Isoélectrique théorique : 8,25
Composition en acides aminés
AIa (A) 2 16,7 % Met (M) 0 0,0 %
Arg (R) 2 16,7 % Phe (F) 0 0,0 %
Asn (N) 0 0,0 % Pro (P) 0 0,0 %
Asp (D) 0 0,0 % Ser (S) 0 0,0 %
Cys (C) 0 0,0 % Thr (T) 2 16,7%
GIn (Q) 0 0,0 % Trp (W) 0 0,0 %
Glu (E) 1 8,3 % Tyr (Y) 2 16,7%
GIy (G) 1 8,3 % VaI (V) 0 0,0 %
His (H) 0 0,0 % Asx (B) 0 0,0 %
Ile (I) 1 8,3 % GIx (Z) 0 0,0 % Leu (L) 1 8,3 % Xaa (X) 0 0,0 %
Lys (K) 0 0,0 %
Nombre total de résidus chargés négativement (Asp + Glu) : 1 Nombre total de résidus chargés positivement (Arg + Lys) : 2
Composition atomique : Carbone C 63
Hydrogène H 100 Azote N 18 Oxygène O 19
Soufre S 0
Formule : C63H100N18O19 Nombre total d'atomes : 200 Coefficient d'extinction : Conditions: 6,0 M d'hydrochlorure de guanidium
0,02 M de tampon phosphate pH 6,5 Les unités des coefficients d'extinction sont en M" cm"
276 278 279 280 282 nm nm nm nm nm
Ext. coefficient 2900 2800 2690 2560 2400 Abs 0,1 % (=1 g/1) 2.051 1.981 1.903 1.811 1.698 Demi-vie estimée :
Le N-terminal de la séquence considérée est T (Thr). La demi-vie estimée est : 7,2 heures (réticulocytes de mammifères, in vitro).
>20 heures (levures, in vivo).
>10 heures (Escherichia coli, in vivo). Index d'instabilité :
L'index d'instabilité a été calculé à 11,86 Ceci classifie la protéine comme stable. Index aliphatique : 81,67
Moyenne d'hydropathie : - 0,417
II- Matériels et méthodes
1°) Procédé de fabrication des peptides
La synthèse peptidique a été effectuée sur un Synthétiseur Milligen
9050 en utilisant une chimie Fmoc-Opfp/Hobt. Le peptide est ensuite analysé et purifié sur une colonne Vydac C 18 (5 μm) de 4,6 ou 10 mm de diamètre et 250 mm de longueur puis caractérisé par spectrométrie de masse électrospray sur un SCIEX API 165.
2°) Séquence des peptides
Peptide 1 : TALPJRATYGEY (SEQ ID N° 1) Position 344-355 (Figure 1)
Peptide 2 : GLTKTYTFRLNE (SEQ ID N° 2)
Position 309-321 (Figure 1)
Peptide 3 : DVKNLENIRDNL (SEQ ID N0 3)
Position 1169- 1180(Figure 1)
3) Analyse quantitative des propriétés d'adhérence cellulaire du peptide de l'invention par un test colorimétrique - Préparation des substrats d'adhérence
Les peptides 1, 2 et 3 ont été utilisés au cours des expériences d'adhérence cellulaire. Une gamme de 7 concentrations décroissantes (100 microgrammes/ml; 50 microgrammes/ml; 25 microgrammes/ml; 12,5 microgrammes/ml; 6,25 microgrammes/ml; 3,125 microgrammes/ml et 1,562 microgrammes/ml) a été réalisée par dilution successive dans du PBS (Phosphate Buffer Saline, KH2PO4 1,54 mM ; Na2HPO4 1,42 mM ; NaCl 131 mM), à partir d'une solution de départ à 1 mg/ml. Ces solutions ont été immédiatement distribuées sur des plaques de culture à 96 puits (Greinher, Dutscher, Brumath, France) à raison de 100 μl par puits. Les plaques ont ensuite été placées à + 4°C pendant 16 à 18 heures. Les solutions ont ensuite été enlevées par retournement des plaques et chaque puits a été saturé par une solution de PBS-SAB 1% (sérum albumine bovine). Trois puits supplémentaires sans substrat ont subi le même traitement et ont servi de blanc. - Test d'adhérence cellulaire
Les cellules épithéliales ont été détachées des boîtes de culture par une solution de trypsine/EDTA (0,05-0,02 %), puis ont été suspendues dans du milieu DMEM sans additifs pour les lignées cellulaire et KBM-2 sans additif pour les kératinocytes humains. Le nombre de cellules semées par puits est indiqué dans les légendes des graphes (50 000 à 100 000 cellules par puits).
- Evaluation du test d'adhérence cellulaire
Après ensemencement des cellules, les plaques multipuits ont été placées dans un incubateur à 370C sous atmosphère de CO2 à 5 %. Après une incubation de 30 à 60 minutes, les cellules sont observées au microscope à contraste de phase afin de vérifier que le test s'est correctement déroulé. Le milieu d'adhérence est alors éliminé et chaque puits est lavé avec une solution de PBS stérile afin d'enlever les cellules n'ayant pas adhérées. Les cellules restantes, adhérentes au substrat, sont ensuite fixées à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde à 1 % dans du PBS, pendant 15 minutes. La solution de glutaraldéhyde est enlevée et les cellules sont alors colorées avec une solution de crystal violet dilué à 1 % dans de l'eau distillée pendant 30 minutes.
Après plusieurs rinçages à l'eau, les cellules sontperméabilisées par une solution de triton à 0,02 % pendant 15 minutes, afin de solubiliser le crystal violet. La lecture de l'absorbance est effectuée à 570 nm, à l'aide d'un lecteur de plaques ELISA reader (MR500, Dynatech, Guernsey Chanel, Island). Chaque point expérimental a été réalisé en trois exemplaires. La valeur du blanc représente la moyenne de l'absorbance des 3 puits témoins (SAB). Celle-ci a été soustraite à chacune des valeurs de densité optique obtenues pour les points expérimentaux. On a ensuite calculé les moyennes des trois valeurs d'absorbance pour chacune des tripliquettes.
Les résultats ont été représentés sous forme de courbe, avec en ordonnée, les valeurs de l'absorbance, et en abscisse, les différentes concentrations en substrat. Les cellules adhérées ont été photographiées en microscopie à contraste de phase.
4) Les cellules utilisées pour l'étude
A- les lignées
Dans un premier temps les cellules suivantes provenant de lignées épithéliales (couramment utilisées pour les études préliminaires d'adhérence cellulaire) ont été utilisées :
- les cellules de la lignée HTl 080 (fibrosarcome humain), American Type Culture Collection CCL- 121.
- les cellules de la lignée HBL100 (épithélium mammaire humain), American Type Culture Collection HTB -124. - les cellules de la lignée A431 (épithélioïdes de peau), American
Type Culture Collection CRL-1555.
Ces cellules ont été maintenues en culture dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et 2mM de glutamine et ont été cultivés à 37°C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, 95 % d'air et 98 % d'humidité).
B- les Mratinocytes primaires
Dans un deuxième temps des kératinocytes humains normaux fraîchement isolés ont été utilisés. En effet, les kératinocytes basaux de Pépiderme étant en contact direct avec la LN-5 dans la peau, il était nécessaire de tester leur capacité d'adhérence sur le peptide d'intérêt. Les kératinocytes humains ont été obtenus à partir de biopsie de prépuce (déchet opératoire, Pavillon T-Bis, Hôpital
Edouard Herriot). Le milieu de culture utilisé au cours de notre travail a été le milieu défini pour culture de kératinocytes KBM-2 (contenant : Extrait pituitaire bovin 35 mg, hEGF 10 ng/ml, insuline 5 μg/ml, Hydrocortisone 0,5 μg/ml, transferrine 0,1 %, épinéphrine 0,1 %) fabriqué par Clonetics et commercialisé par
Cambrex (Belgique) contenant 0,15 mM de CaC12, pH 7,2 à 7,4.
Les kératinocytes ont été obtenus selon la technique décrite par Boyce et Ham (Cultivation, frozen storage, and clonal growth of normal human epidermal kératinocytes in sérum free-media, Tiss Cuit. Meth. 1985, 9 :83-93). Les morceaux de peau, après rinçage soigné dans du tampon PBS contenant des antibiotiques, sont débarrassés du tissu graisseux situé sous le derme à l'aide d'instruments stériles. La peau a ensuite été découpée en morceaux de 3 mm2, lesquels ont été placés dans une solution stérile de trypsine à 0,25 % dans du PBS pendant 16 heures à 40C. La séparation derme / épiderme a été effectuée à l'aide de pinces fines dans une boîte de Pétri contenant du milieu de culture afin d'arrêter l'action enzymatique de la trypsine. Les fragments d' épiderme ont été aspirés et refoulés plusieurs fois avec une pipette pour en détacher les cellules basales libres. La suspension cellulaire ainsi obtenue a été centrifugée 5 min à 1000 tours/min et le culot ainsi obtenu a été suspendu dans un volume connu de KBM-2 pour effectuer un comptage des cellules vivantes à l'aide d'un colorant d'exclusion : le bleu trypan. 3.104 cellules vivantes ont été ensemencées par cm sur des boîtes pour culture de tissus de 25 cm (Corning, Polylabo, France). Les kératinocytes ont été cultivés à 370C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, 95 % d'air et 98 % d'humidité). Le milieu a été changé tous les deux jours. La sous-culture a eu lieu quand les cellules ont atteint la sous-confluence. Le tapis cellulaire a alors été rincé avec du PBS, puis recouvert d'une solution de Trypsine-EDTA (0,05-0,02 %). Après une courte incubation à 37°C, les cellules se sont détachées du support plastique. Les cellules ont alors été ensemencées dans des boîtes de culture de 75 cm2. La congélation des cellules (3 à 5 millions par ampoule) a été réalisée dans le milieu de culture utilisé, en présence de 10 % de Diméthyl sulfoxyde (DMSO) et 20 % de sérum de veau sous un volume de 1 ml.
III- Résultats
Les expériences d'adhérence cellulaire présentées sur les figures 1 à 5 ont été effectuées avec les quantités depeptides immobilisées suivantes : 0 ; 0,15 ; 0,31 ; 0,62 ; 1,25 ; 2,5 ; 5 ; et 10 microgrammes. Deux lots différents dupeptide 1 ont été testés en parallèle. Les peptides 2 et 3 sont des peptides contrôle ; le peptide 2 a été volontairement choisi dans une région proche du peptide 1 dans le domaine L4 de la chaîne gamma 2 et le peptide 3 dans une région éloignée. Le peptide 1 (peptide de l'invention) induit l'adhérence cellulaire des différentes lignées épithéliales testées : HBLl 00 (Figure 2), HTl 080 (Figure 3) et A431 (Figure 4) de façon croissante en fonction de la quantité de peptide immobilisé variant de 0 à 10 microgrammes. Cet effet est également obtenu avec les cellules de l'épidémie : les kératinocytes humains normaux (Figure 5). Les cellules sont solidement ancrées sur le peptide puisqu'elles ont résisté aux différents lavages avant leur fixation. Les deux autres peptides (peptides 2 et 3), choisis au hasard sur la même protéine, n'induisent aucune adhérence quelque soit la quantité immobilisée. L'adhérence des kératinocytes humains normaux est induite pour une quantité de peptide 1 immobilisée de 0, 15 microgrammes et l' adhérence maximale est atteinte pour une quantité de peptide 1 immobilisée de 0,62 microgrammes (Figure 5). L'adhérence des cellules HBL 100 est induite pour une quantité de peptide 1 immobilisée de 0,31 microgrammes et l'adhérence maximale est atteinte pour une quantité dé peptide 1 immobilisée de 1,25 microgrammes (Figure 2). L'adhérence des cellules HTl 080 est induite pour une quantité de peptide 1 immobilisée de 0,15 microgrammes et l'adhérence maximale est atteinte pour une quantité de peptide 1 immobilisée de 0,15 microgrammes (figure 3). L'adhérence des cellules A431 est induite pour une quantité de peptide 1 immobilisée de 0,62 microgrammes et l'adhérence maximale est atteinte pour une quantité de peptide 1 immobilisée de 1,2 microgrammes. Les photos obtenues en microscopie à contraste de phase confirment les résultats quantitatifs et confirment l'absence de cellules adhérées sur les peptides contrôles 2 et 3. Les cellules adhérées au peptide TALRIRATYGEY (peptide de l'invention) présentent majoritairement une morphologie arrondie avec des regroupements cellulaires fréquents (Figures 2, 3, 4 et 5). Ces regroupements peuvent être le signe de la mise en place d'interactions cellules-cellules. On note également la présence de prolongements cellulaires qui sont les plus visibles dans le cas des HBL100 (Figure2), des HTl 080 (Figure 3) et des kératinocytes humains normaux (Figure 5). On les voit plus difficilement dans le cas des A431, car les cellules sont plus petites. Ces prolongements cellulaires peuvent être le signe d'un réarrangement du cytosquelette de la cellule en réponse à l'adhérence sur le peptide. Les résultats ont été confirmés avec les kératinocytes humains normaux (cellules de l' épidémie, Figure 5). EXEMPLE 2 I. Matériel et méthodes
1°) Culture des cellules a0) Les lignées et kératinocytes humains normaux ( voir Exemple 1) b°) Obtention et culture des kératinocytes jeunes et âgés
Pour obtenir des kératinocytes provenant de biopsies de sujets très jeunes et de sujets âgés, prélevés au même site anatomique, les inventeurs ont effectué l'étude sur des biopsies cutanées de la face. La zone du visage située derrière les oreilles a été choisie afin de n'étudier que le vieillissement intrinsèque et de s'affranchir des effets provoqués par le vieillissement photo-induit. Des déchets opératoires provenant d'opérations de chirurgie esthétique (lifting en l'occurrence) chez des sujets d'âge avancé et des déchets opératoires provenant des interventions sur oreilles décollées chez des jeunes enfants ont été collectés. Il était primordial de disposer des biopsies le jour même de l'intervention afin de mettre en culture rapidement, les kératinocytes de 1 ' épidémie. Pour cette étude les cellules de biopsies de sujets âgés (60, 63 et 71 ans) et de sujets jeunes (8, lO et ll ans) ont été utilisées. Les kératinocytes ont été obtenus selon la technique décrite par Boyce et Ham, 1985. Les morceaux de peau, après rinçage soigné dans du tampon PBS contenant des antibiotiques, ont été débarrassés du tissu graisseux situé sous le derme à l' aide d'instruments stériles. La peau a ensuite été découpée en morceaux de 3 mm2, lesquels ont été placés dans une solution stérile de trypsine à 0,25 % dans du PBS pendant 16 heures à 40C. La séparation derme / épiderme a été effectuée à l'aide de pinces fines dans une boîte de Pétri contenant du milieu de culture afin d'arrêter F action enzymatique de la trypsine. Les fragments d' épiderme ont été aspirés et refoulés plusieurs fois avec une pipette pour en détacher les cellules basales libres. La suspension cellulaire ainsi obtenue a été centrifugée 5 min à 1000 tours/min et le culot ainsi obtenu a été suspendu dans un volume connu de milieu KBM-2 pour effectuer un comptage des cellules vivantes à l'aide d'un colorant d'exclusion : le bleu trypan. 3.104 cellules vivantes ont été ensemencées par cm2 sur des boîtes pour culture de tissus de 25 cm2 (Corning, Polylabo, France). Les kératinocytes ont été cultivés à 37°C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, 95% d'air et 98% d'humidité). Le milieu a été changé tous les deux jours. La sub-culture a eu lieu quand les cellules ont atteint la sub-confluence. Le tapis cellulaire a alors été rincé avec du PBS, puis recouvert d'une solution de Trypsine-EDTA (0,05-0,02 %). Après une courte incubation à 370C, les cellules se sont détachées du support plastique. Les cellules ont alors été ensemencées dans des boîtes de culture de 75 cm2. La congélation des cellules (3 à 5 millions par ampoule) a été réalisée dans le milieu de culture utilisé, en présence de 10 % de Dirnéthyl Sulfoxyde (DMSO) et 20 % de sérum de veau sous un volume de 1 ml. Lors de la décongélation, les cellules ont été semées à raison de 10 000 cellules/cm2.
2°) Tests d'adhérence cellulaire Dose-réponses d'adhérence cellulaire des cellules jeunes et âgées sur le peptide TALRJRATYGEY
Une gamme de 7 quantités décroissantes de peptide TALRIRATYGEY a été réalisée par dilution successive dans du PBS (Phosphate Buffer Saline, KH2PO4 1,54 mM ; Na2HPO4 1,42 mM ; NaCl 131 mM), àpartir d'une solution du peptide à 1 mg/ml. Ces solutions ont été immédiatement distribuées sur des plaques de culture 96 puits (Greiner, Dutscher, Brumath, France) à raison de 100 μl par puit. Les plaques ont été placées à +40C pendant 16 à 18 heures. Les solutions ont ensuite été enlevées par retournement des plaques et chaque puit a été saturé par une solution de PBS-SAB 1% (sérum albumine bovine). Trois puits supplémentaires sans substrat ont subit le même traitement et ont servi de blanc.
Les kératinocytes provenant de sujets jeunes ou âgés ont été détachées des boîtes de culture par une solution de trypsine/EDTA (0,05-0,02%), puis ont été suspendues dans du milieu KBM-2. Le nombre de cellules semées par puit est indiqué sur les graphes. Le même nombre de cellules jeunes/agés est utilisé au cours des expériences comparatives.
Après ensemencement des cellules, les plaques multipuits ont été placées dans un incubateur à 37°C sous atmosphère 5 % CO2. Après une incubation de 30 à 60 minutes, les cellules sont observées à l'aide d'un microscope à contraste de phase afin de vérifier que le test se soit correctement déroulé. Le milieu d'adhérence a alors été éliminé et chaque puit a été lavé avec une solution de PBS stérile afin d'enlever les cellules n'ayant pas adhérées. Les cellules restantes, adhérentes au substrat, ont été fixées à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde 1 % dans du PBS, pendant 15 minutes. La solution de glutaraldéhyde a été enlevée et les cellules ont été colorées avec une solution de Crystal Violet diluée à 1 % dans de l'eau distillée pendant 30 minutes. Après d'importants rinçages à l'eau, les cellules ont été perméabilisées par une solution de triton à 0,02 % pendant 15 minutes, afin de solubiliser le Crystal Violet. La lecture de l'absorbance a été effectuée à 570 nm, à l'aide d'un lecteur de plaques ELIS A-Reader (MR500, Dynatech, Guernsey Chanel, Island). Chaque point expérimental a été réalisé en trois exemplaires. La valeur du blanc représente la moyenne de l'absorbance des 3 puits témoins (SAB). Celle-ci a été soustraite à chacune des valeurs de densité optique obtenues pour les points expérimentaux. On a ensuite calculé les moyennes des trois valeurs d'absorbances pour chacun des triplicatas.
Les résultats ont été représentés sous forme de courbe, avec en ordonnée, les valeurs de l'absorbance, et en abscisse, les différentes quantités de substrat déposées dans les puits. Les cellules adhérées ont été photographiées avec un microscope à contraste de phase.
IL Résultats et Discussion
Adhérence cellulaire des NHK-jeunes et NHK-âgés
Sachant que le vieillissement cutané est caractérisé par une déficience des interactions cellules-matrice extracellulaire, il était nécessaire de vérifier la capacité des kératinocytes provenant de sujets âgés à pouvoir adhérer au peptide d'intérêt. Deux expériences comparatives d'adhérence cellulaire « NHK-jeunes versus NHK âgés » au peptide TALRIRATYGEY ont été effectuées (Figure 6). Les expériences ont été réalisées avec les quantités de peptides : 0, 0,08 ; 0,15 ; 0,30 ; 0,6 ; 1,25 ; 2,50 et 5 microgrammes déposés par puit. Pour chacune de ces deux expériences, le nombre de NHK-jeunes et NHK-âgés a été identique afin de pouvoir comparer le résultat obtenu. Une expérience a été effectuée avec des kératinocytes provenant d'une biopsie cutanée d'un enfant de 10 ans et de ceux d'un adulte de 71 ans (figure 6A), l'autre expérience a été effectuée avec des kératinocytes provenant d'une biopsie cutanée d'un enfant de 11 ans et de ceux d'un adulte de 60 ans (figure 6B). Le peptide TALRIRATYGEY induit l'adhésion cellulaire des NHK-jeunes et des NHK-âgés de façon dose dépendante. On constate, dans les deux expériences, qu'un plus grand nombre de NHK-jeunes (approximativement 2 fois plus) ont adhéré par rapport aux NHK-âgés. Ce résultat indique que le récepteur cellulaire reconnaissant le peptide TALRIRATYGEY pourrait diminuer avec l'âge. Le point intéressant est qu'il est toujours exprimé de façon significative et qu'il est fonctionnel puisque l'effet dose-réponse du peptide vis-à-vis des NHK-âgés est identique à l'effet dose obtenu avec les NHK-jeunes. Les photos obtenues en microscopie à contraste de phase confirment les résultats quantitatifs. Les NHK-jeunes adhères au peptide TALRIRATYGEY présentent majoritairement une morphologie arrondie avec des regroupements cellulaires fréquents (comme décrit dans l'exemple 1), on note moins de cellules dans le cas des NHK-âgés. L'adhérence des NHK-jeunes est induite pour la quantité de peptide déposé 0,08 μg et celle des NHK-âgés pour une quantité déposée variant de 0,08 à 0, 15 μg. Le plateau d' adhérence est atteint dans la fourchette de 0,3 à 0,6 microgrammes de peptide déposé par puit. EXEMPLE 3 I. Matériel et méthodes
1°) Culture des cellules a°) Les lignées et kératinocytes humains normaux ( voir Exemple 1) b°) Obtention et culture des kératinocytes jeunes et âgés (voir exemple 2)
2°) Test de prolifération cellulaire
L'effet dupeptide sur la prolifération cellulaire a été analysé à l'aide d'un test colorimétrique (CeIl Prolifération Kit XTT, Roche Diagnostics, Meylan, France) sur les cellules utilisées pour les tests d'adhérence cellulaire, à savoir : les cellules
HTl 080, A431 , HBL 100 et les kératinocytes humains normaux provenant de-sujets jeunes et de sujets âgés.
La réaction chimique du test est basée sur la production de NADPH des cellules vivantes permettant la réduction des sels de tétrazolium XTT jaunes en sels de formazan orange. Lamesuredel'absorbance esteffecméeà490nmàPaided'un lecteur de plaques ELISA-Reader. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 10 000 cellules par puit (6 puits/condition) dans du milieu de culture KBM-2. Après 24 heures de culture à 37°C en présence de 5% de CO2, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu sans sérum contenant les quantités de peptide indiquées sur les graphes et le réactif du test. Les plaques ont ensuite été placées dans un incubateur à 370C et des lectures de Pabsorbance ont été effectuées à Ih, 2h, 3h, 4h et 5h. Des témoins sans peptide ont été réalisés sur la même plaque. Les résultats sont présentés sous 2 formes:
- sous la forme de courbes montrant l'évolution de Pabsorbance en fonction du temps
-ou sous la forme du pourcentage de la viabilité des cellules mises en présence du peptide par rapport aux témoins sans peptide. Dans ce cas, la viabilité cellulaire a été calculée selon la formule : %viabilité = (Abs. cellules avec peptide / Abs. cellules témoins) X 100.
3°) Etude de l'effet du peptide apporté sous forme soluble sur le comportement des kératinocytes Les kératinocytes ont été ensemencés dans des plaques 12 puits (Costar) à raison de 5 000 Cellules / puit dans du milieu KBM-2. Après 24 heures de culture à 370C en présence de 5% de CO2, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu KBM-2 contenant les quantités de peptide indiquées sur les Figures (un contrôle sans peptide a été effectué). Après 24 heures de culture, la même quantité de peptide a été ajoutée au milieu de culture et l'expérience à été arrêtée après 24 heures supplémentaires de culture. L'analyse microscopique a été effectuée sans fixation préalable avec un microscope Axiovert 40 Zeiss couplé à une caméra Coolsnap (Roper Scientific, Evry, France).
II. Résultats et Discussion
1- Effet du peptide sur la prolifération cellulaire
Dans le but d'analyser l'effet du peptide TALRIRATYGEY sur la prolifération cellulaire les inventeurs ont dans un premier temps analysé l'effet de 2 concentrations différentes 0,5 et 1% sur les cellules HTl 080, HBL100 et A431 (Figures 7, 8 et 9). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 10000 cellules par puit. Après 24 heures de culture, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu sans sérum contenant les quantités de peptide indiquées sur les graphes et le réactif du test. Les plaques ont ensuite été placées dans un incubateur à 37°C et des lectures de Pabsorbance ont été effectuées à Ih, 2h, 3h, 4h et 5h. Des témoins sans peptide ont été réalisés sur la même plaque. Une augmentation modérée mais régulière de la prolifération des cellules de la lignée HTl 080 (Figure 7A), de la lignée HBLl 00 (figure 7B), et de la lignée A 431 (Figure 8) a été observée au cours du temps pour atteindre à la 5ème heure une augmentation moyenne de 8 % par rapport au contrôle. Des temps plus longs ont été testés et n'ont pas montré d'effet plus prononcé. Aucune différence n'a été notée entre les deux concentrations de peptide testées quel que soit le type cellulaire testé. Le test a ensuite été réalisé avec des NHK-jeunes et NHK-âgés (Figure 9). Les quantités de peptide ajoutées ont été réduites (0,05 % et 0,1%) dans le but de réaliser le test dans une gamme de concentrations plus proche des conditions d'utilisation du peptide au cours des tests d'adhérence. A nouveau, une augmentation modérée et régulière de la prolifération a été observée pour atteindre à la 5ème heure une augmentation moyenne n'excédant pas 7 % par rapport au contrôle. Aucune différence significative n'a été observée, ni entre les deux concentrations utilisées, ni en fonction de l'âge des cellules. Une dernière série d'expériences a été effectuée avec les NHKs sur une gamme plus large de concentrations du peptide et sur un temps plus long (24h) (Figure 10). Les résultats sont présentés sous la forme du pourcentage de la viabilité des cellules mises en présence du peptide pendant 24h par rapport aux témoins sans peptide. Dans cette expérience, on note une augmentation de la prolifération cellulaire variant de 6 à 13 % en fonction de la concentration du peptide ajouté (0,004% à 0,37 %).
2- Etude de l'effet du peptide apporté sous forme soluble sur le comportement des kératinocytes en culture
Le peptide TALRIRATYGEY induit l'adhérence cellulaire lorsqu'il est fixé sur les plaques 96 puits (Exemples 1 et 2). Nous avons voulu savoir s'il était capable d'agir sur le comportement des kératinocytes lorsqu'il est ajouté dans le milieu de culture. Pour cela, les NHKs ont été ensemencées dans des plaques 12 puits à raison de 5 000 cellules par puit. Après 24 heures de culture, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu neuf contenant les quantités de peptide 5% ; 2,5% ; 1,25% ; 0,6% et 0,3%. Un témoin sans peptide a été réalisé dans la même plaque. La plaque a ensuite été placée dans un incubateur à 37°C et l'opération a été répétée une fois pour 24 heures de culture supplémentaires. Dans le puit témoin (sans ajout de peptide), les NHKs sont, pour la majorité, encore isolés et commence à se rassembler en colonie (Figure 1 IA). On constate que les NHKs cultivés en présence du peptide sont déjà rassemblés en colonies de plus grande taille bien identifiables (Figure 1 IB-F). L'observation de ces colonies à plus fort grossissement (Figure 12), montre que les cellules cultivées en présence de peptide forment un tapis cellulaire jointif et cohésif. On n'observe pas de différence morphologique entre les cellules cultivées en présence du peptide (Figure 12B5C) et les cellules contrôles (Figure 12A). Cependant l'ajout du peptide dans le milieu des NHKs a permis la formation de colonies cohésives plus rapidement. Cet effet peut être la conséquence de la petite augmentation de la prolifération cellulaire induite par le peptide.
EXEMPLE 4 I. Matériel et méthodes
1°) Culture des cellules a°) Les lignées et kératinocytes humains normaux ( voir Exemple 1) b°) Obtention et culture des kératinocytes jeunes et âgés (voir exemple 2)
2°) Test d'adhérence cellulaire
Analyse de l'effet du peptide d'intérêt sur l'adhérence des kératinocytes à la laminine 5 CLN5*) et au collagène IV fC0L4^
Une gamme de quantités décroissantes de LN5 (préparée au laboratoire) et de COL4 (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) ont été réalisée par dilution successive dans du PBS. Ces solutions ont été immédiatement distribuées dans des plaques de culture 96 puits (Costar) à raison de 100 μl par puit. Le déroulement de l'expérience est identique à ce qui est décrit dans l'exemple 2). Les résultats ont été représentés sous forme de courbe, avec en ordonnée, les valeurs de l'absorbance représentative de l'adhérence, et en abscisse, les différentes quantités de substrat déposées dans les puits. Les cellules adhérées ont été photographiées avec un microscope à contraste de phase.
II. Résultats et Discussion
Analyse de l'effet du peptide sur l'adhésion des kératinocytes à la Laminine 5 et au collagène IV.
Le réseau moléculaire de base de la jonction dermo-épidermique (JDE) est constitué par l'assemblage des molécules de collagène IV (COL4). Ce réseau moléculaire conduit à la formation d'un filet à mailles lâches, structure polygonale servant de charpente pour arrimer les autres protéines de la lame basale (Figure 13A). Un second réseau moléculaire, est formé par les molécules de laminine. La laminine 5 (LN5) est la glycoprotéine quantitativement la plus importante de la jonction dermo-épidermique, elle est le composant des filaments d'ancrage. LaLN5 joue un rôle crucial et irremplaçable dans l'adhérence de Pépiderme par le biais d'interactions avec les intégrines. Dans le but d'analyser l'effet du peptide TALRIRATYGEY dans le contexte de la JDE, les inventeurs ont effectué des expériences de co-immobilisation du peptide avec la LN5 et le COL4 et analysé les capacités d'adhérence des kératinocytes. Dans un premier temps, pour définir les conditions expérimentales, des expériences d'adhérence aux substrats (LN5 et COL4) seuls ont été effectuées. Les expériences ont été réalisées avec les quantités de peptides : 0 ; 0,03 ; 0,06 ; 0,125 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 et 2 microgrammes par puit. Comme largement décrit dans la littérature et illustré sur la figure 13B, les 2 protéines testées induisent l'adhérence des NHKs mais la LN5 est un bien meilleur substrat. Les photographies obtenues en microscopie à contraste de phase confirment les résultats quantitatifs et montrent que la LN5 induit la formation d'un tapis cellulaire épithélial cohésif alors et le COL4 induit une adhérence plus faible (Figure 13 C). Pour la suite des expériences, une quantité de substrat (LN5 et COL4) inductrice d'une adhérence moyenne ont été sélectionnées sur les courbes présentées Figure 13B : 0,2 microgramme de LN5 et 0,03 microgramme de COL4.
Pour analyser l'effet du peptide sur l'adhérence cellulaire aux protéines de la
JDE, le peptide TALRIRATYGEY (peptide 1) a été co-immobilisé avec la LN5 (Figure 14) et le COL4 (Figure 15). La quantité de protéine matricielle (LN5 et
COL4) fixe et la quantité de peptide variable sont indiquées sur les graphes (Figures
14 et 15). Les peptides 2 et 3 (décrits dans l'exemple 1) ont été utilisés comme contrôles au cours de cette expérience. Les tests d'adhérence ont été effectués avec des NHK dans les mêmes conditions que dans l'expérience présentée Figure 13 (50 000 cellules par puit). Pour analyser l'effet d'adhérence lié àla présence du peptide, un contrôle sans peptide a été effectué et représente le 100 % d'adhérence (LN5 seule ou COL4 seul). Les résultats ont ensuite été exprimés en pourcentage de ce contrôle.
Comme présenté sur la Figure 14, le peptide TALRIRATYGEY augmente de façon progressive et significative l'adhérence des NHKs à la LN5. L'adhérence à la LN5 est en moyenne doublée pour une quantité de peptide de 0,21 à 0,87 μg/puit. Cet effet est spécifique puisqu'il n'est pas observé pour les peptides contrôles 2 et 3. Les photographies obtenues en microscopie à contraste de phase confirment les résultats quantitatifs et montrent que la LN5 utilisée seule à 0,2 mg induit une adhérence moyenne. L' apport du peptide P 1 induit la formation d'un tapis cellulaire confluent alors que les peptides P2 et P3 ne modifient pas l'adhérence obtenue avec la LN5 seule. La même expérience menée avec le COL4 (Figure 15) ne montre pas d'effet significatif du peptide TALRIRATYGEY sur l'adhérence des kératinocytes au COL4. L'ensemble de ces résultats indiquent que le peptide TALRIRATYGEY potentialise l'adhérence des NHKs à la LN5 lorsque ces 2 protéines sont présentes conjointement.
L'effet du peptide TALRIRATYGEY sur l'adhérence à la LN5 a été vérifié avec des NHKs-âgés (Figure 16). Des NHKs-jeunes (8 ans) ont été testés en parallèle et 30000 cellules/puit ont été utilisées dans les 2 cas (les NHKs-âgés sont toujours limitant car obtenus en plus faible quantité). D'une manière générale, les résultats obtenus au cours de cette expérience sont moins prononcés que ceux obtenus lors de l'expérience présentée Figure 14 car (1) le nombre de cellules est inférieur (30000 au lieu de 50 000) et (2) la gamme de peptide testée est également inférieure. Cependant, l'effet de potentialisation du peptide TALRIRATYGEY sur l'adhérence des NHK-âgés à la LN5 est observé. Cet effet, moins prononcé que l'effet obtenu avec les NHKs-jeunes, est vraisemblablement lié à la diminution de l'adhérence des NHKs-âgés au peptide TALRIRATYGEY avec l'âge (Figure 6).
EXEMPLE 5
Détermination de la quantité minimale peptide induisant l'adhérence cellulaire. I. Matériel et méthodes
1°) Production du peptide
Le peptide a été construit, comme décrit dans l'exemple 1. La synthèse peptidique a été effectuée sur un Synthétiseur Milligen 9050 en utilisant une chimie Fmoc-Opfp/Hobt. Le peptide a ensuite été détaché de la résine et déprotégé en utilisant une solution de TFA (acide trifluororacétique) contenant des scavengers (phénol, eau, ethanedithiol et thioanisole). Le peptide a ensuite été analysé et purifié sur une colonne Vydac Cl 8, 5mm de 4.6 ou 10 mm de diamètre et 250 mm de longueur puis caractérisé par spectrométrie de masse électrospray sur un SCIEX API 165.
2°) Détermination de la quantité de peptide immobilisé sur les plaques par la méthode d'analyse des acides aminés.
Le peptide a été dilué dans du PBS stérile. Les échantillons contenant le peptide à doser ont été lyophilisés par évaporation. Ils ont été déposés dans un réacteur et soumis à un vide poussé afin d'éliminer les molécules d'oxygène susceptibles d'oxyder certains acides aminés. L'hydrolyse des liaisons peptidiques a été effectuée à l'aide d'un mélange d'Acide Chlorydrique (HCL 6N, 2/3), Acide Trifiuoro-Acétique (TFA, 1/3) dans une enceinte à 150°C pendant 45 minutes. L'hydrolyse en phase gazeuse permet d'éviter les contaminations par des ions présents dans les acides. Les échantillons ont ensuite été séchés et solubilisés dans un tampon approprié à la chromatographie échangeuse d'ions (citrate de sodium). La chromatographie échangeuse d'ions a permis de séparer les acides aminés selon leur force ionique, et à leur sortie de colonne, ils réagissent avec un réactif, la ninhydrine, pour former un complexe coloré avec les aminés primaires (violet, lisible à 570 nm). La ninhydrine réagit aussi avec les aminés secondaires (proline, hydroxyproline) pour former un composé jaune lisible à 440 nm. Deux chromatogrammes distincts permettent l'analyse des échantillons. Un analyseur semi-automatique Beckman 6300 optimisé pour cette analyse a été utilisé, associé au logiciel Beckman GoId permettant la quantification des chromatogrammes. Les résultats ont ensuite été transférés sur un tableau MS-Excel sur lequel une macro a permis le calcul des compositions relatives.
3°) Culture des cellules a°) Les lignées et kératinocytes humains normaux ( voir Exemple 1) b°) Obtention et culture des kératinocytes jeunes et âgés (voir exemple 2)
4°) Test d'adhérence cellulaire (voir exemple 2)
II. Résultats et Discussion
Détermination de la quantité de peptide immobilisée sur les plaques 96 puits Les expériences d'adhérence cellulaire effectuées avec le peptide nécessitent une première étape d'immobilisation du peptide sur les plaques de culture 96 puits. Cette étape s'effectue par un contact de la solution contenant le peptide avec la surface de plastique pendant 18 heures à +4°C. Les solutions sont ensuite éliminées par aspirations et le peptide est immobilisé sur la surface, prêt à interagir avec les cellules apportée lors du test d'adhérence cellulaire proprement dit. Selon les propriétés physicochimiques des peptides ou protéines utilisés, un pourcentage plus ou moins important est réellement immobilisé sur le support. Il a donc fallu déterminer avec précision le pourcentage d'immobilisation du peptide TALRIRATYGEY afin de connaître la quantité réelle de peptide inductrice de l'adhérence.
La Figure 17 rassemble les données obtenues lors des expériences de mise au point des conditions de dosage du peptide déposé sur les plaques 96 puits et non immobilisé. Cinq expériences ont été réalisées avec des quantités décroissantes de peptides allant de 5 μg à 0,7 μg. Pour chaque condition, la quantité de peptide indiquée a été déposée dans 3 puit différents (100 μl/puit) d'une plaque 96 puit. Après un contact de 18 h à +40C, les surnageants ont été recueillis et déposés dans des tubes destinés au dosage par la méthode de détermination de la composition en acide aminés. Deux échantillons identiques de la solution utilisée pour les dépôts ont été re-dosés dans les mêmes conditions. Les premières expériences réalisées avec 5, 19 μg montrent d'emblée que la quantité de peptide immobilisée est très faible. Les résultats obtenus dans cette condition n'ont pas pu être exploités car les valeurs déterminées dans les surnageants étaient parfois supérieures à celles de la solution de départ. Ceci signifiait d'emblée que la différence entre quantité de départ et surnageant était trop faible pour pouvoir être détectée, et se trouvait certainement comprise dans l'intervalle de l'écart à la moyenne des dosages de la solution de départ. L'expérience a donc été recommencée avec des quantités plus faibles de peptide : 3,55 μg; 2,56 μg; 1,23 μg et 0,73 μg déposés dans les puits. Les quantités de peptide étaient satisfaisantes pour réaliser l'expérience puisque nous avons obtenu pour ces 4 conditions des résultats équivalents. La quantité depeptide restant dans le surnageant après l'immobilisation est d' approximativement 90 % de la quantité de peptide apporté.
Dans un deuxième temps, 2 quantités de peptides différentes (Ql et Q2) ont été choisies pour effectuer un dosage sur un plus grand nombre d'échantillons (Figure 18). Deux échantillons de Ql (2 x 100 μl) et deux échantillons de Q2 (2 x 100 μl) ont été directement déposés dans les tubes spéciaux destinés au dosage des deux solutions de départ par la technique de détermination des acides aminés. Cinq puits différents de la plaque 96 puits ont reçu la quantité Q 1 (volume 1 OOμl) et cinq autres puits ont reçu la quantité Q2 (volume 100 μl). Après un contact de 18 h à +40C, les 5 surnageants des puits Ql et les 5 surnageants des puits Q2 ont été recueillis dans des tubes en verre spéciaux pour le dosage des acides aminés. Tous les échantillons, solutions de départ et surnageants ont été dosés en même temps. Le dosage a permis de doser une quantité moyenne de 2,44 μg dans Ql . Le dosage des 5 surnageants ont permis de déterminer une quantité moyenne de 2,212 μg étant resté en solution dans les puits, montrant qu'il reste 90, 7 % du peptide dans la solution après l'immobilisation. Ceci signifie que 9,3 % depeptide seulement ont été immobilisés. Un pourcentage équivalent a été retrouvé pour la quantité Q2 dont la quantité moyenne de départ a été de 1 ,09 μg. Après l'étape d'immobilisation, le dosage a permis de déterminer la quantité moyenne de 1,002 μg dans les surnageants ce qui signifie que 92 % de la quantité de peptide n'a pas été immobilisée.
L'ensemble de ces résultats permet de conclure que 8 à 9 % seulement de la quantité de peptide apportée dans le puit au départ est finalement immobilisée.
Cette quantité étant très inférieure à celle apportée dans le puit au départ, ceci permet de déterminer avec précision, la quantité minimale de peptide réellement active. Pour déterminer la quantité minimale de peptide active, une seconde approche a été utilisée et le nombre de cellules adhérentes a été augmenté dans le but d'obtenir un tapis cellulaire confluent. Les cellules HT1080 ont été choisies pour cette expérience car elles présentent le même profil d'adhérence que les kératinocytes. Les conditions du test d'adhérence sont les mêmes que ce qui a été décrit précédemment. Les courbes d'adhérence au peptide, dans deux conditions d'ensemencement cellulaire, sont présentées par les graphes de la Figure 19. Deux ensemencements cellulaires ont été testés: 80 000 cellules par puit (volume de 100 μl) et 150000 cellules par puit (volume 100 μl) . Comme montrées sur la Figure 19, les 2 courbes d'adhérence sont parallèles et atteignent le plateau d'adhérence pour la même quantité de peptide immobilisée. La différence observée entre les deux courbes est liée à la différence d'intensité de l'absorbance qui est supérieure dans le cas où il y a le double de cellules. Des images illustrent sur la droite le tapis cellulaire homogène et confluent obtenu dans le cas où 150 000 cellules ont été ensemencées. Les cellules sont jointives et sont associées les unes aux autres. A noter que le peptide induit l'étalement cellulaire et l'établissement de jonctions cellule-cellule, deux garants d'une bonne communication cellulaire.
A partir de ces conditions, la zone ascendante de la courbe a été analysée pour connaître la quantité minimale de peptide permettant une adhésion significative (Figure 19). L'ensemencement à 150 000 cellules par puit révèle que la quantité minimale de peptide induisant une adhérence significative est située entre 0,008 μg et 0,015 μg. EXEMPLE 6 : Exemples de compositions comprenant le peptide TALRIRATYGEY (SEQ ID N°l) :
Composition N°l : émulsion W/O (eau dans huile)
Figure imgf000043_0001
Composition N°2 : émulsion OAV (huile dans eau)
Figure imgf000044_0001
Composition N°3 : lotion
Figure imgf000045_0001
Composition N°4 : gel
Figure imgf000045_0002

Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide présentant la séquence suivante : TALRIRATYGEY (SEQ DD N0I)
2. Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est obtenu par synthèse chimique.
3. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu' elle comprend au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2.
4. Composition pharmaceutique selon la revendication 3 , caractérisée en ce que la composition contient de 0,00002 % à 5 %, de préférence de 0,00005 % à 0,1 % et plus préférentiellement encore de 0,0001 % à 0,001 % en poids de peptide et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
5. Composition pharmaceutique selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un autre principe dermatologiquement actif.
6. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une crème, d'un lait, d'une émulsion huile dans l'eau, d'une émulsion eau dans l'huile, d'une émulsion multiple, d'une solution, d'une suspension, d'un gel aqueux, d'un gel huileux, d'un gel hydroalcoolique, d'une lotion, d'un stick ou d'une poudre.
7. Utilisation du peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à renforcer la jonction dermo-épidermique, l'adhérence cellule-cellule et/ou l'adhérence cellule- matrice au niveau de Pépiderme et à favoriser la réparation de l'épiderme.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est telle que définie dans l'une des revendications 3 à 6.
9. Utilisation selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que ladite composition est destinée au traitement des altérations de la peau induites par des pathologies dermatologiques.
10. Utilisation selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que ladite composition est destinée au traitement des altérations de la peau fragilisée par des traitements cosmétiques ou thérapeutiques.
11. Utilisation selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que ladite composition est destinée au traitement curatif ou préventif du vieillissement cutané tel que les rides, le relâchement, la perte d'élasticité, la moins honne cicatrisation, de la xérose sénile, des modifications du système pigmentaire de la peau, de l'appauvrissement du réseau vasculaire de la peau, et de l'altération des phanères.
12. Procédé de traitement cosmétique de la peau caractérisé en ce qu'on applique sur la peau une composition cosmétique comprenant au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2.
13. Procédé de traitement cosmétique de la peau selon la revendication 12 caractérisé en ce que ladite composition contient de 0,00002 % à 5 %, de préférence de 0,00005 % à 0,1 % et plus préférentiellement encore de 0,0001 % à 0,001 % en poids de peptide et au moins un excipient cosmétiquement acceptable.
14. Procédé de traitement cosmétique de la peau selon l'une quelconque des revendications 12 et 13 caractérisé en ce que ladite composition comprend en outre au moins un autre principe cosmétiquement actif.
15. Procédé de traitement cosmétique de la peau selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 caractérisé en ce que ladite composition se présente sous la forme d'une crème, d'un lait, d'une émulsion huile dans l'eau, d'une émulsion eau dans l'huile, d'une émulsion multiple, d'une solution, d'une suspension, d'un gel aqueux, d'un gel huileux, d'un gel hydroalcoolique, d'une lotion, d'un stick ou d'une poudre.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9260507B2 (en) 2009-03-13 2016-02-16 Symatese Peptide promoting cell adhesion and migration
WO2023041801A1 (fr) * 2021-09-20 2023-03-23 Laboratoires D'anjou Peptides et compositions pharmaceutiques et cosmetiques les contenant

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102065171B1 (ko) * 2019-02-20 2020-01-13 (주)케어젠 대기오염물질에 의한 피부 손상 방지 및 항노화용 펩타이드와 이의 용도
KR102539445B1 (ko) * 2020-11-25 2023-06-05 (주)케어젠 미세먼지에 의한 세포 손상 방지 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
KR102474470B1 (ko) * 2020-11-25 2022-12-07 (주)케어젠 미세먼지에 의한 세포 손상 방지 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000066731A2 (fr) * 1999-04-30 2000-11-09 Biostatum, Inc. Laminine 5 recombinee
US6294356B1 (en) * 1998-01-16 2001-09-25 Northwestern University Methods and materials for making and using laminin-5

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4377522B2 (ja) * 2000-05-09 2009-12-02 株式会社ヤクルト本社 安定な酸性乳飲料、その製造方法およびこれに使用する酸性乳飲料用添加剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6294356B1 (en) * 1998-01-16 2001-09-25 Northwestern University Methods and materials for making and using laminin-5
WO2000066731A2 (fr) * 1999-04-30 2000-11-09 Biostatum, Inc. Laminine 5 recombinee

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9260507B2 (en) 2009-03-13 2016-02-16 Symatese Peptide promoting cell adhesion and migration
WO2023041801A1 (fr) * 2021-09-20 2023-03-23 Laboratoires D'anjou Peptides et compositions pharmaceutiques et cosmetiques les contenant
FR3127219A1 (fr) * 2021-09-20 2023-03-24 Laboratoires D'anjou Nouveaux peptides et compositions pharmaceutiques et cosmetiques les contenants

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